Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация супероксиддисмутазы и каталазы альдегиддекстраном для экспериментальной антиоксидантной терапии силикоза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модификация супероксиддисмутазы и каталазы альдегиддекстраном для экспериментальной антиоксидантной терапии силикоза"

р\3 - од ' ' -

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТ*» ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КАРДИОЛОГИИ

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА Екатерина Леонидовна

МОДИФИКАЦИЯ СУПЕР0КСЩЩИСМУТАЗЫ И КАТАЛАЗЫ АЛЬДЕГИДДЕКСТРАНОЫ ДЛЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ АНТИОКСИДЛНТНОИ ТЕРАПИИ СИЛИКОЗА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологичесхгк наук

Москва 1993

Работа выполнена в отделе биотехнологии Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научного'Центра РАМН

Научный руководитель :

N '

доктор биологических наук A.B. Максименко. Научный консультант : доктор химических наук В.П. Торчилин.

Оф'.шиальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор К.Б. Афанасьев; доктор биологических наук О.й. Писарснко.

Ведущая организация - Институт биохимии иа. А.Н. Баха РАН

с Г^хээз г. в (1 часе

Защита состоится»^.г. в часов оо ыин. на заседании специализированного совета К 001.22.02 в Кардиологическом научном центре РАШ, по адресу : 121552. Москва. 3-я Черепковская ул.. isa. ,

Автореферат разослан ______19S3 г.

С диссертацией мозно ознакомиться в научной библиотеке Кардиологического научного центра РАМН

Ученый секретарь специализированного совета /\

кандидат биологических каукГ У /Т.И. Венгерова

Актуальность теми исследования. Высокая эффективность и избирательность действия ферментных препаратов обусловили их появление в химической технологии и пищевой промышленности, аналитических процедурах и медицине. Актуальность медицинского использования ферментов связана как с созданием лекарственных средств, имплантантов и диагносгтаумов. так и с разработкой принципиально новых методов коррекции нарушений метаболизма и способов' их выявления. Широкое применение ферментов в медицине сдергивается, в первую очередь, их малой доступностьи и дороговизной их чистых препаратов. Эффективность реального медицинского использования ферментов определяется величиной их стабильности. Одним из способов получения стабилизированных водорастворимых форм ферментных препаратов является химическая модификация.

Актуальность темы работы определяется практической необходимостью .использовать стабилизированные производные ферментов для их реального применения в качестве лекарственных средств, а также отсутствием в настоящее время эффективных средств для терапии довольно широко распространенного профессионального заболевания легких - силикоза. Силикоз развивается при попадании в легкие человека промышленных кварцсодерхаших аэрозолей. При этом в легких активизируется свободкорадикальные процессы и увеличивается синтез соединительнотканных белков. В патологических условиях фиброза легких эндогенных феркзнтов антиоксидантной завиты [суперок-сиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ)] может оказаться недостаточным для эффективного удаления и Н202. поэтому представляется целесообразный использовать экзогенные СОД и КАТ для терапии силикоза. С цель» ловиаения возможного фармакологического воздействия мы использовали СОД и КАТ в стабилизированном виде. Такт образом, получение стабилизированных ферментных препаратов., сравнительное изучение эффективности их действия на модели экспериментального силикоза является весьма актуальным для разработки действенных лекарственных средств и новых курсов терапии легочных поражений.

Цели и задачи исследования. Задачи настоящей работы

СОСТОЯЛИ В : .

(1)-исследовании химической модификации супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) :

Ч

N.

з -

и каталазы (КАТ)

(г) изучении сравнительных фармакокинетическнх свойств Ферментных препаратов :

(з! апробации : действия ферментных препаратов на модели экспериментального силикоза у крыс :

(4) определении роли дополнительного эффекта КАТ к действии СОД при терапии фиброза легких ; \

(5) обосновании возможности использований комбинированных ферментных препаратов для терапии легких (в форме составов/композиций или ковалентных коньюгатов).

Целью данного диссертационного изучения явилась экспериментальная разработка модифицированных производных супероксиддисмутазы и каталазы для автиоксидантной терапии легких при силикозе и апробация подходов для их применения при экспериментальной лечении. ■-' ■

Научная новизна работы.

1. В настоящей работе подобраны оптимальные условия получения навых ферментных средств на основе супероксиддисыутазы и каталазы. модифицированных альдегиддекстраном, проведено сравнительное изучение свойств натавных и модифицированных ферментов, отмечена повьпенная термостабильность последних в результате модификации.

2. Впервые получен и охарактеризован биферментный коваленткый коныогат КАТ-АД-СОД. сохраняющий обе специфический каталитические активности в системах in vitro и in vivo.

3. В работе впервые применены модифицированные ферменты СОД и КАТ для терапии силикоза, используя различные способы их введения.

4. На «одела экспериментального сшижоза показан дополнительный терапевтический эффехт каталазы к действию супероксиддисмутазы. Оценена эффективность антифиброзного действия каждого из препаратов (СОД-АД. КАТ-АД. КАТ-АД-СОД. СОД-АД-»КАТ-АД. СОДtКАТ. СОД, КАТ) при экспериментальном силикозе.

Практическая ценность работы.

1. В работе экспериментально обоснована целесообразность применения модифицированной СОД для терапии силикоза, г. На модели экспериментального силикоза продемонстрирован дополнительный защитный эффект каталазы к действию СОД.

з. Указан подход для проведения комбинированной гнзимотерапин этого заболевания с использованием Ферментных композиций, обладающих различными видами ферментативной активности : СОЛ (оксидоредуктаза) ■ антиоксидантноп и ■ гиалуронидаза (ГУ), гидролаза - делолимеризующей.

МшаОация работы. Результаты исследования были представлены ! на VIII и X Всесоюзных семинарах "Кислородные радикала в хинин. биологии и медицине" {Минск, 1990 г. Карочь. гэзгг.): на vu Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва. 1991 г.): на ill Всесоюзной конференции "Современное состояние я перспективы развития фармакокинетики" (Москва, 1991 г.); на XI конференции "Enzyme Engineering" (Hawaii, USA, 1991 Г.): на конференции "Asia-Pecific Biochemical Engineering Conference" (Yokohama. Japan. 1992); на иежлабораторном семинаре КНЦ РАМН (Москва. 1993 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано ю работ. Структура и объем работ»■ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, виводов и списка цитируемой литературы.(171 наименование). Работа изложена на 133 стр. машинописного текста, включает 13 рисунков и 9 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Перспективность практического использования ферментов обусловлена высокой эффективностью и избирательностью их действия. Однако, реальное широкое применение биокатализаторов в медицине сдерживается из-за низкой стабильности препаратов нативных ферментов в физиологических условиях. Для получения стабилизированных форм ферментов применяют химическую модификацию, в результате чего увеличивается время активного функционирования биокатализаторов в организме, возрастает их терапевтический эффект.

Одним из довольно иироко распространенных профессиональных заболеваний является силикоз, развивающийся от воздействия промышленных кварцсодерхащих аэрозолей. Заболеваемость силикозом высока среди рабочих, занятых в горнорудной и машиностроительной промышленности, в производстве огнеупорных материалов, размоле песка, проходке тоннелей, обработке гранита и напрямую зависит от

ч

условий и организации труда. К сояаленйэ. до сих пор не напдепо лекарственных средств. способных эффективно воздействовать на фиброзный -процесс в легких при силикозе.

При попадании в легкие человека кварцевой пыли развивается Фиброзный процесс, в результате чего касса легких и лимфатических узлов увелявдеается. в них растет содержание соединительнотканных белков. Существует различные точки 'зренья • на причины фиброгенностп квараеьой пыли, анализ данных о механизмах развития Фиброза свидетельствует о сложности и многосторонности специфического патологического процесса. включающего как иежклеточнве взаимодействия, так и биохимические и иммунологические реакции в ткани легких и организме в целом. По мнению больаинства исследователей, фагоцитоз частиц кварцевой пыли и гибель макрофагов являются обязательна« звеном в последующем формировании фиброзного процесса. При поглощении частичек кварцевой пыли макрофагами во внеклеточное пространство выделяется - супероксид-радикал и другие активные метаболиты кислорода. Кониофаг. то есть макрофаг, поглотивший частичку кварца гибнет и та же самая частичка опять попадает во внеклеточное пространство , вновь фагоцитируется и процесс повторяется. Таким., образом, в легких развивается воспалительный процесс, в очаге которого скапливаются нейтрофшш, при активации которых также происходит выделение во внеклеточное пространство активных метаболитов кислорода. '.

Итак, попадание кварцевых частиц в легкие приводит к генерации активных метаболитов- кислорода, в первую очередь супероксид-радикала. - Его спонтанное диспропориионнрование. а также диспропорционирование. катализируемая супероксиддисмутазой, приводят к образованию перекиси водорода. А взаимодействие мегяу супероксид-радикалом и перекисью водорода с присутствии железа ведет к образованию наиболее токсичного гидроксильного радикала. Таким образом. опасность появления избыточных количеств супероксид-радикалоз состоит в их способности взаимодействовать с перекисьп водорода с образованием мощного окислителя, способного атаковать ДНК. липиды мембран и - другие жизненно необходимые компоненты клетки.

Первичная защита осуществляется ферментами. которые каталитически устраняют промежуточные продукты- восстановления кислорода. Супероксид-радикал элиминируется суперс.тслддисмутаэой. которая катализ(фует его' превращение в перекис:, водорода' и кислород.' Перекись водорода разлагается каталаяоД, которая восстанавливает ее до волн Ясно, что эффективное удаление суперокснд-раднкала _ • и перекиси водородаV, предотвращает образование, пвдроксильного радикала, которий быстро реагирует со :шогиии веществами и специфическое ферментативное устранение которого невозможно. Из литературы известно, что активные метаболиты кислорода являются нормальными гродуктами аэробного метаболизма. Но в патологических условиях. например при.силикозе. их генерация избыточна и эндогениах {-ермэнтов антиоксгдантной защиты супсроксиддисмутазы и каталазы - оказывается недостаточно для эффективного удаления ' соответствующих субстратов. поэтому представляется целесообразным использовать для экспериментальной терапии силикоза экзогенные супероксвддисмутазу и каталазу и по возможности обеспечить одновременное попадание обок ферментов в зону поражения. Для повышения возможного лечебного воздействия мы использовали эти'ферменты в стабилизированном виде. Модификация ферментных препаратов применяется для- устранения таких негативных .свойств биокатализаторов как ' лабильность в физиологических условиях, -быстрое выведение из организма, ангнгеввосгь и т.п. Модификация; позволяет повысить эффективность действия ферментов по .сравнению с кх нативньми формами, что позволяет уменьшить величину Евсяюрй доги препарата и как следствие способствует снижению стоимости'курса терапии. Названный подхсд бил реализован нами ■ при исследовании возможности получения г применения ковалентно связанных с высокомолекулярным носителем COI и КАТ для экспериментальной терапии силикоза.

1.Носитель для аодибикзции Ферментов.В хачгстве носителя для стабилизации • СОД и КАТ использовали альдегидлекстргн. поскольку модификация биокатализаторов АД. как ранее было экспериментально показано, усиливает их терапевтический эффект при легочных поражениях. Кроме того, АД уже используется в клинической практике в составе модифицированных ферментных средств. Альдегиддекстран получали путам частичного окисления декстрана

периодатом натрия. Причем, условия окисления были подобраны так. чтобы s получаемо!.: альдегиддекстранэ было 20 альдегидных групп на ico гликозидных звеньев полимерной цэпп. 2.Получение кэнъагата супдроксиадиеыутазы с альдегиддекстрапом. Наилучшие воказатели связывания фермента с носителем (доля связанного йелка и величина остаточной каталитической акгизксати) были достигнута при использовании дехстрала-с молекулярной кассой 70 кДэ. Опяаильнык значением рН инхуЗационно1Ц саеси оказалось рН 8,5. Для получения конъпгатов модифицированной СОД брали различные соотноиения фермент-носитель: 1:0,05: 1:0.1: 1:1: 1:2; 1:5: 1:10; 1:зо. Варьирование концентрации алькегиядекстрана в инкубационной смеси показало, что по гель-хрсматогрэфэтескии (сефадекс с-200) и алактрсфоретическим (SDS-Сорэз) данннм наибольшее количество связанного бзлкг обнарузквается при соотношениях СОД:АД, равных l-.o.1 (конъггат-и или i;30 (конъагат-2} в инкубационной смеси. Концентрация носителя при этом составляет, соответственно, 1 и зоо мхМ. В результате связывания СОД м АД ( гель-хроматограмма представлен« на Ркс. .1) 30-S5* белга от исходного количества присosд инл s тс я к носителю.

0.01

, 23 22 55 40

05ЪЕМ l>o¡

Рис. 1. Гелх-хроматограмш (а) коньигатз-i СОД-АД. (б) натив-ноП СОД на колонке (К-16) с сефадехсоа с-200.

¡УКЬ

' I''

/«I .

, J \ ■

V-

глс^ггоагс vi;r.\\«K:: i--)

Рис. 2 . Денсчтограда.а SDS-электрсфсреза в ПААГ(5-20Х) препаратов А - СОЛ-АД. Б -КАТ-АД л D .- КАТ-АЯ-СОД.

Характеристики эти* коньюгатов и нативноп СОД приведена в таблице 1. Видно, что химическая Модификация повышает термостабильность СОД. Исходная' каталитическая активность натнвноИ СОД составила 1400 ед/мг, препарата, а коньюгата-1 (СОД-АД) - 450 ед/ш" препарата. При этом остаточная каталитическая активность коныогата-2 довольно низка.■ что может быть связано с чрезмерно высокой степень» модификации этого препарата (таблица 1). Для определения молекулярного состава полученных ферментных препаратов были изучены их гидродинамические свойства.

Таблица 1. Характеристики препаратов нативной и кодифицированной альдегиддекстраном супероксиддисмутазы.

Препарат Натйвная СОД-АД, СОД-АД,

Параметр СОД коныогат-1 коньюгат-2

Содержание Волка в

препарате (х| во зо з

Сохраняемая каталитическая активность

ед/мг белка (х) юо 86 13

Содержание аминогрупп на моль белка (X)

*) 100 32 1

Остаточная каталитическая активность после 3-х часовой

инкубации ферментных 75 90 87

ппопяпятов при 50 С

в о,1 й фосфатньм буфере рн 7,4 (х от исходной)

з. . Гидродинамическое исследование.* Экспериментально определяемыми параметрами б нашем исследовании были коэффициенты диффузии (С0) и седиментации (з01 СОД, АД а их кокыогатов при различных концентрациях, . препаратов. Найденные значения представлены. в таблице 2. Мы попыталась -подобрать подходящую молекулярную модель для полученных коньюгатов варьированием величин М} (либо 32, либо 16 . кДа, дкиер или мономер СОД. соответственно) в уравнении Сведберга .•

З«1 " %> = ^<1 - У,ро! + с6й2(1 - .

где и - соответственно молекулярная масса и удельный объем СОД в конъюгате. И2 и У2 - то же для АД в конъюгате. об- число

* Работа выполнена совместно с А.Д. Ыоррзкиныи и Е.Б. Минковсккм.

ч

\

Таблица 2

Пвдхдашашческие характеристики частиц СЩ, ДЦ и 1« кгашгатов и восе.сший состав этих частиц

Тип " дезтщ Н&тишая ООД , Эо, ВД. СЕВДбарга > ,3.5 Со 10,1 нм 2,1 ; МИ-^ 8 500 % соетев , 0ОД ДЦ 100 - м, сад 32 000 Ьа ДЦ • У смЗ/г 0,735. г/Ее (6=0,2) I в 5 I

шг1 ' 4,1 6,0 3,6 . 16 700 - .100 . - 69 000 0,7СЭ

' 3,3 7,5 2,9 10 800 73 27 32 ООО 12 100 0,742 1,150 3,50

Кошкгат-2 сод-од 2,3 7,6 2,8 7 400 53 47 16 000 14 300 0,746 1,325 6,15

где (Ь0,2 - степень ювдущзстБбНЮй пдаатац® макромолекул, р/а - отнсшние гзалкчиш болш*! псшуоаи вытянутого ажлсщца зрвдзния к шлей патусси (показатель стегани асимэтрш чесеи^) , /

г/£о - оонеявниз козйигеекта траш птсрапфСБаянсй /

частицы к иседа.де'.му тренж гатотетическгЛ части ^

того ив состава, ко шзсщэй акрсо^азную фад/, п5 - радиус С'гокса

молей - АД (или его остатков) на моль СОД, мк"м - молекулярная масса и удельный обьем коныогата.

Было • установлено, что коньюгат-1 можно представить частицей, состоящей из димера СОД. химически модифицированного остатком АЛ с молекулярной массой 12100 Да. Состав-частиц конъогата-1 ; 73%1 СОД и 27* АД (по весу).

Модификация СОД фрагментом/фрагментами АД связяна с возможностью деструкции последнего при щелочных значениях рН. Для коньюгата-2 наиболее адекватной молекулярной моделью является частица, состоящая, из мономера СОД и остатка АД с молекулярной массой изоо Да. Состав частиц : 53* СОД и их АЛ. Затруднительно говорить об истинной длине остатка/остатков АД в этой частице. Однако сравнение величин радиусов Стокса. оцененных по константам диффузии конъюгатов (таблица 2). показывает, что они близки друг другу (2.9 и 2.8 ни. соответственно) при большом различии радиусов составлягаих их белков (димера и мономера СОД, соответственно). По-видимому, в образовании коньюгата-2 участвуют более крупные остатки АД. Мы установили, что константы диффузии коньюгатов 1 и 2 очень близки друг другу, хотя молекулярная масса коньюгата-1 почти в 1,5 раза выпе. чем у коньюгата-2. Почти полная компенсация эффекта молекулярной массы возможна только за счет изменения степени асимметрии частиц. Параметр в/а показывает (таблица 2), что апроксимируя форму частиц эллипсоидом вращения, мы действительно получаем увеличение степени асимметрии для частиц коньюгата-2 по сравнению с конъюгатом-1. Для бяодедишшскях исследования ш использовали коньюгат-1. обладающий высокой величиной сохраняете ферментативной активности после модификации.

4. Фармакокинетическое исследование прзг-арзтор НЗТРРНОЙ и модифицированной супероксиддисмттазн. Сувественных различий в накоплении нативноЯ и модифицированной СОД после внутривенного введения швам в селезенке, легких, сердце не отмечено. Больае нативноБ. чем модифицированной, обнаруживается в почках, -что свидетельствует об определенной резистентности коньюгата СОД-АД к протеолизу. В результате кодификации отмечен пролонгированный характер пребывания СОД-АД с кровотоке, печени (соответственно \

"Ч

отношение времени полу-зизни модифицированного и нативного ферментов составляет 1.4 и ю). В целой, модификация СОЛ увеличивает время удержания препарата в организме ТРис. з). Эти данные позволяют надеяться на упроиение схемы введения модифицированной СОД по сравнению с нати-вной. Сходное со невысокой величине накопление препаратов'в легких свидетельствует о предпочтительности другого

(негели внутривенного) пути введения этого препарата (например, ингаляционного или внутрибрюииняого) для терапии экспериментальных легочных поражений. 5. .АнтиФиорозное действие изтивиой СОД и хоныогата СОД-АД. ** Известно, что попадание в легкие животных кварцевой пыли вызывает развитие фиброзного процесса. При этом возрастает масса легких и лимфатически; узлов, в легких растет содержание соединительных белков. Для изучения влияния разных форм СОД на развитие фиброзного процесса в легких крыс использовали ингаляционное введение препаратов. Данные, характеризующие развитие фиброза в легких крыс приведены в таблице з. Не обнаружено достоверных различий в кассовых коэффициентах г.ече-.м. почек, селезенки и сердца хизотных всех леченых групп по сравнении с крысами о экспериментальным силикозом (массовые коэффициенты - массу легких и лихфоузлов на, юо г пассы животного - рассчитывали с целью

Иэучениг экспериментальной терапии силикоза проведено совместно со специалиста«« НИИ гигиены труда а профзаболеваний Л.И. Безрукавн-лковой, О.Г. АрхиповсП и В.В. Яглозым.

Рис. з. Величина радиоактивности проб после внутривенного введения мызам препаратов нативной (1) и модифицированной АД (2) СОД суиагрно по воем исследуемым органам.

и иэдФадфовапиаЁ СХЩ

Еилеткчзаай нот£у®

Ммсльй коачиц-энт

саик лети (мгЛСОг) 124±43 <х>

МаосовьЛ ксз-^йишзкт сухих ликЬазлоа

(мг/КЙг) б±1

(*)

0эдзр;анда огя про-

лкта в лэпок (мг) 5,61±0,23

т

Сяяшоз (бзз леченил)

272130 100

21*3 100

12,02*1,28 100

Нахю.ная ОЭД

99,2

2&.4 112,4

12,63*1,24 1об,5

Кй.гьгат СОД-АД .

212±17* 78,0

26*1* 136,6

9,91±0,68* 82,5

Паазатапи $иСржюго грсцзсса в лэшк яр« посла щлрифаитого ведения бифдгагпш концгатоз сугероксидч смутам и каталазы •

. Изагаир 5

Показатель

Еиаюда-зский контроль

Силикоз (без ло-шм)

Овсь КАТ-ДДКОД-М

Кэиногат КАТ-АЦ-СОД

1г:йссов.-я жзйицкзнт

орт к легких (чг/КОг) 85±5 (£)

су л к да.фт/з/юз

(|^100г1 3±1

Ссрзр.адаа оиигюо-.таа в дагаих (мг) 5,10±р,70

(X)

ш

7,^,74

1см

6,63^,57 91,8

160(3* ■ 85,2

17±3* 121,4

5,71*0,60" 79Д

* - дрстовернсз отличие от групги ирис с аишоэсм бзз лечения (р< 0,05)

избегания влияния на исследуемые параметры изменения массы животных в теченне эксперимента). Массовые коэффициенты легких крыс..получивзшх хонъюгат СОЛ-АД. достоверно ниже зкачениг. этого показателя для животных с силикозом (таблица з). Лечение модифицированной СОД достоверно снижает и содержание соединительнотканных белков, определяемых по оксипролину. по сравнению с контролем. Однако массовые коэффициенты сухих лимфатических узлов достоверно превышают этот -^показатель в группе животных с силикозом. Нативная СОД в э^их условиях вообще не оказала тормозящего действия на развитие фиброзного процесса в легких при экспериментальном силикозе, а дейстзие декстрана не столь ощутшю.

Таким образои. благодаря модификации СОД кокъвгат СОД-АД оказывает заизтное антяфиброзное действие, снижая массовые коэффициенты легких ка 18-22%. Но при этом в качестве побочного эффекта терапии препаратами как натизной. так и модифицированной СОД зыступает увеличение массовых коэффициентов' лимфатических узлов по сравнению с группой силикоза.

о. Модификация каталазы. С целые повышения стабильности каталазы (увеличения времени удержания е организме, понижения лабильности в физиологических условиях) была проведена модификация фермэнта .13. Для.отого использовали альдегаддекстран с молекулярной массой 150 кДа. Намбольаах величин ховаленткого связывания фермента с носителем и остаточной каталитической активности .удается достичь при концентрации АД 5 ыкМ при соотношении з инкубационной среде фермент-носитель равном 1:5. Полученный так;;;.! образом препарат был подвергнут дальнейиеиу изучению. Активность исходной каталазы составляла зоб единиц/г.;г 'препарата, после модификации активность комплекса КАТ-АД 98 единиа/мг препарата. Некоторые параметры различных форм каталазы приведены в таблице 4.

Оптимальный способом получения бийерментного ко'нъагата КАТ-АД-СОД охазался трехотапний способ : модификация КАТ альдегкддекстроном - ковалентиое присоединение СОД - восстановление продуктов КеВН4. Гель-хроматографический профиль коньигага представлен на Рис. 4. Площадь пиков i и II составляет <9о+з)% к (ю+з)%. соответственно. свидетельствуя о заметном связывании белков з коньпгате. Параметры КАТ-АД-СОД приведена в таблице 4.

Специфическая активность конъ-югата зз единицы хаталазной активности/ыг препарата и 354 единицы СОД-активности/мг препарата. Отиетим. что модификация каталазы повышает ее тер-ностабильность з комплексе. КАТ-АД и кокьюгате КАТ-АД-СОД. Повыяег.ной термостабильностьо в конъюгате обладает и СОД. Данные SDS-элекгрофореза показали. что модификация ведет х образованию ковалектннх комплексов, обладающих знсокой гетерогенностью состава зой CL-5B. Стрелками обозна- (Рис. 2. В). Многокомпонентное^ чены положения пиков натизнкх кодифицированного препарата

ферментов КАТ (1) и СОД (г). не позволяет провести садимен-

тациокный анализ частиц. Вероятно, учитывая высокую степень модификации каталазы (заметно снижено содержание аминогрупп после модификации фермента, таблица 4) и возможность деструкции АД при связывании с белкой , moseo полагать, ^то ферменты ковалентно модифицированы остаткоа/остатками носителя. Действительно, основная полоса электрофорегра:.;« для КАТ-АД расположена (в сравнении с маркерами) в области > 200 kDa (Рис.2. Б), а для кошюгата КАТ-АД-СОД - > зоо !d>a (Рис.2. В). Предполагаемый состав этих козалентннх комплексов, вероятно, включает тетрааер каталазы и дммер супероксэддисмугазы, что минимально необходимо для проявления этими ферментами специфической каталитической активности. Учкткзая молекулярнуа массу полученных частиц, модификация биокатализаторов, по-видимому, осуществляется фрага-ентом/фрагыентак!! ¡гасителя.

7. Фзрмакокинетяческэе изучение препаратов каталазы. Накопление разных препаратов каталазы (после внутривенного введения уышам) в сердце, селезенке • и легких существенно не отличается друг от

Рис. 4. Гель-хроыатограммы конъ-югатов КАТ-АД-СОД (а) и КАТ-АД (б) на колонке (К-16) с сефаро-

Таблица 4. Характеристики препаратов нативноП. модифицированной АД к конъюгированкоа через него с супероксиддмсмутазоЬ каталазы.

Препарат Параметр

Нативная каталаза

22

ладь

29

Содержание белка в препарате (%)

Сохраняемая ката-лазная активность-ед/иг белка (*)

Сохрадаемая супе-роксиддисмутазная активность ед/мг белка (Я) .

Содержание аминогрупп на моль белка (*)

Остаточная каталитическая активность после з-х часовой инкубации ферментных аппаратов при

о,1 м фосфатном буфере

?Н 7,4

х от исходной)

57

100

100

каталаз-ная активность

СОД-ак-тавность

83

1б

40

<60

<70*

17

40

30

друга. Однако суимарно по всем исследуемым органам модификация каталазы увеличивает время ее удерхсакия в организме (Рис. 5). Основной вклад в это ьносит накопление модифицированной каталазы в печени, особенно препарата КАТ-АД, что, вероятно обусловлено высокой молекулярной массой модифицированных фору. Вместе с тем, не наблюдалось выраженного пролонгированного характера пребкьания модифицированной каталазы в кровотоке. • Исчезновение кош>::гата КАТ-АД-СОД кз.крови было даже более быстрым, чем комплекса КАТ-АД. Полученные результаты подтверждают, что для эксперицеиг-ально?. терапии легочных поражений препаратами каталазы более •предпочтителен другой способ введения, чс:.: внутривенный. 8.Сравнительное антийкброзное действк™ препаратов кртиеисй и мота^шидаоваркоЦ аля1егидгекстт>~иог' каталазы. На ьоделк экспериментального силвд:оза у крыс было показано, что поел* курса ингаляций ферментная препаратов цассовке коэффициенты печени, почек, о-елезекки и сгргла гйзэткнх из ессх лгчепглх групп ке и»-;гэт суяестэенимх оитчШ от пс!:азателзЯ группы кр::о с силикозом. Введение препаратов шлевной ил*л иодвфиц'-реззджо?, кг.аяазы

о

не оказывает существенного антнфиброз-ного действия. Отмечен о достоверное понижение массы сухих легких и их массовых коэффициентов в группе крыс, получавших смесь нативных КАТ и СОД, в сравнении с группой нелеченных животных,, что свидетельствует о торао--¿ении развития фиб- . розного процесса. Однако массовые коэффициента сухих лимфатических узлоз достоверно превышают значения показателей скли..оз;:цх крыс. Введение этой смеси достоверно сяигает я содержание окс^пооляна в легких зквоткых. Во всех группах крас показатели периферической крови (содержание гемоглобина, количестзо эритроцитов и лейкоцитов! существенно не отличаются от данных биологического контроля.

В конце эксперимента (практически.через з месяца после введения животным пыля) морфологические изменения в легких Рис. 6.А) характеризовались следующим образом. В легких крыс с экспериментальным силикозом содержались многочисленные мелкие и крупные гранулемы, часто с концентрически расположенными з н;»х клеточными элементами.- Среди них обнаружены сравнительно тонкие и толстые холлагеновне волокна. Степень фиброзирования более выражена з крупных узелках. Коллагеновые волокна окружают отдельные гранулемы, формируя вохруг них нежную фиброзную капсулу. Вокруг силикотических узелкоз часто видны эафизематозко измененные альвеолы. Полиыо этого, вокруг гранулем, в прилегавших к ним альвеолах, часто содержится серозный эксудат с примесь» альвеолярных макрофагов и д<?сквашрованнкх альзеолсиитов (с ерозно-десквамативннй альвеолит).

Рис. 5. Величина радиоактавности проб после внутривенного введения мнаам препаратов на-тивной КАТ (1), коньюгатов КАТ-АД (2) и КА7-АД-С0Д (3) суммарно по всем исследуемым органам.

Рис. Б. Очаговый серозно-десквамативный альвеолит <з мес. после интратрахеального введения в легкие крыс кварцевой пыли) (А). Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: об. 16, ок.Ю. Крупные сливающиеся силикогические гранулемы легкого белой крысы образованы макрофагами, фибробластами и содержат коллагеновые волокна. Серозно-десквамативный альвеолит (силикоз з мес.. леченный биферментным коньюгатоы КАТ-АД-СОД) (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: об.6.3. ок.ю. Многочисленные мелкие силико-тические гранулемы легкого белой крысы образованы ыахрофагаш.

В легких, крыс, получавших смесь . нативных СОД и КАТ, содержатся многочисленные, часто сливающиеся друг с другом, гранулемы. Большинство из них не содержит коллагеновых волокон, хотя в некоторых из узелков они присутствуют. В- легочных альвеолах, расположенных вокруг гранулем, как'правило. содержится серозный выпот- и десквамированные клетки- альвеолярной выстилки (серозно-десквамативный альвеолит). .„.-

Сравнительные данные. позволяют полагать. что лечение экспериментально вызванного силикоза смесью нативных СОД' и КАТ оказывает влияние на строну легких и существенно замедляет развитие в ней и в гранулемах коллагеновых волокон. Смесь нативных ферментов обладает заметным антифиброзным действием, снижая массовые коэффициенты легких на 23-27Х. как это похазано на Рис. 9. и превосходит действие СОЛ-АД.

120

£

к 33 ICO

х м L.

а О W 60

о

и а

% о н 60

X

ы и

а; Я ¿0

£> Z3

и

5 20

ч о

м о

5 м

№ я

а 120

о

4

5 100

3 -<о

1 L" &__

г 5 го

Já

i

Р'ло. 7. Изменение массовых коэффициентов легхих крыс в группах : 1 - биологический контроль, 2 - сил;:::оз без лечения. 3 - гочле ингаляционного введения сиесм кативинх СОЯ и ICAT.

Рис. 8. йзыенение массовых коэффициентов лимфоузлов крыс в группах : 1 - биологический контроль. 2 - силикоз без лечения. з - после ингаляционного введения СОД-ЛД, 4 -после чередования внутрибрю-зв:;нных инъекций коньюгатов СОД-АД к ГУ-АД.

Такиа образом, при экспериментальной терапии слликоза наблюдается дополнительный защитный эффект хаталазы к действия СОД^ что, по-.-видимому, объясняется последовательным устранением 02 и Н202. образующейся при длсыуталии 02, катализируемой СОД и КАТ в очаге поражения. В связи с эткы обстоятельством нам казалось интересным подтвердить полученнае аффекты использованием биферментного кокь-югата КАТ-АД-СОД, в котором заведомо гарантировано одновременное присутствие обоях ферментов в зоне поранения при усложнении схемы эксперимента (знутрибрюаикные инъекции) КАТ-АД-СОД в сравнении со стабилизированными формами СОД-АД и КАТ-АД.

З.ДптистбРозяое действие биферментного препарата каталазы и супе-роксиддисглутазы. После курса инъекций биферментиых препаратов мо-дифглкрсЕанках ферментов крысам с -экспериментальным силикозом было обнаружено, что массовые коэффициенты печени, почек, селезенки и сердца не имеют существенных отличий от показателей группы крыс

с силикозом. Отмечено некоторое снижение массы сухих легких и достоверное снижение массового коэффициента сухих легких (на 15%) у крыс, получавиих биферментный ковалентнай коныэгат КАТ-АД-СОД (таблица 5). Аналогичные показатели для комбинации КАТ-АД и СОД-АД (даже в стабилизированном виде) достоверно нг'отличались от величин в группе силикоза. Содержание оксипролина в легких жи-. вотных, леченных коньюгатом КАТ-АД-СОД. достоверно понижено по сравнению с нелеченными. Отмечено снижение содержания оксипролина на юо мг сухой ткани легких как для группы крыс, получавших КАТ-АД-СОД, так и для животных. леченных смесь» модифицированных фермевтов КАТ-АД и СОД-АД.

Морфологические изменения, в легких крыс с силикозом перед началом лечения были описаны выше. Картина, наблюдаемая через з месяца после введения пыли (без лечения), показана на Рис. 6.А. В те же сроки морфологические изменения в легких крыс, леченных как КАТ-АД-СОД характеризуются следующим образом. В легких наблюдается замедление развития силикотического процесса, выражающееся в образовании многочисленных, преимущественно . милиарных гранулем, состоящих из макрофагов без признаков фиброзирования. Вокруг силикотических гранулем выражен серозно-десквамативный альвеолит (рис. 6,.Б). В лимфоузлах имеет место очаговая гиперплазия клеток ретикулярной ткани. В печени н почках морфологических изменений не обнаружено.

Данные сравнительного, изучения позволяют полагать. что лечение экспериментально вызванного силикоза коньюгатом КАТ-АД-СОД замедляет слияние ¡¿илиарных гранулем в более крупные и торьозит развитие в них коллагеновых волокон. Отсутствие фиброзирования. гранулем хорошо подтверждается значительным снижением содержания оксипролина на юо мг ткани сухих легких в сравнении с группой силикоза.

Сравнительный анализ представленных данных обращает внимание на заметную эффективность действия композиции натизных КАТ и СОД. По отдельности ни нативная СОД. ни кативная КАТ антифлброзкой активностью не обладали. Сочетакное ингаляционное применение нативнкх КАТ и СОД позволяет достичь эффекта. сходного по величине с таковым при использовании модифицированной альдегиддекстраком СОД. Это не' только подчеркивает важность

использования композиций нативных ферментов при силикозе, но и свидетельствует о дополнительном запйтном эффекте каталази. ярко проявляющемся в этих условиях. Ведь и после курса внутрибрзашнных ин1екциЯ каталаза в состгЕЭ бгсферыентного /совалентного конъюгага также оказызала акт^фяСрозное действие, а при использовании комбинации КАТ-АЛ и СОЛ-АД заметного эффекта не обнарузилось. Вероятно пшпику различной зффективности действия смесей нативных и мод!<ф:-л1ировенных фесиентов предположительно можно видеть во влиянии метода ззеденая и/или биораспределения препаратов, поскольку ковалентный коньигат КАТ-АД-СОД з этих условиях гнтифиброзноэ дайствие оказывает.

Увг.г.!'чен!;е массовых коэффициентов лимфоузлов при такой экспериментальной терапии говорит о необходимости варьирования доз и состава используемых «оппозиций.

Ю.Аптдй'Лбтзозноч дэДстзиа комбинации " модифицированных алъдегиддзке-рат'этд супегоксиддисмутази и гигл''Рончдазы. Данняе эксперы-'гкталькой черспии елдйкоза л::быии из использованиях наыи ирепап£ть2 ант.-.окендантных йор^ентов ; как в нативной. так и в модифицированной форме) свидвтгльстзукт об увеличений массовых коэффициентов лдчфоугдоЕ как о побочном эффекте тской тарапил. Раной б«.ю показано, что гкелуронидаза, модифицированная альдагЕддехсграном, обладала Еыраггенным тормозящим действием на развитие фиброзного прэцеае^ при :иаилозе. Так как патологические изианеняз ши этой габолс-занич сложна и ыногосторояни. л."я его терапии какоолее оффгхт:;вьуу »юхет оказаться комплексный подход (энзиыотэрапия фермекгныык прзларагах! с снтпоксидэнтной - СОЛ а гидролитической - ГУ гктийноатяал). Для г.овиаеиия интенсивности возможного фармакологического чозаейстзкя мы использовали дадифшшрованнче альдегэддйксграко;.: производные этих ферментов. Наибольший заиитннй аффект пр;1 экспериментальном силикозе был достигнут при -лепелъзоваш:;; сиеск иатязннх СОЛ и УАТ. Снижение массовых хсзф*ншиочгов легких после двухмесячного курса ингаляция составило ез-;!7Х. но также солрозоздалось уЕелнченьеи. массовых коэффициентов лшфоузлое по сразнекиа с группой силикоза. Мы попытались устранить отст г.еяелятелъжй эффэкт применение« другой ферментной композиции, состояиая из СОД-АЗ и ГУ-АЗ ■ -

ферментных препаратов, различающихся по виду своей каталитической активности. С этой целью использовали чередование внутрибрюшпк:-шх инъекций препаратов СОД-АД и ГУ-АД крысам' с экспериментальных) силикозом и следили за развитием фиброзного процесса. Результатом чередования енутрибрюшиннах инъекций СОД-АД/ГУ-АД явилось снижение кассовых коэффициентов лимфоузлов ь группе леченных Животных в среднем на -2вх по сравнена» с показателями в группе крыс с силикозом. Рис. 8. Не наблсдалось достоверных различий в значениях массовых коэффициентов легких. Вместе' о тэм, морфологические дакш:е (не показаны) свидетельствует, что в . результате комбинированно? терапии в легких крыс замедляется.рост силикотичеоких грануле« и существенно уменьшается степень их фиброзированкя.' Достоверно пошжено такге содержание оксипролина в легких леченных зивотнкх. По-видииому, варьирование доз вводимых препаратов. как и состава'используемых композиций может позволить достичь больвих эффектов экспериментальной терапии. .

Таким образом, совместное применение антипероксидантных (СОД . и КАТ) и деполимеризующих (ГУ) ферментов .перспективно для дальнейшего" поиска. эффективных ферментных композиций, антифиброэного действия. Их использование, позволяет надеяться на достижение наибольших терапевтических эффектов (массовые коэффициенты легких, содержание окь;;пролина) при снижении побочного действия (массовое, коэффщиекти лимфоузлов) препарата при лечении силикоза. -.

.-. ВШОДН. '

1. Химическая- модификация СОД и КАТ г.:ьдегиддекстраном (как в" составе коЕалентиах кошыскбов СОД-АД-и КАТ-АД. так и в составе би-ферментного коныогата КАТ.-АДтСОД) приводит к повааению стабильности этих.фэрментных препаратов и времени их .удержания в организме экспериментальных жизотшх при сохранении высоких значений соответствующих . каталитических' активностер.: - что делает ".их - перег.окткв-нааи для лальнеПнего био^едщинского изучекм. .. ;

2. Хпаческгя модификация ССД альдегиддекстраном превраяает -это ферие'атное. • производное в потенциЕдьнэе средство".-анткфиброэной терапии. Конюга» - СОД-АД ирл гнгаляциокнои . ?зедении оказывает заметное антифиброзное дейстзие. тогда как нативная СОД в

условиях эксперимента зообде не оказывает тормозящего действия на развитие фиброзного процесса.

З.4 Экспериментальная терапия силикоза смесь» натмвных СОД и КАТ при ингаляционном введении препаратов, как и внутрибршинное введение конъигата КАТ-АД-СОД, свидетельствует о дополнительном защитном эффекте каталаэы по отнесению :с действию одной СОД. ' 4. Комбинированное применение антипероксядантных и деполимерг^уп-икх ферментов в кодифицированном виде обеспечивает достижение благоприятной картины экспериментальной терапии по основным и побочным показателям и пригодно для дальнейшего поиска эффективных ферментных композиций (составов) аатифиброзного действия. 5. На основе модифицированных ферментов антиоксидантного и депо-лимеризлздего действия перспективна разработка курсов терапии легочных поражений с использованием методов введения препаратов, обеспечивавших их заметное и одновременное попадание к очагам поражения.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Максименхо A.B., Григорьева Е.Л.. Морозкин А.Д.. Тияенко Е.Г.. Минковский Е.Б.. Торчилин B.C. Оценка состава и строения ковален-тных комплексов супероксиддисмутазы с альдегиддекстраном методом аналитического ультрааентрифугирования // Биохимия. 1991. т.56. N7, С.1330-1336.

2. Максименко А.В . Григорьева Е.Л., Безрукавникова Л.М.. Петров А.Д., Тищенко Е.Г., Архипова О.Г., Торчилин В.П. Антифиброзное, действие модифицированной альдегиддекстраном супероксиддисмутазы при экспериментальном силикозе // Билл, экспер. биол. мед.. 1931. N 9, С.265-267.

3. Максименко A.B.. Безрухавникова Л.М.. Григорьева Е.Л.. Тияенко Е.Г., Архипова О.Г., Яглов В.В., Торчилин В.П. Антифиброзное действие модифицированных форм каталазы и супероксиддисмутазы при экспериментальном силикозе// Вопр. мед. химии. 1992. т.38. N3.

С.4-8.

4. Максименко A.B.. Безрукавникова Л.М., Григорьева Е.Л.. Петров А.Д.. Тищенко Е.Г..-Яглов В.В., Торчилин В.П. Комбинированное применение модифицированных альдегиддекстраном супероксиддисыута- ■ зы и гиалуронидазы снижает побочные эффекты гнтифиброзной терапии

при экспериментальной силикозе у крыс // Хим-фарм. х.. 1993. т. 27. n 1. с.11-13. *

5: Григорьева Е.Л.. Морозкин А.Д;„ ¿аксименко A.B.. Торчилнн В.П. Оценка состава и строения "ковалентных:комплексов супёроксиддисму-тазы с альдегиддекстранои методом аналитического ультрацентрифугирования // В сб. тезисов vir Всесовзного: симпозиума "Инженерная анзимология", Москва. 8-12 апреля 1931 г. .-с. 82-83. - .

6. Максименко A.B.. Григорьева Е.Л.. Безрукавникова Л.Ы.. Петров А.Д., Тищенко Е.Г.. Архипова О.Г.. Торчилнн В.П. -Антифиброзное действие модифицированной альдегиддекстраном супероксиддисыутазы -при экспериментальном силикозе // В об. тезисов VII Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология*. Москва. 8-12 апреля 1091 г.,

С. 81-82.

7. Максшенко A.B.. Петров А.Д., Григорьева Е.Л.. Тиденко Е.Г.. Торчилин В.П. Влияние ковалентной модификации, супероксиддисмутазы и каталазы на фармакокинетику ферментных препаратов // В сб. тезисов ill Всесоюзной конференции по фармакокиветике. "Современное состояние и перспективы развития фармакокинеткки*. Москва. 18-19 декабря 1991 г., с.51.

8. Максименко A.B.. Григорьева Е.Л.. Безрукавникова Л.М. Антифиброзное действие модифицированных альдегиддекстраном супероксид-дисмутазы и гиалуронидазы при экспериментальном силикозе у крыс// В сб. тезисов IV конференции "Биоантиоксидант", Москва. 2-4 июня 1992 Г. .

9. Maksiaenko V., Bezrukavnikova L.ll. ., Grigoryeva E.L. . Yaglov V.V., Torchilin V.P. Effect of native and modified forns of superoxide dismutase and catalase on experimental silicosis in rats. Ann- New York Acad. Sei., 1992, v. 672, p.118-125.

10. Maksimenko ¿.V.. Bezrukavnikova L.ll.. Grieoryevo E.L. . Petrov A.D., Tischenko E.G.. Yaelov V.V.. Torchilin V.P. Antifibrosis effect of enzyme compositions (superoxide dismutase. catalase. hyaluronidase) .in experimental silicosis. "Biochemical Engineering for 2001" (Eds. S. Furusaki. I: Endo. E. Hatsuno) ' Springer Verlag : Tokyo - Berlin - Heidelberg - New York - London

- Paris - Hong Kong - Barcelone. 1992. p.648-648.