Микробный контактный тест на основе Bacillus pumilus для оценки токсичности загрязненных почв и отходов

Галицкая, Полина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микробный контактный тест на основе Bacillus pumilus для оценки токсичности загрязненных почв и отходов
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Микробный контактный тест на основе Bacillus pumilus для оценки токсичности загрязненных почв и отходов"

На правах рукописи

ГАЛИЦКАЯ ПОЛИНА ЮРЬЕВНА

МИКРОБНЫЙ КОНТАКТНЫЙ ТЕСТ НА ОСНОВЕ BACILLUS PUMILUS ДЛЯ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ И ОТХОДОВ

03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ-2006

Работа выполнена на кафедре прикладной экологии экологического факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина».

доктор биологических наук,

профессор Селивановская Светлана Юрьевна

доктор биологических наук, профессор Яковлев Валерий Анатальевич

кандидат биологических наук, старший преподаватель Киямова Светлана Наильевна

Татарский Государственный Гуманитарно-Педагогический Университет, г. Казань

Защита диссертации состоится 14 ноября 2006г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.081.19 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан « 10 » октября 2006г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор химических наук

Г.А. Евтюгин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Растущая антропогенная нагрузка на экосистемы диктует необходимость разработки системы мер по ее минимизации. Для эффективного природоохранного управления необходима информация о степени опасности загрязняющих веществ для окружающей среды, прежде всего, их токсичности (Filip. 2002; Ладонин, Пляскина, 2004; Feisthauer et al., 2005; Fernandez et al., 2005; Classens et al., 2006; Судницын, 2006). В настоящее время наряду с методами Химического анализа для оценки состояния природных и антропогенных объектов все чаще используются биологические методы. Наиболее сложны для анализа плотные многокомпонентные объекты, такие как почва, бытовые и промышленные отходы (Латыпова с соавт., 2002; Malkomes, 2006).

Одно из перспективных направлений в оценке плотных многокомпонентных сред -микробные тесты (Abbondanzi et al, 2003; Kookana et al., 2004; Van Beelen, 2003; Hinojosa et al., 2004; Rajapaksha, 2004). Наиболее разработаны методы, основанные на оценке аборигенной микрофлоры, которые являются достаточно простыми и чувствительными к токсикантам (Хазиев, 2005; Moreno et al., 2006; Sauve, 2006; Palmroth et al. 2006). Однако при интерпретации результатов зачастую возникают проблемы, связанные с отсутствием незагрязненного образца, идентичного анализируемому. Альтернативой указанным методам являются методы биотестирования, основанные на оценке ответной реакции интродуцированной микрофлоры (Ronnpagel et al., 1998; Athiainen et al., 2002). В настоящее время разработано большое количество таких тестов, включая ряд коммерческих, однако в основном они предназначены для оценки токсичности водных образцов (Карапеп, Itavaara, 2001; Селивановская, 2004; Classens et al., 2006). В случае же тестирования плотных образцов обязательная процедура - это получение водного экстракта (ISO 10712: 1995 (Е), 1995; ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.3-99, 1999; ФР. 1.39.2003.00923, 2003; Plaza, 2005; Fjallborg, 2006). Однако результаты, полученные на водных экстрактах, могут недоучитывать тип и количество загрязняющих веществ (Roenpagel et al., 1998; Alonso, 2006). Кроме того, общая проблема методов биотестирования - это отсутствие адекватного подхода к математическому описанию результатов экспериментов.1

Минимизировать недостатки обоих подходов может использование методов контактного биотестирования. В настоящее время такие методы разработаны в основном для высших растений и животных (Feisthauer, 2005; Moreno, 2006), тогда как методы с использованием микроорганизмов - основных агентов круговоротов элементов - в России отсутствуют, а в Европейском Союзе и США находятся в стадии разработки. Перспективным, на наш взгляд, в качестве тест-объекта использовать микроорганизмы, относящиеся к роду Bacillus, которые являются типичными представителями микрофлоры плотных сред, в частности, почв, а в качестве тестовой функции рассматривать активность фермента дегидрогеназы, отражающего общую метаболическую активность клеток._' ___

Соруководитель работы в области математического моделирования - д.б.н., к.ф.-м.н., профессор Савельев A.A.

Цель данной работы - разработка метода контактного микробного биотестирования для оценки токсичности многокомпонентных плотных объектов.

Задачи исследования.

1. Выбрать в качестве тест-объекта штамм, обладающий максимальной дегидрогеназной активностью и высокой чувствительностью к токсикантам, и осуществить его видовую идентификацию с использованием методов молекулярной биологии на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рДНК.

2. Разработать методику контактного биотестирования и определить метрологические параметры методики - прецизионность, повторяемость и интервалы концентраций стандартных токсикантов (Сг+6, Cd+2), вызывающих 50% ингибирование тест-функции (ЕС5о), в водных и почвенных образцах.

3. Определить адекватную математическую модель, описывающую результаты анализа водных и почвенных образцов различными методами биотестирования и методом оценки аборигенной микрофлоры.

4. Определить токсичность модельных почвенных образцов, загрязненных металлами, их смесью и органическим токсикантом, методом оценки активности аборигенной микрофлоры, методом контактного биотестирования с использованием Bacillus pumilus, методами элюатного биотестирования с использованием В. pumilus, инфузории Paramecium caudatum и ветвистоусого рачка Ceriodaphnia affinis и оценить чувствительность методов анализа

5. Разработать ранжировочную систему для отнесения промышленных и бытовых отходов к классам опасности и установить токсичность образцов промышленных отходов для В. pumilus, P. caudatum и С. affinis.

Научная новизна.

Впервые предложена методика контактного биотестирования с использованием дегидрогеназной активности бактерии В. pumilus КМ-21 для оценки опасности плотных объектов (почв и отходов). Стандартизированы условия культивирования тест-объекта, подготовки его к тестированию и операционные параметры реакции. Определены метрологические характеристики методики биотестирования — прецизионность, повторяемость и диапазон концентраций стандартных токсикантов (Сг+6, Cd+2), вызывающих 50%-ный ответный отклик тестового параметра (ЕС5о).

Впервые проведен сравнительный анализ пяти математических моделей зависимости «концентрация токсиканта - эффект» и показано, что наиболее адекватно описывает реальные результаты кинетическая модель неполного ингибирования.

Впервые на основе изучения различных способов определения токсичности почвенных образцов, искусственно загрязненных индивидуальными металлами, их смесью и органическим токсикантом, установлено, что разработанная методика контактного биотестирования с использованием В. pumilus КМ-21 по чувствительности сопоставима с тестированием на основе аборигенной микрофлоры и превосходит метод элюатного биотестирования с использованием В. pumilus КМ-21. Результаты

контактного теста более тесно коррелируют с результатами теста с аборигенной микрофлорой по сравнению с элюатным тестом.

Впервые с использованием разработанной методики определены границы токсичности отходов, позволяющие ранжировать их по классам опасности. Продемонстрировано, что контактный тест с использованием В. ритИш КМ-21 дает возможность выявить большее количество отходов, относящихся к 2 и -3 классам опасности по сравнению с используемыми в настоящее время элюатными тестами на основе низших ракообразных С, а/^тэ и простейших Р. саисЗашт.

Методика передана На апробацию в Центральную специализированную инспекцию аналитического контроля при МЭПР РТ и в Центральную заводскую лабораторию ОАО «КЗСК». Результаты исследований используются при проведении практических работ по курсам «Экологическое нормирование» и «Управление в обращении с отходами» на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета (КГУ), а также включены в учебное пособие «Теория и методы экологического нормирования» (2006), рекомендованное для обучения студентов и аспирантов экологического факультета КГУ.

Результаты, полученные в исследованиях, могут быть использованы для совершенствования системы почвенного мониторинга и при разработке мер по минимизации негативного влияния промышленных отходов на окружающую среду.

На защиту выносятся следующие положения:

• Разработанная методика контактного биотестирования плотных объектов (почв и отходов) с использованием дегидрогеназной активности бактерии В. ритИиз КМ-21 является более чувствительной в отношении ряда металлов, их смеси и органического токсиканта по сравнению с элюатной методикой с использованием того же тест-объекта и сопоставима по чувствительности с методикой на основе тестирования аборигенной микрофлоры.

• Установленные метрологические характеристики методики биотестирования (презиционность и диапазон ЕС50 стандартных токсикантов), а также стандартные условия ее проведения позволяют рекомендовать методику для использования в различных лабораториях и получать сравнимые результаты.

• Для всех трех вариантов тестирования (контактное, элюатное биотестирование и оценка активности аборигенной микрофлоры) зависимость «концентрация токсиканта -вызываемый эффект» наиболее адекватно описывается кинетической моделью неполного ингибирования.

• Предложенный способ создания «суррогатного» контрольного образца дает возможность оценить степень негативного воздействия токсикантов в природных образцах и отходах при отсутствии идентичных незагрязненных образцов.

• Установленные границы токсичности, определяемые с использованием предлагаемой методики, позволяют ранжировать отходы по классам опасности для биологических объектов окружающей среды.

Апробация работы. Материалы работы изложены на II Международной научно-практической конференции «Экология: образование, наука, промышленность и здоровье» (Белгород. 2004), VI республиканской конференции «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан» (Казань, 2004), Международных молодежных конференциях «Туполевские чтения» (Казань, 2004, 2005), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы аграрной науки и пути их решения» (Ижевск, 2005), Всероссийской научной конференции «Современные аспекты экологии и экологического образования» (Казань, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Личный вклад автора в работу состоит в выполнении экспериментальной части диссертации, обсуждении результатов и формулировании выводов на их основе. Соавторами публикаций являются научный руководитель д.б.н. Селивановская С.Ю., д.х.н., профессор, заведующий кафедрой прикладной экологии Латыпова В.З., сотрудники Гиссенского Университета (ФРГ) профессора Hummel Н., Duering R-A. и Gaeth S., сотрудник Кливлендского университета (Огайо, США) профессор Hung Y-T., участвовавшие в обсуждении результатов. В создании программы для математической обработки результатов принимали участие д.б.н., профессор Савельев A.A. и к.х.н.. с.н.с. Семанов Д.А.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 151 странице; состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 34 рисунка, 15 таблиц. Список литературы содержит 47 отечественных и 249 зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы представлены современные сведения о способах оценки токсичности индивидуальных веществ, состояния почв и плотных антропогенных образований с использованием живых организмов. Рассмотрены методы биотестирования с использованием микроорганизмов, основанные на угнетении роста микробной культуры, ингибировании люминесценции и ферментные тесты, а также методы с использованием высших организмов. Уделено внимание публикациям, посвященным оценке состояния аборигенной микрофлоры почв, загрязненных

различными веществами, их влиянию на микробную биомассу, процессы трансформации углерода и азота в почве, ферментативную активность почв, на микробное разнообразие и устойчивость сообществ. Приведены данные о механизмах влияния металлов на микроорганизмы. В завершающей части обзора литературы представлены подходы к оценке опасности промышленных отходов для окружающей среды.

Представленные данные литературы свидетельствуют о стремительном распространении методов микробного анализа в рамках экотоксикологических исследований. Однако в литературе практически не представлены данные о разработке или применении методов контактного микробного биотестирования, являющихся одним из перспективных направлений современной прикладной экологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили 9 штаммов микроорганизмов, относящихся к роду Bacillus, полученных на кафедре микробиологии КГУ: Bacillus sp. КМ-21, Bacillus sp. КМ-5, Bacillus sp. KM-34, Bacillus sp. KM-3F, Bacillus sp. KM-16, Bacillus sp. KM-22, Bacillus sp. KM-4F, Bacillus sp. KM-13 и Bacillus sp. KM-6.

Видовую идентификацию осуществляли методами молекулярной биологии на основе анализа последовательности 16S рДНК. Идентификации подвергали штамм Bacillus sp. КМ-21. Экстрагирование ДНК проводили с использованием буфера ТЕ ®, SDS протеиназы К, ацетата аммония, лизоцима, изопропанола и этанола. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали раствор Master Mix, праймеры MR for, MR rev и таг-полимеразу. ПЦР проводили в аппарате Biometra® Т-Gradient. Секвенирование продукта ПЦР проводили согласно процедуре ABl PSISM Big Dye® с использованием флоуресцентных меток для нуклеотидных оснований Big Dye ® и AmpliTag Polymerase FS ® согласно Cycle Sequencing Kit ABI PRISM ® в аппарате ABI PRISM ® Genetic Analyser 310, тип геля РОР-6™.

Обработку полученных хроматограмм проводили в программе Mega 3.1. Для идентификации нуклеотидных последовательностей использовали базы данных www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.'

Дегидрогеназную активность аборигенной микрофлоры почвы определяли методом Ленарда в модификации И.О. Колешко ( 1981).

Контактное биотестирование осуществляли в соответствии со следующей процедурой. К навеске образца 1 г приливали 1 мл 0,1М раствора глюкозы, 2 мл 0,1 M фосфатного буфера (pH 7,2), 1 мл 1% раствора ТТХ и 1 мл бактериальной культуры. Смесь встряхивали и инкубировали 24 часа при 28°С. После инкубирования в реакционную смесь добавляли 5 мл этанола и центрифугировали при 4 тыс. об. мин. Надосадочную жидкость колориметрировали при 480 нм. Количество формазана находили по калибровочной кривой, построенной по чистому формазану.

Для того, чтобы избежать влияния окрашенных компонентов ростовой среды или почв, предусматривали так называемый "слепой контроль", где 1 мл бактериальной

суспензии был заменен на 1 мл дистиллированной воды. Для контроля активности культуры (негативный контроль) (Ка) в каждой серии опытов предусматривали вариант, в котором почвенную навеску заменяли на 1 мл дистиллированной воды (контроль активности). В ряде случаев расчет относительной дегидрогеназной активности проводили относительно незагрязненной почвы (почвенного контроля) (Кп).

Для оценки токсичности рассчитывали ингибирование (I, %) или относительную активность (Аотн, %) и определяли ЕС50 или ЕС ю. I (%) = {Фка ~ФспР°быКщ, где

<ФКа~ФсКа>

ФКа - усредненная концентрация формазана в пробе при оценке активности культуры;

Фска - усредненная концентрация формазана в слепой пробе при оценке активности культуры; ..

Фпробы - усредненная концентрация формазана в пробе;

Фспробы - усредненная концентрация формазана в слепой пробе. . , • При определении токсичности водных растворов токсикантов тестирование проводили, заменяя 1 г почвы на 1 мл водного раствора токсиканта.

При элюатном биотестировании для приготовления экстракта навеску 1 г разбавляли дехлорированной водой в соотношении 1:10, смесь встряхивали в течение I часа, отстаивали в течение 24 часов, затем фильтровали. Биотестирование проводили в соответствии с методикой, описанной выше, заменяя 1 г образца на 1 мл фильтрата.

.Биотестирование .почв и отходов с использованием P. caudatum и С. affinis осуществляли в соответствии с рекомендациями стандартизированных методик (ПНД ФТ 14.1:2:3:4.3-99,1999; ФР. 1.39.2003.00923, 2003).

Анализируемые образцы. Анализу подвергали: 1) водные растворы К2СГ2О7, С4(К0з)2*4Н20, РЬС12, СГ2О3, NiS04, фенола; 2) модельные почвенные образцы (тип почвы - серая лесная, Сорг - 0,76%), искусственно загрязненные CuS04*5H20, РЬС12, Cd(N03)2*4H20, NiS04, K2Cr207, фунгицидом альто-супер и комплексом металлов РЬ, Guv; Cd,' Ni (в виде указанных солей), до содержания в почве каждого из металлов на уровне 1,5, 10 и 50 ОДК для песчаных и супесчаных почв; 3) незагрязненные почвы с различным содержанием органического вещества (0,16 - 1,6%); 4) модельные почвенные образцы, содержащие 0,16 и 1,6% органического вещества загрязненные CuSO^SHzO; 5) почвы, обработанные компостом в дозах 75 т/га и 150 т/га в условиях полевого, эксперимента и контрольная почва, без внесения компоста; 6) модельные образцы отходов,.,содержащие такое количество загрязняющих веществ (металлов), которое позволило отнести их к граничным при определении класса опасности расчетным методом; 7) промышленные отходы ряда предприятий РТ. ! Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Microsoft Office Excel 2003, Origin 7.0. До проведения статистической обработки исходных

результатов проводили отброс значений по критериям Граббса и Кохрена в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002.

Для вычисления ЕС50 и ЕС]0 использовали линейную и нелинейные модели. В первом случае ЕС50 и ЕС10 оценивали по линейному участку зависимости, построенной в координатах «натуральный логарифм концентрации элемента - ингибирование (%)» методом наименьших квадратов. В качестве нелинейных моделей для описания полученных результатов применяли две кинетических модели, предложенные T.W. Speir с соавторами (1995), сигмоидальную модель, предложенную L. Haanstra с соавторами (1985) и логистическую модель (Abbondanzi et al., 2003).

v= —-— (модель 1) у = а- (модель 3)

l + bi ' 1 + ехр х ~с)

v = C(1 * (модель 2) У =--—г (модель 4)

1 + ы — ■ (

•if)

\ о)

Все модели были , реализованы в пакете R. Gui, в программе, подготовленной профессором кафедры моделирования экологических систем КГУ A.A. Савельевым.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор тест-объекта и его идентификация При выборе тест-организма рассматривали бактерии, относящиеся к роду Bacillus. Тест-функцией, по ответной реакции которой предполагалось оценивать токсичность, служила дегидрогеназная активность. В качестве тест-объекта необходимо было выбрать штамм, обладающий совокупностью следующих свойств: высокой активностью и чувствительностью по отношению к токсикантам. Определение дегидрогеназной активности изучаемых штаммов, находящихся в экспоненциальной фазе роста, позволило выявить, что наибольшую активность продемонстрировали штаммы Bacillus spp. КМ-21 и КМ-6 - 6,1 и 5,8 мг формазана/мл (табл. 1). Для скрининга изучаемых штаммов по уровню их чувствительности была определена их дегидрогеназная активность в присутствии растворов, содержащих различные концентрации неорганических загрязнителей (Pb, Cr (III), Ni), а также фенол. Поскольку ответные реакции штаммов варьировали в широких пределах, была применена бальная оценка полученных данных (табл. 1). Установлено, что по уровню чувствительности микроорганизмы составили следующий ряд: Bacillus sp. KM-16 > Bacillus sp. KM-34 > Bacillus sp..KM-21 > Bacillus sp. KM-3F > Bacillus sp. KM-4F > Bacillus sp. KM-13 > Bacillus sp. KM-5 > Bacillus sp. KM-22 > Bacillus sp. KM-6.

На Основании полученных результатов в качестве тест-объекта был выбран штамм Bacillus sp1. КМ-21, поскольку он оказался на третьем месте по чувствительности к проанализированным токсикантам и проявил наибольшую дегидрогеназную активность.

Таблицаl

Дегидрогеназная активность штаммов Bacillus spp. в негативном контроле и в

присутствии водных растворов стандарных токсикантов

Штамм Bacillus sp. С(формазана), г/л А отн.. %

РЬ, 400мг/л Cr (III), 500мг/л Ni, 15 Омг/л фенол, 1 ООмг/л

КМ-5 3,9±0,6 23,8 23,8 71,4 60,0

КМ-16 4,3±0,2 24,0 12,0 47,0 24,0

КМ-22 3,9±0,4 44,4 26,7 71,1 44,4

KM-3F 3,6±0,5 22,7 6,0 81,0 22,7

КМ-21 6,1±0,8 15,0 12,5 70,8 23,6

KM-4F 3,9±0,5 22,2 11,1 111,1 22,2

КМ-13 4,6±0,2 24,1 10,0 74,1 37,0

КМ-6 5,8±0,3 30,9 14,7 58,8 30,9

КМ-34 4,1 ±0,5 12,5 12,5 70,8 22,9

Для видовой идентификации штамма, выбранного в качестве тест-объекта, был проведен молекулярный анализ и установлена нуклеотидная последовательность 16S рДНК. Результаты сравнения установленной последовательности с таковыми, содержащимися в базе данных www.ncbi.nlm.nih.gov, позволили идентифицировать изучаемый штамм как Bacilluspumilus (рис.1).

- В. pumilus DSMZ2716S rONA -6. sf>. <9499 LMG19499 i6S jONA

- 8. sp. Ш-2<

-В. pumilus mm J6S rO'vA

Рис. 1 Результаты сравнения нуклеотидных последовательностей штамма Bacillus sp. КМ-21 и штаммов из базы данных www.ncbi.nlm.nih.gov

2. Определение операционных параметров методики контактного биотестирования

и поправочного коэффициента Для оптимизации методики измерения дегидрогеназной активности варьировали следующие параметры: присутствие в реакционной смеси субстрата реакции, СаСОз, концентрация ТТХ, использование буфера, количество экстрагента. Максимальная активность культуры установлена в варианте опыта, в котором присутствуют все компоненты реакционной смеси, за исключением СаС03, и экстрагирование производится 5 мл этанола.

В процессе проведения биотестирования было обнаружено, что при тестировании незагрязненных почв, а также почв с низкими концентрациями токсикантов наблюдается увеличение уровня дегидрогеназной активности В. ритйих КМ-21 по сравнению с негативным контролем (Ка), связанное, скорее всего, с присутствием в почве органического вещества (ОВ). В том случае, если задачей исследования является не только оценка токсичности всего образца в целом, но и оценка токсичности

вещества, содержащегося в образце, а незагрязненный образец отсутствует, на наш взгляд, возможно применение поправочного коэффициента для негативного контроля, учитывающего стимулирующий эффект ОВ на дегидрогеназную активность культуры. Для определения такого поправочного коэффициента были протестированы незагрязненные почвенные образцы с различным содержанием ОВ и установлена зависимость, позволяющая определять поправочный коэффициент в анализируемом образце (рис. 2).

2,2

2,0 1,8 S 1,6

1.4 1,2

-1,37

1 +

• + 2,25, где

\2,57

ч 0,48 J

so- пересчетный коэффициент для Ка,

х — содержание ОВ, %

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,8 0.8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8

Рис. 2 Относительная дегидрогеназная активность В. pumilus при тестировании незагрязненных почвенных образцов с различным содержанием органического вещества

Очевидно, что стимулирующий эффект почвенных образцов зависит не только от содержания ОВ, но и от механического состава и других факторов, опосредованно влияющих на его доступность, равно как и на доступность токсичных веществ (Dar, Mishra, 1994; Perez et al., 2001; Ivask et al., 2004; Plaza et al., 2005). Однако, несмотря на вышеизложенное, мы считаем возможным использовать такой поправочный коэффициент для моделирования активности тестовой культуры в «суррогатном» контрольном образце.

3. Определение метрологических характеристик методики биотестирования Для того, чтобы рекомендовать метод для широкого применения, необходимо установить его метрологические параметры, к числу которых относятся прецизионность и повторяемость метода. Оценку внутрилабораторной прецизионности (<зг) осуществляли для следующих методов: определение токсичности водных растворов стандартного токсиканта - К2Сг207 - на основе ингибирования дегидрогеназной активности В. ритИт, определение токсичности почвенных образцов, загрязненных этим же токсикантом, элюатным и контактным методами (рис. 3). Вычисленный параметр аг позволил определить предел предупреждения метода. Установлено, что во всех вариантах методики значения относительной активности при всех концентрациях токсиканта выше предела предупреждения, что свидетельствует о достаточной прецизионности метода.

1.1 Л 0,9

8 .0,7

о 0.5 § °'3

х 0,1

5 -о,1

-0,3

6 2

£ 1.5 1

£ 1 -¡к

я 0,5

1 0

-0,5 +-

1,6 -I 1,4 ■ 1.2 ■ 1 -0,8 -■ 0,6 ■ 0,4 0,2 .. О i -0,2

-2 0 !п С(Сг), мг/л

2 4 6

1п С(Сг), мг/кг

-2

2 4 6

1п С(Сг), мг/кг

Рис. 3 Относительные значения дегидрогеназной активности (значения, полученные в эксперименте) и предел предупреждения при биотестировании водных растворов (а) и почв, загрязненных Сг (IV), контактным (б) и элюатным (в) методами

Поскольку Сг используется как стандартный токсикант в России, а зарубежные исследователи в этих целях рассматривают и другие элементы, аналогичные исследования проведены для водных растворов и почвенных образцов, загрязненных С<1(М03)2*4Н20, протестированных контактным и элюатным методами. Результаты тестирования также продемонстрировали высокую прецизионность методик. В зарубежных публикациях характеристикой метода анализа является коэффициент вариации (СУ). СУ результатов анализа водных растворов К2Сг207 оказались более низкими по сравнению с таковыми, рассчитанными для результатов тестирования плотных сред (11, 23 и 17% соответственно). Аналогичные СУ (10-15%) для результатов анализа жидких сред указаны Б. АЬЬоп<Загш (2003) и А. 1уазк (2004) с соавторами, а для плотных сред эти коэффициенты оказались более низкими по сравнению с представленными в литературе (1уаэк е1 а1., 2004), что свидетельствуют о хорошей повторяемости методики.

4. Определение адекватной модели описания результатов биотестирования и . установление диапазонов концентраций стандартных токсикантов, вызывающих 50%

ингибирующий эффект Точность измерений при работе с биологическими объектами зависит не только от случайных погрешностей, обусловленных ошибкой измерения или подготовки проб, но и от состояния тест-объекта. Исходя из этого, необходима периодическая проверка чувствительности тест-объекта по отношению к стандартным токсикантам, при этом состояние культуры следует считать нормальным, если она отвечает стандартной

реакцией на определенную концентрацию токсиканта. Для установления интервала концентраций, при которых тест-объект демонстрирует 50% ингибирование тест-функции, нами использовались два стандартных токсиканта - К2СГ2О7 (рис. 4а) и Сс1(М0з)2*4Н20. В соответствии с нормативными документами РФ, для установления искомого интервала концентраций первоначально была построена зависимость погрешности измерения Р от значений ингиби-рования дегидрогеназной активности и найдено соответствующее уравнение линейной регрессии. Из полученного уравнения была найдена погрешность измерения Р$о, соответствующая 50%-ному ингибированию дегидрогеназной активности, затем был построен график и найдено уравнение регрессии для линейного участка зависимости ингибирования от натурального логарифма концентрации токсиканта. С использованием интервала ингибирования, рассчитанного по формуле 50% ± 1,96Р50 (для 95%-ной вероятности), определены соответствующие ему значения концентрации токсиканта (рис. 4а).

Аналогичным образом были найдены интервалы концентраций токсиканта, содержащегося в почве, которые вызывают 50% ингибирование дегидрогеназной активности, при определении токсичности контактным и элюатным методами (рис. 46 и в). Указанные интервалы для Сг (VI) составили 1,7-14,4 мг/л, 8,18-9,56 и 31,4-81,68 мг/кг для водных растворов, а также для почвенных образцов, оцененных "с помощью контактного и элюатного методов соответственно. Для Сс1 эти интервалы составили 0,01-0,53 мг/л, 3,07-3,30 и 221,4-1096,6 мг/кг соответственно.

Стандартный способ вычисления ЕС50 (по линейному участку зависимости «логарифм концентрации — ингибирование») не всегда позволяет адекватно оценить значения ЕС50. Преодолеть недостатки этого метода возможно при использовании для

-2 0 2 4 6 8 10

№ С(Сг), мг/кг

Рис. 4 Определение интервалов концентраций К2СГ2О7, в пределах которых обнаруживается 50% ингибирование дегидрогеназной активности В. ритйш при тестировании водных образцов (а) и почв контактным (б) и элюатным. (в) методами

расчета ECJ0 нелинейных моделей. В литературе представлены некоторые модели (Haanstra, 1985; Speir et al., 1995; Abbondanzi, 2003; Moreno et al., 2002, 2006), однако сравнения их адекватности для решения конкретных задач проведено не было. Поэтому для определения ECjo нами были рассмотрены 4 нелинейных модели. Модель 1 описывает полное ингибирование, модель 2 - частичное ингибирование тестового параметра, модель 3 представляет собой сигмоидальную дозо-зависимую модель, модель 4 является логистической. Для определения доверительного интервала концентраций, вызывающих 50%-ный эффект, был использован перестановочный тест с числом перестановок 999. На рис. 5 представлены зависимости уровня относительной активности и концентрации Сг в почвенном образце (контактный метод биотестирования), полученные с помощью 4 моделей.

лаа всю «м> нюо С(Сг). мг/кг

Модель 1

доо ело «оо С(Сг), мг/кг

Модель 2

С(Сг), мг'кг

Модель 3

С(Сг). мг'кг

Модель 4

Рис. 5 Результаты перестановочного теста, полученные с помощью 4 нелинейных моделей, на примере модельных почвенных образцов, загрязненных Сг (контактное . . , биотестирование)

..Для того чтобы определить, какая из моделей наиболее адекватно описывает кривую «токсичность - концентрация вещества», были проведены уточняющие эксперименты. Для тех же концентраций токсикантов было проведено прогнозирование значений относительной активности с помощью 4 нелинейных моделей и уравнения линейной регрессии. На основании значений модулей разности прогнозных и реальных

значений была осуществлена оценка адекватности каждой из пяти моделей и установлено, что оптимальной является модель 2 (кинетическая модель неполного ингибирования). В пользу этой модели свидетельствовует и то, что она удачно описывает все варианты биотестирования. Установленные при расчете по 2 модели интервалы концентраций, при которых наблюдается 50%-ное ингибирование тест-функции (ЕС50), составили для Сс1 и Сг (VI) 4,5-6 и 4,3-5,1 мг/л для водных растворов. 7,2-10,1 и 10,1-14,5 мг/кг для почвенных образцов при контактном биотестировании и 321,3-374,3 и 17,4-22,3 мг/кг ~ при элюатном биотестировании - соответственно.

5. Анализ токсичности почвенных образцов, содержащих индивидуальные металлы, их

смесь и органический токсикант, методами контактного биотестирования с использованием В. ритНы, элюатного биотестирования с использованием В. ригпЦиз, Р. саийаШт и С. а/Атв, а также методом оценки активности аборигенной микрофлоры Для того, чтобы сравнить чувствительность разрабатываемого контактного теста с более распространенным элюатным методом и традиционным методом, основанным на оценке активности аборигенной микрофоры почвенных образцов, нами были протестированы образцы почв, содержащие в качестве токсикантов К2СГ2О7, Сс1(М0з)2*4Н20, РЬС12, N1304, Си(804)*5Н20, фунгицид альто-супер, а также смесь токсичных металлов (Сс1, Си, РЬ), наиболее часто встречаемых в почвах РТ (Государственный доклад, 2004). Результаты тестирования представлены в табл. 2.

Таблица 2

Интервалы значений ЕС50 при контактном и элюатном биотестировании почв, загрязненных Си(804)*5Н20, Са(К03)2*4Н20, №804, РЬС12, К2Сг207, смесью

токсикантов (Си, С<Д, N1, РЬ) и фунгицидом альто-супер

Токсикант Интервалы значений ЕС5о, мг/кг

Контактное биотестирование Элюатное биотестирование

Ка Кп Ка Кп

Си 60,3-74,1 18,1-24,1 96,1-121,5 58,2-70,9

Сё 7,2-10,4 3,5-4.1 321,3-374,3 38,3-64

N1 94,1-107,1 40,2-46,3 157-189,9 80,6-105,3

РЬ 106,8-131,3 35,9-43,3 234,0-280,2 171,4-215,3

Сг (VI) 10,1-14,5 1,3-1,9 17,4-22,3 18,1-37,1

Смесь токсикантов 4,3-6,3 1,9-2,1 5,8-9,2 5,0-6,1

Альто-супер 14,4-23,5 3,8-6,2 81,0-87,0 40,6-76,7

Примечание. Ка - активность, оцененная с использованием в качестве контроля активности тестовой культуры в присутствии воды, Кп - активность, оцененная с использованием в качестве контроля активности тестовой культуры в присутствии незагрязненной почвы

Анализ полученных данных позволяет сделать несколько заключений. Во-первых, как при контактном, так и при элюатном тестировании значение ЕСзо, определенное на

основе набора данных относительной активности, рассчитанной с использованием Кп, оказалось ниже ECjo, определенной на основе набора данных, рассчитанных с использованием Ка (табл. 2). Такое различие обусловлено тем, что при расчете с использование Кп мы элиминируем стимулирующий эффект, обусловленный присутствием OB. Во-вторых, токсичность металлов в отношении дегидрогеназной активности В. pumilus, оцененная контактным методом биотестирования, снижалась в ряду Cr > Cd > Си > Pb ä Ni. Данный ряд был практически идентичен при использовании обоих типов контроля. Ряд токсичности металлов, полученный при элюатном биотестировании выглядел следующим образом: Cr > Cd > Си > Ni > Pb.

Важной выявленной закономерностью является то, что при одинаковых концентрациях токсиканта уровень ингибирования тест-функции существенно выше при проведении биотестирования контактным методом по сравнению с элюатным, что свидетельствует о большей чувствительности первого. Это утверждение подтверждается и определенными нами значениями ЕС50 (табл. 2). Согласно данным литературы, зачастую понятие биодоступности вещества или элемента отождествляют с их водорастворимостью. Полученные нами данные не согласуются с данной точкой зрения, поскольку при одинаковой исходной концентрации в почвенном образце уровень ингибирования при контактном методе биотестирования оказался в несколько раз > выше по сравнению с элюатным методом. Так, например, такое превышение оказалось кратным 2 для Ni (концентрация 100 мг/кг), 2-3 для Pb (100 мг/кг), 1,3-1,8 для Си (70 мг/кг), 14 для Cd (6 мг/кг) и 2-6 для Cr (16 мг/кг). Таким образом, можно заключить, что для бактерий, относящихся к роду Bacillus, биодоступными являются не только водорастворимые формы токсикантов.

Сравнение полученных нами данных с результатами, представленными в литературе, позволяет нам сделать заключение о большей чувствительности используемого нами метода биотестирования. Действительно, при попытке использования Bacillus cereus как предиктора биодоступности Cd, польскими авторами установлено, что его 1С50 составляет 1,0-3,8 иг/т и варьирует в зависимости от типа почвы (Prokop et al., 2001). Не обнаружено негативного эффекта в отношении индукции люминисценции В. subtilis BR151-(pT0024) при анализе суспензии почвы, загрязненной Cd в концентрации до 1,46 мг/кг и содержащей 34-39% OB (Ivask et al., 2004). Применение люминисцентного биосенсора, содержащего Rhizobium leguminozarum biovar trifolii TAI lux AB, для анализа почв, содержащих Си или Zn, выявило, что цинк вызывает 50% негативный эффект при его содержании в почве 403 мг/кг, тогда как Си при содержании 349 мг/кг не оказывает эффекта (Chaudri et al., 2000).

'■'' Для того чтобы определить, насколько адекватны результаты, полученные методом контактного биотестирования, и действительно ли они отражают влияние токсиканта на почвенное микробное сообщество, нами в этих же образцах была определена дегидрогеназная активность, проявляемая аборигенной микрофлорой. Внесение всех неорганических токсикантов приводило к снижению дегидрогеназной

активности почвы. Наибольший негативный эффект выявлен в случае внесения Сг (рис. 6). На основании рассчитанных значений ЕС5о по снижению уровня негативного эффекта, оказываемого на аборигенную микрофлору, металлы составляют ряд: Сг (0,9 мг/кг) > С<1 (3,6 мг/кг) > Си (19,7 мг/кг) > РЬ (23,6 мг/кг) > N¡(41,0 мг/кг). Внесение в почву смеси металлов до их содержания на уровне ОДК не привело к достоверному изменению уровня дегидрогеназной активности почвенного сообщества. Для того чтобы достичь практически полного ингибирования процесса необходимо увеличить суммарное содержание металлов до уровня, соответствующего 10 ОДК и выше.

При анализе аборигенной активности почв, загрязненных фунгицидом альто-супер выявлено, что при низком содержании (до 1 мг/кг) он стимулирует микробное сообщество, увеличивая дегидрогеназную активность на 25-35%. При дальнейшем увеличении содержания альто-супер в почве наблюдается дозо-зависимое снижение активности. Сравнение значений ЕС50 Для ряда металлов и их смеси, полученных при контактном биотестировании и в опытах с аборигенной микрофлорой показывает, что уровни ЕС50 для Сс1, N1, Си и смеси металлов практически одинаковы как в контактном биотестировании так и в тестах с использованием аборигенной микрофлоры. В случае Сг и РЬ ЕС5о, установленные в контактном биотестировании оказались в 1,6 раз выше. При применении элюатного метода анализа различия в установленных значениях ЕС50 оказались существенно более высокими и составили в среднем 8,5 раз, что позволяет считать контактный метод предпочтительным по сравнению с элюатным.

Коррелятивный анализ результатов биотестирования - модельных почвенных образцов (контактным и элюатным методами с использованием В. ритИт) и активности аборигенной микрофлоры, произведенный на основе значений ЕС5о, выявил тесную корреляцию между результатами, полученными в контактном методе биотестирования и результатами анализа аборигенной микрофлоры (11=0,96). В случае же сопоставления результатов, полученных в элюатном анализе, и результатов определения активности аборигенной микрофлоры коэффициент корреляции оказался существенно ниже (11=0,62). Это свидетельствует о том, что контактный тест более адекватно отражает воздействие исследованных токсикантов на почвенную микрофлору. Несмотря на то, что большинство авторов отдает предпочтение оценке состояния объектов окружающей среды с привлечением методов, основанных на оценке аборигенной микрофлоры, до настоящего времени не решен вопрос о контрольном образце, который бы позволил определить степень негативного воздействия токсичных веществ. В этом плане контактное биотестирование позволяет

1,21,00,8 £0,6 0,40,2 0,0-

60 60 С(Сг), мг/кг

960 980 1000

Рис. 6 Влияние К2СГ2О7 на дегидрогеназную активность серой лесной почвы

решить эту проблему, предложив в качестве контроля либо активность тестовой культуры, либо, так называемый, «суррогатный» образец. Впрочем, мы поддерживаем мнение ряда ученых (Chapman, 1996; Brohon et al., 2004), считающих, что наиболее оптимальным может быть сочетание обоих указанных методов, поскольку оно позволит преодолеть такие негативные стороны методов, как недостаточная экологическая релевантность биотестов и возможная адаптация или даже стимуляция аборигенной микрофлоры загрязненных почв.

Поскольку в РФ наиболее распространены тесты с использованием P. caudatum и С. affinis, на следующем этапе нами было проведено сравнительное исследование их чувствительности с чувствительностью тестов на основе В. pumilus. Биотестированию подвергли 14 модельных почвенных образцов, загрязненных Cd(N03)2*4H20 и К2Сг2С>7. Результаты тестирования представлены в табл. 3. Установлено, что в случае Cd предлагаемый тест обладает чувствительностью более высокой по сравнению с P. caudatum и сопоставимой с С. affinis. Так, например, при содержании Cd в почве 58 мг/кг £ля снятия ингибирующего эффекта потребовалось разбавление образца в 45, 133 и 153 раза в тестах с P. caudatum, С. affinis и В. pumilus соответственно. В случае же Сг чувствительность разрабатываемого теста оказалась несколько ниже в сравнении с таковой в тестах с гидробионтами.

Таблица 3

Токсичность модельных почвенных образцов, определенная в элюатных тестах с использованием Р. саиАаЫт, С. а^пгз и контактном тесте с использованием В. ритйт

ЭКр,0

Модельный почвенный образец Р. caudatum С. affinis В. pumilus Модельный почвенный образец P. caudatum C. affinis B. pumilus

НП 1 1 1 Cd, 0,25 1 1 1

Сг, 0,312 1 1 1 Cd, 1 1 1 1

Сг, 3,12 5 10 1 Cd, 3 1 2 4

Сг, 7,8 45 100 15 Cd, 5,8 3 13,3 15

Сг, 15,6 95 200 103 Cd, 11,6 10 20 20

Сг, 992,75 200 1000 115 Cd, 58 45 133,3 153

Сг, 3971 1000 5000 254 Cd, 232 98 200 211

6. Использование методики контактного биотестирования для оценки класса опасности промышленных отходов Один из возможных вариантов практического использования предлагаемой методики - определение класса опасности отходов. Для того, чтобы установить такую возможность, нами были протестированы 15 образцов промышленных отходов, образующихся на различных предприятиях РТ. Анализ токсичности отходов осуществляли двумя методами - контактным и элюатным (рис. 7). Выявлено, что в восьми случаях контактный тест оказался более чувствительным, чем элюатный. Максимальное соотношение результатов тестирования, полученных контактным и элюатным способами, составило 5,4 раз, что подтверждает наше предположение о том,

что в данных отходах содержатся токсичные компоненты, которые плохо растворимы в воде, однако способны оказывать негативное влияние на организмы. Для семи видов отходов достоверных различий (Р<0,05) между относительными активностями, полученными контактным и элюатным способами, не выявлено.

120 - > □ контактный

виды отходов

Рис. 7 Относительная дегидрогеназная активность В. ритШя в присутствии промышленных отходов, оцененная с использованием контактного и элюатного способов биотестирования

Если активность интродуцированной культуры составляла < 90% от контроля, отходы подвергались разбавлению и последующему тестированию. Поскольку при определении класса опасности в качестве величины, используемой при ранжировании по классам, используют кратность разбавления отхода, не вызывающую негативного воздействия (ЭКрю), в данном блоке исследования мы рассчитывали этот параметр.

Практическое использование результатов биотестирования отходов возможно лишь при наличии информации о том, какие значения ЭКрю являются граничными при отнесении отходов к различным классам опасности. Для создания ранжировочной таблицы, нами были найдены показатели ЭКр]0 для модельных образцов отходов, специально загрязненных таким количеством металлов, которое при определении класса опасности расчетным методом, являлось граничным между 5 и 4 (отход К10), 4 и 3 (отход К100) и 3 и 2 (отход К1000) классами опасности (табл. 4).

Полученные результаты позволили нам произвести отнесение отходов и почвенных образцов к классам опасности (табл. 5). Для сравнения нами было проведено элюатное биотестирование этих же образцов отходов с использованием Р. саи(1аЫт и С. а$1тз. Необходимо отметить, что отнесение к классам опасности по результатам биотестирования проводилось двумя способами: 1) в соответствии с нормативным документом «Критерии отнесения опасных отходов к классу опасности...» (2001); 2) в соответствии с рекомендациями, представленными в литературных источниках (Селивановская с соавт., 2001, 2004) и нашей ранжировочной таблицей.

••• Таблица 4

Ранжировочиая таблица для отнесения отходов к классам опасности по результатам контактного биотестирования на основе оценки ингибирования

Класс опасности Отхода Кратность разведения образца; при которой наблюдается 10% ингибирование дегидрогеназной активности (ЭКрю)

: 1-Н ЭКр10^215

III 215 г ЭКр10>5

: IV 5 гг ЭКр10> 1

V ЭКр10=1

Итоговый класс опасности, определенный методом биотестирования с учетом ранжировочной таблицы, представленной в нормативном документе, в 12 случаях из 15

совпал с классом опасности, установленным расчетным способом.

Таблица 5

Отнесение промышленных отходов к классам опасности__

Название образца Биотестирование с Р. СаийаЫт Биотестирование с С. с$1тз Биотестирование с В. ри/пИш КлЗ

ЭКр.о* Кл1 Кл2 ЭКр,о * Кл 1 Кл 2 ЭКрю Кл 1 Кл 2*

ШМП 1 5 5 1 5 5 30 4 3 4

ШК 9,5 4 4 43 4 4 45,9 4 3 2

ШР 10 4 4 89 4 ' 4 4,2 4 4 4

ШМП2 1,54 4 4 5 4 4 - 17 4 3 4

ВП 2,78 4 4 7,14 4 4 1 5 5 4

• чс 13,3 4 4 66 4 4 90 4 3 4

• ШГ„. 4 4 4 35 4 4 103 3 3 3

ШВП..... 1,3 4 4 120 3 4 83 4 3 3

ШГ2 2,7 4 4 200 3 4 75 4 3 3

ОБОС 1 5 5 1 5 5 1 5 5 5

И1ГЗ 2 4 4 16 4 4 1,2 4 4 4

ШФ 35,6 4 4 595,2 3 3 283 3 2 3

ИА 2,5 4 4 4 4 4 29 4 3 . 4

ИП 1 5 5 1,1 4 4 18 4 3 3

ШС 1,3 4 4 3,8 4 4 3,6 4 4 4

Примечание. ЭКр10* - данные предоставлены ЛАЭК КГУ, Кл1 - класс опасности, определенный согласно «Критериям отнесения опасных отходов к классу опасности...» (2001), Кл2 - класс опасности, определенный согласно литературным данным (Селивановская с соавт., 2001, 2004), Кл2* - класс опасности, определенный согласно предложенной нами ранжировочной таблице, КлЗ - класс опасности, определенный расчетным способом

У трех образцов отходов расчетный класс опасности оказался более жестким, чем класс, установленный на основе биотестирования. В случае же использования

предлагаемой нами ранжировочной таблицы, количество отходов, у которых совпал класс опасности оказалось меньшим - девять образцов. При этом у пяти оставшихся отходов более жестким оказался класс, определенный методом биотестирования, и только в одном случае определяющим оказался расчетный метод. Полученные результаты могут свидетельствовать в пользу применения для определения класса опасности ранжировочной таблицы с индивидуальными интервалами ЭКр)0 для каждого тест-объекта, поскольку это позволяет выявить большее количество отходов, обладающих негативным воздействием на живые объекты окружающей срсды.

При сравнении результатов отнесения отходов к классам опасности на основании биотестирования с использованием трех видов организмов установлено, что между результатами отсутствует достоверная корреляция (R = 0,16-0,67). Такое отсутствие зависимости связано, скорее всего, с тем, что тест-организмы обладают дифференцированной чувствительность к различным токсикантам, присутствующим в отходах, существование которых нам неизвестно. Этот факт подтверждает наше утверждение о необходимости использования системы тест-объектов для определения опасности объектов окружающей среды и отходов и совпадает с мнением ряда зарубежных и отечественных авторов (Bioassays..., 1995; Кабиров с соавт., 1997; Селивановская, Латыпова, 2004; Fernandez et al., 2006; Alonso et al., 2006).

При биотестировании с использованием Р. caudatum и С. affinis к 5 и 4 классам опасности отнесены 100 и 93% всех протестированных отходов. Результаты контактного биотестирования с использованием бациллы позволили отнести к 5 и 4 классам только 33% отходов. Более того, по результатам контактного биотестирования один отход был отнесен ко 2 классу опасности. Таким образом, применение метода контактного биотестирования позволило выявить максимальное количество опасных отходов, что позволяет рекомендовать данную методику, после ее аттестации органами Государственного стандарта, к включению в систему тестов для оценки их класса опасности.

ВЫВОДЫ

1. По уровню дегидрогеназной активности и ее чувствительности в отношении ряда металлов наиболее перспективным в качестве тест-объекта признан штамм Bacillus sp. КМ-21, впоследствии идентифицированный на основе молекулярного анализа последовательности 16S рДНК как В. pumilus.

2. Высокая повторяемость результатов (коэффициент вариации 14%) обеспечивается за счет использования при биотестировании 38-40 часовой культуры с оптической плотностью 1,6 опт. ед. Методика обладает высокой прецизионностью и достаточной чувствительностью (ЕС50 Сг+6 1,5 мг/кг, ECsoCcT2 3,8 мг/кг).

предпочтительности по сравнению с традиционной моделью линейной регрессии, кинетической моделью полного ингибирования и двух сигмоидальных моделей.

4. По степени негативного воздействия в отношении дегидрогеназной активности В. pumilus КМ-21 при контактном методе биотестирования металлы составляют ряд Сг > Cd > Си > Pb > Ni, идентичный ряду, установленном^ при использовании теста с аборигенной микрофлорой.

5. На основе изучения различных методбв определения токсичности почвенных образцов, искусственно загрязненных индивидуальными металлами, их смесью и органическим токсикантом, показано, что разработанный метод контактного биотестирования по чувствительности сопоставим с тестированием на основе аборигенной" микрофлоры и превосходит метод элюатного биотестирования. Результаты контактного теста тесно коррелируют с результатами теста с аборигенной микрофлорой (R-0,96), что свидетельствует о возможности замены последнего тестом с ин-фодуцированной культурой В. pumilus КМ-21.

6. По степени токсикорезистентности в отношении Cd(N03)2*4H20 тест-методы располагались в следующем порядке: тест с P. caudalum > тест с С. affinis г тест с

B. pumilus, в отношении К2Сг207 - тест с В. pumilus > тест с P. caudatum > тест с

C.^affinis.

. 7. Использование ранжйровочной системы для отнесения отходов к классам опасности для окружающей среды для результатов контактного биотестирования с В. pumilus КМ-21 позволило распределить обследованные промышленные отходы следующим образом: 5 класс - 13%, 4 класс - 20%, 3 класс - 60%, 2 класс - 7%, тогда как при применении стандартных тестов с С. affinis и P. caudatum к 3 и 2 классу было отнесено лишь 7% отходов, что свидетельствует о большем потенциале предлагаемого нами метода.

Основные публикации по теме работы . Работа, опубликованная в журнале из перечня ведущих рецензируемых изданий

1. Селивановская, С.Ю. Оценка токсичности плотных многокомпонентных сред с использованием контактного метода биотестирования [текст] / С.Ю, Селивановская, П.Ю. Галицкая // Токсикологический вестник. -2006. - №4. - С. 12-15.

Другие публикации

2. Selivanovskaya, S.Y. Suitability of organic wastes for land application with spécial regard to métal and organic contaminant contents in Tatarstan [текст] / S.Yu. Selivanovskaya, R.-A. Duering, V.Z. Latypova H. Hummel, S. Gaeth, P.Yu. Galizkaya II Environmental radioecology and applied ecology. - 2004. - №1. - Vol. 10. - P. 22-28.

3. Галицкая, П.Ю. Применение контактного метода биотестирования для оценки состояния почв и отходов [текст] / П.Ю. Галицкая, С.Ю. Селивановская // Материалы II Международной научно-практической конференции «Экология:

образование, наука, промышленность и здоровье». - Вестник БГТУ им. В.Г. Шухова, 2004. - №8. - С. 36-37.

4. Галицкая, П.Ю Биологические методы оценки состояния почв: контактное биотестирование [текст] / П.Ю. Галицкая, Д.М. Шахмаева, С.Ю. Селивановская // Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан: Тез докл. VI республиканской конференции. - Казань, 2004. - С.54.

5. Галицкая, П.Ю. Разработка контактного теста для оценки состояния твердых сред [текст] / П.Ю. Галицкая, С.Ю. Селивановская // Материалы международной молодежной конференции «Туполевские чтения». - Казань, 2004 - Т.1. - С. 229.

6. Галицкая, П.Ю. Оценка состояния почв с помощью аборигенной и интродуцированной микрофлоры [текст] / Галицкая П.Ю., Селивановская С.Ю И Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005». - М.: МГУ, 2005. - Т.6. - С. 135-138.

7. Галицкая, П.Ю. Микробный контактный тест для оценки состояния плотных сред, подверженных антропогенному воздействию [текст] /П.Ю. Галицкая // Материалы всероссийской научно-практической конференции 15-18 февраля 2005г. «Современные проблемы аграрной науки и пути их решения». - Ижевск, 2005. - Т. 2.-С. 140-143.

8. Галицкая, П.Ю. Дегидрогеназная активность интродуцированной микрофлоры как адекватный показатель состояния плотных сред [текст] / П.Ю. Галицкая // Материалы Международной молодежной конференции «XX Туполевские чтения». -Казань, 2005.-Т.З. - С. 142-145.

9. Селивановская, С.Ю. Теория и методы экологического нормирования [текст]: учеб. пособие / С.Ю. Селивановская, В.З. Латыпова, П.Ю. Галицкая. - Казань: КГУ, 2006. -85с.

10. Галицкая, П.Ю. Некоторые характеристики микробного контактного метода биотестирования [текст] / П.Ю. Галицкая, С.Ю. Селивановская // Материалы Всероссийской научной конференции 19-23 сентября 2005г. «Современные аспекты экологии и экологического образования». - Казань, 2005. - С. 414-416.

11.Галицкая, П.Ю. Преимущества и недостатки микробных контактных тестов [текст] / П.Ю. Галицкая // Вестник Татарстанского отделения Российской Экологической Академии. - 2005. - № 4(26). - С.55-60.

12.Selivanovskaya, S.Yu. Microbial toxicity test for evaluating waste quality [текст] / S.Yu. Selivanovskaya, P.Yu. Galitskaya, Y.T. Hung, V.Z. Latypova // International Journal of Environmental Pollution. - 2006, in press.

13.Галицкая, П.Ю. Определение метрологических характеристик микробного теста на основе оценки ингибирования дегидрогеназной активности Bacillus pumilus / П.Ю. Галицкая. С.Ю. Селивановская // Ученые записки Казанского Университета. Серия Естественные науки. - 2006. - Т. 148, кн. 2. - С. 63-72.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207 Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. . Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 09.10.2006 г. Усл. п.л 1,44. Заказ М К-5429. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризографам.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Галицкая, Полина Юрьевна

Введение

Глава 1 Обзор литературы. Оценка токсичности индивидуальных веществ, состояния почв и плотных антропо-генных образований с использованием микроорганизмов. 10 Общие положения

1.1 Методы биотестирования

1.1.1 Биотестирование с использованием микроорганизмов

1.1.1.1 Угнетение роста микробной культуры

1 1.1.2 Ферментные тесты 14 1.1.1.3 Тесты, основанные на ингибировании люминесценции

1.1.1 Биотестирование с использованием других организмов

1.2 Методы, основанные на оценке состояния аборигенной микрофлоры

1.2.1 Определение состояния почв и плотных антропогенных образований ^ на основе измерения микробной биомассы ф 1.2.2 Оценка состояния объектов на основе анализа процессов трансформации азота и углерода в почве

1.2.3 Оценка состояния почв на основании измерения ферментативной активности аборигенной микрофлоры

1.2.4 Оценка состояния экосистем на основе определения микробного ^ разнообразия и устойчивости сообществ

1.3 Влияние металлов на микроорганизмы

Глава 2 Материалы и методы исследования

2.1 Объекты исследования, культивирование, идентификация

2.1.1 Объекты исследования

2.1.2 Культивирование организмов

2.1.3 Идентификация организмов

2.1.3.1 Экстрагирование ДНК

2 1.3.2 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 45 2.1.3.3 Секвенирование продукта ПЦР

2.2 Методы биотестирования

2.2.1 Биотестирование объектов с использованием Bacillus pumilus КМ-21 47 * 2.2.1.1 Контактное биотестирование

2.2.1.2 Биотестирование водных образцов 48 2 2.1.3 Элюатное биотестирование

2.2.2 Определение дегидрогеназной активности аборигенной ^ микрофлоры почвенных образцов

2.2.3 Биотестирование объектов с использованием Paramecium caudatum

2.2.4 Биотестирование объектов с использованием Ceriodaphnia affinis

2.3 Анализируемые образцы

2.3.1 Водные растворы

2 3.2 Искусственно загрязненные почвенные образцы

2.3.3 Незагрязненные почвы с различным содержанием органического ^ вещества

2.3.4 Почвы, обработанные компостом

2.3.5 Модельные образцы отходов

2.3.6 Промышленные отходы

2.4 Обработка и оценка результатов

Глава 3 Результаты и обсуждение

3.1 Выбор тест-объекта

3.1.1 Ростовые характеристики бактерий рода Bacillus

3.1.2 Дегидрогеназная активность бактерий рода Bacillus

3.1.3 Чувствительность бактерий рода Bacillus к стандартным токсикантам

3.2 Идентификация тест-объекта

3.3 Определение опрерационных параметров и стандартизация методики контактного биотестирования

3.3.1 Определение операционных параметров методики

3 3.2 Стандартизация условий биотестирования

3 3.3 Определение поправочного коэффициента при тестировании ^ почвенных образцов

3.4 Определение метрологических характеристик методики контактного ^ биотестирования

3.5 Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих 50%-ный ^ ингибирующий эффект

3.5.1 Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих ^ 50%-ный ингибирующий эффект, с помощью линейной модели

3.5.2 Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих ^ 50%-ный ингибирующий эффект, с помощью нелинейных методов

3.6 Анализ токсичности почвенных образцов, содержащих индивидуальные металлы, их смесь и органический токсикант, методами контактного и элюатного 90 биотестирования

3.6.1 Анализ токсичности поченных образцов методами контактного и элюатного ^ биотестирования

3.6.2 Определение токсичности почвенных образцов на основе оценки дд активности аборигенной микрофлоры

3.7 Анализ токсичности почвенных образцов, загрязненных хромом и кадмием, в ^ тестах с использованием Р caudatum и С affims

3.8 Использование методики контактного биотестирования для оценки класса j ^^ опасности промышленных отходов и почв

3.8.1 Определение токсичности промышленных отходов

3.8.2 Создание ранжировочной таблицы для отнесения отходов к классам j j опасности

3.8.3 Определение классов опасности отходов на основании результатов j j ^ биотестирования с использованием В pumilus, Р caudatum и С affinis

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробный контактный тест на основе Bacillus pumilus для оценки токсичности загрязненных почв и отходов"

Актуальность работы. Растущая антропогенная нагрузка на экосистемы диктует необходимость разработки системы мер по ее минимизации. Для эффективного природоохранного управления необходима информация о степени опасности загрязняющих веществ для окружающей среды, прежде всего, их токсичности (Filip, 2002; Ладонин, Пляскина, 2004; Feisthauer et al., 2005; Fernandez et al., 2005; Classens et al., 2006; Судницын, 2006). В настоящее время наряду с методами химического анализа для оценки состояния природных и антропогенных объектов все чаще используются биологические методы. Наиболее сложны для анализа плотные многокомпонентные объекты, такие как почва, бытовые и промышленные отходы (Латыпова с соавт., 2002; Malkomes, 2006).

Одно из перспективных направлений в оценке плотных многокомпонентных сред -микробные тесты (Abbondanzi et al, 2003; Van Beelen, 2003; Kookana et al., 2004; Hinojosa et al., 2004; Rajapaksha, 2004). Наиболее разработаны методы, основанные на оценке аборигенной микрофлоры, которые являются достаточно простыми и чувствительными к токсикантам (Хазиев, 2005; Moreno et al., 2006; Sauve, 2006; Palmroth et al. 2006). Однако при интерпретации результатов зачастую возникают проблемы, связанные с отсутствием незагрязненного образца, идентичного анализируемому. Альтернативой указанным методам являются методы биотестирования, основанные на оценке ответной реакции интродуцированной микрофлоры (Ronnpagel et al., 1998; Athiainen et al., 2002). В настоящее время разработано большое количество таких тестов, включая ряд коммерческих, однако в основном они предназначены для оценки токсичности водных образцов (Kapanen, Itavaara, 2001; Селивановская, 2004; Classens et al., 2006). В случае же тестирования плотных образцов обязательная процедура - это получение водного экстракта (ISO 10712: 1995 (Е), 1995; ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.3-99, 1999; ФР. 1.39.2003.00923, 2003; Plaza, 2005; Fjallborg, 2006). Однако результаты, полученные на водных экстрактах, могут недоучитывать тип и количество загрязняющих веществ (Roenpagel et al., 1998; Alonso, 2006). Кроме того, общая проблема методов биотестирования - это отсутствие адекватного подхода к математическому описанию результатов экспериментов.1

Задачи исследования.

2. Разработать методику контактного биотестирования и определить метрологические параметры методики - прецизионность, повторяемость и интервалы концентраций стандартных токсикантов вызывающих 50% ингибирование тест-функции (ЕС50), в водных и почвенных образцах.

1 Соруководитель работы в области математического моделирования - д.б.н., к.ф.-м.н., профессор Савельев А. А.

Научная новизна. Впервые предложена методика контактного биотестирования с использованием дегидрогеназной активности бактерии В. pumilus КМ-21 для оценки опасности плотных объектов (почв и отходов). Стандартизированы условия культивирования тест-объекта, подготовки его к тестированию и операционные параметры реакции. Определены метрологические характеристики методики биотестирования - прецизионность, повторяемость и диапазон концентраций стандартных токсикантов (Cr*6, Cd+2), вызывающих 50%-ный ответный отклик тестового параметра (ЕС50).

Впервые на основе изучения различных способов определения токсичности почвенных образцов, искусственно загрязненных индивидуальными металлами, их смесью и органическим токсикантом, установлено, что разработанная методика контактного биотестирования с использованием В. pumilus КМ-21 по чувствительности сопоставима с тестированием на основе аборигенной микрофлоры и превосходит метод элюагного биотестирования с использованием В. pumilus КМ-21. Результаты контактного теста более тесно коррелируют с результатами теста с аборигенной микрофлорой по сравнению с элюатным тестом.

Впервые с использованием разработанной методики определены границы токсичности отходов, позволяющие ранжировать их по классам опасности. Продемонстрировано, что контактный тест с использованием В. pumilus КМ-21 дает возможность выявить большее количество отходов, относящихся к 2 и 3 классам опасности по сравнению с используемыми в настоящее время элюатными тестами на основе низших ракообразных С. affinis и простейших P. caudatum.

Практическое значение работы. По результатам проведенных исследований разработана, стандартизирована и подготовлена к аттестации в органах Госстандарта методика определения токсичности плотных объектов с использованием бактерии В. pumilus КМ-21. Предлагаемая методика опробована для определения токсичности реальных образцов промышленных отходов, образующихся на предприятиях г. Казани. Методика передана на апробацию в Центральную специализированную инспекцию аналитического контроля при МЭПР РТ и в Центральную заводскую лабораторию ОАО «КЗСК». Результаты исследований используются при проведении практических работ по курсам «Экологическое нормирование» и «Управление в обращении с отходами» на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета (КГУ), а также включены в учебное пособие «Теория и методы экологического нормирования» (2006), рекомендованное для обучения студентов и аспирантов экологического факультета КГУ.

На защиту выносятся следующие положения:

• Разработанная методика контактного биотестирования плотных объектов (почв и отходов) с использованием дегидрогеназной активности бактерии В pumilus КМ-21 является более чувствительной в отношении ряда металлов, их смеси и органического токсиканта по сравнению с элюатной методикой с использованием того же тест-объекта и сопоставима по чувствительности с методикой на основе тестирования аборигенной микрофлоры.

Апробация работы. Материалы работы изложены на II Международной научно-практической конференции «Экология: образование, наука, промышленность и здоровье» (Белгород, 2004), VI республиканской конференции «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан» (Казань, 2004), Международных молодежных конференциях «Туполевские чтения» (Казань, 2004, 2005), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы аграрной науки и пути их решения» (Ижевск, 2005), Всероссийской научной конференции «Современные аспекты экологии и экологического образования» (Казань, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Личный вклад автора в работу состоит в выполнении экспериментальной части диссертации, обсуждении результатов и формулировании выводов на их основе. Соавторами публикаций являются научный руководитель д.б.н. Селивановская С.Ю., д х.н., профессор, заведующий кафедрой прикладной экологии Латыпова В.З., сотрудники Гиссенского Университета (ФРГ) профессора Hummel Н., Duering R-A. и Gaeth S., сотрудник Кливлендского университета (Огайо, США) профессор Hung Y-T., участвовавшие в обсуждении результатов В создании программы для математической обработки результатов принимали участие д.б.н., профессор Савельев А.А. и к.х.н., с.н.с. Семанов Д А.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Галицкая, Полина Юрьевна

Выводы

1. По уровню дегидрогеназной активности и ее чувствительности в отношении ряда металлов наиболее перспективным в качестве тест-объекта признан штамм Bacillus sp КМ-21, впоследствии идентифицированный на основе молекулярного анализа последовательности 16S рДНК как В pumilus.

3. Наиболее адекватно описывает реальные результаты тестирования почв (контактное, элюатное биотестирование и оценка активности аборигенной микрофлоры) кинетическая модель неполного ингибирования, что свидетельствует о ее предпочтительности по сравнению с традиционной моделью линейной регрессии, кинетической моделью полного ингибирования и двух сигмоидальных моделей.

4. По степени негативного воздействия в отношении дегидрогеназной активности В pumilus КМ-21 при контактном методе биотестирования металлы составляют ряд Cr > Cd > Си > Pb > Ni, идентичный ряду, установленному при использовании теста с аборигенной микрофлорой.

5. На основе изучения различных методов определения токсичности почвенных образцов, искусственно загрязненных индивидуальными металлами, их смесью и органическим токсикантом показано, что разработанный метод контактного биотестирования по чувствительности сопоставим с тестированием на основе аборигенной микрофлоры и превосходит метод элюатного биотестирования. Результаты контактного теста тесно коррелируют с результатами теста с аборигенной микрофлорой (R=0,96), что свидетельствует о возможности замены последнего тестом с интродуцированной культурой В pumilus КМ-21.

6. По степени токсикорезистентности в отношении Cd(N03)2*4H20 тест-методы располагались в следующем порядке тест с P. caudatum > тест с С. affinis £ тест с В pumilus, в отношении К2СГ2О7 - тест с В pumilus > тест с P. caudatum > тест с С affinis

7. Использование ранжировочной системы для отнесения отходов к классам опасности для окружающей среды для результатов контактного биотестирования с В. pumilus КМ-21 позволило распределить обследованные промышленные отходы следующим образом: 5 класс - 13%, 4 класс - 20%, 3 класс - 60%, 2 класс - 7%, тогда как при применении стандартных тестов с С. affinis и P. caudatum к 3 и 2 классу было отнесено лишь 7% отходов, что свидетельствует о большем потенциале предлагаемого нами метода.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Галицкая, Полина Юрьевна, Казань

1. Амбулос, Н. Бациллы. Генетика и биотехнология текст. / Н. Амбулос. М.: Мир, 1992. - 198 с.

2. Ананьева, Н. Д. Устойчивость микробных сообществ почв при внесении пестицидов текст. / Н.Д. Ананьева, Т.С. Демкина, У. Ч. Стан //Почвоведение. -1997 б. -№ 1. -С. 69-74.

3. Ананьева, НД. Влияние высушивания-увлажнения и замораживания-оттаивания на устойчивость микробных сообществ почвы текст. / Н.Д. Ананьева, Е.В. Благодатская, Т.С. Демкина // Почвоведение.-1997 а.-№9.-С.1132-1137.

4. Ананьева, Н.Д. Микробиологические аспекты самоочищения и устойчивости почв текст. / Н.Д. Ананьева// Агрохимия. 1999. -№ 7. - С. 92-95.

5. Андреюк, Е. И. Иерархическая система биоиндикации почв, загрязненных тяжелыми металлами текст. / Е. И. Андреюк, Г. А. Путинская, Е.В. Валагурова, В.Е. Козырицкая, Н.И. Иванова, А. Д. Остапенко // Почвоведение. 1997. - №7. - С. 1491-1496.

6. Бабьева, И. П. Биология почв текст. / И. П. Бабьева, Г. М. Зенова.-М.: Изд-во МГУ, 1989. -336с.

7. Башкин, Е.В. Биогеохимические основы экологического нормирования текст. / Е.В. Евстафьева, В.В. Снакин и др. М.: Мир, 1993.- С.128-141.

8. Благодатская, Е.В. Изменение экологической стратегии микробного сообщества почвы, инициированной внесением глюкозы текст. / Е.В. Благодатская, И.Н. Богомолова, С.А Благодатский // Почвоведение. 2001. - №5. - С. 700-608.

9. Благодатская, Е.В. Характеристика состояния сообщества почв по величине метаболического коэффициента текст. / Е.В. Благодатская, Н.Д. Ананьева, Т.Н. Мякшина // Почвоведение. -1995.-№2.-С. 205-210.

10. Галиулин, Р.В. Индикация загрязнения почв тяжелыми металлами путем определения активности почвенных ферментов текст. / Р.В. Галиулин // Агрохимия. 1989. - №11. - С. 133-142.

11. ГН 2.1.7.020-94. Ориентировочно допустимые концентрации (ОДК) тяжелых металлов и мышьяка в почве Дополнение №1 к перечню ПДК и ОДК №6229-91. [текст]. М.: Госкомсанэпиднадзор России, 1995. - 4с.

12. Гонзалес, А. Инфузории в биотестировании тяжелых металлов текст. / А. Гонзалес, Х.К. Гуттиерес // Инфузории в биотестировании: Тез. докл. междунар. научно-практ. конференции. СПб, 1998. - С. 212-215.

13. Гончарук, Е.И. Гигиеническое нормирование химических веществ в почве текст. / Е.И. Гончарук, Г.И. Сидоренко.- М: Изд-во Медицина, 1987. 320 с.

14. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. текст. Основные положения и определения. М.: ИПК Изд-во стандартов. 2002. - С. 24.

15. ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. текст. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений. М.: ИПК Изд-во стандартов. 2002. -С. 42.

16. Государственный доклад "О состоянии природных ресурсов и об охране окружающей среды Республики Татарстан" текст. Казань: Мир без границ, 2004. - 471 с.

17. Граковский, В.Г. Оценка загрязнения почв Челябинской области тяжелыит металлами и мышьяком текст. / В.Г Граковский, А.С. Фрид, С.Е. Сорокин, П.А. Тимохин // Почвоведение. -1997. -№1. С. 88-95.

18. Громов, Б.В. Экология бактерий текст. / Б.В. Громов, Г.В. Павленко. СПб.: ЛГУ, 1989. -254 с.

19. Гусев, М.В. Микробиология текст. / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. М.: Изд-во московского университета, 2001. 396 с.

20. Звягинцев, Д.Г. Микробиологические и биохимические показатели загрязнения свинцом дерново-подзолистой почвы текст. / Д.Г. Звягинцев, А.В. Кураков, М.М. Умаров, 3. Филип//Почвоведение. 1997.- №9. -С. 1124-1131.

21. Иванова, Ю.Н. Электрополимеризованные флавины эффективные катализаторы окисления

22. NADH текст. / Ю.Н. Иванова, К.В. Ревунова, Е.Е. Карякина, А.А. Карякин // Сенсор. 2004. -№4(13).-С. 19-25.

23. Ильин, В.Б. Тяжелые металлы в системе почва-растение текст. / В.Б. Ильин. Новосибирск: Наука, 1991.-151с.

24. Кабиров, P.P. Разработка и использование многокомпонентной тест-системы для оценки токсичности почвенного покрова городской территории текст. / P.P. Кабиров, А.Р. Сагитова, Н.В. Суханова// Экология. 1997. - №6. - С. 408-411.

25. Колешко, О.И. Экология микроорганизмов в почве текст. / О.И. Колешко. Минск: Высш. шк., 1981.-345 с.

26. Критерии отнесения отходов к классу опасности для окружающей природной среды. Утверждены приказом МПР России от 15.06.2001 г. №511 текст. 2001. - 8с.

27. Ладонин, Д.В Изучение механизмов поглощения Си (II), Zn (II), Pb (II) дерново-подзолистой почвой текст. / О.В. Пляскина // Почвоведение. 2004. -№5. - С. 537-544.

28. Латыпова, В.З. Региональное нормирование антропогенных нагрузок на природные среды текст. / С.Ю. Селивановская, Н.Ю. Степанова, Р. И. Винокурова. Казань: Фэн, 2002. -243 с.

29. Ленинджер, А. Основы биохимии текст.: пер. с англ. / А. Ленинджерю М., 1985. - 105 с.

30. Логинов А.Г. Состояние энергетического метаболизма лимфоцитов регионарного лимфатического узла при имплантации никелида титана текст. / А.Г. Логинов // Бюллетень СО РАМН. 2005. - № 2(116). - С. 139-142.

31. ПНД Ф Т 14.1;2;3;4.3-99. Токсикологические методы контроля. Методика определения токсичности воды по смертности и изменению плодовитости дафний текст. Москва, 1999. -.31с.

32. Потапова, Н.А. Метод биотестирования загрязненных вод с помощью культур водных микроорганизмов текст. / Н.А. Потапова, Т.В. Королевская // Методы биотестирования вод. -Черноголовка, 1988.-С. 17-18.

33. Сазонова, В.Е. Использование биотестов при разработке мониторинга водной экосистемы текст. / В.Е. Сазонова, Л.А. Замуняк, Л.М. Савельева, Е.В. Морозова, О.Б. Костюк // Экология. -1997. № 3.- С. 207- 212.

34. Селивановская, С.Ю. Обоснование системы экспериментальной оценки класса токсичности осадков сточных вод и выбора способа их утилизации текст. / С.Ю. Селивановская, В.З. Латыпова // Экологическая химия.- 2001 а. т. 10. - №2.-С.124-134.

35. Селивановская, С.Ю. Система биологических тестов для оценки токсичности объектов окружающей среды (почва) текст. / С.Ю. Селивановская, В.З. Латыпова. Казань: лаборатория оперативной полиграфии КГУ, 2001 б. - 24 с.

36. Селивановская, С.Ю. Создание тест-системы для оценки токсичности многокомпонентных образований / С.Ю. Селивановская, В.З. Латыпова // Экология. 2004. - №1. - С. 21-25.

37. Селивановская, С.Ю. Теория и методы экологического нормирования текст.: учеб. пособие / С.Ю. Селивановская, В.З. Латыпова, П.Ю. Галицкая. Казань: КГУ, 2006. - 85с.

38. Судницын, И.И. Закономерности распределения Си, Zn, РЬ и Ni в почвах Московской области текст. / И.И. Судницын, И.И. Сашина // Агрохимия 2006. - №2 - С. 30-37.

39. Хазиев, Ф.Х. Методы почвенной энзимологии текст. / Ф.Х. Хазиев. М.: Наука, 2005. -48 с.

40. Черных, Н. А. Нормирование загрязнения почв тяжелыми металлами текст. / Н. А. Черных, В. Ф. Ладонин // Агрохимия. -1995. № 6. - С. 71-79.

41. Яковлев, А.С. Биологическая диагностика и мониторинг состояния почв текст. / А.С. Яковлев // Почвоведение. 2000. - №1. - С. 70-79.

42. Alonso, E. Assessing the Influence of Biota on Metal Mobility in a Multi-Species Soil System (MS-3) текст. / E. Alonso, C. Fernandez, I. Najera, J. Pro, J.V. Tarazona, G. Carbonell // Soil and Sediment Contamination.-2006.-Vol. 15.-No. 7.-P. 327-337.

43. Alvarez, M.A.D. Effects of compost on rhizosphere microflora of the tomato and on the incidence of plant growth-promoting rhizobacteria текст. / M.A.D. Alvarez, S. Gagne, L. Antoun // Applied Environmental Microbiology. 1995. -No. 61. - P. 194-199.

44. Anderson, Т.Н. Maintenance carbon reqiurements of actively-metabolizing microbial populations under in situ conditions текст. / Т.Н. Anderson, K.H. Domsch //Soil. Biol. Biochem. 1985. -No 17.-P. 197-203.

45. Andreoni, V. Bacterial communities and enzyme activities of PAH polluted soils текст. / V. Andreoni, L. Cavalca, M.A. Rao, G. Nocerino, S. Bernasconi, E. Dell'Amico, M. Volombo, L. Gianfreda // Chemosphere. 2004. - No. 57. - P. 401-412.

46. Aoyama, M. Factors affecting microbial biomass and dehydrogenase activity in apple orchard soils with heavy metal accumulation текст. / M. Aoyama, T. Nagumo // Soil Science and Plant Nutrition. 1995. No.42. - P. 821-831.

47. Atlas, R.M. Microbial Ecology: Fundamentals and Applications текст. / R.M. Atlas, R. Bartha. -Redwood City, CA: Benjamin /Cummings, 1998. 694 p.

48. Avidano, L. Characterization of soil health in an Italian polluted site by using microorganisms as bioindicators текст. / L. Avidano, E. Gamalero, G.P. Cossa, E. Carraro // Applied Soil Ecology. -2005.-No. 30.-P. 21-33.

49. Baath, E. Effects of heavy metals in soil on microbial peocesses and populations (A review) текст. / E. Baath // Water Air Soil Pollut. 1989, No 47. - P. 335-379.

50. Balestra, G.M. Increasing the efficiency of the plate counting method for estimating bacterial diversity текст. /G.M.Balestra, I.J.Misagi //J. Microbiol. Meth.- 1997.-No. 30.-P. 111-117.

51. Bargett, R.D. Changes in soil fungal: bacterial biomass rations following reductions in the intensity of management of an upland grassland текст. / R.D. Bargett, P.J. Hobbs, A. Frostegard // Biol. Fertil. Soil. -1996. No. 22. - P. 261-264.

52. Barns, S.M. Remarkable archael diversity detected in a Yellowstone National Park hot spring environment текст. / S.M. Barns, R.E. Fundyga, M.W. Jeffries, N.R.Pace // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1994.-No 91.-P. 1609-1613

53. Bierkens, J. Comparative sensitivity of 20 bioassays for soil quality текст. / J. Bierkens, G. Klein, P. Corbisier, R. Van Den Heuvel, L. Versxhaeve, R. Wetlens, G. Schoeters // Chemosphere.- 1998.-V.37, N14-15.-P.2935-2947.

54. Bioassays for Soils Текст. / eds. G. Kreysa, J. Wiesner. Frankfurt am Main: DECHEMA, 1995. -45p.

55. Biro, В. Metal sensitivity of some symbiotic Infixing bacteria and Pseudomonas strains текст. /

56. B. Biro, H.E.A.F. Bayoumi, S. Balazsy, M. Kecskes // Acta Biolodica Hungarica. 1995. - Vol. 46. - No. 1.-P. 9-16.

57. Bitton, G. Bacterial and enzymatic bioassays for toxicity testing in the environment текст. / G. Bitton, B. Koopman // Rev. Environ. Contamin. Toxicol. 1992. - No 125. - P.l-22.

58. Bitton, G. Short-term toxicity assay based on daphnid feeding behavior текст. / G. Bitton, K. Rhodes, B. Koopman, M. Cornejo // Water Environ.Res 1995. -Vol. 67. - P. 290-293.

59. Bitton, G. Wastewater Microbiology текст. / G.Bitton.- New York: Willey-Liss, 1994. 478p.

60. Bloem, J. Microbial indicators текст. / J. Bloem, A.M. Breure // Bioindicators and Biomonitors. -2003.-Vol. 6.-P. 259-282.

61. Bogomolov, D.M. An ecosystem approach to soil toxicity testing: a study of copper contamination in laboratory soil microcosms текст. / D.M. Bogomolov, S.-K. Chen, R.W. Parmelee, S. Suber,

62. C.A. Edwards // Applied Soil Ecology. -1996. Vol. 4. - P.95-105.

63. Bossio, D.A. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles текст. / D.A. Bossio, K.M. Scow, N. Gunapala,K.J.Graham//Microb.Ecol.- 1998.-No. 36.-P. 1-12.

64. Bremner, J.M. Effects of nutrification inhibitors on denitrification of nitrate in soil текст. / J.M. Bremner, J.C. Yeomans//Biol. Fert. Soils. 1986. - No 2. - P. 173-179.

65. Brendecke, J.W. Soil microbial activity as an indicator of soil fertility: long-term effects of municipal sewage sludge on an arid soil текст. / J.W. Brendecke, R.D. Alexson, I.L. Pepper // Soil Biol. Biochem.- 1993.- V.25.- P.751-758.

66. Bringmann, G. Comparison of the toxicity thresholds of water pollutants to bacteria, algae, and protozoa in the cell multiplication inhibition test текст. / G. Bringmann, R. Kuhn // Water Research. 1980. - Vol. 14. - No. 3. - P. 231-241.

67. Brohon, B. Complementarity of bioassays and microbial activity measurements for the evaluation of hydrocarbon-contaminated soil quality текст. / В. Brohon, С. Delolme, R. Gourdon // Soil Biology and Biochemistry. 2001. - No. 33. - P. 883-891.

68. Brookes, P.C. The use of microbial parameters in monitoring soil pollution by heavy metals текст. / P.C. Brookes // Biol. Fertil. Soils. 1995. - Vol. 19. - P. 269-279.

69. Brouwer, H. Testing for chemical toxicity using bacteria текст. / H. Brouwer // J. Chem. Educ. -1991. Vol. 68. - No. 8. - P. 695-697.

70. Buckley, D.H. Phylogenetic analysis of nonthermophilic members of the kingdom Crenarchaeota and their diversity and abundance in soils текст. / D.H. Buckley, J.R. Graber, T.M. Schmidt // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - No. 64. - P. 4333-4339.

71. Bundy J.B. Combined microbial community level and single species biosensor responses to monitor recovery of oil polluted soil текст. / J.G. Bundy, G.I. Paton, C.D. Campbell // Soil Biology & Biochemistry.-2004.-No. 36.-P. 1149-1159.

72. Bums, R.G. Enzyme Activity in soil: some theoretical and practical considerations текст. / R.G. Burns // Soil Enzymes. 1978. - No. 1. - P. 295-340.

73. Burrows, L. The use of integrated microcosms to predict the fate and effects of pesticides on soil ecosystems текст. / L. Burrows, C.A. Edwards // European Journal of Soil Biology. 2002. - No. 38.-P. 245-249.

74. Camargo, F.A.O. Diversity of chromium-resistant bacteria isolated from soil contaminated with dichromate текст. / F.A.O. Camargo, B.C. Okeke, F.M. Bento, W.T. Frankenberger // Applied Soil Ecology. 2005. - No. 29. - P. 193-202.

75. Chaineau, C.H. Bioremediation of a crude oil-polluted soil: biodegradation, leaching and toxicity assessment текст. / C.H. Chaineau, C. Yepremian, J.F. Vidalie, D. Ballerini // Water, Air and Soil Pollution. 2003. - Vol. 144. - P. 419-440.

76. Chander К Different sources of heavy metals and their long-term effects on microbial properties / K. Chander, J. Dyckmans, R. Joergensen, B. Meyer, M. Raubuch // Biol. Fertil. Soils.- 2001.-V.34.-P.241-247.

77. Chapman, P.M. Integrating toxicology and ecology: putting the "eco" into ecotoxicology текст. / P.M. Chapman// Marine Pollution Bulletin. 2002. - No. 44. P. 7-15.

78. Chen, Y.X. Phototoxicity of dredged sediments from urban canal as land application текст. / Y.X Chen, G.W. Zhu, G.M. Tian, G.D. Zhou, Y.M. Luo, S.C. Wu // Environmental Pollution. 2002. -Vol.117.-P. 233-241.

79. Chronkar, P.K. Degradation of clay-enzyme complexes by soil microorganisms текст. / P.K. Chronkar, J.C. Tarafdar // Zbl. Mikrobiol. 1985. - No 140. - P. 471-474.

80. Dahllof, I. The effect of tbt on the structure of marine sediment community a boxcosm study текст. /1. Dahllof, S. Agrenius, H. Blanck, P. Hall, K. Magnusson, S. Molander // Mar. Pollut. Bull. - 2001. - No. 42 (8). - P. 689-695.

81. Dar, G.H. Impact of lead and sewage sludge on soil microbial biomass and carbon and nitrogen mineralization текст. / G.H. Dar // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1997. - Vol. 58. - P. 234240.

82. Dar, G.H. Influence of the cadmium on carbon and nitrogen mineralization in sewage sludge amended soils текст. / G.H. Dar, M.M. Mishra // Environmental Pollution. 1994. - Vol. 84. - P. 285-290.

83. Davoren M. A test battery for the ecotoxicological evaluation of the agri-chemical Environ текст. / M. Davoren, A.M. Fogarty // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2004. - No. 59. - P. 116122.

84. De Leij, F.A.A.M. The use of colony development for the characterization of bacterial communities in soil and on roots текст. / F.A.A.M. De Leij, J.M. Whipps, J.M. Lynch // Microb. Ecol. 1993. -No. 27.-P. 81-97.

85. De Mora, A.P. Changes in enzyme activities and microbial biomass after "in situ" remediation of a heavy metal-contaminated soil текст. / A.P. de Mora, J.J. Ortega-Carlo, F. Cabrera, E. Madejon //Щ

86. Applied Soil Ecology. -2005. -No. 28. -P. 125-137.

87. De Ruiter, P.C. Modelling food webs and nutrient cycling in agroecosystems текст. / P.C. De Ruiter, A.-M. Neutel, J.C. Moore // TREE. 1994. -No. 8. - P. 378-383.

88. Debosz, K. Evaluating effects of sewage sludge and household compost on soil physical, chemical and microbiological properties текст. / К. Debosz, S.O. Petersen, L.K. Kure, P Ambus // Applied Soil Ecology. 2002. - No. 19. - P. 237-248.

89. Factories. 2006. - Vol, 5. - No. 11. - P. 1186-1192.

90. Doelman, P. Resistance of soil microbial communities to heavy metals текст. / P. Doelman // Microbial Communities Soil / eds. V. Jensen. A. Kjoller, L.H. Soerensen, London, New York: Elsevier, 1985.-P. 369-383.

91. Doelman, P. Short- and long-term effects of heavy metals on phosphatase activity in soils: An ecological dose-response model approach текст. / P. Doelman, L. Haanstra// Biol. Fert. Soils. -1989.-No 8. -P.235-241.

92. Doelman, P. Short-term and long-term effects of cadmium, chromium, copper, nickel, lead and zink on soil microbial respiration in relation to abiotic soil factors текст. / P. Doelman, L. Haanstra //Plant and Soil. 1984. - No 79. - P. 317-327.

93. Domsch, K. Status and perspectives of side-effect testing текст. / К. Domsch // Toxicol. Environ. Chem.-1991.-No 30.-P. 147-152.Щ

94. Donkin, S.G. A soil toxicity test using the nematode Caenorhabditis elegans and an effective method of recovery текст. / S.G. Donkin, D.B. Dusenbery // Arch. Environ. Contain. Toxicol. -1993.-No. 25.-P. 145-151

95. Doran, J.W. Defining Soil Quality for a Sustainable Environment текст. / J.W. Doran, D.C. Coleman, D.F. Bizdicek, B.A. Stewart // American Society of Agronomy, SSSA, Special Publication, Madison: WL, 1994. - No. 35. - P. 23-37.

96. Duelli, P. Biodiversity indicators: the choise of values and measures текст. / P. Duelli, M. Obrist // Agriculture, Ecosystems and Environment. 2003. - No. 98. - P. 87-98.

97. Dutka, B.J. Application of four bacterial screening procedures to assess changes in the toxicity of chemicals in mixtures текст. / B.J. Dutka, K.K. Kwan // Environmental Pollution (Series A). -1982.-Vol. 29.-No. l.-P. 125-134.

98. Dutka, B.J. Comparison of several microbiological toxicity screening tests текст. / B.J. Dutka, N. Nyholm, J. Petersen // Water Res. 1996. - Vol. 17. - P.1363-1368.

99. Edwards, С.A. Assesing the effects of environmental pollutants on soil organisms, communities, processes and ecosystems текст. / C.A. Edwards // European Journal of Soil Biology. 2002. -No. 38.-P. 225-231.

100. Faixova, Z. Effects of divalent ions on ruminal enzyme activities in sheep текст. / Z. Faixova, S. Faix, Z. Makova, P. Vaczi, M. Prosbova // Acta Veterinaria. 2006. - No. 56 (1). - P. 17-23.

101. Feisthauer, N. Effects of metal-contaminated forest soils from the Canadian shield to terrestrial organisms текст. / N. Feisthauer, G.L. Stephenson, J.I. Princz, R.P. Scroggins // Environmental Toxicology and Chemistry. 2005. - No. 25. - P. 823-835.

102. Felske, A. In situ detection of an uncultured predominant Bacillus in Dutch grassland soils текст. / A. Felske, A.D.L. Akkermans, W. De Vos // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - No. 64. - P. 45884590.

103. Felske, A. Spatial homogeneity of abundant bacterial 16S rRNA molecules in grassland soils текст. / A. Felske, A.D.L. Akkermans // Microb. Ecol. 1998. - No. 36. - P. 31-26.Щ

104. Fernandes, S.A.P. Effects of sewage sludge on microbial biomass, basal respiration, metabolic quotient and soil enzymatic activity текст. / S.A.P. Fernandes, W. Bettiol, C.C.Cerri // Applied Soil Ecology. 2005. - No. 30. - P. 65-77.

105. Filip, Z. International approach to assessing soil quality by ecologically-related biological parameters текст. / Z. Filip // Agriculture, Ecosystems and Environmfcnt. 2002. - No. 88. - P. 169-174.Щ

106. Fjallborg, B. Toxicity identification evaluation of five metals performed with two organisms (Daphnia magna and Latuca sativa) текст. / В. Fjallborg, B.Li, E. Nilsson, G. Dave // Arch. Environ. Contain. Toxicol. 2006. - No. 50. - P. 196-204.

107. Fliessbach, A. Soil microbial biomass and microbial activity in soils treated with heavy metal contaminated sewage sludge текст. / A. Fliessbach, R. Martens, H.H. Reber // Soil Biol. Biochem. -1994.- V.26.-P.1201-1205.

108. Freitas dos Santos, L. Comparison of three microbial assay procedures for measuring toxicity of chemical compounds: ToxAlert®10, CellSense and Biolog MT2 microplates / L. Freitas dos

109. Santos, L. Defrenne, A. Krebs-Brown текст. // Analytica Chimica Acta . 2002. - Vol. 456. - P.41.54.

110. Gabrielle, B. Field-scale modeling of carbon and nitrogen dynamics in soils amended with urban waste compost текст. / В. Gabrielle, J. Da-Silveira, S. Houot, J. Michelin // Agriculture, Ecosystems and Environment. 2005. - No. 110. - P. 289-299.

111. Gabrielle, B. Simulating urban waste compost impact on C-N dynamics using a biochemical index текст. / В. Gabrielle, J. Da-Silveira, S. Houot, C. Francou // J. Environ. Qual. 2004. - No. 33. -P. 2333-2342.

112. Garcia- Gil, J.C. Long-term effects of municipal solid waste compost application on soil enzyme activities and microbial biomass текст. / J.C. Garcia-Gil, C. Plaza, P. Soler-Rovira, A. Polo // Soil Biology & Biochemistry. -2000. -V.32. -P.1907-1913

113. Garcia, C. Effect of Bromacil and Sewage Sludge Addition on Soil Enzymatic Activity текст. / С. Garcia, Т. Hernandez // Soil Sci. Plant Nutr. 1996. - No. 42. - P. 191-195.

114. Garland, J.L. Patterns of potential С source utilization by rhizosphere communities текст. / J.L. Garland // Soil Biol. Biochem. 1996. - No. 28. P. 223-230.

115. Ghosh, S.K. Toxicity of zinc in three microbial test systems текст. / S.K. Ghosh, P.B. Doctor, P.K. Kulkarni // Environ. Toxicol, and Water Quality. 1996. - Vol.11. - No 1. - P. 13-19.

116. Giller, K.E. Toxicity of heavy metals to microorganisms and microbial processes in agricultural soils: a review текст. / K.E. Giller, E. Witter, S.P. McGrath // Soil Biol. Biochem.- 1998.- Vol. 10/11.-P.1389-1414.

117. Haanstra, L. An ecological dose response model approach of short- and long-term effects of heavy metals on arylsulphatase activity in soils текст. / L. Haanstra, P. Doelman // Biol. Fertil. Soils. -1991.-No 11.-P. 18-23.

118. Haanstra, L. Glutamic and decomposition as a sensitive measure of heavy metal polution in soil текст. / L. Haanstra, P. Doelman //Soil. Boil. Boichem. 1983. - No 16. - P. 595-600.

119. Haanstra, L. The use of sigmoidal dose response curves in soil ecotoxicological research / L. Haanstra, P. Doelman, V.H. Oude Voshaar текст. / Plant Soil. 1985. - No. 84. - P. 293-297.

120. Habte, M. Residual toxicity of soil-applied chlorothalonil on mycorrhizal symbiosis in Leucaena leucocephala текст. / M. Habte, T. Aziz, and J.E. Yuen // Plant and Soil. 1992. - No 140. - P. 263-268.

121. Hackett, C.A. Statistical analysis of the time course of Biolog substrate utilization текст. / С.A. Hackett, B.S. Griffiths Hi. Microbiol. Meth. 1997. - No. 30. - P. 63-69.

122. Haider, K.M. Mineralization of 14C-labelled humic acids and of humic acid bounds 14C-xenobiotics by Phenerochaete chrysoporium текст. / K.M. Haider, J.P. Martin // Soil. Biol. Biochem. 1988. - No 20. - P. 425-429.

123. Hani, H. Soil effect due to sewage sludge application in agriculture текст. / H. Hani, A. Siegenthaler, T. Candinas //Fertilizer and Environment / ed. C.Rodriguez-Barrueco, 1996. P. 267274.

124. Haymore, B.R. A case of persistent Bacillus pumilis bacteremia associated with cholangitis текст. / B.R. Haymore, K.S. Akers, T.M. Ferguson // Journal of Infection. 2006. - Vol. 52. - Iss. 2 - P. 154-155.

125. Hernandes-Apaolaza, L. Initial organic matter transformation of soil amended with composted sewage sludge текст. / L. Hernandes-Apaolaza, J. M. Gasco, F. Guerrero // Biol. Fertil. Soils. -2000.-No. 32. -P.421-426

126. Hitzl, W. Application of multivariate analysis of variance and related techniques in soil studies with substrate utilization tests текст. / W. Hitzl, M. Kessel, H. Insam // J. Microbiol. Meth. 1997. -No. 30.-P. 81-89.

127. Hoekstra, J.A. Alternatives for the no-observed-effect level текст. / J.A. Hoekstra, P.H. van Ewijk // Envirin. Toxicol. Chem. 1993. - No 12. - P. 187-195.

128. Ни, S. Microbial dynamics associated with multiphasic decomposition of 14-labeled cellulose in soil текст. / S. Ни, A.H.C. van Bruggen // Microb. Ecol. 1997. - No.33. - P. 134-143.

129. ISO 11269-1 Soil quality Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 1: Method for measurement of inhibition of root growth текст. - 1993. - 9p.

130. ISO 11269-2 Soil quality Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 2: Effects of chemicals on the emergence and growth of higher plants текст. - 1995. - 7p.

131. ISO/CD 11438: Water Quality Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of of Vibrio fischeri (Liminescent bacteria test) /International Standard текст. - 1993. -14p.

132. ISO/DIS 10712. Water Quality Pseudomonas putida growth inhibition test (Pseudomonas Cell Multiplication Inhibition Test)/ International Standard. - 1995. - 14p.

133. Jiang, X.L. Changes in soil microbial biomass and Zn extractability ovse time following Zn addition to a paddy soil текст. / X.J. Jiang, Y.M. Luo, S.L. Liu, K.Q. Ding, S.C. Wu, Q.G. Zhao, P. Christie // Chemosphere. -2003. No. 50. - P. 855-861.

134. Jiangning, C. Ecotoxicological evaluation of 4-aminobiphenyl using a test battery текст. / С. Jiangning, Y. Hongxia, L, Ying, J, Wei, J. Jie, Z. Junfeng, H. Zichun // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2004. - No. 58. - P. 104-109.

135. Johansson, M. Microbial and chemical changes in two arable soils after long-term sludge amendments текст. / M. Johansson, B. Stenberg , L. Torstensson // Biol. Fertil. Soils. 1999. -Vol. 30.-P. 160-167.

136. Jordan, M.J. Effects of zink-smelter emissions on forest soil microflora текст. / M.J. Jordan, M.P. Lechevalier //Can. J. Microbiol. 1975. -No 21. - P. 1855-1865.

137. Kapanen, A. Ecotoxicity Tests Compost Applications текст. / A. Kapanen, M. Itavaara // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2001. - No 49. - P. 1 -16.

138. Kelly, J.J. Effects of the land application of sewage sludge on soil heavy metal concentrations and soil microbial communities тест. / J.J. Kelly, M. Haggblom, L.T.I Robert // Soil Biology and Biochemistry. 1999. - Vol. 31. - P. 1467-1470.

139. Kenzaka, T. rRNA-Targeted fluorescent in situ hybridization analysis of bacterial community structure in rivet water текст. / Т. Kenzaka, N. Yamaguchi, K. Tani, M. Nasu // Microbiology. -1998.-No. 144.-P. 2085-2093.

140. Khan, M. Effect of soil on microbial responses to metal contamination текст. / M. Khan, J. Scullion // Environmental Pollution.- 2000 .- Vol. 110 . P. 115-125.

141. Knight, B. A method to buffer the concentrations of free Zn and Cd ions using a cation exchande resin in bacterial toxicity studies текст. / В. Knight, S.P. McGrath // Environmental Toxicology and Chemistry. 1995. - Vol. 14. - No. 12. - P. 2033-2039.

142. Koenig, P.D. Evaluation of measyrement errors in toxicity tests for nitrogen fixation текст. / P.D. Koenig, W. Toetz // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1990. - No 45. - P. 6-12.

143. Konopka, A. The use if carbon substrate utilization patterns in environmental and ecological microbiology текст. / A. Konopko, L. Oliver, Jr.R.F. Turco // Microb. Ecol. 1998. - No. 35. - P. 103-115.

144. Kooijman, S.A.L. A safety factor for LC50 values allowing for differences in sensitivity among species текст. / S.A.L. Kooijman // Water Res. 1987. - No 21. - P. 269-276.

145. Kuperman, R. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass, and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem текст. / R. Kuperman, M.M. Carreiro // Soil Biol. Biochem.-1997.-V. 29.-P. 179-190

146. Kuperman, S. Multispecies and multiprocess assays to assess the effects pf chemicals on contaminated sites текст. / S. Kuperman, T. Knacker, R. Checkai, C.A. Edwards // Anal Bional Chem. 2002. - No. 373. - P. 596-603.

147. Kwan, K.K. Development of reference sediment samples for soild phase toxicity screening test текст. / K.K. Kwan, B.J. Dutka // Bull. Environ. Contam. Toxicology. 1996. - No. 56. - P. 696207.

148. Kwan, K.K. Evaluation of Toxi-chromotest direct sediment toxicity testing procedure and Microtoxsolid-phase testing procedure текст. / K.K. Kwan, B.J. Dutka // Bull Environ Contam Toxicol. -1992.-Vol. 49.-P. 656-662.

149. Ladd, J.M. Soil structure and biological activity текст. / J.M. Ladd, R.C. Foster, P. Nannipieri, J.M. Oades // Soil Biochemistry, Vol. 9 [текст] / eds. G. Stotzky, J.M. Bollag, New York: Marcel Dekker, 1996. P. 23-78.

150. Lai, K.M. Enzyme activities in sandy soil amended with sewage sludge and coal ash текст. / K.M. Lai, D.Y. Ye, W.C. Wong // Water, Air and Soil Pollution.- 1999. Vol. 113 - P. 261-272.

151. Lee, S. A novel microbial sensor for determination of toxic compounds utilizing recombinant DNA technology and bioluminescence текст. / S. Lee, M. Suzuki, E. Tamila, I. Karube // Chem. Express. -1991. Vol. 6. - No. 6. - P. 415-418.

152. Lehman, R.M. Combined microbial community-level analyses for quality assurance of terrestrial 1 subsurface cores текст. / R.M. Lehman, F.S. Colwell, D.B. Ringelberg, D.C. White // J. Microbiol. Meth. 1995. - No. 22. - P. 264-281.

153. Levine, A.D. Effect of chemicals on microorganisms текст. / A.D. Levine, W. Toetz // Water Environ. Res. 1994. - No 66. P. 611-623.

154. Liu, D. Rapid toxicity assessment of water-soluble and water-insoluble chemicals using a modified agar plate method текст. / D. Liu, Y.K. Chau, B.J. Dutka // Water Research. 1989. - Vol. 23. -No. 3. - P. 333-339.

155. Lopes, W.S. Influence of inoculum on performance of anaerobic reactors for treating municipal solid waste текст. / W.S. Lopes, V.D. Leite, S. Prasad // Bioresource Technology. 2004. - No. 94.-P. 261-266.

156. Macalady, J.L. Effects of metan sodium fumigation on soil microbial activity and community structure текст. / J.L. Masalady, M.E. Fuller, K.M. Scow // J. Environ. Qual. 1998. - No. 27. -P. 53-63.

157. Madejon, E. Soil Enzymatic response to addition of heavy metals with organic residues текст. / E. Madejon, P. Burgos, R. Lopes, F. Cabrera // Biol Fertil Soils. 2001. - No. 34. - P. 144-150.

158. Madejon, E. Soil enzymatic response to addition of heavy metals with organic resides текст. / E. Madejon, P. Burgos, R. Lopes, F. Cabrera // Biol Fertil Soil. 2001. - No. 34. - P. 144-150.

159. Madrid, M.M. Ecotoxicity tests using Daphnia magna snd Tubifex tubifex for the characterization of river sediments текст.: doctoral thesis / Martinez Madrid M. University of he Basque Country, Spain -1997.

160. Malkomes, H.P. Mikrobiologisch-oekotoxicologische Bodenuntersuchungen von zwei Unkrautbekaempfung mit hohen Dosierungen eingesetzten Fettsaeure-Herbiziden текст. / H.P. Malkomes // Umweltchemie und Oekotoxicology. 2006. - No. 18 (1). - P. 13-20.

161. Maloney, P.E. Bacterial community structure in relation to the carbon environment in lettuce and tomato rhizospheres and in bulk soil текст. / P.E. Maloney, A.H.S. van Bruggen, S. Hu // Microb. Ecol.-1997.-No. 34.-P. 109-117.

162. Markwiese, J.T. Toxicity bioassays for ecological risk assessment in arid and semiarid ecosystems текст. / J.T. Markwiese, R.T. Ryti, M.M. Hooten, D.I. Michael, I. Hlohowskyj // Rev. Environ. Contam. Toxicol. 2001. - Vol. 168. - P. 43-98.

163. Marschner, P. Structure and function of the soil microbial community in a long-term fertilizer experiment текст. / P. Marschner, E. Kandeler, B. Marschner // Soil Biology and Biochemistry. -2003.-No. 35.-P. 453-461.

164. McGrath, S.P. Effects of heavy metals from sewage sludge on soil microbes in agricultural ecosystems текст. / S.P. McGrath // Toxic Metals in Soil-Plant Systems, New York: John Wiley & Sons Ltd, 1994. - P.247-274.

165. McGrath, S.P. Long-term effects of metals in sewage sludge on soils, microorganisms and plants текст. / S.P. McGrath, A.M. Chaudri, K.E. Giller // J. Industrial Microbiology. 1995. - Vol. 14. -P. 94-104.

166. Mitsui, H. Incubation time and media requirements of culturable bacteria from different philogenetic groups текст. / H. Mitsui, K. Gorlach, H.-J. Lee, R. Hattori, T. Hattori // J. Microbiol. Meth.-1997.-No. 30.-P. 103-110.

167. Moffett, B.F. Zinc contamination decreases the bacterial diversity of agricultural soils текст. / B.F. Moffett, F.A. Nicholson,N.C. Uwakwe, B.J. Chambers, T.C.J. Hill // FEMS Microbiology Ecology. -2003.-Vol. 43.-P. 13-19.

168. Moreno, J. L. The ecological dose of nickel in a semiarid soil amended with sewage sludge related to the unamended soil текст. / J. L. Moreno, A. Perez, A. Aliaga, T. Hernandez // Water, Air, and Soil Pollution. 2003. - No. 143. P. 289-300.

169. Moreno, J.L. Ecotoxicity Tests for Compost Applications текст. / J.L. Moreno, C. Garcia, L. Landi, L. Falchini, G. Pietramellara, P. Nannipieri // Ecotoxicology and Environmental Safety. -2001.-No 49.-P. 1-16.

170. Moreno, J.L. Effect of cadmium on microbial activity and a ryegrass crop in two semiarid soils текст. / J.L. Moreno, A. Sanchez-Marin, T. Hernandez, C. Garsia // Environmental management. 2006. - Vol 37. - No. 5. - P. 626-633.

171. Moreno, J.L. Effects of cadmium-contaminated sewage sludge compost on dynamics of organic matter and microbial activity in an arid soil текст. / J.L. Moreno, T. Hernandez, C. Garcia // Biol. Fertil. Soil. 1999. - Vol. 28. - P. 230-237.

172. Moreno, J.L. Toxicity of cadmium to soil microbial activity: effect of sewage sludge addition to soil on the ecological dose текст. / J.L. Moreno, T. Hernandez, A. Perez, C. Garsia // Applied Soil Ecology. 2002. - No. 21. - P. 149-158.

173. Morgan, J.A.W. Microbial biomarkers текст. / Morgan J.A.W., C. Winstanley // Modem Soil Microbiology / eds. J.D. van Elsas, J.T. Trevors, E.M.H. Wellington, New York: Marcel Dekker, New York, 1999.-P. 331-352.

174. Mortelmans, K. The Ames Salmonella / microsome mutagenicity assay текст. / К. Mortelmans, E. Zeiger // Mutat. Res. 2000. - No. 455. - P. 29-60.tt

175. Nalecz-Jawecki, G. The toxicity of cationic surfactants in four bioassays текст. / G. Nalecz-Jawecki, E. Grabinska-Sota, P. Narkiewicz // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2003. -No. 54.-P. 87-91.

176. Nannipieri, P. Ecological signi®cance of the biological activity in soil текст. / P. Nannipieri, S. Greco, B. Ceccanti // Soil Biochemistry, Vol. 6 [текст] / eds. G. Stotzky, J.M. Bollag, New York: Marcel Dekker, 1996. P. 233-355.

177. Nejidat, A. Nitrification and occurance of salt-tolerant nitrifying bacteria in the Negev desert soils текст. / A. Nejidat // FEMS Microbiology Ecology. 2004. - No. 12. - P. 1123-1131.

178. Nendza, M. Application of bacterial growth kinetics to in vitro toxicity assessment of substituted phenols and anilines текст. / M. Nendza, J.K. Seydel // Ecotoxicology and Environmental Safety. -1990.-Vol.19. No.2.-P.228-241.

179. Nordgen, A. Soil microbial activity, mycelial lengths and physiological gropus of bacteria in a heavy metal polluted area текст. / A. Nordgen, T. Kauri, E. Baath, B. Soederstroem // Environ. Pollut. -1986. No 41. -P. 89-100.

180. Ohya, H. Zinc Effects on a soil bacterial flora characterized by fatty acid composition of the isolates текст. / H. Ohya, Y. Komai, M. Yamaguchi // Biol. Fert. Soils. 1986. - No 2. - P.2-18.

181. Pascual, J.A. Changes in the microbial activity of the arid soil amended with urban organic wastes текст. / J. A. Pascual, C. Garcia, T. Hernandez, M. Ayuso // Biol. Fertil. Soils. 1997. - Vol. 24. -P.429-434.

182. Peijnenburg, W. Short-term ecological risks of deposition contaminated sediment on arable soil текст. / W. Peijnenburg, A. de Groot. T. Jager, L. Posthuma // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2005. - No. 60. - P. 1-14

183. Perez, S. Occurrence of polycyclic aromatic hydrocarbons in sewage sludge and their contribution to its toxicity in the ToxAlert® 100 bioassay текст. / S. Perez, M. Farre, M.J. Garcia D. Barcelo // Chemosphere. 2001. - Vol. 45. - P.705-712.

184. Piotrowska-Seget, Z. Metal-tolerant bacteria occurring in heavily polluted soil and mine spoil текст. / Z. Piotrowska-Seget, M. Cycon, J. Kozdroj // Applied Soil Ecology. 2005. - No. 28. - P. 237-246.

185. Plaza, G. Assessment of genotoxic activity of petroleum hydrocarbon-bioremediation soil // G. Plaza, G. Nalecz-Jawecki, K. Ulfig, R.L. Brigmon // Ecotoxicology and Environmental Safety. -2005 a. Vol 62. - Iss. 3. - P. 415-420.

186. Plaza, G. The application of bioassays as indicators of petroleum-contaminated soil remediation текст. / G. Plaza, G. Nalecz-Jawecki, K. Ulfig, R.L. Brigmon // Chemosphere. 2005 b. - No. 59. -P. 289-296.

187. Posthuma, L. Heavy-metal adaptation in teeresrial invertebrates: A review of occurence, genetics, physiology and ecological concequenses текст. / L. Posthuma, N.M. van Straalen //Сотр. Biochem. Physiol. 1993. - No 106C. - P. 11-38.

188. Pozo, C. Effect of Chlorpyrifos on soil microbial activity текст. / С. Pozo, M.V. Martinez-Toledo, Salmeron,B.Rodelas, J. Gonzales-Lopez//Environ.Toxicol.Chem.- 1995.-No 14.-P. 187-192.

189. Prokop, Z. The Use of a Microbial Contact Toxicity Test for Evaluating Cadmiun Bioavailability in Soil текст. / Z. Prokop, I. Holoubek // J. Soils and Sediments. 2001. - No. 1. - P. 21-24.

190. Rajapaksha, R.M.C.P. Metal toxicity affects fungal and bacterial activities in soil diversity текст. / R.M.C.P. Rajapaksha, M.A. Tobor-Kaplon, E. Baath // Applied Environmental Microbiology. -2004. No. 70. - P. 2966-2973.

191. Reber, H.H. Simultaneous estimates of the diversity and the degradative capability of heavy-metal-affected soil bacterial communities текст. / H.H. Reber // Biology and Fertility of Soils. 1992. -No. 13.-P. 181-186.

192. Reichardt, W. Microbial community of contentiously cropped, irrigated rice fields текст. / W. Reichardt, G. Mascarina, B. Parde, J. Doll // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - No 63. - P. 233238.

193. Ren, S. Using factorial experiments to study the toxicity of metal mixtures текст. / S. Ren, R.W. Mee, P.D. Frymier // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2004. - No. 59. - P. 38-43.

194. Robidoux, P.Y. Screening of illicit toxic substances discharged in chemical toilet sludge текст. / P.Y. Robidoux, J. Lopes-Gastey, A. Choucri, G.I. Sunahara // Quality Assurance. 1999. - No. 6. -P. 23-44.

195. Ronnpagel, K. Microbial bioassays to assess the toxicity of solid-associated contaminants текст. / К. Roenpagel, W.Liss, and W. Ahlf// Ecotoxicol. Environ. Saf. 1995. - No 31. - P. 99-103.

196. Ros, M. Soil microbial activity after restoration of a semiarid soil by organic amendements текст. / M. Ros, M.T. Herbabdez, C. Garsia // Soil Biology & Biochemistry. 2003. - No. 35. - P. 463469.

197. Rost, U. Effects of Zn enriched sewage sludge on microbial activities and biomass in soil текст. / U. Rost, R.G. Joergensen, K. Chander// Soil Biology and Biochemistry. 2001. - Vol. 33. - P. 633638.

198. Sanchez-Monedero M.A. Land application of biosolids. Soil response to different stabilization degree of the treated organic matter / M.A. Sanchez-Monedero, C. Mondini, M. de Nobili, L. Leita, A. Roig // Waste Management. 2004. - No. 24. - P. 325-332.

199. Sato, C. Characterization of effects of copper, cadmium and nickel on teh growth of Nitrosomonas europaea текст. / С. Sato, J.L. Schnoor, and D.B. McDonald // Environ. Toxicol. Chem. 1986. -No5.-P. 403-416.

200. Sauve, S. Copper inhibition of soil organic matter decpmposition in a seventy-year field exposure текст. / S. Sauve // Environmental Toxicology and Chemistry. 2006. - Vol 25. - No. 3. - P. 854-857.

201. Schloter, M. Indicators for evaluating soil quality текст. / M. Schloter, O, Diily, J.C. Munch // Agriculture, Ecosystems and Environment. 2003. - No. 98. - P. 255-262.

202. Seco, J.I. A study of leachate toxicity of metal-containing solid wastes using Daphnia magna текст. / J.I. Seco, C. Fernandez-Pereira, J. Vale // Ecotoxicology and Environmental Safety. -2003.-No. 56.-P. 339-350

203. Selivanovskaya, S.Yu. The Use of Bioassays for Evaluating the Toxicity of Sewage Sludge and Sewage Sludge-Amended Soil текст. / S.Yu. Selivanovskaya, V.Z. Latypova // J Soils & Sediments. 2003. - Vol. 3. - No. 2. - P. 85-92.

204. Shakashiri, B.Z. Chemical Demonstrations: A Handbook for Teachers in Chemistry текст. / B.Z. Shakashiri. University of Wisconsin: Madison. - 1989. - V. 2. - P.142-146.

205. Sinclair, G.M. Lux-biosensor assessment of pH effects on microbial sorption and toxicity of chlorophenols текст. / G.M. Sinclair, G.I. Paton, A.A. Mehard, K. Killham // FEMS Microbiology Letters. 1999. - No. 174. - P. 273-278.

206. Smalla, K. Analysis of BIOLOG® GN substate utilization patterns by microbial communities текст. / К. Smalla, U. Wachtendorf, H. Heuer, W.T. Liu, L. Forney // Appl. Environ. Microbiol. -1998.-No 64.-P. 1220-1225.

207. Sochova, I. Using nematodes in soil toxicology текст. /1. Sochova, J. Hofman. I. Holoubek // Environment International. 2006. - Vol. 32. - Iss. 3. - P. 374-383.

208. Sorvari, J. Influence of metal complex formation on heavy metal and free EDTA and DTPA acute toxicity determined by Daphnia magna текст. / J. Sorvari, M. Sillanpaa // Chemosphere. 1996. -No, 33.-P. 1119-1127.

209. Steffan, R.J. DNA amplification to enhance detection of genetically engineered bacteria in environmental samples текст. / R.J. Steffan, R.M. Atlas // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - No 54.-P. 2185-2191.

210. Stotzky, G. Survival of and genetic trasfer by, genetically engineered bacteria in natural environments текст. / G. Stotzky, H. Babich //Adv. Appl. Microbiol. 1987. - No 31. - P. 90-138.

211. Thompson, F.R. Persistence and effects of some chlorinated anilines on nitrification in soil текст. / F.R. Thompson, C.Y. Corke // Can. J. Microbiol. 1968. - No 15. - P. 719-796.

212. Torsvik, V. Comparison of phenotypic diversity and DNA heterogeneity in a population of soil bacteria текст. / К. Salte, R. Sorheim, J. Goksoyr // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - No 54. -P. 2185-2191.

213. TU Hamburg-Harburg. Arthrobacter globiformis Kontakttest fuer kuenstlich kontaminierte Feststoffe текст. - 1999. - P.7.

214. Tu, C.M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil текст. / C.M. Tu // J. Environ. Sci. Health. 1993. - No B28. - P. 67-80.

215. Van Beelen, P. A review on the application of microbial toxicity tests for deriving sediment quality guidelines текст. / P. Van Beelen // Chemosphere. 2003. - No 53. - P. 795-808.

216. Van Beelen, P. Significance and application of microbial toxicity tests in essessing ecotoxicological risks contaminants in soil and sediment текст. / P. Van Beelen, P. Doelman // Chemosphere. -1997.-V. 34, No3. P. 455-499.

217. Van Beelen, P. Significance and application of microbial toxicity tests in assessing ecotoxicological risks of contaminants in soil and sediment текст. / P. Van Beelen, P. Doelmann // Chemosphere. -1997. Vol. 34. - No. 3. - P. 455-499.

218. Van Beelen, P. Toxic effects of pentachlorophenol and other pollutants ot the mineralization of acetate in several soils текст. / P. Van Beelen, A.K. Fleuren-Kamilae // Ecotoxicol. Environ. Saf.1993.-No 26.-P. 10-17.

219. Van Straalen, N.M. Ecotoxicological evaluation of soil quality criteria текст. / N.M. Van Straalen, C.A.J. Denneman // Ecotoxicol. Environ. Saf. 1989. - No 18. - P. 241-251.

220. Van Straalen, N.M. Soil invertebrates and microorganisms текст. / N.M. VanStraalen, C.A.M. Gestel // Handbook of ecotoxicology / ed by P. Calow, Oxford: Blackwell Scientific Publications,1994.-P. 251-277.

221. Van Winzengerode, F. Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-based rRNA analyses текст. / F. Van Winzengerode, U.B. Gobel, E. Stackebrandt // FEMS Microbiol. Rev. 1997. - No. 21. - P. 231-229.

222. Vepsalainen, M. Application of soil enzyme activity test kit in a field experiment текст. / M. Vepsalainen, S. Kukkonen, M. Vestberg, H, Sirvio, R.M. Niemi // Soil Biology & Biochemistry. -2001.-No. 33.-P. 1665-1672.

223. Viti, C. Characterization of cultivable heterotrophic bacterial communities in Cr-polluted and unpolluted soils using Biolog and ARDRA approaches текст. / С. Viti, L. Giovannetti // Applied Soil Ecology. 2005. - No. 28. - P. 101-112.

224. Ward, D.M. Ribosomal RNA analyses of microorganisms as they occur in nature текст. / D.M. Ward, M.M. Bateson, R. Weller, A.L. Ruff-Roberts // Advances in Microbial Ecology [текст] / eds. K.C. Marshall, New York: Plenum Press, 2000. - P. 219-286.

225. White, P. Mutagens in contaminated soil: a review текст. / P. White, L. Claxton // Mutagen Research. 2004. - Vol. 567. - P. 227-345.

226. Wilke, B.M. Effects of single and successive additions of cadmium, nickel and zinc on carbon dioxide evolution and dehydrogenase activity in a sandy luvisoil текст. / B.M. Wilke // Biol. Fert. Soils.-1991.-No 11.-P. 34-37.

227. Winding, A. Fingerprinting bacterial soil communities using biolog microtitre plates // Beyond the Biomass текст. / A. Windning [текст] / eds. K. Ritz, J. Dighton, K.E. Giller, New York: Wiley Sayce, 1994.-P. 85-94.

228. Workneh, F. Variables associated with corky root and Phytophtora root rot of tomatoes in organic and conventional farms текст. / F. Workneh, A.H.C. van Bruggen, L.E. Drinkwater, C. Shennan // Phytopatology. -1993. No. 83.-P. 581-589.

229. Zak, J.C. Functional diversity of microbial communities: a quantitative approach текст. / J.C. Zak, M.R. Willing, D.L. Moorhead, H.G. Wildman // Soil Biol. Biochem. - 1994. - No. 26. - P. 11011108.

230. Zelles, L. Discrimination of microbial diversity by fatty acid profiles of phospholipids and lipopolysaccharides in differently cultivated soils текст. / L. Zelles, R. Rackwitz, Q.Y. Bai, T. Beck, F. Beese//Plant Soil.-1995.-No. 170.-P. 115-122.

Информация о работе

Галицкая, Полина Юрьевна
кандидата биологических наук
Казань, 2006
ВАК 03.00.16

Диссертация

Микробный контактный тест на основе Bacillus pumilus для оценки токсичности загрязненных почв и отходов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы