Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микроорганизмы в загрязненных природных средах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микроорганизмы в загрязненных природных средах"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правах рукописи

ФИЛИП Зденек

УДК 576. 852.

МИКРООРГАНИЗМЫ В ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПРИРОДНЫХ СРЕДАХ

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва, 1996 г.

- г -

Работа выполнена в Институте гигиены воды, почв и возду Федерального министерства по защите окружающей среда ФРГ

Официальные оппоненты:

Д.Г.Звягинцев - доктор биологических наук, профессор С. В. Летунова - доктор биологических наук Д.И.Никитин - доктор биологических наук

Ведущее учреждение: Московская сельскохозяйственная академия имени К.А.Тимирязева

Защита состоится "ЛЗ" ЛЮ-Я^ 1996 г. в 15 час 30 мин 1 заседании Диссертационного совета Д. 053.05.66 по адресу: 1198! Москва, ГСП, Воробьевы горы, МГУ им.М.В.Ломоносова. Биологиче кий факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологически факультета МГУ.

Диссертация разослана '¿Р" сиьрё~ГЛ~ 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Н. Ф.Пискунко!

Издательство АО "Диалог-МГУ". ЛР N 063999 Тел. 939-38-90, 939-38-91. Факс 939-38-93. Отпечатано на ризографе ИА 4050 с оригинала заказчика. Тираж 100 экз. 1996г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микроорганизмам принадлежит главная роль в биогеохимических процессах круговорота элементов и веществ, протекающих как в наземных, так и в водных экосистемах. Эти же процессы прямо или косвенно влияют и на состав атмосферы Земли. Поэтому ключевым условием поддержания жизни на Земле является обеспечение сбалансированной деятельности природных микробных сообществ.

Вместе с тем в течение последних десятилетий из-за интенсификации промышленного и сельскохозяйственного производства во многих странах резко усилилось загрязнение почвенного покрова и водных бассейнов различными химическими веществами. Многие из этих веществ даже в относительно низких концентрациях могут подавлять жизнедеятельность микроорганизмов и тем самым изменить существующее в природе биогеохимическое равновесие - гомеостаз, создать реальную угрозу биологической безопасности каждой из этих стран, отдельных регионов или биосферы в целом. Не случайно, что именно микробиологии отведена особая роль при составлении разнообразных прогнозов в региональном и глобальном масштабах, в краткосрочных и долгосрочных шкалах времени.

Полученные нами и многими другими исследователями знания позволяют утверждать, что при необходимости прогноза возможных изменений состояния природных сред наиболее перспективным является оценка потенциальной устойчивости основных природных сообществ микроорганизмов к важнейшим группам загрязнителей, доминирующим в этих средах.

С другой стороны, нередко продукты жизнедеятельности микроорганизмов могут сами выступать в роли загрязнителей природной среды. Хорошо известна роль микроорганизмов в образовании гумусоподобных веществ, которые загрязняют поверхностные и грунтовые воды, вызывая снижение их хозяйственной ценности и резко ухудшая качество питьевой воды.

Среди важнейших полезных проявлений метаболизма и кометаболизма микроорганизмов особо следует выделить трансформацию и деградацию разнообразных органических загрязнителей - ксенобиотиков, относимых к так

называемым приоритетным загрязнителям природной среды. Оценка способ ности природных популяций микроорганизмов осуществлять эти процесс также представляет большой научный и практический интерес.

■ Дель и задачи исследования. Основной целью работы являлось изуче ние устойчивости (и роли, пассивной и активной) естественных микробнь сообществ по отношению к широко распространенным органическим затряс нителям природной среды ( почв, воды и воздуха), трансформация эта веществ микроорганизмами и образование ими загрязнителей питьевой вс ды.

В соответствии с этим в работе решались следующие экспериментам ные задачи:

-определение влияния хлорированных углеводородов, как наиболе распространенных и опасных загрязнителей природной среды, на числе* ность и ферментативную активность основных групп микроорганизмов почвах;

-выявление действия разнообразных загрязнителей органической прр роды на численность и активность микроорганизмов грунтовых вод;

-оценка действия отходов биотехнологической промышленности на де ятельность почвенных микроорганизмов и на свойства почв;

-выяснение роли и масштабов участия микроорганизмов в загрязнет воды гумусовыми и гумусоподобными веществами;

-оценка роли природных популяций микроорганизмов в трансформащ и деструкции некоторых природных и синтетических полимеров.

Научная новизна работы. Впервые по единой методике проведе* оценка действия разнообразных загрязнителей на численность и актш ность основных групп микроорганизмов почв,грунтовых вод и водоемо! Впервые установлены различия в действии хлорированных углеводородов I отдельные группы микроорганизмов и их ферментативную активность в по^ ве. Определена степень устойчивости микрофлоры грунтовых вод к эй химическим загрязнителям. Подробно исследована роль почвенных микроо; ■ганизмов в разложении пластмасс типа полиуретана. Впервые исследова! роль микроорганизмов в генезисе гумусоподобных веществ - загрязнител< воды из фоссилизированных и свежих растительных остатков.Впервые опр(

делена скорость трансформации гуминовых веществ микроорганизмами в маршевых болотах.

Научно-практическая ценность работы. Экспериментальные результаты, полученные при выполнении работы, позволили раскрыть разнообразие механизмов деградации органических загрязнителей микроорганизмами почв и воды и дать количественную оценку потенциальной устойчивости природных микробных популяций к этим загрязнителям. Для ряда этих соединений определена концентрация в природных средах, оказывающая ингибирующее действие на эти популяции, в силу чего их роль как биогеохимических агентов резко падает. Полученные оценки использртся при составлении прогностических моделей для конкретных регионов Германии и могут быть полезны при проведении соответствуюпщх работ в других странах. В отношении ряда химических загрязнителей определен предельно допустимый уровень концентрации,при котором еще возможна их микробиологическая деградация, что необходимо для решения вопроса об изменении соответствующих промышленных технологий и разработки системы очистки природных сред. Показано, что некоторые отходы биотехнологической промышленности могут использоваться в качестве органических удобрений,резко усиливающих активность почвенных микроорганизмов. Установлено, что фоссилизи-рованные древесные остатки, находящиеся в нижних горизонтах почв Северной Германии, не играют существенной роли в поступлении гуминовых веществ в грунтовые воды. Вместе с тем микробиологическая трансформация свежих растительных остатков оказывает существенное влияние на этот процесс, хотя ранее образование и трансформацию гуминовых веществ связывали в основном с абиотическими процессами (диагенез).

Апробация работы. Материалы, представленные в работе, докладывались на следующих симпозиумах и конгрессах: Международный симпозиум "Микробные сообщества почв",Копенгаген,Дания,1985; Международный симпозиум "Биодеградация материалов",Кранфилд,Великобритания,1985; Международное собрание Общества по изучению гуминовых веществ,Осло,Норвегия, 1986; Нагойя, Япония,1990; Международный симпозиум "Микробиология грунтовых вод",Куопие.Финляндия,1987; Международный симпозиум "Микробиология глубинных горизонтов",Орландо, США,1990; Сьезд Германского

- б -

общества почвоведов "Органические загрязнители в почвах",Гиссен,199: Съезд Германского научного общества "Загрязнители грунтовых вод",Шту: гарт,1992; Первый латиноамериканский симпозиум но биодеградации мат< риалов, Кампос де Шордао,Бразилия,1992; Собрание международного о< щества по изучению гуминовых веществ, Монополи,Италия,1992; Сан Аугу< тин, Тринидад и Тобаго,1994; Сьезд американского микробиологически общества "Качество воды в Западной гемисфере", Сан Хуан.Пуэрто Рига 1993; Международный'симпозиум по биогеохимии, Саламанка,Испания,199! X Международный конгресс почвоведов,Киото,Япония,1992; Международы симпозиум памяти Л.Пастера, Папеэтэ.Таити,1995.

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 43 печати работах, в том числе в 8 обзорах и в 14 коллективных монографиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.Влияние хлорированных углеводородов на микроорганизмы и ферментативную активность почв

Объекты и методы исследования. Почвенные образцы отбирали из гор] зонта АПах окультуренной коричневой почвы в округе Берлин. Образцы д< водили до воздушно-сухого состояния, просеивали через сито с отверст] ями в 2 мм." Химический состав почвы: С0бщ= 1,44%; Noenf 0.12; рНн20=6,8. Влажность образцов поддерживали на уровне 50% от максимаш ной влагоемкости. Навески почвы по 100 г помешали в стеклянные флакоз (250 мл), закрытые тефлоновыми пробками. Шприцем вносили в почву три; лоратилен (Merck,958), тетрахлорзтилен (Merck,964) или дихлорзт; (Merck,6049) в количестве 10, 100 или 1000 мкг (0,1;1;10 ррш). Повто] ность каждого варианта 15- кратная. Все флаконы инкубировали в термо( тате при 25°С. Через 3, 7, 14, 28 и 56 суток почву из трех парамел ных флаконов объединяли и использовали для анализа. Биомассу почвенн микроорганизмов определяли по содержанию АТФ методом Пауля-Джонсо; (Paul and Johnson,1977). Копиотрофные и олиготрофные группировки 6ai

терий подсчитывали на полной или разбавленной в 100 раз среде Мерка (Merck,5450). На этой же полной среде подсчитывали спорообразуюпще бактерии и актиномицеты. Для учета почвенных грибов использовали среду Мартина (Martin,1950). Учет бактерий рода Clostridium проводили на специальной среде (Merck,5411). Посев из каждого разведения проводили на пяти повторных чашках Петри и рассчитывали среднее арифметическое. Ферментативную активность почв определяли методами Хайано (Науа-по,1973) для ß-глюкозидазы.Каназавы и Такай для ß-ацетилглюкоаминидазы (Kanazava, Takai,1978), Табатабаи и Бремнера для фосфатазы (Tabatabai, Bremner,1969), Иши и Хайано для фосфодиэстеразы (Ishii, Науапо,1974), Ладда и Батлера для протеазы (Ladd, Butler, 1972). Активность каждого из перечисленных ферментов выражали в нмоль/г/мин при 30°С, пересчитывали на сухую массу почвы и обозначали как m/unit/g.

Результаты исследований. Биомасса почвенных микроорганизмов является важнейшим показателем их состояния в конкретных почвах и взаимоотношений с органическим веществом этих почв. При определении биомассы по содержанию АТФ в почве выяснилось, что концентрация АТФ резко снижалась при загрязнении почвы 10 ррш хлорированных углеводородов(рис.1).

Trichtoroethyiene Tetrochloroethytene DicNoromethon«

о-—О : Оуид* (control) • ■— • : Юд>д" д-л:100/ид" «-к : ЮОО^ид"

Content of volatile chformated hydrocarbons /уд/Ю0д dry soif

Рис.1 Влияние трихлорэтилена, тетрахлорэтилена и дихлорметана на биомассу почвенных микроорганизмов (по содержанию АТФ)

В течение трех суток содержание АТФ снизилось на 80-857» по сраз нению с контрольным образцом почвы. Внесение в почву 1 ррш трихлорэи лена и тетрахлорэтилена также приводило к снижению содержания АТФ, кс торое наблюдалось в течение 14 суток.Такая же концентрация дихлорметг на, а также более низкая концентрация вышеуказанных контаминантов (0. ррш) не оказывали достоверного влияния на концентрацию АТФ в почве, этих вариантах, как и в контрольных образцах почвы наблюдали постепе; ное снижение концентрации АТФ (и, следовательно, биомассы почвенш микроорганизмов) в течение двух месяцев инкубации. Проведенное раш изучение группового состава микроорганизмов в опытных вариантах пою зало, что доминирующими являлись олиготрофные бактерии (Капагаиа.Р: Ир, 1986). Второй по значимости группой были микроскопические гриб! Данные, приведенные на рис. 2 и 3, показывают, что присутствие в поч] хлорированных углеводородов влияет на эти группы микроорганизмов та!

1од

ТпсНогое(Ьу1епе

- 8 ел

е >»

£ *

2 5 и о

2 Г

Те1госЪ1оое1Ьу1еп<

01сНоготе1Ьапе

м1 I—1-

0 7 и 28

О 7 К 28 56

1псиЬо1|оп 11те Иау5}

о—о : О/ид' (сотго!) •-• : Ю/|д" а-а.: 100^д"

V СоШет о! \«1о1Пе сЫоппо'.рй ЬуЙгосогЬспэ ^д/ЮОд ¿'У 5о<1

<6 0 7 К 29

: 1000 |ид"

Рис.2 Влияние трихлорэтилена, тетрахлорэтилена и дихлорметана численность почвенных микроскопических грибов

же, как и на АТФ. Численность бактерий снижалась постепенно в течение двух месяцев инкубации в образцах контрольной почвы и в образцах, в которые вносили 0,1 или 1 ррш загрязнителей. Внесение в почву 10 ррш вызывало снижение численности олиготрофных бактерий и микроскопических грибов на 907. через 3 и 28 суток инкубации соответственно. Затем численность олиготрофных бактерий возрастала, вероятно, из-за эффекта "частичной стерилизации" почвы. При внесении в почву тетрахлорэтилена в количестве 10 ррш численность бактерий даже увеличивалась по сравнению с контролем.

1с>9

ТпсМо*ое1Ьу1епе

«* о»

о

£ с

2 3

О 7 П 26

Тс1гасМ(ко«(Ьу1еле

56 0 7 и Й

О'сЫоготМЬап«

И . I I

5е 0 7 и 28

1псиЬо1'Оп 1»те (¿оу*) о—о: О^д'иоШго!) 10 ^д' а—л: 100л>д*

СоИеп1 оГ уо!о1П? сЬГоп'поСе«! Ьу^осагЬол* уид/ ТОО д с*гу 5<?»|

ЮООуид

Рис.3 Влияние трихлорэтилена, тетрахлорэтилена и дихлорметана на численность олиготрофных бактерий в почве

8

7

1-1_I

На рис.4 приведены данные об изменении ферментативной активности почвы при внесении перечисленных выше загрязнителей. Активность в-глю-козидазы снижалась до 1-2 ш-единицы при добавлении в почву 10 ррш кон-таминантов и оставалась на этом уровне в течение всего опыта (2 мес.).

В еще большей степени снижалась активность протеазы ( рис.5).

Trichlof ©ethylene

Tetrochlo t oethylene

é Б

Ю-J—i i.

Oichloromethone

O 7 ti 28

0 7 14 28 5S O 7 14 28 56

lncubotion time (days) O O: Q/jg'(conuoi) •—•: t0^9* *—üMOO/jq" -* ЮОО

' Content of volatile chlorinated hydrocarbons /jg/ЮОз dry soil

Рис.4 Влияние трихлорэтилена, тетрахлорзтилена и дихлорметана активность 8 -глюкозидазы в почве

TWchioroethylene

Tetrochlo'oethylene

Dicniofomethone

с. э ё

О 7 U 29

56 о 7 14 га

Incubation time (days) о—о 0/jg*{ccnuol) »— »10/ug* -д. Ю0,ид*

Contení ©t volatile chlorinated hydrocarbons ¿13/'QO g dry

S5 <J 7 14 2a

. ЮОО yug*

i j ■ i

Рис.5 Влияние трихлорэтилена, тетрахлорзтилена и дихлорметана активность протеазы в почве

- и -

Другие почвенные ферменты - fi-ацетилглюкоаминидаза, фосфатаза и фосфодиэстераза, также снижали свою активность примерно в той же степени, что и з-глюкозидаза. Во всех вариантах этой серии опытов энзима-тическая активность почвы, загрязненной конташнантами (хлорированными углеводородами) -в низкой концентрации не отличалась от энзиматической активности контрольной почвы. При оценке масштабов экологического ущерба, наличие которого совершенно очевидно по результатам наших исследований, следует учитывать, что в почвенном воздухе ряда индустриальных регионов Германии содержание трихлорэтилена колеблется в пределах SO- 200 мкг/м3, а тетрахлорэтилена - 30-300 мкг/м3 (Neuma-уг,1981;1984). В этой связи особо подчеркнем, что почвенные образцы, использованные нами в опытах, содержали в 103-10б раз больше хлорированных углеводородов. Поэтому резкое угнетение жизнедеятельности почвенных микроорганизмов, их ферментативной активности, будет наблюдаться в случаях каких-либо крупных локальных загрязнений почвы, например, вследствие аварий. Но и в этих случаях необходимо учитывать, что испарение хлорированных углеводородов и их последующее фотохимическое разрушение в атмосфере будет способствовать снижению их концентрации в почве. Исходя из этих соображений можно сделать вывод, что влияние хлорированных углеводородов на почвенные микроорганизмы будет относительно кратковременным. В почве возможно и микробюлогичёское разрушение хлорированных углеводородов.

2.Влияние органических загрязнителей на микроорганизмы грунтовых вод

Грунтовые воды являются одним из важнейших природных ресурсов.В виде грунтовых вод находится более 90% запасов пресной воды в мире (Stetzenbach et al.,1986). В США до 50%, а в Германии до 70% питьевой воды получают из грунтовой воды (Ventulo, Larson, 1985; Mahess et al., 1988). В то же время во многих районах гигиеническое качество воды все чаще ухудшается из-за попадания разнообразных химических загрязнителей. В очистке от этих поллютантов важную роль играет автохтонное микронаселение, причем наиболее эффективно это происходит в тех

случаях, когда удается включить их в биотехнологический процесс разложения органических загрязнителей (Filip,1988;1990). Одним из важнейж факторов, обусловливающих эффективность такого процесса, является устойчивость автохтонной микрофлоры к действию химических поллютантов Поэтому мы определяли чувствительность микроорганизмов грунтовых вод : ряду химических соединений, загрязняющих их в Германии.

Объекты и методы исследования. Образцы воды отбирали в колодце i глубины 32 м вблизи г.Эпертгаузен у Франкфурта на Майне (ФРГ). Пере, отбором образцов, во избежание загрязнения посторонними микроорганизмами, воду из колодца откачивали в течение 3 часов.

Бактерии высевали на среду Стенли (Stanley,1968) "PYGB", котора согласно результатам исследования Гирша и Радес-Роколя (Hirsch, Rades- Rohkohl,1983) удобна для учета разнообразных групп бактерий грунтовых водах. Перед посевом среду разбавляли (1:4), разливали п 250 мл в колбы и инокулировали тем же количеством (250 мл) грунтово воды. Инкубирование посевов проводили при температуре 10°С, характер ной для естественных грунтовых вод, в течение 12 суток при перемешива нии. Биомассу микроорганизмов отделяли путем центрифугирования, зате: промывали ее водой, лиофилизировали и хранили в этом состоянии, йден тификацию бактерий из биомассы осуществляли по их физиолого-биохими ческим характеристикам (программа Biolog). Согласно этим оценкам, био масса микроорганизмов состояла преимущественно из бактерий p.p.Alcali genes, Arthrobacter, Flavobacterlum, Pseudomonas. При проведении экс периментов в колбы вносили по 100 мл среды и заражали ее лиофилизиро ванной биомассой бактерий. Инкубировали посевы 7 суток при 10°С, поел чего определяли оптическую плотность при длине волны 650 нм и до вели чины Е=0,04. В этих опытах использовали в общей сложности 56 различны химических соединений, список которых приведен в табл.1.

Все эти соединения известны как загрязнители грунтовых вод (Kern dorff et al.,1990). Действие перечисленных загрязнителей на микроорга низмы оценивали по изменению концентрации АТФ (Stutz et al.,1986),п активности дегидрогеназы (Liu,1987) и по потреблению культурами кисло рода (DEV/L2). Результаты 5 серий повторных опытов обрабатывали ста тистически при помощи критерия "t"- Стьюдента. Минимальную концентра

цию химического соединения, при которой наблюдалось снижение биохимической активности микроорганизмов на 50%, отмечали как MEC (Minimum Effect Concentration). В большинстве случаев для установления МЕС использовали данные о концентрации АТФ, как наиболее чувствительного теста.

Таблица 1

Химические загрязнители грунтовой воды, изучавшиеся в экспериментах

1. Моноциклические ароматические соединения

Бензол, толуол, о-толуол, ш-толуол, р-ксилол, 1,3,5 - триметил-бензол, стирол, зтилбензол, изопропилбензол

2. Хлор- и нитроароматические соединения

Хлорбензол,1,2-дихлорбензол, 1,3-дихлорбензол, 1,4-дихлорбензол, 1,2,4- трихлорбензол, гексахлорбензол, 2-хлортолуол, 2,4-дихлор-толуол,нитробензол, 3-нитротолуол

3. Хлоралифатические соединения

Дихлорметан, трихлорметан, тетрахлорметан, 1,1,1-трихлорэтан, 1,1,2- трихлортрифторэтан,1,2-транс-дихлорэтан, трихлорэтен.тетрах-лорэтенЛ,2-дихлорпропан, 1,3-дихлорпропен, а-гексахлорциклогексан, В-гексахлорциклогексан, г-гексахлорциклогексан

4. Полициклические ароматические соединения Антрацен,фторантрен, фенантрен

5. Анилины

М-метиланюшн, М-диметиланилин, 2,4-диметиланилин

6. Фенолы

Фенол, 2,4-дихлорфенол, 2,4,5- трихлорфенол.пентахлорфенол У.Размягчители

п-Дибутилфталат,бензилбутилфталат,ди-2-этилгексилфталат,трибутилфосфач

8. Эфиры

Метоксибензол, 1,3-диметоксибензол, дифениловый эфир, 1,4-диоксан

9.Прочие

Ацетон,атразин, 2-этш-1-гексан, зтилпаратион, ттофен

Результаты исследований. Согласно полученным данным (табл.2), ток сичность испытанных в опытах ароматических соединений снижалась по мере увеличения их растворимости в воде. Например, бактерии грунтово; воды подавлялись при концентрации о-ксилола 100 ррш, тогда как толуол в такой же концентрации не угнетал их. Для бензола токсичная концентрация составляла 1000 ррш. Метиланшшны оказывали токсическое действи на бактерии грунтовой воды уже через 1 сутки при концентрациях 1-10: от точки насыщения грунтовой воды этими соединениями (табл.3).

Таблица ;

Действие некоторых ароматических соединений на микроорганизмы грунтовой воды

Соединение L (ррш) МЕС (1 сут) МЕС (42 сут)

Бензол 1770 1100а 1000

Толуол 470 н.о. 290

о-Ксилол 175 110а 100

ш-Ксилол 130 81а

р-Ксилол 200 н.о.

1,3,5-Триметилбензол 20 н.о.

Стирол 280 170а

Этилбензол 140 88^

Изопропилбензол 50 31а

L - растворимость

MEC (1 сут) - минимальная действующая концентрация черев 1 сутки МЕС (42 сут)- минимальная действующая концентрация через 42 суток а - при определении АТФ

b - при определении дегидрогеназной активности н.о. - не определялось

Таблица 3

Влияние некоторых анилинов на микроорганизмы грунтовой воды

Соединение Ь(ррш) МЕС (1 сут) МЕС (42 сут)*

Н-метиланилин 30000 О-диметиланилин 1000 2,4-диметиланилин 1000

300а <30

620аЬ 620

ЮОаЬ

* - обозначение величин см. в таблице 2

Наиболее сильное токсическое действие на бактерии грунтовой воды оказывали 2,4,5 - трихлорфенол и тетрахлорфенол (табл.4).

Таблица 4

Влияние некоторых фенолов на микроорганизмы грунтовой воды

Соединение Цррт) МЕС (1 сут) МЕС (42 сут)*

Фенол 82000

2,4-дихлорфенол 4500

2,4,5-трихлорфенол 2000

Пентахлорфенол 2000

30а 10Ь

0,3а >3

0,ЗЬ 3

* - обозначение величин см. в таблице 2

Однако при длительной инкубации образцов воды с этими соединениям наблюдалась адаптация микроорганизмов к их присутствию в концентрации до 3 рргп.

К важнейшим химическим загрязнителям грунтовых вод относятся хлорированные алифатические углеводороды, что обусловлено их широким использованием для разнообразных целей и хорошей растворимостью в воде. В таблице 5 приведены данные для некоторых из этих загрязнителей грунтовых вод Германии - их растворимость в воде, минимальная эффективная концентрация, выявленная нами в опытах.

Таблица £

Водорастворимость и максимальная концентрация некоторых соединений в грунтовой воде и их влияние на микроорганизмы воды

Соединение Ь (ррш) Макс.конц.** МЕС*

Дихлорметан 16000 499 3000

Трихлорметан 9000 2 300

Тетрахлорметан 800 0,023 500

1,1,1-трихлорэтан 500 0,27 312

1,2-дихлорэтилен 600 411 375

Трихлорэтилен 1100 128 300

Тетрахлорэтилен 150 6,5 94

* - размерность см. в табл.2 ; ** - по КегпсЬ^ еЬ а!., 1990

Можно видеть, что граница токсичности достигается быстро, особенно I вариантах с трихлорэтаном и 1,2 - дихлорэтаном. Отметим также, чтс изомеры дихлорэтана образуются при разложении три- и тетрахлорэтана ) могут накапливаться в глубоких горизонтах почв и поступать в грунтовые воды. Хлороформ (трихлорметан) также является загрязнителем грунтовое воды, опасным для населяющих ее микроорганизмов, поскольку минимальна$ токсичная концентрация достигается уже при 1/30 максимальной водораст-воримости этого соединения.

3.Влияние отходов биогехнологической промьменности на микрофлору почв и содержание гуминовых веществ

Как известно, современная биотехнологическая промышленность имеет дело с огромными объемами разнообразных микробных культур и, соответственно, создает большое количество отходов. Обычно эти отходы стремятся очищать, для чего созданы сложные и дорогостоящие технологии. Поскольку нередко отходы содержат значительное количество органических веществ, возникла идея вносить их в почву в качестве органического удобрения. В проведенных модельных экспериментах мы оценивали влияние на почву отходов, образующихся при индустриальном выращивании грибов Aspergillus nlger с целью получения лимонной кислоты.

Объекты и методы исследования.Образцами служили отходы биотехнологического производства лимонной кислоты, которые имели следующий состав: сахароза 8%, лимонная кислота 2,5%, белки 1,8%, С0бщ.18,8%, N06m-4,2%, К 9,5%, Na 2,2%, Са 1,5%, Mg 0,8%, Р 0,08%, Fe 0,07%, NH4+0,5%, S0~~4 2,5%, СГ 2,5%, рН 6,5, сухое вещество 63,2%.

Отходы, имевшие консистенцию патоки, вносили из расчета 25, 100 и 200 т/га в темно-коричневую почву (1,5 кг) с размерами агрегатов <2 мм. Почву инкубировали в аэробных условиях при влажности около 40% максимальной влагоемкости и при температуре 30°С. В течение 21 суток постоянно следили за динамикой развития аэробных бактерий, актиномице-тов и микроскопических грибов, за эмиссией из почвы СОг и NH4+, а также за содержанием и составом гуминовых веществ.

Результаты исследований.При внесении отходов производства лимонной кислоты численность микроорганизмов резко возрастала. На рис.6 приведены данные об изменении численности микроскопических грибов в почве -она возрастала пропорционально количеству внесенных отходов. В то же время численность бактерий возрастала медленнее, чем грибов. При внесении максимальной дозы отходов (200 т/га) численность бактерий через 21 день инкубации достигла максимального уровня - 9х109 кл/г. Во всех вариантах опыта с внесением отходов количество бактерий было существенно выше, нежели в контрольной почве.

Данные, приведенные в табл.6, показывают, что с ростом численносг микроорганизмов в удобренной отходами почве происходит и резкое усиле ние процеса аммонификации, в том числе и с потерей азота в виде аммиа ка. При этом также наблюдается прямая корреляция между дозой внесенны отходов и интенсивностью аммонификации.

Рис.6 Развитие микроскопических грибов в почве обогащенной отхо дами биотехнологической промышленности (1- контроль, 2 25 т/га, 3 - 100 т/га, 4 - 200 т/га)

Внесение отходов усиливает и дыхание почвы. Лишь в вариантах с вне сением максимальной дозы (200 т/га) в первые несколько суток продукци СОг была ниже, чем в контроле. Однако через 7, 14 и 21 суток актив ность дыхания в этом варианте была максимальной.

Минерализация углерода внесенных отходов, определенная по методу Вагнера (Wagner ,1975), в максимуме достигала 657,. При этом часть внесенного углерода включалась в микробную биомассу или трансформировалась в разнообразные органические вещества. Проведенный нами анализ показал, что в течении 21 суток инкубации в контрольном варианте минерализовалось около 4,1% всех органических соединений, тогда как при внесении 25 т/га отходов минерализация составила 63,4%, при внесении 100 т/га - 69,57. и при дозе 200 т/га - 36,8%.

Таблица 6

Влияние отходов биотехнологической промышленности на аммонифицирующую активность почвы

Длительность Ферментативная активность (мг Ш4+/24 ч/100 г почвы)

опыта (сутки) -----------------------------------------------------

Контроль 25 т/га 100 т/га 200 т/га

0 0 0 1,7 5,3

7 1,7 3,1 9,1 16,6

14 1,0 2,9 9,6 25,0

21 0,5 2,9 9,1 25,4

Фракционирование гуминовых веществ, выделенных из этих образцов почв, позволило выяснить распределение органического углерода, внесенного в форме отходов. Данные, приведенные в табл.7, позволяют утверждать, что произошло резкое увеличение фракции так называемых "свободных" фульвокислот (экстракция 0,1 N НгБО^, доля которых достигала более чем 40% от всего органического углерода. Одновременно возросло и содержание гуминовых кислот (экстракция смесью 0,1 N ИаОН + 0,1 М ИазРгО?).Полученная картина может быть легко обьяснена массовым развитием в почве с отходами микроскопических грибов, роль которых в образовании гуминоподобных веществ хорошо известна (ПИр е1 а1., 1976).

Поскольку оптическая плотность гуминовых веществ, выделенных из почв в которые вносили отходы, резко уменьшилась (например, 0 4/6= 4,06 дл гуминовых кислот контрольной почвы и 6,31 - для почвы с внесением 20 т/га отходов), то можно предполагать активное участие новообразованны гуминовых веществ в общем пуле органического углерода.Необходимо тага« отметить, что агрегатный состав почв в опытных вариантах значительн улучшился, т.е. количество микроагрегатов уменьшилось, а количеств макроагрегатов возросло.

Таблица

Влияние внесения отходов биотехнологической промышленности на содержание гуминовых веществ в почве (в % от С0бщ)

Варианты Свободные Связанные Гуминовые . Всего гуми- НерастЕ

опыта С0бщ фульвокис- фульвокис- кислоты новых кислот остаток лоты лоты

% % %Собщ %С0бщ % %С0бщ % %Собщ %Со5

Контроль 1,95 0,10 5,2 0,20 10,5 0,10 5,2 0,30 15,8 1,55 81,

25 Т/га 1,80 0,40 22,2 0,40 22,2 0,10 5,6 0,50 27,8 0,90 50,

100 т/га 2,80 0,70 25,0 0,30 10,7 0,40 14,3 0,70 25,0 1,40 50,

200 т/га 11,69 5,00 43,1 2,00 17,2 2,00 17,2 4,00 34,5 2,69 23,

4.Роль микроорганизмов в загрязнении грунтовой воды гуминовых веществами

Гуминовые вещества, т.е. гуминовые кислоты, фульвокислоты и гу мин, как известно, играют многообразную положительную роль в почве прямо определяют ее плодородие. Известна также их роль в снижении кой центрации ряда органических и неорганических загрязнителей в жидкс

фазе почв, что обусловлено высокой сорбционной и катионобменной способностью гуминовых веществ. Соответствующие примеры приведены в наших работах (Filip et al.,1986; Alberts et al.,1989). В частности, в гуминовых веществах, экстрагированных из отходов на свалках, содержание тяжелых металлов было в 103 выше, чем из лизиметрических вод этих же свалок. В то же время все чаще гуминовые вещества считают органическими загрязнителями природных вод, причем не только из-за появления желто-коричневой окраски. В составе питьевых вод, которые обычно дезинфицируются химическим или физическим путем (хлор, УФ-лучи), гуминовые вещества могут стать источником ряда низкомолекулярных соединений, опасных для здоровья человека. В частности, они могут трансформироваться в соединения типа трихлорметана, обладающего канцерогенными свойствами. Именно по этим причинам признана важной задача очистки грунтовых вод от гуминовых веществ или, по крайней мере, снижения их поступления в эти воды. Ранее нами была подробно исследована роль разнообразных групп почвенных микроорганизмов (бактерий и микроскопических грибов) в образовании гуминовых веществ (FiИр,1968;1970; Filip et al., 1972;1974;1976). Затем, в последующих опытах, мы изучили роль некоторых водорослей как источников гуминовых веществ и роль ряда микроорганизмов как факторов отщепления гуминовых веществ из состава сложных органических материалов.

Обьекты и методы исследования.В качестве возможных источников гуминовых веществ исследовались:

- биомасса водорослей Chloroflexus sp. и Mastigocladus sp., которые в большом количестве растут, например, в термальных ручьях Исландии;

- фоссилизированный растительный материал (погребенные деревья) из глубинных горизонтов песчаных осадков вблизи города Ганновер (ФРГ);

-биомасса свежих и мертьых растений Spartina al terni flora (loi-sel.), которые в виде монокультуры растут на засоленных маршах Атлантического побережья США.

Биомассу водорослей прямо подвергали экстракции смесью 0,1N NaOH + 0,1 M адгО? в атмосфере азота. Фоссилизированный древесный материал из четвертичных отложений размалывали и инкубировали 16 месяцев в

грунтовой воде при температуре 10°С. В некоторых вариантах опыта i этим образцам добавляли источники азота (NH4NO3; пептон) или совместш глюкозу и источники азота. В качестве инокулята использовали грунтову{ воду (как источник автохтонной микрофлоры) или разбавленную лизиметрическую воду из-под городской свалки, а также разбавленную водную суспензию, ■ отобранную прямо на свалке. Инкубацию проводили в аэробных i анаэробных условиях (N2), контрольные образцу хранились стерильно.

Перечень всех вариантов этого опыта приведен в табл.8. Развитие аэробных и анаэробных бактерий учитывали на средах Торнтона, стандартна среде 1 (Merck,7882) и на минимальной среде PYQV по Стенли (Stanley, 1968). Микроскопические грибы культивировали на сусло-агар (Merck,5397). Выделение гуминовых веществ проводили после 16 месячно! инкубации образцов из жидкой фазы (культуральная жидкость) и из твердой фазы (фоссилизированная древесина). Для выяснения возможност] действия засоленных и минерализованных вод на процесс освобождения гуминовых веществ использовали свежую и сухую (с места произрастания! биомассу жесткой травы S.altemiflora.

Таблица I

Варианты опытов по извлечению гуминовых веществ из фоссилизированной древесины

N,N

Состав

Инокулят

1 Фоссилизированная древесина (ФД) в грунтовой воде (ГВ)

2 ФД в ГВ

3 ФД в ГВ

4 ФД в ГВ

5 ФД в ГВ + Ш4Ш3

6 ФД в ГВ + пептон

7 ФД в ГВ + ВДОз + пептон

8 Глюкоза + Ш4Ш3 + пептон в ГВ

9 ФД в ГВ (анаэробно)

10 ФД в ГВ + ЩЮз + пептон (анаэробно)

Стерильный контроль Грунтовая вода

Лизиметрическая вода со свалки Суспензия со свалки Грунтовая вода Грунтовая вода Грунтовая вода Грунтовая вода

Для этого нарезанные пучки стеблей экстрагировали 10 месяцев в морской воде в стерильных условиях или при инокуляции смывом эпифитных микроорганизмов с этих растений, а также разбавленной суспензией осадков из мест их произрастания. В некоторых вариантах инокуляцию проводили чистыми культурами грибов Leptosphaerla obiones или Phaeosphaeria typharum. Эти организмы являются постоянными обитателями стеблей и листьев S.al terni flora. Инкубацию вели при комнатной температуре в темноте; затем жидкую фазу отделяли от твердой фильтрованием и центрифугированием, после чего осаждали из жидкой фазы гуминовые вещества при рН 1,5.

Результаты исследования. В табл.9 приведены данные о количестве гу-миноподобных веществ (гуминовых кислот и фульвокислот), экстрагированных в атмосфере азота из биомассы Chloroflexus sp. и других образцов. Согласно этим оценкам, их содержание выше почти на 1431% по сравнению с количеством гуминовых веществ в контрольных образцах почвы, взятых на берегу этого ручья и на 4263% в срвнении с образцом песчаных осадочных пород, отобранных с его дна. Однако соотношение гуминовых кис лот и фульвокислот почти не изменилось; оно составляло, соответственно, 0,33, 0,33 и 0,23 для каждого из изученных образцов. В то же время в гуминовых веществах, извлеченных из образца дернового горизонта почвы, отобранного в непосредственной близости от термального потока это соотношение достигает 0,76.В этой связи отметим,что по данным Токудоми и Канно (Tokudomi and Kanno,1968), гуминовые кислоты имеют преимущественно алифатическую структуру, если их отношение к содержанию фульвокислот в том же образце находится в пределах 0,4-0,8.

Наибольшее количество гуминовых кислот было выделено из биомассы водорослей Mastigocladus sp.- 2525 мгС/кг. Этот результат объясним также и способностью этой водоросли к образованию коричневого пигмента, что известно из работ Брока и Рипки (Brock,1979; Rippka et al.,1987).

Коэффициент зкстинкции при длинах волн 465 нм и 665 нм, согласно Чену (Chen et al.,1977) характеризует молекулярную массу, размер частиц и степень конденсированности молекул гуминовых веществ. Поскольку

Таблица 9

Содержание гуминовых веществ в образцах водорослей СЫогоГ1ехиБ эр., МаБЫ^осЫиБ эр., почвы и осадка термального ручья в Исландии

Образец Фульвокислоты и их Гуминовые кислоты и

аналоги (мгС/кг) их аналоги (мгС/кг) Сгум/СфуЛьв

до гид- после всего до гид- после всего ролиза релиза

Пункт 1

СЫого.Бра- 743 653 1396 293 165 458 0,33

(36)ь (53) (46)

Почва,берег 37 59 96 15 17 32 0,33

(81) (85)

Осадок 12 36 48 7 4 11 0,23

(89) (90)

Дерн.почва 97 299 396 77 223 300 0,76

Пункт 2

МаБШ.Бр. 468 2525 5,39

(2) (24)

Дерн.почва 292 770 2,64

(12) (80)

а - данные для образцов, отобранных в мае 1988 и апреле 1990 г.г. Ь - содержание в процентах от зольного остатка

эти коэффициенты для гуминовых кислот из биомассы СЫогоГ1ехиБ Бр. М^Ыё'осШиБ Бр. составили 5,5 и 3,8, то можно полагать, что кислоть выделенные из СЬ1огоГ1ехиБ яр., содержат большее количество низкомоле кулярных алифатических компонентов.

Все гуминовые кислоты, выделенные из природных образцов Исландии содержали большое количество зольных элементов. Однако после удалена этих элементов путем диализа в присутствии инфракрасные спектр

фракции гуминовых кислот из биомассы обоих водорослей показали наличие структур, сближающих их с гуминовыми кислотами образца почвы, отобранного вблизи этого термального ручья (рис.7).

Рис.7 УФ- и Ж-спектры гуминовых кислот и их аналогов из образцов водорослей (А - СЫогоПехиБ Бр., В - МаБШосШиБ Бр.) и почв (С) после НР-диаша

Из этих данных можно сделать вывод, что исследованные нами водоросли образуют органические вещества гуминоподобной природы (меланины, меланоиды и пр.). Следовательно, после отмирания водорослей эти вещества могут стать дополнительным источником гуминовых кислот в термальных ручьях и водоемах Исландии, а также в почве вокруг них. Последнее можно предполагать, поскольку альгосинузии играют важную роль в

качестве первичных источников органического вещества в почвах Ислш дии, формирующихся в экстремальных климатических условиях.

Результаты исследований роли микроорганизмов в образовании гумр новых веществ из фоссилизированной древесины приведенные в табл.1С свидетельствуют о том, что после 16 месяцев инкубации все опытш образцы--были обильно заселены копиотрофными и олиготрофными микрс организмами. Поскольку численность аэробных и анаэробных бактер!

Таблица 1

Развитие микроорганизмов в грунтовой воде с фоссилизированной древесиной и некоторыми питательными веществами после 16 мес. нкубации

М* Факультативно-анаэробные Аэробные бактерии Грибы

бактерии на средах: на средах:

Торнтона Мерк РУвУ Торнтона Мерк РУЗУ

1 0 0 0 0 0 0 0

2 2,5х10б 2,5х105 4.3Х105 9,8х104 1,8x10® 4,ЗхЮ10 1,3х1(

3 4,3х10б 4,3х107 - 1013 0 2.5Х107 2,5хЮ8 2,0х1(

4 2,5х105 2,5х104 4,5хЮ5 2,5х106 2,5хЮ5 2,5хЮ7 4,0х1С

5 2,5х104 2,5х104 -1013 2,5хЮ5 2,5хЮ6 2,5хЮ7 1,2х1(

6 4,ЗхЮ6 2.5Х105 4,5х107 2,5х10б 4,3x10® 4,5х107 4.0Х1С

7 4,ЗхЮ3 4,ЗхЮ4 2,5Х109 1,0х104 2,3х107 2,5х107 4,7x11

8 0 2,5х109 2,5х107 2,5x10е 4,3х107 1,1х108 3,7х1(

9 4,5хЮ4 2,5хЮ5 2,5х105 2,5хЮ4 1,1Х105 2,5хЮ6 1,8х1(

10 2,5Х108 4,5хЮэ 1ДХ109 1ДХ108 1ДХ108 1,1хЮ10 2,4х1(

* перечень вариантов см. в табл.8

различалась мало, можно полагать, что в основном это были факультатт но-анаэробные организмы. Эти же бактерии обладали способностью размш жаться как на полных, так и на разбавленных питательных средах. Микрс скопические грибы, выделенные на сусло-агаре, в большинстве случа<

обладали способностью образовывать ферменты типа полифенолоксидаз, роль которых в образовании гуминовых веществ хорошо известна.

После удаления осадка, состоявшего из остатков внесенной в среду древесины и биомассы микроорганизмов, стало очевидным,что культураль-ная жидкость имела желто-коричневый цвет (вероятно из-за фульвокислот) только в тех вариантах, где в среду вносили пептон как источник азота. Но даже при подкислении до рН 1,5 никакого осадка гуминовых кислот не появлялось. Содержание углерода растворимого органического вещества по вариантам опыта приведено в табл.11.

Таблица И

Содержание растворенного углерода в грунтовой воде в различных вариантах опыта после 16 месяцев инкубации

Вариант мгС/л

Свежая грунтовая вода (ГВ) 0,61

1 Фоссилизированная древесина (ФД) в ГВ, стерильно 22,99

2 ФД в ГВ 16,64

3 ФД в ГВ (инокулят: лизиметрич.вода из-под свалки) 24,00

4 ФД в ГВ (инокулят: городские отходы) 12,94

5 ФД в ГВ + ШЦЮз 15,44

6 ФД в ГВ + пептон 1333,59

7 ФД в ГВ + ШйШз + пептон 626,60

8 ГВ + глюкоза + Ш4Ш3 15337,09

9 ФД в ГВ (анаэробно) 9,19

10 ФД в ГВ + ЩШз + пептон (анаэробно) 769,35

Культуральная жидкость инокулированных вариантов содержала в среднем на 34% меньше" общего углерода", чем в стерильном контроле. Можно полагать, что некоторая часть углеродсодержащх веществ фоссили-зированной древесины была использована микроорганизмами. Высокое содержание углерода в вариантах, обогащенных пептоном и глюкозой, обус-

ловлено избытком этих питательных веществ. Соответственно этому, пов! шенное содержание гуминовых веществ, извлекаемых из внесенных в опьк ные варианты опилок фоссилизированной древесины, обусловлено наличие этих питательных веществ в среде (табл.12).

Таблица 15

. Содержание-гуминовых веществ в фоссилизированной древесине посл( : 16 месяцев инкубации в грунтовой воде

Вариант* Фульвокислоты Гуминовые кислоты Всего Сг/Сс

мг С/г сух.в. мг С/г сух.в. мг С/г

Фассилизированная древесина

(ФД) перед инкубацией 2,0 21,0 23,0 10,!

1 2,1 21,4 23,5 10,5

2 2,1 19,8 21,9 9,'

3 2,0 20,8 22,8 10,'

4 2,4 23,7 26,1 9И

5 2,2 19,5 21,7 8И

6 4,1 12,6 16,7 3,:

7 3,1 11,6 14,7 3/

8 3,8 0,05 3,85 0,(

9 2Д 16,8 18,9 8,С

10 3,1 12,4 15,5 4,(

* - описание вариантов см. в табл.11

Количество фульвокислот возросло как в аэробных, так и анаэробш условиях проведения эксперимента до 95% по сравнению с контролем. С< держание гуминовых кислот в этих вариантах, напротив, резко снизилос] Объяснятся-это явление повышенной микробной деградацией гуминовых кис лот до фульвоююлот. Поскольку некоторое количество гуминоподобных в< ществ появлялось и в вариантах не содержавших фоссилизированную древе сину,-' можно предполагать образование ж микроорганизмами непосредс

твенно в грунтовых водах при наличии доступных питательных веществ.

На рис.8 приведены ИК- спектры фракции гуминовых кислот. Эти данные свидетельствуют об активной роли микроорганизмов в структурооб-разовании гуминовых кислот в присутствии фоссилизированной древесины,

Рис.8 ЙК-спектры гуминовых кислот из грунтовой воды (А),

фоссилизированной древесины до инкубации (В) и после (С), при внесении пептона (Б), глюкозы, N^N03 и пептона (Е)

инкубированной в течение 16 месяцев в грунтовой воде. Именно микрос ганизмы способствовали возрастанию доли алифатических структур (СНг СН2- ), дающих пики около 2400 см"1, азотсодержащих структур (амид II, III) с характерными пиками при 1635 - 1616 см-1, 1539 см-1 и 12 см-1. Алифатический характер (разница между С-0 группами полисахарид с светопоглощением при 1069 см"1) наиболее строго выражен именно в г миновых веществах микробного происхождения (рис.8Е).

В соляных маршах, распространенных вдоль морских побережий, ежегол нарастает значительное количество свежего растительного материала, к торый, вероятно, может способствовать обогащению прибрежных вод гуь новыми веществами. Известно, что эти воды содержат основное количест органического углерода в виде гуминовых веществ, играющих важную рс в биогеохимических процессах, протекающих в морях (Rashid,1985). Пс тому одной из задач наших исследований было изучение роли этого pací тельного материала в поступлении гуминовых веществ в морскую вол Кроме того, предстояло определить степень участия микроорганизмов поступление в воду гуминовых веществ из биомассы S.alterniflora.

В табл.13 приведены данные о содержании гуминовых веществ в обра цах морской воды через 10 месяцев инкубации ее с растительной бжж сой в присутствии и в отсутствие микроорганизмов. Практически во вс вариантах опыта свежая биомасса S.alternlflora оказалась лучшим истс ником для образования гуминовых веществ, нежели сухая прошлогс няя,также собранная в соленом марше. При инокуляции суспензией эпиф^ ных микроорганизмов биомассы растений количество гуминовых вещест поступающих в морскую воду, возросло на 500% в вариантах с свежр растительными остатками и почти на 1700% - с мертвыми (сухими). Г инокуляции биомассы культурой гриба L.obiones или P.typharum количес во гуминовых кислот в воде возросло до 190% для свежей и до 170% j мертвой. Исходя из содержания углерода в растениях можно было расст тать, что в виде гуминовых веществ извлекалось 0,19% С из свежей б& массы при отсутствии микроорганизмов, в стерильных условиях. Но г количество возрастало до 0,92%, 0,32%, 0,31% и 0,37% соответствен»: вариантах с инокуляцией эпифитными микроорганизмами, микроорганизме марша и грибами L.obiones и P.typharum. В опытах с мертвой

Таблица 13

Содержание гуминовых веществ в морской воде после 10 месяцев инкубации биомассы Б.аНегтПога

Вариант РН Гуминовые вещества (сух.в-во)

(мг всего) (мг/л) %

Свежая морская вода (MB) 7,36 0 0 0

MB + свежая биомасса

S.al terni flora:

Стерильный контроль 4,81 937,7 198,7 100,0

С эпифитной флорой 7,15 4683,3 994,3 500,4

С микрофлорой болота 7,46 1506,4 324,7 163,4

С L.obi ones 6,59 1473,8 333,4 167,8

С P.typharum 6,85 1746,3 376,3 189,4

MB + сухая биомасса

S.al terni flora:

Стерильный контроль 5,15 86,8 24,2 100,0

С эпифитной флорой 7,85 1566,7 417,8 1726,4

С микрофлорой болота 7,79 1063,3 301,6 1246,3

С L.obi ones 6,00 143,7 41,2 170,3

С P. typharum 6,10 123,7 32,6 134,7

биомассой растений эти величины составили 0,01% в стерильных условиях, 0,22% при инокуляции эпифитными микроорганизмами, 0,16% - микрофлорой марша и 0,02% - обоими видами грибов. Гуминовые вещества из свежей биомассы содержали от 51,5% до 56,2% углерода и от 2,3% до 6,8% азота. Те же вещества из мертвой биомассы содержали от 46,0% до 51,4% углерода и от 3,2% до 5,0% азота.

Рис.9 УФ-спектры растворимых в воде гуминовых веществ из свеж< биомассы S.alternif1 ora в стерильных условиях (А), щ инокуляции эпифитной микрофлорой (В), микрофлорой марш! вых осадков (С), грибами L.obiones (D) и P.typharum (Е)

УФ-спектры гуминовых веществ, поступающих в воду из остатков свеж растений 5.а1Ьегп1Г1ога, приведены на рис.9. Как известно, поглощен] в области 275 нм и 320 нм свидетельствует о наличии в гуминовых кисж тах низкомолекулярных хромофоров. Такие вещества могут иметь раст] тельную природу (рис.9А), но нельзя исключить и их микробное происхо; дение.

Итак, мы можем заключить, что как при абиотических условиях, так при воздействии разнообразных автохтонных микроорганизмов значительн! количество гуминовых веществ поступает из биомассы 5. аКегтПога морскую воду. Кроме них, дополнительное количество гуминовых вещее1 может возникать из простых соединений растительного происхождения ходе их микробиологической трансформации в течение инкубации.

5. Роль микроорганизмов в трансформации и деградации некоторых загрязнителей природной среды

Объекты и методы исследований.Ранее мы отмечали, что загрязнителями окружающей среды могут быть не только соединения антропогенного происхождения! Иногда-' ими являются и'многие'природные соединения естественного происхождения. Наблюдается это в тех случаях, когда природные соединения не подвержены биологическому разложению и накапливаются в тех местах, где их присутствие нежелательно или даже вредно. Одним из наиболее характерных примеров такого рода являются гуминовые вещества в воде, резко снижающие ее хозяйственную ценность. В наибольшей степени присутствие гуминовых кислот отражается на качестве питьевой воды.

Поэтому изучение процессов микробиологического разрушения гуминовых веществ является одной из важных проблем экологической микробиологии.В своих опытах мы использовали гуминовые кислоты, извлекаемые щелочью из биомассы S.altemiflora или из осадков засоленных маршевых болот Атлантического побережья США. Сухие препараты гуминовых кислот применяли в качестве дополнительного или единственного источника углерода и азо-га в синтетических питательных средах. Инокулятом служила суспензия микроорганизмов вышеуказанных осадков, содержащая около 24х103 кле-гок/г грамположительных и грамотрицательных аэробных бактерий и 1,5х103 - микроскопических грибов, растущих на среде Чапека-Докса. ]реда варьировала по наличию или отсутствию глюкозы и NaN03. Препараты гуминовых кислот вносили из расчета 1 мг/ мл среды. Инкубация протека-па в течение 15 сут при перемешивании (аэробно) культур и в течение 1 года в статических (полуаэробных) условиях при комнатной температуре в темноте. По окончании инкубации биомассу микроорганизмов отделяли от {ультуральной жидкости, осаждали оставшиеся в растворе гуминовые кис-гаты и изучали их природу.

В ряде других опытов исследовали способность микробных фенолокси-заз окислять разнообразные химические соединения, являющиеся загрязнителями наземных и водных экосистем. Продуцентами лакказы служили грибы ?olyporus versicolor и Pleurotus ostreatus, а тирозиназы - Streptomy-:es eurythereus, Коммерческая пероксидаза, использованная в опытах,

была получена из растений редьки.

Потребление кислорода и появление хлора определяли электрометриче*

ки.

В других опытах исследовали способность почвенных микроорганизм* разрушать пластмассу полиуретан, широко применяемую для различных ц лей и вследствие этого в большом количестве поступающую на свалк Пластмассу- мелкого помола вносили в питательную среду Торнтона, koti рую инокулировали разведенной в 10~3 раз водной суспензией чернозе] обыкновенного. Инкубацию вели при перемешивании 30 сут при 22° С. ряде случаев в среду вносили глинистые минералы каолинит или бентони которые характерны для почв. Изменение состава пластмассы исследова методом ИК-спектроскопии.

Результаты исследования.Данные, приведенные в табл. 14, демонстр руют, что в течение 12 месяцев инкубации в статических условиях нал. чие гуминовых кислот в качестве дополнительного или единственного и точника азота всегда отчетливо способствовало развитию микроорганизм и росту их биомассы. В этих опытах гуминовые кислоты, полученные свежей массы растений S. alterniflora, полностью потреблялись микроо ганизмами. Гуминовые кислоты из мертвых остатков растений и из осадк марша использовались не полностью - от 211 до 71,8% в зависимости варианта опыта. Однако во всех случаях потребление гуминовых кисл было выше, когда они являлись единственным источником азота в сред Гуминовые кислоты, полученные из мертвых остатков 5.al terni flora, бы более устойчивы к действию микроорганизмов, чем гуминовые кислоты, в деленные из осадков маршевого болота. Методом ИК-спектроскопии удало установить снижение светопоглощения при 1030 см"1, что соответству снижению содержания углеводов в составе гуминовых кислот в тех случ ях, когда они служили единственным источником углерода для микроорг низмов. В тех же случаях, когда они являлись единственными источника азота, наблюдали снижение поглощения при 1650 см"1 и 1540 см-1, ч соответствует уменьшению содержания амидных групп. При аэробных уел виях культивирования (перемешивание) наблюдали значительно более быс рое и резкое изменение строения гуминовых кислот, что проявлялось изменении ИК спектров. В частности, в дополнение к уже отмеченным и

менениям, происходило усиление полос поглощения, соответствующим ароматическим структурам - полосы 1517 - 1513 см"1, 1457 - 1455 см-1, 1420 и 1125 см-1. Известно (1?азМс1,1985), что такие структурные изменения в составе гуминовых кислот было принято считать результатом длительного абиогенного их изменения (диагенеза), протекающего в глубинных слоях геологических" отложений."

Таблица 14

Образование биомассы и использование гуминовых веществ при микроаэробной инкубации в течение 12 месяцев

Биомасса сухая Гуминовая кислота

ииразец - ---- (мг/100 мл) % (мг/100 мл) Потреблено (в %)

Контроль (полная среда)(ПС) 52,0 100,0 Нет Нет

ПС + гуминовая к-та (ГК 1) 100,0 192,3 0 100,0

ПС - С + ГК 1 32,0 61,5 18,7 81,3

ПС - N + ГК 1 106,0 203,8 0 100,0

ПС + ГК 2 204,0 392,3 73,0 27,0

ПС - С + ГК 2 12,0 23,1 62,5 37,5

ПС - N + ГК 2 41,0 78,8 53,8 46,2

ПС + ГК осад. 121,0 232,7 36,0 64,0

ПС - С + ГК осад. 38,0 73,1 40,0 60,0

ПС - N + ГК осад. 81,0 155,8 28,2 71,8

ГК 1 - гуминовая кислота из свежей биомассы S.alteгniflora ГК 2 - гуминовая кислота из сухой биомассы Б.аНегШПога ГК осад. - гуминовая кислота из донных осадков марша С, N - дополнительный источник углерода и азота в питательной среде

Трансформация ряда низкомолекулярных органических загрязнителей почв и воды возможна при воздействии на них микробных экзоферментов.В габл.15 приведены данные о действии лакказы и тирозиназы на эти соединения.

Таблица

Окисление различных органических соединений в присутствии лакказы и тирозиназы

Соединение Активность (пМ Ог/мин/мл)

Алкилированные фенолы Лакказа Тирозинг

2,6-диметилфенол 9600 180С

2,4,6-триметилфенол 5200 С

2,3,5-триметилфенол 3000 С

2,3,6-триметилфенол 3000 С

2-изопропилфенол 3700 140С

3-изопропилфенол 4100 С

4-изопропилфенол 4400 С

2,6-диизопропилфенол 5200 С

2,4-дибутилфенол 700 С

2,5-дибутилфенол 0 0

2,6-дибутил-4-метилфенол 0 с

Замещенные хлорфенолы

2хлор-6-метилфенол 6600 с

2-хлор-5-метилфенол 2200 0

4-хлор-2-метилфенол 3500 0

4-хлор-З-метилфенол 1500 0

2-хлор-4,5-диметилфенол 6600 с

2,2-метилен-3,4,6-трихлорфенол 5900 0

Галогенированные фенолы

2-хлорфеяол 3800 0

3-хлорфенол 400 0

4-хлорфенол 900 0

2,4-дихлорфенол 1600 0

2,6-дихлорфенол 2500 0

2,3-дихлорфенол 200 0

3,4-дихлорфенол 0 0

2,5-дихлорфенол 0 0

(продолжение табл.15)

,4,6-трихлорфенол 2300 0

,4,5-трихлорфенол 300 0

,3,4-трихлорфенол - ■ 0 0

,3,5-трихлорфенол • 0 0

,3,5,б-тетрахлорфенол 700 0

ентахлорфенол 0 0

-фторфенол 1600 0

-бром-2-хлорфенол 2200 0

риламины, Нитрофенолы

-аминофенол 41000 15000

-аминофенол 3100 0

-аминофенол 8500 900

,5-диметиланилин 2600 0

-метиланилин 4400 0

,М-диметиланилин 5900 0

-аминотрифторбензол 400 0

-нитрофенол 0 0

-нитрофенол 0 0

-нитрофенол 0 0

рочие фенолы

енол 1000 8800

-фенилфенол 600 0

-метоксифенол 3700 28000

-(2-фенил-2-пропил)-фенол 1700 0

Анизол) (0) (400)

В присутствии лакказы окислялось более 2/3 (78%) из 49 исследо-энных нами химических соединений. В то же время только 14% этих сое-шений окислялось в. присутствии тирозиназы. Среди этих соединений шь одно - анизол, окислялось только тирозиназой. Наиболее быстро

протекало окисление алкшшрованных фенолов. Галогенированные фен окислялись медленнее, причем скорость процесса коррелировала с сод жанием этих группировок в молекуле. Например, пентахлорфенол не ок лялся совсем. Фенолы с различными дополнительными функциональн группами окислялись в следующей последовательности: аыино-> пропи фторо ' хлор->-'нитро-. Наиболее интересные результаты приведен табл.16. Они свидетельствуют о том, что иногда окисление галогени ванных фенолов сопровождается отщеплением атомов хлора. При возде твии тирозиназы хлор в некоторых случаях отщепляется даже без однов менного окисления собственно фенольных соединений.

Дегалсгенизация некоторых производных фенолов пероксидазами

Таблица

С1~ освобожденный:

Фенол*

пероксидазой лакказой тирозиназой мг/л % мг/л % мг/л 1

2-хлорофенол 13 1

4-хлорфенол 31 15

2,6-джлорфенол 18 7

2,4,5-трихлорфенол 44

9 1 17 9 46 19 30 77

9 1 58 29 О О

О О О 17

2,4,6-трихлорфенол 100 2,3,5,6-тетрахлорфенол 9 2-хлор-З-метилфенол 26

О 45

4-хлор-2-метилфенол 58 23 4-хлор-З-метилфенол 33 23 2-хлор-4,5-диметилфенол 25

99 39 19 14 24 40

11 4 66 47

О О О

2,4-дихлор-6-метилфенол 54 4-бром~2-хлорфенол 60 64

36 38

*-концентрация: 500 -6000 мг/л %- СГосвободденный/СГсвязанный

I 80

Т>

I 60

>

1 40

и

20 0

;f 80

Z**

>

Я 40

tu " 20

0

5?

fioo В 80 I 60-

о

Ш 40 20 0

Рис.10 Активность пероксидазы, лакказы и тирозиназы после адсорбции на минеральных и органо-минеральных сорбентах (В1,2,3 - три типа бентонита; К1,2 - два типа каолинита; СН - бентонит-гумусный комплекс; ££> - кварцевый песок; Р0 - пористое стекло)

DH ч,о

В1 В2 ВЗ K1 К2 СИ OS PG PEROXIDASE FROM HORSERADISH

81 82 83 K1 K2 CH OS PG

LACCASE FROH P. VERSICOLOR

Bi B2 B3 K1 K2 CH OS PG TYROSINASE FROM S. EURYTHEMUS

Использование микробных ферментов для трансформации химическ загрязнителей непосредственно в почве, к сожалению, затруднено из-влияния минеральных и органо-минеральных сорбентов. Из данных,привел ных на рис.10, следует, что адсорбция, наиболее сильная вблизи изоэл трической точки ферментов, приводит'-к потере активности лакказы, ти зиназы и пероксидазы, причем в некоторых случаях полностью.

cm*1 2000 — I 1 1600 1300

^ N'C'H

\ 1613 \ 1 к

\ Л п 1 /1/1 л' А

V \1°

? к, А -к

>Н-С-0- " 7

о' У ')

ы

17ю\ Л / 1t'12

2123 N V1515

2269 \ 1650

\ 1715 U""

\ 1515

5 в 7 у 1 '

Рис.11 ИК-спектры полиуретана до (А) и после 90-дневной инкуба! со смешанной популяцией микроорганизмов (В), при внесем каолинита (С) и бентонита (В)

Можно полагать, что в благоприятных условиях почвенные микроорганизмы могут расщеплять даже сложные искусственные полимеры,такие,например, как полиуретан. Однако, наличие в почве глинистых сорбентов препятствует полной деградации полимера. На рис.И приведены ИК-спект-ры полиуретана. Образцы полиуретана, внесенные в стерильную питательную 'среду,' встряхивали 30 сут, затем промывали водой и высушивали (рис.НА). В тех вариантах опыта, где образцы полиуретана подвергались действию всего комплекса почвенных микроорганизмов, развивающихся в среде, ИК-спектры были совершенно иными (рис.И,В). Характерные полосы значительно теряли свою интенсивность или исчезали полностью. Наиболее четко это видно для полос изоциаяата (2315 и 2120 см-1), карбонильных групп эфира и мочевины (1715 см"1) и даже для полосы 1412 см-1, которая типична для ароматического кольца изоциаруновой кислоты - структурной единицы полиуретана. В других вариантах опыта типичные для полиуретана ИК полосы выражены слабее, чем в контроле, хотя и достаточно хорошо различимы (рис.11С,В). При этом в среду вносили 0,5% каолинита или бентонита для имитации почвенных условий. Вероятно, эти минералы за счет адсорбции подавляли активность ферментов, необходимых для расщепления структур полиуретана.

6.Заключение

Полученные при выполнении диссертационной работы результаты позволяют утверждать, что почвенные и водные микроорганизмы играют как активную, так и пассивную роль по отношению к разнообразным химическим загрязнителям природной среды. При этом структура микрофлоры в природных местообитаниях может изменяться, поскольку реакция отдельных групп микроорганизмов на присутствие этих веществ различна. Исходя из имеющихся у нас дачных можно с достаточной уверенностью утверждать, что микрофлора способна использовать или трансформировать разнообразные загрязнители. Некоторые группы микроорганизмов, например бактерии грунтовых вод, развившиеся в незагрязненной среде, затем, при появлении загрязнителей оказываются устойчивыми к разнообразным химическим

поллютантам. Нередко загрязнители, не являющиеся по своей природе нобиотиками,такие, как отходы биотехнологической промышленности, борот, содействуют развитию микроорганизмов и усилению их метабола кой активности. Нами показано, что такие вещества могут благопрр влиять на свойства самой среды, например, почвы. Однако, иногда ст ляция- активности природных популяций микрорганизмов вызывает накс ние "вторичных" природных загрязнителей - сложных продуктов метабс ма или частичного разложения сложных органических веществ. Образо! или отщепление гуминовых веществ из свежей гаи фоссшшзированной массы - примеры такого взаимодействия.

Весьма важной является проблема активизации микроорганизма борьбы с химическими загрязнителями. В текущей научной литере всегда много сообщений о способности индивидуальных штаммов или сорций микроорганизмов разлагать отдельные химические соедине обычно выясняются и механизмы этих процессов в лабораторных услов Однако практическое использование таких микроорганизмов остается с ной задачей. В природе, в условиях "т-з^и", даже простое накопл микробной биомассы может отрицательно влиять на процесс разло» загрязнителей. Сама биомасса, из-за особенностей своего состава,ы стать загрязнителем среды.

Ряд наших работ был посвящен использованию микробных ферме для борьбы с загрязнением среды. Отдельные ферменты не могут провс полное расщепление сложных химических соединений. Но иногда достат небольших изменений структуры загрязнителя, чтобы снять его вредо ное влияние. При этом важна точная характеристика свойств среды, в числе наличие адсорбентов, например глинистых минералов в почве, показано, что почвенные сорбенты могут резко изменять активность ментов, окисляющих химические загрязнители.

Несомненно также, что природные сообщества микроорганизмов, о дающие комплексом ферментных систем, способны изменять структуру сложных органических веществ как антропогенных, так и природных, установили,что микробиологическая трансформация гуминовых веществ жет повышать их биогеохимическую стабильность в природных средах.

Пока мало сведений об активности микроорганизмов в местах склад

¡ания отбросов, на свалках, и о их роли в разложении сложных органи-[еских веществ, в обилии поступающих на свалки. Нами было выяснено, ¡то в этих своеобразных антропогенных экосистемах можно регулировать икробиологическую активность, в том числе и до образования гуминовых -еществ (Filip and Küster, 1979-, Filipetal., 1985; Newman et al., 987}.. Показано, что даже сложные по своей химической структуре пласт-¡ассы, такие, например, как полиуретаны, разрушаются микробиологичес-им путем. При этом их отдельные структурные единицы могут использо-аться как источник питания (Filip,1979).

Заслугой российских ученых является то, что уже с самого начала азвития микробиологии как самостоятельной научной дисциплины,они при-ывали исследовать активность микроорганизмов непосредственно в местах х обитания. Этот экологический принцип, ныне общепризнанный, был первые сформулирован русскими почвенными микробиологами. Ныне он пос-едовательно реализуется в работах, посвященных микробиологии загряз-енных природных сред.

Выводы

1. Впервые по единой методике проведена оценка действия разнос разных загрязнителей на численность и активность основных групп микр организмов почв, грунтовых вод и водоемов. Определено также их влиян на ферментативную активность природных сред. Установлена степень сн жениЯ' этих- показателей биологической активности в зависимости от дс и прщюды загрязнителей.

2. Постулируется необходимость сопряженного изучения действия за рязнителей на микроорганизмы разных элементов экосистем - почв, гру товых вод, водоемов.

3.Развита концепция, что некоторые загрязнители антропогенн природы не оказывают отрицательного или, напротив, оказывают поло» тельное действие на природные среды, а также концепция о вреде некот рых природных (естественных) загрязнителей.

4.Показаны принципиальные различия в действии хлорированных угл водородов на отдельные группы микроорганизмов и их ферментативную а тивность в почвах. Определена степень устойчивости микрофлоры грунт вых вод к этим химическим загрязнителям.

5.Подробно исследованы пути деградации в почве отходов биотехн логической промышленности, в нарастающих масштабах поступающих свалки, где они могут стать серьезными загрязнителями почв и воды.П казано, что наиболее приемлемым способом их утилизации может быть и пользование в качестве органических удобрений.

6.Установлено, что природные сообщества микроорганизмов мог выступать в роли загрязнителей природных вод, преобразуя биомассу ра тений в гуминовые вещества, резко понижающих хозяйственную ценное воды и ухудшающих качество питьевой воды. Автохтонная микрофлора уск ряет диагенез гумусовых веществ за счет изменения их структурь уменьшения содержания алифатических структур и возрастания роли аро^ тических ядер. Гуминовые вещества простого строения могут полност использоваться микроорганизмами.

7.Выяснены особенности микробиологического разрушения полиурет новых пластмасс в почве, установлены основные этапы этого процесса роль микроорганизмов в них.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

..Filip Z., Muller H.P. Einfluss von Fermentâtionsruckstanden auf die idenmikroorganismen und auf einige Bodeneigenschaften. Pedobiologia, 184,24,221-232

Filip Z., Kanazava S. Einfluss einiger halogenierter Kohlenwassers-iffe auf die Bodenbiomasse und auf einige Gruppen von Bodenmikroorgasmen. In: Proc.Int.Symp.Munich,P.Udluft,B.Merkel & H.Prossl (Eds.) ichn.Univ.Munich, 1984, vol.2,477-486

LFilip Z., Kanazava S. Vorkommen und Aktivitäten von Mikroorganismen i organischen und mineralischen Bodenpartikeln.Eine Kurzmitteilung indw. Forsch.,1985,38,69-71

Filip Z., Preusse T. Phenoloxidierende Enzyme - ihre Eigenschaften id Wirkungen im Boden. Pedobiologia,1985,28,133-142 I.Filip Z. Verhalten von Nitrilotriacetat (NTA) im Boden - eine Uber-cht.Forum Städte Hyg., 1985,36,35-37

I.Filip Z. Microbial degradation of polyurethanes. In: Biodeteriora-on and Biodegradation of Plastic and Polymers, K.J.Seal (Ed.) Biode-r.Soc..Cranfield, Herford,1985,51-55

.Kanazava S., Filip Z. Microorganisms and enzymatic activity in soil affected by trichloroethylene, tetrachloroethylene and dichloromet-ne. A short communication, In: Microbial Communities in Soil, FEMS mposium No.33, V.Jensen, A Kjoler & L.H.Sorensen (Eds.) Elsevi-,London,1986,207-209

.Kanazava S., Filip Z. Distribution of microorganisms, total biomass d enzyme activities in different particles of brown soil. Microb. ol.,1986,12,205-315

.Kanazava S., Filip Z. Effects of trichloroethylene, tetrachloroet-lene and dichloromethane on enzpatic activities in soil. Appl.Mic-biol.Biotechnol.,1986,25,76-81

.Filip Z. Bodenmikrobiologische Überlegungen zur Einschätzung der Ok sserschutz, G.Milde & R.Leschber (Hrsq.) Schriftenreihe des Vereins r Wasser-, Boden- und lufthygiene, Bd.64,G.Fischer Verlag Stutt-rt,1986,179-191

11.Kanazava S., Filip Z. Effects of trichloroethylene, tetrachloroe hylene and dichloromethane on soil biomass and microbial counts. Zb Hyg.,1987,B 184: 24-33

12.Filip Z. Biotechnologische In-situ-Sanierung kontaminierter Stan dorte, Schriftenreihe des Vereins fur Wasser-, Boden- und Lufthyg Bd.80, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,1988, 394

13.Filip Z., Milde 6. Biotechnologische Prinzipien und uinwelthygie nische Aspekte von In-situ-Sanierungsmasnahmen im Boden- und Grund serbereich. In: Biotechnologische In-situ-Sanierung kontaminierte Standorte, Z.Filip (Hrsq.) Sehr.-Reiche des Vereins fur Wasser-, B den- und Lufthygiene, Band 80, G.Fischer Verlag, Stutgart,1988,1

14.Claus H., Filip Z. Behavior of phenoloxidases in the presence clays and other soil related adsorbents. Appl.Microbiol. Biotech-nol.,1988,28,506-511

15.Filip Z.,Geller A., Schiefer B.,Schwefer H.-J.,Weirich 6. Un suchung und Bewertung von In-situ-biotechnologischen Verfahren zur nierung des Bodens und des Untergrundes durch Abbau petrochemischer Altlasten und anderer organischer Umweltchemikalien. BMFT-Forsch sbericht,1988,310 S.

16.Filip Z.,Smed-Hildmann R. Microbial activity in sanitary ladfl - a possible source of the humic substances in groundwater? Wa Sei.Tech.,1988,20,55-59

17.Filip Z., Alberts J.J., Cheshire M.V., Goodman B.A., Bacon J. Comparison of salt marsh humic acid with humic-like substances from the indigenous plant species Spartina alterniflora (Loisel.). Sei. tal Environ.,1988,71,157-172

18.Filip Z., Alberts J.J. The release of humic substances from Spa na alterniflora (Loisel.) into sea water as influenced by salt mars indigenous microorganisms. Sei.Total Environ.,1988,73,143-157

19.Filip Z. Biotechnologische Aspekte und umwelthygienische Bedeut von In-situ-Sanierungsmasnahmen in Boden- und Grundwasserbe ich.Off.Gsundh.-Wes.,1988,50,415-420

20.Alberts J.J., Filip Z., Leversee G.J.Interaction of estuarine ganic matter with copper and benzo(a)pyrene.Marine Chem.,1989,28,7

l.Filip Z., Alberts J.J. Humic substances isolated from Spartina al-erniflora (Loisel.) following long-term decomposition in sea water, ci.Total.Environ.,1989,83,273-285

2-Filip Z., Dipell G., Hollederer G., Milde G. Resistenz und Abbaupo-ential von Mikroorganismen gegen grundwassergefahrdende organische heinii^Xen^ r ^ ~*210" S."

3.Filip Z. Abbau von Polyurethan durch Mikroorganismen - Abschätzung er Folgen im Grundwasserbereich. Bundesgesundheitsbl.,1990,33,323-328

4.Filip Z. Biologische Verfahren. In: Altlastensanierung, H.-H. Weber t al.(Hrsq.) Springer Verlag Berlin, Heidelberg, 1990, 300-328 ö.Filip Z. Mikrowelle Ökologie des tiefen Untergrundes - ein neues orschungsgebiet. Forum Städte Hyg., 1990, 41, 161-163

5.Claus H., Filip Z. Enzymatic oxidation of some substituted phenols rid aromatic amines, and the behavior of some phenoloxidases in the resence of soil related adsorbents. Wat.Sei.Tech., 1990, 22, 69-77 7.Claus H., Filip Z. Effects of clays and other solids on the activi-y of phenoloxidases produced by some actinomycetes and fungi. Soil iol.Biochem., 1990, 22, 483-488

3.Filip Z. Möglichkeiten zur Sanierungchemisch verunreinigter Stanzte durch biologische Verfahren. In: Halogenierte Kohlenwasserstoffe i Wasser und Boden. Schriftenreihe des Vereins f. Wasser-,Boden- u. ifthygiene, Bd.82. G.Fischer Verlag, Stuttgart, 1990, 227-231 5.Filip Z., Schmelz P., Smed-Hildmann R. Bdellovibrio sp.- a predator ider groundwater conditions? Wat. Sei. Tech., 1991, 24, 321-324 3.Filip Z., Dippell G., Hollederer G.,Milde G. Resistance of ground-iter bacteria to organic chemicals. In: Microbiology of the deep sub-irface, C.Fliermans & T.Hazen (eds.), WSRC Inf. Service, Aiken, SC, 591, 7-89 - 7-95

..Filip Z., Smed-Hildmann R. Entstehung und umwelthygienische Bedeu-mg von Huminstoffen im Grundwasser. Forum Städte - Hyg.,1991, !, 224-228

Claus H., Filip Z. Phenoloxidierende Enzyme als Mittel zur Umwand-ing einiger organischer Schadstoffe im Bodenund Grundwasserbereich, irum Stadte-Hyg., 1991, 42, 214-223

33.Filip Z., Newman R.H., Alberts J.J. Carbon-13 nuclear magnetic sonance characterization of humic substances associated with s marsh environments. Sei.Total Environ., 1991, 101, 191-199

34.Filip Z., Hofmann R. Einige mikrobiologische und andere analyt Laboruntersuchungen zur Beurteilung kontaminierten Bodens. Forum Hyg., 1991, 42,' 199-203 "

35-Filip Z. Smed-Hildmann R. Does fossil plant material release h substances into groundwater? Sei.Total Environ., 1992, 117/118, 31

36.Filip Z., Hofmann R., Dippell G., Hollederer G. Labor- und Feld tersuchungen zur mikrobiologiscen Sanierung von altolkontaminie Raffineriestandorten. Abschlussbericht 2um BMFT - Vorhaben 1480 1992, 319 S.

37.Filip Z..Alberts J.J. Humic substances and some microbial ana from two thermal sites in Iceland. Sei. Total Environ., 117/118,227-239

38.Filip Z. Mikrobiologische, biochemische und stoffliche Beurtei des Stabilisierungsprozesses in einer Hausmulldeponie. In: Biologi Abfallbehandlung, K.Wiemer und M.Kern (Hrsq.),M.I.C.Baeza-Verlag, zenhausen, 1993, 877-904

39.Filip Z.,Alberts J.J. Formation of humiclike substances by fu epiphytic on Spartina alterniflora. Estuaries, 1993, 16, 385-390

40.Filip Z..Alberts J.J. Microbial utilization resulting in early genesis of salt marsh humic acids.Sei.Total Environ.,1994,144,121-

41.Filip Z. Biodegradation of different nitroaromatic compounds -review.Sci.Agric.Bohem., 1995, 26, 145-161

42.Filip Z. Einfluss chemischer Kontaminanten auf die Bodenmikroo nismen und ihre okologisch bedeutenden Aktivitäten - eine Ubersi UWSF-Z.Umveltchem.Okotox. 1995, 5, 7, 92-102

43.Filip Z., Claus H. Effects of soil minerals on the microbial fo tion of enzymes and their possible use in remediation of chemic polluted sites. In: Impact of Interactions of Inorganic, Organ! Microbiological Soil Components on Environmental Quality, P.M.Hua al.,(Eds.) CRC Press.Lewis Publ., 1995, 5, 409-421