Моделирование экологически безопасного циклического процесса биоконверсии растительного сырья

Норенко, Лада Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Моделирование экологически безопасного циклического процесса биоконверсии растительного сырья
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Моделирование экологически безопасного циклического процесса биоконверсии растительного сырья"

1 ->

, ц р \998

на правах р1%кописи

НОРЕНКО ЛАДА МИХАЙЛОВНА

МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНОГО ЦИКЛИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА БИОКОНВЕРСИИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ.

Специальность 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в Экобиоцентре экологического факультета Российского университета дружбы народов и Института биохимии им. А. Н. Баха РАН.

Научные руководители - доктор биологических наук,

профессор Ю. П. Козлов, доктор химических наук М.Л. Рабинович.

Официальные оппоненты - доктор технических наук, профессор М. В. Гернет, доктор химических наук, профессор Э. Г. Розанцев.

Ведущая организация - Российский химико -

технологический университет им. Д. И. Менделеева.

_ Защита диссертации состоится _ . 1998 года в

1Ь часов на заседании диссертационного совета К 053.22.29 в Российском университете дружбы народов по адресу : 113093, г. Москва, ул. Павловская, 28/5, экологический факультет РУДН.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу : 117923, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан ^^■_ 1998г.

Ученый секретарь диссертационного совета ^ /

доктор биологических наук /' В.С.Орлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В настоящее время все развитые страны уделяют большое внимание проблеме парникового эффекта. Согласно решению Конференции ООН по окружающей среде и развитию [Рио-де-ЖанеГфо, 1992 г.], выброс парниковых газов к 2000 г. должен быть сокращен до уровня 1990 г. при одновременном сохранении темпов роста промышленности. Однако, оценка выбросов диоксида углерода за последнее десятилетие, проводимая ООН, зафиксировала повышение уровня на 20-25%. Таким образом, необходимость снижения эмиссии углерода стала глобальной мировой задачей.

Помимо глобальных экологических задач, существуют локальные задачи, требующие немедленного разрешения. В России, при сегодняшней стагнации промышленности, такой проблемой, особенно для больших городов, стали отработанные газы двигателей автомашин. В Москве, по данным экологической милиции, их доля достигает 85% от общих выбросов парниковых газов. . .

В США для 9 наиболее загазованных городов проблема решается путем введения бензина новой формулы, содержащего оксигенаты. Наиболее распространеной добавкой в бензин является этанол. Смесь бензина с 1020% этанола может использоваться в обычных двигателях без конструктивных изменений. Добавка этанола заменяет тетраэтилсвинец, используемый цля повышения октанового числа и, как следствие, почти полностью прекращает загрязнение свинцом почвы и атмосферы.

Если прогнозировать получение этанола на перспективу - есть один способ - биотехнологический. Для того, чтобы этот способ получения этанола стал экономичным и экологичным, необходимо, чтобы он был замкнутым.

Этим аспектам и посвящена данная работа, .'являющаяся составной частью исследований Экобиоцентра Института биохимии им. А. Н. Баха РАН и РУДН, направленных на создание экологически чистой технологии утилизации сельскохозяйственных, промышленных и городских отходов растительного происхождения.

Целью настоящей работы является оптимизация процесса ферментативной деструкции целлюлозосодержащего сырья, включающая в себя : выбор и разработку аппаратурного оформления процесса, условия проведения ферментативного гидролиза, анализ полученных сахарных сиропов, моделирование и оптимизацию процесса ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного сырья с подпиткой исходным субстратом в ходе гидролиза, моделирование процесса культивирования гриба-продуцента целлюлаз на лигноцеллюлозных отходах .после ферментативного гидролиза.

Научная новизна:

1. Предложена схема циклической переработки растительного сырья, позволяющая повысить степень экологической безопасности процесса.

2. Показана возможность ферментативного гидролиза концентрированных суспензий лигноцеллюлозного сырья с содержанием субстрата 20-25% по массе.

3. Разработан и испытан новый тип биореактора, позволяющий проводить гидролиз вязких концентрированных суспензий в режиме непрерывной подгрузки субстрата и отвода растворимых продуктов гидролиза.

4. Получены концентрированные растворы Сахаров с содержанием глюкозы до 16%.

5. Разработана математическая модель двухстадийного процесса переработки растительного сырья, состоящей из стадии ферментативного гидролиза с подпиткой и стадии культивирования гриба-продуцента целлюлаз на лигноцеллюлозных отходах гидролиза.

6. Разработан новый принцип управления процессом ферментативного гидролиза лигаоцеллюлозы, основанный на анализе изменения вязкости суспензии субстрата в условиях непрерывной деструкции его частиц. Предложена эмпирическая формула расчета относительной вязкости такой системы в процессе гидролиза.

Практическая значимость работы. Предложенная схема двухстадийной утилизации растительного сырья является малоотходной, т. к. культивирование микроорганизмов ведется на' твердых отходах стадии гидролиза, что одновременно снижает себестоимость ферментного препарата.

Разработаны методы ферментативного гидролиза отходов производства фурфурола для получения концентрированных сиропов Сахаров, с целью их последующего сбраживания в этанол. Эти методы являются экологически более безопасными по сравнению с применяемыми в отечественной гидролизной промышленности, а получаемые основные и побочные продукты могут быть использованы без какой-либо дополнительной очистки.

Предложены варианты упрощения аппаратурного оформления процесса гидролиза сырья, позволяющие сделать его менее энерго- и материалоемким за счет совмещения нескольких циклов (гидролиз и фильтрация).

Разработанная математическая модель показала пути оптимизации и управления процессом.

Апробация работы. Результаты дисертации представлялись на 8 Европейской конференции по использованию биомассы в энергетике, сельском хозяйстве, экологии, промышленности (Австрия, 1994), XXX научной конференции факультета физико-математических и естественных наук (РУДН, 1994), Международной конференции Биокатализ-98 (Пущино,

1998), Международной конференции молодых ученых по производству этанола из лигноцеллюлозного сырья (Норвегия, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 214 наименований. Работа изложена на /З^стр., содержит // рисунков, -?схем и -/9таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Материалы, методы исследования, методики эксперимента.

В качестве субстрата для ферментативного гидролиза использованы промышленные отходы фурфурольного производства коры дуба, подвергнутые паровой обработке на Шумерлинском химическом заводе.

Источниками фермента служили очищенные путем ультрафильтрации коммерческий целлюлазный препарат целловиридин ГЗХ Приволжского биохимического завода и фильтраты культуральной жидкости Trichoderma viride (штамм F-120 и мутант 6/16), полученной во ВНИИгенетика [МорозоваЕ.С. и др., 1989].

Активность ферментов целлюлазного комплекса по фильтровальной бумаге определяли согласно методике, рекомендованной комиссией IUPAK (1981). Эндоглюканазную и целлобиазную активность определяли по методу Клесова с соавторами [Клесов и др., 1980].

Редуцирующие сахара определяли по методу Шомоди-Нельсона [Somoqui, 1952, Nelson, 1944], концентрацию восстанавливающих Сахаров -динитросалициловым методом [Miller G.L.,1960], глюкозу глюкозоксидазно-пероксидазным методом [Березин и др., 1977]. Хроматографический анализ Сахаров проводили методом ВЭЖХ на аналитическом хроматографе "Милихром", колонка 2*80 мм (Separon SGX NH2), в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил-вода с объемным содержанием ацетонитрила 70%, детектор - дифференцальный рефрактометр RIDK 101.

Определение компонентного состава используемого субстрата производили, по следущей схеме. Экстрактивные вещества удаляли последовательной экстракцией образцов спиртотолуольной смесью (1:2), ацетоном, диэггиловым эфиром в аппарате Сосклета в течение 24, 24, 12 часов соответственно. Содержание гемицеллюлоз определяли по разности массы образца до; и после гидролиза 1н H2SO4. Целлюлозу определяли азотно-спиртовым методом по Кюшнеру, лигнин определяли по методике Комарова и ГОСТ 4845-54 [Оболенская A.B. и др., 1991].

'' Исследования по ферментативному гидролизу густых (до 25% по массе) лигноцеллюлозных суспензий поводили в лабораторных условиях при 50°С, рН= 4,5 в коническом реакторе нового типа объемом 400 мл, оснащенном ультрафильтрационной мембраной для непрерывного отбора проб.

1. Получение исходных данных для построения математической модели эксперимента.

В результате исследований процесса ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного сырья и культивирования микроорганизмов -продуцентов целлюлаз на трудногидролизуемых остатках сложилась общая концепция комплексной безотходной утилизации растительного сырья методами, не требующими никаких химических агентов, кроме неорганических солей. Эта концепция может быть представлена в виде следующей схемы :____

ИСХОДНОЕ РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ

паровая обработка

ПРЕДОБРАБОТАННЫЙ МАТЕРИАЛ

-ферментатиАный ги.

САХАРНЫЙ СИРОП( 10-20%)

¡дролиз-

ТРУДНОГИДРОЛИЗУЕМЫЙ ОСТАТОК ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗЫ

ферментация БИОЭТАНОЛ

Г~

ферментация Т-гееве!-

.ЛИГНИН сжигание

ФЕРМЕНТ . Н

Схема 1. Комплексное использование растительного сырья.

Предложенная циклическая схема биоконверсии растительного сырья состоит из трех стадий. На первой стадии Производится Частичный ферментативный гидролиз лигноцеллюлозы с' образованием глюкозного сиропа концентрацией до 20%. "На второй* ;,стадии труднометаболизируемый, обедненный целлюлозой остаток субстрата утилизируется грибом-продуцентом целлюлаз с ' ■' образованием высокоактивных ферментов для стадии гидролиза. Конечной стадией является микробиологическое сбраживание глюкозно-ксилозных сиропов,в биоэтанол. Такая технология является замкнутой и, следовательно, экологически чистой. Единственным твердым остатком является лигнин, который, в отличие от получаемого в гидролизной промышленности высококонденсированного лигнина со значительным содержанием серной кислоты, является фактически природным лигнином и в этом отношении не представляет никакой экологической опасности.

1.1. Оптимизация процесса ферментативного гидролиза реального отхода фурфурольного производства.

Технология получения отхода фурфурольного производства (отдубина) близка к технологии предобработки древесины в процессе парового взрыва. В этой связи представляет интерес сопоставление использованного субстрата (табл. 1) с обработанным взрывным автогидролизом образцом быстрорастущей породы ивы, любезно предоставленным проф. Гвидо Заччи (университет г. Лунда, Швеция).

Внешне образцы коры дуба и ивы сходны и представляют собой темно-коричневую мелковолокнистую массу со слабым фурфурольным запахом и размером частиц, не превышающим 1 мм. Необходимо отметить, что отход коры дуба прошел на производстве стадию удаления гемицеллюлоз. Поэтому для их удаления из образца ивы, последний подвергали водной экстракции.

Таблица 1. Исследование компонентного состава образцов коры дуба и предобработанной паровым взрывом ивы с' водной экстракцией и без нее._

Компоненты клеточной стенки древесины Содержание в образцах, %

исходный образец ивы промытый водой образец ивы образец коры дуба

СМОЛЫ* 10,8 12 13,5

ГЕМИЦЕЛЛЮЛОЗЫ 11 0 3-5

ЛИГНИН 19-23 22-26 28-32

ЦЕЛЛЮЛОЗА 55-59 62-66 48-52

* - термин СМОЛЫ обозначает все неуглеводные и нелигаиновые компоненты клеточной стенки, извлекаемые последовательными экстракциями.

Представленные результаты указывают на близость компонентного состава отходов коры дуба и образца ивы после водной экстракции. Небольшое расхождение образцов в соотношении лигнин : целлюлрза, возможно, связано с различием в породах и биологическом возрасте исходной древесины.

Отсутствие гемицеллюлозной фракции в изучаемом отходе коры дуба упрощает общий процесс за счет исключения стадии водной экстракции, необходимой при ферментативном гидролизе обработанной паром древесины [Sinitsyn, 1981].

Для гидролиза предобработанных таким способом субстратов оптимальная активность ферментного препарата по данным [Saddler, 1996]

составляет 8-10 ШРи/г1 субстрата. Использование большего количества фермента по нецелесообразно по экономическим соображениям. В данной работе использовали ферментные препараты в соотношениЬ 7-9 1РРЦ/г субстрата. Данное соотношение позволяло быстро достигать высокой концентрации Сахаров и степени конверсии целлюлозы 80-85%.

Ферментативный гидролиз осуществлялся при 45-50 °С, рН=4,5 в . нестерильных условиях. Исходная концентрация субстрата достигала 20-25 % по массе, что в 1,5-2 раза превышает обычно используемые концентрации (10-15%).

Для реализации процесса ферментативного гидролиза густых суспензий лигноцеллюлозного сырья был разработан и опробирован реактор конического типа объемом 400 мл с насосом для равномерного перемешивания реакционной массы и ультрафильтрационным модулем для непрерывного отбора проб в ходе гидролиза. Конструкция предлагаемого реактора позволяет вести процесс ферментативного гидролиза с подгрузкой новыми порциями субстрата 'и одновременным удалением гидролизата (рис. 1).

Б, Е

■Б + Е—

Б+ЕН-Р-

I - реактор

II -1 перемешивающее устройство • Щ - фильтрационный модуль

Б - субстрат I Е - пщролизующий агент Р- продукты гидролиза

Рис. 1. Схема реактора для ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья.

Преимуществами предложенного реактора ло . сравнению с ранее известными типами реакторов являются:

- возможность использования концентрированных (20-25% по массе) суспензий субстрата;

- более высокая производительность на.единицу объема реактора;

- простота и экономичность конструкции;" ,

- возможность непрерывного отвода растворимых продуктов гидролиза; -

- возможность постоянной подгрузи .новы* порций, реакционных компонентов. ¡г. ...

В табл. 2 приведены типичные показатели,процессу ферментативного гидролиза отходов фурфурольного производства коры дуба с использованием реактора нового типа. ,<■. • , ■ >. . ; _ ; : . ;

1 НТО - международные единицы активности по фильтровальной бумаге

Таблица 2. Условия проведения .ферментативного гидролиза.

температура," С 45-50

время пиролиза, ч. 48

концентрация субстрата Г81,% \у/\У . ¿у'""' 20-25

конверсия целлюлозы, %" .80-85

лигноцеллюлозный бстатоК^% (■$ 50-55

концентрация глюкозы,-г/лЙ' 100-150

За кинетикой нарастания Сахаров в ходе ферментативного гидролиза (рис. 2) наблюдали путем отбора проб гидролизатов с помощью ультрафильтрационной мембраны. ВЭЖХ анализ показал преобладающее количество глюкозы (до 16%) и незначительное количество целлобиозы (0,5-3%). ,

Рис. 2. Кинетика образования глюкозы в ходе ферментативного гидролиза отходов коры дуба (20 мае. %) целлюлазным препаратом целловиридин ГЗх (7-9 ШРи/г субстрата), рН 4,5,50°С.

Исходная реакционная масса представляла собой густую вязкую суспензию, трудно перемешиваемую перистальтическим насосом. Опытным путем было определено предельно допустимое значение относительной вязкости суспензии, приемлемое для перемешивания насосом.

В ходе гидролиза было отмечено снижение вязкости реакционной смеси через 3-4 часа после запуска процесса. Это явление может объяснятся двумя фактами:

- растворением частиц субстрата в ходе гидролиза; .

- уменьшением размеров частиц вследствие диспергирования.

В связи с этим было проведено исследование фракционного состава частиц субстрата в процессе деструкции (табл. 3).

8 ... .

Таблица 3. Фракционный состав и средний размер частиц отходов коры дуба (в начальный момент, через 7 часов и по

№ фракции размер сит, мкм средний размер частиц, мкм Исхода. % через 7 часов % конечн. %

1 0,5-1,0 0,75 ± 0,25 23 19 17.5

2 0,5-0,25 0,37 ± 0,12 25 28 17.5

3 0,25- 0,071 0,16 ± 0,09 49 47 49

■ ; 4 <0.071 0,35 ± 0,35 3 6 16

Из таблицы видно, что в ходе процесса число мелких частиц постоянно нарастает.

Наблюдая за разжижением суспензии, мы получили возможность контроля за подгрузкой реакционной смеси новыми порциями исходного субстрата. Критерием, по которому определяется количество подгруженного материала, служит вязкость системы.

Второй замеченный феномен - наличие лаг-периода в образовании Сахаров (рис. 2). Затем происходит быстрое увеличение содержания глюкозы, а к 16-20 ч. накопление .глюкозы вновь замедляется.

Состав образцов коры дуба после завершения ферментативного гидролиза приведен в табл. 4.

Таблица 4. Состав отходов коры дубы после глубокого

Компоненты клеточной стенки древесины Содержание в субстрате, %

исходный прогидролюовапный

Смолы '■ 13,5 25

Гемицеллюлозы 3-5 0

Лигнин 28-32 60-63

Целлюлоза 48-52 11 ; 12-15

Как видно из табл. 4., прогидролизованный остаток содержит 12-15% целлюлозы, дальнейший гидролиз которой затруднен. Очевидно, это связано с образованием лигнином физического барьера, предохраняющего целлюлозу от воздействия ферментов. |

Таким образом, можно сделать вывод об экранировании лигнином целлюлозы, и существовании предела, после которого' процесс гидролиза резко замедляется и становится уже экономически нецелесообразным для получения Сахаров.

1,2. Синтез целлюлоз на отходах ферментативного гидролиза.

С целью создания малоотходного процесса ферментативного гидролиза была исследована возможность использования твердого непрогидролизованнного остатка с пониженным содержанием целлюлозы для выращивания продуцента целлюлаз и получения ферментных препаратрв для стадии гидролиза.

В ранних работах сотрудников лаборатории был подобран оптимизированный состав питательной среды, обеспечивающий накопление в культуральной жидкости целлюлаз с активностью 5,0-6,0 1РРи/г при выращивании мутантов Т. геезе1 Р-120 и 6/16 в колбах на качалке. Помимо обычных компонентов, среда включала 10,0 % лигноцеллюлозного отхода гидролиза в качестве индуктора и источника углерода.

При анализе данных литературы и собственных экспериментов по выращиванию мутантных штаммов Т. геезе1 Р-120 и 6-16 на субстратах различной степени гидролиза, удалось обнаружить зависимость выхода ферментов от соотношения лигнина и целлюлозы в образцах.

В таблице 5 приведены данные литературы [Морозова и др., 1989] и . наши совместные данные [Иогепко е1 а1., 1994] по культивированию штаммов Р-120 и 6/16 на средах, содержащих субстраты с различным соотношением целлюлозы и лигнина.

Таблица 5. Целлюлолитическая активность штаммов Р-120 и 6/16 при культивировании на средах, содержащих лигноцеллюлозы различного состава._

:;^¿отношение в образца*;' целлюлоза лйпгйин У,- ', Средняя акт11вност1г Целл1олаз,1ГРи/мл ,

Штамм 6/16 Штамм Е-120 у \

3:1 • — 1,27 ±0,4 -

2 : 1 1,51 ±0,3 * 1,60 ± 0,2 *

3:2 2,05 ±0,1 * 1,91 ±0,1 *

1:1 2,88 ± 0,7 2,15

1 : 2 4,59 ± 0,9 3,3 ± 1,1 *

1:3 2,41 ± 0,1 * 1,95 ± 0,5 *

1 : 4 1,33 ± 0.5 0,64 ± 0,3

* - [Морозова Е.С. и др., 1989].

Представленные данные подтверждают сделанные ранее выводы о наличии оптимальных для выхода ферментов соотношений лигнина и целлюлозы в образцах. Субстрат с соотношением целлюлозы и лигнина от 3:2 до 1:3 (предпочтительно от 1:1 до 1:2) является оптимальным.

Следовательно, степень гидролиза субстрата на первой стадии выступает в качестве регулятора, определяющего выход фермента на второй стадии при культивировании на остатке после гидролиза.

Таким образом, возникаем необходимость математического моделирования процесса для достижения оптимального выхода продукта гидролиза и состава негидролизованного остатка для стадии синтеза фермента.

2. Моделирование циклической схемы биоконверсии . лигноцеллголозного сырья.

Общая система моделирования включает решение двух самостоятельных задач. Первая задача - описание процессов, наблюдаемых при действии ферментов на частицы субстрата в концентрированной суспензии, при котором после определенного запаздывания образуются сахара, происходит уменьшение общей вязкости и размеров частиц. Входными параметрами здесь являются исходная вязкость, начальные размеры частиц субстрата, соотношение твердой и жидкой фаз (гидромодуль), активности целлюлаз. В решении второй задачи - описания процессов синтеза внеклеточных ферментов грибом - продуцентом целлюлаз на отходах гидролиза - выходные параметры предыдущей стадии являются входными параметрами.

Таким образом, общая схема моделирования разбивается на следующие

Схема 2. Система моделирования циклического процесса утилизации растительного сырья.

2.1. Моделирование изменения вязкости системы в процессе ферментативной деструкции лигноцемюлозы.

В процессе ферментативной деструкции субстрата изменяются два основных фактора, определяющих вязкостные свойства суспензии, - размер частиц и весовая концентрация (лигноцеллюлозного полимера, причем характер их изменения обусловлен кинетической схемой процесса.

Основная теоретическая проблема заключалась в установлении взаимосвязи между снижением вязкости исходных суспензий в ходе ферментативного гидролиза и работой ферментного комплекса на

поверхности субстрата. В литературе, насколько нам известно, эта задача не решена.

Формула, используемая в данной работе для расчета относительной вязкости системы г)г, выведена эмпирически на основании формулы расчета относительной вязкости полидисперсных ньютоновских суспензий [Chong G.S., 1971]. Она учитывает общее объемное наполнение системы ф /фшах и долю мелких частиц фм/ф и имеет вид :

Т)г = (1 + 0,75(ф/фщх / (1- ф/флш))2 *( 1/(1 + фм/ф)2), (1.1) где фшах - предельное наполнение для случая полидисперсного наполнителя, ф - общее объемное наполнение в суспензии, фм - объемное наполнение мелких частиц, 0 < фм/ф <1.

Предложенная формула удовлетворительно описывает наблюдаемые эффекты.

Для расчета предельного наполнения системы фтах при произвольном фракционном составе наполнителя использовали подход, предложенный ¿псковским и Стрком [Wickowsci A., Strk F., 1966]. В качестве исходных данных при этом задаются размеры частиц во фракциях Di (см. табл. 3), коэффициенты пористости pi отдельных фракций, отношение размеров частиц во фракциях объемные доли фракций Xi.

Для коэффициента пористости смеси нескольких монофракций используется выражение :

6-1 n

р =1 Klei pi Xi +Xeps + £Xi[K26i (pH-1) - 1], (1.2)

i=l 6+1 где pi - коэффициенты пористости монофракций, составляющих смесь; рб - коэффициент пористости базовой монофракции; к1я, к2я - эмпирические коэффициенты, являющиеся функциями величин

Тя =D6/Di ( i=l,2.......,6-1,6), (1.3)

4/,6 = Di/D6 ( i= б, 6+1........N).

Фракции здесь нумеруются в порядке убывания диаметров. Под De понимается диаметр частнц базовой (основной) фракции. Для нахождения коэффициентов к1б! и к2« используют следующие выражения : х1я = % (1 +24,6i)/[ %(1 +2%) + (1 - УбО2 ] (1.4)

к2й =xF2i6(3 + xFi6)/[4/Zi6(3+4'i6) + (l-Ti6)3 ] (1.5)

Расчет ведут по уравнениям (1.2) - (1.5), последовательно перебирая все фракции как базовые. Из полученных значений коэффициента пористости р за истинное принимается максимальное. Подставляя ртах, определяют . величину предельного наполнения фшах : ф m« = 1/(1+рпих);

В нашем случае общее объемное наполнение суспензии ф расчитывали как отношение объема твердого вещества к суммарному объему системы. Долю мелких частиц вычисляли как отношение массы частиц фракции 4 (табл.3) к общей массе твердой фазы.

Затем по 'формуле (1.1) находили начальную критическую относительную вязкость системы т|го. Экспериментально начальную относительную вязкость системы Т]ю определяли по пороговой мощности перемешивающего устройства [Мошев В.В. и др., 1990].

Для моделирования использовали схему 3, показывающую возможное перераспределение частиц по размерам в ходе ферментативной деструкции. При этом оперировали четырьмя основными фракциями, условно рассматривая исходный полидисперсный субстрат Б состоящим из частиц четырех размеров. За диаметр, характеризующий каждую фракцию субстрата, принимали средний размер частиц во фракции, исходя из наиболее вероятного распределения частиц по размерам.

Х[ -Х4 - частицы фракций 1-4 соответственно, Р - растворимый продукт гидролиза.

Схема 3. Модель взаимопревращения частиц исходного субстрата в процессе ферментативного гидролиза.

Каждая частица может давать более мелкие частицы, а их общая масса может уменьшаться за счет параллельно идущего процесса растворения с образованием продукта Р.

Установим теперь взаимосвязь между процессом ферментативной деструкции и изменением вязкости. Для этого положим конфигурацию всех частиц одинаковой. Далее, положим, что скорость уменьшения массовой доли крупных частиц пропорциональна массе (или кубу линейного размера) образуемых из них более мелких частиц, скорость образования которых, в свою очередь, обратно пропорциональна вновь образованной поверхности или квадрату линейного размера образуемых частиц.

Введем к2 - константу скорости образования частиц Хг из частиц XI. Тогда константа скорости распада XI на частицы Хг равна £2-£>,У£>23. Для того, чтобы выразить скорость превращения частиц XI в частицы ХЗ, выразим сначала кЗ - константу скорости образования частиц ХЗ через к2. Пользуясь введенным выше допущением, запишем, что кЗ = кг-оЦй]. Тогда константа скорости распада частиц Х1 с образованием Хз равна кЪ-йЦо] или ^г-К^Оз//),3. Выражая аналогичным образом через к2 константы скорости распада крупных частиц на более мелкие и константы скорости образования более мелких частиц, получим следущую систему дифференциальных уравнений, описывающих изменение массы каждой фракции в ходе реакции :

dM, di

dM2 "di

= -kl • M, -D

2(A + A+A) M,dP

■ k2 ■ D]

л/,

Í3L + А

IA А

А3

Mdt

dM ~~dt

3 =k2-D3-D¡

M. M, —г + —г + lA D¡

M,DA

dM4 Л

= Ar2

A2-A2

А/,

D М,

3 У \

А Д

Mdt

M,dP Mdt

M4dP Mdt

(1.6)

(1.7)

(1.8)

(1.9)

где Mi - масса i - ой фракции, М - общая масса, D¡ - средний размер частиц i - ой фракции, Р - образующийся растворимый продукт (в нашем случае это глюкоза).

Последний член в этих уравнениях пропорционален убыли масс частиц на образование растворимого продукта Р в ходе ферментативного гидролиза. Скорость образования продукта Р не зависит от размера частицы [Синицын и др., 1984]. Разные коэффициенты при этих членах указывают долю продукта, образованного из частиц данного тапа.

Решение системы этих уравнений дает текущие величины масс каждой фракции и позволяет на основании формулы (1.1) рассчитывать значения относительной вязкости системы т|г в каждый момент времени t. Полученные величины r|rt оцениваются в сопоставлении с исходным значением Г|го и служат критерием для определения момента подгрузки новой порции субстрата.

Численное значение базовой величины к2 (4,17*10"4мин'1) определено на основании описанной модели из экспериментальной зависимости размеров частиц (табл.3.) от времени гидролиза.

2.2. Моделирование образования Сахаров входе ферментативного

гидролиза.

Существует значительное число отечественных и зарубежных работ, посвященных отдельным аспектам моделирования процесса ферментативного гидролиза целлюлозы [Гусаков и др., 1984,86, Мануковский и др., 1990, Дорохов и др., 1993,94]. Необходимость отдельной разработки этой части в нашей работе связана с тем, что предлагаемые модели не дают объяснения наблюдаемому нами лаг-периоду в образовании Сахаров. В этой связи представлялось целесообразным более подробно остановиться на особенностях дейстия

полйферментного комплекса в процессе гидролиза целлюлозы в условиях соизмеримости эффективных концентраций фермента и субстрата.

Введем обозначение А для исходной поверхности целлюлозы. В предлагаемой модели фермент El представляет эндодеполимеразу, которая гидролизует поверхность А в месте своего прикрепления с образованием "восстанавливающих концов", по неупорядоченному (стохастическому ) механизму. Такую активированную ферментом El поверхность обозначим как В. Фермент Е2 представляет экзополимеразу, поэтапно отщепляющую ди- (или моно-) сахариды от концов полимерного субстрата и производящую "расчистку" образованной поверхности В с ее превращением вновь в поверхность А.

На поверхности А, как и на поверхности В происходит конкурентная адсорбция ферментов El и Ег. Размеры площадок (Ь), занимаемых 1 молекулой каждого фермента, положим равными ввиду приблизительно одинаковых размеров белковых глобул.

Положим, далее, что адсорбция фермента El на поверхности А всегда д :ет продуктивный комплекс (Ein), а на поверхности В - непродуктивный (Eih) 2. Для фермента Е2 связывание с поверхностью А всегда дает непродуктивный комплекс (Егн), а с поверхностью В - всегда продуктивный (Е2п).

Для удаления всего верхнего слоя с поверхности субстрата нужно, чтобы на нем последовательно побывали El и Ег.

Общая схема взаимодействия ферментов El и Ег с поверхностями А и В, используемая в данной модели, выглядит следующим образом :

кадс кдес

El + А -> Еш -» B + Ei

кадс

Ei+B <= => Бы

кдес

кадс

Ег + А <= => Е2н

кдес

кадс к'

E2 + B <= => Е2п -> Е2 + А + Р

кдес

Схема 4. Взаимодействие ферментов El и Ег с поверхностью лигноцеллюлозы в процессе ферментативного гидролиза. Здесь кадс - константа скорости адсорбции ферментов El и Ег, (считаем ее одинаковой для Ei и Ег), кдес - константа десорбции ферментов с поверхности субстрата, к' - константа скорости "расчистки"ферментом Ег

2 Здесь и далее под непродуктивной адсорбцией Е1 подразумеваем такую адсорбцию, при которой адсорбированный фермент Е| не активирует дополнительно поверхность для фермента Ег.

поверхности В т.е. превращения ее в поверхность А следущего слоя с одновременным образованием растворимого продукта Р.

В начальный момент времени мгновенное установление адсорбционного равновесия задается следущими выражениями : Е1п/Е1*А = Кадс (2.1)

Eih/ Ei*B = Кадс (2.2)

Е2и/Е2*А = Кадс (2.3)

Е2п/Е2*В = Кадс (2.4)

Eio = Ei + Ein + EiH (2.5)

. Е2о = Е2 + Е2П + Е2Н , (2.6)

где El, E2 - концентрация свободных ферментов, Ein, Егп - продуктиввно связанные ферменты, Eih, Е2н - непродуктивно связанные ферменты, Кадс -равновесная константа адсорбции.

Динамика перераспределения ферментов в процессе гидролиза и образования новых поверхностей А и В описывается следующей системой дифференциальных уравнений :

dEin / dt = - кдес Ein + кадсЕ1*А; (2.7)

dEiH / dt = - кдес Eih + кадсЕ1*В; (2.8)

dE2n / dt = - кдес Егп + кадс Ег*В, (2.9)

dE2n / dt = - кдес Eîh + кадсЕг*А; (2.10)

dEi/dt = кдес (Ein + Eih) - кадсЕ1*(А+,В); (2.11)

dE2/dt = кдес (Е2н + Е2п) - кадсЕ2*(А + В); (2.12)

Уравнение динамики свободной поверхности А запишется следующим образом :

j---кадс*Е*А + кдсс*Еа +

(г + 2х{{-Смолы-(Кг +1 )L„ -{LJlJ-УА + k'-Ea--^-Ф, (2.13)

{г+ 2x^,^1-Смолы-(К 2 +1 )Lm(LJLKfA"^) 1

где предпоследний член показывает появление новой, скрытой под гидролизованными связями поверхности, учитывая неравномерное распределение лигнина и целлюлозы по толщине клеточной стенки древесины (см. также Мануковский и др., 1990).

Ls - доля лигнина на внутренней поверхности трахеид,

Lm - -"---в центре срединной пластинки,

Смолы - доля нелигниновых и неполисахаридных компонен'г, Кг- коэффициент экранирования целлюлозы лигнином, s - толщина клеточной стенки древесины, г - размер пор в древесных клетках клетках,

х - глубина проникновения гидролизного фронта вглубь клеточной стенки древесины;

Последний член уравнения - функция Ф- отвечает за увеличение свободной поверхности А за счет внесения дополнительных порций субстрата в момент подгрузки.

Динамика поверхности В выглядит аналогично: dB/dt = -W*B*(El+E2) + kflecEln-(bec-k')E2n, ' (2.14)

Последний член уравнения связан с тем, что за время пребывания на поверхности фермент Ег не успевает полностью расчистить площадку Ь, превращая ее в поверхность А.

Исходя из формулировки модели, появление растворимых продуктов гидролиза Р связано с действием Егп следующим соотношением : dP / dt= красщЕгп, (2.15)

где красщ - скорость образования растворимых продуктов Р.

Убыль полисахаридов в результате гидролиза равна Р/1.1 (стехиометрический коэффициент гидролиза), где Р - количество образовавшихся Сахаров. Масса доступных полисахаридов в слое клеточной стенки толщиной х задается выражением, предложенным ранее Кондращенко В. И., Болобовой А. В., Рабиновичем М. JT. (1997г.) :

Mo s s i

откуда по известному P(t) для каждого t рассчитывается глубина (х) проникновения полисахараз в клеточную стенку.

2.3. Моделирование процесса биосинтеза ферментов при глубинном культивировании гриба Trichoderma reesei на твердых лигноцеллюлозных отходах после ферментативного гидролиза.

Для снижения затрат при промышленном производстве целлюлаз в качестве сырья вместо модельных субстратов можно использовать дешёвые целлюлозосодержащие отходы, так как в конечную стоимость получаемого продукта значительный вклад вносят субстраты, используемые для ферментации.

Развитие микроорганизмов на целюлозе предполагает биосинтез и экскрецию ими целлюлаз. Регуляция этого процесса контролируется механизмами индукции и катаболитной репрессии. Известно, что наиболее эффективными индукторами являются углеводы, содержащие Р-1,4-связи, а катаболическим репрессором - глюкоза [Безбородов, Астапович и др., 1984].

Хотя в литературе имеется ряд моделей подобного типа [Калинникова, Кантере, Гернет и др., 1990, Варфоломеев, Калюжный и др., 1990], нам не удалось обнаружить примеров моделирования взаимосвязи состава исходного субстрата, а именно - соотношения лигнина и целлюлозы и выхода ферментов. Поэтому нами был сделан основной акцент именно на

этом аспекте, принципиально важном для создания цикличесой схемы "гидролиз-ферментация".

Прежде чем определить общую структуру модели, условимся, что процесс протекает при отсутствии внешних лимитирующих факторов в периодической культуре и хорошо перемешиваемой жидкой среде с диспергированными в ней частицами субстрата. Для простоты примем, что азот, кислород и другие неорганические вещества находятся в избытке и их изменением в процессе роста культуры и синтеза фермента можно пренебречь.

На растительном субстрате синтезируется сразу несколько групп ферментов - эндоглюканазы Е1 и целлобиогидролазы Е2. Сделаем допущение, что Е1 и Ег индуцируются и репрессируются синхронно, т.е. их гены находятся под контролем одного и того же оперона. В этой связи заменим обозначения Ег и Ег на общее обозначение Е.

Итак, общие черты наиболее простой модели синтеза грибом ферментов, разрушающих целлюлозу, могут выглядеть следующим образом :

к4

Ъ -> 2Х

Схема 5. Простейшая схема синтеза целлюлаз при культивировании гриба-продуцента.

Клетки X, потребляя продукт ферментативного гидролиза Р, растут до состояния делящихся клеток Z, из которых затем получаются две дочерние клетки. При этом, при полном насыщении клеток X продуктом гидролиза Р и лимитировании общего процесса стадией деления клеток Z, максимальная удельная скорость роста Цтах равна кч.

Биомасса продуцента распределяет потребляемое вещество и энергию на 3 потока : поддержание клеток X в рабочем состоянии, синтез новых клеток Ъ, синтез внеклеточных продуктов (ферментов Е). Задача заключается в том, чтобы обеспечить максимальный синтез внеклеточных продуктов Е, пропорциональный количеству клеток Х1 в системе.

Для оценки количества клеток микроорганизма, синтезированных из 1 грамма субстрата, необходимо ввести экономический коэффициент, отражающий отношение констант анаболических и катаболических процессов. Будем полагать, что в первом приближении в процессе всего культивирования экономический коэффициент у сохраняется постоянным.

Для простоты полагаем, что для индуциррвания клеток (клетки ХО необходима низкая концентрация растворимых продуктов, которая присутствует в остатке после гидролиза. Вместе с тем, достаточно высокая концентрация продуктов приводит к выключению синтеза фермента и

переводу клеток Х1 в состояние Хг. Этот процесс описывается константой Кг.

Клетки Хг способны синтезировать только клеточный белок со скоростью/ определяемой константой к2, что соответствует пропускной способности рибосом.

Индуцированные клетки XI параллельно синтезируют молекулы фермента с максимальной скоростью кз и клеточный белок с константой (кг-кз). Здесь константа кз означает долю рибосом, занятых синтезом белка по специфической целлюлазной мРНК.

Источник растворимых углеводов в среде образуется в результате действия ферментов - целлюлаз - на полисахаридную часть твердого лигноцеллюлозного* остатка. Естественно, скорость образования углеводов будет зависеть от текущей концентрации этих ферментов, а также от того, насколько эффективно они действуют на полисахариды. В свою очередь, эффективность их действия определяется общим количеством внесенного остатка на единицу обьема, его общей поверхностью и долей полисахаридов, доступных в данный момент на поверхности остатка.

Скорость же расходования растворимых углеводов Р определяется скоростью их потребления клетками гриба в анаболических и катаболических процессах.

В модель закладываются следующие процессы :

1. Образование клеток X при делении клеток Ъ и их расходование путем превращения в процессе роста в клетки Ъ с учетом конкурентного процесса синтеза внеклеточных ферментов Е.

<1Х/£к= - кгХР + кзКгХР/(Кг + Р) + 2Ъ.Ъ, (3.1)

Кг - константа репрессии синтеза Е продуктом Р,

к2 - суммарная константа скорости анаболических процессов роста клеток и синтеза белка при утилизации продукта Р,

кз - константа скорости индуцибельного синтеза полисахарид-гидролаз Е из продукта Р,

к4 - константа скорости деления клеток;

2. Образование клеток Ъ при росте клеток X, зависящее от подачи источника углерода Р с учетом конкурентного процесса синтеза внеклеточного фермента Е клетками X,, и расходование,клеток Ъ при делении. , .

д№дх- кгХР - кзКгХР/ (Кг + Р) - клХ, ,. (3.2)

3. Содержание свободных ферментов Е в системе, связанное с расходованием их на адсорбцию и приростом в результате синтеза клетками X и десорбции с поверхности субстрата.

ёЕ/сИ = - кадсЕА + кдесЕа +кзКгХ(ыо)Р(мо)/(Кг + Р)Ме (3.3)

Последний член уравнения - кзК/Х«-и)Р<мо)/(Кг + Р)Ме, характеризующий синтез ферментов Е и связанный с общим количеством клеток X, степенью их насыщения субстратом Р и репрессией синтеза ферментов в этих клетках продуктами ферментативного гидролиза, учитывает также

запаздывание в отклике системы на изменение концентраций продукта Р и клеточной массы X, которое соответствует времени синтеза ферментов индуцированными клетками (Ь). ,

4. Образование адсорбированных ферментов из свободных при адсорбции на поверхности лигноцеллюлозного субстрата и их убыль за счет десорбции.

с!Еа/ск = кадсЕА -кдесЕа (3.4)

6. Изменение поверхности лигноцеллюлозного остатка за счет процессов адсорбции и десорбции фермента Е а также появления новой поверхности под прогидролизованными связями в результате работы фермента' Е по образованию продукта Р.

<- РА+к- Р +

к'*Е.*(г + х)*

1 - СМОЛЫ-(К2 + 1)*Ья.*

(г + х(1 • ад)'

(3.5)

к'- константа скорости послойного гидролиза субстрата (см. выше). 7. Образование растворимого углеводного продукта Р при ферментативном гидролизе полисахаридной части субстрата и его расходование на конструктивный метаболизм растущих клеток X, делящихся клеток Ъ. <№/& = красщЕа - РХк2/у ' (3.6)

где красщЕа - образование продукта Р адсорбированным ферментом Еа. Глубину проникновения (х) полисахараз в клеточную стенку находят,, предварительно оценивая общее количество образованного растворимого продукта Р*, считая ёР*/ск = красщЕа. Тогда (см. также 2.16)

0.180*Р* _(1-Смолы)*х _(К2 + 1)*Ьп в (3.7)

Мо в в ^

Выходными параметрами, по которым идет оптимизация, являются в данном случае конечные активности полисахараз. ..

В качестве начальных и граничных условий вводятся : Мо -исходная масса лигноцеллюлозы в ферментере, > < Х0 - исходная концентрация клеток гриба в ферментере, Р0 - исходная концентрация продукта, вносимого вместе с лигноцеллюлозным остатком;

АсеПо - начальная поверхность целлюлозы, вычисляемая по формуле :

АСеио~( 1 -Смолы . |; 150 -Смолы' (К*+0 * * * 4 * (г+2 * хо)

.. ( I 8*(г+8>2*Ь '";*;; -

где хо - глубина проникновения ферментов в клеточную стенку субстркта на предыдущей стации гидролиза

Оптимизация ! процессов ферментативного гидролиза и синтеза целлюлаз проводилось|путем решения на ЭВМ численным методом Рунге -Кутга с!йстем алгебраических и дифференциальных уравнений (1.1)- (1.9),

(2.1)-(2.16) и (3.1)-(3.7). Компьютерная программа составлена Дубровским Ю.В. и Киселевым С.А.

Численные значения констант и переменных, используемых в данной модели. _

Константы и переменные

Обозначения

Чнсленные значения

Константы;

Скорости гидролиза субстрата ферментом Е2п, мин"1 Скорости адсорбции ферментовЕ! и Е2, м'/моль* мин Скорости десорбции ферментов, мин'' Равновесная константа адсорбции, моль /м* Скорости превращения поверхности В в А, мин Скорости образования частиц Фр2, мин'1 Экранирования целлюлозы лигнином, доли Константа репрессии, кг/м*

Общая константа синтеза белка клетками, м'/кг*мин Константа скорости синтеза фермента, м*/кг*мин Константа скорости деления клеток, м'/кг*мин Размер поры, м Толщина клеточной стенки, м Плавучая плотность древесины, кг/м'

Доля нелигнипового и нецеллюлозного компонента в

субстрате

Доля лигнина на поверхности со стороны люмен Доля лигнина в срединной пластинке Размер площадки под 1 молекулой фермента, ма/моль Экономический коэффициент системы Молекулярная масса фермента, кг/моль Начальные данные;_часть 1.

Концентрация фермента Е1, моль/м*

Концентрация фермента Е2, моль/м1

Концентрация субстрата, кг/м*

Размер частицы Фр.1, м

Размер частицы Фр.2, м

Размер частицы Фрм

Размер частицы Фр.4, м

Массовая доля Фр.1 в исходном субстрате

Массовая доля Фр2

Массовая доля ФрЛ

Массовая доля Фр.4

часть 2.

концентрация внесенного остатка, кг/м* концентрация внесенного сахара, кг/м1 концентрация внесенной клеточной массы, кг/м1 глубина проникновения ферментов в клеточную стенку ,м_._

Красщ 12

кале 10

кдес I *102

Кале 1М0"3

к' 3*10"3

к2

К2 0,25

Кг 3

кг 6*10"4

кз 2,1 МО"3

к4 2,5*10'3

г 1*10"5

б 3*10®

g 8*102

Смолы 0,13

Ьб 0,15

Ьт 0,70

Ь 1,5*107

У 0,7

Ме 60

Е1„ од

Е20 0,4

М„ 300

01 7,5*10 ■*

Б2 3,75*10"4

03 1,65*10"4

Б4 3,5*10'®

т1 . 0,23

т2 0,24

тЗ ■ 0,49 ,

т4 0,03

М0 100

Ро 10

Хо '

• *»■ .. от0доЗ*10

Рис.3. Выход продукта в процессе гидролиза. Сплошные кривые - теоретические: а) периодический процесс, б) процесс с подпиткой; Точками показаны экспериментальные значения для процесса с подпиткой вручную.

Рис.5. Теоретическая кривая выхода целлюлолитической активности ферментов стадии культивирования. Показаны экспериментальные значения.

60 50 40 30 20

10 О

Рис.6. Изменение фракционного соства в процессе с подпиткой. М1-М4 - основные фракции (см. табл. 3). Показаны экспериментальные значения.

3. Оптимизация циклического процесса биоконверсии растительного сырья.

На рис. 3, 6 представлены результаты расчета процесса с подгрузкой, управляемого цутем поддержания постоянного значения вязкости суспензии. Как видно из этих рисунков, экспериментальные данные, полученные путем проведения гидролиза с подгрузкой вручную, удовлетворительно согласуются с расчетными. При этом, оптимальный выход продукта в оптимизированном процессе, естественно, выше и достигает 200 г/л. Таким образом, управление процессом по вязкости с использованием разработанного алгоритма является целесообразным.

На рис. 4 представлено расчетное изменение степени конверсии в периодическом процессе (гладкая кривая) и в процесе с подгрузкой. Как видно из этой кривой, подгрузка уменьшает достигнутую среднюю степень конверсии субстрата. Сопоставление рисунков 4 и 6 показывает, что, хотя, измельчение частиц происходит и после завершения активной стадии гидолиза, на этом этапе дальнейшая подгрузка уже не является целесобразной.

Однако, с учетом того, что процесс должен протекать по циклической схеме, результат, представленный на рис. 4 целесообразно сопоставить с результатом на рис.5. На нем изображена зависимость выхода ферментов от степени конверсии целлюлозы в субстрате, используемого в качестве источника углерода и индуктора в исходной среде(либо от соотношения в нем целлюлозы и лигнина). На рис. 5 сопоставляются расчетные данные и экспериментальные, полученные нами [Norenko et al.,1994] совместно с Морозовой Е.С. [Морозова и др.,1989]. Как видно из рис.5, характер зависимости является колоколообразным, причем экспериментальные данные удовлетворительно описываются расчетной кривой. Исходя из данных рис.5, оптимальный выход ферментов, составляющий 8-10 IFPU/мл

достигался на субстрате со степенью конверсии от 50 до 75%. При этом, с точки зрения оптимального выхода Сахаров, наилучшей является степень конверсии 75 %. Таким образом, первая стадия должна быть завершена при степени конверсии 75 % , что соответствует 30-36 часам гидролиза. В этих условиях выход Сахаров (рис.3) близок к максимальному и составляет 180 г/л. Таким образом, в результате первой стадии, которая проводится с подгрузкой, контролируемой по уменьшению вязкости, может ; быть достигнута средняя продуктивность процесса 6 г/л*час, при общей концентрации Сахаров 180 г/л и оптимальной степени конверсии субстрата для второй стадии 75 %.

ВЫВОДЫ.

1. Обоснована циклическая схема утилизации растительного сырья, с получением этанола в качестве конечного продукта, являющаяся экологически более безопасной альтернативой существующему в нашей стране кислотному способу гидролиза древесины. Схема включает ферментативный гидролиз лигноцеллюлозы с образованием 15-20% глюкозного сиропа для сбраживания в этанол. Обедненный целлюлозой остаток субстрата утилизируется грибом-продуцентом ферментов с образованием высокоактивных целлюлаз,. используемых на стадии гидролиза. Единственный побочный продукт - лигнин - сохраняет природную структуру, не содержит токсичных примесей и является экологически безопасным.

2. Отработаны условия проведения процесса ферментативного гидролиза В биореакторе нового типа, позволяющем работать с концентрациями субстрата до 25 масс. % в условиях вязкой лигноцеллюлозной суспензии, с подгрузкой субстрата и отводом продукта гидролизата.

3. Определены фракционный, компонентный состав и степень конверсии субстрата - промышленного отхода производства фурфурола из дубовой коры - на разных стадиях гидролиза.

4. Разработана математическая модель управления процессом подгрузки субстрата в реактор в ходе гидролиза на основании предлагаемых уравнений расчета относительной вязкости, учитывающих изменение размеров частиц субстрата под действием ферментов.

5. Путем численного моделирования определены оптимальные значения степени конверсии субстрата (75%), продуктивности процесса (6 г/л*час), концентрации Сахаров (180 г/л) для реализации циклической схемы.

6. Теоретически обоснован оптимальный выход . ферментов . при культивировании гриба-продуцента на обедненном целлюлозой остатке с определенным соотношением целлюлозы и лигнина.

Основные положения и выводы, сформулированные в диссертации, представлены в следующих работах :

- Норенко Л.М. Водно-бутанольнаяделигпифнкация растительного сырья // Тезисы докладов XXX научном конференции факультета физико-математических и естественных наук. Ч.З. - М.: Изд^во РУДН, 1994. - С.48.

- Норен " Ч. ВЭЖХ анализ растворов после ферментативного гидролиза

растите __ сырья // Тезисы докладов XXX научной конференции факультета физико-математических и естественных наук. Ч.З. - М.: Изд-во РУДН, 1994.-С.61.

-L.M.Norenko, Ariunaa Jalsrain, E.S.Morozova, M.L.Rabinovich, Yu.P.Kozlov Cyclic utilization of lignocellulosics.//Proceedings of the 8th European Biomass Conference. Vienna, Austria, 3-5 october 1994, V. 2,1337-1342 -L.M.Norenko, Ariunaa Jalsrain, E.S.Morozova, M.L.Rabinovich, Yu.P.Kozlov Cyclic utilization of lignocellulosics.//Book of Abstracts of the 8th European Biomass Conference. Vienna, Austria, 3-5 october 1994. -Norenko L.M., Pristavka A,A., Kodituwakky P.A., Rabinovich M.L., Kozlov Yu.P. The comparison of two types of reactors for high solids ensymatic hydrolysis of lignocelltilosics: the effect of stirring.//Book of Abstracts of the International Conference BIOCATALYSIS-98: Fundamentals & Application. Puschino on the Oka, Russia, 13-18 June 1998,P.62. ; - Norenko L.M., Kodituwakky P.A., Kozlov Yu.P; Modelling of reological properties of highly concentrated lignocellulosics suspension under the process of ensymatic hydrolysis.//Book 'of Abstracts of the International Young Scientists Conference - ETANOL FROM LIGNOCELLULOSE. Sarpaborg, Norway, 9-11 November 1998......

Норенко Лада Михайловна (Россия) Моделирование экологически безопасного циклического процесса биоконверсии растительного сырья.

Обоснована циклическая схема утилизации растительного сырья, с ^лучением этанола в качестве конечного продукта, являющаяся ;ологически более безопасной альтернативой существующему в нашей гране кислотному способу гидролиза древесины.

Отработаны условия проведения процесса ферментативного гидролиза биореакторе нового типа, позволяющем получать глюкозные сиропы с энцентрацией до 20%.

Разработана математическая модель, позволяющая оптимизировать вухстадийный циклический процесс.

Lada M. Norenko (Russia) Modelling of an environmentelly safe process of bioconversion of plant raw

materials.

A cyclic process of bioconversion of plant raw materials in order to produce lioetanol has been developed as an environmentally safe alternative of the xisting industrial process of acid hydrolysis of wood. The enzymatic hydrolysis if steam pretreated wood has been performed in the new bioreactor enabling to iroduce sugar syrups with glucose concentration up to 20%.

A mathematical model has been created to optimise the two stage cyclic >rocess.

,II.98r . Объем I, 25п. л. Тир. 100 &ак. 788

Тип. РУДН, Орджоникидзе, 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Норенко, Лада Михайловна, Москва

Российский университет дружбы народов

Норенко Лада Михайловна

МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНОГО ЦИКЛИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА БИОКОНВЕРСИИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. (03.00.16-экология)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: д.б.н.,проф. Козлов Ю.П. д.х.н. Рабинович М.Л.

Москва - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ__4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ__8

1.1. Экологические проблемы, возникающикающие

при получении энергии из ископаемого топлива_8

1.1.1. Исчерпание ископаемых топливных ресурсов _8

1.1.2. Энергетика на ископаемом топливе -

глобальное загрязнение_10

1.1.3. Современное моторное топливо : экологическая

опасность № 1___14

1.2. Возобновляемое сырье как источник энергии_17

1.2.1. Сырьевые источники возобновляемой энергии_19

1.2.2. Биоэтанол как альтернатива ископаемому топливу_ 26

1.2.3. Бразильская спиртовая программа _26

1.3. Технология получения этанола из биомассы _29

1.3.1. Основные характеристики

целлюлозосодержащих материалов_31

1.3.2. Паровой взрыв - экологичный метод

предобработки растительных материалов_37

1.3.3. Ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного сырья-ключевая стадия получения биоэтанола_Ц

1.3.4. Реакторы для ферментативного гидролиза_43

1.4. Математическое моделирование и оптимизация процессов

ферментативного гидролиза целлюлозы__47

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ_53

2.1. Исходные вещества_53

2.2. Методы определения компонентного состава древесины_53

2.2.1. Определение экстрактивных веществ_53

2.2.2. Определение содержания гемицеллюлозы_54

2.2.3. Определение целлюлозы_54

2.2.4. Методы определения лигнина_55

2.3. Метод проведения ферментативного гидролиза_56

2.4. Метод определения восстанавливающих Сахаров_56

2.5. Определение глюкозы в ферментных гидролизатах_58

2.5.1. Определение содержания глюкозы_58

2.6. Определение активности ферментов целлюлазного комплекса_59

2.6.1. Определение суммарной целлюлазной активности_59

2.6.2. Определение целлобиазной активности_60

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ_ 61

3.1. Получение исходных данных для построения

математической модели эксперимента_ 61

3.1.1. Оптимизация процесса ферментативного гидролиза_ 62

3.1.2. Биосинтез целлюлаз на отходах

ферментативного гидролиза_ 71

3.2. Моделирование циклической схемы биоконверсии лигноцеллюлозного сырья_ 73

3.2.1. Подсистема изменения вязкости в процессе гидролиза_74

3.2.2. Подсистема проникновения ферментов вглубь целлюлозного субстрата_86

3.2.3. Подсистема образования Сахаров в ходе гидролиза_91

3.2.4.Система биосинтеза ферментов на отходах гидролиза_99

3.3. Оптимизация циклического процесса биоконверсии растительного сырья в рамках предложенной модели__107

ВЫВОДЫ_124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ_126

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы :

В настоящее время все развитые страны уделяют большое внимание проблеме парникового эффекта. Согласно решению Конференции ООН по окружающей среде и развитию [Рио-де-Жанейро, 1992 г.], выброс парниковых газов к 2000 г. должен быть сокращен до уровня 1990 г. при одновременном сохранении темпов роста промышленности. Однако, оценка выбросов диоксида углерода за последнее десятилетие, проводимая ООН, зафиксировала повышение уровня на 20-25%. Таким образом, необходимость снижения эмиссии углерода стала глобальной мировой задачей,

Помимо глобальных экологических задач, существуют локальные задачи^ требующие немедленного разрешения, В России, при сегодняшней стагнации промышленности, такой проблемой, особенно для больших городов, стали отработанные газы двигателей автомашин. В Москве, по данным экологической милиции, их доля достигает 85% от общих выбросов парниковых газов.

В США для 9 наиболее загазованных городов проблема решается путем введения бензина новой формулы, содержащего оксигенаты. Наиболее распространеной добавкой в бензин является этанол. Смесь бензина с 10-20% этанола может использоваться в обычных двигателях без конструктивных изменений. Добавка этанола заменяет тетраэтилсвинец, используемый для повышения октанового числа и, как следствие, почти полностью прекращает загрязнение свинцом почвы и атмосферы.

Если прогнозировать получение этанола на перспективу - есть один способ - биотехнологический.

Ферментативный способ получения моносахаридов во многом лишен недостатков, присущих способу, основанному на кислотном

гидролизе, поскольку осуществляется в гораздо более мягких условиях по температуре, давлению и кислотности среды. Это требует значительно меньших расходов энергии, предотвращает деструкцию Сахаров и образование трудно утилизируемых отходов, снижающих биологическую ценность гидролизатов. Одновременно появляется возможность решения экологических проблем, связанных с необходимостью создания биотехнологических методов утилизации отходов и вторичных продуктов промышленной и сельскохозяйственной переработки растительного сырья.

Для того, чтобы этот способ получения этанола стал экономичным и экологичным, необходимо, чтобы он был замкнутым.

Этим аспектам и посвящена данная работа, являющаяся составной частью исследований Экобиоцентра Института биохимии им. А. Н. Баха РАН и РУДН, направленных на создание экологически чистой технологии утилизации сельскохозяйственных, промышленных и городских отходов растительного происхождения.

гЪр.пмеНтатиттпгп гмттлпттгтзя

Научная новизна;

- Предложена схема циклической переработки растительного сырья, позволяющая повысить степень экологической чистоты процесса.

Показана возможность ферментативного гидролиза концентрированных суспензий лигноцеллюлозного сырья с содержанием субстрата 20-25% по массе.

Разработан и испытан новый тип биореактора, позволяющий проводить гидролиз вязких концентрированных суспензий в режиме непрерывной подгрузки субстрата и отвода растворимых продуктов гидролиза,

- Получены концентрированные растворы Сахаров с содержанием глюкозы до 16%.

- Разработана математическая модель двухстадийного процесса переработки растительного сырья, состоящей из стадии ферментативного гидролиза с подпиткой и стадии культивирования гриба-продуцента целлюлаз на лигноцеллюлозных отходах гидролиза,

Разработан новый принцип управления процессом ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы, основанный на анализе изменения вязкости суспензии субстрата в условиях непрерывной деструкции его частиц. Предложена эмпирическая формула расчета относительной вязкости такой системы в процессе гидролиза,

Практическая значимость работы. Предложенная схема двухстадийной утилизации растительного сырья является малоотходной, т, к, культивирование микроорганизмов ведется на твердых отходах стадии гидролиза, что одновременно снижает себестоимость ферментного препарата.

Разработанная математическая модель показала пути оптимизации и управления процессом.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экологические проблемы, возникающие при использовании

ископаемого топлива.

1.1,1. Исчерпание ископаемых топливных ресурсов.

Нефтяная и газовая промышленность для многих стран мира являются теми отраслями энергетики, которые обеспечивают устойчивое оазвитие экономики,

х.

Быстрое развитие энергетики в XX в, обеспечивалось бурным развитием сначала угольной, затем нефтяной промышленности. К 1970 г. доля нефти достигла 60% мирового потребления, а доля угля снизилась за 20 лет в 2 раза .

В 60-е - 80-е годы быстрое развитие в нашей стране получает нефтяная и газовая промышленность. В отдельные годы этого периода ежегодный прирост добычи нефти достигал 25 млн, т, а газа 40 млрд. м3.

Согласно существующим геологическим разработкам по оценке ископаемых ресурсов, запасы нефти во всех странах мира составляют 137 млрд. т и природного газа 140 трлн. м3. Основные запасы нефти сосредоточены на Ближнем и Среднем Востоке (Иран, Саудовская Аравия, Ирак, Кувейт), а газа - в России, Иране, Катаре.

В середине 90-х гг. общемировая накопленная добыча нефти превысила 86 млрд. т и газа 53 трлн. м\

Построенные на базе геологических изысканий графики суммарных ресурсов нефти, позволяют прогнозировать циклы ее эксплуатации [90]. Эти кривые ограниченных ресурсов, начиная с нуля, поднимаются до максимума, а затем уменьшаются до нуля. Они имеют форму кривой

нормального распределения. Существующие на сегодняшний день кривые можно экстраполировать для следующей части цикла. Следущие графики показывают циклы эксплуатации нефти, основанные на разных гипотезах.

Ресурс 2 Ресурс 1

1900 1925 1950 1975 2000 2025 2050 2075 2100

Рис. 1. Оценка ресурсов нефти, которые можно получить из литосферы.

Наиболее подходящая оценка (Ресурс2), сделанная Райменом составляет 330*109т. Более пессимистическая оценка (Ресурс 1), сделанная Габбертом, составляет 215 *109 т. В более вероятном случае наблюдается пик в конце этого века, после чего идет уменьшение [105]. Все это диктует настоятельную необходимость в поиске альтернативных нефти источников энергий.

Энергетический кризис 1972 г., затронувший многие страны мира, вызвал резкое повышение цен на нефть. Результатом этого кризиса явилась переоценка роли нефти как дешевого сырья, что в свою очередь дало импульс к разработке новых энерго- и ресурсосберегающих экологически чистых технологий.

1.1.2. Энергетика на ископаемом топливе - глобальное загрязнение.

При освоении нефтегазовых ресурсов необходимо учитывать как техногенные последствия, так и природные геодинамические особенности регионов. При разработке нефтяных и газовых местораждений негативное воздействие на окружающую среду происходит в пределах размещения техногенных объектов. Помимо нарушения почвенного покрова, загрязнения атмосферы, нарушения поверхностного стока и микрорельефа происходят изменения темпнературы и влажности грунтовой толщи, что способствует развитию экзогенных геологических процессов. Добыча нефти и газа приводит также к изменениям и более глубоких горизонтов нефтяных и газовых месторождений [24],

К тому же, террирории, занимаемые техногенными объектами добычи нефти, все чаще относятся к зонам экологического бедствия. Так, в результате 25-летней хищнической эксплуатации Самотлорского нефтяного гиганта территория этого месторождения отнесена к зоне развития экологической катастрофы.

Известны загрязнения окружающей среды со стороны перерабатывающих предприятий нефтяной и газовой промышленности. В 1995 г, принята программа реабилитации земель Среднего Поволжья, на которых размещены нефтеперерабатывающие заводы.

Настоящим бедствием последних десятилетий стали катастрофы танкеров, перевозящих нефть. Участились аварии на нефтепроводах нашей страны.

Рассмотрим теперь вред, наносимый топливной энергетикой.

75% общей выработки электроэнергии в мире приходится на ТЭС, которые потребляют энергоресурсы в виде твердого, жидкого и газообразного топлива.

Топливная энергетика ежегодно выбрасывает в атмосферу Земли более 200 млн. т окиси углерода, более 50 млн. т различных углеводородов, 150 млн, т двуокиси серы, свыше 50 млн, т окислов азота, 250 млн. т мелко дисперсных аэрозолей.

Наттпмл,трг» ТТГ1Г/Г г^жтлтямъга 1П6П т/иг ТПГТТТТДИЯ ТТ/ГТТЯ" ГГОИРГГЬГГЛЫ

X А 1.^/ Л -».О. Г А у Л * А. А V»» Л.ЛЛ.Л.Л. X V Ч/\/ Ж ^ Л. Л. V Л Л^/ Х^ЛЖ/Ч« X Л ХЛХМ ^л, V А Ж V Ч^ХУХ ХХЖ

антрацитовый штаб "образуется: 35,5 т/ч шлака (не доходит до дымовых труб), 193,5 т/ч уловленной золы (из бункеров электрофильтров, очищающих газы на 99%), 10 млн. м /ч дымовых газов (через дымовые трубы), 2350 т/ч углекислого газа, 251 т/ч паров воды, 34 т/ч - ЗОх, 9,34 т/ч - Ж)х , 2,0 т/ч- летучей золы, неуловленной в электрофильтрах [14].

Таким образом, по своим масштабам материального и энергетического обмена с окружающей средой ТЭС, работающие на угле и мазуте, вносит существенный вклад в нарушение баланса установившихся в биосфере круговых процессов. При этом нарушение баланса происходит не только по вредным газам, но и по углекислому газу и безвозвратной потере кислорода^ которые могут отвечать за глобальное потепление с увеличением масштабов производства электроэнергии на базе ископаемого топлива.

Общемировая структура технологий получения первичной энергии, в которой 90% приходится на долю огневых технологий, т.е. сжигательного использования добываемого топлива привела к тем последствиям, которые не заметить сегодня уже невозможно. Расчеты по кольцам деревьев, снежным пластам, коралловым рифам показывают, что температура на поверхности планеты сейчас является наиболее высокой за 600 последних лет. Средний уровень моря поднялся по сравнению с прошлым столетием на 10-15 см. Согласно научным оценкам, средняя температура на планете может к 2010 г, повысится на 1,3°С, Последствия этой тенденции могут стать пагубными в результате неминуемого повышения уровня Мирового

океана на 0,3-1 м и затопления прибрежных территорий и целых островных государств. Еще недавно перспектива глобального потепления даже вызывала восторг по поводу появления в будущем возможности выращивать пшеницу на Крайнем Севере. Теперь пришло осознание того, что изменение климата в районах вечной мерзлоты, на которые приходится 58% российской территории, обернулись бы не только экологическим бедствием всей страны, но и необходимостью практически заново создавать всю инфраструктуру экономики страны.

На рис. 2 представлен общий объем мировых выбросов парниковых газов ПГ (по компонентам), а на рис. 3 - доли разных стран в общем выбросе.

Общая эмиссия Остаточная Диоксид углерода Метан Остаточный Оюсиды азота Галогены

эмиссия углерод

Рис. 2. Общий объем мировых выбросов различных компонентов парниковых газов (по данным [41]).

По оценкам Environmental Protection Agency (ЕРА, США), для стабилизации состояния атмосферы на нынешнем уровне необходимо снизить объем выбросов следующим образом : двуокиси углерода на 5080%., метана на-10-20 %, фреонов на - 75-100%, окислов азота на - 80-85%.

По данным медицинского журнала "Ланцет", воздействия продуктов сжигания одного лишь твердого тотлива может обернутьсяв период до 2020 г. ежегодной смертью дополнительно 700 тыс. человек. Глобальное сокращение выбросов ПГ на 10-15% спасло бы жизнь в 2000-2020 гг. 8 млн. человек (6,9 млн. - в развивающихся странах, 1,1 млн. - в индустриально развитых странах).

Развитые страны

Развивающиеся страны

О 500 1000 1500

Общие выбросы парниковых газов, мпн. тони

О 300 600 900

Общие выбросы парниковых газов, млн. тонн

Рис, 3, Доли разных стран в общемировом выбросе парниковых газов.

На конференции ООН в Киото (декабрь 1997 г.) по эмиссии парниковых газов было отмечено, что живучесть в атмосфере двуокиси углерода - основного антропогенного парникового газа, превышает сто лет. Это означает, что даже в случае полного прекращения выбросов парниковых газов, которое практически неосуществимо, период, за который окажется возможным обратить вспять вызванное деятельностью человека антропогенное изменение климата и связанный с ним экологический ущерб, составит не годы или десятилетия, а столетия и тысячилетия.

1.1.3. Современное моторное топливо : экологическая

опасность N1.

Помимо глобальных экологических задач, существуют локальные задачи, требующие немедленного разрешения. Такой проблемой для городов стало загрязнение атмосферного воздуха отработанными газами транспортных средств. Основным видом транспорта для внутригородских и междугородных перевозок является автомобиль, на котором в качестве силового агрегата используется карбюраторный или дизельной двигатель внутреннего сгорания, являющийся источником загрязнения.

Примерный состав отработанных газов двигателей автомобилей ппе ^ставлен в табл. 1.

Таблица 1. Основные компоненты отработанных газов (ОГ)

двигателей автомобилей»

КОМПОНЕНТЫ ОТРАБОТАННЫХ ГАЗОВ ПРЕ

Информация о работе

Норенко, Лада Михайловна
кандидата химических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.16

Диссертация

Моделирование экологически безопасного циклического процесса биоконверсии растительного сырья - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы