Бесплатный автореферат и диссертация по географии на тему

Методы определения активности внеклеточных эстераз и щелочной фосфатазы сестона и возможности их использования для оценки уровня евтрофирования и загрязнения пресноводных экосистем

ВАК РФ 11.00.07, Гидрология суши, водные ресурсы, гидрохимия

Автореферат диссертации по теме "Методы определения активности внеклеточных эстераз и щелочной фосфатазы сестона и возможности их использования для оценки уровня евтрофирования и загрязнения пресноводных экосистем"

КОМИТЕТ ПО ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИИ И МОНИТОРИНГУ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРШ ГИДРОХИМИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ПРВДЕША Людмила Михайловна

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЭСТЕРАЗ И К [ЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ СЕСТОНА И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ЕВТРОФИРОВАНИЯ И ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ

II.00.07 - гидрология сут, водные ресурсы, гидрохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Ростов-на-Дону 1992

Работа выполнена в Гидрохимическом институте Роскомгидромета

Научные руководители: - доктор биологических наук, старший

научный сотрудник Хоружая Т.Д.

-• кандидат химических наук, старший научный сотрудник Брызгало В.А.

Официальные оппоненты: - доктор химических наук, старший

научный сотрудник Страдомская А.Г.

- доктор биологических наук, профессор И!у галей B.C.

Ведущая организация - Институт гидробиологии АН Украины

Защита диссертации состоится п/Сп /о? 1992 г. в ¡0 часов на заседании специализированного совета Д 024.01.01 в Гидрохимическом института Роскомгидромета по адресу: 344104 г.Ростов-на-Дону, пр.Стачки, 198, зал заседаний. '

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гидрохи-мичесного института. •' •

Автореферат диссертации разослан "1С" /f 1992 г. Ученый секретарь специализированного

совета, кандидат химических наук Л.В.Бражникова

■'• ■ 0Нп1_^ :УЛ'РАК1Е!)"фТ1КА РАБОШ

: А^уальность теш. Загрязнрнкв природных вод является важнпй-1 проблемой, стоящей перед человечеством. Антропогенное воздей-)И9 на пресноводные экосистемы вызывает либо усиление процесса грофирования, дибо деградацию экосистем, вследствие токсического зекта. Структурной перестройке экосистем; предшествуют изменения метаболизма, связанного с изменением скорости круговорота шцес-í и знергии. Процессы превращения последних в водных объектах в 1чительной степени обеспечиваются внеклеточными фврмент-чм« я, з зтности, щелочной фосфатазой и эстеразаш. Эти ферме:!?!,' гяцгюлл-эт сложные органические соединения фосфора и углерода, обеппсчн-I их доступность .для планктонных организмов. Таким образом, ;>ко~ зточные эстеразы и щелочная фосфатаза осуществляют взаимосвязь 1ных организмов со средой обитания и могут быть показателем их шционирования. С другой стороны, ферментативные показатели, от-шющиеся быстрым откликом на неблагоприятные воздействия, по сразит со структурными характеристиками должны быть более информа-даыми для оценки состояния пресноводных экосистем.

До недавнего времени определению значимости ферментативных (азателйй для оценки загрязненности поверхностных вод не уделять достаточного внимания.

Существующие методы определения активности щелочной фосфатп-в воде имеют ряд недостатков. Одни из них требуют длительного эвэдения ферментативного гидролиза, другие - дефицитных флюоро-шых субстратов. Применение их в полевых условиях затруднено.

Активность внеклеточных эстераз в пресноводных экосистемах, змотря'на важную роль этих ферментов в метаболизме углерода, во-це не изучалась'. Методы определения активности эстераз в воде зутствуют. , ' ...

Цель и задачи. В связи с вышеизложенным целью настоящего ис-эдоватая явилась разработка экспрессных, достаточно простых, при-1ИМНХ1В полевых условиях методов определения активности внекле-шой щелочной фосфатазы и неспецифических эстераз састона и оцен-возмо.чсности их использования для характеристики уровня евттюфи-зания и загрязнения пресноводных экосистем.

Ставились следующие задачи:

-подобрать оптимальные условия проведения ферментативного тролиза 1-нафтилф0сфата щелочной фосфатаэой сестона, я

также реакции азосочетания продукта гидролиза I-нафтола о 2,5~ди-метокси-4-бензоиламинофенилдиазонием и на этой основе разработать полевой метод определения активности внеклеточной щелочной фосфа-тазы сестона, выбрать оптимальный вариант обработки пробы воды;

-подобрать оптимальные условия проведения реакции ферментативного гидролиза 1-нафтилацетата эстеразами сестона и на э^ой основе разработать применимый в полевых условиях метод определения активности внеклеточных эстераз сестона;

-исследовать влияние дефицита соединений отдельных биогенных элементов на динамику активности внеклеточных эстераз и щелочной фосфатазы в процессе роста монокультуры синезеленых водорослей в условиях лаборатории;

-провести многофакторные эксперименты с целью анализа комплексного влияния соединений азота и фосфора на активность внеклеточных форменгов монокультуры синезеленых водорослей;

-изучить активность щелочной фосфатазы и эстераз сестона в водных объектах разной трофности, а также в динамике "цветения" в евтрофном водоеме;

-в натурных условиях исследовать взаимосвязи активности внеклеточных эстераз и щелочной фосфатазы сестона с некоторыми гидрохимическими показателями качества вода, включая соединения биогенных элементов, растворенный кислород, легкоокисляемые органические вещества (по БПКд), бихромятную онисляемость, а также ряд загрязняющих веществ: нефтепродукты, фенолы,'тяжелые металлы;

-оценить возможность использования показателей .активности ще лочной фосфатазы и эстераз сестона для характеристики евтрофирова-ния и загрязнения поверхностных вод.

Научная новизна. Разработан экспрессный, простой в исполнении, половой метод определения активности щелочной фосфатазы сестона (а.с. 789712). !

Разработан экспрессный, простой в исполнении, применимый в полевых условиях метод определения активности эстераз сестона.

Изучена активность внеклеточных ферментов, участвующих в кр: говороте соединений важнейших биогенных элементов фосфора и утлё-рода в пресноводных экосистемах с различным уровнем трофности и з; грязнения. Впервые изучена активность внеклеточных эстераз в прес ноеодных экосистемах, исследованы её взаимосвязи с показателями развития фитопланктона, а также соединениями биогенных элементов, растроронным кислородом, органическими веществами, в том числе не> трпродуктами, фенолами, тяжелыми металлами.

Установлено, что изменения активности щелочной фосфатазц и зтераз сестона в процесса "цветения" в евтрофном водоеме харак-эризуются фазовостыэ. Впервые показано, что фазовый характер ди-змики активности ферментов связан с изменением скорости роста возрос лей.

Впервые установлено, что влияния соединений азота и фосфора 1 активность щелочной фосфатазы и эстераз взаимозависимы и долу-I рассматриваться в комплексе.

Разработана шкала оценки трофности пресноводных зкосист.м по »личине активности внеклеточных эстераз и щелочной фоо$а?язн со«тон->.

Поназано, что активность эстераз и щелочной фосфатазы сестон:' )еличиваотся при возрастании уровня загрязнения воды аммонпЯннм ютом, нитрнтным азотом, неорганическим фосфором, логноокисляемы-г органическими веществами (по БПК^), нефтепродуктами, фенолами. 1зрастание активности ферментов связано с интенсификацией метабо--1зма планктонных организмов под влиянием антропогенного воздей-'вия. Присутствие высоких концентраций тяжелых металлов в воде щ.п--|диг к угнетению активности ферментов.

Основные защищаете положения.

1. Методы определения активности внеклеточных эстераз и щечкой фосфатазы сестона, применимые в полевых условиях и облаца-[ив экспрессностью и простотой в исполнении.

2. Шкала по оценке трофности пресноводных экосистем по нг чине активности внеклеточных эстераз и щелочной фосфатазы сеетон;:.

3.. Рекомендации по оценке уровня загрязнения пресноводных осистем аммонийным азотом, нитритним азотом, фенолами, нефтгмгро-ктами и другими органическими веществами на основе анализа живности вненлеточных эстераз и.щелочной фосфатазы сестона.

Практическая значимость работы. Показатели активности ннеплечных эстераз и щелочной фосфатазы'сестона могут быть использов- — в оперативном и режимном мониторинге для оценки трофности под-х объектов при изучении антропогенного евтрофировпния, а так-^' я скрининга загрязненности поверхностных вод соединениями аас-и фосфора, фенолами, нефтепродуктами и другими органичоскет/и дествами.

Методы включо1Ш во "Временные методические уклзюгся по йио-цикации качества поворхновтвих вод" /Л.: Гкярпмтоизд-:?, 1 '<'.'/, горие внедрены п Казахском Тиромитл у, используются ял* X' г •■;>—

ЗТИКИ фуНКЦИОНП ЛЬНОГО состояния ПЛ-ЧНКТОН1ШХ i' т "'!"•.

>П!Т в водо ЗПГряЗ!П!П';г!;х веЯРСТВ. р'> ЯР'<б,УГ-1ШК'': !,•-■;•',::'! •"

ния активности щелочной фосфатазы и эстораз используются в Азовском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства для экспресс-диагностики пестицидной интоксикации ихтиофауны.

Материалы диссертации использованы при разработке рекомендаций по организации системы наблюдений за антропогенным евгрофирова-ниом, а также методических рекомендаций по оперативному выявлению и оценке глубины поражения пресноводных экосистем при антропогенной нагрузке.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе одно авторское свидетельство.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены но школе-семинаре "Фосфор в народном хозяйстве"(Звенигород, 1984 г.). Всесоюзной конференции "Биоиндикация и биотестирование природных вод" (Ростов-на-Дону, 1986 г.), на УШ Симпозиуме по проблемам качества воды (Таллинн, 1990 г.), на школе-семинаре "Математическое моделирование в проблемах рационального природопользования" (Новороссийск, 1992 г.), вошли в заключительные отчеты по теме НИР "Разработать новые и усовершенствовать существующие методы биологического контроля загрязнения поверхностных вод и донных отложений и на их основе оптимизировать систему биомониторинга качества поверхностных вод" (ГР №81042736), по заданию 02 Постановления ГКНТ М68 "Разработать теоретические основы' методов биоиндикации (био~ тестирования) качества природных вод и выдать рекомендации по их и пользованию в системе биологического контроля водных объектов" (ГТ № 01.850018352), по теме НИР У.28.27.2 "Изучить особенности функцк онирования отдельных сообществ водных организмов с учетом процессе планктонного и маярофитного евтрофирования на ряде водных объекты (ГР № 01910002854). '

Структура работы.Диссертация состоит из введения, 6-ти глав выводов, списка литературы и приложения. Диссертационная работа и: ложена на страницах машинописного текста, содержит 37 таблиц, 39 рисунков, общий объем с приложением страниц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении представлена аннотация к диссертации, показана актуальность темы, сформулированы цель и задачи работа, а также н учт-и положения, выносимые на защиту.

Р> пятой туапп дан оОзор литературы, касающейся внеклаточнь Г")*г"нтов гндробионтов: щелочной фосфатази и эстераз.

Внеклеточными считают ферменты, выделенные клетками организмов в OKpjOftaciiQTo среду без нарушений клеточных мембран в процессе их нормального роста и развития /Безбородов А.И..Астапович II.И,, 1984/. Внеклеточные ферменты могут либо оставаться связанными с клеткой, находясь на клеточных стенках или в периплазматическом пространстве между клеточной стенкой и мембраной, либо выделяться в окружай;сую среду.

Ферменты щелочная фосфатаза и эстеразы связаны с важнейшими метаболическими процессами в клетке, вследствие чего их активность может служить показателем интенсивности общего обмена веществ.

Внеклеточные эстеразы и щелочная фосфатаза играют важную роль в пресноводных экосистемах. Эстеразы участвуют в начальных стадиях деградации пестицидов /Остроумов С.A., I9ER /, щелочная фосфатаза -в минерализации фосфора /коЪох-i н. ,Така н.,197У /.

Основными факторами, влияющими на величину активности щелочной фосфатаэы, являются концентрации азота и фосфора, а также биомасса фИТО-, бактерио- И зоопланктона / Iluber A.b., Kidby D.K., 19134 /. Ряд авторов указывают на ниличие корреляционной зависимости между фо-сфатазной активностью в водэ и аммонийным азотом, нитратным азотом, неорганическим и органическим фосфором и биомассой фитопланктона /Хоминская Н.в. , 1984; Tagali., Kobori II., 19Ь0; Imber A.L., Kidby U.K., 1904 /. В других исследованиях этого не обнаруживают / Милиус А.и др., 1977; Агатова А.И. и др., 1985; oiason h., 19Ю< Davies A., Smith К., 19ÖC /.

Имеются немногочисленные сведения о влиянии загрязненности воды на величину активности' щелочной: фосфатаэы /Трифонова Ii.A., 1904; Ланц Г.Р. и др.,.1982/. .

Во второй главе описана разработка метода определения активности щелочной фосфат'азн сестона. В основу метода положена реакция ферментативного гидролиза I-нафтилфосфата с образованием I-нафтола, который количественно, связывают в реакции азосочетания с 2,5-димот-окси-4-бензоилашнофенйлдиаэонием (РР-соль).В результате реакции образуется окрашенное азосоодинение, которое растворяют в ацетоне, и окрашенный раствор фотомегрируют при длине волны 530 нм.

В-оРо.н, „ щелочная + Н,0 ъ—г--

фосфатаза

1-иафтплфосфат

о н ?еи,

Vci/j

X'.yrnon 2,-бо-по.-л-

?-.г.:'!!го Т^нги.'л::" :гсг гт: т

е-он

I-нафтол

Af !1"'ч T-if! i г'>лч

- 6 -о н »Щ

1 ii ' л_- , . +

'оси,

Азосоединение 4-(2,5-димегокси-4-бензоил-амино15енилазо)яафтол-1 ,

Определение активности щелочной фосфатазы состоит из двух этапов: ферментативного гидролиза 1-нафтилфосфата и реакции азосочетания продукта гидролиза 1-нафтола с РР-солью. На первом этапе были исследованы основные факторы, влияющие на скорость ферментативного гидролиза, включая р!1 и состав буфера, концентрацию субстрата, время проведения реакции.

Исследования проводили на взвеси сестона, полученной непосредственно из водного объекта фильтрованием 1-2-х литров воды через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и последующим ре-суспэндированием осадка 10-ю мл фильтрата. Выбранный вариант обработки пробы вода позволил сократить'время проведения ферментативного гидролиза.

При выбо^р оптимальных условий форментативного гидролиза 1-нафтилфосфата щелочной фосфа<азой сравнивали три буфера в щелочной зоне рН: гидрокарбонатный, глициновый и трис-НС1. Найдено, чтс наиболее высокая скорость ферментативного гидролиза наблюдалась в гидронарбонатном буфере при рН 10. (рис.1). Определена, концентрацш субстрата -1-нафтилфосфата, при которой скорость гидролиза максимальна. Она составляет 2,5 мг/мл 1-нафтилфосфата (рис.2). Дальнейшее увеличение концентрации 1-нафтилфосфата практически не влияло на скорость ферментативной реакции.

Проведенные исследования показали,, что зависимости скорости ферментативного гидролиза 1-нафтилфосфата от времени инкубирована в течение 4-х часов и объема внесенной взвеси сестона при выбран ных условиях носят линейный характер.

На втором этапе исследовали факторы, влияющие на реакцию , азосочетания, включая рН и состав буфера, концентрацию соли диа-зония и время проведения реакции. Показано* что высокая скорость реакции азосочетания 1-нафтола с 2,5-дшйтокси-4-бензоиламинофен1 'дтпонят наблюдалась в щелочной зоне рН с максимумом при рН II ¡6 (г-т.'З). При рН 10,0, оптимальном для гидролиза 1-нафтилфосфата, скорость реакции азосочетания была достаточно высока. Сравнение

0,6 0,3

8,0 9,0 10,0 рН Рис.1. Влияние состава и рН буферов на скорость гидролиза 1-нафтилфосфата щелочной фосфата-

зой сестона (- гидрокарбонат-

ннй буфер,---глициновый,

- - - - - трис-НС1 буфер)

2,5 5,0 10,0 Д-нафтилфосфат, мг/мл Рис.2 Зависимость скорости ферментативного гидролиза 1-нафтилфосфата от его концентрации (Е - экстинкции)

гидрокарбонатного, глицинового и аминометилпропандиолового буферов при рН 10 выявило, что наибольшая интенсивность окраски наблюдалась в глициновом буфере, а наименьшая - в гидрокарбонатном (рис.4). Однако, выбран гидрокарбонатный буфер, кок наиболее оптимальный для проведения ферментативного гидролиза Т-нафтилфосфяга, поскольку этот этап является лимитирующим. Установлено, что скорость реакции аэосочетания при таких условиях достаточно высока: полное связывание 5-15 мкг I-нафтола происходит в течение 1-ой минуты. При этом необходимо пятикратное превышение количества образовавшегося 1-няФ-тола солью диазония. Как показали.исследования, зависимость интенсивности окраски 4-(2,5-дшетокси-4-бензоилашноТ«нилязо)1юфтолп-1 от количества I-нафтола в пробе при выбранных условиях линейна б ■ интервале от I до 25 мкг 1-наф'тола. Воспроизводгиость способа определения концентрации 1-нафтола азосочетяниям с РР-солью не превышает 4%, показатель правильности составляет 0,4%.

Пропись метода, разработанного на основании проведенных исследований, состоит в следующем. Реакционную смесь, состоящую из 1-го мл взвеси сестона, 0,5 мл 0,3 моль/л гидрокарбоиатного буфера, рН 10 и 0,7 мл 0,35^-ного раствора 1-няфтилфосфата инкубируют 0,5 часа при 30°С. После инкубирования приливают 0,2 мл 0Д1о-иоп" раствора РР-солп, а через 3 минуты 0,4 мл раствора, содержащего ТО:? гидроокиси натрия и 60% глицерина, и 2 мл ацетокч. Получр"'"10 Р^от--воры фильтруют через бумажные фильтры и фотомотрируют при длтше полны 530 нм. Античность щелочной фосфатазн внрптгат л дамоль/ГО

Е

0.5 . 0,3

Е

0,5 0,3

4 8 12 рН

Рис.3. Влияние рН среда на скорость реакции азосочетания I-нафтола (Е - экстинкция)

Рис.4. Влияние состава буфера на интенсивность окраски раствора 4-(2,5-диметокси-4-бензоиламинофенилазо)нафтола-1 Щ - гидрокарбонатный буфер; 0 - глициновый; □ - амино-метилпоопандиоловый

образовавшегося при гидролизе 1-нафтилфосфата .в I л воды за I час. Воспроизводимость метода определения активности щелочной фосфатазы сестона составляет 11% (табл.1).

Таблица I

Воспроизводимость метода определения активности щелочной фосфатазы сестона

Этап ! Среднее из 'Среднее квад- ! Показатель

опреде- ,ратическое от- ! воспроизводимости

.. • лений, 'клонение , пиш^лоощии^«

! X, мкг ! мкг ! £ , %

без учета отбора и обработки пробы воды

с учетом отбора и обсаботки п пробы воды

Для остановки .реакции ферментативного гидролиза применен Ю^ный раствор гидроокиси натрия в 60^-ном растворе глицерина,

8,0 0,51 6,4

= 20 .

9,2 0,98 11,0

= 10

0,4 -

0,2

Е 0,6

0,3

т

8

9 1«

ис.5. Зависимость скорости ерментативного гидролиза -нафтилацетат от рН среды Е-экстинкция)

0,25 0,5 1,0

' I -нафтилацетат, мг/мл

Рис.6. Зависимость скорости ферментативного гидролиза 1-нафтил-ацотата эсторазаш от его концентрации (Е-экстинкция)

что позволяет прерывать процедуру анализа на этом этапе до 2-х суток при хранении проб в темноте.

При разработке полевого варианта метода ставилась задача упростить процедуру анализа. С этой целы) субстрат 1-нафтилфосфат наносили на хроматографическую бумагу или плотные бумажные фильтры, которые высушивали на воздуха. Растворы соли диазония и гидроокиси нат'рия в' глицерине приливали откалиброваиными капельницами. Это позволяет проводить анализ ферментативной активности непосредственно .на водном объекте, используя для инкубирования широкогорлкй термос.

Третья глава посвящена разработке Метода определения активности внеклеточных эстераз сестона. В основу метода положена реакция ферментативного гидролиза 1-нафтилфосфата эстеразами с образованием I-нафтола, который, как и в методе определения активности щелочной фосфатазн, количественно связывают в реакции азосочотания с РР-сольго. Окрашенный раствор фотометрируют при длине волны 460 нм.

^ н 0 эстеразы

+ СИ,СООН

1-нафтилацетат I-нафтол

При исследовании реакции ферментативного гидролиза 1-нлфтшг-ацетата эстеразами сестона установлено, что наиболее высокая скорость ферментативной реакции наблюдалась в интервале рН от 7,4 до 8,0 (рис.5) при концентрации субстрата 1-нафтилгцотята 0,25 мг/мл. Увеличении концентрации 1-наФтилацетята приводит к угнетению ак-

Е

тивности формонта. Найдено, что в трис-1101 буфере при рН 7,4 и концентрации субстрата 0,25 мг/мл зависимости скорости ферментативное гидролиза 1-нафтилацетата от времени инкубации в течение по крайней мере 4-х часов и объема внесенной взвеси сестона носят линейный характер. Исследование реакции азосочетания в трис-ШД буфере при рН 7,4 показало, что в этих условиях скорость реакции достаточно высока: для полного связывания 5-15 мкг 1-нафтола достаточно одной минуты при пятикратном превышении количества 1-нафтола солью диязония. Зависимость интенсивности окраски азосоединешя от концентрации 1-нафтола при выбранных условиях проведения реакции линейна.

Установлено, что воспроизводимость способа определения концентрации 1-нафтола путем•реакции азосочетания не превышает показатель правильности - 0,3%.

Пропись метода определения активности эстераз сестона на основании проведенных исследований состоит в следующем. Реакционную смесь, состоящую из 1-го мл взвоси сестона, 0,5 мл 0,1 моль/л трис 1Ю1 буфера, рН 7,4 и ОД мл 0,25^-ного раствора 1-нафтилацетата в этаноле инкубируют 0,5 часа при 30°С. Затем приливают 0,2 мл 0,1??-ного раствора РР-соли, а через 3 минуты 10^-ный раствор грихлорук-сусной кислоты в 60^-ном глицерине. Полученный осадок растворяют, прилипая 2 мл ацетона. Окрашенный раствор фильтруют через бумажни? фильтр и фотомэтрируют при длине волны 460 нм. Активность фермент? выражают в мкмоль 1-нафтола, образованного при гидролизе 1-нафтил-чцетата I л воды за I час. Воспроизводимость метода определения ад тивности эстераз сестона 12% (табл.2).

Таблица 2

Воспроизводимость метода определения, активности внеклеточных эстераз сестона

•з • 1 Этап ! ! Среднее из п определе-! ний х, мкг ! Среднее квад-ратическое от! клонение , мкг ! Показатель воспроизводи-1 мости Е , %

без учета отбора I! обработки пробы воды 10,5 п =,20 • 0,75 7,0

с учетом отбора и обработки пробы РОД'-! 7,3 п = 10 0,84 12,0

- н - .

Связь активности щелочной фосфатазы (АЩ1>) и эстераз (АЭ) с численностью водорослей и скоростью их роста в период "цветения" на Куйбышевском водохранилище

Период наблюдения

Г ЛЩФ 1 АЭ Т АЩФу АШЬу ? ЛЭу . АЭу _

Май 1985 г. 0,64 0,48 -0,37 -0,94х

Август 1984 г. 0,75х . 0,20 -0,68х -0,74х

Август 1985 г. 0,88х . 0,89х -0,69* -0,82х

Август 1986 г. ■ 0,38 0,23 -0,66я -0,91х

1984-1986.г.г.3® 0,64х 0,60х -0,66х -0,85х

* - значимые коэффициенты корреляции ( Р=0,95) ш - данные за все периоды наблюдений_

• Для.остановки реакции ферментативного гидролиза применен ра-!твор. трихлоруксусной кислоты в глицерине, что позволяет прерывать [роцедуру анализа на этом этапе до.2-х суток при хранении проб в •емноте.

В четвертой главе изложены результату исследований динамики iKTiiBHOCTii щелочной фосфатазы и эстераз сестона в процессе "цвете-гия" в Сусканском заливе Куйбышэвского водохранилищ. Рассмотрены :вязи активности ферментов с концентрация™ соединений азота и фо-фора и показателями развития фитопланктона.

Данные трехлетних наблюдений показали, что в целом активность i6o;tx ферментов увеличивалась при возрастании численности и бисмас-:ы фитопланктона. Между этими показателями обнаружена положительная корреляционная зависимость. Однако, в отдельные периоды рост числен-юсти водорослей опережал увеличение активности ферментов, и удель-|ая активность ферментов, рассчитанная на единицу численности фито-ланктона, уменьшалась с её ростом. Такие же результаты получены и | исследованиях Davioa л., smith i... Д988 г./. Наиболее значи-■ельные изменения активности щелочной фосфатазы и пстераз наблюда-

! Коэффициенты корреля- ! ,ции между активностью . •ферментов и численностью !водорослей !

! !

! !

Коэффициенты корреляции между относительным изменением удельной активности ферментов ( t Ay ) Ay 4t

и скоростью роста водорос лей )

лись при резких изменениях численности водорослей. Это позволило предположить о связи удельной активности ферментов со скоростью ро ста фитопланктона. Сравнение специфической скорости роста водорослей /Одум Ю., 1975/ с относительной скоростью изменения удел ной активности ферментов ( ^^ ) выявило обратную корреляционную зависимость медду этими показателями (табл.3). Таким образом, вели чина активности щелочной фосфатазы и эстераз сестона в воде завись от численности и соответственно биомассы фитопланктона, а также oi скорости роста водорослей.

Анализ связей между удельной активностью обоих ферментов п с единениями азота и фосфора показал следующее. Корреляционная завис мость между активностью ферментов и неорганическим фосфором не выявлена (табл.4). Связь между ферментативной активностью и аммонийным азотом, нитратным азотом и органическим фоофором была обнаружена, но не во все периоде наблюдений. Более того, корреляционная зависимость между активностью ферментов и концентрациями аммонийш го азота и нитратного азота подчас носила противоположную направлс ность. Регрессионный анализ подученных данных также не выявил зав] симостей между активность ферментов, показателями развития фитопланктона и концентрациями соединений азота и фосфора.

В пятой главе изложены результаты лабораторных исследований на монокультуре сннезелено.1 водоросли i;icrocyatie aeruginosa. • Водоросли вырастали на среде Фитццкеральда (Ф) и её модификациях с исключением фосфора р азота, а также с заменой минерального фосфора на органический.

В процессе роота культуры на разных вариантах среды Фитццже ральда обнаружена положительная корреляция между активность обоих ферментов и численностью водорослей, за исключением варианта с от сутствием в среде азота, где связь активности щелочной фосфатазы численностью водорослей была недостоверной. Это наводит на мысль важной роли азота в продуцировании этого фермента фитопланктоном. Сравнение относительных показателей скорости роста водорослей и изменения удельной активности ферментов показало следующее. Между показателями удельной активности щелочной фосфатазн и скорости ро та водорослей обнаружена обратная корреляционная зависимость, за исключением среда без фосфора, где удельная активность фермента увеличивалась в процессе роста культуры и не зависела от его скорости (табл.5). Это вполне объяснимо, поскольку отсутствие фосфог в среде является важнейшим фактором, стимулирующим синтез фосфатг /ha Comb R. в. et nil, 1979/. Напротив, достоверная отрицатель;

Таблица 4

Связь удельной активности щелочной фосфатазы (АЩФу) и эстераз (АЗу) сестона с концентрациями биогенных элементов в период "цветения" на Куйбышевском водохранилище

Период ! наблюдения ! ! Химические ингредиенты ! Коэффициенты I корреляции ! АЩ'!>у ! АУу

Май 1985 г. нитратный азот -0,79х -0,01

неорганический фосфор ' -0,15 -0,С6

органический фосфор 0,11 -0,75*

Август 1984 г. аммонийный азот 0,44 0,65я

нитратный азот 0,66* 0,62*

органический фосфор ОДО 0,31

Август 1985 г. аммонийный азот -0,75* -0,66*

нитратный азот 0,44 0,71*

неорганический фосфор 0,07 0,16

• органический фосфор 0,10 0,38

Август 1986 г. ' аммонийный -зз от 0,17 0,21

нитратный азот 0,15 0,13

неорганический фосфор 0,43 0,34

органический фосфор -0,20 -0,23

1984-1986 г.г.** аммонийный азот -0,43* -0,27

нитратный азот 0,63х 0,73*

неорганический фосфор -0,06 -0,14

органический фосфор 0,43х 0,24 '

* - значимые коэффициенты корреляции

351 - данные за все периоды наблюдений

Связь активности щелочной фосфатазы (АП№) и эстераз (АЭ) с численностью водорослей и скоростью их роста в модельном эксперименте

Состав среды

! Коэффициенты корре-

, ляции между актив-

• носгыо ферментов и

! численностью водо-. рослей

АШФ

АЭ

! Коэффициенты корреля-. ции между скоростью

изменения удельной ак ! тивности ферментов I (/Ау )

! рослей (•

и роста водо-

д н )

«и

лАШФу ИруТГ

!

ааэу лэу«4

Полная среда Ф 0,74я 1,00* -0,97* -0,39

Среда Ф с органическим фосфором 0,90*' 0,95* -0,63* -0,80*

Среда Ф без фосфора 0,99* 0,87* 0,07 -0,02

Среда Ф без азота 0,46 0,85* -0,71* -0,21

* - значимые коэффициенты корреляции Ф - среда Фитцджеральда

■

корреляция между показателями удельной активности.эстераз и скорости роста водорослей обнаружена лишь при выращивании культуры на среде, в которой минеральный фосфор был заменен органическим. На минораль-1 ных средах удельная активность эстераз увеличивалась в процессе рос- • та и не зависела от егб скорости. В этом случае, согласно существующим представлениям о механизмах регуляции.синтеза ферментов /Диксон М., Уэбб Э., 1982/, стимулирующим фактором является отсутствие в среде легко мэтаболизируемых органических соединений.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что факторы, влияющие на активность щелочной фосфатазы и эстераз взаимосвязаны. Преобладание того или иного фактора будет зависеть от конкретных условий среды.

На стадии отмирания культуры водорослей независимо от состава среды наблюдалось значительное возрастание активности обоих ферментов, что является предпосылкой возможности использования показателей удельной активности ферментов для прогноза сублетального состояния планктонных организмов.

Для изучения взаимного влияния соединений биогенных элементов

Регрессионные уравнения зависимости активности ферментов от содержания соединений азота и фосфора в среде

Время ! экспозиции ' Уравнения регрессии

У1 = 0,35 - 0,07 Х4 - 0,04Х3 - 0,04Х2 ь

I час о,озх3х4 + 0,05Х2Х3Х4 (I)

У2 = 2,31 - 0,13Х4 + 0,19Х2Х3Х4 (2)

25 часов Ух = 0,12 - 0,04X4 - 0,02X3 - 0,01Х? + 0,01х1х3х4 + о,озх?х3х4 - о,о2х1х2х3х4 У2 = 2,41.+ 0,22Х3 0,01Х2Х4 (3) (4)

У| - удельная активность щелочной фосфатазы, 10~9мкмоль/(кл.-ч)Р043~;

У2 - удельная активность зстораз, 10 мкмоль/(кл.-ч) I-нафтола;

X]- - концентрация неорганического фосфора, (+1) или (-1);

Х^ - концентрация органического фосфора, (+-1) или (-1);

Х3 - концентрация нитратного азота, (+1) или (-1);

Х4 - концентраций аммонийного азота, (+1) или (-1)

на активность ферментов проведен многофакторннй эксперимент /Максимов В.Н.,1980/. Активность ферментов определяли через I и 25 часов после вне'сения в культуру водорослей, соответствующих концентраций КАНР0*'ЗК»0. 1-глюкозо-6-фосфата, и А/о. На основании ра-

счетов по алгоритму ИеПтса получены регрессионные уравнения зависимости активности щелочной фосфатазн и эстараз от концентраций соединений азота и фосфора (табл.б). Уравнение (I) свидетельствует о наличии отрицательных линейных зфТюктов аммонийного азота, нитритного азота и органического фосфора на активность щелочной фосфатязы при экспозиции I час. Иными словами, с увеличением концентраций названных соединений удельная активность фермента"должна уменьшаться. Однако, присутствие в уравнении регрессии двойных и тройных эффектов свидетельствует о том, что направленность и сила воздействия каждого фактора в значительной степени будет зависеть от концентраций других. Это объясняет, почему в натурных условиях при сравнении активности формента с концентрацией какого-либо одного из названных соедин-'ннИ могут получиться разные, порой противоположные результат!,'. Прг^но-

Соотношение активности внеклеточных ферментов сестона и биомассы фитопланктона. Шкала трофности пресноводных экосистем

Биомасса фитопланктона, ! Преобладающий , тип водного объекта ! ! Активность , эстераз, •мкмоль/(л-ч) !1-нафтола ! Активность щелоч-, ной фоофатазы. , 1 мкмоль/и-ч) РО. ! *

<-1 олиготрофный <0,45 ¿0,20

1-4 мезотрофный 0,45-1,00 0,20-1,00

. 4-16 евтрофный 1,00-5,00 0,20-1,00

>16 гипертрофный >5,00 >1,00

ние полученных регрессионных уравнений позволило объяснить результаты исследований на Куйбышевском водохранилища.

В тестой главе представлены данные, позволяющие оценить возмоя ности использования величин активности щелочной фосфатазы и эстераз сестона для характеристики евтрофирования и загрязнения пресноводных экосистем.

Результаты натурных наблюдений и лабораторного эксперимент^ свидетельствуют о невозможности создания линейной математической модели, описывающей взаимосвязи активности ферментов сестона с биомассой фитопланнтона и концентрациями соединений биогенных элементов. I связи с этим нами были выбраны интервальные оценки биомассы фитошш ктона как одного из важнейших показателей трофности пресноводных эк( систем. На основании материалов комплексных исследований, проведенн! в течение 1984-1990 г.г; на 16-ти водных объектах, включающих озера Онежское, Чудско-Псковское, Большое Алма-Атинское, Имандра, Вадцай, водохранилища Куйбышевское, Бухтарминское, Капчагайское, Волгоградское, реки Дон, Северский Донец, Мертвый Донец, Волгу, Улъбу, Болып; Алма-Атинку, Тобол, разработана шкала оценки биомассы фитопланктона и соответственно трофности водных объектов по величине активности Э1 терэз и щелочной фосфатазы сестона (табл.7). Для оценки трофности пресноводных экосистем основным показателем является активность эст раз сестона, активность щелочной фосфатазы - дополнительным, увелич вавдим надежность оценки.

Анализ материалов комплексных исследований, проведенных на во

х объектах Курганской области с разним уровнем загряненности, вклю-я реки Тобол, Исеть, Канат, Поцслуйку, Черную, Каменку, Юргамыш, ера Орлово, Галкино, Мельничное и другие, а также р.Соворский Доц на участке в районе г. Лисичанска, позволили выявить взаимосвя-активности форментов сестона с некоторыми показателями качества ды.

Активность ферментов сестона на водных объектах Курганской об-сти изменялась в широком диапазоне величин. Интервал варьирования тивности щелочной фосфатазы составил 0,02-80,00 мкмоль/(л-ч) ,

тераз - 0,10-130,00 мкмоль/(л-ч) I-нафтола. Концентрации аммоний-го азота, нитритного азота, растворенного кислорода, легкоокисляо-х органических веществ (по ЕПКд) изменялись от величин ниже ЩК превышающих 1ЩК в 50 и более раз. Корреляционный анализ данных явил наличие достоверной положительной корреляции обоих ферментов аммонийным азотом и неорганическим фосфором и отрицательной - с створенным кислородом (табл.8). Корреляционная зависимость обняру-на также между активностью щелочной фосфатазы и ШКр. Связь между тивностью ферментов сестона и нефтепродуктами не найдена, по-види-му, вследствие не столь значительного диапазона наблюдавшихся кон-нтраций, по сравнению с аммонийным азотом и неорганическим фосфо-м. В .то же время полученные данные позволяют говорить о тендешцш еличения активности- обоих ферментов при возрастании концентраций фгепродуктов. '

* При анализе полученных данных было обнаружено, что п пробах с сокими, превышающими ШОК в ТОО и'более раз, концентрациями соеди-ний меди активность ферментов, как правило, значительно снижена, смотря на высокие концентрации аммонийного азота, неорганического сфора и БПК^. Исключение этих проб из общего массива донных сущест-нно увеличило коэффициенты корреляции между активностью ферментов концентрациями аммонийного азота, неорганического фосфора и раство-нного кислорода.

Для выяснения информативности ферментативных показателей в энке уровня загрязнения воды проведено ранжирование величин актип-зти ферментов сестона в соответствии с концентрат»дат аммонийного эта, нитритного азота и легкоокисляемых органических веществ (по К^) с учетом загрязнения тяжелыми металлами. Установлено 4 ранга, яичакгдихся по уровню загрязнения (табл.9). В каждом рант выделе-две ситуации: с относительно низкими, не нравнтаэдиш ПДК более, « в 50 раз, и с относительно высокими, превштакгщтми ПДК а 50 и бо-э раз. Результаты ранжирования, представленные п таблице 9, спкио-

Таблица 8

Коэффициенты корреляции между активностью ферментов сестона и гидрохимическими показателями качества воды (водоемы и водотоки Курганской области)

Используемые ! Показатели ! Химические ингредиенты

активности ; | I | ; 1 " 1 '

данные ^ ферментов ¡аммоний-¡нитрит- ¡ниттзат- |неотэга- | угто ' кпк ' п 'нефтепро-

■ный азот'ный азот'ный азот • тпвояиЯ • ! ! 2 !дукты

! ! ! ! !фосфор ! ! ! !

Весь массив ГАктивность г 0,52 ■ -0,02 -<5,09 0,33 1 0,08 0,29 -0,56 0,09 полученных щелочной

данных ¡фосфатазы Р<0,001 >0,05 >0,05 <0,05 >0,05 -¿0,05 <0,001 >0,05

л = 51 ¡Активность г 0Й1 ОМ -0,09 0^30 0,03 0 Д 9 -0,48 0^09 _^стераз Р<0,01 ?0,05 >0,05 <0,05 >0,05 >0,05 <0,001 л 0,05

То хэ без

сокими концентрациями тяжелых мета лов

п = 45

I

СЗ

(Активность • щелочной ,фосфатазы г 0,79 Р< 0,001 0,12 >0,05 ■ -0,09 > 0,05 0,63 <0,001 0,10 >0,05 0,29 0,05 -0,66 <0,001 0,09 >0,05

•Активность г 0,69 0,20 . -0,09 0,59 0,19 -0,59 0,07

:-эстераз Р<0,001 >0.05 >0,05 <0,001 >• 0,05 > 0,05 <0,001 >0,05

Условные обозначения: г - коэффициент корреляции; л - число парных наблюдений;

р - уровень значимости

. Активность ферментов сестона при разном уровне- загрязнения (водоемы и водотоки Курганской области)

Ранги

(Концентрация аммонийного (азота, нитратного азота или !ШКс: прввыше-ние ПДК одного !из ингредиентов

' Амиввооть 'активность

лых металлов ! эстераз, • (щелочной фосфа-•мнмоль/(л-ч),тазы,

I-нафтола ^мкмоль/(л-ч)РО^"

на превышает

низкий3®* 0.52-0.79*

и.кЬ—

высокий**** ОДО ■

_п = 2

0.02-0.38 U.lá

Л = 5 _ _ 0.05-0. ТО

ОТ "

п = 2

го

II

в I-IO раз

низкий

высокий

0.32-5.17 J., 4У

0.I0-I.95 U.KÍ)

п = 20 л = 20

_ 10^90-2,082^! _(а.52-0ж78)_ 0.10-0.83 0.05-0.26 U.3Í1 " U,i¿

п =11 п = II

(0,17-0,43) (0,08-0,16)

III

низкий

• в 10-50 раз

5.40-11.16 У.УН1-

п = 2

0.57-1.95 1.Ü&—

п = 2

высокий

0.I3-T.58

' и.У'?1

И = 3

0.03-0.27

и.уй

п = 3

1У

50 раз

низкий

высокий

ТЯЛ 0-130.00 bU/JU

0.Г1-Т.25 и = 3

9.0-75.40

w.v)—

_ Ü = _ „

аоз-г.зл s и.м—

п = 3

- в числителе дан интервал варьирования, в знаменателе • личина; ** - в скобках указан доверительный интотш^л

*** - концентрации металлов не превышает Щ[К более, чем в

тт - — п — превышают ПДК в 50 и более раз; п -число

• сродняя во-■> );

50 раз; ■ наблюдений

Коэффициенты корреляции между активностью ферментов сестона и гидрохимическими показателями на участке р.Северсного Донца

Показатели активности ферментов ! Химические ингредиенты (

! аммонийный . азот !нитритный азот 1 феноль

Общая активность щелочной фосфатазы 0,85 0,91* 0,45

Удельная активность щелочной фосфатаз фосфатазы в расчете на численность фитопланктона 0,61 0,53 0,7С

Удельная активность щелочной фосфатазы в расчете на численность бакгериоплаьктона 0,88* 0,94* о,<

Общая активность эстераз сестона 0,79 0,70 о,1«

Удельная активность эстераз в расчете на численность фитопланктона -0,08 -0,31 0.6

Удельная активность эстераз в расчете на численность баитериопланктояа 0,88* 0,81 о,

* - значимые коэффициенты корреляции (Р = 0,95, « = 5)

тельстззуит о том, что при относительно низких концентрациях тяжел1 металлов активность обоих ферментов в большинстве йлучаев возраст с увеличением загрязненности води. Высокие концентрации тяжелых № татлов угнетали активность ферментов сестона, и эта тенденция не : являлась. • . ' •";•.'"

. ■ В исследованиях,- проведенных на р.Севёрском Донце в районе : сичанска.также наблюдалось увеличение активности обоих ферментов ] створах, расположенных ниже сбросов промышленных предприятий, по I тению с фоновым (рис.7). Обнаружена положительная корреляция меж. активностью щелочной фосфатазы сестона и концентрациями нигритноп азота (габл.Ю). Коэффициенты корреляции между активностью эстера': и концентрациями аммонийного азота, нитритного азота и фенолов та! г-'о были высоки, от 0,70 до 0,79, Однако, вследствие малой выборки он:: бнлл недостоверны, и можно говорить лишь о тенденции взаимосв) 31! фг.'рмпктртишшх показателей с последними.

Уделы:,ая активность ферментов в расчете на численность как < тт>-, так и С'?.рт«гпо1шшктона также значительно возрастала на загр:

р.

Ау

8.0

4.0

11

I

АУ

0.06,

0,03

I

м

с.?. Активность ферментов сестона на участках р.Северского Донца с разной загрязненностью вода, -об^ал активность щелочной фосфатазы и эстераз сестона (А), мкмоль/(л-ч) Р0|~ или 1-нафтола соответ---нно; б - удельная активность щелочной фосфатазы и эстераз в расчете на единицу численности фито-(Ау), 1С~°шмоль/(кл.-ч) Р0|" или 1-нафтола соответственно; в - то же в расчете на единицу бактериопланктона, 10" мкмоль/(нл.-ч) Р0|* или 1-нафтола соответственно; □ -аелочная Щ -эстеразы; I - фоновый створ; 2 - ниже сбросов ?П0 "Краситель"; 3 - ниже сбросов заво-, левый берег; :4 - то же, правый берег; 5 - 4 км ниже г.Лисичанска

-ткгон т;нност:: ^тгаза; ".л ссод;

iiemiux участках, по сравнению'с фоновым (рис.7). Выявлена положительная корреляционная зависимость удолыюй активности обоих ферментов в расчете на численность бактериспланитона с концентрацией аммонийного азота. Удельная активность щелочной фосфатазы коррелировала также с ни-тритным азотом (табл.10). В то же время показатели развития бактерио-и фитопланктона на всем исследуемом участке изменялись незначительно. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при загрязнении воды активность ферментов сестона увеличивается,вследствие интенсификации метаболизма планктонного "сообщества, что согласуется с современными представлениями о реагировании пресноводных экосистем на антропогенное воздействие /Абакумов Б.А.,1986/.

В конце главы приводится экологическая интерпретация и рекомендации к практическому использованию результатов анализа активности внеклеточных эстераз и щелочной фосфатазы сестона. Для'оценки трофнос-ти водного объекта результаты анализа ферментативной активности сестона, полученный на участках, удаленных от источников загрязнения, сравнивают табличными величинами (табл.7). Основным показателем для оценки трофноста является активность эстераз.

Для скрининга загрязненности на водных объектах с известной тро-фностью величины активности эстераз и щелочной фосфатазы также сравнивают со шкалой трофности. Превышение величин активности ферментов табличных значений будет свидетельствовать о загрязненности данного участка водного объекта соединениями азота, фосфора, нефтепродуктом, фенолами к. .другими органическими веществами. Если активность ферментов будет меньше табличных величин для соответствующей-трофности* то возможно высокое_ загрязнение тяжелыми металлами, в случае неизвестной трофности водного объекта активность ферментов для оценки уровня загрязнения необходимо сравнивать о таковой на фоновом участке. Высокие величины активности ферментов, превышающие Г,б мнмоль/(л-ч ) Р0|~ для щелочной фосфатазы'и 5,0 мкмоль/(л-ч ) I-нафтола для эстераз, однозначно свидетельствуют о неблагополучном состоянии пресноводных экосистем: высоком уровне загрязнения или гипертрофности.

вьгеодо

I. Разработан фотометрический .метод определения активности внеклеточной щелочной фосфятазы сестона, основанный на реанции ферменга-тямкого гидролиза I-нафтилфосфата в гидрокарбонатном буфере при рН 10 к иосле.чую-асй роакции аооеочетания образовавшегося I-нафтола с 2,5-~,;г гокпп-1-бенэо1игш1ч>|ю1»У1Д}:.'13онрем. Реакцию фермпнтятипного гид-Г ocrrnnpjrrwiM? раствором гидроокиси натрия в глицерине, окра-1 и • тг:0(;о~л::;ч'нно растворяют доб.*-.ппонпсм ацотона.

. Взвесь сестона получают фильтрованием пробы вода через мембранный фильтр, с диаметром пор 0,45 мкм и последующим смыванием не-5ольшим объемов воды.

Метод экспрессе!?, применим в полевых условиях. Воспроизводи-юсть метода 11%.'

2. Разработан фотометрический метод определения активности ¡неклеточных эстераз сестона, основанный на реакции ферментативного 'идролиза I-нафтилацетата в трис-IICI буфере при рН 7,4 и последующей юакции азосочетания образовавшегося I-нафтола с 2,5-диметокси-4-бен-юиламинофенилдиазонием. Реакцию ферментативного гидролиза останяпли-)ают раствором трихлоруксусной кислоты в глицерине, окрашенное азосо-динение растворяют добавлением ацетона.

Метод прост, экспрессен, применим в полевых условиях. Воспроиз-юдимость метода 12%.

3. В модельных опытах показано, что активность щелочной фосфа-•азы, рассчитанная на одну клетку водорослей (удельная активность), ¡ависит от содержания в среде неорганического фосфора, аммонийного ;зота, нитратного азота, а также от скорости роста водорослей. При :ефиците фосфора в среде она не зависит-от скорости роста и увеличи-ается по мере развития культуры.

Удельная активность эстераз зависит от содержания в среде ам-юнийного азота, нитратного азота, органического фосфора и скорости оста водорослей и практически не связана с концентрацией неоргани-еского фосфора. В отсутствие легкометаболизируемнх органических везет удельная активность эстераз увеличивается по мере развития куль-уры и зависит от скорости её росга.'

При отмирании клеток водорослей в культуре удельная активность боих ферментов значительно, возрастает и не зависит от состава бпо-енных элементов в -{ультуралЬной среде'.

4. Па основании результатов многофакторного эксперимента рас-читаны регрессионные .уравнения, свидетельствующие о том, что влия-ия соединений азота и фосфора на активность щелочной фосфат,азы и стераз взаимозависимы.

5. В' натурных условиях показано, что активность эстераз и ще-очной фосфатазы сестона увеличивается при возрастании уровня заг-язнения вода аммонийным азотом, нитритным азотом, неорганическим осфором, легкоокисляемнми органическими веществами (по ГПК г,), но1ь епродуктами, фенолами. Присутствие высоких концентраций тятелях ме-аллов в воде приводит к угнетению активности обоих форментов. Условлен« корреляционные зависимости мопду активностью обоих Торь'оитсь

и концентрациями аммонийного азота, неорганического фосфора, (положить л-ьнач корреляция), растворенного кислорода (отрицательная корреляция) в широком диапазоне величин. Активность щелочной фосфатазы коррелировала также с нитритным азотом и BilKg. Коэффициенты корреляции между активностью ферментов и гидрохимическими показателями снижаются в присутствии высоких концентраций тяжелых металлов,вследствие их ингибирующего влияния на ферментативную активность.

6. Показано, что динамика активности щелочной фосфатазы и эс-тераз сестона в процессе "цветения" в евтрофном водоеме носит фазовый характер; связанный с изменением скорости роста фитопланктона.

7. Установлены соотношения величин активности ферментов сестона с биомассой фитопланктона и трофпостью водного объекта. Основным показателем трофности пресноводных экосистем является активность эстераз, активность щелочной фосфатазы - дополнительным, увеличивающим надежность оценки.

8. Выявлено, что показатели активности ферментов сестона более информативны, по сравнений! со структурными характеристикими планктонных сообществ, при оценке уровня загрязнения. Быстрый отклик ферментных систем на антропогенное воздействие связан с изменением интенсивности метаболизма гидробионтов.

9. Установлено, что- показатели активности внеклеточных эстераз и щелочной фосфатазы сестона информативны для характеристики антропогенного евтрофирования и скрининга загрязненности пресноводных экосистем и вдгут быть использованы в оперативном и реяшмном.мониторинге.

' Материалы диссертации опубликованы в следующих работах: Г. A.C. 709712*СССР, MKH3G0rAi2I/78. Способ определени активности щелочной фосфатазы./П.И.Короленко, Л.М.Предеина // Открытия. Изобретения. - 1980. - Ji47 - C.II8-II9

2. Короленко П.И;, Гвоздарев А.Ю., Пределна Л.М. К вопросу создания экспрссс-методов энзимоиндикации функционального состояния жизнедеятельности организмов природных популяций//Гидрохимические материалы.-Л:Гидроыетеоиздат,1Э81. - Т.82. - С.64-77.

3. Предекна JI.M., Брызгало В.А., Хоружая Т.А., Морозова Е.В. Внеклеточные ферменты сестона как показатель евтрофикации водоемов // Всесо-юз. кон'), по биоиндикации и биотестированию природных вод: Тез. докл., Ростоэ-на-Дону, 30сент.-4окт. 1986г. - Ростов-на-Дону, 1986. -С.134.

•1. Риоиндикация качества поверхностных вод. Временные методические зчияя.Серия I./10. Ф. Рожков. Т.Б.Ткаченко, Е.В.Морозова, Л.М.Предеина дг. - Л. :Гидромотоо1!Здат, 1987. - 62 с. F. Гол г. вк-клг точных ферментов планктонных сообществ в процессах ме-г-'ол!г-:.-1 роли,тс экосистем / Бркзггуло В.Л., Хоркая Т.А., Продррка Л.М

и др. // Методы бпоиндикацги и биотестирования природных вод. Вш.2.-Л.:Гидрометеоиздат, 1989. - С.85-108.

6. Преданна Л.М., Федорова Л.С. Активность ферментов сестона в бко-индикации качества природных вод // /III Симпозиум по проблема качества воды водоемов: Тез. докл., г.Таллинн, 23-25 окт. 1990 г. -Таллинн, 1990.-С. 69-72.

7. Брызгало В.А., Федорова Л.С., Морозова Б.В., Предеина Л.М. Оценка состояния пллннтонких сообществ водных экосистем по показателям

активности экзоферментов сестона // ПИ Симпозиум по проблемам качества воды водоемов: Тез.докл., г.Таллинн. 23-25 окт. 1990 г. -Таллинн, 1990. - С. 19-22.

Гидрохимически!! институт Подписайо к печати 4.11.92

г.

Зян.Я 09.

Тир. 100 экз.