Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологический аспект применения гемосорбции при грамоотрицательном сепсисе

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологический аспект применения гемосорбции при грамоотрицательном сепсисе"



%

«И

уУ

«с.

Министерство здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации Челябинский Государственный медицинский институт

и« ям

¿¿и 1Н'

<- Наумкина Елена Витальевна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТ ПРИМЕНЕНИЯ ГЕМОСОРБЦИИ ПРИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОМ СЕПСИСЕ.

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук.

ЧЕЛЯБИНСК-1995

Работа выполнена на кафедре микробиологии, в ЦНИЛ Омской Государственной медицинской академии.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор медицинских наук

А.А. ОБГОЛЬЦ НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: доктор медицинских наук

научный сотрудник Б.А ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук

О.В. БУХАРИН доктор медицинских наук З.Н. КОНДРАШОВА

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Защита состоится "//■у1995 г . в часов на заседании Совета Д.084.04.02 при Челябинском Государственном медицинском институте по адресу 454092, г.Челябинск, ул.Воровского.64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинского государственного медицинского института.

Автореферат разослан " //

Ученый секретарь Совета доктор медицинских наук, профессор

ЗУРОЧКА А.В.

, профессор

, старший .РЕЙС , профессор

, профессор

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В последние годы среди основных возбудителей ишсыса все заметь нтпяп^гг тяо.чогячееггпя рот. грг."стр"ца тельных микроорганизмов. И несмотря на широкое внедрение в клиническую практику новых антибиотиков проблема лечения сепсиса, вызванного этими возбудителями, продолжает оставаться актуальной ( Е.Н. Левина,1985, WHO Drug Inf.,1990, Martin e.a., 1992). Это побуждает к поиску новых, более эффективных методов лечения этого заболевания. Патогенетически оправданным при сепсисе является включение в комплекс лечебных мероприятий эфферентный методов детоксикации, одним из которых является гемосорбция. Рациональность применения этого метода при данной патологии на вызывает сомнений и констатируется многими авторами ( П.Г.Яншек с соавт.,1987, И.И.Неймарк, А.П.Калинин,1990 и др.), однако, клиническая эффективность сорбционных методов детоксикации при сепсисе до настоящего времени не получила должного теоретического обоснования. В частности, недостаточно изучен микробиологический аспект этой проблемы. Хотя "этиоспецифическое" действие является одной из важнейших составляющих лечебного эффекта гемосорбции при генерализованной инфекции, до сих пор нет исчерпывающих данных о сравнительной эффективности сорбции возбудителей и их токсических продуктон различными сорбентами; нуждаются в уточнении механизмы взаимодействия микробных клеток с активированными углями; практически нет данных о характере воздействия сорбентов на вирулентность возбудителей. Немногочисленные сообщения о результатах экспериментальных исследований поглотительной способности

различных сорбирующих материалов в отношении микробных агентов (П.Г.Мадонов, Я.Н.Романова, 1987, М.Е.Шор-Чудновский с соавт.,1988, Н.Н.Прутовых с соавт.,1988, А.В.Григорьев с соавт., 1988,1991) касаются, как правило, ограниченного круга сорбентов, а различие применяемых методик делает результаты несопоставимыми. 'Это затрудняет рациональный выбор адекватного по физико-химическим параметрам сорбента в каждом конкретном случае в зависимости от вида возбудителя и характера течения заболевания. Все это предопределило целесообразноссгь настоящего исследования.

Цель работы. Оценка эффективности элиминации бактерий и их токсинов из крови различными гемосорбентами и определение характера их воздействия на вирулентные свойства грамотрицательных возбудителей сепсиса в эксперименте.

Задачи исследования.

1. Изучить сорбционную эффективность различных гемосорбентов относительно возбудителей грамотрицательного сепсиса ( Esherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa), а также липо-полисахарида (ЛПС) и экзополнсахарида слизи P.aeruginosa.

2. Оценить эффективность экспериментальных образцов гемосорбента ВНИИТУ с различной степенью окисленности при сорбции цельных микробных клеток, а также ЛПС и экзополнсахарида слизи P.aeruginosa.

3. Определить характер влияния сорбирующих материалов на биологические свойства возбудителей, обусловливающие их вирулентность (гидрофобные, адгезивные свойства; чувтвигсльность к бактерицидному действию нормальной сыворотки и цельной крови; чувствительность к антибиотикам.

4. На оснований полученных результатов разработать рекомендации по рациональному выбору и использованию сорбентов при грамотрица-тельной инфекции.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые дана

комплексная оценка широкому кругу применяемых в настоящее время в клинической практике сорбентов по эффективности элиминации из крови наиболее распространенных грамотрнцательных возбудителей сепсиса и их токсических продуктов; проанализированы механизмы адгезии микроорганизмов на углеродных сорбентах, исследован характер изменений поверхностных характеристик и связанных с ними вирулентных свойств возбудителей н результате взаимодействия с сорбирующими материалами; получены модифицированные образцы гемосорбента ВНИИТУ с различной степенью окисленносги и доказана экспериментально их большая эффективность по сравнению с исходной неокисленной формой по отношению к возбудителям и их токсическим продуктам; даны рекомендации по оптимизации применения сорбентов в зависимости от этиологии сепсиса.

Практическая ценность работы и внедрение результатов исследования в практику.

Практическое значение имеют как данные о сорбциошюй эффективности широкого круга применяемых в настоящее время гемо-сорбентов в отношении наиболее распространенных грамотрнцательных возбудителей сепсиса и их токсических продуктов, так и результаты изучения изменчивости возбудителей под влиянием углеродных сорбирующих материалов, свидетельствующие о снижении их вирулентности и изменении антибиотикочувствителыюсти. По результатам работы составлено Информационное письмо , предназначенное для врачей хирургических и реанимационных отделений, отделений сорбционных методов терапии, в котором содержатся рекомендации по рациональному выбору сорбента в зависимости от вида этиологического агента и характера течения заболевания; оптимизации антибиотикотерапии с учетом характера влияния сорбентов на чувствительность возбудителей к отдельным антибиотикам.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Международном симпозиуме 'Эндогенные интоксикации" (Санкт-Петербург, 14-16 июня, 1994), на семинаре в Институте катализа Сибирского отделения РАМН (1994)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы. Работа изложена на 178 страницах, содержит 40 таблиц и 29 рисунков. Объем цитируемой литературы включает 265 наименований, в том числе 169 отечественных и 96 иностранных авторов.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Большинство применяемых в настоящее время в клинической практике углеродных гемосорбентов, будучи высокоэффективными в отношении молекулярных токсических продуктов грамотрицательных возбудителей сепсиса (ЛПС и экзополисахарида слизи Р.аепцрпоБа), проявляют относительно невысокую поглотительную способность но отношению к цельным микробным клеткам.

2. Сорбенты различных типов обладают неодинаковой сорбционной активностью в отношении отдельных видов микроорганизмов. Преимущественная сорбция того или иного возбудителя определяется как физико-химическими характеристиками сорбента, так и различиями в строении поверхностных слоев бактериальных клеток. Лучше сорбируются клетки К.рпеитошае и Р.аешёдпоБа, что объясняется наличием поверхностных капсулоподобных структур полисахаридной природы, обеспечивающих более тесный контакт с поверхностью сорбента и принимающих участие в образовании точечных связей с функционально-активными группировками активных углей.

3. Наиболее выраженное влияние на эффективность сорбции микроор-

ганизмов оказывают величина внешней геометрической поверхности сорбента, а также показатели, характеризующие окисленность - величина электродного потенциала и количество поверхностных функционально-актнвных группировок. Увеличение степени окисленности сорбента позволяет повысить его поглотительную способность как по отношению к цельным микробным клеткам, так и к их молекулярным

Т^ТСНЧ^ПГЯУ пт^птппггя и

4. В результате воздействия гемосорбентов происходит качественное изменение оставшейся в крови части популяции возбудителя, выражающееся в некотором снижении суммарной вирулентности, о чем свидетельствует уменьшение гидрофобносги, снижение способности бактерий к адгезии и увеличение чувствительности к гуморальным и клеточным факторам неспецнфической защиты. Влияние сорбентов на антибиотикочув-ствительность возбудителей неоднонаправлено, результатом взаимодействия бактерий с угольной поверхностью может быть как увеличение, так и снижение чувствительности их к антибактериальным препаратам.

В основе этих изменений может лежать как повреждение поверхностных структур микроорганизмов при контакте с сорбирующими материалами, так и отбор, преимущественная сорбция особей, обладающих комплексом вирулентных свойств.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа основана на результатах 596 стендовых опытов по изучению сорбции микроорганизмов из физиологического раствора, экспериментальных исследованиях на 37 собаках по изучению сорбции микроорганизмов из крови (302 опыта); 80 опытов по изучению сорбции токсических продуктов Р.аетлшоБа (ЛПС и экзополисахарида слизи) из физиологического раствора и крови и 324 опытов по изучению влияния угле-

родных сорбентов на биологические свойства возбудителей (гидрофобные, адгезивные свойства, чувствительность к бактерицидному действию нормальной сыворотки и цельной крови, чувствительность к антибиотикам). Эксперименты на животных проводили в соответствии с приказом МЗ СССР № 755 об обеспечении принципов гуманного обращения с ними.

В качестве тест-культур использовали клинические штаммы E.coli 2135, 2207, 2174; K.pneumoniae 1934,1981,1072; P.aeruginosa 1073, 1074,1012, выделенные из крови септических больных.

Препарат ЛПС получали горячей водно-фенольной экстракцией по Westphal, антиген поверхностной слизи был получен по методике Alms и Bass в модификации А.Д. Александрова с соавт. (1988) из штамма P.aeruginosa 1012.

Для изучения брали сорбенты с различными характеристиками: активированные угли на основе природного растительного сырья ИГИ, БАУ, КАУ, СКТ-бА; активированные угли на основе сополимеров СКН,

СУГС, ГСУ; сорбенты на основе пироуглерода СУМ.С-1 иВНИИТУ-1, а »

также волокнистый углеродный сорбент УВА и синтетический слабокислотный катионит КБС-М. Кроме того, были использованы экспериментальные образцы гемосорбента ВНИИТУ различной степени окисленности.

Для исследования сорбции микроорганизмов из физиологического раствора в асептических условиях проводили перфузию взвеси бактерий концентрацией 5 • 10 3 мк/мл через микроколонки объемом 5 см 3 при помощи аппарата УНИРОЛ-01 со скоростью 15 мл/мин при соотношении взвесь:сорбенг 10:1.

Для изучения сорбции микроорганизмов из крови собаке под нембута-ловым наркозом (Sol. Proraedoli 2%-1 мл, нембутал -15 мг/кг) внут-риартериальио вводили взвесь микроорганизмов, содержащую 10 9 мк/мл из расчета 1 мл на кг веса. Через 1 час производили крово-

пускание, кровь исследовали в стендовых опытах по вышеприведенной методике.

Аналогично изучали сорбцию ЛГ1С и экзополисахарида слизи Р.аегирпояа. Для количественного определения Л ПС использовали биологическую пробу, основанную на способности эндотоксина вызывать местную воспалительную реакцию у интактных кроликов на месте внутрикожпого впедеппгг. '->кзополисахзрнд слизи определяли и реакции ВИЭФ со специфической преципитирующей сывороткой.

Адгезивные свойства микроорганизмов после контакта с сорбентами изучали по методике В.И.Брилис с соайт.(1986), используя развернутый метод, рекомендованный авторами для изучения влияния различных факторов на процесс адгезии. Влияние сорбентов на адгезивность микроорганизмов рассчитывали в процентах к показателям контрольного опыта.

Гидрофобные свойства оценивали по тесту солевой агрегации (ЬшёасЫ,1981).

Серорезисгентаость микроорганизмов определяли по методу Р^ЬеБ, основой которого является совместное выдерживание при 37 ° С мерных объемов бактерий и сыворотки с последующими высевами через 1, 2 и 3 часа на плотную питательную среду и подсчетом колоний. Устойчивость бактерий к действию цельной крови изучали видоизмененным методом, предложенным для изучения завершенности фагоцитоза с целью оценки состояния неспецифической резистентности организма (Л.М.Захарян, 1985).

Устойчивость к антибиотикам определяли методом разведений н пленной питательной среде.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Эффективность гемосорбентов при сорбции цельных бактериальных клеток и продуктов их распада.

1.1 Сорбция цельных бактериальных клеток.

Результаты исследования показали, что гемосорбенты обладают относительно невысокой сорбционной эффективностью в отношении изученных нами микроорганизмов. Исключение составил лишь волокнистый сорбент УВА, показатели сорбции которого для всех трех возбудителей близки к 100 %, что, вероятно, объясняется высокой внешней геометрической поверхностью этого сорбента. Однако, это имеет лишь теоретическое значение в плане перспективности волокнистых материалов для создания гемосорбенгов, поскольку использованный нами УВА из-за малой механической прочности непригоден для гемосорбции. Показатели же остальных сорбентов существенно ниже.

Так, при сорбции из физиологического раствора средний показатель для E.coli по всем сорбентам составил 27,1 ±2,2 %; для K.pneumoniae - 33,8 ± 1,8 %; для P.aeruginosa - 42,0 ± 6,1 %. Показатели сорбции из крови были несколько выше - 41,7 ± 3,8 %, 47,7 ± 1,8 % и 43,7 ± 4,2 % для Rcoli, K.pneumoniae и P.aeruginosa соответственно. Это объясняется, по-видимому, созданием дополнительной пористости в процессе тромбообразования на поверхности угля, а также задержкой форменных элементов крови, имеющих микроорганизмы, адсорбированные на поверхности или подвергнувшиеся незавершенному фагоцитозу.

Данные по сравнительной эффективности отдельных сорбентов в отношении изучаемых микроорганизмов представлены в табл. 1.

Как видно, различия между сорбирующими материалами по удалению отдельных видов бактерии из физиологического раствора и крови достаточно существенны. Преимущественная сорбция различных возбудителей тента или иными сорбентами объясняется, по-видимому, с одной стороны, физико-химическими характеристиками сорбирующих материалов, с другой стороны, различиями в строении и свойствах поверхностных слоев бактериальных клеток, что обусловливает преимущественное

Табл. 1 Эффективность сорбции грамотрицательных микроорганизмов различными гемосорбснтами.

Сорбенты Сорбция Е.соИ,% Сорбция К.рпентошае, % Сорбция Р.аеп^1поха,%

из физ. 1 из крови р-ра п = 5 п = 10 | р < 0,02 г»*- Л О* ( из физ. р-ра п= 10 п 1' из крови п = 5 р < 0,05 из физ. р-ра п= 10 ^ П II 1 у - из кропи п = 5 р < 0,02

1.КАУ 37,4 25,7 32,2 46,2 41,0 52,5

гиги 17,5 22,5 43,5 38,3 34,4 36,7

З.БАУ 18,5 35,0 27,4* 48,2 32,9 40,0

4.СКН-2К 26,8 53,6 41,9 42,0 37,9 44,5

5.СКН-4М 17,7 57,5 26,2 44,0 33,5 42,5

6.КБС-М 27,6 44,8 26,0 46,6 11,5 * 6,5** 44 Л

7.СКТ-6А агсу 27,7 26,0 34.7 48,3 23.2* •

30,4 56,5 30,7 53,9 64,7 47,4

9.СУГС 24,2 43,7 39,6 46,5 84,7 55,4 Г~5Г6 58.4

10.СУМС-1 32,8 50,0 35,7 60,5 58,0

П.ВНИИТУ 38,0 43,8 34,0 50,9 40,6

12.УВЛ 95,9 96,6 99,4 96,4 99,8 96,8

* - Р < 0,1 **-Р>0,1

действие определенных механизмов адгезии на различных этапах

взаимодействия.

Так, несколько более высокие показатели сорбции для К.рпеипюшае и Р.аеги^поха могут быть объяснены наличием у этих бактерий капсуло-подобных структур полисахаридной природы, что обеспечивает более тесный контакт с поверхностью гранул сорбента, а также образование большого количества мелкоточечных связей между поверхностными структурами бактериальных клеток и кислородсодержащими группировками углей. Бескапсулъные клетей Е.соН сорбируются несколько хуже, здесь адгезия, вероятно, осуществляется за счет неспецифических механизмов - сравнительно слабых сил межмолекулярного взаимодействия - Ван-дер-Ваальсовых сил.

1.2 Эффективность сорбции ЛПС и экзополисахарида слизи Р. aeruginosa.

Токсические продукты возбудителей, играющие немаловажную роль в патогенезе генерализованной грамотрицательной инфекции, сорбируются значительно лучше, чем цельные бактерии.

Так, средние показатели сорбции ЛПС из физиолохического раствора составили 80,9 ± 4,8 %; из крови - 89,0 ± 2,6 %. Для экзополисахарида слизи P.aeruginosa средняя эффективность сорбции из физиологического раствора и крови составила 90,9 ± 1,12 % и 95,4 ± 1,7 % соответственно.

По эффективности сорбции ЛПС сорбенты распределились следующим образом. На первом месте оказались УВА, СКТ-6А, ИГИ, СКН-2К; высокоэффективны также БАУ, СУГС и КБС-М; далее следуют ГСУ, СКН-4М, КАУ, ВНИИТУ и СУМС.

Экзополисахарид поверхностной слизи P.aeruginosa наиболее эффективно сорбируется УВА, БАУ, КБС-М и ИГИ, затем вдут СКН-2К, СКН-4М, СУГС, СУМС-1, СКТ-бА, КАУ, ГСУ и ВНИИТУ.

Таким образом, изученные нами сорбирующие материалы более эффективны для ликвидации токсемии микробного происхождения, чем для очищения кровяного русла от самих возбудителей. Наиболее оптимальное соотношение между сорбцией бактерий и ЛПС у сорбентов С.КН, СУГС и ГСУ. ИГИ, СКТ-6А, КБС-М и БАУ, эффективные в отношении ЛПС, обладают относительно невысокой поглотительной способностью в отношении микроорганизмов, а ВНИИТУ и СУМС. показатели которых для всех изученных возбудителей достаточно высоки, по сорбции молекулярных токсических продуктов оказываются на последнем месте.

2. Эффективность сорбции микроорганизмов и их токсических продуктов экспериментальными образцами гемосорбента ВНИИТУ.

2.1 Эффе.КШВНОСП. сорбции цельных микробных клокж. Взятые для работы лксиеримснгальные образцы I смосорпен I а ВНИИТУ харлк авизовались различной степенью окислеиности. Обрахц 1 представлял собой исходную неокисленнуго форму гемосорбента ВНШТГУ-1 Образцы 2-4 были окислены а кипой кислоюй; -окислены воздухомпри 4.55° С.

¡'¡лультшг; исследования показали, тго скислсиие сприентп п!-д;-г г уве:шчеиию показателей сорбции микроорганизмов, однако степень увеличения зависит от вида возбудителя(табл. 2) Табл.2 Эффективность сорбции 1рамотрицательных микроорганизмов экспериментальными образцами гемосорбента ВН ИНТУ.

№ Сорбция II.coli. Сорбция Сорбция

оордэца 1 (¿.pneumoniae, % ['.aeruginosa, %

п = 5

ИЗ фи 1. | из крови из физ. из крови из физ. из кропи

р-ра р < 0,02 р-ра р < 0,002 р-ра р < 0,01

р < 0,05 р < 0,01 ^ J? < 0,05

1.ИСХ 37,8 41,8 33,2 50,9 40,2 58,5

т 37,4 49,0 39,0 66,0 41,1 57,0

3. ...... " 39,0 ~ 49,1 39,4 69,0 41,X 64.2

4- 39,8 49,2 4S.4 62.3 4(),4 бХ.^

5. 39,0 44,4 45,3 72,4 31,6 59,7

6. 40,6 45,4 44,8 75,3 38,4 61.4

_ 5I.T 4!2 "Т.Гб ~~ 40, R ~ 70,0

о. ~ 43.8 48,6 ~ 89 0 ~ 77/) ^ ЯЛ 57, ■

Гак, для К.coli это увеличение незначительно, средний ноказа1ель сорбции для образцов 2-4 составил 38,7 + 0,7 %, для образцов 5-8 - 43,6 + 2.7 % по сравнению с 37,8 % у исходной неокисленной формы.

Наиболее выраженное повышение показателей сорбции окисленными образцами отмечается для K..pneumoniae - 41,3 i 2,7 % в среднем для образцов 2-4 и 56,3 ± 10.09 %для образцов 5-8 но сравнению с 33,2% у

неокисленного образца 1.

Для P.aeruginosa имеет место некоторое увеличение эффективное™ сорбции образцами 2-4 (средний показатель 43,1 ± 1,7 %); для образцов же, окисленных воздухом 5 и 6 отмечается незначительное снижение сорбционной активности, дальнейшее увеличение степени окислен-носги у образцов 7 и 8 ведет к повышению показателей сорбции (40,8 % и 51,4 % соответственно). Исходный показатель при этом был равен 40,6 %.

Таким образом, выраженность влияния физико-химических свойств углей, характеризующих степень их окисленносги, на сорбционную активность в отношении микроорганизмов зависит от вида возбудителя, а следовательно, от строения поверхностных структур, принимающих участие в процессе адгезии.

Корреляционный анализ показал, что повышение элиминационной способности образцов по отношению к микроорганизмам при сорбции из физиологического раствора коррелирует с увеличением количества кислородсодержащих группировок на поверхности угля и значения электродного потенциала. Степень тесноты этой связи, определяемая числовым значением коэффициента корреляции, зависит от вида возбудителя. Наименее выражена зависимость величины сорбции от степени окисленносги для E.coli. Для остальных возбудителей значения г выше и соответствуют высокой, или, в ряде случаев, заметной тесноте связи. Это согласуется со сделанными нами ранее выводами о значительной роли поверхностных капсульных структур K.pneumoniae и внеклеточной слизи P.aeruginosa в процессе адгезии на поверхности сорбентов.

Общая тенденция к увеличению элиминационной способности по отношению к бактериям у окисленных форм сорбентов сохраняется и при сорбции из крови. Так, для E.coii средний показатель сорбции окисленными азотной кислотой образцами составил 49,1 ± 0,1 %; окисленными

воздухом - 45,7 ± 1,0%по сравнению с41,8% у образца 1.

Эффективность сорбгши Р.аегг^тоза окисленными формами ВНЙИТУ составила 63,2 1 3,4 % и 62,2 ± 2,7 % для образцов 2-4 и 5-8 соответственно при исходном показателе 58,4 %.

Наиболее выраженные различия сорбциошюй активности отмечаклся для К.рпеитошае. Так, образцы 2-4 сорбируют из крови в среднем 65,8 ± ' '} ТлПТфС-"!.!' тг.т; - 5,4 ЧТ" «ичИ1«Ш| ипгишнлг,!

исходный показатель 50,9 %.

В целом элиминационная способность изученных образцов при сорбции из крови выше, чем при работе с физиологическим раствором, за исключением образцов 8 для К.рпеитошае и 7 в отношении Е.соН. Разница между показателями сорбции из крови и физиологического раствора более значительна для К.рпеитошае и Р-аеп^шова, чем для Е.соИ.

Наилучшими показателями для Е.соЦ обладают образцы 2-4, а также 8 из образцов, окисленных воздухом. К.рпеитошае наиболее активно сорбируется образцами 6,7 и 8, а в отношении Р.аеги^пова максимальную активность проявили образцы 4 и 7.

2.2 Эффективность сорбции Л ПС и экзополисахарида слизи Р.аегирпоха.

Окисление позволяет значительно повысить показатели сорбции Л1 К.'. Так, если неокисленный ВНИИТУ сорбирует лишь 75 % ЛПС, занимая последнее место среди изученных нами сорбирующих материалов я месте с. КАУ и С.УМС-1, то средние показатели сорбции ЛПС окисленными образцами составили 94,6 ± 0,6 % и 93,2 ± 1,3 % из физиологического раствора и крови соответстпенно, что находится на уровне наиболее эффективных в отношении ЛПС гемосорбептов.

Учитывая гот факт, что ВНИИТУ высокоэффективен в отношении цельных микроорганизмов, можно предположить более высокую эффективность применения окисленных его форм в клинике при грамотрицательной инфекции по сравнению с другими сорбентами.

Как и для ЛГГС, ,чля чкзонолисахарида сличи P.acruginosa отмечается некоторое увеличение показателей сорбции окисленными формами сорбента по сравнению с исходной. Средняя эффективность сорбции экчополисахаридз окисленными образцами из физиологического раеше составила 93,7 ± 1,7 %; из крови - 93,1 ± 1,9 % при исходном показателе образца 1-87,5 %.

Комплексная оценка сорбниоиной активности экспериментальных о( разцов по отношению к цельным микробным клеткам и их токсичесю продуктам показала, что оптимальным соотношением этих показател! обладают образцы 3 и 7.

Таким образом, получение окисленных форм гемосорбенгав существе но повышает их эяиминационную способность как в отношении клеточных форм микроорганизмов, так и в отношении молекулярных продуктов их распада. Степень влияния показателей окисленности сорбентов на величину сорбции возбудителей и характер связи зависят < вида микроорганизмов, что определяется различиями в строении поверхностных слоев бактериальных клеток. То есть, создание сорбеитс с заданными физико-химическими характеристиками позволяет добить определенной степени селективности к тому или иному возбудителю и. оптимального соотношения между сорбцией самих возбудителей и их токсинов.

3. Изменчивость вирулентных свойств грамотрицательных возбудим лей сепсиса в процессе воздействия углеродных i емосорбентон.

Микробиологический аспект лечебного эффекта гсмосорбции при сен тических состояниях не исчерпывается механическим очищением крови

циркулирующих в ней возбудителей и их токсинов. В процессе полден»

стан я углеродных гсмос-орбентов происходи г также качественное измеш ние популяции возбудителя, что может имен, определенное патогенетическое значение.

3.1 Гидрофобные свойства.

Выраженность влияния сорбентов на гидрофобные свойства возбудителей неодинакова у различных видов. Так, на гидрофобность E.coli большинство сорбентов не оказывают заметного влияния, показатель гидрофобности после контакта с поверхностью угля остается без изменений. Исключение составили лишь сорбенты растительного происхождения БАУ и КАУ, после контакта с которыми показатель молярности раствора сульфата г.:,:?,;";;;тт, лтт'мязтоп^п? arp^aumotidk геоий. увеличивается до 1,9 ± 0,8 М и 1,8 ± 0,8 М соответственно с 0,5 ± 0,07 М в контроле, что свидетельствует о снижении гидрофобности.

Гидрофобность поверхности P.aeruginosa при взаимодействии с углеродными сорбентами также уменьшается, о чем говорит увеличение показателя гидрофобности в среднем на 0,5 ± 0,06 М после контакта бактерий с углеродной поверхностью. Что касается сравнительной выраженности влияния сорбегггов на этот признак, то колебания показателей гидрофобности после контакта с отдельными видами сорбентов незначительны. Можно лишь отметить, что несколько более выражено действие на этот признак у сорбентов БАУ, СУГС и СУМС, наименее же активен СКН.

Более значительно изменяется гидрофобность К.рлешпохиае под действием изученных сорбентов. Гак, средний показатель гидрофобности бактерий, проконтактировавших с поверхностью угля, составил 1,7 ± 0,3 М по сравнению с 0.2 М в контроле, что говорит о соответствующем снижении гидрофобности. Несколько более выражены и различия в действии разных сорбентов на этот признак. На первом месте по влиянию на гидрофобность этого возбудителя оказался БАУ, далее следуют КАУ, ГСУ и ИГИ, действие же остальных сорбентов менее заметно.

3.2 Адгезивные свойства.

Величина индексов адгезивности (ИАМ) у котрольиых штаммов (до контакта с сорбентами) позволяет отнести их к категории высокоадге-

ЗИШ1ЫХ (по градации В.И.Брилис с соавт.,1986). После контакта с сорбентами величина этих показателей снижается в разной степени в зависимости от вида микроорганизмов. Для Е.соН в случае принятия исходного значения ИАМ за 100% средняя величина этого показателя после контакта с сорбентами составила лишь 72,3 ± 1,73 %. Для К.рпеипюшае изменение адгезивносги после контакта с сорбентами 60Л1 значительно, величина ИАМ, средняя после контакта с сорбентами, равна 59,5 ± 1,94 % от контроля. Заметно выражено также изменение адгезивносги Р.аега^поБа. Величина ИАМ у проконтактировавших с сорбентами штаммов составила 57,0 ± 3,0 % от контроля.

Максимальное изменение адгезивности всех изученных микроорганиз мов отмечается после контакта с сорбентами растительного происхождс пия БАУ и КАУ. Интенсивность влияния остальных сорбентов на этот признак несколько ниже и варьирует в зависимости от вида возбудителя

3.3 Чувствительность к антибактериальным препаратам.

Результаты исследования показали, что сорбирующие материалы оказывают неоднонаправленное действие на чувствительность микроорганизмов к антибиотикам. В ряде случаев МПК остается без изменений. Наиболее стабильной оказалась чувствительность бактерий фосфомицину.

Так, МПК этого антибиотика не меняется после контакта со всеми без исключения сорбентами для штамма Р.аегодпоБа 1012, а также для К.рпеигаошае 1072 и Е.соН 2174. Чувствительность остальных штаммов этому антибиотику меняется лишь в небольшом проценте случаев. Неизменной остается во всех случаях также МПК гентамицина для Р.аегирпоБа 1012; полимиксина для К.рпеипюшае 1981 ицефотаксш для К.рпеипюшае 1981 и 1072. В остальных случаях с той или иной частотой встречается изменение МПК в сторону уменьшения или повышения.

Наиболее выраженным действием на чувствительность грамотрица-

тельных бактерий к антибиотикам обладает сорбент КАУ. После контакта с ним лишь в 35,1 % случаев МП К остается без изменений, более чем в половине случаев отмечается увеличение чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам, и в 12,9% случаев - повышение МНК. Различия между остальными сорбентами но характеру влияния на шп признак незначительны. В 40,7 - 55,5 % случаев МПК не изменяется, в 31 5 - 3* 7 ПТиРЧЧГГГО гпи^рций II Т1 I I | . 22 2 "/я г,тлгоягп - ППИ1.Ш1Г1ШГ МПК антибиотиков.

Более детально направление изменения МПК отдельных ан тибиотиков под влиянием сорбирующих материалов дня каждого вида микроорганизмов характеризует табл.3

Табл.3 Влияние углеродных сорбентов на чувствительность грамотрицательных бактерий к антибиотикам.

Антибиотики Снижение МНК в 2-4 раза,% МПК без изменения 0/ /о Повышение МПК в 2-4 раза, %

В.соЦ К.рлси* тоЫае Р.аеги- Е.соН К .рлси* тошае Р.аеги-¿то&а Е.соН К.рпси-пюшае Р. ас ги-

1,Полимикиин 37,0 44,4 п,1 33,3 55,6 14,8 29,6 - 74,0

2,Гентамицин 33,3 40,7 40,7 51,9 40,7 59,3 14,8 22,2 -

З.Азлоциллии 11,1 29,6 44,4 59,3 33,3 55,6 29,6 37,0 -

4.Цсфтриагсон 62,9 44,4 66,6 14,8 55,6 33,4 22,2 - -

5.Фосфомицин 33,3 7,4 ' 25,9 66,7 92,6 66,7 - - 7,4

б.Цефотаксим 48,1 3,7 ^ 66,7 29,6 74,0 33,3 22,2 22,2 -

3.4 Чувствительность к бактерицидному действию нормальной сыворотки и цельной крови.

Выявлено, что для всех трех возбудителей имеют место достоверные различия чувствительности к бактерицидному действию нормальной сыворотки и цельной крови у проконтаютровавших'с сорбентами микроорганизмов по сравнению с контролем.

Так, для Е.соН через 3 часа инкубации с сывороткой количество жизнеспособных особей в группе микроорганизмов, конгактировавш сорбентами, снизилось до 13,1 ±6,1 %, тогда как в контроле этот по- . казатель был равен 78,6 ± 3,6 %.

Выраженное снижение зарегистрировано и при исследовании влиян цельной крови на жизнеспособность Е.соИ - через 3 часа инкубации в опытной группе осталось 33,03 ± 9,3 % жизнеспособных клеток по сра! нению с 81,8 ± 2,3 % в контроле.

Для проконтактировавших с сорбентами клеток К.рлеитошае кол чсство жизнеспособных бактерий через 3 часа инкубации с сыворопсо] цельной кровью составило 8,83 ± 1,96 % и 4,4 ± 2,1 % соответственно по сравнению с 32,05 ± 1,5 % и 43,1 ± 0,7 % в контроле.

Увеличивается и чувствительность Р.аего§шо$а к этим факторам: число жизнеспособных клеток через 3 часа инкубации в контроле бьи 23,05 ± 2,05 % и 31,15 ± 0,05 % ог исходного при инкубации с сывороткой и цельной кровью, тогда как в опытной группе эта показател! составили 5,18 ± 1,95 % и 19,5 ± 4,69 % соответственно.

Поскольку наличие и выраженность изученных нами признаков зав сят от строения и свойств поверхностных структур микроорганизмов более всего задействованных в процессе адгезии на поверхности ссор-бентов, выявленные нами изменения могут быть связаны с поврежден) ми этих структур в результате контакта с поверхностью углей.

Кроме того, не исключено, что определенную роль играет отбор, преимущественная сорбция особей, обладающих большей адгезивно-стыо, находящихся в экспоненциальной фазе роста, а следовательно бс метаболически активных.

ВЫВОДЫ.

1. Сорбционная эффективность большинства применяемых в настоящее время в клинической практике гемосорбептов в отношении наиболее рас пространенных грамотрицагельных возбудителей сепсиса (Е.со11, К..рПС1Ш10ШиС, ?.ПСП1£1ПОЗа} 0Т1ЮС1ГТСЛЫ10 ПСВСЛЦКа И 13 СрСДПСМ ПС всем изученным сорбентам не превышает 50% при однократной сорбции из крови, что в значительной мере объясняет более низкую эффективность применения гемосорбции при грамотрицателыюм сепсисе по сравнению со стафилококковым.

2. Показатели сорбции зависят с одной стороны, от физико-химических характеристик сорбента, таких, как величина внешней геометрической поверхности, количество кислородсодержащих группировок, значение электродного потенциала; с другой стороны, от особенностей строения поверхностных структур самих микроорганизмов, в частности, значительную роль играют капсульные полисахариды, что предопределяет более высокие показатели сорбции К.рпеипюшае и Р.аепщпоха по сравнению с бескапсульными клетками Е.соИ.

3.Сравнительный анализ сорбирующих материалов по их поглотительной способности в отношении микроорганизмов позволяет осуществить целенаправленный их выбор в зависимости от вида возбудителя. В целом сорбенты на основе сополимеров СКН, ГСУ, СУГС, а также активированные угли на основе пироуглерода СУМС И ВНИИТУ достаточно активны в отношении всех изученных возбудителей и могут быть выбраны для применения в случае неустановленного этиологического фактора или до получения результата бактериологического исследования крови.

4. Все изученные нами гемосорбенты проявляют высокую поглоти-

тельную способность по отношению к важнейшим токсическим продуктам возбудителей, в частности, эндотоксину (ЛПС) и экзополисахариду слизи Р.аеги^пока, удаляя из крови при однократн< перфузии 75-99% этих веществ. Это предопределяет высокую эффективность гемосорбции для ликвидации токсемии и антигенемии микробного происхождения.

5. Получение окисленных форм сорбентов позволяет существенно уве личить эффективность сорбции как клеточных форм микроорганизмов так и молекулярных токсических продуктов. Изученные нами экспериментальные образцы гемосорбента ВНИИТУ различной степе! окисленности обладают значительно большей сорбционной активное] в отношении всех трех взятых для изучения возбудителей, а также ЛПС экзополисахарида слизи Р.аеш^пова по сравнению с исходной формой ВНИИТУ-1.

6. Важной составляющей лечебного эффекта гемсорбции при грамотр цательном сепсисе является Качественное изменение популяции возбудо телей в ходе применения темосорбентов, выражающееся в снижении у. вирулентности. Уменьшение гидрофобности поверхности и показател адгезивности приводит к снижению суммарной способности возбудителей к закреплению в тканях макроорганизма, а следовательно, снижа вероятность образования вторичных метастатических очагов инфекцт Положительное значение имеет также увеличение чувствительности возбудителей к бактерицидному действию нормальной сыворотки и цельной крови, т.е. к гуморальным и клеточным факторам неспецифической защиты.

7. Неодпонаправленное влияние оказывает применение углеродные сорбентов на чувствительность бактерий к антибиотикам. В болы пин стве случаев этот показатель повышается, либо остается без изменений, что, безусловно, имеет положительное значение. Однако, в ряде случаев отмечается снижение антибиотикочувствительности возбудит

лей, 'по диктует необходимость контроля за этим показателем в ходе применения сорбирующих материалов с целью своевременной коррекции антибиотикотсрапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Выбор гемосорбигга при грамотринательном сепсиса следует осуществлять с учетом следующих данных: наиболее эффективными в отаошешш 11-CGli .тб.тпотсл сррбспга СКН <М. ГСУ, СКН-2К:

К.pneumoniae активнее всею сорбируется СУМС-1, ГСУ, ВНИИТУ-1; для P.aeruginosa следует отдавать предпочтение ВНИИТУ-1, С У ГС, СУМС-1 иКАУ.

2. В отношении токсических продуктов возбудителей все исследуемые сорбенты достаточно активны. Наиболее высокие показатели у углей СКН, ИГИ, СКТ-6А, БАУ, СУГС и КБС-М. Оптимальным соотношением показателей сорбции цельных микробных клеток и изученных нами токсических продуктов обладают сорбенты СК11-2К. СКН-4М, СУГСи ГСУ. Рациональным подходом может бьпъ последовательное использование сорбентов, эффективных в отношении цельных микроорганизмов и их токсических продуктов соответственно.

3. Следует учитывать возможность изменения антибиотикочувптш-тельности бактерий в результате контакта с сорбентами, по пом у необходимо осуществлять контроль за этим показателем в ходе применения гемосорбентов в комплексе с антибактериальными препаратами.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

I. Выбор гемосорбента на основе промышленных углей для лечения колибациллярното сепсиса II Клиническая микробиология: Сб. науч. ст./ Под ред. А.А.Обгольца. - Омск,1993. - С.36-40. (соавт. Б.А.Рейс, Л.И.Ктениди).

2. Сорбция грамогрицательной флоры углеродными сорбентами // Ю ническая микробиология: Сб. науч. ст./Под ред. А.А.Обгольца. -Омск,1993. - С.40-47. (соавт. А.А.Обгольц, Б.А.Рейс).

3. Сорбция грамотрицательной флоры окисленными формами г ем ос бента ВНИИТУ//Клиническая микробиология: Сб. науч. ст./Под ре; А.А.Обгольца. - Омск, 1993. - С.47-52. (соавт. Б.А.Реис. А.К.Чернышев)

4. Влияние углеродных сорбентов на биологические свойства грамот-рицательных микроорганизмов // Патог енез, клиника и терапия экстре мальных и терминальных состояний: Сб. науч. тр./ Под ред. акад. РАМ Л.В.Полуэктова и проф. В.Т.Долгих. - Омск, 1994. - С.50-54. (соавт. Б.А.Рейс, А.К.Черньппев).

5. Возбудители гнойно-септических процессов при сочегганной черепно-мозговой травме. Оценка эффективности сорбции микроорганизмо! углеродными сорбентами // Структурно-функциональные механизмы патологических и компенсаторно-приспособительных реакций./ Под ред. В.В.Семченко, В.А.Акулинина. - Омск, 1994. - С.63-66. (соавт. Т.Ф. колова, Б.А.Рейс).

6. Сорбция некоторых токсических продуктов синегнойпой палочк1 углеродными гемосорбентами //Эндогенные интоксикации: Тез. Междунар. симпозиума. - С.-Петербург, 1994. - С. 139. (соавт. А.А.Обгольц,/ В.П.Клишевич,Б.А.Рейс).