Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологические основы биотехнологии очистки сточных вод нефтехимического производства

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические основы биотехнологии очистки сточных вод нефтехимического производства"

оа

На правах рукописи

ПЕТРОВ Андрей Михайлович

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД НЕФТЕХИМИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА

ОЗ.ОО. 07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 1995

Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории экологической биотехнологии Казанского государственного университета имени В.И.Ульянова-Ленина.

Научный руководитель: Научный консультант: Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Р.П.Наумова

нач.лаборатории 0.И.Якушева

доктор химических наук, профессор В.З. Латыпова, кандидат биологических наук, с.н.с. М.Н. Давыдова

Ведущая организация: Казанский биоинженерный институт.

Защита состоится 1 июня 1995 г. в 14 часов на заседании диссертационного Совета К.053.29.19 в Казанском государственном университете по адресу: 420008, Казань,ул.Ленина,18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета по ад-

"рёсуГ~42000£Г; Казань, улТЛенина, 35.

Автореферат разослан "2.?" аь^о-е**^ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук , л й.пёхк__А.Н.Аскарова

ВВЕДЕНИЕ- ^

Актуальность проблемы. Ухудшение экологической ситуации в I

регионах России связано с растущими темпами химического загрязнения водных, почвенных ресурсов и атмосферы, обусловленного отходами и выбросами промышленных производств. О масштабах суммарного химического загрязнения биосферы в нашей стране свидетельствуют величины ежегодного сброса в водные объекты: более 5000 тыс.т органических веществ; 2000 тыс.т взвешенных веществ; около 300 тыс. т фенолов. Только в реки бассейна Волги со сточными водами ежегодно поступает более 300 тыс.т органических веществ, 90 тыс.т фенолов, около 14 тыс.т нефтепродуктов (Авакян с соавт.,1994; О состоянии окружающей среды..., 1994).

Одной из актуальных задач современной науки является разработка мероприятий по защите окружающей среды и человечества от воздействия присутствующих в биосфере соединений антропогенного происхождения,• аккумуляция которых в живых организмах приводит к отрицательным изменениям генофонда планеты, его невосполнимым потерям.

Ароматические соединения относятся к числу наиболее экологически опасных химических загрязнителей. Масштабы промышленного синтеза ароматических соединений при отсутствии высокоэффективных технологий очистки сопутствующих отходов сопряжены с их систематическими поступлениями в природные сферы, что неоднократно приводило к экологическим катастрофам в различных регионах России (Яковлев, Журба,1991).

Высокотоксичные, концентрированные, многокомпонентные сточные воды производства стирола, получаемого методом дегидратации метилфенилкарбинола, в АО "Нижнекамскнефтехим" частично обезвреживаются путем сжигания при высокой температуре, что связано с необходимостью капитального строительства сложных дорогостоящих сооружени ,, с большими затратами топливно-энергетических ресурсов, загрязнением атмосферы продуктами неполного сгорания. Часть сточьых вод сбрасывается на общезаводские биологические очистные сооружения, что приводит к снижению эффективности очистки при объединении сточных вод различных производств.

Вышесказанное определяет актуальность разработки основ для экономически и экологически целесообразного способа обезврежива-яия концентрированных сточных вод производства стирола.

Общеизвестно, что из всех существующих методов обезвреживания химических загрязнений биологические являются наиболее универсальными и экономичными (Алиева,Клялетдинов,1986; Яковлев с соавт.,1994).

В настоящее время известна принципиальная возможность био-рааложения индивидуальных соединений, входящих в состав сточных вод производства стирола. Согласно данным литературы, потенциальные деструкторы основного загрязнителя данных сточных вод - фенола - принадлежат к различным таксономическим группам. Они отличаются устойчивостью к токсическому действию ксенобиотика (Hensel, Straube,1983; Anselmo et al.,1984; Krug et al.,1986), активностью в иммобилизованном состоянии (Keweloh et al,1989). Имеется также данные о биодеградации ацетофенона (Cripps et al, 1978; Федоров с соавт.,1993), стирола (Hartmans et al.,1990; Utkin et al.,1991; Рустемов с соавт.,1992; Warhurst, 1994). Имеются разработки биотехнологий очистки сточных вод от стирола и его производных (Быстров с соавт.,1988; Клялетдинов, Алиева,1990), фенола в сочетании с рядом ксенобиотиков (Meyer.et al, 1984; Westmeier, Rehin, 1985). Однако исследования, посвященные метаболизму вышеуказанных соединении при одновременном присутствии двух и более компонентов, единичны, а применительно к сложным сочетаниям - практически отсутствуют. В то же время анализ кометаболизма многокомпонентных комплексов токсичных и персистентных ксенобиотиков необходим для прогнозов возможности и эффективности новых биотехнологий для очистки сточных вод.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в разработке научных основ и создании схемы новой биотехнологии очистки концентрированных сточных вод, содержащих фенол, стирол, ацетофенон и другие сопутствующие загрязнения.

В соответствии с поставленной целью решались следующие экспериментальные ведали:___-

1. Изучить возможность локальной детоксикации и очистки сточных вод производства стирола микроорганизмами;

2. Селекционировать штампы и сообщества микроорганизмов с повышенной деструктивной активностью, устойчивостью к высоким концентрациям изучаемых ароматических соединений;

3. Разработать биотехнологию очистки концентрированных локальных сточных вод производства стирола;

4. Разработать программу для оптимизации процессов локальной

очистки с учетом необходимого уровня эффективности.

Научная новизна. Путем селекции' в условиях непрерывного культивирования, максимально приближенных к реальным экологическим ситуациям, получены штаммы Pseudomonas sp.KS 1.1, Rho-dococcus sp.KS 9.2, Bacillus sp.KS 4.1 и ассоциации микроорганизмов с повышенной деструктивной активностью, способные утилизировать комплекс ароматических соединений, включающий фенол, стирол, ацетофенон и другие ксенобиотики.

Выявлены и охарактеризованы спектры метаболических возможностей индивидуальных штаммов и микробных сообществ.

Исследовано влияние фенола в сочетании со стиролом и ацето-феноном на масштабы биодеградации компонентов сточных вод производства стирола выделенными штаммами.

Впервые показана возможность биологической очистки активными микробными сообществами концентрированных, многокомпонентных, токсичных,сточных вод производства стирола.

Практическая значимость. Создан банк штаммов микроорганизмов, разлагающих комплекс ксенобиотиков, включающий фенол, стирол, ацетофенон, бензол, толуол, метилфенилкарбинол и этилбензол.

Путем непрерывного культивирования в условиях селективного воздействия возрастающих концентраций комплекса изучаемых ксенобиотиков получены сообщества микроорганизмов, утилизирующие совокупность загрязнений, включающую фенол, стирол, ацетофенон и другие ксенобиотики.

В условиях лабораторных испытаний модельных очистных сооружений определены оптимальные параметры процесса очистки сточных вод производства стирола.

Впервые разработана двухступенчатая биотехнология очистки концентрированных сточных вод производства стирала. Разработан регламент на проектирование первой ступени биотехнологии, в соответствии с которым в АО "нижнекаыскнефтехим" создан проект, построены локальные сооружения для биологической очистки концентрированных сточных вод указанного производства. В 1994 году разработанная биотехнология стала частью производства стирола.

Впервые продемонстрирована возможность дальнейшей локальной биологической очистки сточных вод изучаемого производства с использованием пространственно разобщенных иммобилизованных биоценозов. Полученные результаты являются основой для создания второй ступени локальной биологической очистки сточных вод производства стирола.

- б -

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на YII съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата,1985), Всесоюзной конференции "Мониторинг нефти и нефтепродуктов в окружающей среде"(Уфа,1985), Всесоюзной конференции" Еиоиндикация и биотестирование природных вод"(Ростов-на-Дону,1986), на IV Всесоюзной конференции "Управляемое культивирование микроорганизмов" (Пущино,1986), на II Всесоюзной конференции "Микробиологические методы защиты окружающей среды"(Пушино, 1988), 14 Менделеевском съезде по общ. и прикл.химии (Минск, 1989), I Республиканской конференции по интенсифика-г ции нефтехимических процессов (Нижнекамск,1990), Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии (Пущино,1990), Всесоюзном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия" (Оренбург,1991), Всесоюзной конференции "Биотехнология и биофизика микробных популяций" (Алма-Ата, 1991), V конференции РФ "Новые направления в биотехнологии (Пущино, 1992), "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан (Казань,1993), VI конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущино,1994). Материалы диссертации явились составной частью экспонатов на ВДНХ СССР (1986, 1989), отмеченный бронзовой и серебряной медалями.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ. Получены два авторских свидетельства СССР и патент РФ.

Структура и объем диссертации; Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка использованно] литературы, содержащего 190 источников, из них 113 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 167 страницах машинописного текс-

-та, -иллюстрирована 29-рисунками -и -27- таблицами.-

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объектами исследования служили штаммы Bacillus sp. KS. 4.1 Pseudomonas sp.KS 1.1, Rhodococcus sp.. KS 9.2 и сообщества микро организмов, селекционированные в лабораторных установках с суспендированной и иммобилизованной микрофлорой в аэробных условия: в режиме непрерывного культивирования при поэтапном повышени: суммарной концентрации органических веществ в составе сточных во, производства стирола с 1 до 10 г/л (по ХПК).

В качестве исходного резерва при селекции использовали мик

робное сообщество активного ила общезаводских биологических очистных сооружении АО"Нижнекамскнефтехим", микрофлору почв, загрязненных отходами нефтехимических производств, а также ранее селекционированные микроорганизмы-деструкторы компонентов сточных вод изучаемого производства из коллекции Казанского университета. Бактерии идентифицировали, используя определитель Берги (Bergey, 1986) и работы обзорного характера (Stanier. et.al, 1966; Pallero-ni,1981).

В работе в качестве источников углерода и энергии использовали: ацетофенон, бензол, метилфенилкарбинол, стирол, толуол, фенол, зтилбензол и сточные воды производства стирола.

При изучении свойств штаммов использовали среды следующего состава:

Среда 1 (г/л): (NH4)2S04 - 1,00; MgS04-7H20 - 0,51; КН2РО4 -0,40; Na2HP04-12H20 - 1,75; СаС1г - ОД; FeSO4-7H20 - 0,025; NaMo04-2H20 - 0,005; MgCl2'4H20 - 0,02; источник(и) углерода;

Среда 2 (г/л): (NH4)2S04 - 1,00; MgS04-7H20 - 0,51; КН2РО4 ~ 0,27; Na2HP04-12H20 - 2,14;агар - 20,0; Н20 водопр. - 1000 на; источник(и) углерода.

Среда 3 (г/л): (NH4)2S04 - 1,20; MgS04-7H20 - 0,51; КН2РО4 -0,45; Na2HP04-12H20 - 0,55; агар - 20,0; сточные воды - 1000 мх с ХПК 2,0-3,2, рН 7,2.

В качестве посевного материала использовали 12-14- часовые культуры бактерий, выращенные на среде 1. Количество вносимого посевного материала составляло 0,1-0,2 ед.опт. плотности (ФЭК-55М, Х-540 нм, мов.5 мм). О концентрации биомассы судили по оптической плотности с пересчетом, при необходимости, на массу сухих клеток, которую оценивали согласно методике, приведенной в книге "Методы общей бактериологии" (под ред. Ф.Герхардта,1983).

Микроорганизмы культивировали на качалке (120 об/мин) в 0,5 -литровых колбах, содержащих 100 мл среды 1 при t 28-30°С или в термостате в стационарных условиях при заданной температуре.

Выделение микроорганизмов проводили на среде 2 с помощью посева из серийных разведений в стерильной водопроводной воде. Инкубацию проводили в течение 4-5 суток при 28-Э0°С.

Микрофлору с волокон "ерша" и "вий" тщательно суспендировали в гомогенизаторе типа ER 10 в течение 20 мин. при 3 тыс. об/мин, соблюдая стерильность, и высевали вышеуказанным способом.

Способность штаммов расти на отдельных ароматических вещест-

вах тестировалась на агаровых пластинках с питательной средой 2 при t 28-30°С, где в качестве единственного источника углерода и энергии добавлялось одно из испытуемых веществ. Фенол вносили в концентрации 0,5 г/л непосредственно в среду после ее стерилизации, летучие вещества контактировали с микроорганизмами через газовую фазу при создании их насыщающей концентрации в герметично закрытом эксикаторе.

Окислительную активность суспендированных клеток измеряли манометрическим методом в аппарате Варбурга при 28°С. Клетки, дважды отмытые 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,2, ресуспендировали в том же буфере и использовали для определения окислительной активности. Сосуды Варбурга содержали: 0,3 мл 15% КОН в центральном резервуаре; 1 мл раствора субстрата с ХПК 1,6-2,2 г/л; 1 мл суспензии бактериальных клеток,содержащих 0,9-1,1 мг биомассы (масса сухих клеток). Газовая фаза - воздух.

В качестве тест-объекта при определении токсичности сточных вод использовали равноресничную инфузорию Paramecium caudatum, которая входит в состав фауны активных илов биологических очистных сооружений (Маслов с соавт.,1988). Токсичность сточной воды выражали через смертность особей после часовой экспозиции в исследуемой пробе в процентах по отношению к контролю.

При определении мутагенной активности и ДНК-повреждающего эффекта сточных вод использовали штаммы Salmonella typhimurium ТА 1535, ТА 1538 и тестерные штаммы Escherichia coli: WR-2 - дикий тип, и три мутантных штамма: pol Al, uvr А, гес А дефектные по различным путям репарации. Мутагенную активность определяли методом полуколичественного учета генных мутаций без метаболической активации (Ames et al,1973).

Моделирование очистки сточных вод проводили в лабораторных установках из органического стекла диаметром 6,0-10 см, высотой 50- 60 ~ см;~с рабочим - объемом Л, 5-2,0 г При разработке -биотехнологии на основе иммобилизованных микроорганизмов носителем служили стекловолокно, изготовленное в виде ершей, и капроновое волокно -"вия". Часть опытов по очистке сточных вод производства стирола проводили в лабораторной модели аэротенка-смесителя с отстойником и АНКУМ-2М.

Селекцию активных микробных комплексов и моделирование процесса очистки вели на сточных водах производства стирола. При необходимости очищаемую жидкость разводили технической водой дс

требуемых значений суммарного содержания органических веществ (ХПК), после чего подкисляли серной кислотой и вносили биогенные элементы N и Р в виде (N114)2304 и КН2РО4 из расчета ХПК:Ы:Р -100:2,5:0,5.

Концентрацию фенола определяли с 4-аминоантипирином, ХПК -бихроматным методом (Лурье,1984). БПК в отдельных опытах определяли стандартным скляночным методом (Лурье,1984), а в остальных -манометрическим методом.

Органические компоненты анализировали на хроматографе типа ЛХМ-8Щ с пламенно-ионизационным детектором. Использовали две колонки из нержавеющей стали длиной по 1 м, диаметром 3 мм. Газ-носитель - азот, очищенный от органических примесей. Твердый носитель - Порохром 1 (фракции 0,025-0,315 мм). Температура термостата колонок - 95°С, испарителя проб 125°С.

Определение органического углерода (ОУ) проводили на газовом хроматографе ЛХМ 8Щ с детектором по теплопроводности после окисления органических примесей, содержащихся в сточных водах до СОг-Газ-носитель - гелий. Сорбент - Полисор&-1 (фракции 0,025-0,5 мм). Температура термостата колонок - 50°С, испарителя проб 50°С.

Гидробионтов учитывали по условной пятибалльной шкале(Фауна аэротенков, 1984).

Степень очистки сточных вод определяли по (Ласков с соавт., 1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное нами сравнительное изучение токсичности 56 локальных потоков сточных вод отдельных производств АО "Нижнекамск-нефтехим" показало, что наиболее экологически опасными являются концентрированные, высокотоксичные, обладающие генетической активностью сточные воды производства стирола.

Учитывая то, что биологические методы обезвреживания химических загрязнений являются наиболее универсальными и экономичными, а их создание возможно только для сточных вод, компоненты которых подвергаются биологическому окислению, на первом этапе нами был проведен скрининг основных локальных потоков сточных вод производства стирола на токсичность и биоокисляемость, а также определены их основные физико-химические характеристики.

В результате сопоставления вышеуказанных характеристик локальных потоков жидких отходов производства стирола были выявлены сточные воды, доступные для биодеградации, условно обозначенные как А2 и АЗ.

Формирование активных микробных комплексов осуществлено в условиях непрерывного культивирования (D 0,04-0,08 ч-1) на реальных сточных водах производства стирола (А2+АЗ) в биотенке с иммобилизованной на стекловолокне микрофлорой (Б) и АНКУМ-2М (А) при постепенном повышении суммарной концентрации органических веществ от 1 до 10 г/л (по ХПК). С целью оптимизации условий, способствующих наиболее быстрому и полному завершению минерализации органических загрязнении, процесс селекции сопровождали оценкой влияния pH среды и суммарной концентрации загрязнений сточных вод на рост микробной ассоциации.

Исследования показали, что сообщества микроорганизмов активны в широком диапазоне pH среды (от 6,2 до 7,8), хотя в интервале pH 7,2-7,8 выход биомассы был на 6,6-10,5% выше, чем при pH 6,2-6,6. Дальнейший сдвиг pH в щелочную область (до pH 8,2-8,8) приводил к снижению интенсивности роста селекционируемого микробного сообщества.

Оценка влияния суммарной концентрации органических веществ в составе сточных вод на прирост биомассы показала, что изменение начальной суммарной концентрации ксенобиотиков, в силу их токсичности, удлиняет лаг-фазу и сокращает масштабы роста микробных ассоциаций.' При содержании органических веществ до 5,6 г/Л (по ХПК) ассоциации растут без лаг-фазы, до 7,6г/л - требуют 4-8 ,ч адаптации, до 11,7 г/л - замедляют экспоненциальный рост на' 34-38 ч. Концентрации загрязнений выше 11,7 г/л - полностью ингибируют рост микроорганизмов.

Дальнейшую селекцию сообществ осуществляли в условиях непрерывного культивирования при pH 7,2-7,5, суммарной концентрации органических веществ в исходной воде 10 г/л (по ХПК) и скорости протока, регулируемой с расчетом, чтобы ХПК частично очищенной жидкостинепревьш1апо-5,6"т/л. ~~

Проведенный после двухмесячного культивирования на реальных сточных водах производства стирола анализ микрофлоры показал, что различие в условиях селекции привело к изменениям в количественном составе микробных сообществ. Сообщества из установок А и Б содержали б и 11 штаммов соответственно, причем в обоих случаях количественно доминировали штаммы Bacillus sp.KS 4.1 и Pseudomonas sp.KS 1.1, содержание которых составляло 67,8% и 21,3%, 65,5% и 15,6% от общей численности микроорганизмов, входяпщ в неиммо-

- И -

билизованное и иммобилизованное сообщества.

Что касается метаболических возможностей выделенных штаммов, то наиболее активными деструкторами компонентов сточных вод оказались Bacillus sp.KS 4.1 и Pseudomonas sp.KS 1.1, а также один из минорных членов иммобилизованного сообщества - Rhodococcus sp.KS 9.2 (0,5%). Каждый из них в той или иной мере утилизировал все 7 предложенных ароматических субстратов в качестве единственного источника углерода и энергии. Существенно уже спектр утилизируемых ксенобиотиков у двух других штаммов: KS 2.1 (бензол, зтилбензол, толуол), KS 6.1 (бензол, ацетофенон). Интересно распределение в рассматриваемых сообществах изолятов, которые не утилизируют ни один из предложенных ароматических ксенобиотиков: в иммобилизованном сообществе их число в 4 раза выше, чем в неиммо-билизованном (8 и 2 соответственно).

Исходя из того, что доминирующий компонент изучаемых сточных вод обладает биоцидными свойствами, необходимо было оценить влияние фенола на рост и биохимическую активность штаммов. Варьирование начальной концентрации фенола от 0,5 до 3,0 г/л выявило наличие корреляции между резистентностью Bacillus sp.KS 4.1, Pseudomonas sp.KS 1.1 й Rhodococcus sp. KS 9.2 к различным концентрациям ксенобиотика и процентным содержанием этих видов в составе сообществ.. Так, штамм Bacillus sp.KS 4.1, содержание которого в сообществах ферментера и биотенка составляло соответственно 67,7 и 65,5%, устойчив к концентрациям фенола до 3,0 г/л, Pseudomonas sp.KS 1.1 (21,3 и 15,6%) утилизирует фенол при его содержании в среде до 2,1 г/л, а для Rhodococcus sp.KS 9.2 фенол доступен при концентрации до 1,3 г/л.'

Известно, что при одновременном присутствии в среде ароматических субстратов может происходить взаимное ингибирование их деструкции микроорганизмами (Wang et al,1988), поэтому в сравнительном плане представляют интерес наши данные о влиянии стирола и ацетофенона на устойчивость изучаемых штаммов к токсическому действию фенола и на экономический коэффициент роста. Оказалось, что присутствие стирола и/или ацетофенона (0,5 г/л) приводит к снижению скорости окисления фенола (0,9 г/л). При этом в бинарных комбинациях окисление ксенобиотиков идет одновременно, тогда как при внесении третьего ароматического субстрата у Pseudomonas sp. KS 1.1 и Rhodococcus sp.KS 9.2 активное окисление фенола начиналось после полной или частичной деградации стирола и снижения

- 12 -

концентрации ацетофенона до 0,3-0,35 г/л.

Влияние дополнительных токсичных ксенобиотиков проявлялось также в снижении урожая клеточной массы Pseudomonas sp.KS 1.1 и Rhodococcus sp.KS 9.2, тогда как в случае Bacillus sp.KS 4.1 введение в среду третьего компонента сопровождалось увеличением клеточной массы (табл.1). Возможно, этим объясняется его лидирующее положение в составе сообществ, сформировавшихся в условиях контакта со сложным комплексом ароматических загрязнений.

Таблица 1

Влияние комбинаций фенола, стирола и ацетофенона на выход биомассы штаммов Rhodococcus sp.KS 9.2, Pseudomonas sp.KS 1.1 и Bacillus sp.KS 4.1

1 ..... 1 Выход биомассы, Z 1

фенол 1 1 I фенол+| | стирол| 1 1 1 фенол+[ АФ | 1 фенол+| С+АФ |

|Rhodococcus sp.KS 9.2| 63,0 1 1 I 20,0 | 1 I 1 18,0 | I 7,0 |

[Pseudomonas sp.KS 1.1| 27,6 1 1 1 15,0 | 1 I 1 15,7 | 1 9,6 |

| Bacillus sp.KS 4.1 | ' i 57,9 1 1 1 12,5 | 1 1 1 15,1 | | 24,4 | 1

С точки зрения механизма биодеградации стирола интересен факт временного накопления ацетофенона в процессе роста Rhodococ-сиэ.эр. К5 9.2 на среде, содержащей фенол и стирол (рис.1). Это является косвенным свидетельством взаимосвязи метаболизма стирола и ацетофенона:

СН-СНг СО-СНз

Ф---

стирол ацетофенон

О такой возможности свидетельствуют и некоторые данные литературы (Джусупова с соавт.,1985; \Jtkin е1.а1. ,1991). Подобно этому, согласно нашим данным, возможным вкладом в "пул" фенола в среде в первые часы культивирования является его образование в процессе метаболизма стирала и ацетофенона в результате функционирования выявленных ранее метаболических последовательностей

(Сг1ррэ,1978; Федоров,1993).

СО-СНз О-СОСНз

ОН

ацетофенон

фенилацетат фенол

ОН

пирокатехин

0.0 +лт

Рис.1. Динамика роста штамма ^схЗососсиз эр. КБ 9.2 и снижения кон-" центрации фенола и сопутствующих ароматических загрязнений. о - Оопт; + - фенол; х - стирол; -- ацетофенон.

20 25 30"

Время, ч

Разработку биотехнологии предварительной очистки и детокси-кации концентрированных сточных вод производства стирола проводили в следующих вариантах лабораторных установок: В. Аэротенк с отстойником; Г. Биотенк с бактериальным комплексом, иммобилизованным на стекловолокне; д. Биореактор с флотатором. Моделирование процесса очистки реальных сточных вод с ХПК 10,0-29,0 г/л осуществляли при варьировании скорости разбавления (Б) от 0,03 ч-1 до 0,1 ч-1 (в зависимости от цели эксперимента), рН 7,2-7,5, температуре 27-30°С, концентрации растворенного кислорода 2-4 мг/л, концентрации биомассы около 4,0 г/л.

Проведенные сравнительные исследования с целью выбора наиболее эффективной схемы очистки сточных вод в вышеуказанных установках продемонстрировали неперспективность вариантов В и Г для очистки сточных вод изучаемого производства: - установки В -из-за образования слабооседающих агломератов, выноса биомассы с очищенной жидкостью, и, как следствие, снижения эффективности

очистки. Попытки улучшения седиментационных свойств биоценоза за счет применения флоккулянта латекса и коагулянта сульфата алюминия не увенчались успехом; - установки Г - из-за резкого уменьшения площади поверхности носителя под воздействием эмульгированных углеводородов и, как следствие, снижения- активности биомассы.

При испытании варианта Д в биореакторе с возвратом биомассы флотацией решали задачу по обоснованию выбора оптимальной скорости разбавления (Б) и начальной суммарной концентрации ксенобиотиков.

Пилотные испытания при Б 0,03 ч-1 и изменении суммарной концентрации ксенобиотиков в очищаемой жидкости показали следующее: при исходном ХПК 10 и 20 г/л эффективность, разложения ксенобиотиков составляла 84 и 85% соответственно при снижении токсичности обработанной жидкости со 100 до 0-10%. Дальнейшее повышение начальной концентрации загрязнений до 25. г/л приводило к резкому увеличению содержания органических веществ в обработанной жидкости - до 8,8-11,6 г/л, эффективность очистки при данной концентрации поллютантов составила 59-60% при остаточной токсичности 80-90%. При более высоких концентрациях загрязнений процесс очистки выходил из-под контроля.

Варьирование Б показало, что в интервале Б 0,03-0,05 ч-1 (ХПК до 20 г/л) эффективность разложения ксенобиотиков примерно одинакова и составляет около 83%. При увеличении скорости разбавления до 0,06 ч-1 этот показатель в среднем составил 75%, что обеспечивало требуемую эффективность очистки. Дальнейшее повышение Б приводило к снижению эффективности очистки до 43-67%.

Проведенное нами трехмесячное моделирование биотехнологии при 0 - 0,06 ч-1, ХПК очищаемой жидкости 20 г/л показало, что токсичность последней в процессе очистки снижается с 100 до 0-30% при эффективности окисления ксенобиотиков около 76,7% по ХПК.

Оценка'зффективностй биотехнологии первого этапа локальной очистки сточных вод производства стирола показывает, что, несмотря на удаление большей части загрязнений (76,7%), в составе прошедших предварительную очистку сточных вод содержатся высокие остаточные концентрации ксенобиотиков, поэтому с учетом целесообразности повторного использования очищенной жидкости в технологических процессах очевидна необходимость изучения возможности ее более глубокой очистки.

С учетом того, что использование иммобилизованной микрофлоры

позволяет не только повысить устойчивость микробных ассоциаций к токсикантам и окислительную мощность биологических очистных сооружений, но и увеличить глубину деструкции загрязнений за счет пространственной сукцессии микроорганизмов (Goronszy, 1987; Дмитриевский с соавт.,1991; Horst,1992; Никоненко с соавт., 1993), моделирование процесса осуществляли в пилотной установке, состоящей из четырех последовательно соединенных секций с иммобилизованной на капроновых "виях" микрофлорой.

Анализ работы установки на модельных сточных водах, содержащих фенол - 1,4, ацетофенон - 0,5, стирол 0,2, пропиленгликоль -0,5 г/л (ХПК 5,2 г/л), при D 0,033 и 0,042 ч-1 показал, что при обоих режимах в целом был достигнут сопоставимый эффект очистки (на уровне 96,5% по ХПК и 95% по органическому углероду (ОУ)) (рис.2). Что касается эффективности работы последовательно функционирующих секций при варьировании скорости разбавления, то она существенно различалась. Так, при D 0,042 ч-1 снижение ХПК составило: 31, 17, 35 и 14% в первой-четвертой секциях. В то же "время, при D 0,033 ч-1 максимум снижения концентрации загрязнений в очищаемых модельных сточных водах наблюдался в первой секции (49% от исходного ХПК сточных вод), минимум в четвертой - 3%. Параллельная оценка"-снижения ОУ дала согласующиеся результаты (рис.2).

Рис.2. Эффективность очистки модельных сточных вод в последовательно функционирующих секциях при варьировании скорости разбавления. 1-4 -секции; А - ОУ, В -- ХПК; левая группа столбцов - 0 0,033 ч-1, правая - Б 0,042

Таким образом, увеличение времени обработки жидкости на 25% (Б 0,033ч-1) привело к тому, что деструкция основного количества органических веществ (около 80%) происходила в первых двух секци-

ях , тогда как при D 0,042 ч-1 такой же аффект достигнут в результате функционирования трех последовательно работающих секций, что позволяет-прогнозировать возможность оптимизации процесса на второй ступени очистки сточных вод.

Предварительно селекционированный микробный комплекс, основой которого являлись биоценозы, использованные на предшествующем этапе очистки сточных вод, включал 17 иммобилизованных на капроновых "виях"штаммов. Моделирование процесса осуществляли с использованием жидкости, прошедшей предварительную обработку на первой ступени очистки.

В последовательно соединенных секциях спектр соединений, включающий как исходные компоненты, так и образующиеся интермеди-аты, изменяется по ходу течения жидкости, что приводит к изменению состава микроорганизмов, закрепленных на носителе.

Сравнительный анализ микробных комплексов, сформировавшихся в процессе очистки реальных сточных вод, показал, что три штамма входили в состав сообществ четырех секций, два - в состав трех и три штамма - в состав сообществ двух секций (рис.3). Если процентная доля ряда штаммов (СТО, СТО, СПИ и СТО - идентичен штамму Rhodococcus sp.KS 9.2) в составе сообществ практически не ме-

1 2 3 8 1720 213141516 41819 5 7 6 9112110

Штаммы

Рис.3 Состав иммобилизованных микробных сообществ, очищающих реальные сточные воды в последовательно функционирующих секциях. А - первая, В - вторая, С - третья, Б - четвертая секции. 1-21 штаммы СП1 - СП21 соответственно

нялась, то для других (СПб и СП2,идентичного Bacillus sp.KS 4.1) характерно уменьшение их доли по мере снижения концентрации загрязнений в ряду последовательно работающих секций. Особого внимания заслуживает иаолят, который по своим физиолого-биохимическим и деструктивным' свойствам идентичен штамму Pseudomonas sp.KS 1.1. Его доля, в составе сообществ возрастала с 21% . в первой секции до 67, 74 и 95% во второй, третьей и четвертой секциях соответственно. Смена лидеров в составе иммобилизованных сообществ в сравнении с первой ступенью очистки, вероятно, связана со снижением пресса токсичных загрязнений, что и привело к увеличению доли штамма Pseudomonas sp. KS 1.1.

Наряду с пространственной сукцессией микрофлоры, на последовательных этапах очистки сточных.вод наблюдалось закономерное изменение состава микрофауны. Массовое развитие жгутиконосцев в первой секции сменялось доминированием инфузорий во второй - четвертой и активным развитием нематод в третьей и четвертой секци-, ях. Выявленная динамика фаунистической части биоценоза согласуется с аналогичными тенденциями, обнаруженными в ряде работ (Luna-Pabello et al,1992; Никоненко с соавт., 1993).

Результаты наших испытаний при варьировании скорости разбавления послужили основой для прогнозирования возможности сокращения суммарного времени очистки на второй ступени за счет оптимизации времени обработки сточных вод в отдельных секциях. Это позволило осуществить завершающий этап работы - моделирование процесса очистки с помощью ЭВМ, которое продемонстрировало возможность согласованного ответа математической модели и полученной экспериментально эффективности удаления загрязнений . (96.5%) " при сокращении общего времени очистки с 24 до 19.3 ч.

Суммируя полученные данные, можно заключить,, что использование селекционированных нами штаммов и микробных сообществ по предлагаемой технологической схеме (первая, и вторая ступени) позволит провести детоксикацию и очистку сточных вод производства стирола с эффективностью порядка 98-99%.

ВЫВОДЫ

1. В результате-селекции в условиях непрерывного культивирования, максимально приближенных к реальным экологическим ситуациям, созданы сообщества микроорганизмов,. метабодизирующие комплекс

ароматических ксенобиотиков,входящих в состав концентрированных высокотоксичных сточных вод производства стирола.

2. В составе селекционированных сообществ (иммобилизованного на инертном носителе и неиммобилизованного) на первой ступени очистки доминировали штаммы Bacillus sp.KS 4.1 и Pseudomonas sp.KS 1.1, содержание которых составляло 65,5% и 15,6%, 67,8% и 21,3% соответственно.

3. В составе иммобилизованных сообществ, функционирующих на второй ступени очистки, характерно преобладание штамма Pseudomonas sp.KS 1.1 доля которого увеличивается с 21% в первой до 95% в четвертой секции.

4. Штаммы Bacillus sp.KS 4.1 и Pseudomonas sp.KS 1.1, а также один из минорных членов иммобилизованного сообщества - Rhodococ-cus sp.KS 9.2, превосходящие по совокупности признаков (толерантность к высоким концентрациям испытанных субстратов, спектр метаболизму емых ароматических ксенобиотиков, высокая деструктивная активность при их различных комбинациях) известные штаммы-деструкторы, используют в качестве единственного источника углерода и энергии компоненты изучаемых сточных вод: фенол, стирол,- ацетофе-нон, метилфенилкарбинол, бензол, толуол, этилбензол.

5. Впервые разработана биотехнология предварительной очистки -высокотоксичных концентрированных сточных вод производства стирола, позволяющая снизить содержание органических загрязнений на 76%, токсичность на 70-100% при следующих параметрах процесса: суммарное содержание органических загрязнений до 20,0 г/л (по ХПК) D 0,06 ч-1, pH в биореакторе 7,2-7,6, температура 28-32°С, концентрация растворенного кислорода 2-3 мг/л, концентрация биомассы около 4,0 г/л.

6. Впервые продемонстрирована принципиальная возможность и разработана вторая ступень технологии биологической очистки сточных вод производства стирола с использованием пространственно разобщенных иммобилизованных биоценозов с эффективностью удаления загря8нений до 96.5%.

- 7. Разработана программа для ЭВМ, позволяющая оптимизировать процесс второй ступени очистки сточных вод производства стирола.

8. Разработанная биотехнология очистки концентрированных, многокомпонентных, высокотоксичных сточных вод внедрена в Акционерном обществе "Нижнекамскнефтехим".

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Якушева О.И., Ворожейкин А.П., Кичигин В.П., Маслов А.П., Наумова Р.П., Петров A.M. Работы по интенсификации биологической очистки на основе скрининга на токсичность,биоокисляемость и мутагенность сточных вод нефтехимических производств// Всес. конф. "Мониторинг нефти и нефтепродуктов в окружающей среде":Тез.докл.-Уфа,1985.-С.155.

2. Якушева 0.И. .Петров A.M.,Маслов А.П..Гиниатуллин И.М., Череп-нева И.Е..Идрисова Ф.М. Дугушева Х.Б. Биологический контроль сточных вод производства нефтехимический промышленности с применением микробных тест-систем //YII съезд ВМО:Тез.докл.-Алма-Ата, -1985.-Т.б-С.205.

3. Маслов А.П.,Асадуллин А.3..Петров A.M..Наумова Р.П. Использование экспресс-теста на парамециях для регуляции очистки сточных вод//Всес.конф."Биоиндикация и биотестирование природных вод": Тез.докл.- Ростов-на-Дону -С.174.

4. А.с.СССР 1265152, МКИ С02 F 3/34. Способ подготовки сточных вод для биологической очистки активным илом / О.И.Якушева, А.М.Петров, А.П. Маслов, И.М.Гиниатуллин, В.П.Кичигин, Г.З.Скрип-ник, А.М.Багаманов, Р.П.Наумова. - Опубл. 22.06.86., Бюл.39.

5. Петров A.M., Маслов А.П., Якушева О.И., Кичигин В.П., Идрисо-ва Ф.М., Наумова Р.П. Регуляция очистки сточных вод нефтехимических производств с использованием экспресс-тестов // 4 Всес. конф. "Управляемое культивирование микроорганизмов":Тез.докл.-Пущине, 1986.-С.141.

6. Петров A.M., Маслов А.П., Тихонова М.Г. Селекция бактериальных сообществ и очистка сточных вод нефтехимического производства в условиях ферментера и биотенка"//2 Всес.конф. "Микробиологические методы защиты окружающей среды":Tea.докл.-Пущино,1988.-С.51.

7. Маслов А.П..Петров A.M..Гиниатуллин И.М..Наумова Р.П. Метод биотестирования сточных вод, поступающих на биологическую очистку. -В сб."Методы биотестирования вод"-Черноголовка.1988-С.97-99.

8. Наумова Р.П., Зарипова С.К., Маслов А.П., Петров A.M., Якушева 0.11., Селивановская С.Ю.. Гиниатуллин И.М., Гарусов A.B. Итоги и перспективы создания биотехнологий очистки промышленных сточных вод // 14 Менделеевский съезд по общ. и прикл.химии: Реф.докл.и сообщ. - М., 1989.-Т.2.- С.443.

Э.Петров A.M., Маслов А.П., Лучинина Л.Н., Идрисова Ф.М., Кади-

мов И.И., Наумова Р.П. Виотехнслогические аспекты очистки сточных вод нефтехимических производств//! Республиканская конференция по интенсификации нефтехимических процессов: Тез.докл.-Нижнекамск, 1990.-С.76.

10.А.с.СССР 1686799, МКИ С 02 F 3/34. Способ предварительной очистки сточных .вод, содержащих фенол и другие ароматические углеводороды / Петров A.M., Маслов А.П., Якушева О.И., Ворожейкин А.П., Кичигин В.П., Белокуров В.А., Васильев И.М., Лучинина Л.Н., Идрисова Ф.М., Наумова Р.П.- 1990.

' 11.Петров A.M..Якушева О.И.,Маслов А.П..Наумова Р.П. Моделирование процессов очистки промышленных сточных вод микроорганизма-ми//Всесоюзный симпозиум "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия":Тез.докл.-Оренбург,1991.-С.100.

12.Петров A.M., Якушева О.И., Наумова Р.П. Моделирование процессов очистки промышленных сточных вод // Всесоюзн.конф. "Биотехнология и биофизика микробных популяций":Тез.докл.- Алма-Ата, 1991. - С. 68.

13.Петров A.M., Лутфуллина А.Н., Наумова Р.П. Формирование иммобилизованного микробного сообщества для очистки фенолсодержащих сточных вод//5 конференция РФ "Новые направления в биотехнологии": Тез. докл. - Пущино, 1992.-С.171.

14.Петров A.M., Якушева О.И., Наумова Р.П. Биологическая очистка сточных вод нефтехимического производства // Химия и технология воды.- 1992.-Т.14,N 3. - С.221-225.

15.Патент N 1686799 РФ МКИ С 02 F 3/34. Способ предварительной очистки сточных вод, содержащих фенол и другие ароматические углеводороды / Петров A.M., Маслов А.П., Якушева О.И., Ворожейкин А.П., Кичигин В.П., Белокуров В.А., Васильев И.М., Лучинина Л.Н., Идрисова Ф.М., Наумова Р.П.- 1992.

16.Селизановская С.Ю., Петров A.M., Егорова K.B. Формирование иммобилизованных биоценозов при очистке сточных вод от комплекса токсичных соединений //'VI конференция Российской Федерации "Новые направления биотехнологии":Тез.докл.-Пушино,1994.-С.45.

Соискатель

A.M. Петров

Сдано в набор 24.04.95. Подписано в печать 25.04.95. Форм.бум. 60 х 84 I/I6. Печ.л. I. Тираж 100. Заказ 182

Лаборатория оперативкой полиграфии КГУ 420008 Казань, Ленина, 4/5