Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модельные подходы к изучению механизма действия лигниназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модельные подходы к изучению механизма действия лигниназы"



РОССИЙСКАЯ АКАДШИЯ ОДЩВДНСКЙХ нш ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ И МЕДЩЙНСКОЯ ЯШИ

На праваг рукописи УДК 547.992.3 : 577.158.193

ЛЕВИТ Михаил Нахиыович

МОЛЕЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ЛИГНИНАЗЫ

(03.00.04 - биологическая химия)

Автореферат

диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических нзук

Москва 1952

Работа выполнена в Институте биологической и медицинской и Институте химической физики им-. Н.Н.Семенова РАН

химии РАМН

Научные руководители:

академик РАМН, доктор биологических наук, профессор А.И. Арчаков кандидат химических наук, вед. н. с. А.М.ШкроС

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Г.И. Бачыанова кандидат химических наук H.H. Нуцубндзе

Ведущая организация - ' Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ

Защита состоится " " 1992 г. в часов мил

на заседании специализированного совета Д.001.10.01 по адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская., д. 10.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Института биологической и медицинской химии РАМН

Автореферат разослан " " 1992 г.

Ученый сехретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Л.В. ПаЕЛииша

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Грибы, разрушающие древесину, секре-тируют окислительные лигнолитические фермента, окисляющие не только лигнин, но и различные стойкие загрязнители окружающей среды. Поэтому их можно использовать для решения широкого круга экологических и биотехнологических задач в промышленности, сельском хозяйстве и здравоохранении. Конечные прикладные цели здесь могут быть самыми разными - от направленного конструирования организмов-деструкторов до создания искусственных детоксицируядих систем, своего рода протезов печени, обезвреживающих ксенобиотики. С точки зрения энзимологии особенно важно понять, какие специфические особенности структуры и механизма действия лигнолити-ческих ферментов обусловливают их эффективность.

Среди лигнолитических ферментов наибольшей окисляющей способностью, по—видимому, обладают гемсодертащиэ лигнинпероксидазы (лигниназы), секретируемые грибом Fhanerochaete сЬгузозрог1хт. Все, что в настоящее время известно о лигниназах, настолько подчеркивает их сходство с другими гемсодеркащими пероксидазами, что естествен вопрос, чем не отличаются от них лигниназы? Особое внимание привлекают следущие две проблемы. Во-первых, лигниназы окисляют лигнин и его синтетические аналоги лишь в кислых средах, причем эта активность возрастает с понижением рН вплоть до 2-3. Неясно, является ли это уникальным свойством лнгниназ, или в какой-то мере присуще и другим гемсодертащим пероксидазам, которые, будучи более доступными, могли бы стать моделями для изучения денного феномена. Во-вторых, как для понимания биологиче-л<ого поло.:ор^:зма ллгнэтаз, так и для их прикладного ис-

шльзоерлм ко обходи1 "1 тяуггпъ 'фкч.'зн различий в субстратной

специфичности разных изоформ лигниназ и других пероксвдаз при окислении лигнкноподобных соединений. Для этого целесообразно сравнить кинетику и спектр продуктов окисления различных аналогов лигнина нероксидазаш и химическими одноэлвктронными окислителями, геяерирующшэ, как и пероксидазы, катион-радикалы субстратов. В отсутствие фэрлента направление и скорость превращений катион-радикалов зависят лишь от внутренне присущих ш свойств. Только зная • эти свойства мохшо выявить и изучить влияние форманта на судьбу связанных на нем витермеднатов окисления и, тем саьим, определить его роль на всех этапах окислительного процесса.

Цель работа - наЗзп подхода к изучению каталитических особенностей грибных лигьчдгаз, основанные на пх моделировании как геысодерзсащиш гвроксидазааи растительного и животного происхождения, так и химическими одноэлектровшши окислителями.

■ Для достижения этой цели были поставлены следущиз гулами:

1). Установить, существуют ли условия, в которых неспецифа-ческие пероксидазы способны окислять нефонольные аналоги лигнина - типичные субстраты лигниназ;

2). В даннзл условиях сравнить каталитические свойства этих пероксидаз с известншли свойствами лигшшаз (рН-завигашость каталитической актлшостл, действла ингибиторов и промоторов, субстратная специфичность к т.д.);

3). Выявить факторы, опред&лякдие рогиоспецнфлчность ферментативного и хкгачзского окисления аналогов лигппна.

Научч?я новизна и практическая значимость работы.

Показано, что генсодэряащка пороксвдазы растительного и

131ВОТКОГО 1ГрОГ.ЗХОЗДеНИЯ В КИСЛОЙ СрзДо СКЗСОбНЫ 01&СЛЯТЬ

- э -

нефенольные аналога лигнина, ранее считавшиеся доступными только для специфических грибных лигниназ.

Установлено, что вклад окислительно-гидролитического деалки-лирования мояот служить показателем стабильности субстратных катион-радикалов и их экранирования в активно?! центре фермента.

Предложены новые тестовые субстраты, позволяющие классифицировать окислительные лигнолктические ферменты по их способности влиять на скорость и направление превращений прсмеасуточвых субстратных катион-радикалов.

Разработан простой и эффективный метод очистки и разделения на изоформы сырых препаратов пероксидазы из хрена.

Апробация работы состоялась 27-11-91 на совместной научной конференции лабораторий физико-химических методов анализа, микро-сомального окисления, использования вычислительной техники в биохимии Института биологической и медицинской хеуии АМН СССР, кафедры биохимии МВФ и ШШ экологии, токсикологии и метаболизма лекарственных препаратов 2-го МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова. Результаты исследований докладывались на Всесоизных конференциях кЦитохром Р-450 и охрана окружающей среды" (Новосибирск, 1987), "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989) и на 2-ой Международной школе по биотехнологии (Тарту, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 160 страницах, включая 25 рисунков, 12 схе?л и 16 таблиц, и состоит из введения, глав: "Обзор .литературы", "Материалы и метода исследований" , "Результаты и обсуждение", выводов и списка цитируемой литературы (252 ссылки).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ' НАТЕРШИ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пероксидазу из хрена производства Reanal (Венгрия) (700 ед./мг по о-дианнзидину) после гель-фильтрации через колонку Se-phadex G-50 разделяли на фракции нзоформ на последовательно соединенных ионообменных колонках DEAE-Toyopearl 65011 и Cíí-Toyopearl 650S. Для сравнения удельных активностей разных изофоры применяли также пероксидазу типов VI, VII и IX (Sigma, СЯМ).

Модели лигнина были получены на основе описанных в литературе методик.

Скорость образования ароштхческих альдегидов при ферментативном и персульфатам окислении моделей лигнина определяли спек-трофотометрически.

ФерлентапиВное окисление моделей лигнина проводили при 25°С; реакционная смесь обычно содержала 100 мМ К-цитратного буфера, рН 3,5, 3-8 мкМ ферыэнта, 0,5 ыМ субстрата и 0,2 мМ HjOj. Реакцию начинали добавлением HgOg.

Окисление моделей лигнина персульфатах калия в водных растворах проводили обычно при 4СрС, в 25 ыМ растворе ^^ % . рН 1,0 (5 нкл в^зо^хонц./ыл), содержащем 0,5 mí,5 субстрата.

Окисление моделей лигнина персулъфзтол. калия в ацетонитриле проводили при БСЯС в растворе , содержащем 4 tóí , 15 мМ

18-короны-б И 0,5 + 18 мМ субстрата.

Идентификацию продуктов окисления лоделей лигнина обычно проводили в ходэ ВЭЖХ на колонках Zorbax 0DS (4,6 х 250 мм).

Zorbax С-8 (элюонт метанол-вода) и Zorbax Sil (элюент эфир-гексан), используя спектрофотометрический детектор с диодной матрицей HP 1040. Спектры, снятые в момент прохождения пиков, далее сравнивались со стандартными. В ряда случаев получали О-мэтилоксимы и гадразоны образующихся альдегидов. Для этого реакционную смесь разбавляли равным объемом метанола и, после удаления ' белка центрифугированием, - инкубировали с О-метил-гидроксиламином или гидразином.

Какиртрацих) форлалъдегида, образующегося при ферментативном окислении метилендисксизамещенных моделей лигнина определяли спектрофотометрически с помощью З-метнлбензтиазолон-2-гидразона (ЫБТН) по модифицированной методике Sawicki et а!.(19б1).

Соотношение выходов альдегидов и кетонов, образующихся при персульфатном окислении метилендиоксизачеценннх моделей лигнина определяли . путем разделения ВЭЖХ их предварительно полученных динитрофенилгидразонов на колонке Zorbaz СИ 4,6 х 150 мм (элюент зфир-гексан).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУ ЗДЕНКЕ

I. ОКИСЛЕНИЕ АНАЛОГОВ ЛИГНИНА ПЕРОШЩАЗОй ИЗ ХРЕНА

С целью обнаружить "лигниназную" активность у пероксидазы из хрена был использован набор 3,4-диметоксифешлкарбинолов - аналогов лигнина, включающий стандартный. субстрат для определения лиг-ниназной активности - вератриловый спирт (I), а также гидро-бензошш (2) (эритро- и трео-изомеры) и (3) (трео-лзомер), дметоксифеншшропандиол (4), диметоксифенилбензилкарбинол (5) и

я ф

снон

I

СН3ОН с нон

оме О/Чс

вератриловый спирт (I) К = Н - 3,4-дииетоксипадробензоин (2)

Р; = ОМе - 3,4,4'-триыетоксигидробензоин (3)

I- (3,4-даыетокснфенил) --1,2-пропандиол (4)

3,4-диметоксифенил-бензилкарбинол (5)

СН3ОН > см-о-СНОИ оме

ОМе ОМе

В-0-4-зфир (6)

Схема I

Пероксидазное окисление замещенных гидроСенз'оинов

А

СНОН снон

^О/Че

-2е

-2Н+

I-(3,4-диметоксифенил)-2-(2-метоксифенокси)-1,3-пропандиол (6) (так называемый Р-О-4-эфир). За протеканием реакции следили по образованию вератрового альдегида, являющегося общим продуктом лигниназного окисления этих субстратов.

В обычных условиях (6 5 рН ^ 8) пероксидаза из хрена неспособна окислять эти субстраты. Мы, однако, обнаружили, что их окисление наблюдается при рН ^ 5,5. С наибольшей скоростью верат-ровый альдегид образуется при окислении гидробензоинов (табл. I). Спектрально и хроматографически было показано, что, как и с лиг-ниназой, вератровый и бензойный (анисовый - для соединения (3)) альдегиды здесь являются единственными продуктами реакции, образующимися с одинаковой скоростью (схема I).

Табмщх I.

Начальная скорость образования вератрового альдегида при окислении аналогов лигнина пероксидазой из хрена

Субстрат Скорость

мин 1 /3

трео-3,4,4'-Триметоксигидробензоин (3) 2,01 100

ярео-3,4-Дшетоксжтадробензоин (2) 1,53 76

зршро-3,4-Диметоксигидробензоин (2) 1,44 71

I-(3,4-Диметоксифенил)-1,2-пропандиол (4) 0,54 27

Вератриловый спирт (I) 0,15 7

3,4-Дк.гатокскфенилбенз11лкарбипол (5) 0,10 5

З-О-4-зфир (6) 0,09 4

Эта реакция не чувствительна .к ловушкам свободных радикалов (маннит (50 мЮ, даметилсульфоксид (50 мМ)) и супероксиддисмутаза (20 ед. акт./мл, рН 5)), но подавляется ингибиторами гемсодержа-щих ферментов - азидом и цианидом. Реакция не идет в отсутствие ílgOg и/или фермента, а также в присутствии 1^02 в сочетании с ионами железа, геыином и с денатурированной пероксидазой (преин-кубированной при рН 2 или в 50% метаноле или же нагретой в растворе до 100°С). Зависимость начальной скорости образования вера-трового альдегида от концентрации субстратов хорошо описывается уравнением Шхаашса-Ментен (параметры Кщ, Vm: I,2±0,0S mf,i, 2,96±0,13 мин-1 - эршлро-, 0,6±0,03 мМ, 2,04±0,07 мин-1 -трго-гидробензоин (2), 0,5±0,03 мМ, 4,2±0,1 мин-1 - гпрео-гидробензоин (3)). "Лигшшазная" активность- присуща всем изученным нами изо-формам пероксидазы из хрена. По удельной активности они различаются не более, чем в три раза, причем отношение активностей цри кислых рН с аналогами лигнина и при рН 6 с о-даанизидином у разных изоформ весьма близко. Существование корреляции означает, что в данных условиях проявляется одна и та же активность ферлента.

Итак, при рН s 5,5 пероксидаза из хрена расщепляет диметок-сигидробензоины подобно грибной лигниназе. Сходство между этими ферментами проявляется и в том, что скорость окисления монотонно возрастает с уменьшением рН, по крайней мере, вплоть до рН 3 (рис. I). Большинство экспериментов проводили при значении рН 3,5, являющимся компромиссом между стремлением достичь наибольшей скорости реакции и необходимостью предохранять фермент от быстрой инактивации при рН s 3.

Окисление аналогов лигнина пероксидазой из хрена значительно ускоряется в присутствии даметоксибензолов. Данный эф|вкт, характерный и для лигниназы, объясняют тем, что даметоксибензолы пред-

3

4

5

3

4

5

рН

рН

Рис. I. рН-Зависимость начальной скорости образования вератрово-го альдегида (А) и ее полулогариймичеекая анаморфоза (В) при окислении 3,4,4'-тримвтоксигидробензоина (3) перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена (100 мМ К-цитратный буфер, I М ЫаОХ, 0,5 мМ субстрат, 0,2 мМ Н^, 5,3 мкМ фермент, 25°С). Наклон анаморфозы -0,78±0,02.

охраняют фермент от инактивации перекисью водорода и/или служат переносчиками электронов от субстрата к ферменту. Это справедливо и для пероксидазы из хрена: время ее полуинактивации удваивается в присутствии I кМ 1,4-диметоксибензола, а начальная скорость окисления гидробензоина возрастает при этом в 6 раз. Чтобы эффективно служить переносчиком электронов, соединение должно хорошо связываться в активном центре фермента. Действительно, индуцируемое диметоксибензолами увеличение начальной скорости ошеления гидробензоинов, которое описывается уравнением Михаэлиса-Мэнтен,

характеризуется значением К^ак в несколько раз меньшим, чем у субстратов (рис. 2).

V -V, ш1п~1

ПИП '

0.15

0.10

0.05

0.4 0.6 0.8 [БМВ], вЯ

0.4 0.6 0.8 [ШВ], ЕМ .

Рис. 2. Влияние концентрации 1,4-диметоксибензола (ВЫВ) на прирост начальной скорости пероксидазного окисления 3,4,4'-триметок-сигщробензоина (3) Графики концентрационной зависимос-

ти (А) и ее линейной анаморфозы (В) отвечают уравнению Михаэляса-Ментен с параметрами К^аЕ= 0,17 ± 0,01 мМ и Ут= 6,4 ± 0,2 кшГ1.

По-видимому, в кислой среде катализировать окисление аналогов лигнина могут и другие гемсодержащие пероксидазы, в частности, мы показали это для лактопероксидазы. Итак, представлявшаяся ранее уникальной способность лигниназ катализировать окисление нефенольных аналогов лигнина, в действительности присуща и неспецифическим пероксидазам растительного и швотного происхозздония.

Существенно, что при общем сходстве между лигнинззой и другими гемсодеряащими пероксидазами лигнолитическая активность у них проявляется только в весьма необычных условиях - в сильно кислых средах. Именно это обстоятельство указывает на тождественность механизма окисления, что позволяет ..рассматривать данные перокси-дазы как адекватные модели лигниназы и с их помощью выявлять природу ее субстратной специфичности.-

При действии пероксидазы из хрэна и лактопероксидазы, верат-ровый альдегид образуется примерно на порядок быстрее из гидробензоинов, чем из вератрилового спирта и других использованных субстратов (табл. I). На первый взгляд, эти различия резонно приписать неспособности данных ферментов ' связывать и/или окислять "плохие" субстраты. *.!ы предположили, однако, что это не так, поскольку Есе ''плохие" субстраты, подобно даметоксибензолам, в относительно низких концентрациях ускоряют расщепление гядробснзои-нов, а это означает, что они и связываются фэр?яентом, и достаточно быстро игл окисляются. Дело, по-видимому, заключается не столько в скорости окисления субстратов в катион-радикалы, сколько в выходе регистрируемого продукта (вератрового альдегида) в ходе вторичных превращений этих катион-радикалов. Иными словами, малая скорость образования вератроЕого альдегида при окислении "плохих" субстратов неспецифическими пероксидазаш скорее всего указывает на протекание каких-то конкурирующих превращений их катион-радикалов, приводящих не к вератровому альдегиду, а к другим продуктам. В то же время известно, что лигниназа окисляет верагрило-вый спирт практически целиком в вератровый альдегид. Отсюда мо^но предположить, что специфика лигниназы как лигнолитического фермента проявляется не столько на стадии генерации первичных катион-радикалов субстратов, сколько во влиянии на их последующие

превращения. Чтобы установить значение белкового окружения для протекания реакции мы сравнили результаты ферментативного и химического окисления аналогов лигнина.

2. ПЕРСТЛЬФАТНОЕ ОКИСЛЕНИЕ АНАЛОГОВ ЛИГНИНА КАК МОДЕЛЬ ДЕЙСТВИЯ ПЕРОКСИДАЗ

В качестве одноэлектронных окислителей, моделирующих перок -сидазы, были использованы анион-радикалы бо^* , возникающие при термической диссоциации персульфатных ионов . Этот выбор

обусловили доступность и стабильность реагента, его оптическая "прозрачность" (персульфат и продукты его восстановления не мешают спектрофотометрической регистрации скорости окисления субстратов), а также независимость скорости генерации анион-радикалов БОд от рН, что облегчает сравнение результатов химического и ферментативного окисления.

Мы обнаружили, что скорость образования альдегидов в водном растворе сильно зависит от строения субстрата (табл. 2). Естественно предположить, что эти различия объясняются разной реакционной способностью субстратов при их окислении персульфатом. Это, однако, не так, поскольку оказалось, что скорость-лимитирувдей стадией реакции является не окисление субстрата, а генерация анион-радикалов бо^. Действительно, I) скорость окисления практически не зависит от концентрации субстрата; 2) она прямо пропорциональна концентрации персульфата, т.е. определяется скоростью диссоциации Б2с|~ и 3) энергия' активации практически не зависит от строения субстрата. Если, таким образом, окисление всех субстратов протекает с одинаковой скоростью, то наблюдаемые различия в

скорости образования альдегидов отражают вклад этой реакции в совокупность превращений катион-радикалов.

Поскольку скорость образования альдегидов при окислении бен-зиловых спиртов уменьшается с увеличением числа метоксильных заместителей (табл. 2), мы предположили, что одним из альтернативных превращений является гидролитическое деметилирование катион-

Таблица 2.

Скорость образования альдегидов при персульфатном окислении _ *

аналогов лигнина в воде и в ацетонитриле

Соединение Скорость мкМ/мин

СНдСЯ

Бензиловый спирт 12,4 0,66

Анисовый спирт 8,2 1,60

Вератриловый спирт (I) 0,76 6,05

3,4,5-Триметоксибензиловый спирт 0

Гидробензоин 10,0 1,14

ярео-3,4,4'-Триметокскгидробензоин (3) 9,2 7,58

трео-3,4-Диметоксигидробензоин (2) 5,3 7,91

1-(3,4-Диметоксифенил)-1,2-пропандиол (4) 5,8 6,20

3,4-Диметокснфенилбензилкарбинол (5) 0 4,03

&-0-4-эфир (6) 0 7,75

* Для всех замещенных гидробензоинов приведена скорость образования вератрового альдегида, а для незамещенного гидробензоина -половинное значение скорости образования бензальдегада.

радикала. По-видимому, вклад деметилирования мал, если р высокой скоростью протекает фрагментация катион-радикалов с разрывом С-С связи. Такая ситуация характерна для гидробензоинов, выход альдегидов из которых мало зависит от числа метоксильных заместителей. В некоторых же случаях вклад разрыва С-С связей столь.невелик, что соответствующие цродукты обнаружить не удается (диметокси-фенилбензилкарбинол (5), Э-0-4 эфир (6)).

Чтобы проверить эту гипотезу, мы изучили окисление моделей лигнина в безводной среде (раствор комплекса персульфата калия с краун-зфиром в ацетонитриле), где гидролитическое деалкилирование исключено. Если в этих условиях скорость-лимитирухщей стадией является генерация анион-радикалов БО^, то скорость образования альдегидов из разных соединений должна быть одинаковой, если же узким местом станет собственно окисление, то она будет пропорциональна реакционной способности субстратов.

Оказалось, что в области малых концентраций субстратов, где скорость реакции определяется их окислением, вератриловый спирт окисляется быстрее, чем бензиловый, как к следует ожидать, поскольку его потенциал ионизации гораздо ниже (рис. 3). С увеличением концентрации, когда скорость лимитируется уже не окислением, а генерацией анион-радикалов БО^*, окисление вератрилового и бензилового спиртов протекает со сравнимыми скоростями. Эта закономерность характерна и для других соединений, так, незамещенный гидробензоин в низких концентрациях расщепляется заметно медленнее, чем его диметоксипроизводные (табл. 2). В безводной среде, где подавлено гидролитическое демешлироваше, удалось наблюдать образование вератрового альдегида из &-0-4 эфира и диметоксифэ-нилбензилкарбинола.

Итак, полученные результаты показывают, что в водных раство-

Рис. 3. Влияние концентрации субстратов на отношение скоростей образования альдегидов при окислении вератрилового (v1) и бензи-лового (V2) спиртов персульфатом калия в безводном ацетонитриле.

paz гидролитическое деметилирование мог:ет вносить ощутимый вклад в превращения катион-радикалов лпгнияоподобшк соединений. Зтот вклад мал у дпметокскгидробензоинов и достаточно велик у первичных и, особенно, у вторичных дшлетокскоанилкарбико^ов.

Интересно сравнить данные о персульфзтном и ферг.-.зптатявнсм окислении аналогов лигнина. Если судить но образованию вератрово-го альдех'ида, то тата:о классические субстраты лнгниказы, как зе-

ратриловый спирт и В-О-4 эфир являются для пероксидазы из хрена "плохими" субстратами. В этом отношении действие лигниназы можно уподобить персульфатному окислению в неводных средах, а действие пероксидазы из хрена - персульфатному окислению в водных растворах. Возможно, эта аналогия отражает важное различие между пероксидазой из хрена и лигниназой.- Мы полагаем, что специфика лигниназы как . пероксидазы, ориентированной на окислительное расцепление лигнина, заключается в том, что в ее активном центре катион-радикалы субстратов в той или иной мере зачищены от гидролитического деметилирования. В других пероксидазах (и оксидазах) первичный катион-радикал либо недостаточно изолирован от воды, либо быстро покидает активный центр, вследствие чего увеличивается вклад деметилирования и других реакций свободных катион-радикалов с растворителем. Очевидно, что результаты окисления лигнина при этом сильно различаются: в первом случае преобладают низкомолэкулярные "осколки", во втором - водорастворимые (вследствие ■ увеличения числа фанольных груш) высокомолекулярные продукты. Таким образом как для выяснения роли разных окислительных ферментов (в том числе различных изофэрм лигниназы) в деградации лигнина, так и для их .разумного использования в биотехнологических целях необходимо знать вклад окислительно-гидролитического деалкилирования.

Другой важный результат изучения персульфатного окисления заключается в том, что,- как мы показали, в водной среде скорость окисления аналогов лигнина практически не зависит от рН. Это означает, что необычная рН-зависимость лигяолитической активности гемсодержащих пэроксидаз обусловлена не свойствами промежуточных катион-радикалов, а диссоциацией определенных групп в молекулах ферментов.

3. ИВТШШВДЮКСИШШЫШЕ АНАЛОГИ ЛИГНИНА -ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВКЛАДА ОШУМТЕШЮ-ЩЦ>ОЛИТИЧЕСКОГО ДЕАЛКШНРОВАНИЯ

Непосредственная оценка вклада гидролитического деметилиро-вания при окислении аналогов лигнина сопряжена со значительными методическими трудностями. Ее можно произвести, например, определяя количества образующегося метанола. Однако существующие ныне методы его определения в столь малых концентрациях (мкМ) 1файне слояшы или недостаточно чувствительны. Упростить задачу, как оказалось, можно, используя соединения, в которых окислительно-гидролитический разрыв эфирной С-0 связи приводит к отщеплении от катион-радикала не изтанола,- а формальдегида, сравнительно легко определяемого в виде различных-окрашенных производных (например, динитрофэнилгидразонов, цианиновых красителей и т.д.). В качестве таких субстратов наш были предложены аналоги лигнина, в молекулах которых обччно присутствующие диметоксифенильные остатки заменены па метилендиоксифенильные: шшерониловый спирт (7) и 3,4-метиландиоксигидробенгоин (8):

сном

снлон

СИОН

■о

СП

(8)

РА ВА

РА

РА

Рис. 4. Образование формальдегида при персульфатном окислении 3,4-штлендаокси4енильных субстратов (25 мМ К2320а, субстрат 0,5 мМ, 5сРс, время инкубации I ч). Хроматографнческое определение карбонильных продуктов в виде динитрофенилгидразонов (ра - формальдегид, ба - бонзальдегид, ра - шперональ). Г - контроль (бэз субстрата), 2 - 3,4,3' .¿'-гУисштилвндаюксигидробензоин, 3-3,4-мзшлендиоксигидроббнзоин (8), 4 - пиперониловый спирт (7).

Мы выясшш!, что эти соединения как субстраты окисления сходны с д1мэтокси$йнильными производными: пиперональ значительно скорее образуется из соответствующего гидробензоина, чем из пипе-рокилового спирта. При их оккслевги действительно образуется формальдегид, причем соотноэение выходов формальдегида к шшеро-наля при окислении пиперонилового спирта свидетельствует о значительном вкладе окислительно-гидролитического деалкилирования в превращениях- его катион-радикалов. На рис. 4 представлены хрома-тограммы смеси гидразонов, полученных при обработке продуктов

персульфатного окисления данитрофенилгидразином. Соотношения выходов фора альдегида и пипероналя весьма близки к найденным при озшслешга тех субстратов пероксидазой из хрена и лахтоперокси-дазой (табл. 3).

Таблица 3.

Выход пипероналя (РА) и формальдегида (РА), мкМ,

. при окислении метилендиокскфэнильных субстратов

_ £

пероксидазой из хрена (НИР) и лактопероксидазой (и?)

Субстрат Фермент РА РА РА+РА РА/РА

Глдрэбэнзокн (8) НКР 53,1 ■ <0,1 53,2 ~103

ЕР 5,0 0 5,0 >103

Иптэр-лздовкй спирт (?) ИКР 12,3 16,0 28,3 0,77

1Л? 1,2 1.8 3,0 0,66

* Смесь, содержащую 0,5 м.4 субстрата, 6 1,кМ фермента и 0,5 Т'Н Т^О^ в 100 1,2,1 К-иптратном буфэрэ, рН 3,5, инкубяровали I ч (22°С).

Получение результата ?,югут слу:;ит:> методической базой для слздущзго шага - непосредственного спрзделзгшл вклада скпслп-телыю-гядрататяческого деалюшфовя^я при дейстзгл гр:йвлх лот-эшаз и других дйгксипшртескпх формантов. И пзроксядезы, и окск-дазн, прнсутствуггло в д-лгксгагачосклх хоуптексах, окисллвт субстрата с сСрзгосгзх" кзтЕон-радпсакоз л потеглуалько спосс-бьи

влиять "йа характер превращений этих интермедиатов. Определить, в какой мере они реализуют эту возможность - это значит приблизиться к пониманию роли этих ферментов в биодеградации лигнина и дать в руки селекционерам и генным инженерах! критерий для направленной деятельности.

вывода

1. Представлявшаяся ранее уникальной способность геисодерха-щих грибных лигнинпероксидаз (лигниназ) катализировать в кислой среде окисление нефенольных аналогов лигнина в действительности присуща и неспецифичесгаш пероксидазаи растительного к швотного происхождения: пероксидазе из хрена и лактопероксидазе.

2. При окислении алкоксизаыещенных аналогов лигнина неспеци-фическпш пероксидазаи!, пак и в модельной реакции их персульфат-кого окисления, одшщ из конкурирующее превращений субстратных катион-радикалов является их гидролитическое деалкилирование.

3. Вклад окислите льно-гадроитгческого деалхилирования при действии на аналоги лигнина неспецифических пероксидаз таков же, как и при их персульфатнои окяслепки. Это означает, что такие ферменты не влшшт на вторичные превращения субстратных катион-радикалов.

4. Разработаны тестовые субстраты - аналоги лигнина, содержащие ыетилендпоксифенилыые остатки, окисление которых приводит к образованию формальдегида. Эти субстраты позволяют легко определять В1шад деалхилирозаная при химической и энзиматическои окислении.

СПИСОК РАБОТ,. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шкрсб A.M., Левит М.Н. // Расщепление вицинальных диолов пероксидазой из хрена. О природе субстратной специфичности лигни-назы // Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды", Новосибирск, 1987. С.155.

2. Шкроб A.M., Левит М.Н., Арчаков А.И. // Модельные подхода к изучению механизма действия лигниназы. Чем отличается лигниназа от других пероксидаз? // Биоорган, химия. 1989. Т.15. N I. С.53-69.

3. Левит М.Н., Шкроб A.M. // Метилендиоксифенилсодерзащие субстраты позволяют легко определять соотношение разрывов' С-О и С-С связей при действии лигнинолитических ферментов // Тез. докл. т-ой Всесоюзн. конф. "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул". Ялта. 1989. С.329-330.

4. Левит М.Н., Шкроб A.M. // Лигнин и лигниназа (обзор) // Биоорган, химия. 1992. Т.18. N 3. С.309-345. .