Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методика и применение автоматизированной микроскопии лейкоцитов с количественной оценкой цитохимических реакций

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Методика и применение автоматизированной микроскопии лейкоцитов с количественной оценкой цитохимических реакций"

Т-Тл иллйоу т '^^УЦ^СИ --,

Парпара Анатолий Анатольевич

МЕТОДИКА И ПРИМЕНЕНИЕ АВТОМАТИЗИРОВАННОЙ МИКРОСКОПИИ ЛЕЙКОЦИТОВ С КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКОЙ ЦИТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

03.00.02 — биофизика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва — 2007

003058143

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель

кандидат физико-математических наук, доцент Пятницкий Алексей Михайлович

Официальные оппоненты

1 Доктор биологических наук, профессор Потапенко Александр Яковлевич

2 Доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Шмаров Дмитрий Александрович

Ведущая организация-

Федеральное государственное учреждение Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава

Защита диссертации состоится " 16 "_мая 2007 г в " 10" часов

на заседании диссертационного совета Д 208 057 01 при ФГУ «НИИ физико-химической медицины Росздрава» по адресу. 119992 Москва, ул М Пироговская, д 1а

С диссертацией можно ознакомиться в библи'4 ""ке ФГУ «НИИ физико-химической медицины Росздрава»

Автореферат разослан " 12 " апреля__2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических паук

М.А Мурина

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Цитометрия, го есть техника подсчета, измерения и сортировки клеточных частиц, занимает одно из важнейших месг в арсенале современных медицины и биологии, вюм числе гематологии Методы цито-метрии позволяют описывать клеточную популяцию с помощью объективно измеряемых количественных показателей, чем выгодно отлетаются от традиционной визуальной микроскопии, результаг которой сильно зависит от квалификации цитолога и его субъективных предпочтений [Медовый В С , 2005]

Наиболее широкое распространение получила проточная цитометрия (flow cytometry) благодаря высокой степени автоматизации, значшеиыюй скорости работы и санитарной безопасное ги для персонала Между тем, эта методика имеег ряд существенных ограничений, в частности, фиксированный набор измеряемых признаков, отсутствие возможности визуального контроля, высокую стоимость оборудования и расходных материалов [Козинец Г И , 2002]

Таким образом, развитие гехноло1 ии автоматического анализа крови повысило точность и воспроизводимость определения основных гематологических показателей, но не отменило исследований клеток крови методом световой микроскопии Микроскопические исследования выполняются в лабораториях, обслуживающих гематологические стационары, в большом объеме и сопровождаются значительным напряжением органов зрения и опорно-двигательного аппарата сотрудников Утомление, развивающееся в результате длительной монотонной работы является потенциальным источником ошибок

Поэтому метод видеоцитометрии (image cytometry), то есть цитометрии по микроскопическому изображению, всегда находил свою область применения Разработаны аппаратно-программные комплексы, позволяющие автоматически производить поиск на мазке, измерение и классификацию нормальных клеток крови, например, комплекс МЕКОС-Ц2 [Медовый В С , 2006] Видеоцитомет-рия также используется как средство объективной количественной оценки в гистологии и цитологии при различных методах окрашивания [Автандилов Г Г , 2006,LehrH А, 1997]

Тем не менее, для цитохимических методов, имеющих большое значение при диагностике острых лейкозов, методика количественной оценки отсутствует Между тем, сотрудники лабораторий, работающих в клиниках онкогема-гологического профиля, испытывают дополнигельное психо-эмоциональное напряжение, связанное с особой ответственностью врача-лаборанта, устанавливающего диагноз злокачественного заболевания, поскольку его лечение само по себе может вызывать летальные осложнения Успех терапии острого лейкоза в значительной мере определяется правильной диагностикой формы и варианта заболевания, в основе которой лежат морфология и цитохимия [По-горелов В М, 2006] Выраженная клинико-цитологическая гетерогенность острого лейкоза, использование при классифицировании конкретных случаев преимущественно неспецифических цитологических признаков, значение которых оценивается лишь в контексте всего спектра цитологических характеристик бластных клеток — делают диагностику острого лейкоза наиболее сложным разделом современной лабораторной гематологии Поэтому задача автоматизации и объективизации оценки цитологических параметров лейке-мических клеток представляется актуальной и важной

Исследование эстераз при остром лейкозе традиционно используется для подтверждения моноцитарной природы бластной популяции и диагностики М4 — М5 вариантов острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) Диагностическое использование а-нафтилацетатэстеразы (неспецифической эстеразы, НЭ) базируется на чувствительности этого фермента к ингибированию №Р в клетках моноцитарной линии [НауЬое Б , 1998] Объективизация результатов этой реакции особенно актуальна, поскольку наличие ингибирования часто весьма трудно определить на глаз Хотя количественная видеоцитометрическая оценка ряда других цитохимических реакций предпринималась [Славинский А А, 2000], для реакции на НЭ объективная методика предложена не была

Методика видеоцитометрии, пригодная к широкому практическому применению, должна быть хорошо воспроизводима и максимально автомагизи-рованна Для обеспечения воспроизводимости необходимо выяснить влияние вариабельности окрашивания и других факторов, от которых зависит измеряемая оптическая плотность клетки, в частности, длины волны, на ко-

торой проводится измерение Автоматизация же методики требует разработки надежных алгоритмов автофокусировки и выбора места на мазке Предлагавшиеся ранее алгоритмы автофокусировки, например, [БиЬЬагао М, 1998], непригодны для микроскопии из-за особенностей механики Ал горитм выбора места на мазке до настоящего времени предложен не был

Таким образом, разработка авюматизированного метода объективной количественной оценки реакции на НЭ имеет важное значение для современной медицины В настоящее время разработка методик автоматизированной видеоцитометрии является особенно актуальной, поскольку имеется возможность реализовать их широкое внедрение с применением современных компьютерных технологий и доступного качественного оборудования

Целью настоящей работы является разработка методики количественной оценки активное ш неспецифической эстеразы и ее ингибирования фторидом натрия в лейкоцитах средствами автоматизированной видеоцитометрии, а также проверка применимое га этой методики для исследования клеток костного мозга в норме и при острых лейкозах Задачи.

1 Разработать методику количественной оценки активности неспецифической эстеразы и ее ингибирования фторидом натрия в лейкоцитах на мазке костного мозга средствами автоматизированной видеоцитометрии

2 Создать макет прибора для микроспектрофотометрии, с его помощью зарегистрировать спектры поглощения клеток и их частей и подобрать оптимальные спектральные диапазоны для количественной оценки активности неспецифической эстеразы, а также для ряда других цитохимический окрасок на миелопероксидазу, гликоген (ШИК-реакция), липиды (судан черный Б), кислую фосфатазу

3 Подобрать набор признаков клеток, достаточный для оценки реакции на неспецифическую эстеразу, разработать алгоритмы их автоматического измерения Разработать алгоритмы выбора места на мазке и автофокусировки для автоматизации сбора выборки клеток

4 Оценить практическую значимость разработанной методики для исследования костного мозга здоровых пациентов и больных острыми лейкозами

Научная новизна. Проведен анализ современного состояния видеоцито-метрии, что позволило сформулировать и решить ряд задач, существенно важных для создания полноденной автомашзированной системы видеоцито-метрии, в частности для количественной оценки цитохимических реакций

Впервые разработана методика количественной оценки активности неспецифической эстеразы и ее ингибирования фторидом натрия найдены оптимальные условия для измерения оптической плотности, подобран набор признаков клеток характеризующий данную реакцию, предложена нормировка по интегральной оптической плотности эритроцитов, позволяющая учесть вариации окрашивания Впервые разработан алгоритм автоматического выделения гранул фермента Найдены спектральные диапазоны для измерения поглощения при ряде других цитохимических окрасок

Показано, что применение разработанной методики повышает информативность и объективность реакции на неспецифическую эстеразу, позволяет делать заключения в сомнительных случаях

Впервые разработан алгоритм автоматической фокусировки для микроскопии, позволяющий получать сфокусированные изображения клеток с максимальной эффективностью и надежностью более 99%

Впервые разработан алгоритм автоматического выбора траектории на мазке крови, позволяющий собирать выборку клеток в оптимальной зоне, в том числе при неправильной форме мазка Разработан оригинальный алгоритм оценки качества места на мазке по толщине слоя эритроцитов

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенные работы являются существенным вкладом в процесс создания системы автоматизированной видеоцитометрии Разработанный метод заметно повышает информативность, объективность и точность оценки активности неспецифической эстеразы и её ингибирования фторидом натрия, что имеет существенное значение для проведения научных и клинико-диагностических исследований

Реализация результатов исследования. 1 Разработанные алгоритмы с 2004 г применяются в составе аппаратно-программного комплекса МЕКОС-Ц2, коюрый эксплуатируется в более чем 100 медицинских и научно-исследовательских учреждениях России

2 Разработанная методика количественной оценки активное»! неспецифической эстеразы и ее ингибирования фторидом натрия применяется в Российской детской клинической больнице в качестве экспериментально! о метода при диагностике острых лейкоюв

Апробация диссертации. Машриалы работы докладывались на заседании кафедры биофизики РГМУ 21 06 2006

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ Объем и структура работы. Диссертация сосюит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы Рабога изложена на 112 страницах, иллюстрирована 27 рисунками и 4 таблицами Список литературы включает 87 наименований, из которых 30 работ представлены на русском языке, 57 — на английском

Работа выполнена на кафедре высшей математики ГОУ ВПО РГМУ Росз-драва (заведующий — профессор, доктор физико-математических наук В Н Акимов) и в цитологической клинической лаборатории ГУ РДКБ Росздрава (заведующая — кандидат медицинских наук JIВ Байдун)

Материалы и методы

Состав и характеристики аппаратуры. В качестве основной рабочей установки использовался комплекс МЕКОС-Ц2 (микроскоп Leica DM1000 с автоматическим устройством перемещения столика и фокусировки МЕКОС-MS2, видеокамера DeltaPix Infmity-X)

Установка собрана и функционирует в цитологической клинической лаборатории Российской детской клинической больницы Настройка оборудования и измерение его параметров производились с помощью разработанной нами программы «МЕКОС-Валидатор», содержащей средства для измерения и неравномерное ги освещенности поля зрения, шума камеры, пространственного разрешения камеры, шага столика с помощью средств автоматического анализа движения, шаг а микровипта, люфтов столика и микровинта

Для 1естирования алгоритмов фокусировки и перемещения по мазку использовались еще две установки в клинико-диашостической лаборатории НИИ неотложной детской хирургии и травматологии (микроскоп Leica DMLA, камера Sony DXC390P) и в цитологической клинической лаборатории Россий-

ской детской юшническои больницы (микроскоп ЛОМО Микмед-2 с МЕКОС-М52, камера 1УС Б32и) Для микроспектрофотометрии (МСФ) использовался объектив 100х 1,25, для количественной цитохимии— 50х0,90

Видеокамера ГпНпПу-Х дает цветное ЯОВ-изображение 1280х 1024 пикселя разрядностью 8 бит Пространственное разрешение камеры составило 4,81 пиксель/мкм (объектив 50х) и 9,62 пиксель/мкм (объектив 100х) Проверка линейности камеры проводилась с помощью набора нейтральных фильтров

Техника количественной цитохимии. Были использованы мазки костного мозга 28 пациентов Российской детской кчинической больницы от 3 до 15 лет (15 мужского пола, 13 женского) Из них 4 с нормальным костным мозгом, 8 с острым лимфолейкозом (ОЛЛ), 7 с острым промиелоцитарным лейкозом (ОМЛ МЗ), 1 с острым миеломоноцитарным лейкозом (ОМЛ М4) с эо-зинофилисй, 6 с острым моноцитарным лейкозом (ОМЛ М5), 1 с острым ме-гакариоцитарным лейкозом (ОМЛ М7), 1 с бластным кризом хронического миелолейкоза (ХМЛ) по М5-гииу У пациентов с лейкозами доля бластов в костном мозге составляла 76--92%

Цитохимическое окрашивание препаратов производилось с помощью наборов марки «ДИАХИМ» производства НПФ «Абрис+» в соответствии с прилагаемой инструкцией Реакция на НЭ (а-нафгалацетатэстеразу) проводилась на двух параллельных мазках без ингибитора и с его добавлением

Для количественной оценки реакции на НЭ производился сбор 200-300 ядросоднржащих клеток в не слишком толстой части мазка Огдельно в зоне монослоя записывались несколько кадров с 200-300 отдельно лежащими эритроцитами для нормировки Точно так же производился сбор выборки на препарате НЭ с ингибированием №Р

На каждом отснятом кадре выполнялась полуавтоматическая сегментация клеток и фона с помощью программы МЕКОС-ДММ В качестве фона брался участок плазмы, не содержащий клеток или других объектов Чтобы оценить влияние неспецифического окрашивания плазмы, на 41 препарате в 30 местах была измерена оптическая плотность (ОП) отпечатков смытых эритроцитов, более светлых, чем окружающая плазма 8

Для каждого лейкоцита измерялись счедующие признаки

1 Площадь, мкм2

2 Относительная интегральная оптическая плотность (ИОП) по зеленому каналу (отн ИОП) безразмерная величина, равная отношению ИОП клетки (средняя ОП, умноженная на площадь клетки) к средней ИОП нормировки (эритроцитов) Огн ИОП характеризует общую активность фермента в клетке

3 Коэффициент вариации ОП (КВОП) Рассчитывался как отношение стандартного отклонения (СО) ОГ1 внутри клетки к средней ОП Характеризует неравномерность распределения активности фермента

4 Относительная ИОП гранул (отн ИОП гранул) Измерялась так же, как ИОП, но не для всей клетки, а только для площади, занимаемой гранулами фермента Последние выделялись автоматически с помощью разработанного нами алгоритма Темные гранулы характерного размера подчеркивались с помощью ЬоС-фильтра — линейного фильтра с лапласианом функции Гаусса в качестве ядра Оптимальное значение параметра а было подобрано экспериментально и оказалось равным 0,25 мкм После ЬсС-фильтрапии порог сегментации гранул определялся с учетом средней ОП диффузной реакции и отношения отклика фильтра к величине ОП

Препарат в целом описывался средними значениями каждой из характеристик, измеренных на препарате без добавления НаТ7 Кроме того, степень ин-гибирования описывалась показа гелем ингабирования (ПИ)— отношением средних оти ИОП клеток без ингибитора и с ним Также подсчитывался процент гранулярных клеток, то есть клеток с отн ИОН гранул больше 0,001

Статистическая обработка и визуализация данных проводилась с помощью пакета «К» версии 2 2 1 Для каждого пациента строились распределения клеток по каждому из признаков с ингибитором и без него, вычислялись средние и стандартные ошибки Площадь, отн ИОП и отн ИОП гранул имели распределение, близкое к логнормалыюму, поэтому статистические показатели вычислялись дтя их десятичных логарифмов При подсчете среднего логарифма отн ИОП гранул учитывались только гранулярные клетки

Достоверность отличий в средних значениях характеристик при разных патологиях оценивалась с помощью критерия Вилкоксона

Чтобы установить вклад гемоглобина в поглощение эритроцита в зеленом канале, была измерена ОП эритроцитов на 10 неокрашенных препаратах здоровых доноров Мазки фиксировались 12 мин в парах формалина, на каждом измерялось по 200 клеток

Техника микроснектрофотометрии (МСФ). Для измерения спектров поглощения микропрепаратов штагный осветитель заменялся сисгемой монохроматического освещения, сконструированной и собранной нами совместно с Физическим институтом им Лебедева РАН Система состоит из осветителя на основе лампы накаливания и монохроматора с раздвижной входной щелыо до 2 мм и призмой Аббе в качестве диспергирующего элемента Для подведения света в микроскоп использовался гибкий световод. Для определения спектрального разрешения и калибровки монохроматора использовался спектрометр «Солар S100» Для увеличения апертуры осветителя световод вдвигался в объектив ЛОМО 40><0,65, фронтальная линза которого направлялась на препарат Съемка проводилась при дпинах волн от 400 до 700 нм с шагом 10 нм

Алгоритм автофокусировки включает процедуру оценки фокуса и алгоритм управления движением микровинта Для оценки фокуса на изображении выделялся квадрат со стороной 64 или 128 пикселей, выполнялось двумерное преобразование Фурье, вычислялась сумма всех компонентов спектра мощности кроме нулевого, одного или двух первых и 1/4 старших коэффициентов Определение достоверности изменения оценки фокуса проводилось с учетом шума камеры и вибрации установки Ал гори im перемещения микровинта.

1 Выбрать направление движения случайным образом

2 Повернуть микровинт на один шаг в выбранном направлении

3 Если зафиксировано достоверное убывание оценки, но достоверного возрастания не было, изменить направление движения, вернуться к шагу 2 Если возрастание было, перейти к шагу 4, иначе вернуться к шагу 2

4 Вернуть микровинт к положению максимальной оценки фокуса Проверка проводилась на трех установках в режиме поиска лейкоцитов на

мазках, окрашенных но Романовскому-Г'имзе Было просканировано 60 пре-

паратов (всего 5580 фокусировок) Дчя каждой установки определялись среднее число шаюв фокусировки и средний процент сбоев фокусировки

Алюритм выбора месга на мазке состоит т оценки толщины мазка, отыскания направления движения на ее основе и формирования траектории с учеюм найденного направления

Для оценки толщины мазка использовалась величина И - где --

средняя площадь эритроцита, N— число эритроцитов в кадре, а 5— общая площадь кадра N оценивалось как ИОП кадра, деленная на среднюю ИОП одного эритроцита Средние площадь и ИОП эритроцита оценивались автоматически при прохождении тонкого слоя мазка На основании экспертных оценок были выделены 3 пороговых значения для к, так чтобы толщина между первым и вторым порогами была оптимальна для сбора выборки эритроцитов, а между вторым и третьим — для подсчета лейкоцитов

Для определения направления все кадры разделялись по толщине на пригодные и непригодные Перед очередным перемещением столика оценивалась вероятность получить после перемещения непригодный кадр Если она была больше 0,9, направление движения менялось Для оценки вероятности использовалась разработанная нами математическая модель границы между благоприятной и неблагоприятной зонами мазка Положение границы оценивалось по значениям толщины уже пройденных кадров в заданной окрестности на основании предложенной модели с помощью формулы Байеса

Алгоритм навигации был проверен на трех установках на 60 мазках нормальной и патологической (анемия, лейкопения) крови различной формы Из них 20 имели форму, отличную от прямоугольной, и 6 не имели достаточно широкой зоны монослоя Каждый мазок сканировался 3 раза, для проверки устойчивости алгоритма выбирались как правильные исходные точки, так и смещенные в толстую часть Оценивались качество и стабильность оценки толщины мазка и качество работы алгоритма выбора направления Также визуально и с помощью алгоритма оценки толщины чазка определился средний процент кадров из слишком толстой части мазка

Результаты исследования

Количественная оценка активности НЭ в лейкоцитах ее ингибирова-ния при острых лейкозах.

Из приведенных на рисс 1-3 данных видно, что по отн ИОН, ПИ и проценту гранулярных клеток нормальные препараты довольно близки между собой Большие различия наблюдаются по площади и КВОП они хуже воспроизводятся, так как сильно зависят от скорости нанесения мазка НЭ клеток нормального костного мозга не ингибируется №Р Действительно, доля клеток моноци гарного ряда в норме не выше 2%

ОЛЛ характеризуется более низкими значениями всех характеристик, кроме препаратов 3 и 4, где бласты имеют умеренно положительную реакцию Из 9 случаев ОЛЛ в двух наблюдалось ингибирование (пациенты 3 и 6) Поскольку оно происходило на фоне достагочно слабой реакции, достоверно зафиксировать ингибирование можно было только количественно В среднем по всем показателям отличия от нормы недостоверны (р > 0,1)

Препараты с ОМЛ М5 характеризуются высокими значениями всех показателей Отличия от нормы и ОЛЛ достоверны по всем характеристикам (площадь р < 0,1, отн ИОП, ПИ р < 0,01, остальные — р < 0,05), от ОМЛ МЗ — по проценту гранулярных клеток и огн ИОП гранул (р < 0,05) 1оль-ко пациент 11 с умеренным значением отн ИОП имел нетипичную преимущественно гранулярную реакцию в небольшом проценте бластов Все препараты с ОМЛ М5 показывают достоверное ингибирование КтаР Сходный тип реакции наблюдался и у пациента с М5-вариантом бластного криза ХМЛ

Для препаратов ОМЛ МЗ и ОМЛ М4 отн ИОП выше, чем в норме (р < 0,01) По КВОП они находятся на уровне нормы, а по проценту гранулярных — несколько выше {р < 0,1) От ОЛЛ достоверны отличия по отн ИОП (р < 0,01), площади (р < 0,05), КВОП и проценту гранулярных (р < 0,1) Особенно интересны результаты оценки ингибнрования №Р из 8 случаев большой ПИ наблюдался в трех (пациенты 5, 8 и 18), что не позволило выявить статистически значимые различия между ОМЛ МЗ и ОМЛ М5 по этому показателю

22 ■

«20 $21

428

Ф18

«27

«26

фг

$17

Фб

|24

«19

«15

»23

ф11

ф13

$14

а)

I I I I I I I

Норма ОЛИ ОМЛМЗ 0МЛМ4 ОМЛ М5 ОМЛ М7 ХМЛ Диагноз

С

о

° 06 -

.ля

Норма

04

ез »7

« »7

§18 18

Ф22

«24

О 23 »15

б)

ОЛЛ ОМЛ МЗ ОМП М4 ОМЛ N15 ОМЛ М7 ХМЛ Диагноз

Рис 1 Результаты количественной оценки активности НЭ пчощадь (а) и относительная интегральная ошическая плотность (б) Каждая точка соответствует одному пациенту Приведены средние и стандартные ошибки Рядом с точками указаны номера пациентов

16

,121

9

-таил

|и

а)

Норма ОЛЛ ОМЛ МЗ ОМЛ М4 ОМЛ М5 ОМЛ М7 ХМЛ Диагноз

0 20 -■

15

б)

$26 |4

|?7 |3

Норма ОЛЛ ОМЛ МЗ ОМЛ Ш ОМЛ М5 ОМЛ М7 ХМЛ Диагноз

$19 $15

Ф11

$12

Рис 2 Результаты количественной оценки активности НЭ показатель ингибирования (а) и коэффициент вариации оптической плотности (б) Обозначения как на рис 1

<z о s

$13

$11

§8 ÍB

$28 §16 {20 $21 i t §1 *7 Ф27 i $5 §18 $17 $10 i $24 $12 $15 i i

а)

Норма ОЛЛ ОМЛ МЗ ОМЛ М4 ОМЛ М5 ОМЛ М7 ХМЛ Диагноз

е-

Í 40 -

^16

'и 28

I

Норма

--irf-

II? 3

8г

I

ОЛЛ

^24

$11

б)

ОМЛ МЗ ОМЛ М4 OMI1 М5 ОМЛ М7 Диагноз

Рис 3 Результаты количественной оценки активности НЭ относительная интегральная оптическая плотность гранул (а) и процент гранулярных клеток (б) Обозначения как на рис 1

/ \

1" & / \

£ £ 1 - //

о - / о ------ © Ъ------____ I 1

пи

Рис 4 Распределение ПИ в исследованных образцах Каждый кружок соответствует одному пациенту Сплошная кривая - - ядерная оценка плотности распределения ПИ Пунктирная кривая — плотность нормальною распределения со средним 1,0 и СО 0,07 Вертикальная прямая проходи г через значение 1,14

ОП пустого стекла относительно плазмы. При измерении ОП отпечатков смытых эритроцитов было получено значение -0,011±0,003 Учитывая, что средняя ОП относительно плазмы эритроцитов, окрашенных на НЭ составляет 0,081-Ь0,007, относительная погрешность может достигать 20% Гем не менее, мы считаем, что ОГ1 следует измерять относите аьно плазмы, поскольку участки плазмы можно найти на каждом кадре и минимальная ОП в клетке относительно плазмы часто неотличима от 0, в то время как относительно пустого стекла она всегда достоверно положительна То есть плазма может играть роль отрицательного контроля, позволяющего учесть неспецифическое окрашивание

ИОП эритроцитов характеризуется достаточно большим разбросом от 1,91 до 5,66 При этом достоверные различия наблюдаются и для препаратов с иш ибитором и без, которые 1 отовятся и окрашиваются параллельно Средняя ИОП эритроцитов на препарате с ЫаР уменьшается в 16 случаях (14 дос-16

товерныч) и увеличивается в 12 случаях (9 достоверных), различие недостоверно (р > 0,1)

Гаким образом, хотя наличие ингибитора, по-видимому, не влияет на окрашивание эритроцитов, их средняя ИОП воспроизводится плохо Подобным образом ведет себя и ИОП лейкоцитов ПИ, вычисленный без нормировки, имеет большой разброс и почти не выявляет различий между ОЛЛ, ОМЛ МЗ и ОМЛ М5 Более того, у пациента 22 ИОП бластов на препарате с NaF оказалась достоверно выше1 Если же поделить ИОП лейкоцитов на средшою ИОП эритроцитов того же препарата, сразу выделяется ipynna точек вокруг значения 1,0, отвечающая случаям неингибируемой НЭ (рис 4), все пациенты с ОМЛ М5 имеют высокий ПИ в полном соответствии с данными литературы, и достоверные случаи «повышения» активности по действием NaF отсутствуют Для значений ПИ, недостоверно отличающихся от 1,0 (16 из 28) среднее ГШ составляет 1,01, а СО — 0,07 ПИ, равный 1,0, означает, что ингибитор не влияег на активность фермента, поэтому в качестве порогового значения при оценке ингибирования можно предложить 1,14 (среднее + 2 СО) Если ПИ превышает этот порог будем считать, что фермент ингибируется

ИОП фиксированных неокрашенных эритроцитов оказалась равной 0,382±0,030 Это составляет почти 20% от минимальной ИОП эритроцитов, окрашенных на НЭ Тем не менее, поскольку систематическая погрешность присутствует и в числителе, и в знаменателе, ошибка определения ПИ составляет не более 3,5%, и ей можно пренебречь

Микроснектрофотометрия при цитохимическом окрашивании. ОП гематоксилина Майера максимальна в области 580—600 нм и убывает в 2 раза при 500 и 640 нм Поглощением хематоксилина в синей части спектра нельзя пренебречь, поэтому при измерении активности ферментов на фоне докрашенного ядра следует вносить поправку

Спектр соли диазония, применявшейся при реакции на НЭ (рис 5), имеет почти постоянную ОП от 480 до 600 нм, что оправдывает использование зеленого канала цветной видеокамеры для количественной оценки этой реакции, поскольку докраска гематоксилином в этом случае не производилась

Рис 5 Усредненные спектры клеток при окраске на НЭ без докраски i ематоксили-ном--положительная реакция в цитоплазме лейкоцита-----эритроцит

Для остальных красителей, кроме реагента Шиффа (окраска на гликоген), целесообразно использовать длину волны 440 нм, поскольку здесь минимально поглощение гематоксилина и невелико — гемоглобина Для ШИК-реакции отношения ОП на 440 нм и 600 нм для ядра и цитоплазмы очень близки, поэтому длину волны 440 нм следует заменить на 560 нм Проверка работы алгоритмов фокусировки и навигации по мазку Работа алгоритма фокусировки сильно зависит от качества оборудования Лучшие результаты показывает Leica DMLA (в среднем, 6,85 ± 0,61 шагов, 0,79% сбоев) Худшие результаты наблюдаются для Микмед-2 + MEKOC-MS2 (8,05 + 0,53 шагов, 1,11%) Главными причинами трудностей фокусировки являются noipenmocra механики микровинта и заметная вибрация столика, приводящая к колебаниям оценки фокуса

В большинстве случаев траектория своевременно реагировала на выход из оптимальной зоны, также полностью удавалось избегать таких фатальных ошибок, как выход за край мазка Доля кадров из неблагоприятной зоны составляла от 1,5% до 3,3% Траектория поиска лейкоцитов на прямоугольных хорошо распределенных мазках, как и следовало ожидать, оказывалась нря-моуюльной, что доказывает стабильность, прежде всего, оценки толщины Стабильными оказывались результаты и на скругленных мазках

Обсуждение

Для автоматизации цитологических исследований применяются две основные группы приборов проточные анализаторы п видеоцишметры Хотя наиболее распространены проточные приборы, они имеют ряд недостатков, например, ограниченные возможности в измерении морфологии клеток, отсутствие визуального контроля Поэтому альтернативный метод видеоцитометрии всегда находил свою область применения [Козинец Г И, 2002, Медовый В С , 2004]

Однако в настоящее время видеоцитометры находятся в основном на уровне научно-исследовательских разработок и пока не получили достаточно широкого распространения Причинами столь медленного внедрения видеоциго-метрии являются недостаток автоматизации, отсутствие стандартных схем проведения исследований и отрабошнной схемы клинической интерпретации результатов Полноценная система видеоцшомегрии должна обладать способностью автоматически находить клетки на препарате, выполнять сегментацию изображения (то есть выделять фон, ядра, цитоплазмы различных клеток), проводить измерения морфометрических и денситометрических характеристик, осуществлять классификацию типов исследуемых объектов

Разработка комплекса МРКОС-Ц2 явилась крупным шагом на пути преодоления перечисленных проблем, однако реализованный набор возможностей все еще достаточно ограничен, а уже работающие методики могут быть существенно улучшены В данной работе ставилась цель разработать и проверить на практике методику количественной оценки активности НЭ и ее инти-бирования в лейкоцитах для диагностики острых лейкозов, кроме того, были решены две более общие задачи видеоцитометрии, существенно важные для автоматизации как количественной цитохимии, так и других видеоцито-метрических техник автофокусировка и выбор места на мазке

Прежде всего, для видеоцитометрии важную роль играет качество получаемых изображений клеток В частности, для получения качественных изображений требуется надежная автофокусировка Нами был разработан специально адаптированный для микроскопии алгоритм, который использует максимум одну перемену направления движения Последнее обстоятельство

особенно важно, поскольку изменение направления движения связано с компенсацией люфта которая не может быть выполнена достаточно точно Ранее предлагавшиеся алгоритмы [Subbarao М, 1998] адаптированы для макросъемки, где шаги перемещения примерно в 100 раз крупнее и люфтом можно пренебречь Наименьшее число шагов описанного нами алгориша— 4 Как показывают результаты испытаний, при фокусировке в среднем делается лишь 2 дополнительных шага по сравнению с теоретическим минимумом При этом оптимальная скорость алгоритма сочетается с высокой надежностью более чем в 99% случаев находится истинное положение фокуса

Вторая частая причина получения изображений низкого качества— неправильный выбор места на мазке (слишком толстая или слишком гонкая часть) Ранее предлагались способы оценки толщины мазка [Angulo J , 2003], но собственно алгоритм навигации до настоящего времени разработан не был Нам удалось разработать оценку толщины мазка, которая позволяет определять оптимальную зону сбора как эритроцитов, так и лейкоцитов, а предложенный алгоритм навигации позволяет находить правильную траекторию движения на мазках сложной формы

В настоящее время комплекс МЕКОС-Ц2 может применяться лишь для анализа мазков крови, окрашенных по Ромаловскому-Гимзе, но большое значение в гематологии имеют и другие методы окрашивания В частности, цитохимические методики являются важнейшим и наиболее широко распространенным методом диагностики острых лейкозов [Погорелов В М, 2006]

Создание прибора, позволяющего автоматизировать и объективизировать цитохимическое исследование, имело бы важное значение для улучшения качества диагностики острых лейкозов Как первый шаг к созданию такого прибора нами была предпринята разработка методики количественной оценки реакции на НЭ Также были найдены спектральные диапазоны для измерения поглощения при ряде других цитохимических окрасок а-нафтилацетатэстераза традиционно используется для дифференциальной диагностики между вариантами ОМЛ МЗ и М5 считается, что при ОМЛ МЗ фермент, как правило, не ингибируется NaF, а при ОМЛ М5 — ингибируется Правильная диагностика этих двух вариантов имеет первостепенное значение, поскольку при их лечении используются различные схемы терапии

При выполнении работы мы старались уделять особое внимание методическим аспектам, влияющим на воспроизводимость результатов Так, из результатов микроспектрофотометрии следует, что для количественной оценки реакции на НЭ без докрашивания ядер можно использовать зеленый канал цветной видеокамеры, так как спектр продукта реакции в этой области почти горизонтален, а поглощением гемоглобина можно пренебречь

Для обеспечения воспроизводимости нами использовалась нормировка, в качестве которой была выбрана средняя ИОП эритроцитов Особенно важное значение имеет наличие нормировки при оценке степени ингибирования Без нормировки средние ИОП с ингибитором иногда оказывались достоверно больше, чем без него Напротив, средние ИОП относительно эритроцитов всегда имели разумные значения Таким образом, среди наиболее ярких преимуществ количественной методики можно выделить возможность объективного сравнения характеристик популяции клеток на различных препаратах В перспективе это можно использовать для прослеживания динамики состояния пациента и для выделения групп сходных случаев

Для описания реакции нами были предложены четыре характеристики клетки, одна из которых описывает размер клетки (площадь), другая — суммарную активность фермента (отп ИОП), две оставшиеся — распределение фермента (КВОП и отн ИОП гранул) Сложнее всего оказалось отличить диффузную реакцию от гранулярной Дело в том, что наличие более светлой области ядра и более темной области цитоплазмы вызывает сильное увеличение КВОП даже при наличии диффузной реакции Поэтому понадобилось разработать особый алгоритм выделения гранул, который выделял бы неравномерность ОП именно заданного размера (0,7-2 мкм)

Особенно интересна с практической точки зрения оценка ингибирования ЫаР Нами предложена количественная характеристика — показатель ингибирования (ПИ) и установлено, что ингибирование можно считать достоверным, если ПИ превышает 1,14 Считается, что моноцитарная НЭ ишибируется №1% а гранулоцитарная— нет Действительно, во всех случаях ОМЛ М5 наблюдался достоверно высокий НИ Однако в 3 из 8 случаев ОМЛ МЗ и ОМЛ М4 также наблюдалось достоверное ингибирование, при этом высокий ПИ, по-

видимому, характерен для более интенсивной реакции (высокая отн ИОП) Тем не менее, резулыаты не противоречат литературным данным, поскольку известны случаи промиелоцитариого лейкоза, когда бласты содержат моноци-тарную НЭ В то же время, все препараты с ОМЛ М5 имеют достоверно более высокий процент гранулярных клеток или отн ИОП гранул, чем ОМЛ М5 Таким образом, по нашим данным при оценки реакции на НЭ большое диагностическое значение имеет не только ингибирование ЫаР, но и характер распределения фермента в клетке

Также интересно наличие одного случая ОЛЛ с достаточно высокой отн ИОП Данный случай, сходный с ОМЛ М5, можно отличить уже на основе реакции на НЭ по отсутствию ингибирования и по низкой степени гранулярности.

Таким образом, представлена методика, позволяющая количественно оценивать активность НЭ и ее ингибирование Кар в лейкоцитах Разработаны все этапы процедуры, начиная от сбора выборки клеток и кончая интерпретацией результатов, показана практическая применимость методики К числу ее преимуществ перед традиционной визуальной оценкой можно отнести объективность, наличие нормировки в явном виде, возможность количественного представления результатов для сопоставления с результатами других исследований, изучения динамики заболеваний, сбора статистики и научной работы Все измерения выполняются автоматически, поэтому метод существенно менее требователен к наличию у врача большого опыта цитохимической диагностики острых лейкозов, что особенно важно в условиях лечебных учреждений общего профиля

Выводы

1 Разработана методика количественной оценки активности неспецифической эстеразы (НЭ) и ее ингибирования фторидом натрия в лейкоцитах на мазке костного мозга средствами автоматизированной видеоцитометрии, позволяющая объективно оценивать результаты данной цитохимической реакции Для обеспечения воспроизводимости результатов при количественной оценке активности НЭ в качестве нормировки может быть использована средняя интегральная оптическая плотность эритроцитов Оптиче-

скую плотность следует измерять относительно плазмы Средствами мик-роспектрофоюметрии установлено, что для реакции на НЭ без докраски количественная оценка может проводиться по зеленому каналу цветной камеры

2 Подобран набор параметров клеток, описывающих как интенсивность реакции, так и ее характер (гранулярность) Получена количественная характеристика, описывающая степень ингибирования НЭ фторидом натрия (показатель ингибирования) Определены значения полученных показателей, характерные для нормального костного мозга, острого лимфолейкоза, острых промиелоцитарного и монобластного лейкозов

3 По полученным характеристикам наблюдаются выраженные различия между острым промиелоцигарным и острым монобластным лейкозами, чю доказывает высокую информативность разработанной методики при дифференциальной диагностике острых лейкозов Доказано, что в ряде случаев при остром промиелоцитарном лейкозе может наблюдаться инги-бирование НЭ фюридом натрия

4 Получены спектры поглощения клеток при цитохимических окрасках на миелопероксидазу, гликоген (ШИК-реакция), фосфолипиды (судан черный В) и кислую фосфатазу с докраской гематоксилином Майера Установлено, что для реакции на гликоген измерение оптической плотности может производиться на длинах волн 560 и 600 нм, для остальных реакций — на длинах волн 440 и 600 нм

5 Разработаны эффективные алгоритмы, необходимые для автоматизации сбора выборки лейкоцитов алгоритм автофокусировки, позволяющий автоматически получать сфокусированное изображение клетки с надежностью больше 99% и эффективностью, близкой к максимальной, алгоритм оценки толщины мазка, позволяющий автоматически оценивать пригодность данного места на мазке для сбора выборки клеток, алгоритм автоматического перемещения по мазку, позволяющий собирать выборку клеток в оп гимальной зоне, в том числе при неправильной форме мазка

Список опубликованных работ но теме диссертации

1 Ьайдун JIВ , Кашпор С А , Парпара А А , Плясунова С А , Пятницкий А М, Соколинскии Б 3 Автоматическая эригроцитометрия в роботизированном микроскопе МЕКОС-Ц1 //Клин лаб диш н -2003 -№6 - С 39-42

2 Медовый В С , Парпара А А , Николаенко Д С , Пятницкий А М , Соколинскии Б 3 , Демьянов В J1, Маркеллов В В Применение автоматизированного комплекса микроскопии МЕКОС-Ц2 для телемедицины, для ис-пьланий новых мегодик анализов, для сбора электронного архива препаратов редких форм патолошй, для удаленной аттестации и обучения // Арх патол - 2006 - №5 - С 40-43

3 Медовый В С , Парпара А А, Пятницкий А.М, Соколинскпй Ь 3 , Демьянов В JI Обзор методик автоматизированной микроскопии биоматериалов //Клин лаб диагн -2006 -№7 - С 15-20

4 В С Медовый, А А Парпара, А М Пягницкии, Б 3 Соколинский, В Л Демьянов Структура системы автоматической микроскопии МБКОС-Ц2 и методики ее испытаний //Медтехн -2006 -№4 - С 36-41

5 Медовый В С , Пятницкий А М, Соколинскии Б 3 , Демьянов В Л, Парпара А А Автоматизированная микроскопия биоматериалов // Здравоохр и медтехн -2005 -Лг24 - С 42-43

6 Парпара А А , Пятницкий А М , Медовый В С , Соколинский Б 3 , Демьянов В Л Навигация по мазку крови при автоматическом подсчете лейкоцитарной формулы и эритроцитометрии // Здравоохр и мед гехн - 2005 -№7 - С 37-38

7 Плясунова С А , Балугян РIII, Хмельницкий К Е , Медовый В С , Парпара А А , Пятницкий А М , Соколинский Б 3 , Демьянов В Л , Николаенко Д С Медицинские испытания автоматизированных методик микроскопических анализов мазков крови // Здравоохр и мед техн - 2006 - №5

8 Пятницкий А М , Парпара А А Применение методов компьютерной микроскопии для количественного изучения движения крови // Труды восьмой международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» 28 06-01 07 2005 Москва -2005

9 Б 3 Соколинский, В Л Демьянов, В С Медовый, А А Парпара, А М Пятницкий Автоматическая сортировка лейкоцитов мазка крови с использованием методов обучаемых нейронных сетей и watershed // Здравоохр и мед техн -2005 -№4 - С 35

Отпечатано в типографии "Риза-М" Заказ 144 от 11 04 07 Тираж 100 экз

Москва, Садовая-Самотечная, 8/3 Тел /факс. 699-08-22, 505-18-22

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Парпара, Анатолий Анатольевич

Введение

1 Антоматтнрошшняи лидеоцнтомстрии лейкоцитов (обзор литературы) Ю 1.1 Историк развитии видеоцкгомстрин .Ш

12 Место ынкрсинкмтомсгрни » вроеиале пкдоцгажвтрячв-еких методик и её задачи

13 Оборудование для микр^ногтометрин

14 Измерение количества поглощающего вещества ли цифровому юображеюю

15 (И^йСотка и анализ данных мнкродснсптоыетрин

1 6 Вцдгоцитометрии лейкоцитов

2 Материалы и методы 42 2.1 Состав н характеристики аппаратуры

2 2 Методик* количественной оценки реакции н» иеспоцкфичсскую эстврвзу

2.3 Методика мккроакктрофотометрни

2.1 Алгоритмы н программное обеспечение

3 Результаты собственных пселсдошшнЛ

3.1 Количественная оценка активности ИЭ в лейкоцитах л ее ннгмбмрвшшт при острых лойномх

3.2 Результаты мнкроспекгрофсггометрии лрл пяти наиболее распространёлннх цитохимических окрасках

3 3 Проверка работы алгоритма фокусировки 92 34 Проверка работы алгоритма выбора мести ни мазке

4 Обсуждение ад Литература

Список основных сокращений

ПОП — интегральная оптическая плотность

КВОП — ноэффмЦнигГ вариации иггичгекой плотности

КСЧ кривая спектральной чувствительности

МДМ янкроденситсыетрия.

МП миелогеероксидаза.

НЭ и ее m; пифическая эстсраза

ОЛЛ — острыП лиыфолсАшя.

ОМЛ - острый ыншщлеЛвдч

ОМЛ МЗ - острый промтыювдшфныП лейкоз

ОМЛ M4 - ектрыП миеломоноблистиый леЯкиз.

ОМЛ М5 - острый лрмшйяоцрпрмый лейкоз

ОМЛ M 7 огтрыА нсгяквраиЛлагтныП ЛЕЙ кот

ОП - шпгмешя илогиость.

Otii МОП HitTcrpOLiniiui оптическая плотность относительно нормировки

ПИ показатель ингибироианни СО стандартное отклонение. ХМЛ хронический мтлолейкоз ФРГ функция размытия точки

Введение Диссертация по биологии, на тему "Методика и применение автоматизированной микроскопии лейкоцитов с количественной оценкой цитохимических реакций"

Актуальность проблемы г Цитометрин, то есть техника ПОДСЧЙТа» измерения и Сортировки клеточных Частиц, «ншмост одно г» важнейших МОСТ В ЯрССНаЛР Современных медицины и биологии, Н ТОМ ЧИСЛе гематологии Методы цитометрин ролюляюг описывать клеточную популяцию с помощью объективно измеряемых количественных показате-лсЛ, чей выгодно отличаются от трвлииионно*! визуальной микроскопии, результат которой сильно зависит от квалификации цитолога н его субъективных предпочтений [18].

Наиболее широкое распространение пилу чили нродошм цнтомстрни (Яо^ су1сигиг1гу) благодаря, я честности, высота степени дзтомвтиэ»-щгн. зшчлпнвй скорости работы я шшпрноЯ беэопясяоетя для нер-«мои». Между тем, эта методикл имеет ряд существенных аершпшй, п частности, фкнскровиниыП набор измеряемых признаков, отсутствие возможности яшуялыюго контрили, высокую стоимость оборудования м расходных ЫВТСрМЫКП |9|.

Таким образом, рвавитие технологии автоматического лиализв крови ■ювыснло точность и иоснроизвадимость ОПрСДелШм основных гематологических НОтитедвЯ, Ко не отменило исследо1ншиЛ клеток кроши методом свстоиоЛ микроскопии, Микроскопические исследования выполняются и лабораториях, обслуживающих гематологические стационары, а большом объёме и сопровождаются значительным напряжением органов зрения и опорно-двигательного аппарата сотрудников Утомление, развивающееся и результата диптльноИ монотонной работы является потенциальным источником ошибок

Поэтому метод видсоцнтомсгрин (ипа^е суЧовпеСгу), то есть цитомст-рнн по микроскопическому изображению, всегда иаходнл свою область применения Так, разработаны аппаратно-программные комплексы, позволяющие автоматически производить поиск па мазке. нлмереиие н классификацию нормальных клеток крови при окраске по Рошшовекому-Гимзе, например, комплекс МБК0С-Ц2 |17| Вндеоштигетрия также используется как средства объективной количественной оценки в гнето-лопш и щттологни нрн различных методах окршпнвання |65, 1|

Тем M менее, для щгтохнмнческнх методов, имеющих большое значение при диагностике острых лайкион, методика количественной онелкн OTcyTCTOjvr Между тем, сотрудники лабораторий, работающих в клиниках анкокмитологнчккогй профиля, испытывают дополнительное пп еаьэ M стЦМОН Full J к» напряжение» гвяминое г особо!) ответственностью ирачоилвборамти, уешнмлшикщаго дошл гтжачсстмаидаго мболе-вниин. поскольку его лечение само по с*бс может вышвюь летальные осложнении Успех терапии острого лейкоза и имчитсльной мерс определяется irpimiMbicofl диагностикой формы и iwpnsirra заболевании, в оеншк которой лежит морфологии и шггтаимии [2Ä]. Выраженная ыиинко'цитологическая гетгрогеинос-п, острою лейкоза, пеггольтооа-шк при клагоифицирошшни конк1*?тных случаев преимущественно нес||еш|фич«*нх Ц)гг0л01"и'и«ких л(игл1лкои, значение которых оцениваемся лини в НОКТОНСТб всего спектра цитологических характеристик бллстных клеток ■ делают диагностику острого лейкоза наиболее сложным разделом современноЛ лабораторной гтматологин, Поэтому задача ютометмэ&иии и обккдоимцм оценки цитологических параметров лей .«одических клеток представляется актуальной и сажмоП

Ишкдюши! эстерат при острой лейко» трлдицинлк пмАзутя для подтверждения моносцггароол flpijw бластноП популяции н диа-гооепоск М-1 ■ МБ варианте* острого мнежтдиогв лейком (ОМЛ). Диагностическое использование п-нл|тиацет*г»стер«ам (иеспецифнческой эстервэы, НЭ) базируется на чувствительности этого фермента к иягнби-роаанию NaF в клетках моноцвтарноП линии |ТА| Обьектнянтацня результатов этой реакции особенно актуальна, поскольку наличие инги Бнрования часто весьма трудно определить на глаз. Хотя количествен-пая видеощтшстрическая оценка ряда других цитохимических реакций предпринималась |25], дли реакции на НЭ объективная методика предложена не была

Одной ИЗ ПЖНсЛаии величин. шмсрнсмых при колшкетвенной оценке цитохимических реакций, являетгя оптическая плотность (ОП) Дли того чтобы правильно выбрать спектральный интервал для её нзмере-IIкн. необходимо знать спектры ноглоп(енни используемых красителей Дли цитохимических методой окрашивания ira работа не была выпалиена рапсе, поэтому, хотя в рамки даюй работы ми ограничиваемся и основном рл-цлботкоП методики количественной «ишки МГППНОСТИ НЭ 11 ее ингибированля фторидом натрия, нами выполнены исследования спектров погашения и при ряде других внршиттив окрашивания, что является необходимым предварительным шагом для разработки соответствующих техник.

Мегодикя видсоцнтомегрпи, пригодная к широкому практическому применению, должна быть хороша воспроизводима и максимально автоматизирования Для обеспечения воспроизводимости необходимо выяснить влияние вариабельности окрашивания и других факторов, от которых зависит измеряемая оптическая Плотность клетки, и частности, длины волны, на которой проводится измерение Автоматизация же методики требует разработки надёжных алгоритмов аитофокуенронки и выбора места на мазке Предлагавшиеся ранее алгоритмы аятофокусн-ровхи, наприиср, [89], непригодны для микроскопии из-за особенностей мехяиики Алгоритм выбора места па мют ле настоящего времени предложен не был

Таким образом, разработка ипмтюиромита метода обгмжтнв-ной КШШЧОСПСНВОП оценки реакции НЭ имеет важное значение для современной мелиииим В Настоящее время разработка методик аитома-тняроишпй ввдияипгометрми ямяется особенно шуиыюЯ, постольку имеется возможность реализовать их широкое пкдреюк« применени-см со&ремениих компьютерных технологии и доступного качественного оборудомшня

Целью настоянной работы является разработка методики кодиче пагмиоП оценки активности неепецифической эетераяы и ее нш'ибиро-ваиия фторидом натрия в лейкоцитах средствами автоматизированной видеоиитоыетрии. а также ирокрка прнменимоепг этой методики для исследования клеток костного нот га в норме и при острых лейкозах.

Задачи,

1 Рдзрйбстть методику колячОСПММОЙ оцонкн активности нвспе-цнфнческоА эсприы и ч4 ингиГщроввннм фторидом натрии в лоЛ-КОЦ1ГТМ 1IH ЫВЗНС КОСТНОГО МСИГв С|КДСТ№Ы|| «ШТОМДЛСЫфО мл i toll Ш1ДСйЦИТОМеТрНИ.

2. CœwiiTW пакет ирнбирп для мн^кклектрофотомстрин, с «и помощью знрегиетрироит. спектры поглощении клеток ir их мнетеit и 11ОД0б|1*ГЬ OimillAJlWÍUf"í'l 1еК1ТЛ)ЬИЫ[Ь« ДИиШЭОНЫ дои КОДНЧ«ТвП1-ноЛ оценки активн«>етн игспсц|ф|ческо11 »стср»эы< а также для ри

Ди Других НИТОХНМНЧескиП üKpACOK IIA M1 »C Лч) П i41X i к ri i; LFúy, ГЛИКОГгИ

ШНК-реакцня), ДЛИНАМ (судан черный В), кнглу*1 фосфагачу.

3 ГКуюбрап. набор иртилкии кдегмк, достаточный для оптики реакции и* илдищифи'ксхую «вриу, рлэ работать алгоритмы их mm> МЛТИЧеСВДГО 11ЭЫ«рС11ИЯ. РкфЛ&тГвТ* АЛГОрИТМЫ Выбор» ШЛЯ НП мазке И авгофокуенровки для автоматизации сбор* Выборки клеток.

4. Quotum, практическую значимости раэрарботаиноД методики для исследования костного мозга практически здоровых пациентов и больных острыми лейкозами

Научная ноннзнд, Проведен анализ еовроыешюго состоянии йидеи-цнтометрнп, что позволило сформулировать и решить ряд задач, существенно важных для создания полноценная автоматизированной системы видеолитсыстрин. в частности дм колнчестпеиноЛ оценки цитохимических реахдиЛ

Впервые разработана методика количественной оценки активности неспсиифнческой эстеразы и се ннгнбиропания фторидом натрия ниПдс-ны онтиьшльиые условия для намерения оптическаЛ плотности, подобран набор признаков клетгок wip^Ktrptnywutiifl данную реакцию, предложена нормировки но интсгральиоЛ овггичсекоП ндотносги »ритро^штов, позволяющая учесть вариации окршмивания Впервые разра<х»тан алгоритм автоматического выдежнин гранул фермчгг* НаЛдены гнектрпльнме диаипзомы для и-шерсния поглощения при ряде других цнтокнмнчеекнх окрасок.

Показам», что применение разрнботаиноЛ методики повышает кифарнаяшюстъ И объективность рсшщш ми исспспифичесхую эстеразу, по> виляет делать заключения и С0ШШТСАЫ1 wx случаях

Впервые разработан мгорнтн автоматической фокусировки для микроскопии, шяволнющиП получать сфпдюфомшк Изображения клеток с максимальная эффективностью и надежностью более 99%

Впервые разработан алгоритм автоматического выбора траектории на мазке кроив, позволяющий собирать выборку клеток U оптимальной зоне, в том числе при непраошшноЛ форме m язи». РазрйбоПН оригинал и-нып алгоритм оценки качества места на мотке по ТОЛЩИН» слоя эритроцитов.

Теоретическое и приктк-юскос значение 1*и>оты, Проведённые работы являются существенным вкладом и процесс создания системы автоматизированной втдеоцитометрии- Рлэ работай им It мпчд заметно повышает 1ШфорЫВТИ ИНОСТЬ, объеКТНВНОСТЬ и ТОЧНОСТЬ ООДИКИ дктнино-сти иеспецнфичеехоП эстеразы и ее ннгибнронаиия фтормлом iMitpitH, что имеет существенное значение дли проведения научных и клинико-дрипюстнческих исследования

Реализация результатов исследования. Внедрение подученных результатов в практику осуществляется следующими путями

1 Разработанные алгоритмы с 200-1 г. применяются на практик«? в составе аппаратно-программного комплекса МЕКОС-Ц2. ДянныЛ комплекс эксплуатируется в более чем ]00 медицинских и иаучно-нсследовательскнх учреждениях России.

2 Результаты опубликованы в 9 печатных работах, докладывались нв научных н научно- првктнческ их конференциях

3 Разработанная методика количественной оценки активности иеспе-щ[фическоЙ эстсразы и № ПНГНбирШЯШИЯ фторидом натрия применяет™ в Российской детской КЛИНИЧГСКОЙ бОЛЫНЦО и кячкпг ЭХЫЕСрНМСКТВЛЫЮГО нспзДВ При ДИ»П10СП1КС острых ЛсЛксгюО

Агфобацни диссертации. Материалы работы докладымлна» im заседании кафедры биофизики РГМУ 23 00.3006

Публикаций. По материалам/диссертации оиублнковамо 9 печатных работ,

OSiiCM и структура работы, Диссертация состоит in введения, ■ пшц выводов и списка литературы Pafitmi иэламоси» на ] (границах, иллюстрирована 27 рисунками и t таблицами Список лип'|>ятури кнлю-4JU.T 97 наименован Hfl, из которих 32 работы представлены па риском ИЗЫКС, я 65 iul йнгливском

Работа ИЫПОЛНСН* МП юфсдре пЫСШвВ ÉttlttlBMKR ГОУ ВПО РГМУ Рогадрава (вдедукщмП профессор, доктор фпШЯО-ттеммгическнх наук В Н. Акимов) и в цптолошчсскоП клнннчккоП лаборатории ГУ РДКБ Pocíapitim {ли№t"jty ю спин - кандидат медицинских ннук Л В БиЛ-дуи).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Парпара, Анатолий Анатольевич

Выводы

J Разработана методика количественной оценки активности леепеци-фнческой TcrejNCíu (НЭ) и ее ингибнроаяния фторидом натрии в лейкощгтвх нп мазке костного MOtjru средствами автомапинрояан-Holt внлеоцитометрии, позволяющая объективно оценивать результаты данной цитохимической реакции Для обеспечения воспроизводимости результатов при количественной оценке активности НЭ в качестве нормировки может быть не пользе вала средняя интегральная оптическая плотность вритроцитое. Оптическую илот-ноегь следует измерять опюсительио плазмы. Средствами микрокраски количественпак оценка может йровшитьен по зелёному каналу иогтной камеры,

2. Подобран набор параметров клеток, описывающих как иитенсив-кость реакции, твк и ее характер (гранулярность) Получена количественная характеристика, описывающая степень нигибиртвопия НЭ фторидом натрия (показатель нмшбиринш). Опрсделе-иы значения полученных показателей, характерные для нормвль-иого костного мозга, острого лнмфолейкоза, острых промщуюшь тарного и моиобласпюго лейкозо«.

3 По 1юлучеиным характеристикам наблюдаются выраженные раз-лнчия между острым промнелоцитвриым и острым Монобластным установлено, что для реакции на НЭ без долейкозами, что доказывает высокую информативность разработанной МеТОДИКК При ДнфферСИШ1ВЛЫ10Й ДНВПЮСТИКе ОСТРЫХ ЛСЙКОэов. Доказано, что в рнде случаев при остром промиелощггврном лсЛкоэе может наблюдаться нпгнбкрошш НЭ фтористом натрия ■I Получены спектры HíH.iuim'íiHM кдгток при цитохимических окраг-ках на мнслопсроксилаэу, гликоген {ШИК-реакцим}, фосфолшшды {судаи черный В] и кислую фосфатазу с докраской гематоксилином Майе pa Установлено, что дли реакции на гликоген измерений оптической плотности может производиться на длинах воли 560 и 600 им, для остальных реакций - на длинах волн '140 и 6Ш им, 5 Разработаны эффективные алгоритмы. 1геобходнмые для автоматизации сбора выборки лейкоцитов алгоритм автофокусировки, позволяющий автоматически получать «^юкуенроианиос изобра-жс|И№ клетки с надёжность» больше 99% и -фиктивностью, близкой к максимальной, алгоритм оценки толщины мазка, позволяющий автоматнчйскн оценивать пригодность данного места на мазке для сбора выборки клеток, и алгоригм автоматического перемещения по мачку, позволяющий собирать выборку клеток в оптимальной зоне, в том числе» при неправильной форме мазка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Парпара, Анатолий Анатольевич, Москва

1. М Наука, 197£ 192 с-|8| Каганец Г И . Котельников В. Af.r Гмъдберг В. Цито^кяомет-рия геыопозтических клеток. - Томск; Изд-во Том ун-та. 1986 232 с.

2. Луг.овсхал С- А Почтарь М, Е Гематологический атлас. М Триада. 2004 227 С.

3. Л/a-Tjyjj Э М. Тромбоцит Ц Ппофитлогш крови. Пер с англ. f Под ред Ф. Д Шиффман. М.-СГО-, 2000. - С. 156-161.11.4. Медовый В С Информационные ШТОНЮГОРОМННЫС системы микроскопии для анализа биоматериалом // Bjwч ч юирорм тег-нол — 2Ü0J С, 32 37

4. CtmrxtwtCKud Б 3 Методика к иримсигние автомапгзированиоП •fMI I |MVUuHtTplli: Анирсф. ДОС квид мед неук / M 2001

5. Dmda A h', Imagecytomfitry; a new tool for dbngnwia of glomerular hHematuria Ынт J Patturl Mtcr#btoL 2001 - Jan - Vol 44. no, I - Pp. 13-16.

6. GtortlU 1Г Originsof flow cytometry inapplications in oncology.

7. IDAS: Tlw Image Analysis Program IB AS 2000. Revision 4 4, 1986. -J one

8. SAME)A The cell tmage aniilyset for pathologists // Compcndium oq tbe Gomputeraed Cytoíogy niwJ llistology / lid by 0. L Wied. P H. Hartéis, D. L. RosenthaL, U- Sctienc*, Cbkago, 1991 Pp 368375.

9. Tha poesibilities of (he automated morphometry in the diagnosis oí the hyperlipopi oteidemia Morphometry III live diagnosis oí the hyperlipoprtrteideinjiMi. // Bumater Artif Cettt Ariif Organ* 1937

10. Vol 15, no-1- — Pp 137-149,