Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микрофлора кишечника у больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микрофлора кишечника у больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий"

На правах рукописи

0055ЭЭ1*-

ЛИХАНСКАЯ ЕЛЕНА ИВАНОВНА

Микрофлора кишечника у больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ОКТ 2013

Москва - 2013

005535120

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Кандидат медицинских наук Пожалостина Любовь Владимировна

Заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор Грачёва Нина Михайловна

Официальные оппоненты:

Митрохин Сергей Дмитриевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологииим. В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий отделом микробиологии и клинической фармакологии

Токмалаев Анатолий Карпович, доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный врач РФ, Российский университет дружбы народов, профессор кафедры инфекционных болезней с курсом эпидемиологии

Ведущая организация: Государственное бюджетное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерств; " ~ Федерации

диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.

Защита состоится

в 10 часов на заседании

10.

Автореферат разослан <_ _ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного сов доктор медицинских наук

Борисова Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Одной из актуальных проблем современной микробиологии является этиологическая расшифровка острых кишечных инфекций с учетом возрастающей роли «нетрадиционных» возбудителей, ранее считавшихся безопасными. Среди них всё большее значение в последние годы приобретают криптоспоридии - простейшие, поражающие эпителий желудочно-кишечного тракта и желчных протоков человека с развитием диареи. Попадая в организм человека, ооцисты криптоспоридии нарушают микроэкологическое равновесие кишечника и вызывают дисбаланс микробной флоры, которая является важным показателем резистентности организма к возникновению различных инфекционных заболеваний (Воеводин Д.А., 2001; Бондаренко В.М., 2007; Волжанин В.М., 2008). Разнообразные нарушения микробиоценоза кишечника при диарейных состояниях у больных, выделяющих криптоспоридии, могут служить пусковым механизмом возникновения и в дальнейшем поддержания патологических процессов (Романова Т.В., 1992; Грачёва Н.М., 2004). В связи с этим, определение состояния микрофлоры кишечника является актуальным для больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий.

Ранее считалось, что криптоспоридии являются причиной диарей при различных иммунодефицитных состояниях, в основном при СПИДе. Однако в настоящее время установлено, что криптоспоридии поражают человека и без выраженных иммунологических расстройств, особенно детей младшего возраста (Лысенко А.Я., 1996; Покровский В.И., 2006). Учитывая ухудшающуюся экологическую ситуацию, качественную недостаточность питания, водоснабжения, применение антибиотиков, иммунодепрессантов, рост вторичных иммунодефицитов среди населения, необходимо углубленное изучение состояния микрофлоры кишечника и распространённости криптоспоридиоза при развитии диарейных состояний.

Клиническая диагностика криптоспоридиоза сложна из-за неспецифического характера симптомов заболевания. Решающее значение для подтверждения диагноза этой инвазии имеет лабораторная диагностика, позволяющая обнаружить возбудителя в клиническом материале от больных (фекалии, рвотные массы, желчь, мокрота и др.). Диагностика криптоспоридиоза у больных диареями неустановленной этиологии в основном базируется на обнаружении ооцист криптоспоридий в фекалиях при микроскопических исследованиях (Бейер Т.В., 1987; Чистенко Г.Н., 1993; Грачёва Н.М., 2004) и нуждается в модернизации.

При лечении больных криптоспоридиозом применение противопротозойных препаратов малоэффективно. Данные литературы по лечению, особенно средне-тяжелых и тяжелых форм криптоспоридиоза, различными антибактериальными средствами также говорят об отсутствии выраженной эффективности (Якубовский М.В., 1994; Т^Ьей 0,М.,2000). В последние годы согласно рекомендациям ВОЗ назначалось лечение мономицином (паромомицином). Однако, эти препараты обладают высокой токсичностью и не применяются в педиатрии. В то же время

з

имеются экспериментальные исследования, свидетельствующие об антагонистической активности лактобацилл в отношении криптоспоридий, что позволяет включать в комплекс лечения пробиотические препараты, содержащие лактобактерии (Alak J.I.B., 1997 Грачёва Н.М., 2004; Саша V.A., 2007).

Все вышесказанное обуславливает актуальность научных исследований, направленных на определение особенностей состояния микробиоценоза кишечника у больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий и усовершенствование лабораторного обследования больных с диареями неустановленной этиологии.

Степень её разработанности

По данным ВОЗ в зарубежных странах в этиологической структуре ОКИ криптоспоридиоз является широко распространённой инфекцией и занимает 3-5 место, уступая лишь таким заболеваниям, как шигеллёз, сальмонеллёз, кампилобактериоз и ротавирусная инфекция (Покровский В.И. и др., 2003; Alves М., 2006; CamaV.A. 2007).

В России сведения о криптоспоридиозе пока немногочисленны и противоречивы. Учет и регистрация заболеваемости не проводится. Распространение криптоспоридий среди больных диареями неустановленной этиологии изучено мало (Романова Т.В., 1992; Дехнич A.B., 2001; Лысенко А.Я. и др., 2002; Волжанин В.М., 2008).

Целью исследования является определение особенностей микробиоценоза кишечника у больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, усовершенствование методов лабораторной диагностики, микробиологический контроль лечения лактосодержащими пробиотическими препаратами.

Задачи исследования:

1. Выявить распространение ооцисткриптоспоридий у взрослых и детей больных диареями неустановленной этиологии.

2. Определить качественный и количественный состав микробиоценоза кишечника у наблюдавшихся больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий.

3. Провести микробиологический контроль за состоянием микробиоценоза кишечника у больных диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, до и после проведения лечения пробиотическими препаратами.

4. Дать сравнительную оценку двух методов выявления криптоспоридий: микроскопического и иммунохроматографического.

Научная новизна

Впервые дана оценка изменений микробиоценоза кишечника у больных диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, указывающая на глубокие нарушения микрофлоры кишечника при криптоспоридиозе.

Получены новые данные о распространении криптоспоридий среди взрослых и детей, больных диареями неустановленной этиологии, свидетельствующие об их возрастающей роли в этиологии острых кишечных инфекций.

4

Впервые проведён микробиологический контроль за состоянием микробиоценоза кишечника и частотой выделения ооцист криптоспоридий у больных до и после назначения пробиотических лактосодержащих препаратов, показавших улучшение состояния микрофлоры кишечника и санацию организма от ооцист криптоспоридий.

Для повышения эффективности выявления ооцист криптоспоридий, помимо классического микроскопического метода мазков из фекалий установлена целесообразность использования иммунохроматографического теста.

Теоретическая и практическая значимость работы

Доказана значимость нарушений состояния микробиоценоза кишечника при криптоспоридиозе и научно обоснована тактика лабораторного обследования и лечения больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий.

Полученные результаты о высокой распространенности криптоспоридий у больных с диареями неустановленной этиологии свидетельствуют о необходимости обследования этой группы больных на криптоспоридиоз.

Выявленная положительная тенденция к нормализации показателей микробиоценоза кишечника и санация от криптоспоридий у больных с диареями неустановленной этиологии на фоне применения лактосодержащих пробиотических препаратов обосновывает целесообразность включения их в комплекс лечебных мероприятий.

Микроскопическое исследование колонобиоптатов на обнаружение криптоспоридий при назначении по медицинским показаниям ректороманоскопии будет способствовать уточнению диагноза и расшифровке патогенеза заболевания.

Применение иммунохроматографического теста для выявления криптоспоридий позволит осуществлять экспресс-диагностику криптоспоридиоза у больных с диареями неустановленной этиологии и проводить исследование при отсутствии специализированной лаборатории.

По материалам работы издано пособие для врачей «Диагностика, клиника, лечение и особенности распространения криптоспоридиоза», Москва, 2004 г. (Утверждено председателем секции Учёного совета МЗ РФ по эпидемиологии, инфекционным заболеваниям, вирусологии В.И. Покровским протокол №5 от 02.12.2004года).

Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле и практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей-бактериологов «Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии», проводимых на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2005; 2006;2009; 2010 гг.), а также в научно-практической работе лаборатории микробиологии и профилактики кишечных инфекций ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора и инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы.

Методология и методы исследования

Результаты диссертационной работы основаны на клинико-лабораторном обследовании 405 больных диареями неустановленной этиологии в период 2002- 2012 гг. Среди обследованных больных - взрослые, госпитализированные в инфекционное отделение ИКБ №1, - 219 человек; дети, находящиеся в отделении детских инфекционных болезней, - 106 человек; дети, амбулаторно наблюдавшиеся в КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, - 80 человек (таблица 1).

В работе использовали комплексные бактериологические, микробиологические, биохимические и иммунохроматографические методы исследования.

Комплексное обследование взрослых больных проводили совместно с врачами-инфекционистами клинического отдела МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора (руководитель - Заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Н.М.Грачева); детей - с врачами-инфекционистами детского инфекционного отделения МОНИКИ им. Владимирского (руководитель - д.м.н., профессор Л.В.Феклисова); при участии к.м.н., в.н.с. Т.В.Продеус (институт медицинской паразитологии и тропической медицины им.Е.И.Марциновского Первого МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава РФ).

Таблица 1. Характеристика обследованных больных и объём проведённых исследований.

Группы больных Количество больных Количество исследований микрофлоры кишечника Количество исследований на выявление ооцист криптоспоридий Возраст больных

Взрослые с ОКИ, находящиеся в стационаре 219 438 438 18-75 лет

Дети с ОКИ, находящиеся в стационаре 106 212 212 0-14 лет

Дети с ОКИ, амбулаторно обследованные вКДЦ 80 80 160 0-18 лет

Всего 405 730 810 0-75

Микробиологические методы исследования

Изучение микрофлоры кишечника проводили культуральным, биохимическим и микроскопическим методами согласно методическим рекомендациям «Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» (Москва, 1986 г.) и оценивали по отраслевому стандарту ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (2004г.)

Исследуемый материал в соответствующих разведениях высевали на диагностические среды для выявления и идентификации аэробных и анаэробных бактерий и грибов. Для выделения патогенных и условно-патогенных энтеробактерий использовали плотные питательные среды Плоскирева, Левина, Эндо (НПО «Микроген»), желточно-солевой агар для стафилококков («Диакон»); жидкие среды обогащения Мюллера, селенитовую, магниевую («НИЦФ») с последующим высевом на плотные среды. Основой для кровяного агара служил питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ) с добавлением 5 % бараньей крови. Для выделения и культивирования бифидобактерий использовали полужидкую печеночную среду Блаурокк («ГНЦПМБ»), для лактобацилл - жидкую среду MPC («Диакон»). Биохимическую индикацию энтеробактерий проводили на питательных средах фирмы «Диакон». Дрожжеподобные грибы рода Candida выделяли на среде Сабуро («Himedia», Индия).

При исследовании микрофлоры кишечника определяли количество бифидо- и лактобактерий, кишечной палочки с нормальной и сниженной ферментативной активностью, энтерококков, стафилококков, гемолизирующей кишечной палочки, условно-патогенных лактозонегативных энтеробактерий (клебсиелла, протей, энтеробактер, цитробактер и др. ), грибов рода Candida.

Для обнаружения ооцист криптоспоридий в фекалиях больного использовали метод модифицированного окрашивания кислотоустойчивых организмов карболфуксином по Цилю-Нильсену. Окрашенные мазки фекалий исследовали с помощью масляной иммерсионной системы микроскопа с увеличением не менее ЮООх (рисунок 1).

Ооцисты криптоспоридий также выявляли в мазках из колонобиоптатов при их окраске по модифицированному методу Циля-Нильсена и просматривали в световом микроскопе при объективе 90 и окуляре 7 (рисунок 2). Исследования проводили согласно методическому пособию для врачей "Диагностика, клиника, лечение и особенности распространения криптоспоридиоза" (2004г.).

Рисунок 1. Образец фекалий больного криптоспоридиозом. Стрелками

отмечены ооцисты криптоспоридий. Окраска по Циль-Нильсену.

Рисунок 2. Ооцисты криптоспоридий на поверхности эпителия слизистой оболочки. Окраска по Циль-Нильсену.

Иммунохроматографический метод исследования

Использовали стандартную тест-систему RIDA®QUICK Cryptosporidium (Германия) для иммунохроматографического анализа, согласно инструкции производителя ,RIDA®Quick Cryptosporidium является одностадийным иммунохроматографическим тестом, основанным на латекс-агглютинации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На основании проведенных лабораторных исследований у больных диареями неустановленной этиологии выявлено широкое распространение ооцист криптоспоридий.

2. Выраженные изменения микробиоциноза кишечника, обнаруженные у всех обследованных больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, обосновывают включение в схему лечения различных лактосодержащих пробиотических препаратов, что обеспечивает положительный эффект в плане восстановления микрофлоры кишечника и санации организма от ооцист криптоспоридий.

3. Помимо стандартного микроскопического метода обнаружения ооцист криптоспоридий в мазках из фекалий целесообразно использование иммунохроматографического метода.

Степень достоверности и апробация результатов

О достоверности полученных результатов свидетельствует значительное количество исследований, проведённых с помощью комплексных микробиологических, биохимических и иммунохроматографических методов с использованием поверенного, сертифицированного оборудования и адекватных методик статистической обработки результатов.

Диссертация апробирована на заседании секции «Эпидемиология, микробиология, клиника инфекционных заболеваний» Учёного совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол №1 от 28.03.2013г.

Основные положения и полученные результаты исследования представлены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе» (13-14 октября 2011г., Москва); X Всероссийском научно-практическом обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (12-13 апреля 2012 г., Москва); научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии» (21-22 сентября 2012 г., Иркутск).

По теме диссертационной работы опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 - в рецензируемых изданиях, 4 работы - в материалах конференций, 1- пособие для врачей, 1- раздел в руководстве по медицинской микробиологии.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, перспективы дальнейшей разработки темы, список литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 27 рисунками. Список литературы включает 204 источника, в том числе 111- отечественных и 93 - зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Особенности микробиоценоза кишечника у взрослых больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, и распространённость ооцист криптоспоридий у этих больных.

Проведены комплексные клинико-лабораторные обследования 219 взрослых больных, поступивших в стационар ИКБ № 1 с диареями неустановленной этиологии. Среди обследованных были преимущественно мужчины - 72,1%, в основном молодого и среднего возраста (18 - 40 лет) - 80,4%. Все больные были со среднетяжелым течением заболевания.

Больные, помимо общепринятых клинических мероприятий, обследованы на наличие ооцист криптоспоридий и определение состояния кишечной микрофлоры. Больных обследовали дважды при поступлении в стационар и в динамике после проведенного лечения.

Диагностика криптоспоридиоза у наблюдаемой группы больных основана на обнаружении ооцист криптоспоридий в фекалиях. У части больных, которым для уточнения характера основного заболевания назначали по медицинским показаниям с диагностической целью ректороманоскопию с взятием колонобиоптатов, проводили микроскопию мазков из колонобиоптатов на выявление ооцист криптоспоридий с окраской по Цилю - Нильсену. Эту работу выполняли совместно с ведущим научным

9

сотрудником клинического отдела д.м.н. И.Т. Щербаковым. Так, среди 219 взрослых больных метод микроскопии кала позволил выявить наличие криптоспоридий у 44 (20%) обследованных, а у 29 (13,3%) больных - из колонобиоптатов, что увеличило общий процент выявления криптоспоридий у наблюдавшихся больных до 33,3% (рисунок 3).

1*

микроскопическое исследование фекалий

микроскопическое

исследование колоноОиоптатов

всего обнаружено микроскопическим методом

О не обнаружены ооцисты

криптоспоридий

I обнаружены ооцисты

криптоспоридий

Рисунок 3. Обнаружение ооцист криптоспоридий у взрослых больных с диареями неустановленной этиологии.

Учитывая антагонистическую активность лактобактерий в отношении криптоспоридий, клиническим отделом ФБУН МНИИЭМ им .Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, принимая во внимание характер изменений микрофлоры кишечника у больных, разработаны методы лечения этих больных пробиотическими препаратами, особенно содержащими лактобактерии. В комплекс терапевтических средств включали пробиотические препараты (лактобактерин, хилак - форте) в традиционных дозах и курсах. Введение препаратов потребовало тщательного лабораторного контроля за состоянием микробиоценоза кишечника у больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий, и наблюдения за санацией организма от криптоспоридий.

Для оценки состояния микробиоценоза кишечника у взрослых больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий, были проанализированы результаты исследования микрофлоры кишечника у 73-хчеловек с определением степени дисбиотических изменений микрофлоры кишечника (рисунок 4).

При первичном обследовании у большинства 53 (72,6%) взрослых больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий, обнаружены глубокие дисбиотические изменения микрофлоры кишечника III степени; у 20 (27,4%) больных - II степени; изменений I степени не обнаружено. После проведенного лечения у обследованных лиц отмечали положительную динамик ус уменьшением степени дисбиотических

нарушений микрофлоры кишечника. Так, у 39 (53,4%) больных регистрировали изменения II степени, у 19 (26,0%) больных выявлены изменения I степени, в то время как III степень дисбиотических изменений отмечали лишь в 20,6% случаев (вместо 72,6% при первичном обследовании). Статистический анализ достоверности различий результатов первичных и повторных исследований микрофлоры кишечника показал, что различия достоверны.

Дисбиотические нарушения микрофлоры кишечника II степени характеризовались снижением содержания бифидобактерий до 107 КОЕ/г и ниже, лактобактерий до 105 КОЕ/г и ниже, повышением содержания гемолитических эшерихий и других условно-патогенных микроорганизмов в концентрации 10-10 КОЕ/г, появлением стафилококковой флоры в концентрации 107 КОЕ/г, грибов рода Candida - в концентрации Ю5КОЕ/г.

У больных с III степенью дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника наблюдали снижение содержания бифидобактерий до 10 КОЕ/г и ниже, лактобактерий до 105 КОЕ/г и ниже, обнаружение ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов в концентрации 10б-107 КОЕ/г и выше, повышение количества гемолитических эшерихий в концентрации 106-107 КОЕ/г и выше, появление стафилококковой флоры 108 КОЕ/г, грибов рода Candida - в концентрации 106 КОЕ/г.

Рисунок 4. Степени дисбиотических изменений кишечника у взрослых больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий, до и после лечения лактосодержащими пробиотическими препаратами.

Сравнение частоты выделения ооцист криптоспоридий у 219 больных с диареями неустановленной этиологии до и после применения лактосодержащих пробиотических препаратов показало, что при первичном обследовании ооцисты криптоспоридий обнаружены у 73 (33,3 %) человек, при повторном обследовании

11

отмечалось полное исчезновение ооцист криптоспоридий из фекалий на фоне общей коррекции дисбиотических нарушений в кишечнике (рисунок 5). Разница статистически достоверна,^ 10,5, что соответствует вероятности безошибочного прогнозар>95%.

Рисунок 5. Обнаружение ооцист криптоспоридий у взрослых больных с диареями неустановленной этиологии до и после лечения лактосодержащими пробиотическими препаратами.

Таким образом, впервые изучена распространённость криптоспоридий среди взрослых больных с диареями неустановленной этиологии и обнаружено, что у данных больных регистрируется высокая частота выделения криптоспоридий (33,3%), приводящая у большинства в (72,6% случаев) больных к глубоким дисбиотическим нарушениям микрофлоры кишечника, в основном III степени.

Полученные результаты микробиологического лабораторного контроля за состоянием микрофлоры кишечника и частотой выделения ооцист криптоспоридий после применения лактосодержащих пробиотических препаратов показали значительное улучшение микробиоценоза кишечника и на этом фонесанацию организма от ооцист криптоспоридий, что обосновывает включение этих препаратов в схему лечения.

Характеристика микрофлоры кишечника у детей больных диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий.

Проведено обследование 106 детей с острыми кишечными инфекциями различной бактериальной и вирусной этиологии, поступивших в специализированный стационар и получавших в составе комплексного лечения терапию пробиотиками. Все дети были обследованы на наличие ооцист криптоспоридий и выявление дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника.

Больные по возрасту распределились следующим образом: до Злет - 63 (59,4%) ребенка, от 3-х до 7 лет - 34 (32,1%), старше 7 лет - 9 (8,5%) пациентов, то есть

12

большую часть составляли дети до 3 лет, из них мальчиков было 47 (44,3%), девочек - 59 (55,7%). По тяжести течения заболевания у 13 (12,3%) больных было легкое течение, у 84 (79,2%) - средней тяжести, у 9 (8,5%) - тяжелое, то есть в основном регистрировалось средне - тяжёлое течение заболевания.

Все больные обследованы 2-х кратно при поступлении в стационар и после проведенного лечения. Лечение детей, наблюдавшихся в клинике, проводили в соответствии с общепринятыми принципами ведения больных с острыми диареями. Учитывая экспериментальные данные об антагонистической активности лактобактерий к криптоспоридиям, помимо базовой терапии применяли препараты флорин-форте и аципол.

При первичном обследовании ооцисты криптоспоридий были обнаружены у 31 (29,2%) ребенка, при повторном - у 6 (5,7%) детей (рисунок 6). Вычисленный критерий Стьюдента 1=2,8 показал соответствие вероятности безошибочного прогнозар>95%, т.е. разность статистически достоверна.

25,20

% 5,70%

□ Обнаружены ооцисты

криптоспоридий

■ Не обнаружены ооцисты криптоспоридий

Первичное обследование Повторное обследование

Рисунок 6. Обнаружение ооцист криптоспоридий у детей, больных ОКИ.

С целью характеристики микробиоценоза кишечника были проанализированы данные состояния микрофлоры кишечника у 31 ребенка, выделяющего ооцисты криптоспоридии, до и после лечения (рисунок 7).

При первичном обследовании у детей, выделяющих ооцисты криптоспоридии, обнаружены значительные дисбиотические изменения микрофлоры кишечника II степени и III степени в 41,9% и в 58,1% случаев соответственно, I степень дисбиотических нарушений не наблюдали. После проведенного лечения пробиотическими лактосодержащими препаратами при повторном обследовании произошло значительное улучшение состояния микробиоценоза кишечника. Так, I степень дисбиотических нарушений регистрировали в 67,1% случаев, II степень - в 16,1% случаев и III степень - в 16,1% случаев. Статистический анализ достоверности различий полученных результатов показал их статистическую достоверность.

□ I степень дисбиотических нарушений

□ 11 степень дисбиотических нарушений

■ III степень дисбиотических нарушений

Пооторнос обследование

Рисунок 7. Степени дисбиотических нарушений у детей, выделяющих ооцисты криптоспоридий, до и после лечения лактосодержащими пробиотическими препаратами.

Таким образом, при проведении микробиологического контроля состояния микрофлоры кишечника и выделения ооцист криптоспоридий на фоне терапии лактосодержащими пробиотическими препаратами в динамике у большинства наблюдавшихся больных детей произошло значительное улучшение состояния микрофлоры кишечника, сопровождающееся частичной санацией организма от ооцист криптоспоридий. У детей, повторно выделяющих ооцисты криптоспоридий, во всех случаях были обнаружены дисбиотические нарушения микрофлоры кишечника только III степени, что может свидетельствовать о роли состояния микрофлоры кишечника в санации организма от ооцист криптоспоридий.

Нами проведен анализ микрофлоры кишечника у 31 ребенка, выделяющего ооцисты криптоспоридий, в динамике на фоне терапии лактосодержащими пробиотическими препаратами (таблица 2).

Дисбиотические изменения микрофлоры кишечника у детей, выделяющих ооцисты криптоспоридий, после проведенного лечения пробиотическими препаратами значительно уменьшились. Так, если при первичном обследовании снижение содержания Е.соИ наблюдали в 100% случаев, то при повторном исследовании только в 35,4% случаях. Количество Е.соН со сниженной ферментативной активностью уменьшилось с 38,7% до 9,7% случаев. Количество гемолитических Е.соИ снизилось с 35,5%до 12,9% случаев.

Таблица 2. Характеристика особенностей микрофлоры кишечника у детей, выделяющих ооцисты криптоспоридии.

Особенности микробиоценоза кишечника Количество детей

первич повтор

абс % абс %

Снижение общего количества кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью менее 300 млн/г 31 100 11 35,4

Повышение количества кишечной палочки со сниженной ферментативной активностью более10% 12 38,7 3 9,7

Присутствие лактозонегативных энтеробактерий >104 Citrobacter 5 16,1 2 6,5

Klebsiella 8 25,8 3 9,7

Др. микроорганизмы 3 9,8 - -

Присутствие гемолизирующей кишечной палочки 11 35,5 5 16,1

Присутствие кокковой флоры в количестве, превышающем25% от общей суммы микробов St. aureus 9 29,0 1 3,2

St. saprophyticus 4 12,9 1 3,2

Присутствие гемолизирующих кокков 3 9,8 - -

Присутствие грибов рода Сап<И<1а> 104 5 16,1 2 6,4

Снижение количества бифидобактерий<10' 23 74,2 7 22,5

Снижение количества лактобактерий <10ь 29 93,5 5 16,1

Количество детей, выделяющих ооцисты криптоспоридий 31 100 6 19,4

Всего 31 100 31 100

При первичном обследовании у 16 (51,7%) детей, выделяющих ооцисты криптоспоридий, обнаружили условно-патогенные энтеробактерии: микроорганизмы рода Klebsiella - у 8 (25,8%), Citrobacter - у 5 (16,1%) больных, другие микроорганизмы были выделены - у 3 (9,8%) детей. При повторном обследовании выделены условно-патогенные энтеробактерии - у 5 (16,2%) детей: микроорганизмы рода Klebsiella - у 3 (9,7%), Citrobacter -у 2 (6,5%) пациентов.

У 13 (41,9%) детей были обнаружены Stphylococcus spp в фекалиях при первичном обследовании, причем St. Aureus - у 9 (29,0%) детей и St. saprophyticus - у

15

4-х (12,9%), при повторном обследовании St. Aureus выделен у 1 (3,2%) ребенка и St. saprophytics - у 1 (3,2%) . Гемолизирующие Staphylococcus spp в фекалиях были обнаружены только при первичном обследовании - у 3 (9,8%) детей.

Грибы рода Candida в концентрации >104 КОЕ/г фекалий при первичном обследовании были у 5 (16,1%) обследованных, при повторном - у 2-х (6,4%) детей.

У детей, выделяющих ооцисты криптоспоридий, отмечалось снижение количества бифидофлоры < 107 при первичном обследовании у 23 (74,2%) больного, при повторном обследовании - у 7 (22,5%) пациента. Снижение количества лактобактерий до < 105 при первичном обследовании составило 29 (93,5%) случаев, при повторном обследовании - 5 (16,1%) случаев. По всем показателям статистические различия достоверны.

Проведенные комплексные лабораторные исследования позволили выявить наличие криптоспоридий у детей, поступивших в стационар, в 29,2% случаев и значительное изменение микрофлоры кишечника у них. Включение лактосодержащих пробиотических препаратов (флорина-форте, аципола) в схему лечения показало, что на фоне улучшения состояния микрофлоры кишечника происходило резкое уменьшение выделения ооцист криптоспоридий с 29,2% до 5,7%. Это обосновывает эффективность применения данных препаратов у детей с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий.

Усовершенствование методов лабораторной диагностики обнаружения криптоспоридий.

Основным методом обнаружения криптоспоридий в настоящее время является специальная окраска мазков фекалий больных, включающая модификацию окрашивания кислотоустойчивых микроорганизмов (карбол-фуксином по Цилю -Нильсену и др.) с последующим исследованием в иммерсионной микроскопии. Помимо этого, в настоящее время предлагается использовать современные экспресс -методы диагностики криптоспоридиоза, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью. Одним из таких методов является иммунохроматографический тест для качественного определения антигенов Cryptosporidiym parvum в образцах кала человека Преимуществом метода является то, что он не требует специально оснащённой лаборатории и может быть проведён в полевых условиях, что также представляется важным при диагностике криптоспоридиоза.

Проведён сравнительный анализ эффективности двух лабораторных методов обнаружения криптоспоридий: микроскопического метода с окраской мазков исследуемого материала модифицированным методом по Цилю-Нильсену с последующим выявлением ооцист с помощью иммерсионной микроскопии и иммунохроматографического теста (RIDA®Quick Cryptosporidium).

Всего было обследовано 80 детей с диарейным синдромом, проходивших амбулаторное обследование в КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Среди которых 58,7% мальчиков и 41,3% девочек. По возрасту

были дети до 3- х лет - 34 (42,5%), от 3-7 лет - 29 (36,3%)и в возрастной группе от 7до 18 лет - 17 (21,2%) человек.

У всех обследованных детей были выявлены дисбиотические изменения микрофлоры кишечника в основном II и III степеней (87,5%) (рисунок 8).

12,S0%

38.70%.

□ Дисбиотические изменения I степени

Ш Дисбиотические изменении П степени

■ Дисбиотические изменения II! степени

48,80%

Рисунок 8. Распределение обследованных больных с различной степенью дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника.

Сравнительный анализ показал, что в результате микроскопического исследования ооцисты криптоспоридии выявлены в17 образцах, что составляет 21,3% от всего изученного материала. При использовании иммунохроматографического теста обнаружено 14 положительных проб, что составляет 17,5% (Разница статистически не достоверена 1=0,6, р<95%)(рисунок 9).

100%

У у У

□ Не обнаружены ооцисты

крнптоспорндпй

■ Обнаружены ооцисты

К|НШТОСПО|П!ДНЙ

микроскопическое иммунохроматофЦжческий исследование анализ

Рисунок 9.Сравнительные данные по выявлению ооцист криптоспоридии различными методами.

Криптоспоридии обнаружены в основном у детей до 3-х лет (11,3%), причем результаты исследований при определении возбудителя микроскопическим методом и при использовании иммунохроматографического теста совпали. В возрастной группе детей от 3-х до 7 лет выявили расхождение результатов: при микроскопическом исследовании криптоспоридии обнаружены в 6,2% случаев, а при использовании иммунохроматографического анализа - в 3,8% случаев. В возрастной

группе от 7 до 18 лет криптоепоридии выявили в 3,8% случаев при микроскопическом исследовании, и - в 2,4% случаев при использовании иммунохроматографического анализа теста (рисунок 10).

Рисунок 10. Обнаружение ооцист криптоспоридий у обследованных больных различных возрастных групп двумя методами.

Исследование показало эффективность использования

иммунохроматографического теста в лабораторной диагностике криптоспоридий у больных диареями с неустановленной этиологией так как количество совпадений при исследовании двумя лабораторными методами: окраски по Цилю - Нильсену (выявлены криптоепоридии в 17 случаях)и иммунохромотографического анализа (в 14 случаях), составляет 82,4 % совпадений (рисунок 11).

Микроскопическое обследование

6,20% 3,30%

■ Не обнаружены оо цисты криптоспоридий

□ Обнаружены

ооцисты

криптоспоридий

(оозрасг до 3

лет)

■ Обнаружены

ооцисты

криптоспоридий

(возрастет 3 до

7 лет]

Ш Обнаружены

ооцисты

криптоспоридий

озрасгот7до Иммунохроматографическии ^

17,60%

,40%

■ совпадение положительных результатов обнаружения

□ несовпадение положительных результатов обнаружения

Рисунок 11. Совпадение положительных результатов обнаружения крисптоспоридий при проведении микробиологического и иммунохроматографического анализов.

Это позволяет рекомендовать иммунохроматографический метод для выявления криптоспоридий особенно при массовых исследованиях, учитывая возможность применения готовых наборов вне специализированных лабораторных условий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

1. У обследованных больных, поступивших в стационар с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, обнаружены выраженные изменения микрофлоры кишечника в основном II и III ст.

2. На основании проведенных лабораторных исследований у 106 детей больных диареями неустановленной этиологии ооцисты криптоспоридий обнаружены микроскопическим методом у 31(29,2%) ребёнка.

3. При обследовании 219 взрослых больных ооцисты криптоспоридий обнаружены традиционным микроскопическим методом исследования фекалий у 44 (20%) пациентов. Дополнительно, у этих больных при изучении колонобиоптатов, ооцисты криптоспоридий найдены ещё у 29 пациентов (13,3%), что составило общее количество подтверждения в этой группе больных 33,3%.

4.При проведении микробиологического лабораторного контроля состояния микрофлоры кишечника после лечения лактосодержащими пробиотическими препаратами у взрослых больных установлено, что у больных произошла полная санация от ооцист криптоспоридий на фоне улучшения показателей микробиоценоза кишечника. У детей после приёма лактосодержащих пробиотических препаратов улучшилось состояние микрофлоры кишечника и отмечалась положительная динамика снижения выделения ооцист криптоспоридий с 29,2% при первичном обследовании до 5,7% при повторном.

5. Сравнительная оценка эффективности 2-х методов индикации криптоспоридий показала, что криптоспоридии обнаружены в 21,3% случаев при микроскопическом методе исследования и в 17,5% случаев прииммунохроматографическом тесте. Совпадение результатов получено в 82,4% случаев.

РЕКОМЕНДАЦИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

У больных с диареями неустановленной этиологии рекомендовано проводить обследование на обнаружение ооцист криптоспоридий и исследование микробиоценоза кишечника.

При выраженных изменениях микрофлоры кишечника у больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий, целесообразно применение лактосодержащих пробиотических препаратов.

Помимо микроскопического метода выявления криптоспоридий для усовершенствования диагностики показано включение в комплекс лабораторных исследований иммунохроматографического метода, особенно при массовых обследованиях, учитывая возможность применения готовых наборов вне специализированных лабораторных условий.

Перспективы дальнейшей разработки темы заключаются в совершенствовании лабораторной диагностики и лечения криптоспоридиоза с учетом состояния микробиоценоза кишечника у больных с диареями неустановленной этиологии и расширения спектра использования различных пробиотических лактосодержащих препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пожалостина, JI. В. Результаты лабораторного исследования на криптоспоридии материалов от детей, больных острыми кишечными инфекциями / Л. В. Пожалостина, Л. В. Феклисова, Е. Р. Мескина, Е. И. Лиханская // Клиническая лабораторная диагностика.- 2002.-JY® 9.-С. 30.

2. Пожалостина, Л. В. Выявление криптоспоридий у больных острыми кишечными инфекциями / Л. В. Пожалостина, Н. М. Грачева, О. С. Партии, А. И. Соловьева, Е. И. Лиханская // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - М., 2002.- Том III.- С. 317.

3. Грачёва, Н. М. Диагностика, клиника, лечение и особенности распространения криптоспоридиоза /Н. М. Грачёва, О. С. Партии, Л. В. Пожалостина, Т. Т. Волохович, И. Т. Щербаков, Н. И. Леонтьева, В. В. Яний, Е. И. Лиханская, А. В. Галеев // Пособие для врачей,- М., 2004. - 36с.

4. Лиханская, Е. И. Распространение криптоспоридий среди детей, больных ОКИ /

Е. И. Лиханская, Л. В. Пожалостина, Л. В. Феклисова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе».- М., 2011- С.231.

5. Яний, В. В. Выявление криптоспоридий у лиц, обратившихся в поликлинику по

поводу заболевания желудочно-кишечного тракта / В. В. Яний, Е. И. Лиханская // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе». - М., 2011,- С.446.

6. Лиханская, Е. И. Сравнение эффективности лабораторной диагностики криптоспоридиоза у больных ОКИ двумя методами исследования / Е. И. Лиханская, Л. В. Пожалостина // Материалы X Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации». - М., 2012. - Том II. -С.291.

7. Лиханская, Е. И. Выявление криптоспоридий и характеристика микрофлоры кишечника у детей с острыми кишечными инфекциями / Е. И. Лиханская, Л. В. Пожалостина, Л. В. Феклисова, Н. М. Бочкарёва // Бюллетень ВосточноСибирского Научного Центра. - Иркутск, 2012. - С. 63-67.

8. Лиханская, Е. И. Криптоспоридии и их роль в патологии человека / Е. И. Лиханская // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2012.- № 5. - С. 34-40.

9. Пожалостина, Л. В. Возбудители криптоспоридиоза [текст] / Л. В. Пожалостина, Т. В. Продеус, Е. И. Лиханская // Руководство по медицинской микробиологии, под редакцией А. С. Лабинской, Н. Н. Костюковой - Москва : Изд-во Бином, 2013. - 1500 экз. - ISBN978-5-9518-0536-2-С. 638-653.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ЖКТ - желудочно - кишечный тракт

КДЦ - консультативно - диагностический центр

КОЕ - колониеобразующие единицы

ОКИ - острые кишечные инфекции

СРК - синдром раздраженной толстой кишки

УПБ - условно-патогенные бактерии

Подписано в печать: 02.10.2013 Тираж: 100 экз. Заказ № 979 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лиханская, Елена Ивановна, Москва

Федеральное бюджетное учреяедение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

На правах рукописи

11/. 'ЗП1 717Г4 с ¿г* уг /"

— ^^

ЛИХАНСКАЯ Елена Ивановна

МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА У БОЛЬНЫХ С ДИАРЕЯМИ НЕУСТАНОВЛЕННОЙ ЭТИОЛОГИИ, ВЫДЕЛЯЮЩИХ ООЦИСТЫ КРИПТОСПОРИДИЙ

03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: кандидат медицинских наук, Л.В. Пожалостина

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Н.М. Грачёва

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение............................................................................... 4

Основная часть....................................................................... 21

Глава 1. Обзор литературы....................................................... 21

1.1. Характеристика микробиоценоза кишечника при острых кишечных инфекциях................................................................. 21

1.2. Криптоспоридии и их роль в патологии человека......................... 29

Результаты исследования.......................................................... 44

Глава 2. Характеристика микрофлоры кишечника у взрослых больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридии.......................................................... 44

2.1. Выявление ооцист криптоспоридий у взрослых больных............... 50

2.2. Лабораторная диагностика криптоспоридий у взрослых больных... 52

2.3. Изменение микрофлоры кишечника у взрослых больных, выделяющих ооцист криптоспоридий, до и после лечения

пробиотиками........................................................................... 53

Глава 3. Характеристика микрофлоры кишечника у детей больных

с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридии....................................................................... 55

3.1. Выявление ооцист криптоспоридий у больных детей.................... 63

3.2. Изменение микрофлоры кишечника у больных детей при выделении ооцист криптоспоридий до и после лечения пробиотиками... 67 Глава 4. Усовершенствование методов лабораторной диагностики

обнаружения криптоспоридий.................................................... 77

Заключение............................................................................. 83

Практические рекомендации и перспектива дальнейшей разработки темы...................................................................... 91

Список сокращений Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследований

Одной из актуальных проблем современной микробиологии является этиологическая расшифровка острых кишечных инфекций с учетом возрастающей роли в их развитии «нетрадиционных» возбудителей ранее считавшихся безопасными. Среди них важную роль в последние годы приобретают криптоспоридии - простейшие, поражающие эпителий желудочно-кишечного тракта и желчных протоков человека с развитием диареи. Важным показателем резистентности организма к развитию различных инфекционных заболеваний является состояние микробиоценоза кишечника, изменение которого усугубляет течение кишечных инфекций. Определение специфически обусловленного изменения микрофлоры кишечника является актуальным для больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий.

Учитывая ухудшающуюся экологическую ситуацию, качественную недостаточность питания, водоснабжения, применение антибиотиков, иммунодепрессантов, рост вторичных иммунодефицитов среди населения, необходимо углубленное изучение распространенности криптоспоридиоза при развитии диарейных состояний.

Все вышесказанное обуславливает актуальность научных исследований, направленных на оценку состояния микробиоценоза кишечника у больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий, повышения качества дифферинциально-диагностического обследования больных с диареями неустановленной этиологии, а также изучения распространения криптоспоридий среди этих больных.

Степень её разработанности

По данным ВОЗ в этиологической структуре ОКИ в зарубежных странах

криптоспоридиоз занимает 3-5 место, уступая лишь таким заболеваниям, как шигеллёз, сальмонеллёз, кампилобактериоз и ротавирусная инфекция [87,118].

В России сведения о криптоспоридиозе пока немногочисленны и противоречивы, учет и регистрация криптоспоридиоза не проводится. Распространение криптоспоридий среди больных диареями неустановленной этиологии изучено не достаточно [29, 40, 66,92].

Цель исследования

Определение особенностей микробиоценоза кишечника у больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, усовершенствование методов лабораторной диагностики, микробиологический контроль лечения лактосодержащими пробиотическими препаратами.

Задачи исследования

1. Выявить распространение ооцист криптоспоридий у взрослых и детей больных диареями неустановленной этиологии.

2. Определить качественный и количественный состав микробиоценоза кишечника у наблюдавшихся больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий.

3. Провести микробиологический контроль за состоянием микробиоценоза кишечника у больных диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, до и после проведения лечения пробиотическими препаратами.

4. Дать сравнительную оценку двух методов выявления криптоспоридий: микроскопического и иммунохроматографического.

Научная новизна

Впервые дана оценка изменений микробиоценоза кишечника у больных диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, указывающая на глубокие нарушения микрофлоры кишечника при криптоспоридиозе.

Получены новые данные о распространении криптоспоридий среди взрослых и детей, больных диареями неустановленной этиологии, свидетельствующие об их возрастающей роли в этиологии острых кишечных заболеваний.

Впервые проведён микробиологический контроль за состоянием микробиоценоза кишечника и частотой выделения ооцист криптоспоридий у больных до и после назначения пробиотических лактосодержащих препаратов, показавших улучшение состояния микрофлоры кишечника и санации организма от ооцист криптоспоридий.

Для повышения эффективности выявления ооцист криптоспоридий, помимо классического микроскопического метода мазков из фекалий установлена целесообразность использования иммунохроматографического теста.

Теоретическая и практическая значимость работы

Доказана значимость нарушений состояния микробиоценоза кишечника при криптоспоридиозе и научно обоснована тактика лабораторного обследования и лечения больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий.

Полученные результаты о высокой распространенности криптоспоридий у больных с диареями неустановленной этиологии свидетельствуют о необходимости обследования этой группы больных на криптоспоридиоз.

Выявленная положительная тенденция к нормализации показателей микробиоценоза кишечника и санация от криптоспоридий у больных с диареями

неустановленной этиологии на фоне применения лактосодержащих пробиотических препаратов обосновывает целесообразность включения их в комплекс лечебных мероприятий.

Микроскопическое исследование колонобиоптатов на обнаружение криптоспоридий при назначении по медицинским показаниям ректороманоскопии будет способствовать уточнению диагноза и расшифровке патогенеза заболевания.

Применение иммунохроматографического теста для выявления криптоспоридий позволит осуществлять экспресс-диагностику криптоспоридиоза у больных с диареями неустановленной этиологии и проводить исследование при отсутствии специализированной лаборатории.

По материалам работы издано пособие для врачей «Диагностика, клиника, лечение и особенности распространения криптоспоридиоза», Москва, 2004 г. (Утверждено председателем секции Учёного совета МЗ РФ по эпидемиологии, инфекционным заболеваниям, вирусологии В.И. Покровским протокол № 5 от 02.12.2004 г.).

Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле и практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей-бактериологов «Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии», проводимых на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2005; 2006; 2009; 2010 гг.), а также в научно-практической работе лаборатории микробиологии и профилактики кишечных инфекций ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора и инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы.

Методология и методы исследования

Характеристика обследованных больных

Результаты диссертационной работы основаны на клинико-лабораторном обследовании 405 больных диареями неустановленной этиологии в период с 2002 года по 2012 год.

Комплексное обследование больных проводилось совместно с :

клиническим отделом ФБУН МНИИЭМ им.Г.Н.Габричесвского Роспотребнадзора, руководитель - Заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Н.М. Грачева,

- детским инфекционным отделением ГБУЗ МО МОНИКИ им. Владимирского, руководитель - д.м.н., профессор Л. В. Феклисова,

институтом паразитологии и тропической медицины имени Марциновского Первого МГМУ им.И.М.Сеченова Минздрава РФ, к.м.н., в.н.с. Т.В.Продеус.

В работе использовали комплексные бактериологические, микробиологические, биохимические и иммунохроматографические методы исследования.

Среди обследованных больные: взрослые, госпитализированные в инфекционное отделение 219 человек; дети, находящиеся в отделение детских инфекционных болезней - 106 человек; пациенты, амбулаторно наблюдавшиеся в КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора - 80 человек (таблица 1).

Характеристика обследованных и объём проведённых исследований

Группы больных Количеств о больных Количество исследований микрофлоры кишечника Количество исследований на выявление ооцист криптоспоридий Возраст больных

Взрослые с ОКИ, находящиеся в стационаре 219 438 438 18-75 лет

Дети с ОКИ, 106 212 212 0-14 лет

находящиеся в

стационаре

Дети с ОКИ, 80 80 160 0-18 лет

амбулаторно обследованные

в КДЦ

Всего 405 730 810 0-75

Методы исследования микрофлоры кишечника

Изучение микрофлоры кишечника проводили культуральным, биохимическим и микроскопическим методами согласно методическим рекомендациям «Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциям. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» (Москва ,1986 г.) и оценивали по отраслевому стандарту ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника».

Взятие фекалий производили в стерильную посуду, срок доставки биоматериала не более 2 часов.

Исследуемый материал в соответствующих разведениях высевали на дифференциально-диагностические среды для выявления и идентификации аэробных и анаэробных бактерий и грибов. Для выделения патогенных и условно-

патогенных энтеробактерий использовали плотные питательные среды Плоскирева, Левина, Эндо (НПО «Микроген»); жидкие среды обогащения Мюллера, селенитовую, магниевую («НИЦФ») с последующим высевом на плотные среды, желточно-солевой агар для стафилококков («Диакон»). Основой для кровяного агара служил питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ) с добавлением 5 % бараньих эритроцитов. Для выделения и культивирования бифидобактерий использовали полужидкую печеночную среду Блаурокк («ГНЦПМБ»), для лактобацил - жидкую среду MPC («Диакон»). Биохимическую индикацию энтеробактерий проводили на питательных средах фирмы «Диакон». Дрожжеподобные грибы рода Candida выделяли на среде Сабуро («Himedia», Индия).

При исследовании микрофлоры кишечника определяли количество бифидо-и лактобактерий, кишечной палочки с нормальной и сниженной ферментативной активностью, энтерококков, стафилококков, гемолизирующей кишечной палочки, условно-патогенных лактозонегативных энтеробактерий (клебсиелла, протей, энтеробактер, цитробоктер и др.), грибов рода Candida.

Состав нормальной микрофлоры кишечника представлен в таблице 2.

Таблица 2

Качественный и количественный состав основной микрофлоры толстого кишечника у здоровых людей (КОЕ/г фекалий).

Виды микроогранизмов Возраст, годы

< 1 1-60 >60

Бифидобактерии 10ш -10" ю9-ю10 108-10у

Лактобактерии 10° - ю7 107-108 106-107

Бактероиды 107-108 109 - 10ш 10,o-10M

Энтерококки ю5- ю7 105- 10s ю6- ю7

Фузобактерии <10ь 10*-10'° 108-109

Эубактерии 10° -107 10у-10,и 10у - 1010

Пептострептококки <105 10у - 1010 10ш

Клостридии < ю3 <105 <106

E.coli типичные 107-108 ю7- ю8 107-108

E.coli лактозонегативные <105 <10* <105

E.coli гемолитические 0 0 0

Другие условно-патогенные энтеробактерии <104 <104 <104

Стафилококк золотистый 0 0 0

Стафилококки (сапрофитный, эпидермальный) <Ю4 <104 <104

Дрожжеподобные грибы рода Candida <103 <104 <104

Неферментирующие бактерии <103 <104 <104

Оценку степеней микробиологических отклонений поводили по ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (таблица 3).

Таблица 3

Степени микробиологических нарушений при дисбактериозе кишечника.

Возраст Характер изменений

1 2

1-я степень микробиологических нарушений

дети младше 1 года жизни снижение содержания бифидобактерий до 10—10 КОЕ/г, лактобактерий до 105—104 КОЕ/г, типичных эшерихий до 106-105 КОЕ/г, возможно повышение содержания типичных эшерихий до 109—Ю10 КОЕ/г

дети старше 1 года жизни .........................— __ снижение содержания бифидобактерий до 10 — 10 КОЕ/г, лактобактерий до 106—105 КОЕ/г, типичных эшерихий до 106-105 КОЕ/г, возможно повышение содержания типичных эшерихий до 109—Ю10 КОЕ/г

в возрасте до 60 лет снижение содержания бифидобактерий до 10—10 КОЕ/г, лактобактерий до 10б—105 КОЕ/г, типичных эшерихий до 106-105 КОЕ/г, возможно повышение содержания типичных эшерихий до 109—Ю10 КОЕ/г

в возрасте старше 60 лет снижение содержания бифидобактерий до 10-10 КОЕ/г, лактобактерий до 105—104 КОЕ/г, типичных эшерихий до 106-105 КОЕ/г, возможно повышение содержания типичных эшерихий до 109—Ю10КОЕ/г

2-я степень микробиологических нарушений

дети младше 1 года жизни снижение содержания бифидобактерий до 10 и ниже КОЕ/г, лактобактерий до 104 и ниже КОЕ/г, повышение содержания гемолитических эшерихий или других 5 7 условнопатогенных бактерий до концентрации 10—10 КОЕ/г или обнаружение ассоциаций условнопатогенных микроорганизмов в концентрации 104—105 КОЕ/г

дети старше 1 года жизни снижение содержания бифидобактерий до 10 и ниже КОЕ/г, лактобактерий до 105 и ниже КОЕ/г, повышение содержания гемолитических эшерихий или других 5 V условнопатогенных бактерий до концентрации 10—10 КОЕ/г или обнаружение ассоциаций условнопатогенных микроорганизмов в концентрации 104—105 КОЕ/г

в возрасте до 60 лет снижение содержания бифидобактерий до 107 и ниже КОЕ/г, лактобактерий до 105 и ниже КОЕ/г, повышение содержания гемолитических эшерихий или других 5 7 условнопатогенных бактерий до концентрации 10 - 10 КОЕ/г или обнаружение ассоциаций условнопатогенных микроорганизмов в концентрации 104 - 105 КОЕ/г

в возрасте старше 60 лет снижение содержания бифидобактерий до 10° и ниже КОЕ/г, лактобактерий до 104 и ниже КОЕ/г; повышение содержания гемолитических эшерихий или других 5 7 условнопатогенных бактерий до концентрации 10-10 КОЕ/г или обнаружение ассоциаций условнопатогенных микроорганизмов в концентрации 104- 105 КОЕ/г

3-я степень микробиологических нарушений

дети младше 1 года жизни снижение содержания бифидобактерий до 10 и ниже КОЕ/г, лактобактерий до 104 и ниже КОЕ/г, обнаружение ассоциаций условнопатогенных

микроорганизмов в концентрации 10 -10 КОЕ/г и выше

дети старше 1 года жизни снижение содержания бифидобактерий до 10 и ниже КОЕ/г, лактобактерий до 105 и ниже КОЕ/г, обнаружение ассоциаций условнопатогенных микроорганизмов в 6 7 концентрации 10-10 КОЕ/г и выше

в возрасте до 60 лет снижение содержания бифидобактерий до 10 и ниже КОЕ/г, лактобактерий до 105 и ниже КОЕ/г, обнаружение ассоциаций условнопатогенных микроорганизмов в концентрации 106-107 КОЕ/г и выше

в возрасте старше 60 лет снижение содержания бифидобактерий до 106 и ниже КОЕ/г, лактобактерий до 104 и ниже КОЕ/г, обнаружение ассоциаций условнопатогенных микроорганизмов в концентрации 106-107 КОЕ/г и выше.

в возрасте старше 60 лет снижение содержания бифидобактерий до 106 и ниже КОЕ/г, лактобактерий до 104 и ниже КОЕ/г, обнаружение ассоциаций условнопатогенных микроорганизмов в концентрации 106-107 КОЕ/г и выше.

Методы лабораторного обнаружения криптоспоридий

Лабораторное обнаружение криптоспоридий проводили согласно методического пособия для врачей "Дианостика, клиника, лечение и особенности распространения криптоспоридиоза" [37] и стандартной тест-системой R1DA®QUICK Cryptosporidium (производства Германии).

Сбор и хранение материала: испражнения собирали в сухую чистую посуду (стерилизация не требуется) и доставляли в лабораторию в течение дня. Если нужно длительное (недели и месяцы) хранение, использовали консервант. Во флакон вносили 2 части консерванта и 1 часть испражнений и хорошо перемешивали. При температуре +4°С ооцисты в консерванте жизнеспособны в течение года.

Приготовление мазка фекалий: