Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробная деградация акрилонитрила и акриламида

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробная деградация акрилонитрила и акриламида"

ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ГОСУДЯРСТВЕННЫЙ СА.ЧИТАРНО-ЭШШЕШЯОГИЧЕСКИИ НАДЗОР

РОССЯЙ

РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧНУННЯ ИНСТИТУТ

"МЙКРОБ"

На правах рукописи

МОИСЕЕВА Татьяна Николаевна

ЧДК 57S.G95.-S74.S35

МИКРОБНЯЯ ДЕГРАДАЦИЯ АКРИШИТРШ И АКРИШМДА 03.00.07 - иякробиояогия

Автореферат диссертации яа соискание дченой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1393

Работа выполнена в Саратовском филиале Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор БОРИС АРКАДЬЕВИЧ ЕЕНДЕРОд; кандидат химических наук СЕРГЕЙ ПЕТРОВИЧ ВОРОНИН.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАЕН, д.к.н., профессор, заведцвчий кафедрн микробиологии с вирусологией и иммунологией Саратовского медицинского института ГЕННЙДШ МАРКОВИЧ ЕУЕ; кандидат медицинских наук, доцент кафздры микробиологии Саратовского государственного университета НИКОЛАЙ ВАСИЛЬЕВИЧ ГЛЭХОВ.

Ведущая организация - Государственный научный центр по антибиотикам, г. Москва

Автореферат разослан 1993 г.

Завита состоится 1993 г. в ^___чаем на

заседании специализированного Ученого Совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском прогивочукном институте "Днкроб" (410071, г. Саратов, ул. Нниверситетскав, 46).

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института 'Микроб".

Эченнй секретарь специализированного Ученого Совета, доктор биологических наук КОРНЕЕВ ТА.

- 3 -СОДЕРЗШЕ РАБОТЫ "

актуальность ПРПОЛЕМН. Проблема загрязнения янрухасзей среды приобретает зсе более актуальный, а порой н драиатический характер. Последнее прея,а« псего связано с тем, что а биосферу зсе более часто попадая! соединения искусстпонного происхоадения. многие из которых с трудоа подзоргаптся биодеградации естественными анкроОиоценозами. Сложность положения усугубляется такяа и теа. что многие из этих \рудноразлагас*нх ксенобиотиков обладаэт разнообразными токсическими зффектани на все конпояентн биосферы Зенли, зклвча.ч человека.

'К таким соединениям, со осей определенностью, козно отнести производные акрилизэй кислоты - акрялонитрил и акриламиц, ммрозой выпуск которых s начале 80-х годов достигал 2.4 он и 200 тнс. тонн, соответственно (Лкрияакид.... 1303; йкрилонитрил..., 1987).

Возраставшие тенгщ развития производства акрилонитрила и ак-рилаикда обусловлены их яирвкии применением в различных отраслях народного хозяйства. Зто, презде всего, исходные аоноаера при получении полимеров различного назначения. Полимеры к сополимеры на основе акрилонитрила яспользулт для-приготовления зинилпластнко-вых покрытий, клея, целлофана, бумаги, картона, полиолефиновой пленки, эластомеров, аестких, полужестких л модифицирозанных ан-рйловых и виниловых пластиков. Пзлиакрилааиды прииензвт в качестве элективных флокулянтов 2 химической, нефтяной и горнорудной промышленности, ьа пеллялозно-бунагных комбинатах (Йкряламид.... 1S8S, i980; йкрилояитрид..., 1987).

К соаалеака, соврсиенная технология получения акрилонитрила и акриламиза не обеспечивает предотвращения их попадания и атмосферу и сточние воды прндприятий,. поэтомд проблема расширения химического производства акрялстштрила и акрялаиида тесно связана с„ проблемой полной очиегкя сгойсв м стзение. отрицательного воздействия эткх веществ на окрцхапидв среду.

Доказано, что акрилоьитрил я акрилаанд оказывают аырааенные токсические задекта^ что mgsít яеСлагоприятнз отразиться на здоровье чах нынежних, так Ьудугцях ппколаний (Гончарова Я. Н. и др., 13Н4; йаврина Е.Р. и др., 1983: Зустоз В.Я., Наврана E.ÍL, 1975; Qu^ley Н.С. et al., 1942). Fies возраставшие масштаба полупения и использования акокленитрила и акрилаиида сиздавт опас-

кость не только дл£ лнц, непосредственно контактируввих с ниви, hü к для всего осталькога населения, а также для представителей растительного и яивоткого мира. Это обусловлено низкой скоростьг разлаженна акрнлонитркла а акриламида и естественных условиях к их способности аккукулнрйватьса в воде, печве ¡: других катерна-лах до концентраций, лревьвавдих предельно-допустимые (Беспашгт-нов Г.Ii.» 1985).

Предприятия, производящие и потребляющие акрилонитрил к ак-рилаиид, вынуждены затрачивать значительные средства на утилизации сточных вод. содержащих в своем составе эти высокотоксичные соединения. Достаточно ответить, что крупнейвее химическое предприятие области "Нитрон", иыевдее собственные очистные сооружения, не обеспечивает эффективной очистки стоков и вынуждено осуществлять сввганис нсутилизированных отходов, в той числе отходов производства акрилоннтркла, акрилаиида и палиакриламида.

Все это днктуег необходимость разработки нетсдоб и приемов, как предупреждающих попадание акрнлоиитроа и анриламида в окру-Еашадв среду, так и сшсобсгвуквих разружени® уже накопленных в «ей.

Бажнейжик фактором улдчжениа качества окружащей природной среды, зацитк водоемов от загрязнения вредныик вевестваии природного и неприродного происхождения является повышение эффективности функционирования очистнкх сооругений за счет создания систек локальной предочистки стоков, на основе высокоактивных втаи-ков-деструкторов (Алиева Р.IL., 1966; Елялетдинов ft.fi., 1990).

В литературе содержатся сведения а способности грамположи-тельных к граь'огрицательшГх микроорганизмов, относз^ихся к родак Brevibacterius, Bacillus, firthrobacter, Rhodococcus, Pseudoaonas, осувествлять биодеградацив акрнлонитрила и акрилаиида (Yang Н. et al., 1981, 1984; Bui К. et al., 1984; ßsano У. et а!.. 1982; ftrai Т. et al., 1981; Thoapson L.fl: et al., 1988), однако, исследований, посвященные зтоиз вопроса, косят, в основной, поисковый характер и не доведена да стадии пропитанного внедрений, Ячитывад неблагоприятно зкологическув обстановку в Саратовское регионе, а также наличие производств, выпускающих.акрилонитрил, акрилакид и полимеры на их основе, поиск шгаыков-деструкторов, способных с высокой актииностьв очикать сточные воды от акрилонктрила и акрилаиида, изучение условий,; определявших каксикальнув степень их

биодеградации до продуктов, не обладапчих*токсичными свойствами. Я в конечно» счете. создание систем локальной очистки авляптсл весьма актуальными.

ЦЕЛЬЮ настоамей работы явилась разработка биотехнологических приемов локальной очистки сточных вод, содерзамих акрилонитрил и акрилдмид, на основе создания коллекции высокоактивных «тлммов-деструкторов; изучения возмоаности использования иммобилизованных культур этих бактерий в условиях экспериментальной установки дла очистки сточных вод опытного производства акрилааида и полиакрил-анида.

Для достиаения этой цели Онли поставлены следцпаие задачи исследования:

1. Выяснить распространенность микроорганизмов, способных к утилизации акрилонитрила, акрилааида и акриловой кислота в качестве единственного источника углерода и/или азота.

2. Создать коллекция ятаммов микроорганизмов-деструкторов акрилонитрила. акриламида и акрилозой кислота: провести иаентиои-кациа зтааасв с наиболее выра»енной деструктивной активностью.

3. Отработать условия, при которых селектированные атаммы проявляют максимальная деструктивная активность. Выяснить спектр субстратной специфичности бактерий.

4. Исследовать генетическая природу детерминирование признака деструкции акрилонитрила, акриламида и акриловой кислоты и некоторые биохимические механизны этого процесса.

5. Разработать приемы использования селектированных микроорганизмов и доказать принципиальная зозмояяость локальной очистка сточных зсд опытного производства акриламида л полиакрилаяида с использованием иммобилизованных клеток.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые исследована распространенность микроорганизмов, способных разрдяать акрнлонитряя, акрилааид и акри-ловуэ кислоть'. йз почва и сточных зад с лроизаодства акрилонитрила выделена гксокоактивныа зтаама-дестрдкторя, обладавшие зироким субстратным спектрои. Два яз-нях. Рзеш}аног.аз р52ис1оа1саН8епе5 оп и Breuiba.ct.er зр. 13Пн. заадцаны авторскинк свидетельствами К 1712507 я 1752727 от 15.10.1951 г. л ОО.С4Л392 г. с приоритетом от 04.12.1339 г. а 18.12.1383 г., соответственно-.

Определены основные факторы л параметра, а той или иной степени стиаулирузиие или ингибичувщие процесс деструкции^ Четансз-

- о

лена стабильность признака биодеградации акрилонитрила к акрила-мида. Выяснены основные биохймические механизмы процесса деструкции, идентифицирован рад промежуточных и конечных продуктов метаболизма акрилонитрила к акрилаиида.

Разработана принципиальная схема установки для локальной очистки стоков от акрилонитрила и акрилаиида с использованием, иммобилизованных на синтетической насадке, клеток селектированных гтаммов-деструкторов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые создана коллекция ета*-коь-деструкторов. способных утилизировать акрилонитркл к акрила-мид. а- такке другие нитрил« и амиды карбоковнх кислот, используя их е качестве единственного источника углерода к/или азота.

Депонированы три высокоактивных Ртамма-деструктора акрилонитрила, акрилаиида к акриловой кислоты РБеийоЕрпаг а!са11£епе? 5г. Р5еибоЕопа$ рзеш1оа1саНвепе5 6п к Вгеу1Ьас1ег1ив гр. 13ПР. (Авторские свидетельства К 1712407 к 1752727 от 15.10.1881 г. и 0й,.04.1992 г., соответственно), значительно превышавшие по свои* деструктивно-кинетическим характеристикам зарубеькыр аналоги.

Установлены факторы, определяющие максикальную деструктивную активность селектированных ктаммов в отношении акрилонитрила к акркламида.

Разработаны приемы использования микроорганизмов для локальной. очистки сточных вод, отработана основные параметры этого процессе на лабораторной установке. Показана принципиальная возможность создания локальных очистных сооружений с использование^' селектированных штаммов-деструкторов.

По результатам исследований созданы лабораторные регламенты не. процесс наработки биомассы стартерного ктамма Вгеу1Ьас1ег1иь 131Ш к процесс очистки сточных вод. .садэржавих акрилонитрил и акрилаквд.

ВНЕДРЕНИЕ. Селектированные Етаммы использованы в работе лаборатории микробиологической трансформации СФ ВНИИ'Тенетика". имеется акты о внедрении от 16.09.1389 г., 12.1С, 1351; г. I . 0u.07.13Si г. Проведены комиссионные испытаний станков р. реальна* сточных водах опытного производства акрклаыида к пплиакркламидр И* НИИ Полимеров (акты испытания от 21.02.1989 г.).

На эациту выкосатся следующие положения'. .1. Результаты исследований по изучению , распространенное

аикроорганизаов. угилизирул^их акралонитрил н акриламид.

2. Результаты исследований по селекции и изучении биологических характеристик зтаыноз-деструктороа акрилонитрила, акрил-аяида и акриловой кислоты.

3. Результаты исследований по оптимизации условий предкуль-тивированич iTansia Srevibactarina so. iЗПЙ и процесса деструкции акриламида и акриловой кислота с аго участие*.

А. Результаты исследований по изучения путей метаболизма акрилонитрила. акриламида и акриловой «ислота, а также природа генетического детерминирования признака Аипаэетрцкцин у селектированных jtjmmob.

5. Результаты, ибосновцвазжие принципиальная возможность использования селектированных зтаммов для очистки сточных зад. со-деояажих акрилонитрил, акриламид и акриловуп кислоту.

АПРОБАЦИЯ РйБОП

Материалы диссертации бмли доложена на Всесоюзных и ¿ездцна-родгшх симнсзиуиах и конференциях (конференция аолодых ученых ;з -iБФРУ ЛК СССР, Саратов. 1388; рабочее совежание "5иотсхнология а ■юганическоя синтезе и защите окружающей среды", Лччино, 1'383; Зсеспязкач конференция '¡¡озые направления биотехнологии", Пузино. 1390; (J Scientific Sysposius of Socialist Countries on ¡iiu-senna Hungary, 138S; "Forua far applied biotechnology", ileigiua. 1391).

.rJoilKKAHKH

Jo те«е диссертации опубликовано 3 работ, з то» числе i ла-ггнт лсл. рея. о задача татанта от 10.02.32 по заявке К 4944460 /13 (048?57) от П.Об.1381 г.) л 3 авторских свидетельства па изобретения (Н 17'¿407 от 15.10.1391 с приоритетом от 04.12.1989 г.. л 1731814 зт 03.01.1292 г. с приоритета от 17.05.1S90 г. и '{ 1752727 от 38.04.1392 г. с приоритетом от 18.12.1989 г.-).-СТРЗХТЗРа И ЗБ'зЕН РАБОТН

лиссзотааия состоит из введения, 7 глав, заключения. зызо-доз. списка яспользозакзой литература, вкллчаажего 42 работа оте-|ес?38киих и 11В .¡лрубеаных авторов. диссертация излсаена на i80 '.'"кницах иазикописаога такс та. знлачазга'его 2 фотографии, 17 аи-1.ЧНК03. 22 таблицы.

iATEPlifiiTJ а МЕТОДЫ

- в -

Б работе использованы 260 »таьшов граиполовительных и грек-отрицательных бактерий, из которых 6 культур были получены из Центрального вузея проявленных книросрганизыов (ЦИГЮ г. Москва, 4 - из коллекции.кафедры викробиологии Саратовского медицинского института, 1 - из коллекции Саратовского филиала ВНИИ'Тенегкка", 247 некдентйфицироваиных культур были выделены кз различных объектов окружавшей среды.

Материалом для выделения втакмов служили образцы почв 11Б), активного ила (5), пробы сточных сод (56).и другие источники.

Б генетических эксперниентах использовались втакиы PseudoEonas aeruginosa PA03Û3RP4, Pseadoeoiias putida AC 340 к Escherichia coli СйОО из коллекции ВНИИ"Генетика" (г. Москва).

Кшфоорганкзиы хранили при 4°С на столбиках с 0,4V. агаризо-ванной LB -средой с пересевами через кагдые три кесяца, а текЕе в 50% глицерине в пробирках типа Eppendorf при -20°С.

Б работе использовали коммерческие среды отечественного и зарубежного производства: касо-пептонный бульон (НПБ); кясо-пеп-тонный агар iKUfl); LB-среда С г/л): тркптон Eacto -10,0, дроккевой экстракт Bado - 5,0, НаС1 - 10,0.Для селекции к изучения процесса биодеградацик прииенелк кодифицированные нами,.синтетические среды следившего состава (г/л): "fl" MßS0v- 0,1, К2НРСЦ - 0,1, глвкоза - 0,5. пептон - 1,0, pli - 7,2±0,2; "В" MgSO^- 0,1, KgHPO^ - 0.1. PH - 7,2+0,2.

При необходимости видкие средн уплотнялись добавление« агаре в концентрации 15-20 г/я.

В качестве ксследуекых соединений при изучении субстратной специфичноетк и процессов деструкции прикекалк: акрилонитрил, ак-рклаккд, акриловую кислоту, ацетонитрия, бекзонитрил, бутиронит-рил, кзобутиранитркл, конохлораиетонктрил, ацетакид, бензаиид, буткраиид, кзобутиракид, кетакрилакид, пропконакид,ы-хлорацета-иид.

йкрилонитркл, акрилакид, акриловую кислоту, а такие другие исследуекые субстраты, стерилизовали через кеибранкый фильтр к вносили в среды после стерилизации в необходимых концентрациях.

Для изоляции-кикроорганизиоЕ, способных к росту и деградации акрнланитркяа и акрняакида, использовали пряной высев материала на селективнае среды, а такзе кетодк какопителоних культур и ступенчатой адаптации СКарасевнч U.E., 1S?5).

Йдентнфикацни микроорганизмов осдхестзляли на основе изучения физиолого-биохимических и морфолого-культуралъных свойств, определения ГЦ-состава «Леванова Г.9., 1968, 1987: Sergey's, 1986: Hendrie U.S. et al.. 1979; Palleroni H.J.. 1978; Seiler IL. 1983; Stanier R.Y. et al.. 1966).

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяли методом бумаянах дисков по зонам задержи роста.

Антибактериальное действие акрилонитрила, акриламида и акриловой кислоты оценивали на аидиой питательной среде (!ШБ. IB-среде) стандартным методом дзухратннх серийных разведений.

Количественные характеристики процесса биодеградации изучали на видной синтетической среде "В* или в фосфатном буфере при температуре 28° С н круговом перемешивании. С этой целья суточнув (18 часовую) культуру исследуемого ятамаа, зыраченнуз на среде "й" и отмытув физиологическим раствором, вносили а среду "В",- содерха-5уа акрилонитрил. акрияамид или акриловуя кислоту в исследуемой концентрации. 3 случае деструкции акриловой кислота среду нейтрализовали знесеннеа 10Z водного раствора аммиака, который одновременно выступал источником азота. Процесс деструкции останавливали добавлением к пробе 1 Н ЙС1. Параллельно ставили контрольные колба с акрилонитрилом или акряламидои в трех повторностах для подтверждения отсутствия небиологичвского разруиения этих соединзний. О бксдеструктивной активности »таймов сддили по убыли субстрата (акрилонитрила, акриламида или акриловой кислота) из среди культивирования.

Концентрации акрилонитрила, акриламида и акриловой кислота определяли аетодоа газо-5идкостной хроматографии.;Для количественного определенна анализируемых- компонентов использовали метод внутреннего стандарта. Для каядзго из компонентов строили градуи-ровочннй график зависимости отноиеяия плоцадей пиков анализируемого вещества к стандарту от концентрации вещества. Математическую обработку градуировочнзх зависимостей проводили яетодсм наи-аеньэих квадратов. Для эсех определяемых компонентов градуирозоч-кый гра№ xopeso описывался уравнениями линейной регрессии*

Концентрации аммиака определяли с понояьа реактива- йесслера. а такче с использованием ион-селективного, электрода.

Концентрация клеток определяли по оптической плстностм пулъ-туральной аэдхостн иэя длине зелш 540 ям на фотоэлзктрокалори-

метре КФК-2 в кюветес тшшиной оптического слоя 5 мм и пересчитывали на сухой вес (г/л) или на количество клеток (кое/мл) по предварительно построенной калибровочной кригшй П ед оптической плотности соответствует для етакма BrevibacteriuE sp. 1ЗПА - 0,27 г/л по сухому весу или 5,7.10а кл/ыя, для стамыа PsEuüubDüas pseudoalcal igenes - 0,16 г/л по сухому весу или Й,2.i С^- кл/мл).

Оптимизацию среды предкультивирования для етсыыа BrevibacU-riUE sp. 13ПА проводили в екрокок диапазоне состава и концентраций.

Влияние pH (в интервале 5-10), температуры (в интервале -10-45°С). концентрации субстрата (в интервале 1.0-10,0 г/л), микронной нагрузки (в интервале 0,134 - 1,340 г/л по сухому весу для ктамка Brevibacterius sp. 1 ЗИЛ; 1.013 - 0,253 г/л по сухому вег.у для »тамма Pseudoionas pseudoaicaligenes Gu; на кинетику росте втаимов к деструкцию исследуемых соединений изучали на синтетической среде "В" иле в буферных растворах.'

Влияние аэрации оценивали в различных условкзх кзссопередачи, определяемых как степенью запелненйя объема реакционной средой (1/10 - 7/10), так и интенсивность!/ перемевиваниа (70-200 кач/мин).

Стабильность признака деструкции в неселективных условиях хранения определяли, используя общепринятые приемы. При изучении индуцированной элиминации признака в качестве злиминирувдих агентов использовали непермиссивкую температуру инкубации (37 к 42" С), а также акридиновый оранжевый, зтидий бромистый, мктокицин С и SBS в суббактериостатических концентрациях (Миллер де,, 1976).

Трансмиссквность' признака бкодеградацки исследовали по стандартной методике СCfiakrabarty fi.K., 1972).

Для обнаружения плазмидной ДНК в штаммах-деструкторах использовали различные методы электрофореза в агарознок геле (Eirnboiü И.С., Boly Л.. 1379; Eckhardt Т., 1978; Kado СЛ.. Liu S.T., lSSij.

Идентификации продуктов к интеркедиатов микробного метаболизма акрилонитрила, акриламкда и акриловой кислоты проводили методами тонкослойной и газо-ЕИДкостной хроматографии. Идентификация конечных продуктов осушествляли по данный элементного, анализе, и ИК-спектру.

Нмиобилизацив микроорганизмов проводили методом адсорбцк!' ч

синтетическуо насадку типа "ВЙЯ" (Гвоздда П.И.. 1391). йдсорбци-оннуп емкость носителя оценивали на основании определения сухого веса биомасса, закрепленной на единице сухого веса волокна.

Длительность сохранения бактерий-деструктооов з реальных сточных водах опытного производств« акриламида и полиакрилаиида определяли путем снсева десятикратных разведений стоков на питательные среды для подсчета числа виросних колоний.

Оценку эффективности процесса деструкции акриловой кислоты и ее производных з обвззнах реальных сточных над опытного производства акриламида к поляакрил ямида с :н: пользованием иммобилизованных культур ;]гаУ1Ьас1ег1ча эр. 13ПП и Уйе(д1оаопа5 рзеис1оа1сл11ве-пез бп проводили на лабораторной установке, которая приставляла собой пластиковый восьнксекцизшшй аппарат, состояаий из пар-но-сзобщаясихса смеишх секций, оачим оо^мом 2,3 л. Пооток стачной воды с вавьируемсй скоростьа осуществлялся с помоиьа перистальтического насоса. В каадуп секцию был подведен воздух с регулируемым расходом.

рЕзальтпта исслЕ.доваша

3 литературе довольно часто встречаатся своденна о 'способности микроорганизмов в естественных условиях разругать акрнланягрил и акрилаиид, однако концентрации. утилизиризкые такими чиксоорга-низмами, весьма незначительна. Учитывая все возрастание количество подобных соединений в объектах окружений среды, прежде зсаго вблизи предприятий, где их производят или использчит, была пвове-дена серия экспериментов по изучения распространенности микроорганизмов. способных к ыэтабояизму данной группы соединений. С этой целы» в работе б«ло проанализировано 260 ятаиаов аэробных граыпзловчтельнях и гваиотрицательннх бактерий, относящихся к ро-даа &1саПдепе5, йг1ЬгоЬасЪег, ЗасШиз, Пг<пчЬас1ег1иа, Ргеийомпаэ. СогупеЬас^згиш, Носаг(На. йьойсс'зссаз. полученных ч" трех аузеев или изолированных мз 78 образцов почвы, сточных чоц. активного чпа с п/'о "Нитрон", а такае из других объектов ок-руналазй средр. 3 результате проделанной работа установлено, что среди азробнкх бактерий способность н деструкция акрилоштрила и акрялаыиаа распространена более зироко, по сравнения с таковой г; акриловой кислоте. Сопоставляя яави результаты с даннкыи литеры-

туры по этому вопросу, «окно ответить, что наиболее часто деструкторы акрияонитрила, акркламида и акриловой кислоты встречается среди родов РэеийоиопаБ и Вгеу1Ьас1ег1иа. Впервые было установлено наличие способности к минерализации акриламнда у представителей рода КогахеПа (табл. 1).

Таблица 1

Распространенность втаммов-деструкторов среди представителей различных таксономических групп

Родовая принадлемность исследованных штаммов Количество втавыов

исследованных деструкторов HftK деструкторов Afi

Scinetobacter 18 _ 2

Alcaligenes 23 5 3

Arthrobacter 15 4 0

Bacillus 20 3 3

Brevibacterius 51 6 22

Corynebacterius 22 4 3

Eaterobacter 7 - -

Lactobacillus 1 - -

Kicrococcus 10 2 1

Moraxella 1 - 1

Keisseria 1 - -

PseuaoEona? 57 17 12

Rhodococcus 16 3 А

Sarcina 3 - -

Staphylococcus 2 - -

Примечание: ПАК - нитрил акриловой ккслоти

ЙА - акрнлаыид Потенциальными исгочннкаки для селекции высокоактивных деструкторов акриловой1 кислоты и ее производных являются почва к сточные воды предприятий, производящих или потребляющих эти соединенна. Среди коллекционных культур, относящихся к тем ве родам, что к .селектированные втаммы, признак, биодеградации .акрилоннтрила и акрнлаккда не встречался (тебл. 2).

Таблица 2

Зколпгиа жтаммов-деструкгоров акрилонигрила к акрилакнда

Объектн Количество исследованных проб Об*ее количество втаимов Количество вгаммов, устойчивых к Количество втакмов-дес- трукторов

НЙК № НЙК йй

Музейные втаимы 13 3 4 _ _

Активный ил аэротенков

очистиых сооружений 5 3 7 В - -

Обжнй сток п/о

"Нитрон" 1 2 - 1 - -

Почва с очистнях соо-

ружений п/о "Нитрон" 2 5 3 4 - -

Цнаниднке стоки

п/о "Нитрон" 4 5 к/о 3 - -

Производство НАК:

пробы почвы 12 141 89 112 20 3?

Сточные воды опытного

производства акрилаки-

да к полиакриламкда 51 81 н/о н/о 24 20

Прочие источники 3 4 2 2 $ -

Примечания: и/о - не определялась

В результате изучения аналогия бактерий, разруианцих акряло-нитрил и акриламид. нам удалось создать бпяьгув коллекции иикро-организмов, как резистентных к высокий концентрациян акрилонитри-ла к акриламида (205), так и способных кетаболкзировать эти вещества (10! втамм). Особенностью селектированных культур, по сравнении с описанными в литературе, является иирокий спектр утилизируемых соединений данного класса. Из 12 исследованных субстратов только бензонитрил, бензамид и монохлорацетонитрил оказались инертными как источники углерода н/и*и азота, что мовет быть обусловлено либо высокой токскчкостьв этих соединений, либо ог-

сугствяем у ятаиаов специфической ферменгтЯ систекн (Валйуорай-Ьуау А.К. е1 а1., 1956). Таким образом, созданная коллекция атам-из8 аогет быть весьма полезной для будущего конструирования аик-роорганизиов - универсальных деструктороБ практически всех уже созданиях или синтезируемых в будущем нитрилов и амидов карбоно -5ЫХ кислот.

Часть культур, проявляющих наибользуз деструктивную активность, были депонированы в ЦЙПЙ ВНЯйТенетика" (В-4418, 5-925, 3-4315, 5-4937) и педзерглнсь детальнону микробиологическому исследовании. В результате изучения более 80 феначипических характеристик Сиврсрологичесйие, кцльтуральнае, физиологические, биохимические свойства, чувствительность к антибиотикам, анализ ГЦ) изо-¿ироздянзз ь-ультура-дсструкторы были идентифицированы как Рзеи^оаог.аз а'хсаНрпез 5г, Рзеийоаоназ рь'е^оакаНдепег бп. Сге';1Ьас1ег1-ла гр. 13Пй. Два втаыма защищены авторскиаи свидетельствами на изобретение (г( 1712107 от 15.'0.1991 с приоритетов от 04.12.1389 г. и Я 1752?27 от 0В.04.1932 г. с приоритетом от 12.12.1ЭЯ9 г.).

После установления таксономичзской принадлежности наиболее активных атаямоз мы провели более детальное исследование процессов деструкции акрилонитряяа, акршшида н акриловой кислоты с их участке*.

Прежде всего было установлено, что признак деструкции акри-ламида у 8геу1Ьас1ег1ца эр. 13ПЙ язляетса индуцибелькгм, так как предварительная инкубация бактерий на среде "С" в присутствии ак-рилааада или ишйого другого амида значительно полагает деструк-тивнуа активность этого ктанма. Крике того, выявлена, что выраженность индукции энзимов, участвугдих в трансформации акрилами-да, зависит от ряда'факторов', в частности, рп и состава среан. Б результате многочисленных проведенных экспериментов б яиракаа диз-лазене состава и концентраций нам удалось подобрать условия культивирования, при которых арединкабациа исходного »танна дава-;л впоследствии наиболее зкпшнуя а плане деструкции культуру. Такйми условиями оказались:'

рН 7.3-2.0

состав среда "С'Чг/я): К2НР0Ч

Мд501(

глзкоза

- 55 -

дроиевой гидродизат - 5,0 акриламиц - 5,0

дистиллированная вода -1.0 л.

Помимо условий нредкультивированияк- на деструктивную активность Brevibâcleriut sp. 13ПЙ существенное влияние оказывала другие факторн, прегдс всего концентрация бактериальных клеток г. среде, концентрация субстрата, аэрация, рН, температура.

Как и длл других ксенобиотиков, концентрация нкквоо:;кх каток являлась лимиткрувщкм факторов для проявления дестрдгтивягд активности в отноыении акрилоккгрйла к акриламида: чем вкае концентраций бактерий в среде, тем бкетрее и эффективнее проходил процесс деструкции. Ь результате подбора соответствувких параметров процесса «ам удалось добиться полного разрушения акрияакида Си образующейся акрилогой кислотц) в среде "В" при его начальной концентрации 5,С г/л за 30 часов (рис.). Такими условиями оказались: температура 25-30° С, рН 6-8, концентрация субстрата 5-10 г/л, микробная нагрузка 1,34 г/л по сухому Бесу, при этом долмен соблюдаться оптимальный режим аэрации: ограниченная аэрация в процессе трансформации акркламида в акриловая кислоту, усиленная аэрация при утилизации кислого продукта. В оптимальных условиях, трансформация акриламида в ькрилсвув кислоту проходила за 10 часов, в этот кокент в среде содервалось максимальное количество акриловой кислоты (3.7 г/л) и ионов зккоикя Cl,35,г/л). После этого начиналась утилизация акриловой кислоты и интенсивный рост клеток. Полная деструкция акриловой кислоты происходила за 30 часов. Коны аммония из среды полнсстье не удалились к осчаьалксь в концентрации 0,3 г/л. что приводило к сдвигу рН в ходе процесса г. 7,0 до 3,04. Прирост биокассы составим 0,57 г/л. то есть 71"д по отношению к засевннй дозе.

Сопоставляя наии результата с описанными в литературе необходимо отметить, что проведенные эксперименты г. ксиольрокамш;* селектированная микроорганизмов позволили получить н лаоораторнч* условиях болпе Э!рфективЕ!ув деструкции столь трудна разр<1вле»:цх в естественных условиях соединений, как акрилокитрил, акриланид к акпкловая кислота.

Высокая деструктивна« активность селектированных мтаммив Pseudoaonas alcaligeues 5г. Pseudotonas pseudaaicaligenes b-n,

промезцточных продуктов Вге'ЛЬас1,ег1иа зр. <ЗПР. Условия процесса: температура - 28°С; рН среды -7,0;.яемы аэрации - 80-180 аб/иин; микробная нагрузка - 1.34 г/л (по сухому весу клеток); концентрация субстрата -5.С г/л. Процесс проводили в колбах Эрленаейвра объемом 300 ал, заполненных на 1/6 часть средой "В". 2 качестве посевного материала использовали культуру. вщздечнцп на среде "С", содерзааей акрал-амид а качестве яндуктира.

1 - акрядамид

2 - акриловая кислота ' 3 - ЯН., *

4 - -зН"спади

ÜFevibacUriu® sp. 13ПЙ позволила сделать вевод о возможности создания на их основе локальных систе* очистки сточных вод от ак-рилонитрила. акрилаыида и акриловой кислоты. Некоторые подхода к разработке подобных систем нами изучены и будут рассмотрены ниве.

Больво?. теоретический к практический интерес, на нас взгляд, кизывало изучение биохинии деструкции акркяонктрияа. акрилаиида к акриловой кислоты селектированякки кикроорганизчаки. Б связи с зтин, используя различнее приемы хроматографии (газо-кидкостная, тонкослойная), данные ЕИ-спектрометрин к элементного анализа, кк в динакике изучили г.ьоцесск деструкции этих соединений. В результате исследований как удалось показать, что биохимический процесс метаболизма акрилонитрила к акрклаивда еел hg току es пути, что описан н литературе: через образование на перзок этапе деструкции - акриловой кислот» н ионов аныония в качестве интерыедиатов. Метаболизм акриловой кислоты протекал через образование молочной кислоты, идентифицированной по ТСХ в присутствии свидетеля, и приводил в результате к вкдеченив нетоксичного для жибнх организмов соединения - бикарбоната аммония, идентификация которого была проведена по злеиентноку анализу и ИК-спектру.

Б последние годы бояъжое вникание уделяется изучении генетической природы детерминирования признака деградации различных ксенобиотиков микроорганизмам. Анализ литературы показал, что этот процесс в отномении подавлявшего большинства ксенобиотиков обуславливается генами, локализованные в плазмидах ЯуисЬ J.K., Hobbi] D.E., 1388). S связи с этик представляло несомненный интерес выяснить, лежит ли этот генетический механизм и в основе признака деградации акрилонктрилз и акрилакида у селектированных нами бактерий, установить его стабильность. йспользуя обжеприня-тке приемы изучения генетического детерминирования (исследование спонтанной утраты признака, элиминирование ЛИК-тронными агентами, изучение трансииссивности, выделение плазмидной ЛКК и ее последующая визуализация с поиокыз гель-элгктроФореза). мы исследовали генетическую природу признака деструкции для втамжов Srevibacie-riua sp. 13ЯЙ, Рзеийовопая alcalicenes 5r, F'sturtqsonas pssueoai-calißenes ön.

Проведенные эксперименты показали вксокув стабильность признака деструкции акрилонитрила, акрилавида и -акриловой кислоты в условях неселективного хранения и пересева. Ни у одного нз »там-

- 18 -

мов спонтанной утрата признака деструкции на наблюдалось.

Для контроля за процесс он нн ¡¡.ццмроватпй элиыинапт з изучаемые «таямн была зведена известная пдазиида RP4 из Pbeuüuaonas aeruginosa PÖ0303RP4. При этой оказалось, что если - зпе вывеназ-заннае приемы подтвердили наличие плазмиды RP4, то в отноаении генетической трироды детерминирования признака деструкции акрнло-нитряла й акрялаачда мы получили противоречивые результаты. 3 частности, воздействуя на гтамми псвавенной теашератур^й и ¡jDS, удалось выделите клоны, дтративаие способность к биодеградацки исследуемых соединений (с частотой 1.4.10"' кл. l,7.tQ~~ кл для Pseudomonas pssudoal'caligenes 6п, 1.8.10"-кл. 1,9.10~* кл для Pseudomonas aicalisenes 5г, '¡.'¿.IG'2, кл для Brevibacieriua sp. 13Пд). С другой стороны, все попытки визуализировать пла-заиднузз ДНК у исслсдованннх гтаааок путей разнообразных приемов ее изоляция из ялзток (Blrnboti Й.С., Dols Л., 1979; Eckhardt Т., ШЗ: Kijo СЛ., Liu S.T., 138i) не увенчались успехом. Учитывая, что эти аетолы ииепт ограничения аа размеру плозкид (не ssse 300 т.п.к.) и не позволяет визуализировать эпасоау а составе бактериальной хронасеыы, били предприняты попытки по кенькгатниной передач-:: признака.бясдсструкц-м акриленитрала а акриламида з зтаа-<j реципиенты Е. coli СсСО и Pseudomonas putida AC240, а такзе з «такаа исследценах культур, потаряЕзих способность к оисдеграда-ции. йи в одном случае не сало обнаоуаено передачи соответствующих признаков, при этой плазккда ?.Р4 передавалась з аналогичны;; экспериментах с частотой 5,0.10°- 7ЛЛ0~йна клетку донора.

Таким образом, хота нами и Оаяя получзнк косвенные подтверждения плазаидной.природы детерминирования признака деструкции ак-рпяонктркла и акриламйда, окончательно утверждать, что гена, ответственное за зтот процесс, локализованы в плазмидз v.m креме-оме не предстарляется везшзжным. Однако, исходя из задач нашего агследозаиия ваанз ответить, что признак деструкции г.крилйН'.прияа ,i акриламида хвляатся стабильным.

Анализ представленных ннае зечульгатов показал, что исследу-зтаьмн' «мрооргонизхов язлявтея кереяел гивиыни для -дх яс-:: .:ьо»всчия в сооруяекшх по локальной счастье сточных лад от ак-■••.•линитан.та. акоилааида а акралевзй кислота. Чтобя убегдтьед s .: гс-4, .¡ыла юезедена депо титульная серия экспериментов но зазра-■^тче поиенпй «спсльзсвання сслектиповаяннх зтаамов а по создания

лабораторной установки.

Наиболее перспгктквнш методой использования микриосганизись б биотехнологии очистки впдь является применение икмобидизовв"!;;;-: клеток (Гвоздяк П.И., 1У87; Днктренко Г.К., 1984; Илялетдинл Р.Н., Алиева Р.к., ¡967). В сеязи с этим была проведена отработк? у г. л о в у,?', иммобилизации к овечка эффективности деструкции, закрепленными на различных носителях, етаммами. В работе оценивали* ¡. два основных приема иммобилизации: метод вклсчениг е гели и мг.тг-д адсорбции. Б первом случае применяли органические полимерные носители как природного'(агар-агар), так к синтетического (нэлкан-рилаиид) происхзгдеииз. Однако, биокатализаторк, кригстовленнне на основе полимерных гелей, теряли 25-30% активности по сравнение с кктактннки клетками. Кроке тоге, при использовании полимерных носителей вставая вопрос об утилизации отработанного биокатализатора и исходном пелимернок сырье для приготовления гелей, так как на сегодняхний день в СНГ потребности в полкакрияакид-геле и агар-агаре полнее гьв не удовлетворятся,

В резуяьтатг кногочисленных экспериментов по подбору оптимального носителя и способа иммобилизации был выбран метод адсорбции на синтетический носитель типа "ВИЙ", изготовленный на основе текстурироаанйого капронового егдта. Проведение опктк подтвердили високув сорбционнув еккость этого материала, что позволяло локализовать больвие количества биомассы б очистном реакторе. Клетки, иммобилизованные на синтетические волокна "ВИ§", сохраняли своя деструктивнув активность к жизнеспособность в течение-длительного времени.

С целью изучения биологической активности селектированных етаммов в реальных сточных водах была сконструирована лабораторная установка, состоящая из 8 последовательных секций, в кою рук с поиощьв перистальтического насоса с варьируемой скорссгьв подавались образцы промавленнкх стоков, с предварительно . .установленный хииическиь составом. Сещисппссть установки обеспечивала у-.-линненинй путо прохоЕдения сточных вод-и увеличивала время г.г;;-такта.стоков с.микроорганизмами.

Оказалось, что пропуская реальные стоки через устанонгу I иммобилизованными клетками втамков-деструктсрсс. действительна коЕН'.- получать воду, которая на 75,ОХ Рыла очинена от спеииоичвс-ал"рк?кителек: акрилонитрила, акрилаыидз и акриловой кислоты.

Лла повывения эффективности работы (¡становий была оптимизирована! величина микробной нагрузки, степень аэрации на стадиях деструкции акраламида и акриловой кислоты и скорость протока. В результате эффектнзность очистки стоксь, при нагрузке бискатализатора в пересчете на сухой sec биомассы - 2,04 г/л и скорости протока 2,0 мл/мин, достк.ла 95,9±2,Ъ'И.

Таким образом, проведенные исследования позволили разработать принципиальная схему установки по локальной очистке стоков от акрилонитрила, акрилаыида и акриловой кислоты с использованием иммобилизованных на синтетических волокнах типа "9И9" клеток ламясв Srevibatteriua sp. 13ПЙ и Pseudoaonas psewdoalcalig^ftSs 5л.

защн

1. лсслодоваиа распространенность микроорганизмов, разрузав-акрила нитрид, акридамид, и акриловуи кислоту. Показано, что

бактерии, обладающие деструктивной активностью в отношении выйеу-йаланная соединений, достаточно аироко представлена в OKpyiasgdii среде и наиболее часто встречаптсд среди представителей родов BrevihacteriUK и Pseudcionas. Потенциальными источниками их выделения аогут быть почва и стдчныа зодн, содердаяие в своем составе или имяищие непосредственный контакт с исследуемыми субстратами.

2. Создана коллекция итааиов-деструкторов, касчитнваюцая 101 - культуру, в тоа числе 44 памма-деструвтора акрилонитрила я 57

бактерий, утилязируадих акрилашд.

3. Селектированы три эглаиа батерий Ppeudoaonac alcaligeries 5r, Pssudoaonas ps^udoalcaligenes 8n, Brevibacteriua sp. i3iIHt (Авторский свидетельства Я 1752407 от 15.10.1991 г., Я 1752727 от 08.041992 г.), превкзаицие по деструктивной активнисти зарубежные аналоги. Одян из еелектярсваннак зтаммов, Breuibacteriai sp. 13ИЙ, способен з, подобранных экспериментальным путем,, оптимальных условиях (температура 25-30°С, рй 8-8, концентрация субстрата 5-10 г/л, ¡¡кксабная нагрузка 1,34 г/л по сухамц несу, ограниченна;; аэрация в пиоцвссе трансформации акриламьда, усиленная аэоа-иия при утилизации акриловой кислоты) полностью разругать 5.0 г/л акриламиха за 30 часов.

4. Остановлено. что процесс деструкции акрилонитрила и акрн-

лавидэ с участие« селектированных итамиов лрсчогут последовательно. через образование акриловой и молочной кислот. Конечным продуктов дестрцкчии акьклояитрила и акрилаизда я«лгзтся гкдратиро-панный бикарбонат амкония.

5. Установлено, что признак деструкции акрилонитрила и акри-ламкда является стабильным.

С. Разработана методика иммобилизации культур-деструкторов акрилонитрила, акрилакида к акриловой кислоты на синтетическую волокнистую насадку гкпа "ВИЗ".

?. Впервые преклогеиа принципиальная схека к разработан лабораторный регламент на процесс локальной очистки сточных нсд опытного производства акриламида к голиакрилакиде.

- 22 -

список рйвот, ошшпиксвашж ПО ТЕМЕ диссертаций

1. Скрининг атаяаов-дчструкторов акрилогой кислоты и ер производных// биотехнология.- 1991,- H 8.- С. 79-63 (в соавторстве с C.B. Козуликка, П.К. Кулаковой, C.II. Ворониным).

2. Се^кция йтаииов-деструкторсв нитрилов и анидоп карбоно-ввх кислот// Всессйз. кон®. Новые направления биотехнологии Clly-чино, 2-4 октября )990 г.): Тез. докл.- Пучино, 1?Э0.- С. 52-53 (б соавторстве с С.Б. Козулиныа. С.П. Воронина*).

3." 'Аикробная очистка сточннх вод производства акрилаиида и полиакриламида// Всесояз. синпоз. Микробиология охраны биосферы в регионах Нрала и Северного Прикаслия {Оренбург, 14-1S октября 1331 г.): Тез. докл.- Оренбург, 13SL- С. 79-80 (s соавторстве с С.П. Ворониным, il.К. Куликовой).

4. Тис approaches to the solution of the ecological probleas which take place during the process of acrylaside production// Foriis for applied biotechnology(Belgiua. 25-2? September 1991 y.): Abstracts.- University of &ent, Belgium, 1991.- P. 23 (coauthors S.P. iJoronin, S.U. Kozulin. M.K. Sinolitsky, a.S. Vanenko).

5. Авторское свидетельство 1752727 fil СССР, üKH 5 С02 F 3/34. Итани бактерий ßrevibacteriua sp., используемый для очистки сточных вод от акрилаиида и акриловой кислота (соавторы - 5.Р.. Зендеров, .Ü.K. Куликова, А.Б. Полянский.

6. Авторское свидетельство 1712407 fil СССР, ИКЙ 5 С12 К 1/20, CÍ2 S 13/00. IfdHK бактерий Pseudomonas pseudoalnaligenes, используема?, для.очистки сточных вод от нитрила акриловой кислот« (соавторы - C.B. Козулин. Я.К. Куликова, С.П. Вороник, А.5. Полянский, Л.Я. Зороиьева).

7. Авторское свидетельство 1731814 fil СССР, Ш 5 Cl2 Я 3/73, С12 Р 13/02. !тамм бактерий Kiindococcus rheàochrous - продуцент нитрилгидратазыЛ соавторы - fi.С. Зкенко, Я.К. Полякова, O.S. Йстаурова, В.Н. Пауков, С.8. Козулин. М.К. Синолицкий, С.П. Зароним, В.Г-. Дийа-бос).

8. Полон*,тельное ревбиие на выдачу пагента ¡¡о заявке 4Q444C0/Í3 (048/57) от H.Ö8.91. Ркатехнологический спссас получения акрилаиида (соавторы- - 'й.Г. Добабиз, С.fi. Воронин. С.8. Косу.'тиа и др.