Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модернизация метода оценки качества спермы и определение степени влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Модернизация метода оценки качества спермы и определение степени влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей"

На правах рукописи

9-г

ЖАВОРОНКОВА Надежда Викторовна

Модернизация метода оценки качества спермы и

определение степени влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей

03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 ь Ш 2014

Дубровицы - 2014 005549445

005549445

Работа выполнена в лаборатории эмбриологии и биологии воспроизводства сельскохозяйственных животных центра биотехнологии Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель:

АВИЛОВ Ахмедага Имаш оглы, доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник

Официальные оппоненты:

БУКАРОВ Нурмагомед Гаджи кул иевич,

доктор биологических наук, профессор, нача1ьник лаборатории иммуногенетической экспертизы ОАО «Московское» по племенной работе

ФЕДОТОВ Сергей Васильевич,

доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой акушерства, гинекологии и биотехники репродукции животных ФГБОУ ВПО МГАВМиБ

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение «Российская академия менеджмента в животноводстве»

Защита диссертации состоится «» июля 2014 года в 10.00 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006 013 01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу 42 32, Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, т/факс 8 (4967)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии на сайте института www.vii.ru.

Автореферат разослан « » мая 2014 года

Ученый секретарь Совета Д 006.013.01

л

С.В. Воробьева

1. общая характеристика работы

Актуальность исследований. Важнейшей задачей интенсификации животноводства и повышения уровня племенной работы является совершенствование технологии оценки качества спермы. (Эрнст JI.K., 2004; Десятое В.Г. и др., 2004; Амерханов Х.А., Абилов АИ., 2011).

Используемые в практике племпредприятий критерии биологической оценки спермы не имеют стабильной корреляции с оплодотворяющей способностью и не полностью отражают биологической полноценности сперматозоидов (Hallap Т., 2005; Турчанов С., 2008). Совершенствование методов оценки качества спермы находился в центре внимания многих зарубежных специалистов (Leiding С. et al, 2009; Singh A. et al, 2012; Vincent P. et al, 2012). В частности, представляет также интерес изучение влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей разных возрастных категорий.

Цель исследований. Разработать новые технологические элементы при оценке спермы и изучить влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей.

Задачи:

изучить физиологическое состояние быков-производителей на основе биохимических, гематологических и сперматологических показателей;

- определить качественные характеристики спермы на разных технологических этапах в сравнительном методическом аспекте, уточнить распределение сперматозоидов по скорости движения и ее связь с качеством спермы;

- выяснить взаимосвязь между скоростью движения сперматозоидов с их выживаемостью после замораживания-оттаивания и влияние ее на результат искусственного осеменения;

- разработать комплексный метод оценки качества спермы с помощью отечественного спермоанализатора SFA-500

- изучить влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей;

- сравнить степень влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на показатели спермы быков-производителей разного возраста.

Научная новизна. Представлен новый модифицированный метод определения

качественных и количественных характеристик спермы быков-производителей на всех

этапах технологического процесса, на основе лазерного анализа частотного спектра

флуктуаций оптической плотности образца сперматозоидов, вызванных их движением через

3

оптический канал со специальными характеристиками при помощи спермоанализатора ЭРА-500.

Изучено влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей голштанской породы в зависимости от возраста. (Данный раздел диссертационной работы выполнен при финансовой поддержке Федерального государственного бюджетного учреждения «Фонд содействия развитою малых форм предприятий в научно-технической сфере», грант №702).

Практическая значимость работы. Определено общее физиологическое состояние быков-производителей на основе биохимических, гематологических и сперматологических показателей. Разработан, апробирован и внедрен новый метод комплексной оценки спермы быков-производителей при помощи отечественного спермоанализатора 5РА-500 в нашей модификации. Установлена зависимость результата искусственного осеменения от скорости движения сперматозоидов после замораживания-оттаивания.

Выявлена степень отрицательного влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей разных возрастных групп.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены, обсуждены и одобрены на: конференциях лаборатории эмбриологии и биологии воспроизводства сельскохозяйственных животных Центра биотехнологии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии 2008-2014гг; международной научно-пракгаческой конф. «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» / РАМЖ, пос. Быково, Моск.обл., 2013; науч.-практ. конф. молодых ученых «У.М.Н.И.К.» / ВИЖ, 2013; получен грант №702.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, основной части, заключительной части, списка сокращений, библиографического списка, приложений. Материал изложен на 128 страницах печатного текста, содержит 22 таблицы и 16 рисунков. Список литературы включает 222 источника, в том числе 76 на иностранных языках.

Основные положения, выносимые на защиту:

- физиологическое состояние быков-производигелей на основе биохимических, гематологических и сперматологических показателей;

- новый модифицированный комплексный метод оценки качества спермы быков-производителей отечественным спермоанализатором 5РА-500 производства НПФ «Биола»;

- новый протокол исследования для нативной и заморожено-оттаянной спермы быков-производителей;

скорость движения сперматозоидов быков-производителей на разных технологических этапах криоконсервации и ее связь с оплодотворяющей способностью;

- влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на показатели спермы быков-производителей и степень ее отрицательного воздействия на спермопродукцию в разных возрастных группах.

Личный вклад автора состоит в аналитическом обзоре литературы, осуществлении лабораторных и производственных экспериментов, обработке, анализе полученных данных, подготовка и публикация результатов исследований, подготовке промежуточных и заключительных отчетов о научно-исследовательской работе

Автор выражает глубокую благодарность за неоценимую помощь, всестороннюю поддержку и содействие доктору биологических наук, профессору Авилову А.И. (ГНУ ВИЖ) и главному технологу ОАО «ГЦВ» кандидату биологических наук Комбаровой Н.А. и главному технологу ОАО «Московское» по племенной работе кандидату с-х наук Малиновскому А.М.

2. материалы и методы исследований

Работа выполнена в лаборатории эмбриологии и биологии воспроизводства сельскохозяйственных животных центра биотехнологии, лаборатории биохимических анализов ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, ОАО «ГЦВ», ОАО «Московское по племенной работе», колхозе им. Ленина (племхоз) Касимовского р-на Рязанской области в 2008-2013гг. по следующей схеме (рис.1).

Модернизация метода оценки качества спермы н определение степени влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков производителей

-------- Физиологическое состояние быков-производителей: биохимическое, гематологическое, сперматологическое(п=61)

Автоматическая комплексная оценка качества спеимы быков-поонзводителей --- Факторы, влияющие на спермопродукцию в зависимости от возраста н продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии -i

Объем спермы, мл

Концентрация, млрд'мл

—► -»

Общее число сперматозоидов в эякуляте,млрд. 5-6 лет

Выбраковка эякулятов, % 9-11 лет

/

Подвижность, % Предполагаемые экономические потери

—* Скорость движения, юсм/с Осеменение телок спермой, отличающихся между собой по скорости движения сперматозоидов

Взаимосвязь между скоростью движения и выживаемостью сперматозоидов на всех этапах *

-•-.--_-__ Сравнительный анализ данных и их связь с оплодотворяющей способностью спермы j

Рисунок 1 - Общая схема исследований

Использовали быков-производителей (п=61) голштинской породы. Всего было исследовано 1718 эякулятов. Для осеменения использовали 104 телки голштинизированной черно-пестрой породы.

Биохимический анализ крови (показатели альбумина, креатинина, мочевины, глюкозы, общего билирубина, холестерина, Са, Р, Mg, Fe, хлоридов, АЛТ, ACT, щелочной фосфатазы) был проведен на биохимическом анализаторе (ChemWelI-2902-Awareneess Tehnology, США). Микроэлементы: Cu, Zn, Se, Мп в цельной крови атомно - абсорбционным спектрометром («Квант-2А»), Гематологические показатели - на ветеринарном гематологическом анализаторе (ABC VET) в лаборатории биохимического анализа. Изучали влияние этих показателей на жизнедеятельность сперматозоидов и воспроизводительную способность быков-производителей в сравнительном аспекте.

Сперму быков-производителей оценивали в два этапа: в лаборатории при манеже и в лаборатории криобиологии. При этом учитывали: подвижность - по 10-балльной шкале или в % под микроскопом (х200), концентрацию (млрд./мл) - с помощью ФЭК и камеры Горяева, общее число сперматозоидов в эякуляте (млрд.) путем расчета (объем * концентрация), выбраковка спермы (%). Использовали эякуляты с подвижностью не менее 70%, концентрацией не менее 0,8 млрд/мл, и объемом не менее 2 мл. Эякуляты, полученные от одного быка за один технологический день объединяли и разбавляли, эквилибрировали, фасовали и замораживали в соответствии с «Национальной технологией замораживания и

6

использования спермы племенных быков-производителей» (Виноградов В.Н., Стрекозов Н.И., Абилов А,И. и др., 2008).

В качестве нового приема по оценке спермы использовали отечественный спермоанализатор SFA-500 (производства НПФ «Биола»), принципиальная схема которого показана на рис 2.

Установка и подключение прибора к компьютеру через USB-порт проводили согласно руководству по эксплуатации. Сборку камеры осуществляли перед началом работы. В

Рисунок 2 - Схема прибора Через 2,5 мин в диалоговом окне появлялся результат измерения. Прибор автоматически производил новую запись результатов в реестре проведенных исследований.

Метод достаточно точен и позволял автоматизировать работу по оценке нативной и криоконсервированной спермы, отражал основные показатели подвижности и концентрацию сперматозоидов. Однако, в предлагаемом разработчиками варианте, метод не мог использоваться для оценки спермы быков-производителей, т.к. прибор был разработан для оценки спермы человека и нуждался в модификации программного обеспечения (Патент РФ № Яи 83138 Ш, Попов Е.Г., 2009).

Телок в охоте отбирали визуально по «рефлексу неподвижности». Осеменение осуществлено рекгоцервикальным способом. Стельность определена ректальным способом через 45-60 дней после осеменения.

Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на воспроизводительную способность изучали на быках-производителях голштинской породы зарубежной селекции, завезенных из умеренных климатических зон (4 быка-производителя в возрасте 5-6 лет, 8 быков-производителей в возрасте 9-11 лет). Метеорологические данные взяты в Домодедовской метеорологической службе с 1 мая по 30 ноября 2010 включительно. Данный опыт продлился 210 суток в 4 этапа: I этап - контроль, II этап (опытный период), III этап (восстановительный период), IV этап - контроль II. Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального государственного бюджетного учреждения «Фонд содействия

процессе работы использованные камеры промывали в проточной, затем в дистиллированной воде, протирали насухо. Камеру в сборе вставляли в специальное отверстие анализатора. После включения сетевого питания, запускали программу Б А, при достижении 38°С приступали к работе. Образец перемешивали, отбирали пробу 50 мкл (без воздушных пузырей). Для этого наконечник пипетки вводили в цилиндрическое отверстие камеры, не касаясь ее, выпускали отобранную пробу.

развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» («Фонд содействия инновациям»).

Полученные данные статистически обработаны с помощью программы Microsoft Office Excel на персональном компьютере.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Физиологическое состояние быкоа-производителей. Проведен мониторинг по гематологическим и биохимическим показателям сыворотхи крови у быков-производителей для выяснения физиологического состояния животных, подобранных для опыта (Табл.1).

Показатели Ед.изм. Фактические показатели М+ш Вариабельность Min-raax Физиологическая норма Н-норма >выше нормы <ниже нормы

Общий белок г/л 80,32±5,00 63,16-92,93 72,0-86,00 н

Альбумин г/л 30,77±2,76 19,5-34,83 27,00-43,00 н

Глобулин г/л 49,55±4,64 35,34-60,18

AT Ед. 0,64±0,07 0,34-0,73 0,6-1,0 н

Мочевина Ммоль/л 3,76±1,45 2,31-9,61 3,30-7,49 <

Креатинин Мкмоль/л 128,76±26,14 99,91-247,61 55,80-176,80 н

Билирубин Мкмоль/л 4,78±1,12 2,63-8,12 0,20-5,10 н

АЛТ МЕ/л 24,29±4,08 15,76-45,20 6,90-35,30 н

ACT МЕ/л 62,51±7,03 47,88±82,07 45,30-110,20 н

Са Ммоль/л 2,49±0,2б 2,1-3,36 2,38-3,38 н

Р Ммоль/л 2,15±0,42 1,72-3,72 1,45-2,10 >

Отношение Са:Р 1,53±0,25 0,85-1,92 1,7-2,0 <

Mg Ммоль/л 0,88±0,10 0,69-1,15 0,82-1,23 н

Fe Ммоль/л 31,41±5,23 20,62-43,77 17,90-28,64 >

Se Ммоль/л 1,10±0,24 0,53-1,63 0,62-1,52 н

Си Ммоль/л 15,85±2,20 13,02-23,48 12,6-17,3 н

Zn Ммоль/л 40,64±7,02 24,65-55,67 38,5-77,0 н

Щел. фосфатаза МЕ/л 285,92±72,91 93,18-444,25 17,50-152,70 >

Глюкоза Ммоль/л 3,83±0,36 2,51-4,41 2,23-3,33 >

Холестерин Ммоль/л 2,15±0,39 1,39-3,17 1,30-4,42 н

Хлориды Ммоль/л 105,32±4,14 97,5-113,82 95,70-108,60 н

Щел. резерв Об/%СОг 53,5б±3,55 46,37-62,5 46-66 н

Каротин Мкг/% 90,64±63,44 37,35-366,96 400-1000 <

Витамин А Мкг/% 69,50±33,59 28,55-228,40 24-80 к

Лейкоциты 109,л 8,04±1,42 6,15-12,64 4-12 н

Эритроциты Ю'\л 7,89±0,73 5,64-9,72 5-10 н

Гемоглобин г/л 117,04±10,28 94,7-144,0 99-129 н

Гематокрит % 38,00±3,14 30,58-48,71 24-46 н

Из таблицы 1 видно, что в основном все параметры белково-липидного обмена: были в норме. Электролитный обмен (Са, Р, Mg, Fe, а также концентрация хлоридов) и содержание микроэлементов (Си, Zn, Se, Mg) в сыворотке крови в среднем у всех животных соответствовал нормативным показателям, кроме Fe, Se и Са/Р отношения (1,53 при норме 1,7-2,0). Анализ состояния витаминно-ферментной системы показал, что концентрация каротина (предшественника витамина А) была ниже нормы, тогда как показатель витамина А соответствовал нормативу. Уровень АЛТ, ACT и щелочной резерв находились в норме, а содержание щелочной фосфатазы в крови увеличено на 60%.

Гематологические показатели быков-производителей в основном находились в физиологическом нормативном диапазоне.

В таблице 2 приведены показатели спермопродукции показатели быков-производителей.

Таблица 2 - Спермопродукция быков-производителей

Показатели спермопродукции Факт, М±т Норма

Объем эякулята, мл 4,3±0,6 2>

Концентрация, млрд/мл 1,6±1,8 0,8 >

Кол-во сперматозоидов в эякуляте, млрд 5,1±1,2 1,6 >

нативная 70-80 70% >

Подвижность, % После 0 34,7±6,0 40% >*

оттаивания 5 10,6±4,8 5%>

Примечание: * - допускается для спермы высокоценных и востребованных быков-производителей подвижность 30% и выше.

Из таблицы 2 видно, что все показатели спермопродукции быков-производителей соответствуют технологическим параметрам.

3.2. Разработка метода комплексной оценки качества спермы быков-производителей с помощью отечественного спермоанализатора вРА-500. Представлен метод определения основных характеристик спермы с помощью отечественного спермоанализатора 8РА-500 со следующими модификациями: внесение изменений в программное обеспечение, разработка нового протокола исследований, калибровка прибора, подборка оптимальной степени разбавления нативной спермы. Также изучена возможность применения спермоанализатора в технологической цепочке получения и криоконсервации спермы быков-производителей.

Разработан протокол для быков-производителей в форме бланка исследований спермы. Настоящие изменения к протоколу составлены на основе стандартных методик исследований свежевзятой и заморожено-отгаянной спермы быков-производителей. Были предложены к введению в протокол (табл. 3) параметры, наиболее полноценно

демонстрирующие качественные и количественные характеристики спермы. В протокол

внесены графы ручного и автоматического заполнения.

Таблица 3 - Протокол оценки спермы быков-производителей в рабочем режиме Сперма криоконсервированная

Кличка Презент

№ быка 105585572

Порода голштинская

Линейная принадлежность Рефлекшн - Соверинг

Визуальная оценка и до.

Показатель Результат Норма

Степень разбавления 10

Дата криоконсервации 13.12.2013

Серия 1091213

Технология пайепы

Количество доз 200

Объем дозы 0,25

Разбавитель ЛГЖ

Бакзагрязненность На исследовании Не более 500 МТ

Коли-титр, см3 - отрицательный

Измеряемые параметры

Концентрация, млн/мл 36,2

Подвижность,а+Ь,% 50,7 Не менее 40%

Быстроподвижных, а,% 31,7

Медленноподвижных, Ь,% 19

Средняя скорость, мкм/с 81,1

Кол-во сперматозоидов с ППД, млн/мл 18,35

Апробация разработанного метода. Спермоанализатор модифицировали применительно к сперме быка так, чтобы конечная концентрация измеряемого образца укладывалась в диапазон измерений прибора 2-250 млн/мл. Для чего пробы нативной

спермы были разбавлены в 2-32 раза и одновременно исследованы в анализаторе и при помощи камеры Горяева (рис.3).

Как видно из рис.3, концентрация нативной спермы совпадает в различных методах измерения, начиная с разбавления в 4 раза.

Результаты определения оптимальной степени разбавления для определения подвижности показаны в табл.4.

ручной метод

■ автоматический метод

Рисунок 3 - Сравнение результатов измерения концентрации автоматическим и ручным методами (п=12)

Таблица 4 - Сравнение результатов определения подвижности спермоанализатором и

Степень разбавления Процент подвижности спермы

Традиционный метод Новый метод (спермоанализатор)

Подвижных Быстроподвижных Средняя

2 58,5±0,7 32,0±1,4 28,0±1,1 81,5±1,9

4 55,5±1,2 48,9±2,1 42,3±1,8 74,6±1,5

8 53,7±0,6 54,8±1,9 41,5±1,4 65,4±0,9

16 50,0±0,5 51,б±3,0 37,7±1,8 64,4±2.1

32 45,0±1,2 56,0±1,9 37,3±2,3 55,2±3,3

Установлено, что оптимальный рабочий диапазон разбавлений для изучения подвижности спермы находится в пределах 30-150 млн/мл (2-32), Наибольшее совпадение между автоматическим и визуальным методами наблюдается при разбавлении нативной спермы в 8-16 раз.

Подсчет концентрации

криоконсервированной спермы одновременно в I камере Горяева и автоматически на анализаторе (рис.4) показ&ч, что данные совпадают с

анализатор

камераГоряева

Рисунок 4 - Концентрация криоконсервированной спермы

традиционным методом оценки. Выяснено, что оптимальное рабочее разбавление нативной спермы для измерений качественных и количественных характеристик находится в пределах 8-16, для густой спермы до 32 раз.

Проведено сравнение количественных и качественных характеристик спермы быков-производителей на всех этапах технологического процесса автоматизированным и традиционным методами (рис.5).

я спермоэиализатор в микроскоп

X У

Рисунок 5 - Сравнение характеристик спермы быков-производителей на разных этапах технологического процесса (п=48)

Как видно из рис.5 подвижность в нативной сперме, определенная визуально, на 17% превышала результат, полученный автоматическим методом, в тс же время криоконсервированная сперма была оценена обоими методами практически одинаково.

Влияние всех технологических процессов на динамику характеристик спермы быков-производителей отражено на рис 6.

Цифрами обозначены технологические этапы: 1 - свежевзятая сперма; 2- первое разбавление;

3 - второе разбавление;

4 - фасовка;

5-8 - каждый час эквилибрации;

9 - подвижность сразу после опаивания;

10 - подвижность после 5 часов инкубации при +38°С.

О -,----,------Т----,---,---г------- О -Ц-—г--,-т—-т---,-:-,-,--

123466789 10 123466789 Ю

1 23456739 10

—*— средня* скорость..мюл/с»* I

Рисунок 6 - Влияние технологических этапов криоконсервации на динамику характеристик спермы быков-производителей.

Выяснено, что снижение процента подвижных и быстроподвижных сперматозоидов наблюдается при первом и втором разбавлении, затем идет плавное снижение качественных показателей и количества подвижных клеток на 24% по отношению к исходной подвижности в нативной сперме, тогда как непосредственно процесс криоконсервации сокращает количество подвижных сперматозоидов на 18%.

Подвижность в нативной сперме определяли при малом увеличении и высокой концентрации клеток (около 500 и более млн/мл). В нашем случае эти эякуляты имели визуальную оценку 80% подвижных сперматозоидов в поле зрения. Параллельный подсчет подвижных клеток в спермоанализаторе 8РА-500 составил 64,2%, 60,5% сперматозоидов после первого разбавлении были определены как полноценные подвижные. Подвижность после оттаивания составила 39%, из них быстроподвижных определено 16% (скорость движения 25 и более мкм/сек). Предполагается, что неразрушенные в процессе криоконсервации сперматозоиды имеют среднюю скорость 25 мкм/сек и более. Установлено, что после криоконсервации скорость движения сперматозоидов в оттаянной сперме

Проведен анализ 48 эякулятов в зависимости от средней скорости движения сперматозоидов после пятичасовой инкубации спермы (табл.5).

Таблица 5 - Взаимосвязь между начальными (нативная) и конечными (оттаянная

после 5 ч инкубации) качественными характеристиками спермы

Группы эякуля тов/ п Нативная сперма Оттаянная сперна 0 ч Оттаянная спериа 5 ч

Подвиж ных % Быстрых % Средняя скорость икм/с Подвиж ных % Быстрых % Средняя скорость мки/с Подвиж ных % Быстрых % Средняя скорость мкм/с

1/13 64,0±3,7 40,1±3,2 51,8±2,0 27,1±2,7 «,3±1,0 28,9±1,7 11,8±1,3 3,1±0,3 26,3±1,5

1/15 59,3±3,1 39,4±2,3 54,3±1,6 42,2 ±2,4 16,9±1,8 36,5±2,2 19,5±1,6 7,1±0,3 35,5±1,4

III/10 62,7±4,8 42,7±2,9 54,8±2,4 45,3 ±3,3 18,9±1,8 37,9±2,4 31,4±1,9 12,3±0,4 36,2±1,6

IV/7 57,0±4,0 36,9±3,9 53,9±3,5 45,4±2,7 19,8±1,4 39,1±!,8 35,2±1,4 16.2±0,5 40,3±1,8

V/3 59,9±3,6 40,6±4,7 57,4±1,5 45,1 ±0,1 24,7±0,9 48,1±3,6 47,3+6,5 27,0±0,1 44,7±4,7

Установлено, что первичная оценка нативной спермы не может служить четким маркером качественных характеристик спермы после криоконсервации. Для уточнения связи между подвижностью и скоростью движения условно разделили эякуляты на 5 групп по подвижности: I -1-5%; II - 5-10%; III - 10-15%; IV - 15-20%; V- От 20%. Во всех группах не было значительных различий между показателями. Однако сразу после оттаивания наметилась тенденция распределения эякулятов в зависимости от средней скорости движения сперматозоидов. В первой группе подвижность составила 27%, количество быстрых (функциональных) сперматозоидов 8,3%, средняя скорость 28,9 мкм/сек. В остальных группах подвижность находилась на уровне 42%. количество быстроподвижных пропорционально увеличивалось от 17 до 24,7%, средняя скорость в первой группе составила 29 мкм/сек, во второй и третьей группах находилась на уровне 37 мкм/сек, а в пятой группе была на уровне 48 мкм/сек. Разница между первой и пятой группами по скорости движения сперматозоидов составила 19 мкм/сек. Через пять часов инкубации при +38°С криоконсервированной спермы наблюдалось более резкое расхождение в подвижности и по скоростям движения сперматозоидов между группами. Так значительно сократилось количество подвижных во второй группе до 19,5%, также в 2,5 раза сократилось число функциональных клеток. В среднем на 12% сократилось число подвижных в третьей и четвертой группах. В пятую группу попали эякуляты, практически не изменившие свои характеристики после пяти часов инкубации.

Выяснено, что после криоконсервации-отгаивании сперму условно можно разделить на три основные категории: удовлетворительная (1 и 2 группы), хорошая (3 и 4 группы) и отличная (5 группа). Отличная сперма: подвижных не менее 40%, быстроподвижных не менее 20%, средняя скорость не менее 40 мкм/сек. Хорошая сперма: подвижность не менее 40%, количество функциональных клеток 10%, средняя скорость не менее 35-40 мкм/сек.

13

Удовлетворительная сперма: подвижность от 10% до 30%, быстроподвижных не менее 3%, средняя скорость не менее 25 мкм/сек.

На основании полученных данных предложена методика автоматической комплексной оценки спермы быков-производителей, которая обсуждена и одобрена на Ученом совете ВИЖа: протокол № 19 от 26 октября 2009г., опубликована в сборнике инновационных разработок ВИЖа «Система повышения эффективности воспроизведения крупного рогатого скота» под редакцией А.И Авилова и Н.М. Решетниковой, Дубровицы, 2010, с.29-50.

Доказана возможность использования спермоанализатора БРА-500 НПФ «Биола», предложенного для медицинских исследований, с внесенными нашими изменениями и дополнениями в программное обеспечение с целью определения основных качественных и количественных характеристик нативной и криоконсервированной спермы быков-производителей. Разработка внедрена и используется в повседневной практике в ОАО «ГЦВ»с2011 года.

Оплодотворяющая способность быков-производителей в зависимости от скорости движения сперматозоидов. Для осеменения телок была использована сперма от 12 быков (по 20-30 доз от каждого), в зависимости от скорости движения сперматозоидов в эякуляте: низкая, средняя, высокая (табл.6).

Труп па Скорость движения, мкм/с Количество быков Подвижность через 5 ч. после оттаивания в % Средняя скорость, мкм/сек через 5 ч.

Микроскопический анализ Спермоана-лизатор

I Низкая (2-30) 3 17,3±2,3 19,8±5,2 28,6**±1,3

II Средняя (30-35) 5 20,7±1,5 22,8±2,6 34,3*±1,1

III Высокая (от 35) 4 24,0±1,0 26,9±3,0 37,4±1,6

Из табл. 6 видно, что между группами существенной разницы нет, но в то же время оценка качества спермы спермоанализатором более точная, чем визуальная оценка под микроскопом. Это же подтверждается и скоростью движения сперматозоидов через 5 ч. после оттаивания (Р<0,001). Достоверность между 1 и 3 группами составляет Р<0,001, тогда как между 2 и 3 группами Р< 0,1.

Изучены результаты искусственного осеменения телок в зависимости от скорости движения сперматозоидов (Табл.7).

Таблица 7 - Результаты осеменения телок в зависимости от скорости движения

сперматозоидов

Группа Скорость движения сперматозоидов Подготовлено доз спермы, п Подвижность оттаянных сперматозоидов % Результаты осеменения

Микроскопия По скорости движения ЙГЛ-500 Осеменено, всего Из них стельные

п %

I Низкая 90 35,0±2,6* 28,6±1,3*** 17 б,С±4,1

II Средняя 120 39,6±0,8 34,3±1,б 50 50,0±5,0"

III Высокая 80 41,8±1,7* 37,4±1,б*»« 37 32,0±5,4**

Примечание: I. *Р <0,05, **Р <0,01, ***Р<0,001; И. от каждого быка по 1 дозе было использовано для определения их скорости движения в период искусственного осеменения.

Как видно из табл.7 в первую группу были выделены быки, сперма которых имела низкую скорость движения, результативность осеменения составила 6%, несмотря на то, что глазомерная оценка подвижности соответствовала нормативам.

Ко второй группе были отнесены производители, сперма которых имела среднюю скорость движения 34,3±1,1 мкм/сек, в этой группе стельными оказалось 50% животных. Третью группу составили производители с высокими показателями подвижности спермы, как при измерении скорости движения спермоанализатором, так и при глазомерной оценке, 37,4±1,6 мкм/сек., здесь процент стельных оказался ниже и составил 32%.

3.3. Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей разиого возраста. Анализ данных Домодедовской метеослужбы показал, что в период с 24 июня по 15 августа 2010 года температура воздуха держалась на отметке выше 30°С, иногда превышая температуру тела животных

Этапы исследований были определены на основании полученных аналитических материалов в зависимости от среднестатистических значений температуры воздуха (табл.8).

Таблица 8 - Периоды исследования быков-производителей в зависимости от _атмосферных температурных аномалий (2010г)_

Даты исследований Этапы наблюдений Длительность этапа, сутки Обозначение периодов исследования Температура, °С

Статистическая Нормальная

01.05.-22.06. I 52 I контроль 20,29±5,0 18-20

23.06.-18.08. II 56 Атмосферная аномалия (опыт) 33,14±4,2 18,5-22

19.08.-11.10. Ш 52 Восстановительный период 15,72±6,6 15,5-20

12.10.-30.11. IV 49 II контроль 5,12±3,7 5-10

Из табл.8 видно, что на втором этапе наблюдений четко прослеживается продолжительная высокотемпературная атмосферная аномалия. С 23 июня по 18 августа среднесуточная температура составила 33,14±4,2°С (Р<0,001), что в среднем на 10°С превысило среднестатистическую норму для этого периода года.

Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномали на воспроизводительную способность быков-производителей в возрасте 5-6 лет.

Выяснено, что на всех этапах исследования количество взятий спермы не изменилось в значительной степени, кроме опытного периода, тогда же получено больше всего

эякулятов от быков-производителей, воздействие продолжительной

высокотемпературной атмосферной

аномалии привело к увеличению

25

ад

1

периоды исследований

количества выбракованных эякулятов на 27% (рис.7).

В рис.8 приведены данные по динамике объема полученной нативной спермы в различные периоды исследований.

Средний объем эякулята на всех этапах исследования оставался неизменным за исключением восстановительного периода, характеризующегося спадом жары и возвращением температурных показателей к комфортным величинам. Объем бракованной спермы в период жары составил на 8.7 % больше, чем на других этапах исследований.

Концентрация спермы на всех этапах исследования оставалась примерно на одинаковом уровне и составила 1,1-1,3 млрд/мл. В то же время наименьшее количество спермодоз заморожено в период продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии.

Установлено, что сперма, замороженная в период аномально высокой температуры воздуха, характеризовалось низкими показателями подвижности как после оттаивания, так и после 5-ти часовой инкубации при +38°С. Это тенденция сохранилась и в период восстановления.

Рисунок 7 - Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на качество эякулятов быков-производителей 5-6 лет

и объем "нормальной - спермы,мл

■У. объем выбракован ной спермы, мл

¡этап II этап III этап IVэтап

Рисунок 8 - Объем спермы,

Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на снермопродукцию быков-производителей в возрасте 9-11 лет. На племпредприятиях содержится до 25% быков-прокзводителей старше 8 лет, как правило, эти быки являются улучшателями, сперма которых пользуется потребительским спросом.

Анализ данных показал, что больше всего эякулятов быков-производителей 9-11 лет было выбраковано во II периоде исследования (10,5 вместо 7,5 в контроле), хотя количество взятий спермы и полученных эякулятов соответствует технологическому нормативу, предусмотренному инструкцией на данном племпредприятии. Кроме того, после прекращения воздействия продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии, ее влияние на количество полученных нормальных эякулятов и на сам процесс сперматогенеза не закончилось (III период): процент выбракованной спермы оставался высоким.

Изучено влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на объем спермы (табл.9).

Таблица 9 - Влияние атмосферных высокотемпературных аномалий на объем семени быков-

производителей 9-11 лет

Этапы исследований Эякуляты (норма/ брак) Объем спермы, (мл) Потери по отношению к I этапу, %

нормальной выбракованной

на быка Средний объем на быка % потери на группу

I 114 /25 64,9 4,8± 1,8 14,8 ± 13,3 18,6 ±2,3 100,0

II 128 /73 92,1 4,7 ± 1,8 42,1+25,4 32,0 ± 2,3 172

III 109/57 59,9 4,4 ± 1,4 34,7 ± 23,5 52,5 ± 2,8 282,3

IV 140/30 72,6 4,2 ± 1,3 15,6 ± 10,3 17,7 ±2,1 179,5

Анализ данных таблицы 9 показал, что количество исследованных эякулятов существенно не отличается по периодам исследования и соответствует технологическим параметрам. Во всех периодах опыта объем спермы на 1 быка составил 4,2-4,8 мл, что в пределах нормы. Следует отметить, вместе с увеличением общего объема спермы на быка, зафиксированном на II этапе исследования, что связано с повышением половой активности у быков-производителей, увеличился и объем выбракованной спермы. Если показатели, полученные на I этапе исследования взять за 100%, то в период аномалии и восстановительный период потери спермы значительно превысили контрольные показатели, составив на II этапе 172%, на III - 282% соответственно (что в свою очередь косвенно может доказывать происходящие глубокие изменения в семенниках у быков-производителей в возрасте 9-11 лет).

Также проанализировано качество спермы на основе показателей подвижности сперматозоидов в момент взятая, сразу после замораживания-оттаивания и пятичасовой инкубации при +38°С. Установлено, что после замораживания-оттаивания качество спермы было ниже во II периоде исследования по сравнению с контролем, что еще больше усугубилось после 5 часов инкубации оттаянной спермы при +38°С. В период продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии и восстановительный период качество спермы по подвижности было ниже на 30%, чем в контроле.

Сперма, допущенная для следующего этапа технологического процесса (замораживания), имела концентрацию во II периоде исследования почти такую же, как в I контроле, когда температура соответствовала среднестатистическим показателям. При этом если показатель концентрации спермы до начала продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии и в период аномалии составил 1,24-1,23 млрд/мл, то после прекращения ее воздействия на III и IV этапах она была ниже - 1,12 и 1,11 млрд/мл, что может быть связано с активизацией половой функции быков-производителей при первоначальном повышении температуры окружающей среды. В итоге, количество замороженных полноценных доз спермы также было меньше во II и III периоде опыта, показатели не только не вернулись к прежнему уровню, но и заметно снизились (на 16-17%) даже после Зх месяцев наблюдений.

Сравнение качества спермы быков-производителей в зависимости от возраста в период высокотемпературной атмосферной аномалии. Мы анализировали качество спермы быков-производителей всех возрастных групп (данные по быкам-производителям 3-х лет: Амерханов Х.А., Абилов А.И., Ескин Г.В. и др., 2011) в зависимости от изучаемого периода (рис. 10).

Из рис. 9 видно, в период продолжительной высокотемпературной

атмосферной аномалии во всех группах животных произошло снижение качества спермы, и количество выбракованных эякулятов увеличился до 32,8% у быков-производителей 3 лет и до 36,3% у быков 9-11 лет. Для восстановления сперматологических показателей до прежнего уровня животным потребовались различные сроки. У молодых быков-производителей (в возрасте до Зх лет) и быков в возрасте 5-6 лет

Рисунок 9 - Процент выбракованных полученных эякулятов в зависимости от возраста и периода исследования

организм восстановился сразу после прекращения воздействий продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии в течение одного цикла сперматогенеза. То есть уже на III этапе процесс нормализации качества спермы завершился. Однако у быков-производителей в возрасте 9-11 лет этот процесс шел намного медленнее, и спустя 2-3 месяца процент выбракованных эякулятов оставался значительным и составлял 34,3% - это всего на 2% меньше, чем в опытном периоде.

Из вышесказанного можно сделать вывод, что молодые быки (до 3 лет) еще не полностью адаптированы к экстремальным условиям и внешние факторы сразу сказываются на качестве полученных эякулятов. А у половозрелых быков-производителей (5-6 лет) процент выбракованных эякулятов увеличился не намного и составил 27,05%, что на 5% меньше, чем у молодых быков и иа 3% меньше, чем у старых (9-11 лег).

Данные по замораживаемой спермы показаны в рис.10.

Ш1 этап

Згода 5-6 лет 9-И лег а IV этап

Рисунок 10 - Заморожено доз спермы в зависимости от возраста быков в период исследования

Из рис. 10 видно, что аномалия не влияла на число замораживаемых доз спермы от

каждого быка. Во всех возрастных группах на всех этапах было заморожено почти

одинаковое количество качественных доз. Количественные отличия наблюдались только в

зависимости от возраста. У молодых быков количество замороженных доз спермы в период

аномалии, и до, и после нее было одинаковым (244±5,9). Однако эти же показатели у

взрослых и старых быков были намного выше и составили более 30% (325,6±16,9 у быков-

производителей в возрасте 5-6 лет и 322,6±31,8 у быков-

производителей 9-11 лет).

Определены предполагаемые потери спермы в

дозах на каждого быка-производителя в зависимости от

возраста (рис. 11). Из рис. 11 видно, что наибольшие

потери спермы были отмечены в группе старых быков-Рисунок 11 - Предполагаемые потери „ ,

спермы на 1 быка в период аномалии производителей (1916 доз) - это больше, чем в 2 раза по (в дозах)

сравнению с показателями быков-производителей Зх лет и 5-6 лет, 787 и 879 доз соответственно.

ВЫВОДЫ

1. Быки-производители имеют нормальное физиологическое состояние по биохимическим, гематологическим и сперматологическим показателям. Имеются отклонения по содержанию в крови железа (увеличено на 8,7%), мочевины (снижено на 11%), щелочной фосфатазы (увеличено на 66%), отношению Са/Р (снижено на 10-20%).

2. Для более точной оценки спермы быков-производителей необходим учет движущихся сперматозоидов, что позволяет использование спермоанализатора SFA-500. Оптимальная степень разбавления нативной спермы быков-производителей для оценки качества с помощью спермоанализатора SFA-500 составляет 8-16 раз, а для густой спермы до 32 раз.

3. Выявлена биологическая закономерность между скоростью движения сперматозоидов и результатом искусственного осеменения. Установлено, что высокая (от 35 мкм/с) и низкая (до 30 мкм/с) скорости движения отрицательно влияют на результативность искусственного осеменения (Р<0,01).

4. Разработанный, апробированный и внедренный в производство метод оценки спермы быков-производителей с помощью отечественного спермоанализатора SFA-500 в нашей модификации может быть использован для оценки качественных показателей спермы быков-производителей.

5. Продолжительная высокотемпературная атмосферная аномалия отрицательно влияет на воспроизводительную функцию быков-производителей. Увеличивается объем спермы на 0,17-0,78 мл (4-18%) на эякулят у быков-производителей 5-6 лет, общий объем спермы на быка на 27,2 мл (42%) в возрасте 9-11 лет, объем выбракованной спермы на 8,6% у быков 5-6 лет и на 72% у быков 9-11 лет (Р<0,001). Снижается подвижность оттаянной спермы сразу после оттаивания на 5,8-9,3% и через 5 часов инкубации при +38°С на 30%.

6. Нарушения, вызванные продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалией у быков до 5-6 летнего возраста, восстанавливаются в течение одного цикла сперматогенеза (45 суток), для быков 9-11 требуется больше времени на восстановление (>2 циклов сперматогенеза).

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

Для определения качества заморожено-отгаянной спермы предлагаем ввести

индивидуальный документированный контроль выпускаемой продукции на всех этапах технологического процесса с помощью отечественного спермоанализатора SFA-500 в нашей модификации.

В случае возникновения продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии во избежание ее последствий племпредприятиям предлагается организовать для высокоценных быков-производителей более комфортные условия содержания (например, путем обеспечения кондиционирования помещений и смещения графика работы в жаркий период на более раннее время).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ:

1. Абилов А.И., Амерханов Х.А., Ескин Г.В., Турбина И.С., Комбарова H.A., Федорова Е.В., Жаворонхова Н.В. Продолжительные высокие атмосферные температурные аномалии и показатели семени быков-производителей в возрасте 5-6 лет // Зоотехния. - 2013. - №6. - с. 27-30.

2. Абилов А.И., Ескин Г.В., Амерханов Х.А., Комбарова H.A., Жаворонкова Н.В., Федорова Е.В., Турбина И.С. Влияние продолжительной высокой температурной аномалии на спермопродукцию быков-производителей в возрасте 9-11 лет // Молочное и мясное скотоводство. - 2013. - №5. - с. 15-18.

В других изданиях:

3. Комбарова H.A., Жаворонкова Н.В., Малиновский А.М., Попов Е.Г.. Опыт использования спермоанализатора SFA-500 для оценки качественных характеристик семени быков-производителей на всех этапах технологического процесса II Практик для рет.специалистов. - СПб, 2010. - №2. - С. 56-62.

4. Комбарова H.A., Жаворонкова Н.В. Автоматическая комплексная оценка спермы быков-производителей // Система повышения эффективности воспроизведения крупного рогатого скота: сб. инновационных разработок. - Дубровицы. - ВИЖ, 2010. - С. 2950.

5. Абилов А.И., Ескин Г.В., Амерханов Х.А., Комбарова H.A., Жаворонкова Н.В., Федорова Е.В., Турбина И.С. Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на качество спермы и экономические показатели предприятия // «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения»: материалы

международной научно - практической конференции. - Вып. 19. - РАМЖ, пос.Быхово, Моск.обл., 2013. - С. 144-148.

6. Жаворонкова Н.В. Усовершенствование биотехнологических методов для повышения эффективности использования самцов-производителей в стрессовых ситуациях, вызванных природными катаклизмами // Молодежные научно-инновационные проекты Московской области: тезисы V научно-практической конференции (14-15 мая, 2013 г. Серпухов - п. Дубровицы). - Дубровицы: ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, 2013. - С. 68-69.

Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (4967)65-13-18 (4967)65-15-97

Сдано в набор 05.05.2014. Подписано в печать 06.05.2014. _Заказ № 9. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз._

Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жаворонкова, Надежда Викторовна, п. Дубровицы

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии

сельскохозяйственных наук

На правах рукописи

лл гн /. б оо-? а

«тьи I т /• / ь. и

Жаворонкова Надежда Викторовна

МОДЕРНИЗАЦИЯ МЕТОДА ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА СПЕРМЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ ВЛИЯНИЯ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОЙ ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНОЙ АТМОСФЕРНОЙ АНОМАЛИИ НА СПЕРМОПРОДУКЦИЮ БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

Специальность - 03.03.01 - физиология.

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Абилов Ахмедага Имаш оглы

Дубровицы - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.................................................................................4

2. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ...............................................................9

2.1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................9

2.1.1. Физиологическое состояние быков-производителей........................9

2.1.2. Показатели спермы и оплодотворяющая способность......................15

2.1.3. Методы оценки качества сперматозоидов......................................23

2.1.4. Факторы, влияющие на воспроизводительную функцию быков-производителей.............................................................................31

2.1.5. Гипертермия и ее последствия на организм животных.....................38

2.2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.......................................51

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................................57

2.3.1. Физиологическое состояние быков-производителей.......................57

2.3.2. Разработка автоматического метода комплексной оценки качества спермы быков-производителей с помощью отечественного спермоанализатора 8РА-500............................................................57

2.3.2.1.Разработка протокола исследований спермы быков-производителей.58

2.3.2.2.Апробация разработанного метода............................................59

2.3.2.3.Влияние технологических этапов криоконсервации на динамику

качественных характеристик спермы быков-производителей....................65

2.3.2.4.3ависимость оплодотворяющей способности от скорости движения сперматозоидов быков-производителей..............................................70

2.3.3. Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей разного возраста.. ..73 2.3.3.1.Этапы исследования в зависимости от продолжительности

высокотемпературной атмосферной аномалии.................................................73

2.3.3.2.Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на воспроизводительную способность быков-производителей в возрасте 5-6 лет...........................................................................76

2.3.3.3.Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей в возрасте 9-11

лет..............................................................................................79

2.3.3.4.Сравнение влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на качество спермы быков-производителей разного

возраста (в экономическом аспекте).....................................................82

3. ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНАЯ ЧАСТЬ......................................................................87

3.1. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ........................87

3.2. ВЫВОДЫ..............................................................................91

3.3. РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ..........................................93

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................95

ПРИЛОЖЕНИЯ...........................................................................120

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одной из главных задач интенсификации животноводства и эффективного ведения племенной работы на современном этапе является наиболее полная реализация генетических ресурсов с применением репродуктивной биотехнологии (искусственное осеменение сельскохозяйственных животных), которая не была бы возможной без криоконсервации спермы. (Эрнст Л.К., 2004; Десятов В.Г. и др., 2004; Амерханов Х.А. и др., 2012).

Принятые такие критерии биологической оценки, как концентрация, подвижность, выживаемость, позволяют предварительно выбраковывать сперму с низкими показателями, однако, эти критерии не имеют стабильной корреляции с оплодотворяющей способностью и, являясь суммарной характеристикой спермы, не отражают биологической полноценности сперматозоидов (Соколовская И.И., Милованов В.К., 1981; Шапиев И.Ш. и др., 1994; Hallap Т., 2005; Кононов В.П. и др., 2007; Celeghini Е.С. et al., 2008; Турчанов С., 2008; Brito L.F.C. et al, 2010; Padrik P. et al, 2012).

Ученые на протяжении многих лет прилагают все усилия, чтобы разработать методы оценки качества спермы, которые бы позволили точно определить оплодотворяющую способность и вместе с тем, сделать анализ объективным, легко воспроизводимым и быстрым (Шапиев И.Ш., 1994; Januskauskas A., Zilinskas H., 2002; Leiding С. et al, 2009; Singh A. et al, 2012; Vincent P. et al, 2012). Решение данной задачи по-прежнему остается актуальным.

Известно, что в практике племенных предприятий нередко наблюдается снижение качества спермы самцов-производителей различной степени тяжести под воздействием внешних и внутренних факторов (Милованов В.К., 1962).

Особенно при длительном воздействии на организм животных таких внешних факторов, как перегрев, переохлаждение, повышенная инсоляция и др., возможно нарушение воспроизводительной функции.

И.И. Соколовская, Ф.М. Островский, В.К. Милованов (1973, 1981) доказали влияние одного из внешних факторов (перегрев семенника) на сперматогенез самцов, проведя ряд модельных опытов, в ходе которых установили нарушение целостности гематотестикулярного барьера. Также ученые выяснили, что при этом ослабевала его физиологическая функция, что в свою очередь привело к нарушению сперматогенеза на всех его стадиях.

Изучением проблем, возникающих при гипертермии организма животных разных видов занималось немало ученых (Демесинов Б., 1989; Козлов Н.Б., 1990; Насибов Ш.Н. и др., 2004; Кондрахин И.П., 2007; Ка^еНс 1.Р., 2013; Субботин А.Д. и др., 2013; Фомичев Ю.П. и др., 2013).

Но необходимо отметить, что опыты, лежащие в основе этих исследований, проводились либо на модельных животных при искусственной гипертермии, либо, если фиксировались аномально высокие значения температуры окружающей среды, то они имели непродолжительный характер, либо опыты были проведены на аборигенном поголовье скота, адаптированном к местным условиям среды (в регионах с тропическим климатом).

Амерханов Х.А., Абилов А.И и др. (2011) показали зависимость качества и количества спермы у молодых быков (в возрасте 3-х лет), завезенных в РФ из стран с умеренным климатом, от влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии летом 2010 года Данное исследование проведено на животных такой возрастной группы, когда организм еще недостаточно хорошо адаптируется к воздействиям внешней среды. Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей других

возрастных групп, имеющих различную адаптационную способность, по-прежнему остается неизученным.

Цель и задачи исследования - разработать новые технологические элементы при оценке спермы и изучить влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей.

Для решения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

- изучить физиологическое состояние быков-производителей на основе биохимических, гематологических и сперматологических показателей;

- определить качественные характеристики спермы на разных технологических этапах в сравнительном методическом аспекте, уточнить распределение сперматозоидов по скорости движения и ее связь с качеством спермы;

- выяснить взаимосвязь между скоростью движения сперматозоидов с их выживаемостью после замораживания-оттаивания и влияние ее на результат искусственного осеменения;

- разработать комплексный метод оценки качества спермы с помощью отечественного спермоанализатора БРА-бОО

изучить влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей;

- сравнить степень влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на показатели спермы быков-производителей разного возраста.

Научная новизна. Представлен новый модифицированный метод определения качественных и количественных характеристик спермы быков-производителей на всех этапах технологического процесса, на основе лазерного анализа частотного спектра флуктуаций оптической плотности образца сперматозоидов, вызванных их движением через оптический канал со специальными характеристиками при помощи спермоанализатора ЗБА-500.

Изучено влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей голштинской породы в зависимости от возраста. (Данный раздел диссертационной работы выполнен при финансовой поддержке Федерального государственного бюджетного учреждения «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере», грант №702).

Практическая значимость работы. Определено общее физиологическое состояние быков-производителей на основе биохимических, гематологических и сперматологических показателей. Разработан, апробирован и внедрен новый метод комплексной оценки спермы быков-производителей при помощи отечественного спермоанализатора 8РА-500 в нашей модификации. Установлена зависимость результата искусственного осеменения от скорости движения сперматозоидов после замораживания-оттаивания.

Выявлена степень отрицательного влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей разных возрастных групп.

Основные положения, выносимые на защиту:

- физиологическое состояние быков-производителей на основе биохимических, гематологических и сперматологических показателей;

- новый модифицированный комплексный метод оценки качества спермы быков-производителей отечественным спермоанализатором 8РА-500 производства НПФ «Биола»;

- новый протокол исследования для нативной и замороженно-оттаянной спермы быков-производителей;

- скорость движения сперматозоидов быков-производителей на разных технологических этапах криоконсервации и ее связь с оплодотворяющей способностью;

- влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на показатели спермы быков-производителей и степень ее отрицательного воздействия на спермопродукцию в разных возрастных группах.

Достоверность исследований подтверждена биометрической обработкой данных с использованием ^критерия Стьюдента.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены, обсуждены и одобрены:

на конференциях лаборатории эмбриологии и биологии воспроизводства сельскохозяйственных животных центра биотехнологии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии 2008-2014гг;

- на международной научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» / РАМЖ, пос.Быково, Моск.обл., 2013;

- на научно-практической конференции молодых ученых «У.М.Н.И.К.» / ВИЖ, 2013; получен грант №702.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

2. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1.1. Физиологическое состояние быков-производителей

За последние 20 лет достигнут значительный генетический прогресс в животноводстве. Такой прорыв в первую очередь был обеспечен масштабным внедрением искусственного осеменения и возможностью тиражирования ценных генотипов (Букаров Н.Г. и др., 2011), который обусловлен высокой интенсивностью процессов обмена веществ. Главными критериями оценки состояния их здоровья являются не клинические признаки заболеваний и даже не снижение продуктивности и воспроизводительной способности, а показатели интенсивности процессов всех видов обмена, выявление ранних субклинических нарушений их течения (Владимиров B.JL и др., 2004).

Интенсификация отрасли животноводства предусматривает максимальное использование биологических возможностей быков-производителей, когда получение качественной спермопродукции возможно только при нормальном протекании многочисленных обменных процессов и обеспечении высокой резистентности организма, где главную роль играет кровеносная система, реагирующая на любые физиологические сдвиги в организме животного (Малахов А.Г., 1984; Бузлама B.C., 2000).

Для поддержания продуктивного и репродуктивного здоровья и повышения эффективности использования животных новой генетической формации требуются более глубокие исследования обменных процессов не только у материнских (Решетникова Н.М. и др., 2002), но и у отцовских особей, тем более у высокоценных быков-производителей необходим комплексный подход к исследованию физиологических процессов (Комбарова H.A. и др., 2006). Также установлено, что незначительные нарушения обмена у молодых животных, могут являться маркерами генетических аномалий (Жигачев А.И. и др., 2008).

Физиологическое состояние как общее устройство организма, а также многие стороны промежуточного обмена веществ отражается составом крови. Биохимический состав крови взаимосвязан с продуктивными и племенными качествами животных (Стрелец A.B. и др., 2005). И для контроля над этими качествами и воспроизводительной способностью животных в условиях промышленных комплексов показатели крови могут иметь огромное значение. Исследования показателей крови актуальны и широко используются в практике (Воронин Е.С. и др., 2002).

Нормальные гематологические показатели дают нам понять, что организм лучше обеспечен кислородом, интенсивнее происходит общий метаболизм, а также по содержанию лейкоцитов можно судить о состоянии здоровья животных (Фомичёв Ю.П. и др., 2013).

Гомеостаз и его поддержание представляет собой необходимое условие при селекции животных. Гематологические показатели зависят от возраста, физиологического состояния и условий обитания животных. Высокопродуктивные и малопродуктивные животные различаются по ряду гематологических признаков (Кудрин А.Г., 2006).

Исследуют такие биохимические показатели крови, как белок, его фракции, ферменты, липопротеиды, холестерин, которые играют важную роль в жизнедеятельности организма (Васильева Е.А., 1991).

Существует зависимость показателей продуктивности от уровня ферментов крови, которая указывает характер протекания обменных процессов в организме, что позволяет нам в свою очередь сделать вывод о физиологическом статусе животного, продуктивных качествах животных, его племенной ценности и провести селекционный отбор в раннем возрасте (Кудрин А.Г., 2006; Комбарова H.A., 2009).

Нарушение обмена веществ различной этиологии, в том числе связанное со свободноднорадикальным окислением липидов и напряженностью в работе печени (Степанова И.П., 2005; Koeleman Е., 2011), ведет к подавлению воспроизводительной функции животных (Решетникова

Н.М. и др., 2007; Самохин В.Т. и др., 2007; Нежданов А.Г. и др., 2011). Накопление в организме продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), разрушая биологические мембраны и изменяя активность ферментов, затрагивает важнейшие биохимические процессы в организме, определяющие основные проявления жизнедеятельности (Наук В.А. и др., 2004; Комбарова Н.А., 2008). С липидным составом мембран сперматозоидов, который влияет на реакцию сперматозоидов к охлаждению и замораживанию, связана способность спермы животных противостоять холодовому шоку (Впшко 8.Р. е1 а1, 2005; Павленко Л.Н. и др., 2008).

Добавление умеренного количества дополнительного жира улучшает потребление калорий и имеет умеренное позитивное воздействие на фертильность (В1зтоИ:о 11.8. е1 а1, 2012).

В обмене веществ ведущая роль принадлежит белкам крови животного, которые выполняют многообразные функции, участвуют в процессе питания и роста, синтезе гормонов и ферментов (Иванова И.В., 2009).

Племяшов К.В. (2010) оценивал содержание белка по показателю мочевины в сыворотке крови, высокая ее концентрация свидетельствовала о высокой степени распадаемости протеина кормов. В результате повышенного содержания белка у животных происходило ослабление синтетической функции печени, что ведет к снижению синтеза мочевины.

Известно, что в организме человека и животных в основном содержится 15 наиболее значимых микроэлементов (Бе, I, Си, Ъп, Со, Бе, Мп, Сг, V, Мо, Р, 1л, 81, Аб). Они играют важную роль в организме: входят в состав рецепторного аппарата клетки, влияют на активность ферментов, гормонов, витаминов, участвуя в их синтезе, поддерживают осмотическое давление, кислотно-щелочное равновесие, входят в состав белков -переносчиков, оказывают антиоксидантный эффект, участвуют в процессах пищеварения, дыхания и кроветворения, влияют на состояние различных звеньев иммунитета и т.д., что, в итоге, способствует улучшению состояния

здоровья животных и повышению продуктивности (Кузнецов С.Г., 1992; Hermann W., 2001).

Любое отклонение, как в меньшую, так и в большую сторону от нормы содержания макро-,