Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Милюминесцентный метод в ранней диагностике особо опасных инфекций

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Милюминесцентный метод в ранней диагностике особо опасных инфекций"

Р Г Б О Д На правах рукописи

2 5 НОЛ

КОКОВА Людмила Юрьевна

МШШНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД В РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

03.00.07 - микробиология

14.СЮ.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов-1996

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте

ст.н.с А.Т. Яковлев ст.н.с B.C. Рыбкин

профессор В.И.Ефременко профессор Ю.М.Ломов

Ведуп^я организация - Саратовский государственный

медицинский университет

Защита диссертации состоится 1996г.

е0 гг

час на заседании диссертационного совета Д 074.32.01 по защите диссертаций на соискание, ученой степени доктора нзук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071, г.Саратов, Университетская,46)

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке института "Микроб"

Автореферат разослан "- 1996 г.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, доктор медицинских наук,

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доктор медицинских наук,

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Корнеев Г.А.

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Ранняя диагностика бактериальных инфекционных заболева-ши, в том числе и особо опасных, базируется на использовании азфобиологических исследований/ направленных на выделение и щентификациэ возбудителей; серологических и 'иммунологических «годов,позволяющих выявить антигены возбудителей и антитела к шм.

Диагностическое и прогностическое значение при этом имеют юкаэатели уровня определяемых антител в динамике инфекционно-'о процесса.. Весьма информативен позитивный результат выявлена антигена (антигенемия, антигенурия), поскольку частота об-шружения бактериальных антигенов в 2-3 раза превышает частоту збнарухения возбудителя. Кроме того, антигены обнарузкиваются я® з первые дни болезни,, а наличие их в биологических субс-гратах не зависит от проведенной антибактериальной терзшш.

I

1ля поиска аятэтеноз Еогбудителеи и антител к ним в настоящее зреет используются такие высокочувствительные методы, как им-*унофлюоресцгнтный, ихмукофериентяый, радиоиимушши анализ. Збязательныии компонентами постановки этих методов являются шагала (или антигены), меченные специальными маркерами (ло-¿инесцирущие, ферменты, радиоизотопы). Кроме того, в арсенале методов диагностики бактериальных, инфекций' имеются и приемы илергодизгностики, поскольку возбудители инфекционных и инез-зиёных болезней, а такие продукты их штаболизш способны выз-зать развитие аллергических процессов, которые часто становят-;я составной-частью патогенеза заболеваний. К числу таких ин-¡Звкционко- аллергических заболеваний относятся хронические ин-

фекции (туберкулез, лепра, сифилис, лейзшаниоз, кандидозы), также большинство бактериальных особо опасных инфекции (чума бруцелле'з, туляремия, сзл, мелиовдрз, сибирская язва) (Дагова дянц С.М..Пономарев Н.Г.,Сероглагов В.В. ,1972;Вершилов П.А..Чернышева М.И.,Князева Е.Н, 1974; Олсуфьев H.r.,1975;ßali mand М.,Dodin А..1933 и Др.).

Методы аллергодиагностики до недавнего времени сводилис к накожным, внутрикожным и кожным пробам. И хотя до сих по эти приемы находят применение в научной и практической работе накапливающийся материал свидетельствует об их недостатках отсутствие корреляции между уровнен сенсибилизации и чувстви тельностью кожи при некоторых аллергиях; появление сенсибили зации при постанов!« повторных кожных проб; возможное проявле вне после введения аллергеяз системных или обащ реакций вплоть до развития анафилактического шока. Интенсивное разви

■ ■ ' /I

тие • теоретической и прикладной иммунологии способствовало по явления новых методов регистрации состояния гиперчувствитель ности и в частности - методов лабораторной диагностики аллер

гш.

Из таких приемов наиболее широко стеля использовать; спе щфгческий лейкоцитолиз, задергкку миграции лейкоцитов, реакци бласттрансформации лимфоцитов (РБХЛ), дегрануляцизо тучных кле ток и.баэофилов, показатель повреждения нейтрофилов (ШШ) (Ва видов М П., Киселев A.C..Назарова Е.К., 1996;Суханов H.A. с со авт.1983; Фрадкин В.А.,1985 и др.). Несомненными достоинствам этих тестов являются:' ползая безвредность для пациента', воз ыожность апробации в качестве аллергена препаратов, которые н

аогди быть использованы при парентеральном введении; возможность наблюдения за изменением состояния сенсибилизации в процессе лечения. В то же время проявились и некоторые негативные зтороны, усложняющие такую диагностику. К ним следует отнести необходимость соблюдения стерильности при постановке большинства этих тестов, использование специальных ингредиентов (сред, лейкоцитов животных), длительность проведения реакции.

' Однако, один из лабораторных тестов диагностики сенсибилизации организма все же быстро привлек внимание клиницистов и экспериментаторов - показатель повреждения нейтрсфилов по Ерадкину В.А. (1962) . В дополнение к уже перечисленным достоинствам лабораторных методов диагностики аллергии следует отнести необходимость для постановки ПОН палых обгемов крови, непродолжительное Ереия для постановки и учета, а также простоту постановки тестз, что предопределяет возможность внедрения этого приема в клинических лабораториях практически лпбой категории.

Накопивсшйся опыт использования ЛЕН в научной и практической работе с целыз выявления сенсибилизации к бактериальным антигенам не только показал его Еысокуп информативную ценность, но и вскрыл основной недостаток - субъективность учета результатов теста. Интенсивность проявления амебоидного движения, альтерации клеток в присутствии специфического аллергена зо разному оценивается исследователями и не поддается приборному учету, в то же время чувствительны!.« и объективным методом регистрации функционального состояния фагоцитирующих и иммуно-■сомпетентных клеток является хемилюминесцентный анализ. С по-

- б -

мотаю этого метода бндо показано, что у больных с адлергичес кими заболеваниями можно в ранние сроки.относительно быстро просто выявлять гиперчуствительность к различным аллергенам контролировать ее изменение в процессе специфического лечения Наличие серийно выпускаемой аппаратуры позволяет избегать не определенности и несравнимости результатов, получаемых разлив ными исследователями при использовании хешшоминесцентного ме тода (Еарабой Б.А,,Орел В.Э.,1983;НеЕМятулин А.Л.,1989; Ope В.Э., 1S7B;Рассанов С.П. Двинский А.К. /Чеботарь И.Б., 198"? Сатр1е11 А.К.»Hallet M.B..Weeks 1.,1985).В доступной литерат> ре имеется единичные сведения об использовании хешшзминес центного метода для оценки иммунореакткввости организма щ особо опасных инфекциях. .

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

Изучить информативность хешшзминесцентного метода, ка;

I

объективного интегрального показателя . активации фагоцитирующих и иммунокомпетентных клеток крови, вызванного специфическим аллергеном и отражающего степень сенсибилизации мак-рооргакивма антигенами возбудителей особо опасных инфекций.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. -

1. Получить аллергены (антигены) из штаммов возбудител« 00И для использования их в ППН и ХЛ анализе.

2. разработать и оптимизировать условия постановки и уч* та ХЛ метода и провести сравнительную оценку его аффективное: с ППН.

3. Изучить информативность и специфичность ХЛ метода \ вакцинальном и инфекционном пррцессах, вызванных возбудителя) 00И.

4. Определить ценность показателей XЛ метода для ранней диагностики ООП.

5. Изучить возможность использования ХЛ метода, для опосредованного обнаружения возбудителен СЮИ в объектах знесней среды.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

ВперЕые теоретически обоснована и доказана в эксперименте возможность хемадазминесцентной регистрации феномена активации фагоцитирующее а иммузскомпетентных ¡слеток крови в присутствие специфических антигеноз, как интегрального показателя интенсивности гиперсенсибализацпи мзкроорганлзмз при инфекционном и вакцинальном процессах, вызванных возбудителями ООН.

Епервыэ показана сысокая информативность хешшмкяесцент-ксго анализа (в сравнешгл с микроскопной регистрацией ППН и методами серологической диагностики) в качестзе приема ранней

• I

диагностики особо опасных инфекций.

■ ПРАКБ1ЧШ-УЯ ЗНАЧЙЮСТЬ.

1. Разработан и предложен простой, ' доступный для лаборатории любого профиля ХЛ метод регистрации функционального состояния фагоциткрувпзк кммуноко?я1е"тентпых клеток крови.

2. На примере ООН показана Еысокая информативность ХЛ метода а ранней диагностике этих инфекций.

3. Показано, что с помогаю ХЛ метода возможно обнаружение возбудителей ООН в объектах внесней среды путем заражения ими экспериментальных животных и последующей регистрацией у них гиперсенсибилизации, что позволяет рекомендовать его как дополнительный тест-в схеме индикации ООП.

4. Материалы диссертационной работы использованы при оформлении методических рекомендации 'Применение хемклюминес-центного метода для диагностики чумы, сапа и мелиоидоэз и обнаружения их возбудителей в объектах внешней среды", утвержденных в ноябре 1995г. директором Волгоградского НИШШ, акзде-м1:ком РЭА, профессором Тихоновым Н.Г.

• ОСНОВНЫЕ ПОЛОНЕНИЯ, БЫНОСШЕ НА ЗАЩТУ.

1. Хемилшинесценткач регистрами активации фагоцитирующих и иммунокомпетентных клеток крови .в присутствии специфического антигена, йак способ определения гиперреактивности экспериментальных животных, зараженных или вакцинированных возбудителями 00й.

2. Диагностическая значимость XI метода в ранней диагнос-. тике ОШ в сравнении с микроскопной регистрацией ШН и традиционными методами диагностики.

3. Использование УЛ метода в качестве дополнительного теста в схеме индикации возбудителей ООП.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации долсвкены и обсуждены на расширенных научно-производственных советах Астраханской противочумной станции (1992, 1993гг.), научных.конференциях Волгоградского НИПЧИ (1994, 1995гг.), Всероссийского НШШ "Микроб" (1995), Харьковского НИИ микробиологии и иммунобиологии юл. И.И.Мечни-кобз (1995), отражены в гаквдчигедьном отчете при непосредственном участии автора в кзчестве исполнителя (К госрегистрации КИР-01.9.20 006770) ' и в одном инструктивно-методическое документе.

ПУБЛИКАЦИИ.

" Основные положения и результаты исследования изложены в четырех опубликованных научных работах.

СТРУКТУРА И СБЬЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глаз собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, в который входят 111 отечественных и S7 иностранных источников. Работа изложена на.№ страницах, содержит is таблиц, 5 рисунков. "

• СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В экспериментах использовались птачмы возбудителя чумы (У.pestIs Э-93, 231, 650, 661, 654, 706, 915, 933,1435, 1343), возбудителей сала и иелиоидозз (P.mallei Ц-5, 8 и P.pseudcTiallei С-141, 59361), вакцинные штамма возбудителя чумы, бруцеллеза и туляремии (Y.pestis EV, Br.abortus ЗА-19, F.tularensis 15), а также четырнадцать культур близкородственных и гетерогенных микроорганизмов: Y.pseudotuberculosis б, 56, 67; Y.snterocolitica P-7S, 188, H3ssing; E.coli Ог, Оц; P.putida ВКМВ-901; P. vesicularis 974; P.acidovorans BKMS-1294; P.aeruginosa H-3; P.alcaligenes 4138; P.myxogenes 378.

Культуры микроба чумы при посеве на бульон Хоттингера через 2 суток после инкубирования, при 28 С формировали в пробирках првдснно-прпстеночный рост с незначительным помутнением бульона. Нз агаре из кровяных сгустков росли единичные клетки, образуя на поверхности среды колонии чумного микроба в R-фор-ме. Все штаммы обладали хсрспо выраженной фибринолипиесксй

активностью. Ферментировали с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, маннит и не разлагали рзмнозу и сахарозу. Имели ви-доспецифические антигены - пергул фракцию (F-I) и "мыаиный" (I) токсин. Обладали различной вирулентностью по относенио к

морским csiihk3m и беЛЬШ МЫИЗМ.

Штаммы возбудителей сапа и мелшидоза по морфологическим, тинкторизльным и биохимическим признакам были типичными. Они обладали высокой вирулентностью для золотистых хомячков и умеренной для морских, свинок.

В качестве объектов внешней среды были использованы образцы проб воздуха и смыеов с поверхностей, искусственно кон-таминированные разными гидами возбудителей.

В ППН и ХЛ анализе в^качестве аллергенов были использованы общие фракции водорастворимых антигенов (ВРА), водно-солевой экстракт (ВСЭ), приготовленные из высуиенных ацетоном клеток Y.pestis (смесь штаммов 705, 651, 654, 660 и Э-93), P.mallei 8, P.pseudomallei 59351 и Br.abortus ВА-19. Еактериальнух массу заливали 2,5% раствором хлористого натрия в соотношении 1:5 (ч/объем) и оставляли на 43 ч в холодильнике при.4°С. Затем смесь центрифугировали при 6000g в течение 40 мин. Нздоса-дочную жидкость, содержащую общие водорастворимые антигены, сливали ЕО флаконы и замораживали при -20°С, а осадок ресус-пендировали в двойном объеме 2,5% раствора хлорида натрия i разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора фирмы . "Аг-tex" мощностью 40 вт/см2 в течение 30 мин. Шсле разруиешс клеток взвесь центрифугировали в том же режиме. Надосадок декантировали и замораживали, а осадок повторно обрабатывали, как указано гыше. Приготовленные тагам образом три порции во-

дорзстворимых антигенов объединяли в одну и диадкзовзли против дистиллированной воды на магнитной месалкз яри г4°с до полного удаления ионов хлора. После диализа раствор антигенов концентрировали 207. яолизтиленгликолем ш 6000 Д до содержания белка в пробе 20-25 мкг/мл и прогревали при 100°С а'течение 1 часа с целью инактивации термолабильных антигенов. Готовый препарат запаивали а ампулы и хранили при -20°С.

Оптймадьнуп рабочую концентрация аллергенов для постановки ППН и ХЛ определяли с кровью морских свинок, иммунизированных взвесями убитых клеток возбудителей, делая км по 4 внутримышечных . инъекции с недельным интервалом в дозах 1*105-1*Юэ -2*10Э-2*Ю10 м.к./мл. Нз каждый вид возбудителя брали по пять животных. Через 5 дней после заверпения иммунизации у морских свинок получали кровь из ушной венн и смешивали с различными дозами аллергенов. "Шинный" токсин лпбезно предоставлен стар-пш научным сотрудником Кулаковым М.Я. .Калсульным антигеном служил (F-I) -коммерческий препарат, входящий з состав ингредиентов для постановки РПГА, Казахского НИ противочумного иксти-тута (Алма-Ата). '

В опытах по изучения возможности проведения ранней диагностики некоторых. особо опасных инфекций с помощью ХЛ анализа и ППН и обнаружения возбудителей этих инфекций в объектах внешней среды были использованы беспородные морские свинки массой 250-300 г. Заражали их подкожно разными дозами в зависимости от цели опыта в объеме 0,5 мл и 1,0 пл.

Исследуемый материал высевали на чашки Петри с питательной средой, оптимальной для данного зида возбудителя. Для выделения чумного микроба использовали элективные среды: агар

Хоттингера иди Мартена с сульфитом натрия и генциан-виолето!, рН 7,2. Для возбудителя сага и мелнокдоза применяли мясо-пег тонный агар, рН 6,8-7,0 с 5* глицерина. •

При постановке теста ППН в опытную пробирку вносили О,С мл аллергена, разведенного 51 раствором цитрата натрия, а контрольную - 0,02 ил 51 цитрата натрия. Для каждой опытной контрольной пробы- набирали по 0,03 мл крови и вносили в пр! докнуи часть пробирок. Через 2 часа после инкубации в герма-тате при 33°С готоеили мазки, погружали на 40 мин в фиксато; а затем поэтапно обрабатывали раствором лерйодата, погружали реактив Шиффз и обрабатывали в рзстгоре, гематоксилина, после довательно промывая их после каждой операции дистиллирование водой. В опытных и контрольных препаратах подсчитывали.по 1С нейтрофалов, учитывая поврежденные, разрушенные и амебовдны? Показатели уровня поврежденных клеток крови определяли по фо{ муле:

Н1 - Н2

100

где Hi - число поврежденных нейтрофшгав в опыте; Н2 - число поврежденных нейтрофалов в контроле; 100 - количество просмотренных в мазках клеток.

Полохаггельной считали реакцию о показателями повредценш нейтрофилов крови 0,1 и выше. Лшинесцентнуш микроскопию иа; ков проводили в модификации В.Б.ГерЕазиевой (1963). Для этогс 1) в две небольшие силиконовые проб!фки вносили по 0,45 i крови с антккоагулянтом (соотношение 2:1), в качестве которое

использовали 1,5% раствор двунатриевой соли ЗДТА ("Хелатсн-3") в; 0,7% физиологическом растворе (рН не выне 8,0 во избежание неспецифнческого лизиса лейкоцитов); 2) в опытную пробирку добавляли 0-,05 мл свежеприготовленного аллергена, разведенного .1:10 раствором Сшмса. Содержимое пробирок осторожно перемешивали и оставляли на 1 час при комнатной темперзтуре; 3) перед флаорохромированнем содержимое пробирок вновь осторожно пере-мешггалй л добавляли по О,05 из (экспозиция 5 мин) соленого раствора акридинового оранжевого в разведении 1:20000. ' основной раствор акридинового оранжевого готовили на дистиллированной годе. (1:1000). Для претотсвленкя рабочего раствора акридинового оранжевого 1:20000 (рН не нкг.э 6,3) использовали солевой раствор Сиимса. Рабочее разведенке пригодно для работы з течение 1-2 нэд.; 4)' вапла смеси гз опытной и контрольной про-б5фск (по истечении 5-минутной окраски клеток) наносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и исследовали в лзминесцэнтнам мжфоскопе. Производили подсчет 1000 граяулоци-тоз, определяли процент позреядеяккх элементов.В лзсминесцент-нсм микроскопе нейтрофилы выглядели в виде шаровидных клеток с обнккм ' рубиновых гранул на фоне тускло-зеленого свечения ци--тодлаз мы.

При постановке ХЛ анализа кровь животных в объеме 100 мкл разводили в 100 раз•раствором Хенкса (без фенолового красного) С добавлением 10 ЕД/нл гепарина и оставляли при комнатной температуре на 3-4 часа. Затем разведенный образец крови разливали по 500 'мкл з три полкстироловые пробирки. В перЕке две вносили по 100 мкд лшинола в концентрации Ю-3 - 10~4 М и через 15 ит после инкубщгазазия при 37°с о номоа^ю люмхпюметра 1_КВ

1250 или бета-счетчика LKE-Wallac снимали показатели спонтанной хешшоминесцекции (СХЛ) в милливольтах, а в третьей проб! - показатели фонового свечения (ФХЛ) (Ki). Затем в первуп пробу вносили аллерген в объеме 100"мкл рабочей концентрации, во пробы помешали в термостат при 37°С и черев кзздые 15 мин (15 30, 45 и 60 шш) регистрировали показатели индуцированной хе-милюминесценции (ИХЛ). Параллельно после инкубирования с лши нолом снимали показатели СХЛ, йХЛ-Ki и в" дополнительных контрольных (Кг, Кз) пробирках. Реакция считали .положительно: только при наличии Еыраженной разницы показателей ИХЛ, превы шащих показатели СХЯ, ФХЛ, Кг и Кз не менее, чем в четыре ра за. . . ' -

Ki или ФХЛ представлял собой пробу исследуемого материал в объеме 500 ккл. Кг - 500 мкд разводящей гшдкостя (рзство Хенкса) с добавлением лймивола в концентрации 10~3 - 1Q""4 M Кз - пробирка с физиологическим раствором..'. !.. ■

Статистическую обработку результатов проводили со Б.Ю.Ур баку (1975) с использованием программируемых шкрокалъкулято ров. . - , ."■..-.' - -,

Из серологических методов для поиска аитпгеноз изучаемы возбудителей использовали реакция непрямой геиагглатшшци (РИГА) и реакцда дагексной агглаиждцш; (РАЛ). ¿'.качестве дп агностикумоз были . использованы коммерческий,чумной эритроци тарный антительный диагностику« и азтительный салной зригроця тарный диагностику«" Волгоградского НЙШ1. ..В РАЯ испогьзов'з ли экспериментальные образцы солпгруппового жууногйзбулино вого л&гексного дкагпостккумз, лзбезно предоставленные Смэ-лянским В.Я. -■

Реакщ® агглютинации латекса для'выявления в крови животных антигенов бруцелл осуществляли по нижеописанной методике.

В ряд лунок микрошшаеты' вносили по 50 ыкд разводящей жидкости. Затем в первую"лунку добавляли 50 мкл исследуемой , сыворотки и титровали до третьей лунки. § третьи лунку материал не вносили. После зтого во все Лунки добавляли по 50 мкл латексяого диагностикой. Планшету' слегка встряхивали и оставляли на 18 ч.. Результат считали положительным, когда частицы ■ латекса выпадали на дно. лунки равномерным слоем в виде зонтика, _ а з лунке о контролем - в виде компактного диска. В каждой серш ' опыта. ставили, долсяятельный контроль в концентрации 5*Ю7 М.К./М1.

'"■■ -Результаты а обсуждения. Известно, что микроскопный учет ШН носит ео многом субъективный характер из-за особенностей просмотра мазков, поиска и подсчета иептрофидоз, оценки степени внр£кепностп их гмгбоидного движения и альтерации, поскольку результат какого этапа во многом определяется индизидуаль-' нш. восприятием и йодгстовкой последователя. Это обстоятельство являлось прпчдетй попета приемов, . обеспечиваЕсдх более на-деяпуэ вер::*жгщкэ результатов теста. _ Одним из таких приемов ' стаз способ дополнительной "окраски. мазка фгворехромеын с пос-гздуэзкц их проснотрш з.лшнесцентном микроскопе (В.Б.Герваг. . гнева, 1233).Ханой прием, по мнению автора,■ упрегдл поиск ней-трофшюз га счэт. характерной окраски, свеченш 'ядра и про-трпгазма а коктраствости наблюдаемых объектов..

СргЕНитеаьнс? изучение мшфосконного а ххшнесцентного учета результатов ЩШ выполнено нами на животных {юрские

свинки), иммунизированных высушенными ацетоном клетками возбудителей чумы, сапа, мелиовдоза и бруцеллеза, и на экспериментальных животных, зараженных вирулентными штаммами возбудителей чумы, сапа и мелиовдоза.

Для этого группам животных вводили подкожно 0,5 мл суспензии сухих клеток перечисленных возбудителей,. а на. 7 и 10 сутки забирали кровь и определяли ППН с гомологичным' аллерге-. ном.

Полученные. результаты свидетельствовали о том, что индексы повреждаемости нейтрофилоа крови у иммунизированных морских, свинок и инфицированных 'вирулентными штаммами возбудителей чумы, сапа и мелюидозз практически оказались одинаковыми как при световой, так и люминесцентной »шрасшпм. Разница в показателях отмечалась- лига в сотых долях.При атоу субъективизм оценки альтерации клеток практически не изменялся.Позтому объективный метод учета результатов ППН способствовав бы повызз- • шзз достоверности, и информативности теста. V ,. •

Именно таким йетодш может стать "хемшюшшесцантнна. анализ (ХЛ) (Bender J.Q.,Van Epps O.E. ,l?83;ßinsburg: I. ; et al., 1993). Хешшсьашасцэнция обусловлена ме-таЗс^с-скЕ-я • процессами; кизнедеятелыюсст кяэток oprsänsua,. Сзечеппе возникает в реакциях с активными кислородными продуктами, которыми являются супероксидныи радикал, скнглеткый кислород, гкдроюильшя радикал к перекись '■ водорода (Зенкоз - Н.К.,Куликов В.Ю. ,1985;Гриневич В.А. ,Вгра5ой В.А.,Орел В.Э.,192В; Мгзкокий А.Н. .Невмятулин А.Л. .Чеботарь и.В. ¿1937) .Эти продукты orpsxsar метаболическуи перестройку стимулированных, ■ вазбукд-знных ¿лго-цитирузщих и ишуЕОкомлетентных клеток. Следовательно, г.ежзо-

минесцентная регистрация является наиболее чувствительны* и информативным методом оценки функционального состояния таких клеток (Реэайкина A.BS с соазт.,1995). Клеточная активация может быть инициирована растворимыми и корпускулярными агентами через рецепторы.

Выполненные нами исследования по оптимизации условщ"1 постановки УЛ анализа применительно к поставленным целям и задачам, покззали, что оптггмальные рабочие концентрации аллергенов, использованных в работе, были для возбудителя чумы 750 мкг/мл, сапа 600 мкг/мл, мелиоццоза 600 каст/мл, бруцеллеза 400 мкг/мл.

Наиболее оптимальные показатели ХЛ получены на 0,1М трис-HCl рН 7,0. Из испытанных концентрации лшинола (1*10~2, 1*10~3,1*10~4, 1*10-5 М) - оптимальными являлись- 1*10"? и 1*Ю~5 M в испытуемой проба (конечная концентрация).

У зараженных чумой животных выявлена зависимость появления положительных результатов в ХЛ анализе от срока исследова-. ния и дозы заражения. Установлено, что положительные результаты ХЛ регистрируются уже на 2 сутки, но только у животных, зараженных вирулентным итаммом. На этот период ни бактериологически, ни в РИГА факт инфицировния не подтверждался. Только на 3 сутки после заражения появляются позитивные результаты, кроме ХЛ анализа, в ППН и при бактериологическом исследовании как у ди2отных, зараженных вирулентным щтзммсм, гак n'y животных, зараженных умеренна вирулентны« штаммом возбудителя чумы. Увеличение концентрации клеток возбудителя при заражении, способствующее более интенсивному развитию инфекционного процесса, вызывало появление позитивных результатов ко 2 суткам в ХЛ

анализе (60Х случаев) и ШШ (40% случаев), а на 3 сутки поэи-

t fTbJj О-j '

тивные результаты отмечены и в других• тестах>^У животных, зараженных слабо вирулентным штаммом факт инфицирования не подтвержден нк е одном тесте даже нз 5 сутки после заражения,

Специфичность позитивных результатов ХЛ анализа подтверждена ка животных, зараженных близкородственны)® и гетерологич-ными микроорганизмами:, ка 5 сутки в ХЛ и ППН были получены позитивные результаты только с кроЕыо животных, ззраженных туляремией, а на 7 сутки - зараженных псевдотуберкулезом..

Таким образом, ХЛ анализ позволял уже на/2 сутки еыяелять гиперреактивность животных, зараженных вирулентным штаммом возбудителя чумы, а в тесте ППН - только с 3 суток.При . этом информативность ХЛ' анализа также окааалзсь вьпе, чем в ПШ1, поскольку число позитивных результатов значительно превышало таковые в ППН.

Установлено, что при инфекционном процессе, вызванном заражением возбудителями сапа и мелиоидоза, в ХЛ анализе гиперреактивность животных регистрируется такае на 2 сутки в 45Х случае, а с увеличением срока наблюдения число позитивных результатов возрастает до 60S на.З сутки и до 10031 на 10 сутки. ' Позитивные результаты ППН хотя и регистрируются со 2 суток, но число позитивов ниже, чем в ХЛ анализе; только на .10 сутки наблюдения эти показатели выравниваются (100%). Бактериологический и серологический методы исследования отставали от пер-еых как по чувствительности , так и по информативностк(ркс.1).

^ Таблица 1

Исследование крови морских свинок, зараженных возбудителем чумы __в дозе 1 • I О4 их Am

■.— кг..... ■ ■ Кеизь- • • ч«тео - Число пробсг.схкжигггъюЫ •'• КОЕЙ'-'-'-' •.•.•4SCTJ»-.-. •Число пробе попогнтеганьа!

киготныг- /.-,■ рфУл&Оеи Ai, 2 суп* jwsoiia'n

»'штвкм*-» уь.ссат/. ППН РНГА • • в опыт? '- ППН РИГА

Т. psrti. 528 7 — — — — ' 7 — — — —

Г. pectis 1Е43 7 — . — — — 7 2/гЗ,5 4/S7, 2/23,5 1/14,2

Г. ptr.it 231 S . — г/го 240 — 11 5/45,S ЛЕ1, 6/54,3 XI 3,2

Обозяачеяня: ХЛ - иетод ХЛ ляияза;

ППН - ППН с зпонЕаесаенгаоа ингроскопвеа; . РНГА - реакция неяраиои гемагппохввацнв; 4 - отрапатезьвыа результат; 3/$0 • чвстзтеяъ-гбсолзлаое чвсяо, зваяеаатедь - пропезты.

аБгхтериол. пХЛ а ППН ■ пРНГА

А - доза 1 * 10s млс./мн; В - доза МО4 uxJwn С - доза МО5 млсЛш Рис. U Исследование крози морских сзинох, инфицированных ШТ2ММ0М P-roaUei Ц-5

Аллергены в виде ЕРА сапного и ыелиоидогкого шкрсбсв еыяеляли в ХЛ и ППН перекрестную гиперреактивность у «ивотньк, зараженных как возбудителем сапа, так и возбудителей мелкоидо-за. По частоте позитивных результатов в больней проценте случаев регистрировалась сенсибилизация, вызванная гомологичным возбудителем. '

Показано, что ХЛ анализ превосходит ЩШ в случаях выявления сенсибилизации морских свинок после иммунизации их бруцеллезной вакциной. На* 2 сутки после вакцинации минимальной дозой (1*103 м.к./ыл) в 60% случаев у животных регистрировалась по-' выяенная реактивность, а серологически - в 20% случаев. В тес- ■ те ППН. ни на вторые,- ни кз 3 сутки позитивных результатов в этой опыте не получено. Только с увеличением дозы вакцины тест ППН давал позитивные результаты на 3 сутки (при дозе 1*105 м.к./мд) или на 2 сутки (при дозе 1*10° м.к./мл)(табл.2).

У животных, зараженных высокими концентрациями гетероло-гачных нтаммоа (1*107 м.к,/мл), выявлен перекрестный положительный результат в ХЛ анализе с кравьс животных, инфицированных вакцинным итаммом чумы.

Принимая во внимание высокую чувствительность ХЛ анализа при ранней регистрации гиперчувствителъности организма животных, зараженных возбудителями 00И, нами были проведены исследования, направленные на обнаружение инфицированности воздуха, поверхностей этими возбудителями путем заражения ими животных. Исследуемые пробы инфицировали дозами 1*103 м.к./ыл. Как показали исследования, с помоцьп ХЛ анализа у животных, зарзаекных пробами воздуха, контамшшрованных чумой, _ на 3 сутки в 60£ случаев регистрировалась специфическая гиперреактивность срга-

Таблица 2

Исследование крови морских свинок, иммунизированных штаммом Вг. аЪопиз ВА-19

• ■ • Сроя - -.-.•.-.-.■л-Подаэ^еташгрезузьтзгм прт }№В)Ъ5ёадая-до»а .- ■. .■. .

/'•ЕПКТЁЬГ!-/ ■л'л-МОЯ' йЖШ'.-:УУУ

'■У-гсате'//- УУ1<ути»}-;.;.; ■Ъзх. -ипн РАЛ .•;зр1: -ппн ■ей-.-. ■ хл-- ппн ;-?ал

5 2 — Э-'Ю — 1/20 — — 2/40 — зло 1/20 —

5 3 - — У60 — 1/20 — ьчо 2/40 2/40 — ачо 1/20 г;4о

Обозначения: РАЛ- реакция агглютинации латекса;

остальные обозначения те же, что в таблице 1.

Таблица 3

Исследование крови морских свинок, инфицированных конгашшированньши пробами объектов внешней срелы

/бозбртяёзя- /Кота».-, .песгго. .ЖНМТЛ .-.•Бак."-.- -••••Воз, зух-;-;;-; шш ■рига-] ■Базе-: дави--'.-.■.•ШШ.-.- :рнга

у.резт 231 10 0 6/60 0 0 _ — — . —

Р.таЛа ц-5 10 0 7/70 1/10 0 .0 г/во 0 0

Р.ргеийо-та!1«С-!41 12 2/16,6 10/23,3 1/В.З 0 0 8/66,6 2/16,6 0

Обозначения: 0 - отрицательный результат;

- опыт не ставили.

низмз морских сеннок. Бактериологические, серологические исследования, а также постановка ППН у этих яееотиых дали негативный результат.

При обследовании животных, зараженных пробами Еоздуха, содержащими возбудителей сапа и мелшидоза, на 3 сутки в боль-сем числе случаев регистрировалась специфическая гиперреакткв-ность в тесте ХЛ анализе - в 70% случаев при сале и в 83,3?. -при иелиокдозе. У сапных животных к этому времени только в 10?. случаев отмечен позитивный результат в ППН, а при бактериологическом исследовании возбудитель не выявлен. У животных, ин- • фицированных смывами с поверхностей, контаминировакньк возбудителем сапа, только в ХЛ анализе определена специфическая гк-перреактивность в 80* случаев, в то Еремя как другие тесты дали негативный результат.

Животные, инфицированные проба;.® 'воздуха,- зараженными возбудителем мелиовдоза, в 8,27. случаев давя позитивный результат в ППН, в 2 случаях (16,6%) выделен возбудитель при бактериологическом исследовании. В ИНГА антиген не выявлен ни у одного животного.

У животных, зараженных смывами, кантамивирсзанныма возбудителем мелиоидоза, позитивные результаты ХЛ анализа значительно превышали таковые в ППН (63,6£ против 16,62 соответственно), в то время как ни бактериологически, ни серологически положительный результат не был получен (табл. 3.),.

Таким образом, очевидно, что в принятую схему шэджздш возбудителей 00И из объектов Еневней среды мохто рекомендовать как дополнительный и информативный этап - заражение исследуе-• мыми пробами морских свинок. Обнаружение позитивных рс гуль та-

тов ХЛ анализа с антигенами возбудителей ООН будет свидетельствовать об инфицировании животных конкретным возбудителем. При этом важно отметить, что для постановки ХЛ анализа с целью выявления гиперреактивности ко всем видам возбудителей 00И достаочно взять от зараженного животного всего 0,1 мл крови.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые пскзззна возможность применения ХЛ метода для ранней диагностики возбудителей чумы, сапа, мелиоидоза и бруцеллеза с использованием водорзстворзшх антигенов, полученных из высуденных ацетоном клеток возбудителей этих инфекций.

2. Хе1.шлю!яшесцентньп! анализ превосходит по чувствительности и информативности ППН, бактериологический метод и РНГА и позволяет уже на 2 сутки еыяелять гиперреактивность у животных, зараженных вирулентным штаммом возбудителя чумы:

3. Ранняя регистрация гиперреактивности у животных, зараженных возбудителями сапз и мелиоидоза, в ХЛ анализе более информативна (707. позитивных случаев), чем в ППН (20Х) уже на 2 сутки после, заражения, когда ни бактериологически, ни серологически факт инфицирования не подтверждается.

4. Хемилшинесценция клеток крови инфицированных или вакцинированных животных под влиянием аллергена специфична и не проявляется в реакциях с несенскбшшзированнкми клетками (ин-такткые животные), но макет инициироваться близкородственными з антигенном отношении аллергена)®.

5. Состояние гиперреактивности животного, .вакцинированного бруцеллезной вакщшой, регистрируется на 2-сутки после .вакцинации в 50-£0z -случаев, а в тесте ППН - только в 20% случаев.

6. Хешшэшшесцентный анализ позволяет обнаружить контаминацию возбудителями ООН объектов внешней среды (еоздух, смывы с поверхностей) путем заражения ил: животных и последующей регистрацией у них сенсибилизации к соответствующим аллергенам через 3 суток после заражения.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЩШ.

1. Диагностика чумы при помощи теста ППН с хемилюмияес-центной детекцией. (Л.Ю.Мешкова,А.Т.Яковлев,Г.С.Дунаев и др. // Тезисы докл., Харьков,1995.-С.202.

2. Мешкова Л. Ю. Вариант биологического метода лабораторной диагностики- особо опасных инфекций на основе показателя повреждения нейтрофилов // Информационный бюллетень-. • Саратов, 1995.-,N4.- С.9.

3. Показатель повреждения нейтрофилов. (тест ППН). (Л.Ю.МеЕкова, Г.С.Дунаев, А.Н.Лобанов, , А;Я.Шередекина // Деп.во ЕИНИТИ,-22.09.94., N 2234-В 94.

4. Специфические иммунные комплексы и тест повреждения нейтрофилов для диагностики экспериментального сапа и мелиои-доза.(Г.С.Дунаев,Г.М.Ларионов,А.Н.Лобанов и др.) // Клин. лаб. диагност.- 1994.-N 6.- 0.46-43.,