Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микролимфодинамика в норме и патологии. Оптические методы исследования

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Микролимфодинамика в норме и патологии. Оптические методы исследования"

На правах рукописи

ГАЛАНЖА Екатерина Ивановна

МИКРОЛИМФОДИНАМИКА В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

03.00.02- биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Саратов - 2004

Работа выполнена на кафедре оптики Саратовского государственного университета и в центральной научно-исследовательской лаборатории Саратовского государственного медицинского университета

Научные консультанты: доктор физико-математических наук,

профессор Тучин Валерий Викторович

доктор медицинских наук,

профессор Брилль Григорий Ефимович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Анищенко Татьяна Григорьевна,

доктор медицинских наук,

профессор Денисова Татьяна Петровна;

доктор медицинских наук,

профессор Пучиньян Даниил Миронович

Ведущая организация: Российский государственный

медицинский университет, I .Москва

Защита диссертации состоится "17" февраля 2004 года в 15 30 часов на

заседании диссертационно1 о Совета Д 212 243.05 в Саратовском государственном университете (410012, г Саратов, ул. Асграханская, 83)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке СГУ Автореферат разослан "/^января 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор физико-математических наук, профессор

Iff 06- 9

/<Р?5<Р

гтъъъ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Система лимфомикроциркуляции выполняет в организме разнообразные функции: обеспечивает поддержание состава и объема экстрацеллюлярной жидкости, принимает участие в движении клеток, протеинов и воды из ткани и их возвращении в кровеносное русло, в гуморальной регуляции функций и т.д. (Куприянов В.В.и соавт, 1983; Ткаченко Б. И., 1984; Aukland K.et al., 1993). В настоящее время не вызывает сомнений, что нарушения лимфоциркуляции играют важную роль при развитии различных патологических состояний, таких как венозная недостаточность, инфекционные и сердечно-сосудистые заболевания, патология поджелудочной железы, воспалительные процессы различной этиологии, аномалии развития лимфатической и венозной систем и др. (Буянов В.М., 1990; Mareks Р., 1997; Kayikçioglu A. et al., 2000; Richard L. et al., 2000; Witte C.L. et al., 2000). Однако механизмы этих расстройств до сих пор во многом остаются неясными. В условиях патологии часто нарушается транспортная функция лимфатической системы. Это приводит к возникновению лимфатического отека (лимфедемы), который может появляться после хирургических манипуляций или рентгенотерапии опухолей, поражении лимфатической системы паразитами или бактериями (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. 1999; Mareks Р., 1997; Mortimer P.S., 1998; Richard L. et al., 2000). Так, вторичная лимфедема выявляется у 25-30% (по некоторым данным - до 80%) больных, оперированных по поводу рака молочной железы (постмастэк-томическая лимфедема) (Berlin Е. et al., 1999; Pain S.J. et al., 2000). Лечение лимфедемы до сих пор остается недостаточно эффективным (Mareks Р., 1997; Szuba A. et al., 1998). Требует дальнейшего изучения участие лимфомикроциркуляции в патогенезе ряда других острых и хронических патологических процессов, в том числе венозной недостаточности, никотиновой интоксикации и Т.д.

Вместе с тем, функциональные исследования системы лимфомикроциркуляции в мире проводятся в небольшом числе лабораторий (Хугаева В.К., 1991, 1998; Benoit J.N. et al., 1989, 1991, 1997; Shirasawa Yu. et al., 2000). Несмотря на достигнутые успехи в изучении физиологии лимфатических микрососудов, многие вопросы пока остаются спорными и неясными. В частности, недостаточно выяснены законы перемещения жидкости по лимфатическим микрососудам. Насколько они отличаются от механизмов движения крови? Как соотносятся объемы лимфы, выбрасываемые в центральном и периферическом направлениях? Каковы физиологические механизмы регуляции лимфотока? Каков вклад внутренней лимфатической помпы (фазных сокращений, работы клапанов и т.д.) в регуляцию движения лимфы в отдельных лимфатических

fOC. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИГ И'оТЕКА С Пе.грбург ÎOOjoPK

микрососудах и как коррелируют параметры внутренней активности лимфан-гионов друг с другом?

Включение лимфатического звена в интегральные гомеостатические реакции обеспечивается сложной многоуровневой регуляцией и, в частности, местными регуляторными механизмами, обеспечивающими гибкое приспособление функции лимфатических микрососудов к потребностям конкретного региона ткани. Пока нет отчетливых представлений о характере изменений микролимфодинамики in vivo при изменении концентрации в тканях оксида азота (N0). До сих пор не изучено участие в регуляции микролимфодинамики Рг и Зг-адренореактивных структур стенки микрососудов. Не исследована реакция системы лимфомикроциркуляции на действие ряда фармакологических и физических факторов. Так, хорошо известно положительное противоотечное терапевтическое действие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) (Толстых П.И., Клебанов Г.И. и соавт., 2002; Zharov V.P. et al., 1999, 2000; Kaviani A. et al., 2003), но его эффекты на микролимфодинамику практически не изучены.

Для решения этих и других задач определяющее значение имеет выбор адекватного метода исследования. Существующие методы клинической лим-фодиагностики очень немногочисленны и не могут в полной мере охарактеризовать функциональное состояние лимфангионов. Прижизненное исследование микролимфодинамики в эксперименте является не простой задачей, что во многом обусловлено особенностями строения и функции лимфатических микрососудов. Лимфатические микрососуды прижизненно сложно визуализировать оптическими методами, поскольку они не окрашены, прозрачны и представляют собой слабо рассеивающие структуры. Количественный анализ лим-фотока затрудняется выраженным неламинарным осцилляторным характером движения лимфы. Использование простого и адекватного способа окрашивания микрососудов - введения красящих веществ в крупные коллекторы с целью окрашивания микрососудов - невозможно, поскольку, в отличие от кровеносной, лимфатическая система является незамкнутой. На сегодняшний день представляется перспективным совершенствование методов для исследования лимфомикроциркуляции, основанных на трансмиссионной микроскопии, а также разработка новых методических подходов, в том числе успешно применяемых для диагностики потоков в кровеносных микрососудах - доплеровских и спекл-корреляционных методов.

Целью настоящей работы является развитие и адаптация оптических методов исследования для количественного анализа микролимфодинамики в норме и патологии.

Задачи исследования.

1. Расширить возможности метода цифровой трансмиссионной витальной биомикроскопии для исследований микролимфодинамики.

2. Провести количественную оценку лимфотока с учетом его осцилляторного характера, фазных сокращений, функции клапанов и особенное 1ей регуляции транспортной функции лимфангионов внутрилимфатическими факторами.

3. Проанализировать влияние стимуляторов и блокаторов продукции оксида азота и (3-адренорецепторов на функцию лимфатических микрососудов.

4. Изучить состояние микролимфодинамики при действии лекарственных и немедикаментозных факторов и оценить их эффективность в плане стимуляции транспортной функции лимфангионов.

5. Создать экспериментальные модели острых и хронических патологических процессов (острая и хроническая лимфедема, острая венозная недостаточность, никотиновая интоксикация) и оценить состояние лимфомик-роциркуляции при этих формах патологии.

6 Оценить возможности комбинированного использования различных модификаций спекл-корреляционных методов и цифровой трансмиссионной микроскопии для исследования микролимфодинамики.

7. Разработать алгоритм исследования микролимфодинамики in vivo

8. Оценить возможности применения оптического просветления тканей с помощью различных иммерсионных жидкостей с целью оптимизации исследования микроциркуляции.

Научная новизна. В работе показано, что применение метода цифровой трансмиссионной микроскопии и использование брыжейки крысы в качестве модельного объекта для исследования лимфатических микрососудов irt vivo позволяют получить новую фундаментальную информацию о микролимфодина-мике в физиологических и патологических условиях. В результате: 1. Впервые в условиях in vivo измерены скоростные характеристики лимфотока с учетом возвратно-поступательного характера движения лимфы, а также определен ряд новых показателей фазного сокращения и работы клапана, оценены некоторые реологические свойства лимфы;

2. Установлены ранее неизвестные взаимосвязи между количественными параметрами фазных сокращений, работы клапана и количеством клеток в потоке лимфы и показателями скорости лимфотока;

3. Проанализирован характер и механизмы регуляции работы клапанов лимфатических микрососудов;

4. На основе детального анализа показателей микролимфодинамики определены параметры, имеющие первостепенное значение в стимуляции скорости движения лимфы в микрососудах;

5. Установлено участие оксида азота в регуляции лимфотока;

6. Доказано участие (3-адренореактивных систем в регуляции функции лимфатических микрососудов в физиологических условиях;

7. Разработана этиологически близкая к клинической ситуации модель острой и хронической лимфедемы, позволяющая, с одной стороны, измерить степень отека ткани; а с другой - количественно оценить функциональное состояние лимфатических микрососудов до и после формирования отека, и на основе этого выявить неизвестные звенья патогенеза лимфедемы;

8. Впервые установлены нарушения лимфомикроциркуляции при действии никотина;

9. Получена важная информация о патогенезе лимфомикроциркуляторных нарушений при острой венозной недостаточности, об ответах лимфатических микрососудов на фармакологические (диметилсульфоксид) и немедикаментозные лечебные воздействия (низко- и высокоинтенсивное лазерное излучение);

10. Доказано, что комбинация цифровой трансмиссионной микроскопии с различными модификациями спекл-корреляционного метода имеет достоверные преимущества для исследования микролимфодинамики ín vivo по сравнению с существующими ранее техническими подходами и позволяет, сохранив все достоинства каждого из методов, устранить их основные недостатки;

11. Установлено, что действие различных иммерсионных жидкостей на оптические свойства ткани и состояние микроциркуляции при одинаковой направленности эффектов имеет специфические особенности (степень изменения показателя отражения кожи, длительность эффекта просветления, продолжительность стазов в микрососудах и т.д.).

Практическая значимость. В процессе исследовательской работы были

расширены возможности трансмиссионной микроскопии, а также разработана

и адаптирована для функционального исследования лимфомикроциркуляции

комбинация микроскопического метода и различных модификаций спекл-корреляционных методов. Все методические подходы к исследованию микро-лимфодинамики были успешно внедрены в экспериментальную рабспу. Предложенный алгоритм исследования лимфатических микрососудов позволяет проводить быструю и наиболее полную на сегодняшний день оценку комплекса параметров микролимфодинамики в норме, патологии, а также в динамике того или иного воздействия.

Установленные механизмы нарушений функции лимфангионов при патологических состояниях являются научной основой, позволяющей обозначить главную стратегию лечения, оптимизировать комплекс лечебных мероприятий и предложить новые патогенетически обоснованные терапевтические программы стимуляции механизмов активного транспорта лимфы.

Связь с государственными и международными программами. Исследования по теме диссертации соискателем выполнялись частично в рамках совместных международных программ: в научно-исследовательской лаборатории под руководством проф. Жарова В.П. (University of Arkansas for Medical Sciences, Little Rock, USA), в научно-исследовательской лаборатории под руководством проф. R.K. Wang (Institute of Bioscience and Technology of Cranfield University, UK), в научно-исследовательской лаборатории под руководством проф Q. I.uo (Institute for Biomedical Photonics, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China). Исследования были частично осуществлены при поддержке научных грантов «Создание научно-образовательного центра «Нелинейная динамика и биофизика» (CRDF и Министерства образования РФ № REC-006), РФФИ №98-02-17997 и №99-15-96040, Президента РФ «Оптика и спектроскопия рассеивающей и многокомпонентной среды: биофизическая и медицинская диагностика, фотобиология и фотомедицина» («Поддержка ведущих научных школ» № 00-15-96667 и № 25.2003.2), Ведущих научно-образовательных коллективов РФ № 2.11.03 Министерства Образования РФ, CRDF №№ TGP-642 и TGP-891, «Развитие когерентно-оптических методов для мониторинга реологии крови» («Royal Society») и Федеральной научно-технической программы «Биофотоника».

Достоверность результатов диссертации. Достоверность полученных результатов и выводов обеспечивается адекватностью используемых методов и объектов исследования, использованием современных апробированных методов измерений и статистической обработки экспериментальных данных Достоверность оригинальных экспериментальных результатов подтверждав 1ся

воспроизводимостью результатов экспериментов, а также данными статистического анализа.

Апробация работы. Результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на научных конференциях и симпозиумах: на 6-м международном конгрессе «World Congress for Microcirculation» (Munich, Germany, 1996); на 9-й международной конференции «Vascular Biology Meeting» (Seattle, USA, 1996); на международных конференциях «SFM, Workshop on Optical Technologies in Biophysics and Medicine» (Саратов, Россия, 1998:2003); на международных симпозиумах «Biomedical Optics, BiOS» (San-Jose, С A, USA, 19982003); на II Интернациональном симпозиуме "Tissue monitoring and 3D-lmaging of diseased Organs" (Erlangen, Germany, 2000); на международной конференции «European Biomedical Optics Week, EBiOS, SPIE » (Amsterdam, Netherlands, 2000); на международных конференциях «European Conference on Biomedical Optics, OS A, SPIE » (Munich, Germany 2001, 2003); на международной конференции «International Workshop on Biophotonics - SIWB-02» (Саратов, Россия, 2002); на международной конференции «Conference on Lasers, Applications and Technologies, IQEC/LAT » (Москва, Россия, 2002); на 22-м заседании «European Society for Microcirculation» (Exeter, UK, 2002); на 5-й международной конференции «Lymphedema Network International Conference» (Chicago, USA, 2002), CLEO-03 (Baltimore, USA, 2003).

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Использование цифровой трансмиссионной микроскопии позволяет проводить детальный анализ микролимфодинамики in vivo в остром и хроническом эксперименте. 2. Наиболее эффективная интенсификация лимфотока в интактных микрососудах может быть достигнута за счет стимуляции спонтанных фазных сокращений и работы клапана. 3 Важным фактором, запускающим работу клапана, является изменение латерального натяжения сосудистой стенки.

4. При оценке эффективности лимфодренажной функции микрососудов необходимо учитывать осцилляторный характер движения лимфы и определять соотношение объема лимфы, выбрасываемого в центрипетальном направлении, к объему ретроградного заброса за единицу времени.

5. Применение комбинированной техники, включающей метод цифровой трансмиссионной микроскопии и спекл-корреляционный метод, повышает

объективность и информативность комплексного исследования микро-лимфодинамики.

6. Оксид азота и Р-адренореактивные структуры принимают участие в регуляции лимфотока.

7. Разработанные экспериментальные модели острой и хронической лимфе-демы и острой венозной недостаточности позволяют исследовать нарушения микролимфодинамики на разных стадиях развития отека.

8. Функциональное состояние лимфангионов существенно изменяется при низкоинтенсивном лазерном воздействии, местном применении ДМСО, действии никотина и деструкции кровеносных сосудов с помощью импульсного лазера.

9. При оптическом просветлении тканей с целью повышения эффективности оптической томографии, фотодинамической терапии, фотодеструкции микрососудов и других глубинных структур иммерсионное просветляющее действие зависит от свойств осмотически активного агента.

Публикации. По теме диссертации опубликовано свыше 60 научных работ, в числе которых глава в коллективной монографии, 12 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах, статьи в тематических сборниках и трудах научных конференций.

Личный вклад соискателя. Личный вклад соискателя состоит в постановке основных задач диссертационно! о исследования, обосновании методов их решения, выборе объектов экспериментального исследования и экспериментальных методик, проведении экспериментов, обработке и интерпретации полученных результатов. Представленный в работе алгоритм исследования микролимфодинамики, а также экспериментальные модели лимфедемы и венозной недостаточности разработаны автором самостоятельно. Разработка экспериментального оборудования выполнена совместно с доктором физико-математических наук, профессором Ульяновым С.С. и кандидатом физико-математических наук Федосовым И.В. На выбор направления научных исследований оказали существенное влияние научные идеи доктора медицинских наук, профессора Григория Ефимовича Брилля, докторов физико-математических наук, профессоров Валерия Викторовича Тучина и Владимира Павловича Жарова.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 306 страницах машинописного текста и состоит из введения, основной части, содержащей 8 глав,

заключения и списка использованной литературы. Указатель цитируемой литературы включает 473 источников, в том числе 60 ссылок на публикации автора по теме диссертации. Работа содержит 12 таблиц и иллюстрирована 87 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика работы, обоснована актуальность темы, показана ее научная новизна и практическая значимость, сформулированы цель, основные задачи и основные положения, выносимые на защиту, а также определен личный вклад соискателя, структура и объем диссертации.

В первой главе проведен краткий обзор современных представлений о структурно-функциональной организации и регуляции системы лимфомикро-циркуляции, намечены вопросы, которые являются малоизученными.

Далее приводятся результаты собственных экспериментальных исследований. Опыты выполнены на беспородных белых крысах массой 180-220 г, наркотизированных внутримышечным введением нембутала (40 мг/кг). Лимфатические микрососуды исследовали на брыжейке тонкого кишечника. Функциональное состояние системы микролимфоциркуляции исследовали с помощью цифровой трансмиссионной микроскопии (ЦТМ). За состоянием микроцирку-ляторного русла постоянно наблюдали на экране монитора. Одновременно изображение с микроскопа передавалось с помощью цифровой CCD камеры (Sony mini-DV, DCR-TRV6E или Cohu 2122) на персональный компьютер. Использовали стандартные программы видеозахвата - Adobe Premier 6.0 или Scion Image Software. Функциональное состояние микрососудов регистрировали в реальном времени в видимом свете. Видеоизображение (файлы *.mpg или *.tiff) обрабатывали в обычном и покадровом режимах с помощью пакетов стандартного программного обеспечения (Adobe Photoshop 7.0, Adobe Premier 6.0). Данный метод позволяет проводить прижизненную регистрацию параметров микролимфоциркуляции, не нарушая целостности сосуда с пространственным разрешением 0,5-0,3 мкм и временным разрешением - 40 мс (Рис. 1).

Изменение позиции фокальной плоскости микроскопа позволяет проводить мониторинг лимфатического микрососуда по глубине, и, таким образом, наблюдать и регистрировать движение клеток в центральной части лимфан-гиона. В результате скорость лимфотока измерялась, как линейная скорость поступательного движения клеток в центральной части лимфангиона в мкм/с.

Анализ работы лимфангионов с диаметром от 55 до 268 мкм (в среднем 147±3 мкм) показал, что лимфоток отмечается в 89% лимфангионов. Средняя скорость лимфотока составляет 262+6 мкм/с, однако в отдельных случаях ско-

рость движения лимфоцитов достигает 1 мм/с. Линейная корреляция между средней скоростью лимфотока и диаметром лимфангиона практически отсутствует (г=0,18, р>0,1). Этот факт принципиально отличает лимфодинамику от кровотока.

Рис. 1 Изображение участка брыжейки крысы при различных увеличениях с помощью ЦТМ. Хорошо визуализируются: А - участок лимфангиона с лимфотоком, его стенка, клапан и окружающиеся кровеносные микрососуды; Б - отдельные клетки, движущиеся в потоке лимфы, в частности В - эритроцит и Г - лимфоцит, которые хорошо дифференцируются по форме. Д - даже при больших увеличениях (х60, хЮО) в потоке крови в микрососудах диаметром более 15 мкм невозможно выделить движение отдельных клеток из-за низкого пространственно-временного разрешения метода (скорость движения клеток может быть зарегистрирована в пределах до 2-2,5 мм/с), а также высокой скорости (достигает 6-9 мм/с) и концентрации клеток в кровотоке.

Движение лимфы обычно носит возвратно-поступательный характер. Поскольку возвратно-поступательное движение лимфы в условиях in vivo до сих пор не исследовано, мы провели регистрацию величины абсолютной скорости и направления движения лимфы в течение 15с с временным разрешением 40 мс. Эти данные показали динамику изменения абсолютной скорости лимфото-ка в лимфангионе in vivo с учетом направления движения лимфы (Рис. 2).

На основании полученных результатов были вычислены следующие параметры: частота осцилляций лимфотока в 1 мин равная частоте изменения направления лимфотока за 1 мин; средняя продолжительность движения лимфы в прямом направлении (с); средняя продолжительность движения лимфы в обратном направлении (с); средняя линейная и объемная скорость лимфотока в центрипетальном (прямом) направлении (мкм/с); средняя линейная и объемная скорость лимфотока в ретроградном (обратном) направлении (мкм/с); объем лимфы, выбрасываемый за 1 минуту в прямом направлении (Р)\ объем лимфы, выбрасываемый за 1 минуту в обратном направлении (В) и отношение Р/В, позволяющее количественно оценить, насколько объем лимфы, выбрасываемый в прямом направлении, больше объема, выталкиваемого в обратном. По отношению Г/В можно определить эффективность дренажной функции лимфангиона. Величина обратного заброса может быть значительно меньше объема, выталкиваемого в проксимальный лимфагион (1-й лимфангион на Рис 3). Иногда лимфа только колеблется без поступательного движения (2-й лимфангион на

Таким образом, при анализе эффективности дренажной функции важно учитывать показатели возвратно-поступательного движения лимфы.

500

Рис. 2. График временной динамики скорости лимфотока за 15 с в лимфангионе со средним диаметром 170±5 мкм

Рис 3).

мым объемом (В) за 1 минуту в двух различных лимфангионах. Для первого лимфангиона /<76=3,75; для второго - Р/В=0,83.

Рис. 3. Соотношение объема лимфы, выбрасываемого в прямом направлении (Г) с ретроградно забрасывае-

Известно, что лимфа движется благодаря внутренним и внешним факторам. При этом внутренние силы (фазные сокращения, градиент внутрипросвет-ного давления, работа клапана, реологические свойства лимфы) играют основную роль в продвижении лимфы. Поэтому для понимания механизмов движения лимфы в лимфангионе представляется важным провести анализ внутренних факторов лимфотока и определить их влияние друг на друга и на лимфо-ток. Для этого в работе измеряли параметры фазной сократительной активности лимфангионов (частоту сокращений в 1 мин, амплитуду, продолжительность периода сокращения, устойчивой констрикции, расслабления, полною цикла фазного сокращения и паузы между циклами, рассчитывали средние скорости сокращения и расслабления лимфангиона, а также соотношения между длительностью различных фаз сократительного цикла), и работы клапана (частоту смыкания створок клапана, продолжительность периода смыкания и размыкания створок, периода закрытых створок, общую длительность цикла работы клапана и время между циклами).

Несомненный интерес представляет и определение внутрипросветного давления, однако известный на сегодняшний день метод измерения этого показателя в лимфатических микрососудах in vivo (servo-null micropressure system) является инвазивным для сосуда и, несомненно, будет приводить к заметным изменениям характера и величины скорости лимфотока. Учитывая этот факт и то, что существует тесная взаимосвязь между градиентом внутрипросветного давления и фазными сокращениями (Benoit J.N. et al, 1989), в данной работе мы ограничились подробным анализом фазных сокращений

Проведенные исследования показали, что фазная сократительная активность наблюдается примерно в половине (46-57%) интактных лимфаш ионов. Частота спонтанных сокращений равна 12,5±1,2 в 1 мин; амплитуда 29,4±8,9%. Чем больше диаметр лимфангиона, гем меньше амплитуда возникающих в нем спонтанных сокращений. Каждый цикл фазного сокращения

состоит из грех периодов: периода сокращения лимфангиона, периода устойчивой констрикции и периода расслабления. Количественный анализ показал, что в лимфангионах встречаются 2 типа фазных сокращений (Табл 1)

Первый тип сокращений регистрируется в 57% лимфангионов и характеризуется тем, что периоды сокращения и расслабления в среднем одинаковы по времени (по 26-27% от длительности цикла). Второй тип сокращений отмечается в 43% микрососудов. В отличие от 1 типа, продолжительность сократительного цикла достоверно увеличивается (р<0,02) за счет удлинения периода расслабления и уменьшения его скорости.

Таблица 1

Параметры сократительного цикла для разных типов сокращений (М±ш)

Показатель 1 тип, 2 тип,

Продолжительность цикла сокращения, с 2,22±0,26* 3,31 ±0,31*

Время сокращения, с 0,61+0,08 0,84±0,12

Скорость сокращения, мкм/с 23,13±4,32 26,33±5,90

Продолжительность фазы устойчивой констрикции, с 1,03±0,16 1,29±0,27

Время расслабления, с 0,58±0,07* 1,17±0,21 *

Скорость расслабления, мкм/с 24,13±4,33 17,00±3,63

* - достоверные изменения между соо1ветствующими показателями двух шпов сокращений, р<0,05

Наряду с фазными сокращениями, важное значение для продвижения лимфы имеет функция клапанов. В интактных условиях 36% всех исследуемых клапанов являются работающими со средней частотой 8,9±1,2 в 1 мин. Цикл работы клапана состоит из трех периодов: периода смыкания створок, периода закрытых створок (фаза плато) и периода размыкания створок (Табл. 2). Большую часть времени клапаны находятся в разомкнутом состоянии, давая лимфе свободно продвигаться. Соотношение по длительности паузы (створки открыты) к периоду работы клапана равно в среднем 1:5.

По данным литературы движение створок клапана определяется градиентом давлением до и после устья клапана и вязкостью лимфы. Влияние латс-ральною натяжения стенки лимфангиона на инициацию работы клапана экспе-

риментально не доказано. Мы установили, что фазная активность и работа клапана тесно связаны друг с другом. В 78% случаев работа клапана сочетается со спонтанными фазными сокращениями. Работе клапана способствую! такие условия изменения натяжения стенки, когда амплитуда фазных сокращений достаточно высока, а сокращения относятся ко второму гипу. При этом в большинстве ояучаев синхронно сокращается участок до и после устья функционирующего клапана, т.е. градиент давления практически не изменяется. Таким образом, створки клапана могут закрываться в результате изменения латерального натяжения стенки во время фазного сокращения. Более того, фазные сокращения влияют и на функционирующий клапан. Чем чаще сокращае!Ся лим-фангион, тем интенсивнее работает в нем клапан. Чем продолжительнее фазное сокращение, тем больше длительность цикла работы клапана.

Таблица 2

Параметры работы клапанов лимфатических микрососудов

Показатель Число Среднее Мини- Макси-

наблюдений значение, мальное мальное

(п) М+ш значение значение

Продолжительность

цикла работы 26 1,49+0,17 0,64 4,44

клапана, с

Длительность паузы, с 26 7,73±2,26 0,78 58,84

Время закрытия створок, с 26 0,19±0,01 0,08 0,32

Продолжительность фазы плато, с 26 1,10±0,16 0,20 4,00

Время открытия створок,с 26 0,20±0,02 0,08 0,40

Итак, все лимфангионы в зависимости от наличия фазных сокращений и работы клапана могут быть разделены на 4 группы (Табл. 3). В каждой из этих групп были определены частота встречаемости и оценены наиболее благоприятные условия для лимфодинамики. Установлено, что стимуляция лимфотока и, соответственно, дренажной функции лимфангионов является наиболее эффективной при сочетанной индукции в микрососудах фазной сократительной активности и работы клапана. Увеличение амплитуды и частоты фазных сокращений, обычно используемые как критерии стимуляции работы лимфан-

гиона в экспериментальных исследованиях, и повышение частоты работы клапана оказывают менее выраженное влияние на стимуляцию лимфотока.

Таблица 3

Параметры лимфомикроциркуляции при различных типах функциональной активности лимфаигионов

Тип функционирования Частота встречаемости (%) Диаметр лимфаигионов, М±ш Скорость лимфотока, М±ш

Сокращений нет клапан не работает 45 152,50±5,24 246,57± 10,61

Сокращений нет, клапан работает 4 113,17±5,03 195,50±15,63

Сокращения есть, клапан не работает 11 161,50+9,10 268,74± 15,46

Сокращения есть, клапан работает 40 146,18±5,30 280,04±12,97

Далее в наших исследованиях была предпринята попытка прижизненно охарактеризовать другой фактор лимфотока - реологические свойства лимфы. В настоящее время отсутствует техника, позволяющая проводить прижизненную регистрацию реологических свойств лимфы в микрососудах. Это диктует необходимость поиска хотя бы приблизительных и качественных вариантов оценки реологии лимфы.

Визуальное наблюдение за лимфотоком показало, что в условиях нормы в лимфотоке может наблюдаться внутрисосудистая агрегация клеток (Рис. 4), что в значительной степени может изменять реологию и биомеханику движения лимфы и являться естественным препятствием, приводящим к лимфостазу или заметному ослаблению лимфотока.

Рис. 4. Клеючный агре1ач, движущийся в просвете интактного лим-фангиона

В определенной степени внутрисосудистый реологический статус можег отражать концентрация клеток в лимфотоке. Мы определяли среднее количество форменных элементов в по гоке лимфы по числу лимфоцитов (N) в квадрате, площадью 50x50 мкм. Условно считали, что в просвете сосуда форменных элементов много при N>10, умеренное количество - при 3<N<10 и единичные лимфоциты - при 1<N<3. Оказалось, что в просвете 33% лимфатических микрососудов с лимфотоком клеток много, в 45% лимфапгионов встречается умеренное количество форменных элементов и в 22% - единичные. Реологические свойства потока являются оптимальными для лимфодинамики при умеренном числе клеток в потоке. Увеличение количества клеток в потоке сопровождается заметным уменьшением амплитуды фазных сокращений и увеличением частоты работы клапана (р<0,01).

На следующем этапе работы представляло интерес проанализировать возможности используемого метода и объекта экспериментального исследования лимфомикроциркуляции для получения информации о регуляции функции лимфангионов и действии вазоактивных факторов, о патогенезе лимфомикро-циркуляторных нарушений при патологических состояниях.

Известно, что выраженное модифицирующее влияние на лимфатические сосуды оказывает изменение количества оксида азота (N0) в тканях. Влияние N0 на состояние клапанного аппарата лимфангионов, фазные сокращения и скорость лимфотока практически не изучено. Остаются противоречивыми данные о действии на лимфодинамику блокаторов NO-синтазы. По нашим данным, аппликация экзогенного донора N0 - нитропруссида натрия (10'5 М) - в течение 15-минут вызывает, главным образом, расширение лимфангионов (на 25±2,5 мкм, р<0,05). При этом в 25% случаев наблюдается угнетение работы клапана (р<0,02), а в первые 5 минут аппликации - торможение фазной сократительной активности. В условиях блокады NO-синтаз с помощью N-нитро-Ь-аргинина (10"4 М) и, соответственно, уменьшения образования оксида азота в сгруктурах брыжейки из эндогенных субстратов наблюдается стимуляция фазной сократительной активности в 18% исходно неактивных лимфангионов (р<0,01), что приводит на фоне усиления вазомоций к увеличению на 13% линейной скорости лимфотока (р<0,05).

Важную роль в регуляции функции лимфангионов выполняют адренореак-тивные структуры. Влияние стимуляции и блокады p-адренореактивных структур на лимфатические микрососуды в экспериментах in vivo не изучено. По нашим данным, сшмуляция рг и р2-адренорецспторов изопреналином оказывает дозо- в время-зависимое действие на лимфатические микрососуды. Начиная с концентрации 10"5 М, на фоне прогрессирующего угнетения фазной ак-

тивности и вазоконстрикции определяется снижение скорости лимфотока с 220,1 ±23,0 до 110,1+22,4 мкм/с (р<0,001). |Згадреноблокатор (метопролол) и Рг-адреноблокатор (бутоксамин) индуцируют фазные сокращения в исходно неактивных лимфангиолах, но действие первого является более сильным: при действии меюпролола количество фазноактивных лимфангионов увеличивается на 66% (р<0,05), бутоксамина - только на 33% (р>0,2). В результате, метопролол в отличие от бутоксамина интенсифицирует лимфоток и, соответственно, дренажную функцию лимфангионов, несмотря на то, что блокада рг адренорецепторов уменьшает амплитуду фазных сокращений, а блокада р2-рецепторов ведет к росту частоты и амплитуды сокращений. Это является подтверждением правильности сделанного выше заключения о важной роли в стимуляции лимфотока увеличения количества лимфангионов, вовлеченных в фазную сократительную активность и имеющих работающий клапан.

Таким образом, в проведенных исследованиях получены доказательства активного участия N0, Рг и Рг-адренореакти вных структур в регуляции функции интактных лимфатических микрососудов. Полученные данные также свидетельствуют о значении базального уровня N0 в тканях брыжейки в регуляции функции лимфатических микрососудов и о наличии ингибиторного влияния р-адренореактивных систем на пейсмекерные структуры стенки лимфан-гиона.

При выборе лечебных средств и подборе их дозы в терапии разнообразных патологических состояний важное значение имеет оценка их возможных влияний на микроциркуляторное русло. Вместе с тем, действие многих широко применяемых вазоактивных лечебных агентов на систему лимфомикроцирку-ляции до сих пор остается неясным. К таким препаратам относится диметил-сульфоксид (ДМСО). Мы установили, что аппликация 30% раствора ДМСО уже в течение первых нескольких секунд аппликации на брыжейку вызывает наряду с хорошо известной дилатацией кровеносных микрососудов и повышением проницаемости венул, замедление и остановку кровотока в большинстве артериол и венул. Лимфотропные эффекты ДМСО разворачиваются относительно медленно и выявляются в полной мере через 15-20 минут аппликации. В 46% лимфангионов ДМСО вызывает лимфостаз, в остальных - на фоне умеренной констрикции микрососудов препарат приводит к стимуляции фазных сокращений (в 21% лимфангионов) и, соответственно, заметному увеличению скорости лимфотока (с 190,0±11,7 мкм/с до 233,3+19,6 мкм/с, р<0,05).

Наряду с фармакотерапией, в лечении многих заболеваний последние десятилетия достаточно эффективно применяются низкоинтенсивное гелий-неоновое лазерное излучение (ГНЛИ, >.=632,8 нм). Его противовоспалительное

и противоотечное действие хорошо известно Однако механизмы влияния ГНЛИ на лимфомикроциркуляцию изучены недостаточно. Нами показано, что непосредственное воздействие ГНЛИ на участок брыжейки с лимфатическим микрососудом (450 мВт/см2, 30 мин) вызывает умеренную дилатацию большинства лимфангионов (в среднем 8-12 мкм, р<0,05). При этом после 8-10-минутного латентного периода лазерный свет стимулирует высокоамплитудную сократительную активность в 40-45% исходно спокойных лимфангионов. Следовательно, одним из механизмов стимуляции лимфодренажной функции и ослабления отека при воздействии ГНЛИ является уникальное сочетание эффектов лазерного света: стимуляция фазной сократительной активности при увеличении емкости лимфомикроциркуляторного русла.

Таким образом, в проведенных исследованиях доказано, что блокатор N0-синтаз (Ы-нитро-Ь-аргинин), р,-адреноблокатор (метопролол), ГНЛИ, оказывая влияние на внутренние факторы лимфотока, эффективно стимулируют лим-фодренажную функцию на микроциркуляторном уровне и могут быть рекомендованы для апробации в лечении отечных состояний различного генеза.

Важная роль системы лимфоциркуляции в развитии различных патологических состояний не вызывает сомнений. К непосредственной патологии лимфатической системы относятся первичные и вторичные лимфедемы. Патогенез микрососудистых нарушений и их корреляция с тяжестью отека при лимфеде-ме остаются практически не изученными. Сложной задачей является создание экспериментальной модели лимфедемы. Не всегда объективна и стандартизирована методика измерений степени отека. Нами преложена новая модель экспериментальной лимфедемы на брыжейке крысы путем экстирпации регионарных лимфоузлов. К достоинствам данной модели можно отнести следующие: (1) создание отека, этиологически близкого к ситуации в клинике при постма-стэктомической лимфедеме после удаления регионарных лимфоузлов; (2) возможность проведения высокоразрешающего прижизненного мониторинга и количественной оценки функции микрососудов и лимфотока в них; (3) в отличие от моделирования отека на конечностях животных, значительное уменьшение возможности быстрого развития коллатерального лимфотока, что позволяет изучать хроническую лимфедему; (4) возможность применения количественного способа измерения степени отека.

В наших опытах для создания экспериментальной лимфедемы у животных удаляли цепочку регионарных мезентериальных лимфатических узлов. Состояние одного и того же лимфангиона было изучено до удаления лимфоузлов и в различные временные периоды (30 мин, 7 суток и 28 суток) развития лимфедемы, Для исключения влияния оперативного вмешательства и послеопера-

ционных изменений на изучаемые параметры были проведены контрольные серии экспериментов. У всех животных опытных и контрольных групп после последнего исследования функции лимфатических микрососудов определяли степень отека на основе прямого измерения степени гидратации ткани брыжейки путем высушивания и взвешивания. В результате экспериментов установлено, что брыжейка крысы является удобной экспериментальной моделью для изучения микроциркуляторных нарушений при острой и хронической лимфедеме. Отек начинает формироваться сразу после удаления лимфоузлов и сопровождается угнетением основного фактора лимфотока - фазной активности, уменьшением скорости движения лимфы и вазоконстрикцией в результате обрыва пренодальных сосудов. К 7-м суткам отток лимфы частично восстанавливается, но движение лимфы остается замедленным. Сосуды переполнены и дилатированы (на 13,9±3,6%, р<0,05), фазная активность практически во всех лимфангионах отсутствует, хотя клапанной недостаточности не наблюдается. В результате недостаточная дренажная функция лимфангионов у всех животных приводит к увеличению количества жидкости в ткани брыжейки до 0,85±0,06 г воды на 1 г сухого остатка (в контрольной группе - 0,39+0,07, р<0.01). Изменения со стороны кровеносного звена микроциркуляторного русла (увеличение просвета окружающих венул и расширение сети кровеносных микрососудов) могут выполнять двоякую роль: способствовать прогрессированию отека за счет увеличения площади фильтрации или приводить к его ослаблению в результате увеличения венулярного оттока. Дальнейшие изменения при лимфедеме и их тяжесть обусловлены соотношением факторов компенсации и декомпенсации, которое зависит от индивидуальных особенностей организма. Через 28 дней мы получили большой разброс в степени отека: у части животных он компенсировался, у других сохранялся и достигал высоких значений (до 79% от значений в контроле). Дилатация лимфангионов прогрессировала (на 43,6±10,6%, р<0,01). Наряду с функциональными нарушениями выявлялись и структурно-дегенеративные, о чем свидетельствовало наличие микроаневризм стенки лимфангиона. Наблюдаемое в ряде случаев нарушение функции лимфангионов без заметного отека доказывает существование латентной стадии лимфедемы. Описанные изменения в контрольных группах животных не регистрировались.

В отдельной серии экспериментов нами воспроизводилась острая венозная недостаточность, создаваемая путем лигирования собирающей брыжеечной вены. При этом наблюдаются стазы в венулах, замедление кровотока с постепенным развитием стазов в артериолах и появление множественных геморра-гий вокруг венул. В развитие микроциркуляторных расстройств участвуют и

лимфатические микрососуды. Резко нарастающий отек сдавливает лимфатические микрососуды, что приводит к заметному уменьшению их диаметра, подавлению фазной активности и, соответственно, резкому уменьшению скорости лимфотока (с 141,3±7,3 до 53,7+4,2 мкм/с, р<0,05). Последнему также способствует нарушение реологических свойств лимфы за счет увеличения в лимфе концентрации форменных элементов и изменения клеточного состава лимфы, в котором преобладают эритроциты (увеличивается вязкость).

Нарушения функции лимфатических микрососудов могут играть важную роль в механизмах развития других патологических состояний. Нами установлено, что никотин, наряду с кровеносными, поражает и лимфатические микрососуды. При аппликации 10 мМ раствора никотина найдено его прямое влияние на сократительные элементы сосудистой стенки лимфангионов, которое может возникать уже через 3-5 с и проявляется кратковременной констрикцией (диаметр уменьшается с 127,3±11,6 мкм до 84,4±12,3 мкм, р<0,05) продолжительностью 12-40 с с последующим нарушением движения стенки во время фазных сокращений. В условиях хронической никотиновой интоксикации, развивающейся через 14 дней после подкожной инъекции мини-осмотической помпы (объем 0,23 мл 10 мМ раствора никотина, 0,5 мл/час), аналогичная доза препарата не вызывает каких-либо нарушений лимфо- и гемомикроциркуляции вследствие адаптации организма к действию никотина.

В последние годы в хирургической практике для локального разрушения мелких кровеносных сосудов при сосудистых аномалиях успешно применяют высокоинтенсивное импульсное лазерное воздействие. При этом функция окружающих лимфатических микрососудов не изучалась. Нами найдено, что высокоинтенсивные лазерные импульсы (>.=585 нм, продолжительность одного импульса 10 мс, плотность энергии 0,5-30 Дж/см2), вызывающие разрушение кровеносных микрососудов, приводят к выраженной констрикции (до облитерации) и замедление лимфотока в окружающих лимфангионах, что способствует ослаблению и выключению их из дренажной функции.

Итак, исследование лимфатических микрососудов брыжейки крысы с помощью ЦТМ позволяет получить важную информацию о физиологии и патофизиологии микролимфодинамики in vivo. Однако данный метод имеет ряд ограничений. (1) Детальное измерение скорости лимфотока, особенно при оценке возвратно-поступагельного движения является очень трудоемким и длительным. (2) Метод не применим, когда измерения скорости необходимо проводить в течение длительного интервала времени. (3) Сложные траектории движения клеток и их небольшое количество в визуализируемой плоскости поперечного сечения потока позволяют зарегистрировать в один и тот же интервал времени

движение только 2-3 клеток. (4) При достаточно высокой скорости лимфотока и большой концентрации форменных элементов идентифицикация траектории движения отдельных клеток становится невозможной. (5) По этой же причине скорость кровотока в большинстве окружающих кровеносных микрососудов не может быть оценена.

Эти ограничения были преодолены с помощью применения нового метода исследования, основанного на комбинации ЦТМ и различных модификаций спекл-корреляционного метода (СКМ). Сначала для оценки лимфомикроцир-куляции нами была проведена адаптация спекл-корреляционного метода с частотным анализом сигналов и использованием одного детектора (СКМ-1Д). Для этого в микроскоп был введен дополнительный оптический канал, в котором пучок света Не-Ые лазера (>.=632,8 нм) фокусируется на исследуемый микрососуд. Временные флуктуации интенсивности рассеянного спекл-поля регистрировались фотоприемником, преобразовывались, усиливались и записывались в виде реализации, которая обрабатывалась с помощью стандартных компьютер-пых программных пакетов. Для характеристики скорости вычисляли первый взвешенный спектральный момент, как показатель, пропорциональный средней скорости лимфотока (МО- С помощью ЦТМ измеряли диаметр микрососуда, параметры фазной активности и работы клапана. Установлено, что значение М1 в интактных лимфангионах (М]л) примерно в 10 раз ниже, чем в кровеносных микрососудах (М1К). Линейная корреляция диаметра микрососуда с М1Л отсутствует (г=-0,03), но определяется отчетливая обратная связь диаметра с М1К (г=-0,61, р<0,05). Полученные результаты хорошо согласуются с данными литературы, а также с данными, полученными при прямом измерении скорости микропотока с помощью трансмиссионной микроскопии. Измерения, выполненные СКМ-1Д, были также верифицированы в экспериментах с изучением действия ДМСО на микролимфодинамику. 15-минутная аппликация ДМСО аналогично результатам, установленным с помощью ЦТМ (см. выше), приводила к росту Ми! и, следовательно, увеличению скорости в лимфангионах с сохранившимся лимфотоком и фазными сокращениями. Таким образом, показатель М, при использовании СКМ-1Д, дает возможность быстро получать объективные данные об изменениях интегрального значения скорости движения лимфы или крови в микрососудах. Несомненно, что исследование микролим-фодинамики с использованием комбинированной установки предпочтительнее. Однако данная модификация комбинированного метода имеет ряд недостатков, поскольку (1) не может быть использована для измерения направления движения потока; (2) позволяет определять только относительные изменения скоро-

сти, а (3) регистрация видео- и спекл-сигналов проводится на одном и том же участке лимфангиона не одновременно, а последовательно

Для ликвидации этих недостатков была применена модификация спекл-корреляционного метода с двумя пространственно-разделенными детекторами (СКМ-2Д). Центры фотоприемников располагались в ^плоскости движения клетки так, что при записи получались две подобные функции, но с задержкой во времени относительно друг друга. Эта задержка соответствовала времени, которое необходимо, чтобы спекл-поле преодолело дистанцию между двумя детекторами. Одновременная регистрация видео- и спекл-сигналов была выполнена благодаря использованию красного и зеленого светофильтров. Калибровка усовершенствованного метода была успешно проведена в нашей лаборатории на тонкостенной пластиковой капиллярной трубке диаметром 200 мкм, заполненной водой со взвешенными частицами (Федосов И.В., Тучин В.В., 2002). Далее представленная установка была тестирована нами на интактном лимфатическом микрососуде брыжейки крысы ш vivo (Рис. 5).

Рис. 5. Схема установки: 1 - крыса, 2

- термостабилизируемый столик, 3 -цифровая CCD камера, 4 - зеркало, 5

- осветитель, 6 - компьютер, 7 и 10

- светоделительный кубик, 8 - объектив микроскопа, 9 - лазер, ,11-фотодетекторы, 12 - усилитель, 13 и 14 - зеленые фильтры, 15 - красный фильтр.

Зависимость измеренных с помощью ЦТМ абсолютных значений скорости лимфотока от времени в течение этого периода представлена на рисунке 6, кривая 1. Кривая 2 демонстрирует временную динамику относительных изменений скорости потока на том же участке лимфагиона, строго в тот же интервал времени, но зарегистрированную с использованием СКМ-2Д. Наложение этих двух графиков показывает хорошее взаимное соответствие измерений.

Высокие значения коэффициента корреляции линейной регрессии (0,996) в модельных экспериментах и в опытах на лимфатическом микрососуде ш vivo (0,72) доказывают достоверную взаимосвязь между значениями скорости, измеренными обоими методами. Некоторый незначительный разброс значений скорости может быть связан с погрешностями биомикроскопических измере-

ний скорости, описанными выше. При обработке спекл-сигнала регистрировался интегральный показатель средней скорости всех клеток, проходящих в данный интервал времени через поперечное сечение микрососуда. В целом, трансмиссионная микроскопия позволяет калибровать относительные величины скорости, полученные с помощью СКМ-2Д, а регрессионная прямая может быть использована в качестве калибровочной для определения абсолкиной величины скорости лимфотока в микрососудах.

Рис. 6. Зависимость скорости лимфотока от времени в лимфангио-не диаметром 150 мкм, полученная при использовании ЦТМ (1) и с помощью СКМ-2Д (2).

Таким образом, усовершенствование комбинированного метода позволило устранить его основные ограничения. В результате интегральный показатель средней скорости лимфотока с учетом направления этого движения может быть получен с помощью СКМ-2Д и, соответственно, количественные показатели возвратно-поступательного движения лимфы могут быть легко определены При этом одновременно другие параметры лимфомикроциркуляции могут быть измерены с использованием ЦТМ. Нами был разработан алгоритм экспериментальных исследований микролимфодинамики irt vivo, позволяющий оценить состояние тимфомикроциркуляции в физиологических условиях, при действии вазоактивных факторов и в условиях патологии

Базовый алгоритм исследования

1. Запись сигналов с помощью ЦТМ и СКМ-2Д проводится одновременно в одной и юй же области исследуемого лимфангиона в течение одного и того же промежутка времени.

2. Измерение и вычисление следующих параметров:

с помощью модуля ЦТМ - диаметр микрососуда; фазная сократительная активность лимфангионов (количество лимфангионов, обладающих спонтанной сократительной активностью (%); частота и амплитуда фазных сокращений); функция клапана (количество лимфангио-

нов с работающим клапаном (%), частота смыкания створок клапана).

с помощью СКМ-2Д - параметры лимфотока: средняя скорость движения лимфы с учетом его направления, временная динамика скорости лимфотока, частота осцилляции лимфотока в 1 мин, отношение объема лимфы, который выбрасывается за 1 мин в центрипегальном направлении, к объему обратного потока.

Данный базовый алгоритм позволяет проводить быструю оценку основных параметров функционального состояния лимфомикроциркуляторного русла. В зависимости от поставленных в исследовании задач он может быть значительно расширен, в частности, для оценки функционального состояния окружающих лимфангион кровеносных микрососудов (диаметр, скорость кровотока и т.д.) практически без увеличения времени для регистрации данных и без значительного усложнения их обработки.

Таким образом, применение комбинированного когерентно-оптического метода для количественного определения параметров микролимфодинамики показало его простоту, надежность и информативность. Вместе с тем в клинике и эксперименте важно исследовать микроциркуляцию не только на брыжейке, но и в других органах и тканях, и, прежде всего, в такой хорошо доступной ткани, как кожа. Применение оптических методов для исследования микроцир-куляторного русла кожи часто ограничено небольшой глубиной зондирования ткани. Возможным решением этой проблемы является уменьшение на короткий отрезок времени (диагностический период) коэффициента рассеяния ткани с помощью пропитывания иммерсионными растворами. С другой стороны, есть указания, что такие растворы, в частности глюкоза и глицерин, изменяют функцию микрососудов. В настоящее время установлена только феноменология эффектов. Различия в действии просветляющих агентов на оптические свойства ткани и на сосудистое русло до сих пор остаются практически не изученными.

Для решения этой задачи нами регистрировались оптические свойства кожи после внутрикожного введения растворов глицерина (75%) и глюкозы (40%) (Рис. 7).

Исследования кровеносных микрососудов irt vivo проводились на брыжейке крысы с помощью ЦТМ. Сравнение просветляющих эффектов показало, что действие глюкозы и глицерина ведет к изменению оптических свойств ткани и позволяет хорошо визуализировать небольшие кровеносные сосуды кожи крысы. При этом при введении глюкозы, в отличие от глицерина, уменьшение ко-

эффициента рассеяния и отражения более выражено. На 700 нм максимальное падение коэффициента отражения относительно интактных значений составляет 70% на фоне действия глюкозы, и только 30% - при введении ишцерина. Однако просветляющий эффект раствора глюкозы по продолжительности короче.

Со стороны микроциркуляторного русла оба препарата вызывают дилата-цию кровеносных микрососудов, кратковременное замедление кровоюка и локальный стаз Выявленные изменения микроциркуляции потенциально обратимы, строго локальны и регистрируются только в месте введения просветляющего агента. При этом действие глицерина является более длительным, более локальным и ведет к развитию местного внутрисосудистого гемолиза в области стазов При аппликации глюкозы стазы развиваются не во всех микрососудах, более кратковременны, но в большей степени выражена вазодилатация

Установленные особенности являкнея, вероятнее всего, следствием различий механизмов взаимодействия иммерсионных жидкостей со структурами ткани, сосудистой стенки и клетками крови. Так, изменение рассеивающих свойств кожи при введении глюкозы может быть связано, с одной стороны, с общим для всех просветляющих агентов действием - пропитыванием внесосу-дистого пространства и выравниванием показателей преломления между компонентами ткани. С другой стороны, глюкоза може! проникать в кровеносные сосуды: часть ее соединяется в плазме с белками, другая часть входит в эритроциты и взаимодействует с гемоглобином. В частности, нами была проведена оценка показателя преломления раствора гемоглобина (140 г/л) при различных концентрациях глюкозы (от 0 до 30%) с помощью оптической когерентной томографии (Х=820 нм и 1300 нм).

Сравнение полученных экспериментальных данных и расчетов, сделанных при условии, что глюкоза не взаимодействует с гемоглобином, показали следующее. При концентрациях глюкозы, не вызывающих просветляющего эффекта (до !%), возникает характерная динамика изменения показателя прелом-

Рис. 7. Схема экспериментальной установки для определения оптических свойств кожи: 1 - галогенная вольфрамовая лампа, 2 - волоконно-оптический датчик спекфометра, 3 -"У'-образный волоконный датчик спектрометра, 4 - регистрирующее и записывающее устройство спектрометра, 5 - компьютер, 6 - крыса.

ления раствора, не наблюдаемая в динамике расчетных показателей (Рис. 8А) и, поэтому связанная, скорее всего, с образованием молекул гликированного гемоглобина (ОНЬ) с новыми оптическими свойствами

Поскольку похожая динамика изменения показателя преломления найдена и для цельной крови, важной причиной изменения оптических свойств крови может быть образование ОНЬ. При высоких концентрациях глюкозы (от 1 до 30%), которые могут наблюдаться при вхождении части глюкозы в эритроциты, регистрируется заметный прогрессивный рост показателя преломления, аналогичный увеличению расчетных значений (Рис. 8Б). Из этого следует, что при гиперосмотических концентрациях глюкозы оптические свойства крови могут заметно изменяться в результате прогрессирующего накопления в эритроцитах свободных молекул глюкозы.

1 3»

1 ЗМ I 1JU

I 1 331 85 1.35«

; (.И» 1 34»

v

4'

б N ммпмммиогям кймцмлращм глмкфзы. мг%

1 S 10 18 20 25 30 концентрация глюкозы, %

А Б

Рис. 8. Изменение показателя преломления раствора гемоглобина (140 г/л) при увеличении концентрации в нем глюкозы: А - с 0 до 1% (1000 мг%) и Б - от 1 до 30%; сплошная прямая линия - вычисленные значения.

Таким образом, техника просветления ткани с использованием осмотически активных веществ может быть использована для повышения эффективности оптической томографии, фотодинамической терапии и для проведения неинвазивного имиджинга кровеносных микрососудов in vivo. Локальная остановка кровотока в «прозрачном окне» может быть полезной при хирургическом лечении высокоинтенсивными лазерами сосудистых аномалий кожи. Остановившийся кровоток позволяет заметно уменьшить дозу лазерного воздействия. Возникающее при действии иммерсионных веществ оптическое просветление кожи и стазы в кожных сосудах дают возможность увеличить глуби-

ну проникновения лечебного лазерного света, а визуализация сосудов при просветлении позволяет проводить более точно лазерную деструкцию.

Основные результаты и выводы.

1. Цифровая трансмиссионная микроскопия является информативным, простым, доступным, и одновременно относительно дешевым методом, позволяющим проводить исследования микролимфодинамики для in vivo без нарушения целостности сосуда и в режиме реального времени. Метод может быть адаптирован для изучения возвратно-поступательного характера движения лимфы в микрососуде, анализа фазных сокращений и работы клапана.

2. Использование брыжейки крысы в качестве объекта для исследования микролимфодинамики in vivo позволяет реализовать высокоразрешающий информативный оптический мониторинг лимфатических микрососудов и окружающих кровеносных микрососудов в режиме реального времени, провести детальный количественный анализ функции лимфангионов и проанализировать характер взаимосвязей между основными показателями микролимфодинамики при исследовании одного и того же участка лим-фангиона в течение длительного периода наблюдения в остром и хроническом эксперименте.

3. Специфика микролимфодинамики заключается в отсутствии зависимости скорости движение лимфы от диаметра микрососуда, но лимфоток и, соответственно, дренажная функция, заметно усиливаются при сочетанной стимуляции фазной сократительной активности и работы клапанов в лимфатическом микрососуде. Поскольку движение лимфы имеет возвратно-поступательный характер, для оценки эффективности дренажной функции важно определять соотношение лимфы, выбрасываемой лимфангионом в прямом и ретроградном направлениях (отношение F/B).

4. Полученные данные позволили выявить важные функциональные особенности внутренних факторов лимфотока и характер взаимосвязей между основными внутренними факторами лимфотока. Выделены 2 функциональных типа фазных сокращений, найдены тесные взаимосвязи между параметрами сокращений стенки и работой клапана, экспериментально доказана гипотеза влияния латерального натяжения стенки лимфангиона на инициацию работы клапана.

5. Заметное влияние на микролимфодинамику оказывают изменения реологических свойств лимфы В частности, концентрация клеток в потоке лимфы является важным параметром, который заметно влияет на скорость

лимфотока, амплитуду фазных сокращений и частоту работы клапанов. Даже в физиологических условиях в лимфотоке может наблюдаться внут-рисосудистая агрегация клеток.

6 Несмотря на высокую информативность, установлен ряд ограничений метода цифровой трансмиссионной микроскопии для исследования микро-лимфодинамики. Применение комбинации цифровой трансмиссионной микроскопии v и спекл-корреляционного метода с двумя пространственно-разделенными детекторами дало возможность, сохранив все достоинства ЦТМ, устранить ее основные недостатки. Установка, созданная на базе комбинации этих методов, была адаптирована для прижизненного неинвазивного исследования микролимфодинамики. В результате предложен алгоритм для прижизненного исследования микролимфодинамики, который является перспективным базисом для решения различных задач физиологии и патофизиологии микролимфодинамики.

7. Получены доказательства участия оксида азота и ß-адренореактивных структур в регуляции функции лимфатических микрососудов Блокада N0-синтаз и ßi-адренорецепторов оказывает влияние на внутренние факторы лимфотока и эффективно стимулирует лимфодренажную функцию на микроциркуляторном уровне.

8. • Созданные на брыжейке крысы модели острых и хронических патологиче-

ских процессов позволили получить информацию о важных звеньях патогенеза нарушений микролимфодинамики при острой и хронической лим-федеме, острой венозной недостаточности, действии никотина.

9. Установлены ранее неизвестные механизмы влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на микролимфодинамику, а также особенности ответа лимфангионов при локальной деструкции кровеносных микрососудов высокоинтенсивным импульсным лазерным излучением.

10. Просветление ткани с использованием осмотически активных веществ может быть рекомендовано для визуализации мелких кровеносных сосудов с учетом специфики свойств применяемого просветляющего агента.

Основные результаты диссертации отражены в следующих работах

1. Ульянов С.С., Брилль Г.Е., Захарова (Галанжа) Е.И. Исследование микроциркуляции с использованием явления дифракции сфокусированных лазерных пучков// Физическая медицина. - 1994. - Т. 4. - N 1-2. - С. 39.

2. Беднов A.A., Ульянов С.С., Тучин В.В., Захарова (Галанжа) Е И, Исследование динамики лимфотока методами спекл-интерферометрии// Прикладная нелинейная динамика. - 1996. - Т.4. - N 3. - С.42-51.

3. Бедное А.А., Захарова (Галанжа) Е.И. Оптический мониторинг движения лимфы в микрососудах// В сб.: Проблемы оптической физики. - Саратов, 1997.-С. 152-153.

4. Брилль Г.Е., Захарова (Галанжа) Е.И. Модификация лазерным излучением лимфоконстрикторного действия стафилококкового токсина// Лазерная техника и оптоэлектроника. - 1992. -N 1-2. - С. 36-39.

5. Брилль Г.Е., Захарова (Галанжа) Е.И Влияние диметилсульфоксида на изменения лимфомикроциркуляции, вызванные стафилококковым токсином// Эксперим. и клиническая фармакология. - 1998. - Т. 61. - N 4. - С.54-56.

6. Брилль Г.Е., Галанжа Е.И., Ульянов С.С. и соавт. Функциональная организация лимфатических микрососудов брыжейки крысы// Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. - 2001 - Т. 87. - N 5. - С.600-607.

7. Галанжа Е.И., Брилль Г.Е., Соловьева А.В. и соавт. Участие оксида азота в регуляции функции лимфатических микрососудов// Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. - 2002. - Т. 88. -N 6. - С. 801-807.

8. Соловьева А.В., Галанжа Е.И., Степанова Т.В. и соавт. Изменение лимфомикроциркуляции при патологическом стрессе// Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. - N9 - С. 280-282.

9 Федосов И В , Галанжа Е.И., Соловьева А.В. и соавт. Лазерный мониторинг скорости потока в лимфатических микрососудах с использованием пространственно-временной корреляции динамического спекл-поля// Письма в ЖТФ. - 2002. - Т. 28. - Вып. 16. - С. 58-64.

10. Федосов И.В., Тучин В.В., Галанжа Е.И. Регистрация динамики лимфотока в микрососудах с использованием корреляционных свойств рассеянног о когерентного излучения// Квантовая электроника. - 2002. - Т.ЗЗ. - N 11. - С. 970-974.

11. Bednov A.A., Ul'yanov S.S., Tuchin V.V., Brill G.E., Zakharova (Galan?ha) E.I., Speckle diagnostics of shuttle-stream lymph and blood flows// Proc. SPIE. -1996.-V. 2678.-P. 416-422.

12. Ul'yanov S.S., Tuchin V.V., Bednov A.A., Zakharova (Galanzha) E.I. et al. The application of Speckle Interferometry for the Monitoring of Blood and Lymph Flow in Microvessels// Lasers in Medical Science. - 1997. - N 12. - P. 31-41.

13. Bednov A.A., Ul'yanov S.S., Tuchin V.V., Brill G.E., Zakharova (Galanzha) E.I., Investigation of lymph flow dynamics using methods of speckle interferometry// Proc. SPIE. - 1997. - V. 3177. - P. 89-96.

14 Bednov A.A., Zakharova (Galanzha) E.I., Tuchin V.V. et al. Investigation of statistical properties of lymph-flow dynamics using speckle microscopy// Proc. SPIF,- 1997. V. 2981. - P. 181-190.

15. Brill G.E., Tuchin V.V., Zakharova E.I. et al. Influence of low power laser irradiation on lymph microcirculation at the increasing of NO production// Proc. SPIE.- 1999.-V. 3726.-P. 157-162.

16. Starukhin P., Ulyanov S., Galanzha E. et al. Blood-flow measurements with a small number of scattering events// Applied Optics. - 2000. - V. 39. - N 10. - P. 2823-2829.

17. Galanzha E.I., Brill G.E., Tuchin V.V. et al. Analysis of lymph flow in microves-sels by biomicroscopic and coherent optical methods// Proc. SPIE. - 2000. - V. 4001.-P. 166-173.

18. Galanzha E.I., Brill G.E., Ulyanov S.S. et al. Peculiarities of lymph flow in mi-crovessels// Proc. SPIE. - 2000. - V. 3923. - P. 149-154.

19. Galanzha E.I., Ulyanov S.S., Tuchin V.V. et al. Comparison of lymph and blood flow in microvessels: coherent optical measurements// Proc. SPIE. - 2000. - V. 4163.-P. 94-98.

20. Galanzha E.I., Ulyanov S.S., Tuchin V.V. et al. Imaging of lymph flow in single microvessels in vivo// Proc. SPIE. - 2000. - V. 4224. - P. 317-321.

21. Galanzha E.I., Tuchin V.V., Luo Q. et al. The action of osmotically active drugs on optical properties of skin and state of microcirculation in experiments// Asian Journal of Physics. -2001. -V. 10.-N4.-P. 24-31.

22. Galanzha E.I. Biomicroscopic and speckle-interferometric measurement of lymph flow velocity in single microvessels in norm and in drug application// Proc. SPIE. - 2001. - V. 4241. - P. 461-466.

23. Galanzha E.I., Tuchin V.V., Ulyanov S.S. et al. Optical properties of lymph flow in single microvessels: biomicroscopic, speckle-interferometric, and spectroscopic measurements// Proc. SPIE. - 2001. - V. 4434. - P. 197-203.

24. Galanzha E.I., Solov'eva A.V., Brill G.E. et al. Monitoring of lymph flow in microvessels by biomicroscopy and speckle-interferometry// Proc. SPIE. - 2001. -V. 4251.-P. 210-214.

25. Solov'eva A.V., Brill G.E., Galanzha E.I. et al. Stress-induced changes in lymph microcirculation// Proc. SPIE. - 2001. - V. 4241. - P. 309-311.

26 Solov'eva A.V., Brill G.E., Galanzha E.I. et al. Biomedical applications of coherent-optical methods for the analysis of lymph flow in microvessels// Proc. SPIE. - 2001. - V. 4434. - P. 223-226.

27. Bednov A.A., Tuchin V.V., Brill G.E., Ul'yanov S.S., Galanzha E.I., Investigation of lymph flow characteristics using speckle-interferometrical method// Proc. SPIE. - 2001. - V. 4515.-P. 177-184.

28. Galanzha E.I., Brill G.E., Aizu Y. et al. Speckle and Doppler Methods of Blood and Lymph Flow Monitoring// Chapter in book- Handbook of Optical Biomedical diagnostics. - SPIE Press, PM107, Bellingham, USA, 2002. - P. 875-937.

29 Galanzha E.I., Tuchin V.V., Solov'eva A.V. et al. Development of optical diagnostics of microlymphatics at the experimental lymphedema: comparative analysis//J. X-Ray Sei. and Techno!. - 2002. - V. 10.-P. 215-223.

30. Fcdosov I.V., Tuchin V.V., Galanzha EI. et al. Recording of lymph flow dynamics in microvessels using correlation properties of scattered coherent radiation// Quantum Electronics. - 2002. - V. 32. - N 11. - P. 970-974.

31. Galanzha E.I., Tuchin V.V., Solov'eva A.V. et al. Development imaging and experimental model for studying pathogenesis and treatment efficacy of postmas-tectomy lymphedema// Proc. SPIE. - 2002. - V. 4624. - P. 123-129.

32. Galanzha E.I., Fedosov I.V., Solov'eva A.V. et al. In vivo lymph dynamic monitoring using speckle-correlation technique and light microscopy// Proc. SPIE. -

2002.-V. 4624.-P. 130-133.

33. Galanzha E.I., Tuchin V.V., Luo Q. et al. The effects of different doses of glucose on scattering properties of skin// Proc. SPIE. - 2002. - V. 4707. - P. 244247.

34. Galanzha E., Tuchin V., Solov'eva A. et al. Development of experimental lymphedema in a new animal model// Abstarct of 5th National Lymphedema Network International Conference, August, Chicago, 2002. - P. 16.

35. Galanzha E.I., Solov'eva A.V., Stepanova T V. et al. Analysis of lymph microcirculation in norm, at the experimental lymphedema and pathological stress on animal model// J. Vase. Res. - 2002. - V. 39. - N 5. - P.30.

36. Zharov V.P., Galanzha E.I., Tuchin V.V. et al. Experimental lymphedema in a new animal model// Proc. of 5th National Lymphedema Network International Conference, August, Chicago. - 2002. - P. 16-17.

37 Galanzha E.I., Tuchin V.V., Solov'eva A.V. et al The diagnosis of lymph micro- *

circulation on rat mesentery in vivo// Proc. SPIE. - 2003. - V. 4965. - P. 325333.

38. Zharov V.P., Galanzha E.I., Tuchin V.V. et al. Experimental lymphedema in a new animal model// Online Magazine on Lymphedema, http://elymphnotes.org. -

2003.

39. Galanzha E.I., Solov'eva A.V , Tuchin V.V. et al. Application of optical coherence tomography for diagnosis and measurements of glycated hemoglobin// Proc. SPIE - 2003. - V. 5140. - P. 125-132.

40. Galanzha E. I., Tuchin V V., Solovieva A. V. et al. Skin backreflectance and microvascular system functioning at the action of osmotic agents// J. Phys. D: Appl.

Подписано в печать 12.01.20041. Формат 60X84 1/16. Бума! а офсетная. Печать трафаретная Объем 2,0 уел печ. л Тираж 100 экз. Заказ 2.

Типография «Саратовский источник» Лиц. ПД № 7-0014 от 29 мая 2000 г. г Саратов, ул Университетская, 42, оф. 22 тел.: 520-593

р „

т I

ОУ

РЫБ Русский фонд

2006-4 18338