Молекулярная экология метаногенных и метанотрофных архей гидротермальных мест обитания

Меркель, Александр Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная экология метаногенных и метанотрофных архей гидротермальных мест обитания
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная экология метаногенных и метанотрофных архей гидротермальных мест обитания"

На правах рукописи 005050893

МЕРКЕЛЬ АЛЕКСАНДР ЮРЬЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ МЕТАНОГЕННЫХ И МЕТАНОТРОФНЫХ АРХЕЙ ГИДРОТЕРМАЛЬНЫХ МЕСТ ОБИТАНИЯ

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

005050893

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)

Научный руководитель Черных Николай Алексеевич,

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты Дедыш Светлана Николаевна, доктор

биологических наук, ИНМИ РАН, заведующая лабораторией

Кузнецов Борис Борисович, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" РАН, старший научный сотрудник, руководитель группы молекулярной диагностики

Ведущая организация Московский государственный

университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита состоится «20» февраля 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 002.224.01 при ИНМИ РАН по адресу: 117312, г.Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН. Автореферат диссертации разослан «.4С» января 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, Хижняк Татьяна Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Процессы образования и окисления метана - это количественно значимые компоненты глобального цикла углерода на Земле и, по-видимому, они являлись таковыми на протяжении всего времени существования биосферы нашей планеты. Тем не менее, далеко не все филогенетические группы микроорганизмов, образующих и окисляющих метан, изучены в достаточной степени.

Процессы метаногенеза и сульфатзависимого окисления метана осуществляются археями, объединенными в родственные группы микроорганизмов, относящихся к типу Euryarchaeota (Strous & Jetten, 2004). Эти микроорганизмы широко распространены в природе, где метаногенные археи осуществляют терминальный этап в процессе анаэробного разложения органического вещества в условиях отсутствия высокопотенциальных акцепторов электронов, тогда как метанотрофные археи в составе синтрофных ассоциаций и при условии наличия сульфата осуществляют анаэробное окисление метана (Whitman et al., 2006; Knittel & Boetius, 2009).

Использование гена 16S pPHK для детекции и идентификации метаногенных и метанотрофных архей в сложных микробных сообществах затруднено, поскольку обе эти физиологические группы не являются монофилетичными (Bapteste et al., 2005; Knittel & Boetius, 2009). В связи с этим внимание ряда исследрвателей было обращено на ген метил-коэнзим М редуктазы (mcrA) (Springer et al., 2005; Hales et al., 2006). Результаты, полученные во многих работах подтвердили эффективность использования данного функционального и филогенетического маркера для оценки разнообразия и распространения метаногенных и метанотрофных архей (Luton et al., 2002; Hallam et al., 2003).

В экосистемах, ассоциированных с геотермальной активностью, где водород и метан образуются в результате высокотемпературных абиотических реакций, метаногенные и метанотрофные археи способны выполнять роль первичных продуцентов. Для некоторых термальных экотопов, таких как нефтяные месторождения, гидротермальные осадки, «черные курильщики», уже проведен ряд исследований по разнообразию и распространению метаногенных, а в некоторых случаях и метанотрофных архей (Teske et al., 2002; Dhillon et al., 2005; Jeanthon et al., 2005; Miroshnichenko & Bonch-Osmolovskaya, 2006; Ollivier & Cayol. 2010). Настоящее исследование посвящено слабо изученным в этом отношении экотопам: диффузным глубоководным гидротермальным выходам и наземным горячим источникам.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования была молекулярная детекция, идентификация и количественная оценка метаногенных и метанотрофных архей в гидротермальных экосистемах и реконструкция филогении этих групп микроорганизмов на основании общего функционального и филогенетического маркера — гена а субъединицы метил-коэнзим М редуктазы {тегА).

Основные задачи исследования состояли в следующем:

1. Оценка распространения, численности и филогенетического разнообразия метаногенных архей в образцах диффузных флюидов глубоководных гидротермальных систем и в образцах наземных горячих источников с использованием молекулярных и культуральных подходов.

2. Создание масштабной реконструкции филогении метаногенных и метанотрофных архей на основе гена а субъединицы метил-коэнзим М редуктазы (тег А) с использованием обширной и современной базы данных.

3. Выявление из всего многообразия метанотрофных архей конкретных филогенетических групп, для представителей которых мы сможем прогнозировать адаптацию к высоким температурам.

4. Разработка систем праймеров для детекции термофильных групп метанотрофных архей.

5. Оценка распространения термофильных групп метанотрофных архей в образцах диффузных флюидов глубоководных гидротерм и в образцах наземных горячих источников.

Научная новизна и значимость работы. Впервые на большой выборке образцов проведена оценка количества и распространения метаногенных микроорганизмов в диффузных гидротермальных флюидах нескольких районов Тихого океана. Значительно расширены представления о разнообразии метаногенов в данных экотопах. Выявлена взаимосвязь между содержанием водорода в диффузных гидротермальных флюидах и характером метаногенной популяции этих флюидов.

Получены веские доказательства существования экстремально термофильных метанотрофных архей, а также получены данные об их распространении.

Впервые на большой выборке образцов проведена оценка распространения метаногенных микроорганизмов в наземных горячих источниках. Осуществлена количественная оценка структуры микробного сообщества трех горячих источников. Выявлены новые филогенетически обособленные кластеры некультивируемых метаногенных архей, и впервые показана их широкая распространенность в наземных горячих источниках. С помощью сочетания молекулярных и культуральных методов значительно расширены представления о разнообразии метаногенов, обитающих в наземных горячих источниках.

Проведена масштабная реконструкция филогении метаногенных и метанотрофных архей. Подтверждено отсутствие случаев горизонтального переноса гена тег А.

Практическая значимость. Определен диапазон Г+Ц состава 16Б рРНК, позволяющий прогнозировать адаптацию к высоким температурам архей некультивируемых групп.

Разработаны, а также т-зШсо и экспериментально проверены системы праймеров, позволяющие с высокой степенью специфичности амплифицировать

гены 16S рРНК анаэробных метанотрофных архей кластера ANME-1, включая термофильные микроорганизмы этого кластера.

Получена стабильная синтрофная метанол-использующая метаногенная накопительная культура, растущая при 65°С, представляющая интерес для очистки сточных вод целлюлозных производств.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на международных конференциях «AGU Fall Meeting 2009», «Biodiversity, molecular ecology and biogeochemistry of thermophiles — 2010», «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний 2011», на Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии - 2011» и на на международной конференции «9th international congress on extremophiles — 2012».

Публикации. Материалы диссертации содержатся в 10 печатных работах: 4 экспериментальных статьях и 6 тезисах.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на Í5& страницах машинописного текста и включает 20 рисунков и 10 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и их обсуждение, выводов и списка литературы, который содержит 32.5 наименований.

Место проведения работы и благодарности. Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (ИНМИ РАН) и в лаборатории Джулии Хубер (The Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory). Секвенирование последовательностей генов 16S рРНК и mcrА выполнялось в Центре Биоинженерии РАН и в Центре сравнительной молекулярной биологии и эволюции MBL, США. Подбор олигонуклеотидных праймеров, а также анализ зависимости Г+Ц состава 16S рРНК архей и их температурного оптимума был проведен совместно с к.б.н. Лебединским A.B. (ИНМИ РАН). Автор выражает глубокую признательность д.б.н. Бонч-Осмоловской Е.А., к.б.н. Лебединскому A.B., к.б.н. Черных H.A., д.б.н. Соколовой Т.Г., а также доктору Хубер Д.А. за практическую помощь и ценные советы. Автор приносит искреннюю благодарность всем сотрудникам Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили 16 проб воды и осадков наземных горячих источников полуострова Камчатка (Россия) и острова Сан-Мигель (Португалия), а также 50 проб диффузных гидротермальных флюидов из 42 глубоководных сайтов, расположенных в семи районах Тихого Океана: вулкан Аксиал Симаунт, сегмент Индевор, а также пять глубоководных вулканов, расположенных вдоль Марианской Дуги. Для отработки методов детекции метаногенных и метанотрофных архей использовали пробы осадков Гданьской впадины (Балтийское море), осадков гиперсоленых содовых озер Кулундинской равнины, гидротермальных осадков Бассейна Гуаймас (Калифорнийский залив) и поверхностных осадков метановых сипов Мексиканского залива.

Молекулярные методы. ДНК выделяли ранее описанными методами (Tsai & Olson, 1991; Huber et al., 2007). РНК выделяли с использованием набора RNAqueous-4 PCR (Ambion, Inc.) в соответствии с инструкцией производителя. ПЦР-амплификацию, гель-электрофорез, клонирование, денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ), количественную ПЦР, ПЦР с обратной транскрипцией проводили согласно общепринятым методикам (Маниатис и др., 1984; Saiki, 1989; Muyzer et al., 1993; Kubista et al., 2006).

Анализ полученных нуклеотидных последовательностей. Нуклеотидные последовательности редактировали и собирали в программе BioEdit 7.1.3 (Hall, 1999), выравнивали в программе ClustalW (Thompson et al., 1994), объединяли в репрезентативные операционные таксономические единицы (ОТЕ) в программе cd-hit (Li & Godzik, 2006). Совокупность всех полученных ОТЕ была проверена на наличие химер с помощью программы Pintail (Ashelford et al., 2005). Филогенетичская реконструкция проводилась в программе ARB (Ludwig et al., 2004) с использованием алгоритма maximum-likelihood и непараметрического bootstrap анализа (100 повторов).

Разработка и проверка специфичности систем праймеров. Для разработки специфичных праймеров на ген 16S рРНК филогенетического кластера ANME-1 были использованы нуклеотидные последовательности из баз данных ARB-SILVA (www.arb-silva.de) и RDP (rdp.cme.msu.edu). Разработку праймеров проводили в программе MultiPot (Лебединский, неопубликованные данные). Проверку специфичности праймеров in silico осуществляли с помощью программы OligoReport и онлайн серверов Probe Match (RDP), probeCheck (Loy et al., 2008) и TestPrime (Klindworth et al., 2012).

Получение накопительных культур метаногенов проводили на среде № 203 DSMZ, с вариациями концентрации дрожжевого экстракта, соды и цистеина при различных температурах и значениях рН и с использованием ряда субстратов: Н2/ СОг, формиат, ацетат, метанол, пропионат.

II. Результаты исследования и их обсуждение

1. Молекулярный анализ микроорганизмов диффузных Флюидов глубоководных гидротерм на основе гена тег А и 16Б рРНК

В ходе данной работы было проанализировано 50 образцов диффузных гидротермальных флюидов, отобранных в 42 глубоководных сайтах, расположенных в семи районах Тихого океана. Во всех случаях флюиды отбирали из выходов в базальтовой породе, не имеющих видимого осадочного слоя. Анализ проводили с использованием двух систем праймеров, специфичных к гену тег А. Ампликоны гена тег А были получены из восьми образцов флюидов пяти различных гидротермальных сайтов (Табл. 1.). Для всех этих образцов были сконструированы

Таблица 1. Характеристики образцов гидротермальных флюидов с положительным результатом амплификации гена тег Л.

Образец Географические положение Сайт Координаты и глубина Год отбора проб т, °С Тип матрицы Объем пробы, л* Общее кол-во клеток **

A3SxlO Хребет Хуан де Фука Вулкан Axial Zen Garden 45.937 с.ш. 129.981 з.д., 1519 м. 2007 25.7 ДНК 3.4 Н.Д.

A3Sxll 2007 7.7 ДНК 29

A4Sxl 1 Marker 113 45.922 с.ш. 129.988 з.д., 1526 м. 2007 31.1 РНК 2.6 1.1 * 10'л1

A4Sxl2 2007 31.5 ДНК

FS612 2008 24.8 ДНК 4

FS619 9m 45.926 с.ш. 129.979 з.д, 1519 м. 2008 35.9 ДНК 2 5.3 х 107 л"'

FS625 Сегмент Endeavour Easter Island 47.948 с.ш. 129.099 з.д. 2198 м. 2008 22.1 днк 2 1.3 х 108 л"'

FS448 Мариан. Дуга Вулкан NW Rota-1 Fault Shrimp 14.600 с.ш. 144.777 в.д, 568 м. 2006 25.9 ДНК 3 3.5 х 107 л'1

* Объем отфильтрованного флюида, использовавшегося для выделения ДНК/РНК. ** Концентрация клеток в окружающей морской воде была приблизительно равна 2.5 х 10' Л"' (Данные любезно предоставлены Э.А. ВиИегйеМ с соавторами).

библиотеки клонов гена тег А, а также гена архейной 16S рРНК. Всего было получено 620 последовательностей гена тег А и 338 последовательностей гена архейной 16S рРНК. На основании сходства (более 95%) транслированные нуклеотидные последовательности гена тег А были объединены в 41 OTE. На основании такого же уровня сходства нуклеотидные последовательности гена архейной 16S рРНК были объединены в 47 операционных таксономических единиц (OTE). С целью определения филогенетического положения всех выявленных на основе гена тег А микроорганизмов, была проведена масштабная филогенетическая реконструкция (Рис. 1), для чего из баз данных GenBank и FunGene было выбрано более шести тысяч полных и частичных последовательностей гена тегА, которые в дальнейшем были объединены в 366 репрезентативных OTE (211 последовательностей некультивируемых микроорганизмов и 155 культивируемых видов метаногенов). В результате проведенного анализа было выяснено, что выявленные в образцах последовательности гена тег А относятся к 3 порядкам культивируемых метаногенов: Methanosareinales, Methanomierobiales и Methanoeoecales, а также к двум кластерам некультивируемых архей: ANME-1 и

MCR-2a (Рис. 1). Относительная представленность филогенетических групп в библиотеках клонов гена тег А и гена 16S рРНК отображена на Рис. 2 и 3 соответственно. Для всех проб, в которых были выявлены гены тсгА (за исключением A4Sxll), была проведена количественная ПЦР с целью оценки численности бактерий и архей (на основе гена 16S рРНК), а также метаногенов и анаэробных метанотрофов (на основе гена тсгА (Рис. 4)). Для подсчета количества копий гена тсгА методом количественной ПЦР использовали праймер qmcrA-F (5'-GARGACCACTTYGGHGGTTC-3'), разработанный нами на основании выравнивания всех полученных в ходе этой части работы нуклеотидных последовательностей гена тег А. Данный праймер использовали в паре с праймером ML-R (Luton et al., 2002).

A3 A3 А4 А4 FS . S*.1Q Sxll Sxl 1 Sx.1.2 612

Ы:

FS FS FS 619625 448

Methanosarcinales

Methanocellales

Methano-microbiales

«ИГ*®^ Methanohalophilus ^yMéihanóhdopñflüs related Ш Methánococcoídes , ¿%f Methañosalsum

¡ídmm...... Methanolobus

'i g4%o Methanohalobium 4? Methanomethylovorans

Methanosarcina — ANME-2 " Methanosaeta ' ~№the'rmícóccus Üñc'lífétKándsáfcfñálés MéthánocSílales ¡вИЕВ®я»»»—-—Methanoplanus & Methanomicrobium i 7S>& 9 Methanogenium 99%'",: Methanosphaerula Methanoculleus W Méihanóco^úsculürfi ¡sü—- Métháñospinlíüm Methanolinea Methanoregula group

mrtA

Methano-coccales

r'' Methanobacteríales mrtA ¿<¡£§7Methañocaldócocais 'mrtA mfhandcócojs Metháñbihermocóccüs

g„¿f Methanotorrís

J .....-......" Methanobacteríales

Methanopyrales

100%--;----'- ANME-1

uncultured

^кЕЗ^ Lost City group " MCR-2c

1111 1111

3 111

A4 A4 FS Sx11 Sx12612

FS FS FS 619 625 44Í

Рисунок 1. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа аминокислотных последовательностей а субъединицы метил-коэнзим М редуктазы, полученных в ходе исследования диффузных флюидов гидротермальных систем Тихого океана. Дерево построено в программе ARB с использованием алгоритма maximum likelihood и bootstrap анализа (100 повторов, значения ниже 50% не показаны). Справа в виде таблицы черными квадратами обозначен положительный результат детекции определенных групп, цифрами внутри квадратов обозначено количество OTE.

р К

. 80%

-i I.

; 60%

! >

Í 40%

I >

20% 0%

■ ■ I

■ В I

A3Sxl0 A3Sxl 1 A4Sxl 1 A4Sxl2 FS612 FS619 FS448 FS625

i Methanococcoxdes i Methanocorpusculum • Methanocaldococcus i MCR-2a

i Methermicoccus i Methanococcus Methanotorris i Methanohalophilus related

unidentified rice field soil mcrA i Methanothermococcus iANME-1

Рисунок 2. Отностительная представленность филогенетических групп в библиотеках клонов гена тсгА, полученных в ходе исследования диффузных флюидов гидротермальных систем Тихого океана.

A3Sxl0 A3Sxll A4Sxll A4Sxl2 FS612 FS448 FS619 FS625

□ MG II

□ ANT06-052

□ MHVG

U Methanococcus & Methanothermococcus

□ Thermococcus

□ Pyrodictiaceae Olgnisphaera

■ Thermofilum □THSCG

■ DHVEG-1

□ DSEG О MEG

□ Methanocaldococcus

■ unclassified

□ Firvidicoccaceae И Thermoproteaceae

□ MG I

■ SAGMEG

Рисунок 3. Относительное содержание OTE различных таксономических групп в библиотеках клонов гена архейной 16S рРНК, полученных в ходе исследования диффузных флюидов гидротермальных систем Тихого океана.

■ Бактериальная 16S рРНК

О Архейная 16S рРНК

Я mcrА

A3SxlO A3Sxll A4SX.1.2 FS612 FS6.19 FS625 FS448 Морская

Zen Zen Mkrll3Mkrll3 9m Easter Fault вода Garden, Garden, ДНК ДНК Island Shrimp

25.7 "С 7.7'С 2007 2008 Рисунок 4. Количество копий генов бактериальной 16S рРНК, архейной 16S рРНК и тег А в расчете на 10 нг ДНК, выделенной из образцов диффузных флюидов гидротермальных систем Тихого океана. Указан интервал стандартного отклонения. Показатели для калибровочных кривых: R2>0.99, эффективность от 91% до 96%.

Таким образом, на большой выборке образцов нами была проведена оценка количества, распространения и разнообразия метаногенных и метанотрофных архей в диффузных гидротермальных флюидах нескольких районов Тихого океана. Тот факт, что только в 5 из 42 сайтов удалось обнаружить метаногенов, свидетельствует об относительно слабом распространении микроорганизмов этой физиологической группы в исследуемом типе экосистем. Данный вывод подтверждается также и результатами количественной ПЦР: на метаногенов приходится от 0.2 до 6% архейной составляющей и до 0.5% от общей микробной популяции флюидов (Рис. 4). В 3 из 5 сайтов метаногены имели численность, достаточную для их детекции с помощью универсальных архейных праймеров на ген 16S рРНК, при этом были выявлены только преобладающие филогенетические группы (Рис. 3). В образцах двух сайтов (Marker 113 и 9т), в которых копийность гена тег А была наиболее высокой (Рис. 4), доминировали представители порядка Methanococcales. Кроме того, представители порядка Methanococcales были обнаружены во всех образцах с положительным тег А сигналом, за исключением образцов сайта Zen Garden (Рис. 2). Таким образом представители именно этого порядка метаногенов наиболее распространены в гидротермальных экосистемах, что подтверждается литературными данными (Ollivier & Cayol, 2010).

Современные исследования (Wankel et ai, 2011) выявили существенное (>80%) обеднение по водороду диффузных гидротермальных флюидов хребта Хуан де Фука с температурой ниже 100°С по сравнению с высокотемпературными флюидами тех же районов. Ванкель с соавторами объясняют снижение концентрации водорода в диффузных гидротермальных флюидах деятельностью гидрогенотрофных микроорганизмов, в том числе и метаногенов. Полученные в данной работе результаты позволяют предположить, что деятельность метаногенов не является основной причиной обеднения диффузных флюидов по водороду и что причину потребления водорода следует искать в деятельности микроорганизмов других физиологических групп.

Концентрация водорода в гидротермальных флюидах района вулкана Axial превышает значения константы полунасыщения в уравнение Моно (Ks) для штаммов Methanocaldococcus, выделенных из данной географической области (Ver Eecke et al. 2012). Для двух других районов (гидротермальное поле Endeavour и вулкан NW Rota-1) концентрация водорода в гидротермальных флюидах на выходе близка или ниже минимального значения, способного поддерживать рост этих микроорганизмов (Lupton et al., 2008; Ver Eecke et al. 2012). Эти данные коррелируют с полученными нами результатами: в образцах вулкана Axial 96-100% последовательностей в библиотеке mer А представлены гидрогенотрофными метаногенами культивируемых родов, тогда как в библиотеках mer А образцов гидротермального поля Endeavour и вулкана NW Rota-1 значительная часть последовательностей (23% и 61% соответственно) относится к метилотрофным родам метаногенов (Мethermicoccus и Methanococcoides) и к филогенетическим кластерам некультивируемым форм, субстратная специализация которых неизвестна (Рис. 2). Эти результаты указывают на важность использования отличных от водорода метаногенных субстратов для выделения представителей новых таксонов и оценки биоразнообразия метаногенов культуральными методами в изучаемых экотопах.

На сегодняшний день обнаружено более 500 гидротермальных выходов (Takai & Nakamura, 2011). При изучении таких экосистем внимание микробиологов в большинстве случаев сфокусировано на высокотемпературных (250-350°С) концентрированных флюидах «черных курильщиков». Однако значительная доля морской воды циркулирует через диффузные гидротермальные выходы, температура которых на выходе в большинстве случаев не превышает 50°С (Bemis et al., 2012; Bourbonnais et al., 2012). Постепенно смешиваясь с морской водой при прохождении через океаническое дно, гидротермальные флюиды диффузных выходов образуют обширные зоны с температурами, оптимальными для развития различных групп термофильных микроорганизмов. Проведенный нами анализ Г+Ц состава нуклеотидных последовательностей гена архейной 16S рРНК показал, что во всех образцах низкотемпературных флюидов с положительным результатом детекции гена тег А, за исключением A3Sxll, присутствуют филотипы термофильных микроорганизмов. Отсутствие седиментов в изучаемых сайтах и техника, применявшаяся для отбора образцов, минимизируют вероятность попадания термофильных микроорганизмов в образец из экотопов, расположенных над поверхностью океанического дна. Эти данные еще раз подтверждают обоснованность использования низкотемпературных гидротермальных флюидов для изучения микробной популяции, развивающейся в высокотемпературных зонах под поверхностью океанического дна.

На примере сайта Marker 113 у нас была возможность оценить изменчивость метаногенной популяции диффузных гидротермальных флюидов, сравнив результаты для образцов, собранных с интервалом в один год (образцы A4Sxl2 и FS612). При небольшом изменении соотношения отдельных групп микроорганизмов структура популяции сохранялась, на что указывают данные анализа библиотек клонов как гена тсгА, так и гена архейной 16S рРНК. Наши результаты свидетельствуют о стабильности термальных анаэробных микрониш под

поверхностью океанического дна изучаемого географического района. Кроме того, для сайта Marker 113 мы провели сравнение библиотек клонов гена тег А, полученных на основе ДНК и мРНК. В библиотеке, основанной на мРНК, присутствуют последовательности тег А метаногенов из родов Methanothermococcus, Methanocaldococcus, Methanococcus и незначительное количество Methanotorris, свидетельствуя о том, что данные микроорганизмы находились во флюиде в жизнеспособном состоянии (Рис. 2). Основным отличием библиотеки на основе мРНК являлось отсутствие гена, кодирующего изоэнзим метил-коэнзим М редуктазы (тип II), который преимущественно экспрессируется в экспоненциальной фазе роста микроорганизмов при оптимальной концентрации водорода (Pennings et al., 2000). Отсутствие экспрессии данного изоэнзима указывает на то, что микроорганизмы в изучаемом экотопе существуют в условиях субоптимальной концентрации водорода.

2. Детекция термофильных метанотрофных архей с помощью новых систем праймеров

Мы провели анализ корреляции между Г+Ц составом гена 16Б рРНК (Р<зс) и оптимальной температурой роста (Тор!) для всех типовых штаммов архей (Рис. 5). В результате было установлено, что среди типовых штаммов архей с Р<зс выше 60% нет мезофилов, а с Рос выше 63% нет умеренных термофилов (Рис. 5). Кроме того, проведенный нами Р«: анализ всех последовательностей архейных изолятов имеющихся в базе данных МЭР (около 2500 последовательностей) подтвердил, что показатель Рос выше 60% может использоваться как пороговая величина для определения адаптации к архей к высоким температурам. Анализ Г+Ц состава более 900 нуклеотидных последовательностей 16Б рРНК представителей метанотрофных архей (АКМЕ), показал, что Рос шести АИМЕ групп (ЛИМЕ-1 а, АИМЕ-Иэ, АЫМЕ-1АТ, АЫМЕ-2аЬ, АКМЕ-2с и АИМЕ-З) не превышает 58 мол % (Рис. 6), тогда как значение этого показателя для группы АИМЕ-ЮВа равно 63.34±0.58 мол %. Эти результаты позволили обоснованно прогнозировать адаптацию микроорганизмов группы ANME-lGBa к росту при высоких температурах. Кроме того, так как Рос других филогенетических кластеров анаэробных метанотрофов не превысел 58% процентов, то, основываясь на анализе полученной нами корреляции, мы можем считать представителей группы АММЕ-ЮВа единственными кандидатами на экстремальную термофилию среди метанотрофных архей.

В ходе данной работы было /и 5/7/со проверено 13 ранее опубликованных праймеров, специфичных к последовательностям 16Б рРНК микроорганизмов кластера АЫМЕ-1. Было установлено, что только одна пара ранее опубликованных праймеров пригодна для амплификации генов 16Б рРНК микроорганизмов группы АЫМЕ-ЮВа (М1уа5Ька еГ а1., 2009), но она была разработана на основе лишь четырех весьма сходных нуклеотидных последовательностей, что резко повышает вероятность ее избыточной специфичности.

■¡мезофилы (<50°С) экстремальные термофилы (70-80°С)

60 70 80 90 100 110 Topt, °С

умеренные термофилы (50-70°С) И гипертермофилы (>80°С)

Рисунок 5. Корреляция между оптимальной температурой роста (Тор!) типовых штаммов архей и Г+Ц составом гена 16Б рРНК (Р<зс)-

63.5

о4 62

О В 60

и о 58

О.

АЫМЕ-1а АЫМ-1АТ АЫМЕ-ЮВа АЫМЕ-1Ь АЫМЕ-2аЬ АЫМЕ-2с АЫМЕ-З

Филогенетические кластеры анаэробных метанотрофов

Рисунок 6. Рос анализ известных групп метанотрофных архей, с указанием интервала стандартного отклонения.

Мы разработали праймеры, способные с высокой степенью специфичности амплифицировать гены 16S рРНК микроорганизмов всего ANME-1 кластера, включая его наиболее глубокое ответвление - группу ANME-lGBa: ANME-1_19F (5'-GAGGCYACTGCYATCAGMGT-3'), ANME-1_1118F (5'-

CYCRCAGTTGCCAGCATCT-3'), ANME-1_1406R (5'-

AYCYCACTCGGYTGGCTTGA-3'). Для экспериментального подтверждения специфичности праймеров использовали образцы морских осадков, в которых ранее уже были выявлены филотипы кластера ANME-1 (Табл. 2). В качестве первого объекта использовали образцы осадков сайта MCI 18 в Мексиканском заливе. Сайт MCI 18 (Mississippi Canyon Block 118) характеризуется наличием метановых сипов (Lapham et al., 2008; Lloyd et al., 2010). На данном образце были протестированы три системы праймеров: ANME-1_19F — ANME-1_1406R, ANME-11118F — ANME-1 1406R, а также ANME-119F — ARCH 915R, где реверс-праймер является универсальным для всех архей (Stahl & Amann, 1991). Для каждой системы праймеров было получено 24 клона (Табл. 2; Рис. 7). Несмотря на обилие микроорганизмов глубоких некультивируемых филогенетических линий в осадках сайта MCI 18 (Lloyd et al., 2010), при использовании систем праймеров ANME-119F — ANME-1_1406R и ANME-1_19F — ARCH_915R удалось специфично амплифицировать представителей двух групп: ANME-la и b (83 и 17% библиотеки клонов соответственно). При этом выявляемое разнообразие филотипов и их соотношение в библиотеках клонов при применении этих двух систем праймеров были идентичны. При использовании системы праймеров ANME-1_1118F — ANME-1 1406R был получен один филотип (ANME-lb), что послужило подтверждением сниженной специфичности праймера ANME-1_1118F к группе ANME-la. Еще одним объектом, на котором осуществлялась проверка разработанных праймеров, являлся образец геотермальных осадков сайта BIG 1 Бассейна Гуаймас (Табл. 2). В геотермальных осадках Бассейна Гуаймас ранее уже было обнаружено значительное разнообразие филотипов анаэробных метанотрофов, в том числе относящихся к группам ANME-1AT и ANME-lGBa (Teske et al., 2002). С использованием системы праймеров ANME-1_19F — ANME-1_1406R для сайта BIG 1 была секвенирована библиотека из 28 клонов, которые затем были объединены в 4 ОТЕ. Два из них были отнесены к группе ANME-1AT (7% библиотеки), и два — к группе ANME-lGBa (93% библиотеки) (Табл. 2). Таким образом, была экспериментально подтверждена пригодность разработанных праймеров для выявления двух наиболее глубоких ответвлений кластера ANME-1: ANME-1AT и ANME-lGBa.

Скрининг анаэробных метанотрофов кластера ANME-1 проводили на той же коллекции образцов, которую использовали в первой части работы. Для четырех образцов (Табл. 2) из пятидесяти был получен положительный результат ПЦР реакции с системой праймеров ANME-1_19F — ARCH_915R. 366 секвенированных последовательностей гена 16S рРНК были объединены в 6 ОТЕ (Рис. 7). Все нуклеотидные последовательности 16S рРНК, полученные при анализе сайтов Bag City и Easter Island, и большинство (98%) последовательностей сайта Boardwalk были отнесены к группе ANME-lGBa. Г+Ц состав этих последовательностей составлял около 64%.

Таблица 2. Детекция метанотрофных архей с помощью систем праймеров, разработанных в ходе данного исследования. Характеристика образцов и результаты.

Образец Географические положение и сайт Координаты и птубина т, °С Использовавшиеся системы праймеров* (количество OTE) Детектированные группы ANME-1

1 2 3 AT а b GBa

МС118 Мексиканский Залив, Каньон Миссисипи, сайт MC 118 28°,51.47' с.ш., 88°,29.52' з.д., 880 м 5 +(2) +(1) +(2) + +

FS611 Хребет Хуан де Фука, вулкан Axial, сайт Bag City 129°,59.354' з.д., 45°,54.974' с.ш., 1410м 11,2 НО НО +(1) +

FS62S Хребет Хуан де Фука, поле Endeavour, сайт Easter Island 129 5.967' з.д., 47°,56.88' с.ш., 2150 м 17.8 НО но +(2) +

FS725 Хребет Хуан де Фука, поле Endeavour, сайт Boardwalk 129 °,5.24' з.д., 47°,58.11'с.ш., 2150 м 16.4 но но +(2) + +

FS448 Марианская Дуга, вулкан NW Rota-1, сайт Fault Shrimp 144°,46.62' в.д., 14°,36.06'с.ш., 520 м 25 но но +(1) +

BG410 Калифорнийский залив, Бассейн Гуаймас, сайт BIG 1 111°,24.56' з.д., 27° ,00.37' с.ш., 2000 м 5070 +(4) но но + +

* 1=ANME-1_19F - ANME-1_1406R, 2= ANME-1_1118F - ANME-1_1406R, 3= ANME-1_19F — ARCH_915R. НО - не определялось. Жирным шрифтом обозначены образцы гидротермальных флюидов

Все последовательности 16S рРНК ANME-1, полученные при анализе сайта Fault Shrimp, принадлежали группе ANME-la, а 2% последовательностей сайта Boardwalk - группе ANME-1AT. Использование разработанных систем праймеров для анализа образцов наземных горячих источников (см. третью часть работы) не дало результатов.

Только в образцах сайта Easter Island нам удалось выявить представителей кластера ANME-1 при амплификации генов метил-коэнзим М редуктазы (см. первую часть работы). В этом же сайте при использовании 16S рРНК-специфичных праймеров были детектированы только представители группы ANME-lGBa, что позволяет приписать полученные тсгА последовательности именно к этой группе. На сегодняшний день не существует прямых доказательств участия группы ANME-lGBa в процесс анаэробного окисления метана (АОМ). Тем не менее, сравнение аминокислотных последовательностей метил-коэнзим М редуктазы ANME-lGBa с кристаллизованной и детально описанной метил-коэнзим М редуктазой анаэробных метанотрофных архей (Meyerdierks et al., 2010; Shima et al., 2012) выявило высокий уровень сходства (92%), что является веским подтверждением метанотрофной специализации микроорганизмов группы ANME-lGBa.

i- FN820375

:r AM746101_ANME1b

,_i1- UC118(1)4

BRvJ L ЫС118(3)3 50% '— AJ578130_ANME1b

61,%- FJ712388_ANME1b

AK41~9S24jANMÉÍa FM179893_ANME1a AY714814 FS448(3)S4 UC118(1)1 MC118(3)8

imi^— tsmv -------

AF419626_ANME1AT BG410(1)28 AF419654_ANME1AT BG41(K1)17

АМУдкйгжмет

ANME-1 b

ANME-1 a

ANME-1 AT

ANME-1GBa

Methanomicrobia

Archaeoglobi

Methanopyms

Рисунок 7. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнительного анализа фрагментов гена 16S рРНК. На данной дендрограмме последовательности, полученные в ходе настоящей работы, объединены в 14 OTE (на дереве они обозначены жирным шрифтом). Первые пять символов в названии OTE обозначают использованный образец, в скобках указан номер системы праймеров ( 1=ANME-1_19F - ANME-1_1406R, 3= ANME-1_19F - ARCH_915R). Черным квадратом обозначены детектированные OTE с высоким содержанием ГЦ пар (более 62%). Представленные OTE депонированы в базе данных GenBank под номерами JQ740748-JQ740762.

Превалирующая в клональных библиотеках сайтов Bag City, Easter Island и Boardwalk группа ANME-lGBa ранее была выявлена только в Бассейне Гуаймас (Teske и др., 2002; Biddle и др., 2011). Полученные нами данные свидетельствуют о более широком распространении этой группы термофильных метанотрофных архей в гидротермальных сайтах различных по географическому положению и геологическим характеристикам. Кроме того, опираясь на полученные результаты можно предположить, что микроорганизмы группы ANME-lGBa являются доминирующими представителями метанотрофных архей кластера ANME-1 в диффузных гидротермальных системах Тихого океана.

Тот факт, что метанотрофные архей кластера ANME-1 были выявлены лишь в четырех из 42 неседиментированных сайтах говорит только об эпизодическом присутствии этих микроорганизмов в изучавшихся экотопах. Литературные данные также свидетельствуют о том, что неседиментированные экотопы не являются характерными местами обитания метанотрофных архей. Это может быть объяснено отсутствием метаногенеза и соответственно метана в подобных местах обитания. Однако, при отсутствии видимых осадков в исследованных сайтах существуют

химические данные, указывающие на наличие обширных залежей осадочных пород в сайтах поля Endeavour. Содержание метана во флюидах этого сайта очень высоко (до ЗмМ). Указаний на существование подобных залежей в сайтах вулканов Axial и NW Rota-1 нет. Однако метаногены, присутствующие в тех же сайтах (см. первую часть работы) могут снабжать метаном анаэробных метанотрофов. Учитывая (1) предполагаемую термофилию микроорганизмов группы ANME-lGBa, (2) низкую температуру изучавшихся флюидов на выходе, (3) отсутствие осадков на поверхности изучавшихся сайтов, (4) данные о залежах осадочных пород под поверхностью изучавшихся сайтов мы можем предположить, что детектированные нами метанотрофные микроорганизмы выносятся на поверхность потоком флюида из высокотемпературных зон, расположенных под поверхностью океанического дна.

Несмотря на большой интерес к микроорганизмам, осуществляющим анаэробное окисление метана, ни один представитель данной физиологической группы до настоящего момента не был выделен в чистую культуру. Предполагается, что одной из основных причин сложности их выделения является низкий уровень изменения свободной энергии Гиббса (AG0 < -40 kJ mol"1) в проводимой ими реакции и, как следствие, низкая скорость роста (Knittel & Boetius, 2009). В связи с этим, особый интерес многих исследователей вызывает термофильный процесс АОМ, так как теоретические расчеты показывают, что AG сульфатзависимого АОМ возрастает при повышении температуры (Holler et al., 2011). В настоящей работе было получено убедительное подтверждение существования термофильных микроорганизмов, относящихся к кластеру анаэробных метанотрофных архей ANME-1.

3. Оценка разнообразия, распространения и численности метаногенных архей в наземных горячих источниках на основе молекулярных и культуральных подходов

Мы провели скрининг 16 горячих источников п-ова Камчатка (Россия) и о-ва Сан-Мигель (Португалия) с использованием праймеров, специфичных к гену тсгА (Табл. 3). Целевые последовательности были успешно амплифицированы из ДНК 12 горячих источников. Полученные ампликоны были разделены с использованием ДГГЭ. Все отсеквенированные полосы были объединены в 26 OTE на основании сходства аминокислотных последовательностей выше 95% (Табл. 3). Полученные OTE были отнесены к нескольким таксономическим группам культивируемых метаногенов: Methanosaeta, Methanocellales, Methanobacteriales, и двум кластерам некультивируемых микроорганизмов: MCR-2a и MCR-2c (Рис. 8).

С целью оценки численности метаногенных архей, архей в целом и бактерий была проведена количественная ПЦР для проб из трех горячих источников: Термофильный, Заварзина и 2012 (Рис. 9). Самую высокую численность метаногены имеют в горячем источнике 2012, при этом составляя менее 0.1% от общей численности прокариот.

Горячий источник Географическое положение. Т°С РН тег А

Термофильный П-ов. Камчатка Кальдера Узон Восточное термальное поле 72 6.3 + (5)

Заварзина 57 6.2 + (2)

Трещинный 74 6.5 -

1831 77 6.5 + (2)

Бурящий (котел) Центральное термальное поле 89 6.0 + (1)

Бурящий (ручей) 52 7.7 + (2)

Подводный грот 79 5.7 + (1)

Кухонный оз. Восьмёрка 51 5.9 + 0)

2012 Долина Гейзеров 58 5.7 + (6)

2009 91 7.9 -

2202 Португалия, остров Сан-Мигель 80 7.5 + (1)

2203 49 2 -

2205 66 6.5 + (2)

2209 74 5.7 + (2)

2210 61 6.5 -

2213 75 5.5 + (1)

Тф Зв 18 31 Bp К. 6р Р- 1.Г Кух 20 2 22 02 22 05 22 09 22 13

Methanosarcinales . — Methanosarcinac ----- -------ANME-2 eae

■Methanosaeta 3 D

ioo%-pMethermicoccus ai5%ir;~;ir— Unclassified Methanosartina les

Methanocellales — - Methanocellales ii

Methanomicrobiales Methanomicrobi з/es

mrtA . Methanobacterium mrtA И

iaG%? Methanothermobacter mrtA

~ Methanosphaera mrtA S3'4. .. ^ Methanocaldococcus mrtA

Methanococcales Methanococcales

Methano-bacteriales ____,,„..--------------- Methanobacterium & Methanobrevibacter и 1

W Methanothermobacter 11

Methanothermus

39<- Methanopyrales reostES*— ANME-1 i inn ilh irpH m ».«gss^ Lost City group

0.10 9?s ....... - ................ MCR-2C ......MCR-2a Тф Зе 18 31 5р к. Брр.г. P-I (ухйОЁ2 р2|02 22 05 22 09 22 13

Рисунок 8. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей а субъединицы метил-коэнзим М редуктазы, полученных в ходе исследования наземных горячих источников. Дерево построено в программе ARE с использованием алгоритма maximum likelihood и bootstrap анализа (100 повторов, значения ниже 50% не показаны). Справа в виде таблицы черными квадратами обозначена положительная детекция групп в образцах, цифрами внутри квадратов обозначено количество ОТЕ.

3S s

о и ь и

О) У X

к ¡2

1 х 10 1x10® 1 х ю7 1х106 1 х 105 1 х 104 1х103 1 х 102 1 х 101 1x10°

1 1 |—ЭЕ-1 И с П '

I Бактериальная 16S рРНК

I mcrА

2012 Термофильный Заварзина

Рисунок 9. Количество копий генов бактериальной 16Б рРНК, архейной 16в рРНК и тсгА в расчете на 1 нг выделенной ДНК с указанием интервала стандартного отклонения. Характеристики калибровочных кривых: Я2>0.997, эффективность от 70% до 99%.

Источник 2012 был выбран для оценки соотношения различных групп метаногенов и для определения состава архейной популяции в целом. Для этого были сконструированы библиотеки клонов генов тег А и 16S рРНК. Результаты секвенирования библиотек клонов показали доминирование некультивируемых микроорганизмов кластера MCR-2c (по гену тсгА) и некультивируемых микроорганизмов кластеров pSL12 и THSCG (по гену 16S рРНК). Соотношение выявленных таксономических групп представлено на Рис. 10.

Для оценки разнообразия метаногенов в горячем источнике 2012 на основе культурального подхода использовались различные вариации параметров накопительных культур: температура от 55 до 70 °С, рН от 5.0 до 7.5 и ряд субстратов: Н2/С02, формиат, ацетат, метанол, пропионат. Во всех случаях использовали среду DSM №203 (Methanothermus fervidus medium). В итоге было получено пять стабильных накопительных культур (Табл. 4). Для идентификации метаногенов в накопительных культурах были амплифицированы, разделены с помощью ДГГЭ и секвенированы гены тег А и 16S рРНК. Было идентифицировано три метаногенных микроорганизма, отнесенных к родам Methanothermobacter, Methanosaeta, Methanomethylovorans (Рис. 11; Табл. 4).

В метано генной накопительной культуре на метаноле, полученной при 65 °С и рН 7.0 (2012-MDEC65) в качестве единственного метаногенного микроорганизма нами идентифицирован представитель вида Methanothermobacter thermautotrophicus. Представители рода Methanothermobacter могут использовать только Н2/ С02 и в некоторых случаях формиат в качестве метаногенных субстратов. Микроскопия культуры 2012-MDEC65 помимо характерных для рода Methanothermobacter относительно тонких и длинных палочек выявила также большое количество коротких и относительно широких палочек, морфология которых не характерна представителям рода Methanothermobacter.

Рисунок 10. Соотношение филогенетических групп в библиотеках последовательностей тенатсгА (А) и гена архейной 16Б рРНК (В) горячего источника 2012.

Таблица 4. Метаногенные накопительные культуры (горячий источник 2012).

МСЯ-2а

■ МСЯ-2с

■ МеЛапоЬас1ег1а1е$ тег А

■ МеЛапозаега

■ р8Ь12

■ ТЬегторго1е1 ОБЕй

■ ТШСй

я БАОМЕО

■ АЖ06-05

и МеЛапо8ае1а

■ ТМСй

■ ОРРБООЗ

Культура Тем., °С рН Субстрат* Ближайший культивируемый метаноген. Процент сходства по гену тсгА Процент сходства по гену 168 рРНК.

2012-НТЕС 60°С 6.5 Н2/СО2 МеАапоАегтоЬаМег гкегтаиЮ^орЫсш. 97% 99%

2012-РКЕС 60°С 6.5 Формиат МейктогНегтоЬаМег ЛегтаШо^орЫсш. 97% 99%

2012-АСЕС 55°С 6.0 Ацетат Ме1Ьапо5ае1а ЛегторИИа 88% 98,2%

МеЛапоЖегтоЬаМег ЛегтаШо^орЫсия. 97% 99%

2012-МОЕС55 55°С 7.0 Метанол Ме1кагюте1ку1тогат ЛегторЫ1а 99% Н. О.

2012-М1ЭЕС65 65°С 7.0 Метанол Ме1Иапо1кегтоЬас1ег 1кегтаиШгорЫси$. 97% 99%

* 1. Концентрация вносимого субстрата - 20мМ для жидких субстратов, 14.5 ммоль/л для водорода.

В результате идентификации бактериальной составляющей культуры 2С МБЕС65 с помощью амплификации, ДГГЭ и секвенирования гена 168 рРНК 61 установлено, что основной бактериальный филотип данной культуры отдале: родственен микроорганизмам родов Thermacetogemum и $уп(горкасеПст. Даш микроорганизм имеет 90% сходства к Thermacetogenium ркаеит и 89% сходств БупиоркасеИсиь БсЫпки по гену 16Б рРНК (Рис. 12).

Рисунок 11. Накопительные метаногенные культуры. Световая микроскопия. Шкала 10 мкм.

- EF422412_Dethiobacter_alkaliphilus

GQ377474_methanogenic_phenol-degrading enr. cul.

GU984540...anoxic...rice,,,fieid.,soil

j EF559057_thermophiiic_anaerobic digester 100% "- EU3861 B2_Syntrophaceticus_schinkii

EF586069_digester_fed_wilh„methano! N R_024688_ Thermacetogeniurn_phaeum

J,.Q.Q%. I FJ638539_hot_spring_sediment OQQ97678 oil field

12012_MDEC65_Bac

Рисунок 12. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа последовательностей гена бактериальной 16S рРНК, построенное в программе ARB с использованием алгоритма maximum likelihood и bootstrap анализа (100 повторов, значения ниже 50% не показаны). Черным квадратом обозначен идентифицированный бактериальный филотип метанол-использующей метаногенной накопительной культуры 2012-MDEC65

Результаты проведенного анализа показали, что ген метил-коэнзим М редуктазы присутствует в микробных сообществах большого количества наземных горячих источников: в данном исследовании он был выявлен в 75% образцов горячих источников. При этом результаты, полученные с использованием количественной ПЦР, свидетельствуют о низкой численности метаногенов в исследованных источниках. В ходе данной работы представители ряда филогенетических групп метаногенов: MCR-2a, MCR-2c, Methanocellales, Methanomethylovorans, - впервые были детектированы в наземных горячих источниках.

Микроорганизмы, представляющие порядки культивируемых метаногенов (Methanosarcinales, Methanocellales и Methanobacteriales), обнаружены лишь в некоторых горячих источниках (в 4 из 12 источников с положительным mcrА сигналом), тогда как представители некультивируемого кластера MCR-2a были выявлены в каждом источнике с положительным результатом амплификации гена mcr А.

Только в одном случае два разных подхода - культуральный и молекулярный -дали сходные результаты при оценке разнообразия метаногенов в горячих источниках. В библиотеках по гену тег А и по гену 16S рРНК был детектирован тот

же филотип рода Methanosaeta, что и в накопительной культуре 2012-АСЕС. Основываясь на уровне сходства к Methanosaeta thermophila по гену тег А и по гену 16S рРНК, полученный нами в виде накопительной культуры микроорганизм может представлять новый вид рода Methanosaeta. В обеих библиотеках филотипы рода Methanosaeta были представлены значительным количеством последовательностей (21% для библиотеки по гену тег А и 9% для библиотеки по гену 16S рРНК). Все выделенные на сегодняшний день микроорганизмы этого рода способны только к ацетокластическому метаногенезу. В проведенных ранее исследованиях (Ward & Olson, 1980; Sandbeck & Ward, 1981) на ряде горячих источников Йеллоустона было показано, что по сравнению с гидрогенотрофными метаногенами, активность ацетокластических метаногенов очень низкая или недектируемая. Полученные нами данные на примере источника 2012 свидетельствуют о значимости ацетокластических метаногенов в общем процессе метаногенеза в горячих источниках при умеренно высоких температурах.

Два других полученных в виде накопительной культуры метаногенных микроорганизма - Methanothermobacter thermautotrophicus и Methanomethylovorans thermophila - не были выявлены при использовании молекулярных подходов, что, вероятно, говорит о их низкой численности в микробном сообществе и приверженности к г-стратегии.

В данной работе удалось получить две метанол-использующие метаногенные культуры, осуществляющие этот процесс при двух различных температурных режимах: 55 и 65 °С. В первом случае метаногенез осуществлялся представителем рода Methanomethylovorans. Филотипы, относящиеся к данному роду, ранее не были детектированы в геотермальных экосистемах. Примечательно, что полученный нами из горячего источника Камчатки микроорганизм имеет сходство 99% по белок-кодирующему гену (тегА) к штамму, выделенному из метанол-использующего анаэробного реактора в Голландии. Во втором случае (65 °С) образование метана из метанола предположительно осуществлялось синтрофной культурой, состоящей из гидрогенотрофного метаногена, отнесенного к роду Methanothermobacter, и синтрофной бактерии, представляющей новую филогенетическую линию внутри семейства Thermoanaerobacteraceae (Рис. 12).

Одним из важных результатов данной работы можно считать масштабную реконструкцию филогении метаногенных и метанотрофных архей, проведенную с использованием более 6000 нуклеотидных последовательностей гена тег А. Это позволило упорядочить имеющийся на сегодняшний день значительный объем данных по детекции некультивируемых микроорганизмов на основе гена тег А, а также провести независимый от набора референсных последовательностей филогенетический анализ. Данная реконструкция показала, что кластеры некультивируемых архей MCR-2a и MCR-2c, которые в ходе данной работы впервые были детектированы в гидротермах, являются одними из наиболее глубоких и филогенетически обособленных ответвлений микроорганизмов, обладающих метил-коэнзим М редуктазой. Кластер MCR-2a представляет особый интерес, так как последовательности, отнесенные к этому филогенетическому ответвлению были выявлены не только во всех исследовавшихся горячих источниках с положительной амплификацией гена тег А, но также и в диффузных флюидах глубоководных

гидротермальных систем, что свидетельствует о широкой распространенности данного кластера в экосистемах, ассоциированных с геотермальной активностью. В ряде других исследований (данные получены при анализе базы данных СепЬапк) кластер МСЯ-2а был обнаружены в подземных экосистемах, грязевых вулканах, болотах и метантенках. Второй детектированный нами филогенетический кластер МСЯ-2с интересен в связи с тем, что последовательности именно этого глубокого ответвления архей значительно превалировали в клональной библиотеке гена тсгА источника 2012 (68%). Кластер МСЯ-2с также широко распространен в природе (данные получены при анализе базы данных СепЬапк). Он был детектирован в таких местах обитания как болота, метантенки, пищеварительные тракты животных, почвы, гиперсоленые и подземные экосистемы. Именно на характере распространения представителей кластеров МСЯ-2а и МСЯ-2с основана наша гипотеза о принадлежности этих микроорганизмов к метаногенным, а не к метанотрофным археям, так как перечисленные выше экотопы основываясь на литературных данных можно считать не характерными для анаэробных метанотрофных микроорганизмов. При анализе созданной реконструкции филогении гена тсгА, не было выявлено ни одного случая несоответствия между филогенетическим положением культивируемого метаногена на основе гена тсгА и на основе гена 16Б рРНК. Этот результат подтвердил отсутствие случаев горизонтального переноса гена тег А.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе с использованием гена метил-коэнзим М редуктазы (тсгА) в качестве функционального и филогенетического маркера на большой выборке образцов проведена оценка количества, распространения и разнообразия метаногенных микроорганизмов в диффузных гидротермальных флюидах нескольких районов Тихого океана. Показано, что метаногенные микроорганизмы относительно редко выявляются в диффузных флюидах глубоководных гидротерм и составляют незначительную часть микробной популяции. Эти данные позволяют предположить, что деятельность метаногенов не является основной причиной обеднения диффузных флюидов по водороду. Было выяснено, что в большинстве случаев доминирующими и наиболее распространенными метаногенами в данных экотопах являются представители порядка МеМапососсакБ, при этом характер метаногенной популяции в значительной степени зависит от концентрации водорода: во флюидах с высоким его содержанием метаногенное сообщество представлено культивируемыми гидрогенотрофными микроорганизмами родов МеМапосогризсиЫт, МмкапоЬЪегтососст, Ме&апосаМососст, МеЛапососсиз и Ме1капо1огг1$, а в диффузных флюидах с низким содержанием водорода существенная доля метаногенного сообщества (23 - 61%) представлена метилотрофными микроорганизмами родов Ме1Иапососсо1с/ез и Ме1У1егт1сосст, а также некультивируемыми микроорганизмами, субстратная специализация которых неизвестна.

При изучении архейной популяции с использованием гена 168 рРНК в качестве филогенетического меркера в большинстве образцов низкотемпературных

гидротермальных диффузных флюидов были выявлены филотипы термофильных микроорганизмов. Кроме того, результаты анализа образцов, собранных в разные годы, свидетельствуют о стабильности термальных анаэробных микрониш, образуемых диффузными выходами. Эти данные подтверждают предположения, что флюиды диффузных гидротерм образуют стабильные зоны с температурами, оптимальными для развития различных групп термофильных микроорганизмов.

Детальный анализ корреляции между Г+Ц составом гена 16Б рРНК и оптимальной температурой роста типовых штаммов архей, а также анализ Г+Ц состава более 900 нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК метанотрофных архей позволил выявить конкретную филогенетическую группу анаэробных метанотрофов (АИМЕ-ЮВа), представители которой наиболее вероятно являются экстремальными термофилами. В дальнейшей работе были разработаны, а также т-хШсо и экспериментально проверены системы праймеров, позволяющие с высокой степенью специфичности амплифицировать гены 16Б рРНК анаэробных метанотрофных архей кластера АЫМЕ-1, включая представителей группы АКМЕ-ЮВа. С помощью этих систем праймеров значительно расширены представления о распространении этих термофильных микроорганизмов.

С использованием культурального и молекулярно-экологического подходов проведена оценка распространения и разнообразия метаногенных микроорганизмов в наземных горячих источниках. Осуществлена количественная оценка структуры микробного сообщества трех горячих источников. Показано, что метаногенные микроорганизмы присутствуют в большинстве наземных горячих источников, составляя при этом незначительную часть микробной популяции. Существенно расширены представления о разнообразии метаногенов в данных экотопах: впервые для наземных горячих источников показано присутствие метаногенов таких филогенетических групп как МСЯ-2с, Ме1капосе11а1ез, Ме1капоте1ку1оуогат и МСЯ-2а. Кластер МСЯ-2а представляет особый интерес, так как последовательности, отнесенные к этому глубокому филогенетическому ответвлению, были выявлены не только в большинстве горячих источниках, но также и в диффузных флюидах глубоководных гидротерм. Это свидетельствует о широком распространении данного кластера в экосистемах, ассоциированных с геотермальной активностью.

В результате использования культурального подхода был получен ряд накопительных культур, метаногены в которых были представлены микроорганизмами родов Ме1капо!кегтоЬас1ег, Ме(Иап05ае1а,

Ме{капоте1куШогапз. Две метанол-использующие накопительные культуры, были способны осуществлять метаногенез при различных температурных режимах. Эти культуры могут представлять интерес для биотехнологической очистки сточных вод целлюлозных производств.

выводы

1. На большой выборке образцов показано, что метаногенные микроорганизмы относительно редко выявляются в диффузных флюидах глубоководных гидротермальных систем и составляют незначительную часть микробной популяции. В большинстве случаев доминирующими и наиболее распространенными метаногенами в данных экотопах являются представители порядка Methanococcales.

2. Установлено, что в диффузных гидротермальных флюидах с высоким содержанием водорода метаногеное сообщество представлено культивируемыми гидрогенотрофными микроорганизмами родов Methanocorpusculum, Methanothermococcus, Methanocaldococcus, Methanococcus и Methanotorris. В диффузных гидротермальных флюидах с низким содержанием водорода существенная доля метаногеного сообщества (23 - 61%) представлена метилотрофными микроорганизмами родов Methanococcoides и Methermicoccus, а также некультивируемыми микроорганизмами, субстратная специализация которых неизвестна.

3. На примере образцов сайта Marker 113 разных годов была продемонстрирована стабильность метаногенной популяции. При анализе мРНК образцов сайта Marker 113 была выявлена жизнеспособная популяция представителей порядка Methanococcales, которая существует при субоптимальной концентрации водорода.

4. Определено, что значение Г+Ц состава 16S рРНК выше 60% позволяет обоснованно прогнозировать адаптацию к высоким температурам некультивируемых групп архей.

5. Получены веские доказательства существования экстремально термофильных метанотрофных архей (группа ANME-lGBa). Показано присутствие данных микроорганизмов в различных гидротермальных сайтах.

6. Показано, что метаногенные микроорганизмы присутствуют в большинстве наземных горячих источников с температурным диапазоном 51-89°С, составляя при этом незначительную часть микробной популяции.

7. Впервые для наземных горячих источников показано присутствие представителей филогенетических групп метаногенов MCR-2c, Methanocellales и Methanomethylovorans и MCR-2a, являющейся из них наиболее распространенной. Выявленное разнообразие культивируемых метаногенов сводится к представителям родов Methanothermobacter, Methanosaeta, Methanomethylovorans.

8. Проведена масштабная филогенетическая реконструкция метаногенных и метанотрофных архей на основе гена тсгА, подтверждающая глубокое обособленное положение кластеров MCR-2a и MCR-2c. Подтверждено отсутствие случаев горизонтального переноса гена тег А.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Экспериментальные статьи

1. Меркель А.Ю., Черных Н.А., Канапатский Т. А., Пименов Н.В. Детекция метанотрофных архей в осадках покмарка (Гданьская впадина, Балтийское море) путем анализа последовательностей гена, кодирующего а-субъединицу метил-коэнзим М редуктазы. Микробиология, 2010, Т. 79, № 6, С. 852-855.

2. Nolla-Ardevol V., Strous М., Sorokin D.Y., Merkel A.Y., Tegetmeyer H.E. Activity and diversity of haloalkaliphilic methanogens in Central Asian soda lakes. J. Biotechnol. 2012. V. 161(2). P. 167-173.

3. Ver Eecke H.C., Butterfield D.A., Huber J.A., Lilley M.D., Olson E.J., Roe K.K., Evanse L.J., Merkel A.Y., Cantin H.V., Holden J.F. Hydrogen-limited growth of hyperthermophilic methanogens at deep-sea hydrothermal vents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109(34). P. 13674-13679.

4. Merkel A.Y., Huber J.A., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Lebedinsky A.V. Detection of putatively thermophilic anaerobic methanotrophs (ANMEs) in diffuse hydrothermal vent fluids. Appl. Environ. Microbiol. 2013. V. 79(3). P. 915-923.

Тезисы конференций

1. Huber J.A., Merkel A.Y., Holden J.F., Lilley M.D., Butterfield D.A. Molecular Diversity and Activity of Methanogens in the Subseafloor at Deep-Sea Hydrothermal Vents of the Pacific Ocean. AGU Fall Meeting. San Francisco (USA), December, 2009. Book of abstracts, P. 243-244.

2. Merkel A.Y., Sokolova T.G., Bonch-Osmolovskaya E.A., Chernych N.A. Assessment of methanogens diversity in hot springs of Uzon Caldera, Kamchatka (Russia) using molecular and cultural approaches. The International Workshop "Biodiversity, molecular ecology and biogeochemistry of thermophiles". Petropavlovsk-Kamchatsky (Russia), August, 2010. Book of abstracts, P. 26.

3. Merkel A.Y., Chernych N.A., Kanapatsky T.A., Pimenov N.V. Detection of methanotrophic archaea in pockmark sediments (Gdansk deep, Baltic sea) by sequence analisis of the gene encoding methyl-coenzyme M reductase a-subunit. 10th International Conference on Gas in Marine. Lake Baikal (Russia), September, 2010. Book of abstracts, P. 128-129. .

4. Меркель А.Ю., Хубер Дж.А. Филогенетическое разнообразие, распространенность и экспрессия функциональных генов метаногенеза во флюидах глубоководных гидротермальных систем. VII Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные апекты современной микробиологии». Москва (Россия), Октябрь, 2011. Сборник тезисов, С. 84-85.

5. Chernykh N.A., Merkel A.Y., Miroshnichenko M.L., Lebedinsky A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. Characterization of microbial communities in thermal springs of Uzon caldera, Kamchatka by analysis 16S rRNA and metabolic genes. International conference «Ecology and geochemical activity of microorganisms of extreme environments». Ulan-Ude (Russia) and Ulaanbaatar (Mongolia), September, 2011. Book of abstracts, P. 185187.

6. Merkel A.Y., Huber J.A., Lebedinsky A.V. Detection of putatively thermophilic methanotrophic archaea by using new primer systems. 9th International congress on extremophiles. Sevilla (Spain), September, 2012. Book of abstracts, P. 141.

Подписано в печать 15.01.2013 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1628. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,2.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Меркель, Александр Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ. 4 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Метаногенные и метанотрофные археи. Их роль в экосистеме Земли.

1.1. Метан. И

1.2. Метаногенные археи.

1.2.1. Метаногенез. Роль и структура Метилкоэнзим Мредуктазы.

1.2.2. Таксономия и филогения мепгапогенпых архей.

1.2.3. Экология мешаногенных архей.

1.3. Археи, анаэробно окисляющие метан.

1.3.1. Анаэробное окнсление метана.

1.3.2. Разнообразие и распространение метанотрофных архей.

Глава 2. Молекулярный подход в экологии метаногенных и метанотрофных архей.

Глава 3. Гидротермы, как среда обитания микроорганизмов.

3.1. Глубоководные гидротермальные выходы.

3.2. Наземные горячие источники.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.1. Характеристика мест отбора проб.

1.1.1. Диффузные гидротермальные выходы

Тихого океана.

1.1.2. Наземные горячие источники Камчатки и острова Сан-Мигель.

1.1.3. Отбор образцов.

1.2. Молекулярные методы

1.2.1. Выделение нуклеиновых кислот.

1.2.2. Электрофорез в агарозном геле.

1.2.3. ПЦР.

1.2.4. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез.

1.2.5. Клонирование.

1.2.6. Количественная ПЦР.

1.2.7. Секвенирование.

1.3. Методы т-яШсо.

1.3.1. Первичный анализ полученных последовательностей.

1.3.2. Построение филогенетических деревьев.

1.3.3. Анализ корреляции между относительным содержанием Г+Ц пар гена 168рРНК и температурным оптимумом роста архей.

1.3.4. Анализ относительного содержания Г+Ц пар гена 16БрРНК филотипов анаэробных метатрофных архей.

1.3.5. Разработка и проверка специфичности праймеров на кластер АЫМЕ-1.

1.4. Культуральные методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ?

Глава 1. Молекулярный анализ микроорганизмов диффузных флюидов глубоководных гидротерм на основе гена тег А и 16S рРНК.

Глава 2. Детекция термофильных метанотрофных архей с помощью новых систем праймеров.

Глвава 3. Оценка разнообразия, распространения и численности метаногенных архей в наземных горячих источниках на основе молекулярных и культуральных подходов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная экология метаногенных и метанотрофных архей гидротермальных мест обитания"

Актуальность проблемы. Процессы образования и окисления метана -это количественно значимые компоненты глобального цикла углерода на Земле и, по-видимому, они являлись таковыми на протяжении всего времени существования биосферы нашей планеты. Тем не менее, далеко не все филогенетические группы микроорганизмов, образующих и окисляющих метан, изучены в достаточной степени.

Процессы метаногенеза и сульфатзависимого окисления метана осуществляются археями, объединенными в родственные группы микроорганизмов, относящихся к типу Euryarchaeota (Strous & Jetten, 2004). Эти микроорганизмы широко распространены в природе, где метаногенные археи осуществляют терминальный этап в процессе анаэробного разложения органического вещества в условиях отсутствия высокопотенциальных акцепторов электронов, тогда как метанотрофные археи в составе синтрофных ассоциаций и при наличии сульфата осуществляют анаэробное окисление метана (Whitman et ai, 2006; Knittel & Boetius, 2009).

Использование гена 16S pPHI< для детекции и идентификации метаногенных и метанотрофных архей в сложных микробных сообществах затруднено, поскольку обе эти физиологические группы не являются монофилетичными (Bapteste et al., 2005; Knittel & Boetius, 2009). В связи с этим внимание ряда исследователей было обращено на ген метил-коэнзим М редуктазы (mcrA) (Springer et ai, 2005; Hales et ai, 2006). Результаты, полученные во многих работах подтвердили эффективность использования данного функционального и филогенетического маркера для оценки разнообразия и распространения метаногенных и метанотрофных архей (Luton et ai, 2002; Hallam et ai, 2003).

В экосистемах, ассоциированных с геотермальной активностью, где водород и метан образуются в результате высокотемпературных абиотических реакций, метаногенные и метанотрофные археи способны выполнять роль 4 первичных продуцентов. Для некоторых термальных экотопов, таких как нефтяные месторождения, гидротермальные осадки, «черные курильщики», уже проведен ряд исследований по разнообразию и распространению метаногенных, а в некоторых случаях и метанотрофпых архей (Тезке е/ а1., 2002; ЭЫИоп е* а1., 2005; ^ап^оп еГ а!., 2005; МНгоБЬшсЬепко & ВопсЬ-ОБгшЯоузкауа, 2006; ОПшег & Сауо1. 2010). Настоящее исследование посвящено слабо изученным в этом отношении экотопам: диффузным глубоководным гидротермальным выходам и наземным горячим источникам.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования была молекулярная детекция, идентификация и количественная оценка метаногенных и метанотрофных архей в гидротермальных экосистемах и реконструкция филогении этих групп микроорганизмов на основании общего функционального и филогенетического маркера - гена а субъединицы метил-коэнзим М редуктазы {тегА).

Основные задачи исследования состояли в следующем:

2. Создание масштабной реконструкции филогении метаногенных и метанотрофных архей на основе гена а субъединицы метил-коэнзим М редуктазы (тсгА) с использованием обширной и современной базы данных.

3. Выявление из всего многообразия метанотрофных архей конкретных филогенетических групп, для представителей которых прогнозируется адаптация к высоким температурам.

4. Разработка систем праймеров детекции термофильных групп метанотрофных архей.

Научная новизна и значимость работы. Впервые на большой выборке образцов проведена оценка количества и распространения метаногенных микроорганизмов в диффузных гидротермальных флюидах нескольких районов Тихого океана. Значительно расширены представления о разнообразии метаногенов в данных экотопах. Выявлена взаимосвязь между содержанием водорода в диффузных гидротермальных флюидах и характером метаногепной популяции этих флюидов.

Получены доказательства существования экстремально термофильных метанотрофных архей, а также получены данные об их распространении.

Проведена масштабная реконструкция филогении метаногенных и метанотрофных архей. По результатам анализа полученных данных, случаев горизонтального переноса гена тсгА выявлено не было.

Разработаны, а также in-silico и экспериментально проверены системы праймеров, позволяющие с высокой степенью специфичности амплифицировать гены 16S рРНК анаэробных метанотрофных архей кластера ANME-1, включая термофильные микроорганизмы этого кластера.

Получена стабильная синтрофная метанол-использующая метаногенная накопительная культура, растущая при 65"С, представляющая интерес для очистки сточных вод целлюлозных производств.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на международных конференциях «AGU Fall Meeting 2009», «Biodiversity, molecular ecology and biogeochemistry of thermophiles - 2010», «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний 2011», на Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии - 2011» и на на международной конференции «9th international congress on extremophiles - 2012».

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 160 страницах машинописного текста и включает 20 рисунков и 10 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и обсуждение, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 324 наименования.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Меркель, Александр Юрьевич

выводы

1. На большой выборке образцов показано, что метаногенные микроорганизмы относительно редко выявляются в диффузных флюидах глубоководных гидротермальных систем и составляют незначительную часть микробной популяции. Показано, что в большинстве случаев доминирующими и наиболее распространенными метаногенами в данных экотопах являются представители порядка Methanococcales.

2. Установлено, что в диффузных гидротермальных флюидах с высоким содержанием водорода метаногеное сообщество представлено культивируемыми гидрогенотрофными микроорганизмами родов Methanocorpuscuhun, Methanothermococcus, Methanocaldococcus, Methanococcus и Methanotorris. В диффузных гидротермальных флюидах с низким содержанием водорода существенная доля метаногеного сообщества (23 - 61%) представлена метилотрофными микроорганизмами родов Methanococcoides и Methermicoccus, а также представителями филогенетических кластеров некультивируемым форм, субстратная специализация которых неизвестна.

5. Получены доказательства существования экстремально термофильных метанотрофных архей (группа ANME-lGBa). Показано присутствие данных микроорганизмов в различных гидротермальных сайтах.

7. Впервые для наземных горячих источников показано присутствие представителей филогенетических групп метаногенов МСЯ-2с, Ме1капосе11а1ех и Ме1Напоте1Ьу1о\огап8 и МСЫ-2а, являющейся из них наиболее распространенной. Выявленное разнообразие культивируемых метаногенов сводится к представителям родов МеМапоМегтоЬаЫег, МеЖапо$ае1а, МеМапотеМуЬуогат.

8. Проведена масштабная филогенетическая реконструкция метаногенных и метан отрофных архей на основе гена тег А, подтверждающая глубокое обособленное положение кластеров МСЯ-2а и МСЯ-2с. По результатам анализа полученных данных, случаев горизонтального переноса гена тсгА выявлено не было.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе с использованием гена метил-коэнзим М редуктазы {тегА), в качестве функционального и филогенетического маркера, на большой выборке образцов проведена оценка разнообразия, количества и распространения метаногенных микроорганизмов в диффузных гидротермальных флюидах нескольких районов Тихого океана. Показано, что метаногенные микроорганизмы относительно редко выявляются в диффузных флюидах глубоководных гидротерм и составляют незначительную часть микробной популяции. Эти данные позволяют предположить, что деятельность метаногенов не является основной причиной обеднения диффузных флюидов по водороду. Было выяснено, что в большинстве случаев доминирующими и наиболее распространенными метаногенами в данных экотопах являются представители порядка МеШапососсакз, при этом характер метаногенной популяции в значительной степени зависит от концентрации водорода: во флюидах с высоким его содержанием метаногенное сообщество представлено культивируемыми гидрогенотрофными микроорганизмами родов МеИгапосогршсикип, Ме(Напо1кегтососст, МеМапосаМососсиз, МеШапососсия и МеШапоШгпБ, а в диффузных флюидах с низким содержанием водорода существенная доля метаногенного сообщества (23 - 61%) представлена метилотрофными микроорганизмами родов Ме1}шпососсо1с1еа и МеШептсоссгю, а также некультивируемыми микроорганизмами, субстратная специализация которых неизвестна.

При изучении архейной популяции с использованием гена 168 рРНК в качестве филогенетического меркера в большинстве образцов низкотемпературных гидротермальных диффузных флюидов были выявлены филотипы термофильных микроорганизмов. Кроме того, результаты анализа образцов, собранных в разные годы, свидетельствуют о стабильности термальных анаэробных микрониш, образуемых диффузными выходами. Эти данные подтверждают предположение, что флюиды диффузных гидротерм

119 образуют стабильные зоны с температурами, оптимальными для развития различных групп термофильных микроорганизмов.

Детальный анализ корреляции между Г+Ц составом гена 168 рРНК и оптимальной температурой роста типовых штаммов архей, а также анализ Г+Ц состава более 900 нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК метанотрофных архей позволил выявить конкретную филогенетическую группу анаэробных метанотрофов (АМуЕЕ-ЮВа), представители которой наиболее вероятно являются экстремальными термофилами. В дальнейшей работе были разработаны, а также т-яШсо и экспериментально проверены системы праймеров, позволяющие с высокой степенью специфичности амплифицировать гены 16Б рРНК анаэробных метанотрофных архей кластера АКМЕ-1, включая представителей группы АКМЕ-ЮВа. С помощью этих систем праймеров значительно расширены представления о распространении этих термофильных микроорганизмов.

С использованием культурального и молекулярно-экологического подходов на большой выборке образцов проведена оценка распространения и разнообразия метаногенных микроорганизмов в наземных горячих источниках. Осуществлена количественная оценка структуры микробного сообщества трех горячих источников. Показано, что метаногенные микроорганизмы присутствуют в большинстве наземных горячих источников, составляя при этом незначительную часть микробной популяции. Существенно расширены представления о разнообразии метаногенов в данных экотопах: впервые для наземных горячих источников показано присутствие метаногенов таких филогенетических групп как МСЯ-2с, МеОгапосеЦЫех, Ме1капоте1ку1олюгат и МСК-2а. Кластер МС11-2а представляет особый интерес, так как последовательности, отнесенные к этому глубокому филогенетическому ответвлению, были выявлены не только в большинстве горячих источниках, но также и в диффузных флюидах глубоководных гидротерм. Это свидетельствует о широком распространении представителей данного кластера в экосистемах, ассоциированных с геотермальной активностью.

120

В результате использования культурального подхода был получен ряд накопительных культур, метаногены в которых были представлены микроорганизмами родов Ме1капо1кегтоЪас1ег, Ме1капо8ае1а,

Ме1\1апоте0гу1оуогат. Две метанол-использующие накопительные культуры, были способны осуществлять метаногенез при различных температурных режимах. Это может представлять интерес для очистки сточных вод целлюлозных производств.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Меркель, Александр Юрьевич, Москва

1. Alain K., Holler T., Musat K, Elvert M., Treude T., Kruger M. Microbiological investigation of methane- and hydrocarbon-discharging mud volcanoes in the Carpathian Mountains, Romania// Environ. Microbiol. 2006. V. 8. P. 574-590.

2. Alain K., Querellon J. Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges // Extremophiles. 2009. V. 13(4). P. 583-94.

3. Alperin M.J., Hoehler T.M. The ongoing mystery of sea-floor methane // Science. 2010. V. 329. P.288-289.

4. Alperin M.J., Hoehler T.M. Anaerobic methane oxidation by archaea/sulfate-reducing bacteria aggregates. Thermodynamic and physical constraints // Am. J. Sci. 2009. V. 309. P. 869-957.

5. Amann R.I., Ludwig W., Sehleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiological Reviews. 1995. V. 59. P. 143-169.

6. Armougom E, Henry M., Vialettes B., Raeeah D., Raoult D. Monitoring bacterial community of human gut microbiota reveals an increase in Lactobacillus in obese patients and methanogens in anorexic patients // PLoS ONE. 2009. V. 4. P. e7125.

7. Badr O., Probert S.D., O'Callaghan P.W. Atmospheric methane: Its contribution to global warming // Applied Energy. 1991. V. 40(4). P. 273-313.

8. Baker E.T., Embley R. W., Walker S.L., Resing J.A., Lupton J.E., Nakamwa K., de Ronde C.E.J., Massoth G.J. Hydrothermal activity and volcano distribution along the Mariana arc // J. Geophys. Res. 2008. V. 113. P. B08S09.

9. Baker E.T., Massoth G.J. Characteristics of hydrothermal plumes over twovent fields on the Juan de Fuca Ridge, northeast Pacific Ocean // Earth Planet.124

10. Sci. Lett. 1987. V. 85. P. 59-73.

11. Baldwin B.R., Nakatsu C.H., Nies L. Detection and enumeration of aromatic oxygenase genes by multiplex and real-time PCR 11 Appl. Environ. Microb. 2003. V. 69. P. 3350-3358.

12. Baldwin B.R., Nakatsu C.H., Nies L. Enumeration of aromatic oxygenase genes to evaluate monitored natural attenuation at gasoline-contaminated sites // Water Res. 2008. V. 42. P. 723-731.

13. Banning N., Brock F, Fry J.C., Parkes R.J., Hornibrook E.R.C., Weightman A.J. Investigation of the methanogen population structure and activity in a brackish lake sediment. Environ Microbiol // 2005. V. 7. P. 947-960.

14. Bapteste E., Brochier C., Boucher Y. Higher-level classification of the Archaea: evolution of methanogenesis and methanogens // Archaea. 2005. V. l.P. 353-363.

15. Barnes R.O., Goldberg E.D. Methane production and consumption in anoxic marine sediments // Geology. 1976. V. 4. P. 297-300.

16. Baross J.A., Hoffman S.E. Submarine hydrothermal vents and associated gradient environments as sites for the origin and evolution of life // Naval. Res. Rev. 1986. V. 38. P. 2-12

17. Beal E.J., House C.H., Orphan V.J. Manganese- and iron-dependent marine methane oxidation// Science. 2009. V. 325. P. 184-187.

18. Bemis K., Lowell R.P, Farough A. Diffuse flow on and around hydrothermal vents at mid-ocean ridges // Oceanography. 2012. V. 25(1). P. 182-191.

19. Biddle J.F., Cardman Z., Mendlovitz H., Albert D.B., Lloyd K.G., Boetius A., Teske A. Anaerobic oxidation of methane at different temperature regimes in Guaymas Basin hydrothermal sediments // ISME J. 2012. V. 6(5). P. 10181031.

20. Blake D.R., Rowland F.S. Continuing worldwide increase in tropospheric methane, 1978-1987//Science. 1988. V. 239. P. 1129-31.

21. Blank C.E., Cady S.L., Pace N.R. Microbial composition of near-boiling silica-depositing thermal springs throughout Yellowstone National Park // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 5123-5135.

22. Bloomer S.H., Stern R.J., Smoot N.C. Physical volcanology of the submarine Mariana and Volcano arcs // Bull. Volcanol. 1989. V. 51. P. 210-224.

23. Boetius A., Holler T., Knittel K., Felden J., Wenzhofer F. The seabed as natural laboratory: lessons from uncultivated methanotrophs // Microbiology Monographs. 2009. V. 10. P. 293-316.

24. Boetius A., Ravenschlag K., Schubert C.J., Rickert D., Widdel F, Gieseke A., Amann R., Jorgensen B.B., Witte U., Pfannkuche O. A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane // Nature. 2000. V. 407(6804). P. 623-626.

25. Brazelton W.J., Schrenk M.O., Kelley D.S., Baross JA. Methane- and sulfur-metabolizing microbial communities dominate the Lost City hydrothermal field ecosystem//Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72(9). P. 6257-6270.

26. Brochier C„ Forterre P., Gribaldo S. An emerging phylogenetic core of Archaea: phylogenies of transcription and translation machineries converge following addition of new genome sequences // BMC Evol. Biol. 2005. V. 2. P.

27. Brochier-Armanet C., Boussau B., Gribaldo S., Forterre P. Mesophilic Crenarchaeota: proposal for a third archaeal phylum, the Thaumarchaeota // Nat. Rev. Microbiol. 2008. V. 6(3). P. 245-252.

28. Brock T.D. Thermophiles: General, molecular and applied microbiology New York: John Wiley and Sons, 1986.

29. Buchholz-Cleven B.E.E., Rattunde B. Straub K.L. Screening for genetic diversity of isolates of anaerobic Fe(II)-oxidizing bacteria using DGGE and whole-cell hybridization // Syst. Appl. Microbiol. 1997. V. 20. P. 301-309.

30. ButterfieldD.A., McDuff R.E., Mottl M.J., Lilley M.D., Lupton J.E. Massoth G. J. Gradients in the composition of hydrothermal fluids from the Endeavour segment vent field: phase separation and brine loss // J. Geophys. Res. 1994. V. 99. P. 9561-9583.

31. Caldwell S.L., Laidler J.R., Brewer E.A., Eberly J.O., Sandborgh S.C., Colwell F.S. Anaerobic oxidation of methane: mechanisms, bioenergetics, and the ecology of associated microorganisms // Environ. Sci. Technol. 2008. V. 42. P. 6791-6799.

32. Casamayor E.O., Massana R., Benlloch S., Ovreas L., Diez B., Goddard V.J.

33. Changes in archaeal, bacterial and eukaryal assemblages along a salinitygradient by comparison of genetic fingerprinting methods in a multipond solar127saltern // Environ. Microbiol. 2002. V. 4. P. 338-348.

34. Catling D.C., Zahnle K.J., McKay C.P. Biogenic methane, hydrogen escape, and the irreversible oxidation of early Earth // Science. 2001. V. 293. P. 839843.

35. Chaban B., Ng S.Y.M., Jarrell K.F. Archaeal habitats from the extreme to ordinary // Can. J. Microbiol. 2006. V. 52. P. 73-116.

36. Chistoserdova L., Vorholt J.A., Lidstrom M.E. A genomic view of methane oxidation by aerobic bacteria and anaerobic archaea // Genome Biol. 2005. V. 6(2). P. 208.

37. Colwell F.S., Boyd S., Delwiche M.E., Reed D.W., Phelps T.J., Newby D.T. Estimates of biogenic methane production rates in deep marine sediments at Hydrate Ridge, Cascadia margin // Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 3444-3452.

38. Conrad R. The global methane cycle: recent advances in understanding the microbial processes involved // Environmental Microbiology Reports. 2009. V. 1(5). P. 285-292.

39. Cord-Ritwisch R., Ollivier B. Interspecies hydrogen transfer during methanol degradation by Sporomusa acidovorans and hydrogenotrophic anaerobes // Arch. Microbiol. 1986. V. 144. P. 163-165.

40. Cruse A.M., Seewald J.S. Low-molecular weight hydrocarbons in vent fluids from the Main Endeavour Field, northern Juan de Fuca Ridge // Geochimica et Cosmochimica Acta. 2010. V. 74. P. 6126-6140.

41. Dahle H., Garshol E, Madsen M., Birkeland N.-K. Microbial community structure analysis of produced water from a high-temperature North Sea oilfield //Anton Leeuwenhoek. 2008. V. 93. P. 37^19.

42. Delaney J.R., McDuff R.E., Lupton J.E. Hydrothermal fluid temperatures of128400°C on the Endeavour Segment, northern Juan de Fuca // Eos. Trans. AGU 1984. V. 65. P. 973.

43. Delaney J.R., Robigou V., McDuff R.E., Tivey M.K. Geology of a vigorous hydrothermal system on the Endeavour Segment, Juan de Fuca Ridge // J. Geophys. Res. 1992. V. 97(B13). P. 19663-19682.

44. Denman S.E., Tomkins N., MeSweeney C.S. Quantitation and diversity analysis of ruminal methanogenic populations in response to the antimethanogenic compound bromochloromethane // FEMS Microbiol. Ecol. 2007. V. 62. P. 313322.

45. Deppenmeier U. The membrane-bound electron transport system of Methanosarcina species 11 J. Bioenerg. Biomembr. 2004. V. 36. P. 55-64.

46. Deppenmeier U., Lienard T., Gottschalk G. Novel reactions involved in energy conservation by methanogenic archaea // FEBS Lett. 1999. V. 457. P. 291-297.

47. Ding X., Yang W.J., Min H„ Peng X.T., Zhou H.Y., Lu Z.M. Isolation and characterization of a new strain of Methanothermobacter marburgensis DX01 from hot springs in China//Anaerobe. 2010. V. 16(1). P. 54-59.

48. Diviacco S., Norio P., Zentilin L., Menzo S., Clementi M, Biamonti G., Riva S., Falasehi A., Giacca M. A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by co-amplification of competitive templates // Gene. 1992. V. 122. P. 313-320.

49. Don R.H., CoxPT., Wainwright B.J., Baker K., Mattick J.S. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19(14). P. 4008.

50. Dziak R.P., C.G. Fox. The January 1998 earthquake swarm at Axial Volcano, Juan de Fuca Ridge: Hydroacoustic evidence of seafloor volcanic activity // Geophysical Research Letters. 1999. V. 26(23). P. 429-433.

51. Einen J., Thorseth I.H., Ovreas L. Enumeration of Archaea and Bacteria in seafloor basalt using real-time quantitative PCR and fluorescence microscopy //FEMS Microbiol Lett. 2008. V. 282. P. 182-187.

52. Elderfield H., Sehaltz A. Mid-ocean ridge hydrothermal fluxes and the chemical composition of the ocean // Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 1996. V. 24. P. 191-224.

53. Ermler U., Grabarse W., Shima S., Goubeaud M., Thaner R.K. Crystal structure of methyl-coenzymeMreductase: the key enzyme of biological methane formation // Science. 1997. V. 278. P. 1457-1462.

54. Ettwig K.F., Butler M.K., Le Paslier D., Pelletier E., Mangenot S., Knypers M.M., Sehreiber F, Dutilh B.E., Zedelius J., de Beer D. Nitrite-driven anaerobic methane oxidation by oxygenic bacteria // Nature. 2010. V. 464. P. 543-548.

55. Eitzeby J.P. List of Bacterial Names with Standing in Nomenclature: a folder available on the Internet // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47(2) P. 590-592.

56. Ferry J. G. How to make a living by exhaling methane // Annu. Rev. Microbiol. 2010. V. 64. P. 453-73.

57. Forterre P., Gribaldo S., Brochier-Armanet C. Natural history of the archaeal domain. P. 17-28. In: Garrett R., Klenk H.-P. (ed) Archaea: evolution, physiology, and molecular biology. Blackwell Publishing Ltd, Maiden. 2007.

58. Franke-Whittle I.H., Goberna M., Ins am H. Design and testing of real-time PCR primers for the quantification of Methanoculleus, Methanosarcina, Methanothermobacter, and a group of uncultured methanogens // Can. J. Microbiol. 2009. V. 55. P. 611-616.

59. Frenzel P. Plant-associated methane oxidation in rice fields and wetlands // Adv. Microb. Ecol. 2000. V. 16(3). P. 85-114.130

60. Friedrich M.W. Methyl-coenzyme M reductase genes: unique functional markers for methanogenic and anaerobic methane-oxidizing Archaea // Methods. Enzymol. 2005. V. 397. P. 428-442.

61. Galtier N., Lobry J.R. Relationships between genomic G+C content, RNA secondary structures, and optimal growth temperature in prokaryotes // J. Mol. Evol. 1997. V. 44(6). P. 632-636.

62. Gao B., Gupta R. Phylogenomic analysis of proteins that are distinctive of Archaea and its main subgroups and the origin of methanogenesis // BMC Genomics. 2007. V. 8. P. 86.

63. Giglio S., Monis P. T. Saint C.P Demonstration of preferential binding of S YBR green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR // Nucliec Acids Res. 2003. V. 31. P. el36.

64. Giovannoni S.J., DeLong E.F., Olsen G.J., Pace N.R. Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identification of single microbial cells //Journal of Bacteriology. 1988. V. 170. P. 720-726.

65. Girguis PR., Cozen A.E., DeLong E.F. Growth and population dynamics of anaerobic methane-oxidizing archaea and sulfate-reducing bacteria in a continuous-flow bioreactor // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71(7). P. 3725-3733.

66. Goenrich M, Mahlert F., Duin E.C., Bauer C., Jaun B., Thauer R.K. Probing the reactivity of Ni in the active site of methyl-coenzyme M reductase with substrate analogues // Journal of Biological Inorganic Chemistry. 2004. V. 9 P. 691-705.

67. Gonzalez-Escalona N. Fey A., Hofle M.G., Espejo R.T., Guzman A.

68. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analysis of Vibriocholerae cells entering the viable but non-culturable state and starvation in131response to cold shock // Environ. Microbiol. 2006. V. 8. P. 658-666.

69. Gribaldo S., Brochier-Armanet C. The origin and evolution of Archaea: a state of the art // Philosophical Transactions of the Royal Society. 2006. V. 361. P. 1007-1022.

70. Groot T.T., VanBodegom P.M., Harren F.J.M., Meijer H.A.J. Quantification of methane oxidation in the rice rhizosphere using l3C-labelled methane // Biogeochemistry. 2003. V. 64. P. 355-372.

71. Gutell R.R., Larsen N., Woese C.R. Lessons from an evolving rRNA:16S and 23S rRNA structures from a comparative perspective // Microbiological Reviews. 1994. V. 58. P. 10-26.

72. Hales B.A., Edwards C., Ritchie D.A., Hall G, Pickup R.W., Saunders J.R. Isolation and identification of methanogen-specific DNA from blanket bog feat by PCR amplification and sequence analysis //Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P. 668-675.

73. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucl. Acids Symp. Ser. 1999. V. 41 P. 95-98.

74. Hallam S.J., Girguis PR., Preston CM., Richardson P.M., DeLong E.F. Identification of methyl-coenzyme M reductase A (mcrA) genes associated with methane-oxidizing archaea //Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 5483-5491.

75. Hallam S.J., Putnam N., Preston C.M., Detter J.C., Rokhsar D., Richardson P.M., DeLong E.F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics // Science. 2004. V. 305. P. 1457-1462.

76. Hattori S., Kamagata Y., Hanada S., Shoun H. Thermacetogenium phaeum gen. nov., sp. nov., a strictly anaerobic, thermophilic, syntrophic acetate-oxidizing bacterium //Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 1601-1609.

77. Hedderich R., Klimmek O., Kroger A., Dirmeier R., Keller M., Stetter KO. Anaerobic respiration with elemental sulfur and with disulfides // FEMS Microbiol. Rev. 1998. V. 22. P. 353-381.132

78. Hedderich R, Whitman W. Physiology and biochemistry of the methane-producing Archaea // The Prokaryotes. 2006. V. 2. 3rd ed. P. 1050-1079.

79. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P. Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996. V. 6. P. 986-994.

80. Heller C., Hoppert M., Reitner J. Immunological localization of methyl-coenzyme M reductase in anaerobic methane-oxidizing archaea of ANME 1 and ANME 2 type // Geomicrobiol J. 2008. V. 25. P. 149-156.

81. Hoehler T.M, Gunsalus R.P., Mclnerney M.J. Environmental Constraints that Limit Methanogenesis. In: Timmis K.N. (ed) Handbook of hydrocarbon and lipid microbiology. Springer-Verlag, Heidelberg, 2010. P. 635-654.

82. Hoehler T.M. Biogeochemistiy of dihydrogen (H2) // Met. Ions. Biol. Syst. 2005. V. 43. P. 9-48.

83. Hoehler T.M. Biogeochemistry of dihydrogen. In: Metal Ions in Biological Systems: Biogeochemical Cycles of Elements. Sigel A., Sigel I-L, Sigel R.K.O. ' • (eds.). New York: Marcel Dekker. P. 9-48. 2005.

84. Hoehler T.M., Albert D.B., Alperin M.J., Martens C.S. Acetogenesis from C02 in an anoxic marine sediment//Limnol. Oceanogr. 1999. V. 44. P. 662-667.

85. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5' -3' exonuclease activity ofThermus aquaticus DNA polymerase //P. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. V. 88. P. 7276-7280.

86. Holler T., Widdel F., Knittel K, Amann R., Kellermann M. Y, Hinrichs K. U., Teske A., Boetius A., Wegener G. Thermophilic anaerobic oxidation of methane by marine microbial consortia//ISME J. 2011. V. 5(12). P. 1946-1956.

87. Holm N.G., Baltschejfsky H. Links between hydrothermal environments, pyrophosphate, Na+, and early evolution // Orig. Life. Evol. Biosph. 2011. V. 41(5). P. 483-493.

88. Hori T., Haruta S., Ueno Y., Ishii M., Igarashi Y. Dynamic transition of a methanogenic population in response to the concentration of volatile fatty acids in a thermophilic anaerobic digester // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 1623-1630.

89. Huber J.A., Batterfield D.A., Baross J.A. Temporal changes in archaeal diversity and chemistry in a mid-ocean ridge subseafloor habitat // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68(4). P. 1585-1594.

90. Huber J.A., Mark Welch D.B., Morrison H. G., Huse S.M., Neal P.R., Biitterfield D.A., Sogin M.L. Microbial population structures in the deep marine biosphere // Science. 2007. V. 318(5847). P. 97-100.

91. Janse L, BokJ., Zwart G. A simple remedy against artifactual double bands in denaturing gradient gel electrophoresis // J. Microbiol. Methods. 2004. V. 57(2). P. 279-281.

92. Jeanthon C. Molecular ecology of hydrothermal vent microbial communities // Anton. Leeuwenhoek. 2000. V. 77. P. 117-133.

93. Jeanthon C., Nercessian O., Corre E., Grabowski-Lux A. Hyperthermophilic and methanogenic Archaea in oil fields. In\ Petroleum Microbiology. Ollivier B., Magot M. (eds.), Washington, DC: ASM Press. 2005. P. 55-69.

94. Johnson H.P, Embley R.W. Axial Seamount: An active ridge axis volcano on the central Juan de Fuca Ridge // J. Geophys. Res. 1990. V. 95(B8). P. 1268912696.

95. Kallmeyer J., Boetius A. Effects of temperature and pressure on sulfate reduction and anaerobic oxidation of methane in hydrothermal sediments of Guaymas Basin //Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70(2). P. 1231-1233.

96. Kanokratana P., Chanapan S., Pootanakit K., Eurwilaichitr L. Diversity and135abundance of Bacteria and Archaea in the Bor Khlueng Hot Spring in Thailand. J. Basic Microbiol. 2004. V. 44(6). P. 430-44.

97. Kappel E.S., Ryan W.B.F. Volcanic episodicity and a non-steady state rift valley along northeast Pacific spreading centers: Evidence from SeaMARC I //

98. J. Geophys. Res. 1986. V. 91. P. 925-940.

99. Karl DM. The Microbiology of Deep-sea Hydrothermal Vents. CRC Press; 1995.

100. Kasting J.F. Earth's early atmosphere // Science. 1993. V. 259. P. 920-926.

101. Kasting J.F., Pavlov A.A., Siefert J.L. A coupled ecosystem-climate model for predicting the methane concentration in the Archean atmosphere // Orig. Life Evol. Biosph. 2001. V. 31. P. 271-285.

102. Kato S., Kobayashi C., Kakegawa T., Yamagishi A. Microbial communities in iron-silica-rich microbial mats at deep-sea hydrothermal fields of the Southern Mariana Trough. Environ. Microbiol. 2009. V. 11. P. 2094-2111.

103. Kemnitz D., Chin K.J., Bodelier P., Conrad R. Community analysis of methanogenic archaea within a riparian flooding gradient // Environ. Microbiol. 2004. V. 6. P. 449^161.

104. Kevbrin V.V., Zavarzin G.A. The effect of sulfur compounds on growth of halophilic homoacetic bacterium Acetohalobium arabaticum // Microbiol (RF). 1992. V. 61. P. 563-567.

105. Kimura H., Sugihara M., Kato K, Hanada S. Selective phylogenetic analysis targeted at 16S rRNA genes of thermophiles and hyperthermophiles in deepsubsurface geothermal environments // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72(1). P. 21-27.

106. Klales A., Duncan J., Nett E.J., Kane S.A. Biophysical model of prokaryotic diversity in geothermal hot springs // Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 2012. V. 85. P. 021911.

107. Knab N.J., Dale A.W., Lettmann K, Fossing Ii., Jorgensen B.B. Thermodynamic and kinetic control on anaerobic oxidation of methane in marine sediments // Geochim. Cosmochim. Acta. 2008. V. 72. P. 3746-3757.

108. Knittel K, Boetias A. Anaerobic oxidation of methane: progress with an unknown process //Annu. Rev. Microbiol. 2009. V. 63. P. 311-334.

109. Knittel K, Lösekann T., Boetias A., Kort R., Amann R. Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71(1). P. 467-479.

110. Kotsyurbenko O.R., Glagolev M.V., Nozhevnikova A.N., Conrad R. Competition between homoacetogenic bacteria and methanogenic archaea for hydrogen at low temperature // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 38. P. 153— 159.

111. Kruger M., Meyerdierks A., Glockner F.O., Amann R., Widdel F., Kube M., Reinhardt R., KahntJ., Bocher R„ Thauer R.K. A conspicuous nickel protein in microbial mats that oxidize methane anaerobically 11 Nature. 2003. V. 426. P. 878-881.

112. Kubista M., Andrade J.M., Bengtsson M., Forootan A., Jonäk J., Lind K, Sindelka R., Sjöbaek R., Sjögreen B., Strömbom L., Stählberg A., Zoric N. The real-time polymerase chain reaction // Mol. Aspects Med. 2006. V. 27. P. 95125.

113. Kublanov I.V., Perevalova A.A., Slobodkina G.B., Lebedinsky A.V., Bidzhieva137

114. Lane D. 16s/23s rRNA sequencing. In: Stackebrandt E., Goodfellow M. (ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, West Sussex, United Kingdom. 1991. P. 115-175.

115. Lehmann-Richter S., Grosskopf R., Liesack W., Frenzel P., Conrad R. Methanogenic archaea and CCVdependent methanogenesis on washed rice roots // Env. Microbiol. 1999. V. 1. P. 159-166.

116. Lelieveld J., Crutzen P.J., Dentener F.J. Changing concentrations, lifetime and climate forcing of atmospheric methane // Tellus. 1998. V. 50B. P. 128-150.

117. Li W., GodzikA. Cd-hit: a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences // Bioinformatics. 2006. V. 22(13). P. 16581659.

118. Lilley M.D., Butterfield D.A., Olson E.J., Lupton J.E., Macko S.A., McDuff R. E. Anomalous CH4 and NH4 concentrations at an unsedimented mid-ocean-ridge hydrothermal system //Nature. 1993. V. 364. P. 45-47.

119. Lilley M.D., McDuff R.E., Dahm C.N. Ammonium in hydrothermal vent fields //Eos. Trans. AGU. 1987. V. 68. P. 1721.

120. Liu Y Taxonomy of methanogens. In: Timmis K.N. (ed) Handbook ofhydrocarbon and lipid microbiology. Springer-Verlag, Heidelberg. 2010. P.138549.558.

121. Liu Y., Whitman W.B. Metabolic, phylogenetic, and ecological diversity of the methanogenic archaea // Ann. N. Y. Acad. Sei. 2008. V. 1125. P. 171-189.

122. Lloyd KG., Albert D.B., Biddle J.F., Chanton J.P., Pizarro O., Teske A. Spatial Structure and Activity of Sedimentary Microbial Communities Underlying a Beggiatoa spp. Mat in a Gulf of Mexico Hydrocarbon Seep // PLoS ONE. 2010. V. 5(1). P. e8738.

123. Lloyd KG., Alperin M.J., Teske A. Environmental evidence for net methane production and oxidation in putative ANaerobic MEthanotrophic (ANME) archaea//Environ. Microbiol. 2011. V. 13(9). P. 2548-2564.

124. Lloyd KG., Lapham L., Teske A. An anaerobic methane-oxidizing community of ANME-lb archaea in hypersaline Gulf of Mexico sediments // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 7218-7230.

125. Losekann T., Knittel K, Nadalig T., Fuchs B., Niemann H. Diversity and abundance of aerobic and anaerobic methane oxidizers at the Haakon Mosby Mud Volcano, Barents Sea // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 33483362

126. Lovley D.R., Goodwin S. Hydrogen concentrations as an indicator of the terminal electron-accepting reactions in aquatic sediments // Geochim. Cosmochim. Acta. 1988. V. 52. P. 2993-3003.

127. Ludwig W., Strunk O., Westram R., Richter L., Meier H., Yadhukumar., Büchner

128. A., Lai T., Steppi S., Jobb G., Förster W., Brettske I., Gerber S., Ginhart A. W.,

129. Gross O., Grumann S., Hermann S., Jost R., König A., Liss T., Lüssmann R.,

130. May M., Nonhoff B., Reichel B., Strehlow R., Stamatakis A., Stuckmann N.,

131. Vilbig A., Lenke M., Ludwig T., Bode A., Schleifer KH. ARB: a softwareenvironment for sequence data. Nucleic //Acids. Res. 2004. V. 32(4). P. 1363—139

132. Luo H., San Z., Arndt W., Shi J., Friedman R., Tang J. Gene order phylogeny and the evolution of methanogens // PLoS One. 2009. V. 4(6) P. e6069.

133. Lupton J.E., Delaney J.R., Johnson H.P., Tivey M.K. Entrainment and vertical transport of deep- ocean water by buoyant hydrothermal plumes // Nature. 1985. V. 316. P. 621-623.

134. Luton P.E., Wayne J.M., Sharp R.J., Riley P. W. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in landfill //Microbiology. 2002. V. 148. P. 3521-3530.

135. Magot M., Ollivier B., Patel B.K.C. Microbiology of petroleum reservoirs // Anton Leeuwenhoek. 2000. V. 77. P. 103-116.

136. Martens C.S., Bemer R.A. Methane production in the interstitial waters of sulfate-depleted marine sediments // Science. 1974. V. 185. P. 1167-1169.140

137. Martin W., Baross J., Kelley D., Russell M.J. Hydrothermal vents and the origin of life//Nat. Rev. Microbiol. 2008. V. 6(11). P. 805-14.

138. Martin W.F. Early evolution without a tree of life // Biol. Direct. 2011. V. 30 P. 36.

139. Martinez F., Fryer P., Becker N. Geophysical characteristics of the southern Mariana Trough, 11°500N 13°400N II J. Geophys. Res. 2000. V. 105. 591 -607.

140. Massoth G.J., Butterfield D.A., Lupton J.E., McDuff R.E., Lilley M.D., Jonasson I.R. Submarine venting of phase-separated hydrothermal fluids at Axial Volcano, Juan de Fuca Ridge // Nature. 1989. V. 340 P. 702 705.

141. Matte-Tailliez O., Brochier C., Forterre P., Philippe H. Archaeal phylogeny based on ribosomal proteins. Mol. Biol. Evol. 2002. V. 19(5). P. 631-639.

142. Mayr S., Latkoczy C., Kruger M., Gunther D., Shima S., Thauer R.K., Widdel F., Jaun B. Structure of an F430 variant from archaea associated with anaerobic oxidation of methane. J.Am. Chem. Soc. 2008. V. 130. P. 10758-10767.

143. McDuff R.E., Lapron J.E., Kadko D., Lilley M.D. Chemistry of hydrothermal fluids, Endeavour Ridge, northeast Pacific // Eos. Trans. AGU. 1984. V. 65. P. 975.

144. McGenity T.J., Gemmell R. T., Grant W.D., Stan-Lotter H. Origins of halophilic microorganisms in ancient salt deposits // Environ. Microbiol. 2000. V. 2(3) P. 243-250.

145. Mehta M.P., Baross J.A. Nitrogen fixation at 92 degrees C by a hydrothermal vent archaeon// Science. 2006. V. 314. P. 1783-1786.

146. MerkelA.Y., Huber J.A., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Lebedinsky

147. A. V. Detection of putatively thermophilic anaerobic methanotrophs in diffusehydrothermal vent fluids //Appl. Environ. Microbiol. 2013. V. 79(3). P. 915141

148. Meyerdierks A., Kube M., Kostadinov L, Teeling H., Glöckner F.O., Reinhardt R., Amann R. Metagenome and mRNA expression analyses of anaerobic methanotrophic archaea of the ANME-1 group // Environ. Microbiol. 2010. V. 12(2). P. 422-439.

149. Miroshnichenko M.L. Thermophilic microbial communities of deep-sea hydrothermal vents //Microbiology. 2004. V. 73. P. 1-13.

150. Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A. Recent developments in the thermophilic microbiology of deep-sea hydrothermal vents // Extremophiles. 2006. V. 10. P. 85-96.

151. Mochimaru H., Yoshioka H., Tamaki H, Nakamura K., Kaneko N., Sakata S. Microbial diversity and methanogenic potential in a high temperature natural gas field in Japan // Extremophiles. 2007. V. 11. P. 453-461.

152. Moran J.J., Beal E.J., Vrentas J.M., Orphan V.J., Freeman K.H., House C.H. Methyl sulfides as intermediates in the anaerobic oxidation of methane // Environ. Microbiol. 2008. V. 10. P. 162-173.

153. Moré M.L, Herrick J.B., Silva M.C., Ghiorse W.C., Madsen E.L. Quantitative142cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of microbial DNA from sediment //Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60(5). P. 1572-1580.

154. Mulkidjanian A.Y., Bychkov A.Y., Dibrova D.V., Galperin M.Y., Koonin E.V. Origin of first cells at terrestrial, anoxic geothermal fields // Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. 2012. V. 109(14). P. E821-E830.

155. Myers R.M., Fischer S.G., Lerman L.S., Maniatis T. Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis // Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 3131-3145

156. Nakagawa S., Takai K. The isolation of thermophiles from deep-sea hydrothermal environments // Methods In Microbiology. 2006. V. 35. P. 55-91.

157. Nakamura K., et al. Liquid and emulsified sulfur in submarine solfatara fields of two northern Mariana arc volcanoes // Eos. Trans. AGU. 2006. V. 87(52). V23B-0608.

158. Narihiro T., Sekiguchi Y. Oligonucleotide primers, probes and molecular methods for the environmental monitoring of methanogenic archaea // Microb. Biotechnol. 2011. V. 4(5). P. 585-602.

159. Nauhaus K., Albrecht M., Elvert M., Boetius A., Widdel F. In vitro cell growth of marine archaeal-bacterial consortia during anaerobic oxidation of methane with sulfate // Environ. Microbiol. 2007. V. 9(1). P. 187-196.

160. Nauhaus K., Boetius A., Kruger M., Widdel F. In vitro demonstration of anaerobic oxidation of methane coupled to sulphate reduction in sediment from a marine gas hydrate area // Environ. Microbiol. 2002. V. 4. P. 296-305.

161. Nauhaus K., Treude T., Boetius A., Kruger M. Environmental regulation of theanaerobic oxidation of methane: a comparison of ANME-I and ANME-II143communities //Environ. Microbiol. 2005. V. 7. P. 98-106.

162. Neretin L.N., Schippers A., Pemthaler A., Hamann K., Amann R., Jorgensen B.B. Quantification of dissimilatory (bi)sulphite reductase gene expression in Desulfobacterium autotrophicum using real time PCR // Environ. Microbiol. 2003. V. 5. P. 660-671.

163. Neu T.R., Kuhlicke U., Lawrence J.R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms // Appl. Environ. Microbiol. 2002. 68. P. 901-909.

164. Niemann H., Losekann T., DeBeer D., Elvert M., Nadalig T. Novel microbial communities of the Haakon Mosby mud volcano and their role as a methane sink//Nature. 2006. V. 443. P. 854-858.

165. Nomura M, Mizushima S., Ozaki M, Traub P., Lowry P.E. Structure and function of ribosomes and their molecular components // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1969. V. 34. P. 49-61.

166. Nunoura T., Oida H., Miyazaki J., Miyashita A., Imachi H., Takai K. Quantification of mcrA by fluorescent PCR in methanogenic and methanotrophic microbial communities. FEMS Microbiol. Ecol. 2008. V. 64. P. 240-247.

167. Nunoura T., Oida H., Toki T., Ashi J., Takai K., Horikoshi K. Quantification of mcrA by quantitative fluorescent PCR in sediments from methane seep of the Nankai Trough. FEMS Microbiol. Ecol. 2006. V. 57. P. 149-157.

168. Ollivier В., Cayol J.L. The fermentative, iron-reducing, and nitrate-reducing microorganisms. In Petroleum Microbiology. Ollivier В., Magot M. (eds.). Washington, DC P. ASM Press, 2005. P. 71-88.

169. Ollivier В., Cayol J.-L. Thermophilic methanoarchaea inhabiting hot ecosystems. In Handbook of Hydrocarbon Microbiology: Microbial Interactions with Hydrocarbons, Oils, Fats and Related Hydrophobic Substrates and Products, Springer Verlag. 2010.

170. Olsen G.J., Lane D.J., Giovannoni S.J., Pace N.R., Stahl D.A. Microbial ecology and evolution: a ribosomal RNA approach // Annual Reviews

171. Microbiology. 1986. V. 40. P. 337-365.

172. Olsen R.A., Bakken L.R. Viability of soil bacteria: optimization of plate-counting technique and comparison between total counts and plate counts within different size groups // Microb. Ecol. 1987. V. 13. P. 59-74.

173. Opatkiewicz A.D., Butterfield D.A., Baross J.A. Individual hydrothermal vents at Axial Seamount harbor distinct subseafloor microbial communities // FEMS Microbiology Ecology. 2009. V. 70. P. 413-424.

174. Orphan V.J., House C.H., Hinrichs K.U., McKeegan K.D., DeLong E.F. Methane-consuming archaea revealed by directly coupled isotopic and phylogenetic analysis. Science. 2001. V. 293(5529). P. 484-487.

175. Pace N.R. Origin of life facing up to the physical setting // Cell. 1991. V. 65. P. 531-533.

176. Pavlov A.A., Hürtgen M.T., Kasting J.F., Arthur M.A. Methane-rich Proterozoic atmosphere? // Geology. 2003. V. 31. P. 87-90.

177. Pepper C.B., Monbouquette H.G. Issues in the culture of the extremely thermophilic methanogen, Methanothermus fervidus // Biotechnol. Bioeng. 1993. V. 41(10). P. 970-978.

178. Polz M.F., Cavanaugh C.M. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR. Appl. Environ. Microb. 1998. V. 64. P. 3724-3730.

179. Prieur D. Hydrothermal Vents: Prokaryotes in Deep-Sea Hydrothermal Vents // Encyclopedia of Environmental Microbiology / New York: Wiley. 2002. P. 1617-1628.

180. Pruesse E„ Quasi C., Knitiel K., Fuchs B., Ludwig W, Peplies J. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. R 7188-7196.

181. Rebrikov D. V., Trofunov D. Y. Real-Time PCR: A Review of Approaches to Data Analysis //Applied Biochemistry and Microbiology. 2006. V. 42. P. 455-463.

182. Reeburgh W.S. A major sink and flux control for methane in marine sediments: anaerobic consumption. In Dynamic Environment of the Ocean Floor. K Fanning and FT Mannheim (eds.). Lexington, MA: Heath, P. 203-217. 1982.

183. Reeburgh W.S. Oceanic methane biogeochemistry // Chemical Reviews. 2007. V. 107. P. 486-513.

184. Reysenbach A.-L. Molecular constraints on a high-temperature evolution of early life //Biol. Bull. 1999. V. 196. P. 367-372.

185. Reysenbach A.L., Banta A.B., Boone D.R., Cary S.C., Luther G.W. Microbial essentials at hydrothermal vents //Nature. 2000. V. 404. P. 835-845.

186. Reysenbach A.L., Cady S.L. Microbiology of ancient and modern hydrothermal systems // Trends Microbiol. 2001. V. 9(2). P. 79-86.

187. Reysenbach A.L., Giver L.J., Wickman G.S., Pace N.R. Differential amplification of rRNA genes by polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microb. 1992. V. 58. P. 3417-3418.

188. Reysenbach A.-L., Liu Y., Banta A.B., Beveridge T.J., Kirshtein J.D., Schonten S., Tivey M.K., Von Damm K.L., Voytek M.A. A ubiquitous thermoacidophilic archaeon from deep-sea hydrothermal vents // Nature. 2006. V. 442. P. 444447.

189. Robigou V., Delaney J.R., McDuff R.E. High precision, high resolution map of a vigorous hydrothermal vent field // Eos. Trans. AGU. 1990. V. 71. P. 1610.

190. Rona P.A., Trivett D.A. Discrete and diffuse heat transfer at ASHES vent field, Earth Planet// Sei. Lett. 1992. V. 109. P. 57-71.

191. Roussel E.G., Bonavita M.A., Querellou J., Cragg B.A., Webster G., Prieur D.,

192. Parkes R.J. Extending the sub-sea-floor biosphere // Science. 2008. V.146320(5879). P. 1046.

193. Saiki R.K. The design and optimization of the PCR. In PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (H.A. Erlich, ed.) P. 7-16. Stockton Press, New York. 1989.

194. Sandbeck K.A., Ward DM. Fate of immediate methane precursors in low-sulfate, hot-spring algal-bacterial mats // Appl. Environ. Microbiol. 1981. V. 41(3). P. 775-782.

195. Sawayama S., Tada C., Tsukahara K., Yagishita T. Effect of ammonium addition on methanogenic community in a fluidized bed anaerobic digestion // J. Biosci, Bioeng. 2004. V. 97. P. 65-70.

196. Sawayama S., Tsukahara K., Yagishita T. Phylogenetic description of immobilized methanogenic community using real-time PCR in a fixed-bed anaerobic digester//Bioresour. Technol. 2006. V. 97 P. 69-76.

197. Say eh R., Birrien J.L., Alain K., Barbier G., Hamdi M., Prieur D. Microbial diversity in Tunisian geothermal springs as detected by molecular and culture-based approaches // Extremophiles. 2010. V. 14(6). P. 501-514.

198. Scheller S., Goenrich M., Boecher R., Thauer R.K., Jaun B. The key nickel enzyme of methanogenesis catalyses the anaerobic oxidation of methane // Nature. 2010. V. 465. P. 606-608.

199. Schleper C., Jurgens G., Jonuscheit M. Genomic studies of uncultivated archaea // Nat. Rev. Microbiol. 2005. V. 3(6). P. 479-488.

200. Schouten S., Wakeham S.G., Hopmans E.C., Sinninghe Damste J.S. Biogeochemical evidence that thermophilic archaea mediate the anaerobic oxidation of methane 11 Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69(3). P. 16801686.

201. Schultz A., Delaney J.R., McDuffR.E. On the partitioning of heat flux between diffuse and point source seafloor venting // J. Geophys. Res. 1992. V. 97. P. 12299-12315.

202. Searle R. Tectonic pattern of the Azores spreading centre and triple junction // Earth Planet. Sci. Lett. 1980. V. 51. P. 415-434.

203. Shigematsu T., Tang Y.Q., Kawaguchi H., Ninomiya K., Kijima J., Kobayashi T., Effect of dilution rate on structure of a mesophilic acetate-degrading methanogenic community during continuous cultivation // J. Biosci. Bioeng. 2003. V. 96. P. 547-558.

204. Shima S., Krueger M., Weinert T., Demmer U., Kahnt J., Thauer R.K., Ermler U. Structure of a methyl-coenzyme M reductase from Black Sea mats that oxidize methane anaerobically //Nature. 2012. V. 481(7379). P. 98-101.

205. Shima S., Thauer R.K Methyl-coenzyme M reductase and the anaerobic oxidation of methane in methanotrophic Archaea // Curr. Opin. Microbiol. 2005. V. 8(6). P. 643-648.

206. Shock E.L. Hydrothermal systems as environments for the emergence of life // Ciba. Found. Symp. 1996. V. 202. P. 40-52.

207. Simoncini E., Russell M.J., Kleidon A. Modeling free energy availability from Hadean hydrothermal systems to the first metabolism // Orig. Life Evol. Biosph. 2011. V. 41(6). P. 529-32.

208. Skillman L.C., Evans P.N., Naylor G.E., Morvan B., Jarvis G.N., Joblin K.N.16S ribosomal DNA-directed PCR primers for ruminal methanogens and148identification of methanogens colonising young lambs // Anaerobe. 2004. V. 10. P. 277-285.

209. Skyes P.J., Neoh S.H., Brisco M.J., Hughes E., Condon J., Morley A.A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilutions // BioTechniques. 1992. V. 13. P. 444-449.

210. Sleep N.H., Bird D.K., Pope E.C. Serpentinite and the dawn of life. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2011. V. 366(1580). P. 2857-69.

211. Smith C.J., Nedwell D.B., Dong L.E, Osborn A.M. Evaluation of quantitative polymerase chain reaction-based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples // Environ. Microbiol. 2006. V. 8(5). P. 804-815.

212. Smith C.J., Osborn A.M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 2009. V. 67(1). P. 6-20.

213. Smith J. V. The first 800 million years of the Earth's history // Philos. Trans. R. Soc. Lond. 1981. V. 301 A. P. 401-422.

214. Smith M.O., Delaney J.R. Variability of emitted radiation from two hydrothermal vents // Eos. Trans. AGU. 1989. V. 70. P. 1161.

215. Sorensen A.H., Ahring B.K. An improved enzyme-linked immunosorbent assay for whole-cell determination of methanogens in samples from anaerobic reactors //Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 2001-2006.

216. Sowers K.R. Methanogenesis. In: Schaechter, Lederberg, Alexander, Haselkorn, Ingraham, Baross, Schmidt, Laskin, Hopwood, Summers, Baulcombe, Levin, White, Fierer, Baldauf (eds.), Encylopedia of Microbiology, 3rd edition. Elsevier, Inc. 2009.

217. Spiegelman D., Whissell G., Greer C.W. A survey of the methods for the characterization of microbial consortia and communities // Can. Journal Microbiology. 2005. V. 51. P. 355-386.

218. Springer E., Sachs M.S., Woese C.R., Boone D.R. Partial gene sequences for the

219. A subunit of methyl-coenzyme M reductase (mcrl) as a phylogenetic tool for149the family Methanosarcinaceae // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45(3). P. 5549.

220. Stackebrandt E., and Woese C. The evolution of prokaryotes. // In Molecular and cellular aspects of microbial evolution. Carlise M.J., Collins J.R., and Moseley B.E.B. (eds). Cambridge: Cambridge University press 1-31. 1981.

221. Stahl D.A., Amann R. Development and application of nucleic acid probes in bacterial systematic, p 205-248. In Stackebrandt E, Goodfellow M (ed), Nucleic acid techniques in bacterial systematics, John Wiley and Sons Ltd, Chichester. 1991.

222. Steele L.P., Fraser P.J., Rasmussen R.A., Khalil M.A.K., Conway T.J., Crawford A.J., Gammon R.H., Masarie K.A., Thoning K.W. The global distribution of methane in the troposphere // Journal of Atmospheric Chemistry. 1987. V. 5. P. 125-171.

223. Steigmiller S., Turina P., Graber P. The thermodynamic H+/ATP ratios of the H+-ATPsynthases from chloroplasts and Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P. 3745-3750.

224. Steinberg L.M., Regan J.M. mcrA-targeted real-time quantitative PCR method to examine methanogen communities //Appl. Environ. Microbiol. 2009. V. 75. P. 4435-4442.

225. Steinberg L.M., Regan J.M. Phylogenetic comparison of the methanogenic communities from an acidic, oligotrophic fen and an anaerobic digester treating municipal wastewater sludge //Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 66636671.

226. Strapoc D., Picardal F.W., Turich C., Schaperdoth I., Macalady J.L., Lipp J.S. Methane-producing microbial community in a coal bed of the Illinois Basin // Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 2424-2432.

227. Strous M, Jetten MS. Anaerobic oxidation of methane and ammonium // Annu. Rev. Microbiol. 2004. V. 58. P. 99-117.

228. Suzuki M.T., Giovannoni S.J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes by PCR // Appl. Environ.

229. Microb. 1996. V. 62. P. 625-630.

230. Takai K., Nakamura K. Archaeal diversity and community development in deep-sea hydrothermal vents // Curr. Opin. Microbiol. 2011. V. 14(3). P. 282291.

231. Tang Y.Q., Shigematsu T., Morimura S., Kida K. Microbial community analysis of mesophilic anaerobic protein degradation process using bovine serum albumin (BSA)-fed continuous cultivation // J. Biosci. Bioeng. 2005. V. 99. P. 150-164.

232. Thauer R.K. Anaerobic oxidation of methane with sulfate: on the reversibility of the reactions that are catalyzed by enzymes also involved in methanogenesis from C02 // Curr. Opin. Microbiol. 2011. V. 14(3). P. 292-299.

233. Thauer R.K. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson //Microbiology. 1998. V. 144. P. 2377-2406.

234. Thauer R.K., Jungermann K, Decker K. Energy-conservation in chemotropic anaerobic bacteria // Bacteriol. Rev. 1977. V. 41. P. 100-180.

235. Thauer R.K., Kaster A.K., Goenrich M., Schick M., Hiromoto T., Shima S.151

236. Hydrogenases from methanogenic archaea, nickel, a novel cofactor, and H2 storage//Annu. Rev. Biochem. 2010. V. 79. P. 507-536.

237. Thauer R.K., Shima S. Methane as fuel for anaerobic microorganisms // Ann. N.Y.Acad. Sci. 2008. V. 1125. P. 158-170.

238. Thauer R.K., Shima S. Methyl-Coenzyme M Reductase in Methanogens and Methanotrophs, in Archaea: Evolution, Physiology, and Molecular Biology (eds R. A. Garrett and H.-P. Klenk), Blackwell Publishing Ltd, Maiden, MA, USA. 2007.

239. Thomson R.E., Delaney JR., McDuff R.E., Janecky D.R., McClain J.S., Physical characteristics of the Endeavour Ridge hydrothermal plume during July 1988//Earth and Planet. Sci. Lett., 1992. V. 111. P. 141-154.

240. Tivey M.A., Johnson H.P. The central anomaly magnetic high: Implications for ocean crest construction and evolution // J. Geophys. Res. 1987. V. 92. P. 12685-12694.

241. Tivey M.K., Delaney J.R. Growth of large sulfide structures on the Endeavour Segment of the Juan de Fuca Ridge // Earth Planet. Sci. Lett. 1986. V. 77. P. 303-317.

242. Treude T., Boetius A., Knittel K, Wallmann K, Jorgensen B.B. Anaerobic oxidation of methane above gas hydrates at Hydrate Ridge, NE Pacific Ocean // Mar. Ecol. Prog. Ser. 2003. V. 264. P. 1-14.

243. Treude T„ Orphan V., Knittel K, Gieseke A., House C.H., Boetius A. Consumption of methane and C02 by methanotrophic microbial mats from gas seeps of the anoxic Black Sea // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73(7). P. 2271-2283.

244. Tsai Y.L., Olson B.H. Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments //Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57(7). P. 1070-1074.152

245. Tung H.C., Bramall N.E., Price P.B. Microbial origin of excess methane in glacial ice and implications for life on Mars // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2005. V. 102. P. 18292-18296.

246. Tyler P.A., German C.R., Ramirez-Llodra E., Van Dover C.L. Understanding the biogeography of chemosynthetic ecosystems // Oceanol. Acta. 2003. V. 25. P. 227-241.

247. Ueno Y., Yamada K., Yoshida N., Maruyama S., Isozaki Y. Evidence from fluid inclusions for microbial methanogenesis in the early Archaean era // Nature.2006. 440. P. 516-519.

248. Valentine D.L. Biogeochemistry and microbial ecology of methane oxidation in anoxic environments: a review // Antonie Van Leeuwenhoek. 2002. V. 81. P. 271-282.

249. Van de Peer Y., Chapelle S., Wachter R.D. A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA//Nucleic Acids Research. 1996. V. 24. P. 3381-3391.

250. Veirs S.R., McDuff R.E., Stahr F.R. Magnitude and variance of near-bottom horizontal heat flux at the Main Endeavour hydrothermal vent field // Geochem. Geophys. Geosyst. 2006. V.7 P. Q02004.

251. Visser F.A., van Lier J.B., Macario A.J.L., de Macario E.C. Diversity and population dynamics of methanogenic bacteria in a granular consortium // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 1728-1734.

252. Von Damm K.L. Controls on the chemistry and temporal variability of seafloor hydrothermal fluids. In Seafloor Hydrothermal Systems: Physical, Chemical, Biological and Geological Interactions (Humphris, S. et al., eds). 1995.

253. Von Damm K.L., Bischoff J.L., Chemistry of hydrothermal solutions from the Southern Juan de Fuca Ridge //J. Geophys. Res. 1988. V. 92. P. 4551-4561.

254. Wada A., Suyama A. Local stability of DNA and RNA secondary structure and its relation to biological functions // Prog. Biophys. Mol. Biol. 1986. V. 47(2). P. 113-157.

255. Wahlen M. The global methane cycle // Annual Review of Earth and Planetary Sciences. 1993. V. 21. P. 407-426.

256. Wang G.Z., Spivack A.J., D'Hondt S. Gibbs energies of reaction and microbial mutualism in anaerobic deep subseafloor sediments of ODP Site 1226 // Geochim Cosmochim Acta. 2010. V. 74. P. 3938-3947.

257. WangJ.S., Logan J.A., McElroy M.B., Duncan B.N., Megretskaia I.A., Yantosca R.M. A 3-D model analysis of the slowdown and interannual variability in the methane growth rate from 1988 to 1997 // Global Biogeochem Cycles. 2004. V. 18. P.GB3011.

258. Wankel S.D., Germanovich L.N., Lilley M.D., Gene G., DiPema C.J., Bradley154

259. A.S., Olson E.J., Girguis PR. Influence of subsurface biosphere on geochemical fluxes from diffuse hydrothermal fluids // Nature Geoscience. 2011. V. 4. P. 461-468.

260. Ward D.M., Olson G.J. Terminal processes in the anaerobic degradation of an algal-bacterial mat in a high-sulfate hot spring // Appl. Environ. Microbiol. 1980. V. 40(1). P. 67-74.

261. Weijers J.W.H., Schouten S., van der Linden M., van Geel B., Damste J.S.S. Water table related variations in the abundance of intact archaeal membrane lipids in a Swedish peat bog // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 239. P. 51-56.

262. Weizhong L., Jaroszewski L., Godzik A. Clustering of highly homologous sequences to reduce the size of large protein database // Bioinformatics. 2001. V. 17(3). P. 282-283.

263. Welander P.V., MetcalfW.W. Loss of the mtr operon in Methanosarcina blocks growth on methanol, but not methanogenesis, and reveals an unknown methanogenic pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 1066410669.

264. Welander P.V., Metcalf WW Mutagenesis of the CI oxidation pathway in Methanosarcina barkeri: new insights into the Mtr/Mer bypass pathway // J. Bacteriol. 2008. V. 190. P. 1928-1936.

265. Westerholm M., Roos S„ Schniirer A. Syntrophaceticus schinkii gen. nov., sp. nov., an anaerobic, syntrophic acetate-oxidizing bacterium isolated from a mesophilic anaerobic filter // FEMS Microbiol. Lett. 2010. V. 309(1). P. 100104.

266. White D.E. Thermal waters of volcanic origin // Bulletin of the Geological Society of America. 1957. V. 68. P. 1637-1658.

267. Whitman W., Bowen T., Boone D. The methanogenic bacteria. In The Prokaryotes, 3rd edn. M Dworkin, S Falkow, E Rosenberg, K-H Schleifer, E Stackebrandt (eds.) New York: Springer-Verlag, P. 165-207. 2006.

268. Wilhelms A., Larter S.R., Head I., Farrimond P., di-Primio R., Zwach C.

269. Biodégradation of oil in uplifted basins prevented by deep-burial sterilization //155

270. Nature. 2001. V. 411. P. 1034-1037.

271. Wittwer C.T., Herrmann M.G., Moss A.A., Rasmussen R.P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification // BioTechniques, 1997. V. 22. P. 130-138.

272. Woese C.R. et al. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria and Eucarya // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 4576^579.

273. Woese C.R., Achenbach L., Rouviere P., Mandelco L. Archaeal phylogeny: reexamination of the phylogenetic position of Archaeoglobus fulgidus in light of certain composition-induced artifacts // Syst. Appl. Microbiol. 1991. V. 14(4). P. 364-371.

274. Wolfe R.S. Microbial formation of methane // Adv. Microb. Phys. 1971. V. 6. P.107-146.

275. Wolin E.A., Wolin M.J., Wolfe R.S. Formation of methane by bacterial extracts //J. Biol. Chem. 1963. V. 238. P. 2882-2886.

276. Wright A.D.G., Pimm C. Improved strategy for presumptive identification of methanogens using 16S riboprinting // J. Microbiol. Methods. 2003. V. 55. P. 337-349.

277. Wuebbles D.J., Hayhoe K. Atmospheric methane and global change // Earth-Science Reviews. 2002. V. 57. P. 177-210.

278. Xiang C.C., Brownstein M.J. Fabrication of cDNA microarrays // Methods Mol. Biol. 2003. V. 224. P. 1-7.

279. Yakimov M.M., Giuliano L., Cappello S., Denaro R., Golyshin P.N. Microbial community of a hydrothermal mud vent underneath the deep-sea anoxic brine lake Urania (eastern Mediterranean) // Orig. Life. Evol. Biosph. 2007. V. 37(2). P. 177-188.

280. Yu Y., Kim J., Hwang S. Use of real-time PCR for group-specific quantification of aceticlastic methanogens in anaerobic processes: population dynamics and community structures //Biotechnol. Bioeng. 2006. V. 93. P. 424-433.

281. Yu Y, Lee C., Kim J., Hwang S. Group-specific primer and probe sets to detect156methanogenic communities using quantitative real-time polymerase chain reaction // Biotechnol. Bioeng. 2005. V. 89. P. 670-679.

282. Zehnder A.J.B., Brock T.D. Methane formation and methane oxidation by methanogenic bacteria // J. Bacteriol. 1979. V. 137. P. 420^32.

283. Zhang G.S., Tian J.Q., Jiang N. Guo X.P., Wang Y.F., Dong X.Z. Methanogen community in Zoige wetland of Tibetan plateau and phenotypic characterization of a dominant uncultured methanogen cluster ZC-I // Environ. Microbiol. 2008. V. 10. P. 1850-1860.

284. Геологический словарь. Под редакцией К. Н. Паффенгольца и др. М.: Недра. 1978. 486 с.

285. Заварзин Г.А. Бактерии и состав атмосферы. М.: Наука. 1984. 199 с.

286. Карпов Г.А. В кальдере вулкана. М.: Наука. 1980. 96 с.

287. Кононов В.И., Зверев С.М., Поляк Б.Г. Исландия и срединно-океанич. хребет (глубинное строение, сейсмичность, геотермия). М.:Наука, 1977. 195 с.

288. Короновский Н.В., Якушова А.Ф. Основы геологии. М.: Высшая школа. 1991.420 с.

289. Леин А.Ю., Москалёв Л.И., Богданов Ю.А., Сагалевич A.M.157

290. Гидротермальные системы океана и жизнь //Природа. 2000. V. 5. Р. 47-55.

291. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: методы генетической инженерии. Пер. с англ. М.: Мир. 1984. 479 с.

292. Ножевникова А.Н., Ягодина Т.Г. Термофильные ацетатные метанообразующие бактерии //Микробиология. 1982. Т. 51. С. 642-643.

293. Пиневич A.B. Микробиология. Биология прокариотов. Изд. С.-Петербургского университета. 2007. 331 с.

294. Семенов В. В краю горячих источников. Дальневосточное книжное издательство, Камчатское отделение. 1988. 144 с.У

Информация о работе

Меркель, Александр Юрьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Молекулярная экология метаногенных и метанотрофных архей гидротермальных мест обитания - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы