Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм уридиндифосфатглюкозы в запасающих компартментах клеток корня сахарной свеклы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм уридиндифосфатглюкозы в запасающих компартментах клеток корня сахарной свеклы"

российская академия наук

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ имени К. л. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ИВАНОВ Анатолии Алексеевич

МЕТАБОЛИЗМ УРИДИНДИФОСФАТГЛЮКОЗЫ В ЗАПАСАЮЩИХ КОМПАРТМЕНТАХ КЛЕТОК КОРНЯ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

03.00.12 — физиология растении

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена в Институте физиологии растений имени К. А. Тимирязева РАН.

Научные руководители: академик А. Л. КУРСАНОВ, кандидат биологических наук И. Л./СЕМЕНОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н . Д. АЛЕХИНА , кандидат биологических наук В., II. ХОЛОДОВА

Ведущее предприятие: Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН.

Защита состоится ,1993 года в 10 часов

па заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (К ,002.45.01) в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева .РАН но адресу: Москва, И-276, Ботаническая ул.,;35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН.

■У ,, МПП

Автореферат разослан «...¿5}...»..^.¿¿уха.¿л 1993 г.

/?

,1

Учепый секретарь / ~ ^ /

Специализированного совета ^ ' ^—

кандидат биологических наук /' Л. И. СЕРГЕЕВА

ОНЯАЯ ДЛРАКТКГКСГИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы усилился интерес к потребляющий гетеротрофным органам, поскольку от их акцептирующих свойств зависит распределение Фотоас-синилягов и в конечном счете продуктивность растений ( Doelilert, et.al., 1990 ). Известно, что универсальной транспортной Формой углерода у растений является сахароза и олигосахариды, синтезированные на ее основе ( Павлинова, Туркина, 1978 >. Включение сахарозы в метаболизм запасающего корня сахарной свеклы начинается с расцепления сахарозосинтаэой ( Лаплинова, 1971 ). Один из щюдух-тов сахарозосинтазиой реакций, уридиндифосфатгдюкоза ( УДФГ ) -универсальный донор глвкозильных остатков в биосинтетических процессах. Этот субстрат используется на образование элементов клеточной стенки.

В то же время не исключена возможность утилизации УДФГ непосредственно в запасаюцйх хомпартмантах растительной клетки(Наикег, 1085 ). В этом отнопении несомненный интерес представляют взкуоли сахаронакапливаюцих растений. В последние годы изучалась возможность использования УДФГ в так называемом векторном синтезе сахарозы ( см. рис.1 ) с участием сахароэофосфатсинтази в цепи сопряженных реакций на тонопласте запасающих клеток сахарного тростника < Thon, Karetzki« 1985 ) и красной столовой свехлы ( Thon, et.al., 1006; Voss, Heidner, 1080 ). В пользу существования гипотетического УДФГ-транслокатора свидетельствуют данные о наличии активной сахароэофосфатсинтазы в запасающем корне сахарной свекла ( Fieuw, Willenbrink, 1988, 1990 ), а такке сахарозофосфатазы в Вакуолярной фракции этого объекта (Hawker et.al.,1987;Kchevorrla, Sslvucol, 199i ). Поэтому изучение метаболизма УДФГ вакуолями сахарной свеклы представлялось весьма актуальным.

Пластиды является другим недостаточно изученным запасным ком-партментом растительной клетки. Весьма актуальным представляется изучение потока углерода в эти органеллы в связи с синтезом запасных полимеров < Heidt, et.al., 1881 ). В последние годы получены новые данные о транспортных формах углерода у пластид гетеротрофных клеток. Яа ряде растительных объектов показано, что субстратами для биосинтеза крахмала является не трех-, а аестмуг-леродные соединения - гекеоэофосфаты ( Тувоя, ер Rees, 1888; Keeling, et.al., 1988; Hatzfeld, Stltt, 1980 ). В то хе время

совсем недавно с помощью кинетического анализа в оболочке пластид сладкого клена был похазан аденилатный транслокатор, осуществляющий прямой перенос АДФГ из цитоэоля С Pozueta-Ronero, et.al., 1891 ). Н наконец, г> работах, выполненных еще и 60-х годах, была показана принципиальная возможность синтеза крахмала из УДФГ» что впоследствии было подтверждено для ряда растений ( Preiss, Levi, 1980; Sasaki, Kainuna, 1300 ).

Таким образом, в отношении транспортных форм углерода для пластид гетеротрофных клеток накоплены весьма противоречивые данные, которые, по-видимому, отражают сучоствованио у растений альтернативных путай переноса и синтеза веществ ( ар Веов^1887 ). Сопориенно на изучено,в какой Фйрмо углеродные сколоты поступают в пластиды эопасаюцего органа сахарной свеклы и каков механизм их переноса. Поскольку в клетках корня сахарной своклы обнаружено высокое содержаний уридиновых нуклеотидов ( Павлинова, Холодова, 1985 ), то не исключено, что УДФГ может быть одним из непосредственных субстратов в синтезе запасных углеводных полимеров.

Цель работы заключалась в выиснении особенностей нотаболизма УДФГ в специализированных запасающих коипартментах клеток корня сахарной свеклы - вакуолях и пластидах в связи "с возможный синтезом в них сахарозы и крахмала, соответственно.

В задачи исследование входило:

I. Проверил предположения о механизме векторного синтеза сахарозы с помощь«) гипотетического УДФГ-транслокатора в сахаронаг капливакщих тканях. РабЬта проводилась на изолированных из. запасающего корня маханнческим способом вакуолмх.

Z. Разработка метода выделения интактных пластид из запасаю-«его органа сахарной свеклы, пригодных дла поиска Транспортных Форм углерода в биосинтезе углеводных полимеров. Проведение кинетических опытов по включению в эти. органеллы ряда меченых субст-ратоп.

3. Выяснение возможности непосредственного использование экзогенной УДФГ в синтезе запасных полимеров пластид.

Научна а новизна.В результате проведенных исследований отвергнут постулированный ранее механизм векторного синтеза сахарозы в вакуолях важнейяей сахаронакапливавщей куяьту-ри. Установлено, что метаболизм УДФГ.в аакуолярной фракции из запасающих' клеток сахарной свеклы не связан с образованием сахарозы.

Из корнеплодов сахарной свеклы впервые выделены высокоиитакт-

ныё пластиды, чистоту Фракций которых оценивали по энзиматичоским маркерам различных клеточных компонентов. Впервые устаноилено, что изолированные пластиды метаболиэируют УДФГ со значительной, по сравнению с сахарофосфатами,скоростью. Показано, что продуктом синтеза помимо °£-1,4-глвкана ( крахмала ), является р-глюкан. Представлены экспериментальные данные, согласно которым синтезированный из Г р-глюкаи не накапливается а пластидах, а служит промежуточным соединением в синтезе крахмала.

Практическая н теоретическая значимость проведенной работы вытекает из расширения знаний о путях внутриклеточного распределения и метаболизма Фотоассимиля-топ в гетеротрофных органах. Выполненная работа важна для понима-КЗЯ механизма утилизации УДФГ пластидам», которые могут, вносить эхлад s величину аттрагируюцей силы запасающего органа сахарной сшзяды. В теоретическом плане определенное значение имеет предложенная для клеток запасающего органа гипотетическая схема биосинтеза крахмала из УДФГ. Использованные d диссертации методические разработки позволяют более детально изучать свойства специализированных эапасаюцих компартмоитоэ клеток сахаронакапатвакщкх куль+ур.

Апробация работы. Материалы диссертация докладывались на С-он Конгрессе Федерации Европейского общества Физиологов растений ( FßSPP ) в Сплите ( Югославия, 1308 «а 2-он съезда Всесоюзного общества физиологов растений в Минске ( 1990), на совместной конференции Ботанического общества и Общества физиологов растений Канады в Эдмонтоне ( Канада, 19S1), нг. XXI Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки ( Петрозаводск, 1988 ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, экспериментальной части и обсуждения результг гатов, заключения, выводов и спксса литературы. Работа изложена на 138 страницах, содерлит 2в рисунков, 1в таблиц. Список использованной литература включает 189 наименований, из них 28 на русской взыке.

-в-

ОБЬЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования были 3-4 месячные растения сахарной снеклы Beta vulgaris L., copra Рамонская 03. В опытах использовали растущие, зр<злые и хранящиеся корнеплоды.

Вакуоли выделяли механическим способом на специально мэготопленном релущем аппарата но Ли и Брентону ( Leigh, Branton, 1976 ), адаптируя этот метод для корнеплодов сахарной спекли. Среда выделения содержала 0,7Ь Н маниит, 25 мМ Hopos-KOK ( pH 8,0 ), 2,5 мМ дитиотрайтол. Очистку вакуолей проводили путем флотации органелл в ступенчатом градиеПте метриза-мида ( 1П-10-0Х ). Полученную фракцию собирали из мнтерфаэы 0/1DX и инхубировали в сродах, содорлащих 200 мкМ УДФ[14-С]-гл с удельной активностью 7300 №>к/ммоль. По окончании экспозиции вакуоли отделяли от радиоактивных сред принудительной фильтрацией через слой силиконового масла плотностью 1,08 г/см иа микрофуге при lOOOOi! d точечно 1 нин.

Для выделения пластид ткань корня гомогенизировали в среде, содержащей 400 мМ маннит, 25 мН Тркс-НС1 С рЯ В,0 ), 2 мМ ЭДТА, 0,1* бычий альбумин и 4 мН цистеин. Орга-нелли осахдалн при 5000g в течение 10 мин ( грубая суспеь^ия пластид ). Очистку пластид проводили центрифугированием в ступенчатом градиенте перколла при 3000g в бакет роторе ( 15 кии ). Плпстиди собирали из интерфазы 16/25% перколла ( фракция IV ) и, в занисимостм от стадии онтогенеза растений, из интерфаэ 25/35Х ( фракция V ) и 35/Ь0Х ( фракция VI ) ( см. рис.В.).

Для определения иктактности поду-чоиных препаратов пластид и степени их загрязнения другими клеточными компонентами использовали энзиматические маркеры: длн пластид - латентную б-фосфоглюконатдегидрогеназу ( Journet, 1887 >, для митохондрий - цмтохром-С-оксидаэу (Hodges,Leonard, 1074 ), для аппарата Гольдхи - латентную IDPasy ( Green, 10ВЗ ), для везикул тоноплапта и плазналенмы - Н^-АТФазу (Андреев и др., 1090 ), для цмтозоля - " растворимую" сауарозосинтазу с использованием радиоактивно меченых субстратов: УДФ[14-С]-глюкозы и [14 СJ-Фруктозы. Чистота выделенных пластид оценивалась и с . помочь» электронной микроскопии.

В кинетических опытах полученные фракции пластид инкубировали в 400 мкИ растворах [14-С]-меченых во-

Честя: глюкози, самрози, гх»;козо-1-Ф, глюкозо-в-<Ь и УДФГ с удельныли активностями 3600 КБ*/мноль. Дли построении кинетических кривых включения мичеиих субстратои из инкубационной сне с и через определенные промахуухи времени изгнали аликвота суспензии. Процесс останавливал» отделением органол от радиоактивны* сред дентрнфугнромшием чероэ слой силиконового наела плотностью 1,040 r/сн на мцкро<?уге при ЮОООй п течение 1 мин.

В опытах ее сведением после 30-мии инкубации пластид с удф[3.а-С]-1-^»козоа ( pulse) и отделения от радиоактивности принудительной фильтрацией через силикоиопий слой органоида инкубировали 1-2 ч в той za с.роца, но только но содорха-ЧВЙ иечонув УДФГ ( phase >. ..Процесс останавливали помещая образцы 8 вдпяцу» водяную бани на 3 мни.

Идеи т и и в о ц н в синтозированних продуктов во Фракция* вакуолей и пдаотнд проводили путем хроматографиронпния алнквот йодных экстрактов этих органолл по Маттиасу на бумаге líliatonn til ( расгооритедь: н.бутаиол-уксуснан кислота-иода -4:5:1, верхняя фаза } до и после 1-2 ч поздойстьия коинорчцских препаратов Ферментов ( 3 од/ил ): полочной фосфатали, кислой ин-вортазы, «¿--амилазы, «»¿-анилоглюкоэидаэы < Фириа "Serva" ) и грибной Jl-гдпкозидазн, подучонной в Институте биохимии РАЙ.

Радиоактииность разделенных вкцеств просчитывали с помоцыо аилкостной ецннтилдццкониай спертрофотомотрин. Расчет интенсивности включения радноал^ниных субстрато» р углеводные полинору проводили на иг ('.одна фракции органолл.

Эксперимента проводил»! в течение 1800-1880 годов. ¡»онторность в продолах одного опита 3-5~тикрат»1«я, результаты обработаны статистически.

РЕЗУЛЬТАТЫ Н ОБйУЯДКНКЕ

1. Научение цатаоолизмл УДч>Г во фракции иэолнропзнных mtxypxo/i в связи с поиском векторного синтеза сахарозы

1.1. Гииотатмчаский УДОГ-транслокатор тононласта сахаро-

накашшвакжих клеток Согласно предложенной Том и Марецким схеме ( рис.1 ), единственным субстратом для Ферментоп УДФГ-транслокатора на тоно-пласто клеток слхаронакаплкваючих растений слухат 2 молекулы ци-

Тонопласт

УДФГ-иирофосерорилаза

ГДФГ-

[фоефоглюкомутаза

■ ТЛ-6-»-L-

{фосфоглюкоиэомораэа

—-йР~в-Ф==-.

сохарозофосфатсинтпза

Вакуоль

Рмс.1. Предполагаемая модель механизма векторного синтеза сахарозы < УДФГ-транслокатор ) в вакуолярной • мембране

_САХАГ030~Ф_

сахарозофосфатаэа

—»САХАРОЗА ->Фн

Тестирование УДФГ-пирофосфорилаэной активности и рч-куолярной Фракции по аналипу моченого субстрата н продукта реакции о инкубационной среда А - исходный препарат УД4>[ 14-С]-гл г Б - ' после 10 мин инкубации 200 мкН УДФ[14-еЭ-гл с ва-куолярной фракцией, В - то же, что и В, но с внесением в инкубационную смесь 1 мИ ФФн,

Г - то же. что и В, но после 10 иин предобработки вакуолей 1 нН ЭДТА Под осью абсцисс указано местопожот хение оевеств-свк-дотелей. Цифрами указан X С14-С] в пиках

-э-

топлазиатической УДФГ, а конечный продукт - t молекула сахарозы, аккумулируемая вакуоль» < Thon, Haretzki, 10Ö5 >. УДФГ-пирофос-форилаза - первое звоно векторного синтеза. Фериемт локализован на внешней ( цитоплаэиатической ) стороне тонопласта и вовлекает УДФГ в пирофосфоролнтическое образование глюкозо-1-Ф, который, уже. будучи в мембранной фазе, служит субстратом для следующего этапа - фосфоглюкомутазной реакции. ФосФоглюкомутаза и ФосФоглю-коизомераза не имеют контакта с субстратами цитозоля. Сахарозо-фосфатсинтаза использует 2-ю молекулу УДФГ и вновь образованный фруктозо-8-Ф для синтеза сахарозофосфата. Сахарозофосфатаза -последнее звено мультиферментной цепи - локализована на внутренней стороне тонопласта и выводит продукты катализируемой реакции из Фазы мембраны в вакуолярноа пространство.

1.2. Тестирование УДФГ-пирофосфорнлазной активности на внеа-ней сторона оакуолярной мембраны

УДФГ-лирофосфорилазнуп активность тестировали по скорости метаболизацин субстрата < УДФ[14-С]-гл ) и накоплении продукта ( £14-С)-глюкозо-1-Ф ) реакции в инкубационной среде, то ость еще до вклочення метки вакуолям». Анализ меченых соединений проводили с помощью бумажной хроматографии.

Как показано на рис.2Б,сама по себе нетаболизация УДФ[14-С]-глюкоэц п инкубационной среде била вырахена довольно слабо и составляла не более 10*. При внесении в инкубационную сроду второго субстрата роахции - неорганического пирофосфата ( ФФн > ухе в кратковременных экспозициях ( 5-10 мин) происходило г;-дестиен-ноа перераспределение мотки на хроматограмме d единственный са-харофосфат, что свидетельствует о пнрофосфоролитическом превращении УДФГ в [14-С1-глюкозо-1-Ф ( рис.2 В ). Накопление в среде [14-CJ-глюкозо-1-ф было подтверждено и спектрофотометрически. Тестируемая реакция оказалась очень чувствительной к ионам Kg** предобработка препаратов вакуолей 1 нМ ЭДТА полностью ингибиро-вала процесс даже в присутствие ФФн ( рис.2 Г ). Поскольку моченый продукт реакции обнаруживался в инкубационной среде и не использовался на синтезы инутри вакуолей, то вызывала сомнение связь,обнаруженной УДФГ-пирофосфорнлази с гипотетическим мульти-ферментним комплексом. Более того, в присутствие ФФн включение УДФ[14-С]-гл в вакуолярпук фракции практически полностью прекращалось.

-1(1-

Рио.Э. НИиетмкп включения УЛФ[14-С1-гл а препарат ипоЛиро-ы-иших Ьпкуолей

1 - контроль.

2 - часть суммарной

|т диолкти .июоти - лилинорная фракций,

3 - послн 10 мин

продойрайотки иакуолярного препарата 1 Mil эдтл (суммарная рздяопктивностЦ

11) 15 20 ft|HíMя инкувации, ник

1 Старт

П

m

ШИ

■ 1' ¡X

ЩЩ

Рно. 4 , Радиоавтограф хро-иатограммы продуктоо превращения [14-С] -^гд в препарате вакуолей после экстракции 1* SDS

1 - стартовая точка,

2 - вецесСва хрома-тсгрзфическк подвижной фракция

10 20 Нр<1ни инкубации, мин

1.3. Включения УДФ[14-С}-гл в вакуолярную Фракция

Из рис.3 видно, что инкубация в 200 икМ растворе УДФ|;14-С]-глюкозы приводила к накоплению метки препаратом вакуолей. Процесс отличала прямо пропорциональная зависимость по крайней мер«

в течение первых 20 мин инкубации. После предобработки вакуоляр-

з*-

ного препарата 1 мИ ЭДТА в отсутствие ионов Ий наблюдалось резкое кигибированив включения метки. Процесс восстанавливался с внесением в инкубационную среду магния, но не кальция < данные не приведены ).

После экстракции синтезированных из УДФ[14-С]-гл продуктов холодной водой или этанолом значительное количество радиоактивности оставалось на старте хронатогранн. Это свидетельствовало о наличии в экстрактах, помимо ожидаемых продуктов синтеза сахарозы, также и высокомолекулярных соединений, В то же время, после обработки горячей водой или деторгентаииСIX SRS.1X Тритон Х-100), как и для вакуолярной Фракции из запасающих киоток красной свеклы < Voss, Weidner, 1988), наблюдалось появление 8-ти хроматографичееки подвижных вецеств, хорошо разделяемых о использованной смеси ра-творитолой ( рис.4, рис.5 л ). На их долю приходилось до 50% включенной вакуолями метки. Число выявленных нами веществ и их местоположение на хроматограммах приблизительно соответствовало предсказанному Том.я Марецким при функционировании гипотетического УДФГ-транслркатора. Вецаство III по хроиатографической подвижности оказалось близким к сахарозе.

1.4. Анализ меченых хроматографичееки подвижных продуктов

Поскольку образуемые из УД4>[ 34-С]-гл меченые соединения имелись в инкубационных средах в с ледовых количествах, то при их идентификации использовался прием обработки аликнот водных ваку-олярных экстрактов коммерческими ферментными препаратам«, гндро-лйэукцимм известные типы связей с последующим хроматографирова-иием полученных продуктов. В присутствие и-Фосфатазы но происходило появления новых ведаств, а также заметного перераспредолог ния метки между имеющимися продуктами хроматографичееки подвижной фракции ( рис.5 В >. Следовательно, эти соединения не являются фосфорными эфирами Сахаров. Исключение составлял пик I, который, по всей вероятности, содержал некоторое количество глюкозофосфа-тов. В то и время обработка накуолярних экстрактов к.инверта-эой приводила к значительному перераспределению [14-CJ на хрома-

Рис.5. Идентификация экстрагируемых горячей водой продуктов нетаболизации УДФ-Ц4-С}-гл вакуолярными препаратами А - контроль, без обработки ферментами, Б - после обработки

д.фосфатазоЙ, В - после обработки

к.инпортазой Над пиками указам 2 от суммы метки в хроматогра-> Фнчсскн подвижной Фракции. Под осью абсцисс дано поколение веществ-свидетелей

3 в 8 12 Расстояние от старта хроматограммы, см

тограммах ( рис.5 В ). Метка практически исчезала из зона слабой подвижности и полностью перемечалась в пики с высокой подвижность» - III < дмсахарид > и XV ( гексози ). Венество, сответст-вyoa.cn но положению сахарозе < III ), не только но подвергалось гидролизу, но ого количество,судя по метке, наоборот, увеличивалось почти пдпоо после обработки хроматографически подвижной Фракции икпортаэой. В ово большой степени в этих условиях выражено накопление веществ в пика IV ( более, чем В 10 раз ).

Представленные данные прямо свидетельствуют против векторного синтеза сахарозы из УД®Г на тонэпласте эапасаюцих клеток сахарной спекли. Полученные результаты можно интерпретировать в пользу способности вакуолей мотаболнзировать УДФГ, например, до гидролиэуоких.инпортазой олигосахдридов раФФинозного ряда.

1.5. Анализ хроматографически неподвижных продуктов Анализ природы синтезированных из УД4>[ 14-CJ-rii вечоств полимирней фракции, проиодонный путем их последовательной обработки

Таблица 1.

Идентификация синтезированных из УДФ[14-С]-гл вацоств полимерной Фракции вакуолей с помочью Ферментативного анализа

Использованный фермент

Синтезированное ведество

Его количество в X по отновонив к сумме внесенной мотки

с^-амилоглвкозидаэа Крахмал «¿-амилаза Крахмал

В-глюкозидаза . р-глюкан

кислая ннвертаза Субстрат инаертазм

25 20 42 10

Примечание: количество неидентифицированних соединений, не реагирующих на все использованные ферменты, составляет. 21-2331 от суммы полимеров

рядом гликозидаэ, представлен п табл.1. Видно, что основную доле продуктов этой фракции составляет гомополисахариди,синтезированные на основе глюкозы, поскольку около 703 меченых пецеств под-сергалось атаке со стороны «¿-1,4- и р-глижозидаз. В количест венном отношении среди синтезированных продуктов преобладал р-гл»кан ( 42Х ), чувствительный к грибной р-глюкозидаза. Весьма неожиданным оказалось присутствие среди продуктов нотаболизацин УДФГ полисахарида ( 25-233! ), чувствительного к действии «¿-ани-логлякозндазц и «^амилаэи. Поскольку синтез «¿-1,4-глвкана ( крахмала ) характерен только для пластид, то это убедительно свидетельствует об их присутстпнн как примеси в исследуемой ва-куолярноЛ фракции.

Незначительное количество метки исчезало со старта хромато-гранм посла обработки полимерной Фракции к.инвертазой. Возможно, это связано со способность» УДФ[14-С]-гл частично включаться в полимер типа Фруктана или в высокомолекулярные соединенна сложной лрироди ( гликопротаин, гликолипид, лактин-рецепторный комплекс ). -

Часть метк» ( охоло 20Х ) включалась в продукты иоизпостноЯ. природы.

Таким образом, препараты вакуолей, выделенные из запасающего органа сахарной свеклы механическим путем и подвергвиеся Флотационной очистке в градиенте мотриэамида.были загрязнены пластидами ( синтез ^-1,4-глв>хана из УДФГ - маркера этих органолл ) и.

возможно, плазмалеммой и элементами Гольд*и ( синтез р-глюканп из ГДФ Г ').

2. Изучение метаболизма УДФГ во фракциях изолированных пластид в связи еннтезои запасных полисахаридов

2.1. Выделение высохоннтактшх пластид из запасающего корня сахарной свеклы На рис.В схематически представлено фракционирование неочкявн-ной суспензии пластид в ступенчатом градиенте перколла из корнеплодов на различных этапах онтогенеза сахарной свеклы. В молодых быстро рпстуцих корнеплодах выявлены 3 популяции пластид, которые концентрировались в различных по плотности слоях пвркохла: 1.V25Z - фракция IV ( легкие ), 25/Э5Х - Фракция V, 35/50* -фракция VI ( тяжелые ). У зрелых корнеплодов 4-5 иес растений кохичяство пластид тиколой популяции резко снижалось. В хранящихся корнеплодах они исчезали полностью. Длительно хранящиеся ( 3-4 нос ) корнеплоды имели всего одну легкую популяций орга-нолл, близкую по плотности к митохондрии«. Различна в плотности выявленных популяций пластид скорее всего определяются прире. ,ой, а такхо количеством запасных полимеров. Полученные данные согласуются с результатами электронномикроскопических исследований Холодовой н Боляхиной ( i960, 1£83 ).

Необходимый критерием полноценности выделенных органелл считается и* интахтность. Этот параметр оценивался непосредственно о помочью электронной микроскопии, а таххе биохимически - по степени доступности экзогенного субстрата ( 6~фосфогдвконата ) для пластидной в-фосфоглоконатдегндрогеназы ( Journet. 1907 ). Не рис.7 представлены данные сгюктрофотометрического измерения латентности В-ФГДГ во Фракции легких пластид. Судя по отновенив скоростей окислении субстрата до и посдв обработки пластид D.05X тритоном 1-100, количество интактних органелл. дда которых недоступен В-фосфогхюконат, составляло,около 8ЬХ. Эта величина оказалась сродней из 36 определений и колебалась в прадедах 80-аах. Интактиость плвстнд более гялолых фракций всегда была несколько нише.

Кол-во поглощенной УД$Г н-моль/мин-мг белка

*3 3 ч •

а з ь

о п

ч " я

ч 3 ь» В

я ц л 15

а а 1 м

п. о ая

о

з 1 а

о ь

п аз

X Ф я

О

э

ц 1 л

О <я а

Я >4 3 =

» » X

1 »

Поглощение при 340 ш, %

1-1 < < м

ta о

о о

•g а гз о> о о я i п я «л ч ¡а тз О TUSO

с Ч В

a 5 a s я ч

я

s о

xt и п i, s •i я

SS

р» ?» ür ООН X S)

5 Ч О .

О » я

g о

в»®

OB » í

я Cu H

а X ч

п я г» о

4 я ч JM10 - -я 5 s

о а

О 3 f! ^

яо«

5 - а * п = л v. о а л с J к. о s ai с» ps

к. о a

е- i я !

S $

S \

V \ N

о О

I I

О * Ы X

в о и гз ansa

* я н г

«• О CS и

в: я к. я

h t» (5

Л п <? О о а

м

»

о «

• gl а а •a а

•5 а о «1 »о о а

•8 X

о

I- А О Ь)

Я ч ■

! О

О а «

•a s га тз

Р) X О)

¡1 1 U и >ч тз s с ч » х s

BS» о а X э а

3(D к X

я а в • Й <7 3

в Ц ш X 01

aus о s

та в а

о о Мт и Ч 43 » 3 ч Я 01

s о

Таблица 2.

Поглощение и метаболкзация моченых субстратов пластидами Фракции IV

[14-СЗ-Субстраты Поглоцено Метаболизировано

( 200 мкН ) нмоль/30 мин в X

мг белка

[14-С]-глюкоза 3,0 г

[14-С]-фруптоза 0 0$ '

[14-С]-сахароза 3,6 0

[14-С]-глюкозо-1-Ф 1,2 3

УДФ[14-С}-глюкоза 21 82

$ - степень метаболизации фруктозы оценивалась по инкубационной среде

2.2. Включение УДФС14-С]~гл и других радиоактивно меченых субстратов во Фракции пластид • Выделенные из корнеплодов пластиды обладали способностью к поглощению и метаболизации УДФГ. Концентрационная зависимость поглощения УДФ[14-СЗ~гл пластидами различных популяций, выделенных из растучего корнеплода, представлена на рис.8. В отличие ог гексоэофосфатов,процесс характеризуется четко выражении* выходом кинетической кривой на плато, т.е. насыщением, что свидотельст-вуег о наличии у пластид ферментативных систем, транспортирующих субстрат через меибранну» оболочку и/или нетаСолизн-русцих его. Заматиа тенденция снижения сродства этих систем, к УДФГ с увеличением плаиучей плотности органелл. Б области низких концентраций ( до 2,5 нМ ), наблюдалось некоторое иесоотвотстпие зависимости Неяазлмса-Нентан, что, поиидимону. связано с утилизацией УДФГ несколькими конкурирующими эиэинатическннп системам».

Скорость включения УДФГ в легкие пластиды оказалась на по рядок выве, чем у гжвкозо-1-4> - одного мэ наиболее вероятных субстратов синтеза крахмала в гетеротрофных клетках-( табл.2 ). Слабое включение гехсоэ и сахарозы в пластиды корне сахарной свеклы согласуется с данными, полученными на анилопластах иэ эндосперма 'клецевини ( И1егпук, 0епп1в, 1983 ).■ ■

Хроматогрефический анализ степени метаболизации поглоцейнмс субстратов показал, что-УДФГ практически полностью превращалась в углеводные полиноры.Степеньметаболиэацинглюхоэо-1-Ф оказалась очень низкой, а сахароза и фруктоза ив утилизировались вообце.

Таблица 3. '

Влияние обработки детергентом или осмотического аокировация пластид фракции IV на синтез углеводных полимеров из УДФ[14-С]-гх

Включение меченого субстрата

Обработка органелл -----'---------------------------------------

нмоль/мик на мг X от контроля

Контроль 0,640 + 0,040 100 '

0,Ii Тритон Х-100 0,037 £ 0,009 5.7 А 1.9

Осмотический иок 0,035 ± 0,005 5,3 А 0,8

2.3. Зависимость синтеза полимеров из УД4>С14-С]-гл от целостности оболочки пластид

Обработка препаратов легких пластид 0,1% тритоном Х-100 почти полностью останавливала включение УД4>[ 14-О-гл в состав углеводных полимеров < таба.З >. Близкие результаты были получены в условиях осиотического вока органелл. Оба воздействия оказались связаны с потерей нативности органелл, что контролировалось как визуально по осветлению суспензии, так и биохимически по. освобождению латентной 8-ФГДГ. Эта активность резко увеличивалась при осмотическом ноке пластид и ухе на возрастала при последующем добавлении детергента. Получение результаты свидетельствуют о том, что эффект осмотического вока и детергента на метаболизсШию УДФГ опосредуется преимущественно через транспортные процессы в оболочке пластид и, по-видимому, не связан с воздействием на "'ДФГ-глвкансннгазы. Таким образом,несмотря на казалось бы увеличивавшуюся доступность субстрата к утилизирующим пнутрнпластидним Ферментам при разргвенин органелл, наруаение мембранных лроцес- ' сов ингибирует утилизацию УДФ[14-С]-г*.

2.4. Идентификация синтезированных из УДФГ продуктов

Для хроматографи^еской идентификации углеьодных полимеров,

синтезированных из меченой УДФГ, как и с вакуолями, использовали коммерческие глюкозндази, обрабатывая ими препараты предварительно лизированнмх горячей водой пластид.

Из табл.4 видно, что после действия «£-амилоглюкозидазы происходили частичное перемещение радиоактивности со старта хрома

Таблица 4.

Аналнз нзченых продуктов включения УДФ[14-СЛгл в экстрактах пластид фракции IV с помощью глкжозидаз ( в X от суммы включенной метки )

Хромагографически подвижные продукты

Обработка•ферментами Поли- --- мери 1 2 3 Глюкоза

Контроль 70 в 5 5 8

•¿-амилоглюкозидаза 45 1 1 8 46

р-глюкоэидаза 35 1 20 26 20

сумма Ферментов 27 1 15 21 37

Примечание: 1 - олигосахаридц со степенью полимеризации более 3,

2 - то же, из 3-х остатков глюкозы,

3 - то же, из 2-х остатков глюкозы.

>ограми и почти полное из вадоств со слабой подвихностыа < 1 и 2 ) главным образом в глюкозу, По всей вероятности это явилось следствием гидролиза моченых »¿-1,4-глюканои, синтезированных из ьхлюченной пластидами.УДФ(14-С]-гл, Поело обработки препаратов пластид р-глюкоэидазой такхо отмечалась убыль метки со старта хроматограим. Однако в этом случае накопление радиоактивности отмечено как в свободной глюкозе,так и в олнгосахаридох с низкой степень!) полимеризации. После совместного действия глюкоэндаз наблюдалась более глубокая деградация хронатографически ишодвих-ных радиоактивных продуктов, чем после каждого из этих ферментов в отдельности.

Таким образом,срадн продуктов метаболизацяи УДФГ в пластидах нами обнаружены углеводные пожимери с o¿- и р-типом связей . Способность пластид к образованию ¡s- гликанов оказалось неожиданной, •гак как местом их синтеза считается плазмахемиа и аппарат Гольд-хи < см. Deleer, 1887 ). Однако выделенные на«Н Фракции пластид оыЛи свободны от указанных примесей, поэтому образование |1-глю-канов из УДФГ мы евнзываан непосредственно с изолированными из ■ корня сахарной соекли пластидами.

Оставшиеся на старте хроматограюш после совместного действия «¿-амилоглюкозидазы и р-гдюкозидаэы вещества. представлены главным образом гажактолипндами: моно- и дигалактоанлдиацилгли-церндами. Их идентификаций после специальной экстракции проводи-

-in-

Таблицп 5, •

Включений УДФ[Н-С]-гл в поликори пластид различних популяций и последувцев изменение и* холнчоствд во время слакпшш ( кмп/иин на мг аоякп органелл ) 1 «моль УД«[14'С]1-лйкозн = 1S00O нмп/мин

Попг*«-

ции пластид

Полимер

114-С] п полимерах во примени

30 мин включения I ( pulse) I

-------------------1.

120 ним слежпшш ( сЬллв >'

IV

»¿-глюкам р-глпкан пиколнпнды

«¿-гяпкан р-гликлн гликолипндн

i г í i z

OSZBft I 43 ! 9В100 I 59

37Я7П I 25 ! 23200 | 14

43520 1 31 ! 4МЮЛ ,1 20

70242 I Ы> I 108000 I ВО

21012 ! 1!» ! 1050 I 1

i 3223 ! зо i umao i зз

—........! -

----

I 7J I О I !

71

®¿~psosan р-глйкаи глнколипнды

69037,4

42022 57101;

i 41 !

! 2!> I

I 34 I

Í !

151200 0

0100(1

яи с помочь» двумерной тонкослойной хроматографии.

2.5. Возможная последовательность синтазл полисахаридов

в пластида* из экзогенной УДФГ Наиблое рлзпариугу v картин.» способности сиит<;.чн|*,1В.чн11«х меченых продуктов к дальнейшей метяболичзции даот подход,состойяиЯ в длительном слежении при сохранении условий предварительной ни• кубапии с субстратон. В табл.5 приведены даккич по включннив 100 ккМ УД4-1 Н-С)-гз»коэи в полимерную фракцию у трол популяций пластид, иэолированнше из корнеплодов вегетируюзих ряотрмиЯ, послодгряич еяежпт'вн. Видно, что за 3V мин период подачи УЯ+ £14-С)-гл С pulse) количество синтезированного моченого U-1,4 глакана прог^задало во всех пластидах к составляло около полчки им петзеств полимерной фракции. Неньве радиоективностк обнаруки палог.ь ъ р-глюкале, гп тем не менее иго додп Ь суммарно? поли мерной фракции была весьма ойцгтиной < до 25* ). Во время 4-х ча СОЯОГП СЛОЖЕНИЯ ( chime 1 проиг.хоякдо зпмгггно*.! ичмекоикс v ксли чегтт- ипчпкы* ::оодиноний, г.оторое затрагивало глцпным оброш» пояисахппиды. 1-:с:ли доли «¿-'1,4-гмжана уь'»*ичи|млмсь 60 YJX, то коли<я?стпг» f*- гдшкпна, imc»t«t4>trr, еннкплощ, н оогтняя.члм г им

Y

"сахароза

Цнтозоль

Vue.О. Предполагаемая модель биосинтеза крахмала из экзогенной УДФГ через промежуточное образование р-глюкана в строме пластид

1 - сахароэосиитаэа,

2 - УДФГ-транслокатор в оболочке пластиды,

3 - АДФГ-пирофосФоридаза,

4 - крахмалсинтаза,

5 - ФФн/АГФ-транслохатор, * в - АТФ/АДФ-транслохатор

пулнцик "легких" пластид 14Х, а у "тяжелых" органелл этот глюкан исчезал полностью. Количество меченых глнколипидов в отсутствие подачи экзогенного субстрата практически не изменялось за время слехсния.

Опиты со слежением, выявившие заметный сдвиг в количестве полисахаридов двух типов, позволили предположить, что синтез одного из них ( «¿-.1,4-глюкана ) происходил за счет использования продуктов деградации другого ( р-глюкана ). Синтезированный при этом р-глюкан не накапливается в значительных количествах,а служит лииь промежуточным соединением в образовании конечного продукта - крахмала. Продетаеденная на рис.9 схема, может отражать на наи взгляд,один из путей переноса углеродных скелетов иэ ци-тозолл дли биосинтеза запасных полисахаридов у пластид сахарной свеклы. -•

Физиологический смысл образования р-глюкана в пластидах может состоять и в Быстрой утилизации избытка иэ цитоэоля УДФГ -продукта сахароэосинтазной реакции, весьма активной в корне сахарной свеклы ( Лавлинова, 1971). Важное свойство этого полимера состоит в высокой скорости его синтеза, транзиторном характере в метаболизме пластид, & также в высокой скорости деградации. Все эти свойства сближают выявленный нами р-гл»кан с известным

внеиитоплазматическим р-глвканом - каллозой. Дальнейшая работа

позволит полнее раскрыть роль пластид сахаронакапливающих гетеротрофных клеток в образовании этого продукта.

В И В О Я Ы

1. П изолированных из Корня сахарной свеклы вакуолях не найден постулированный ранее для сахарного тростника и красной столовой свеклы гипотетический УД4Т-гранслокатор - мультифериент-ный механизм векторного синтеза сахарозы-

2. Исходный фермент гипотетического векторного синтеза' сахарозы - высокоактивная УДФГ-пирофоеФорилаэа выявлена при внесении в инкубационную среду ФФн. Фермент локализован на поверхности вакуолей, но, по всей вероятности, непосредственно не связан с синтезом сахарози.

3. В отсутствие ФФн УДФГ14-С]-глюкоза включается в рнд низкомоле-хуллрных соединений, а такхв в углоаодние полторы. Эта нога-Болизация в основном обусловлена наличием дахо в очнценной , вакуолнрной Фракции пластид в качество примеси.

4. Предлолен метод выделении и очистки из запасающего корня са-• харной свеклы высокоинтяктных < до ЛОХ > пластид, . которые,

судя по энзиматическим маркерам, не содержали примеси цитозо-ля, вакуолей и плл.чмалеммы. Загрязнение митохондриями и компонентами Гольдки составляло не более 5*.

5. Из растущих корнеплодов подучены несколько популяций пластид, которые отличались по плавучей плотности в градиенто перколла: легкие ( содержащие хкры? ), средние и тихолые ( храхмалонос-ныо? ). В зрелых корнеплодах обнарухены только легкие орга-коллы.

в. Пластиды всех популяций утилизировали ТДФИ4-С]-глюкозу с образованием 1,4- и р-гхюканоп, а также гликолипидов. Синтез р-глюкана не связан с загрязнением пластид плазмалемной или компонентами Годьдхи.

7. Синтез глпканов обоих типов протекает без образования проме-' хуточных продуктов ( гексозофосфлтов ) и Прокрачются при кару пении целостности пластид.

О. В опытах с кваитой субстрата < УЛФ[14-С1-глпкоза ) при послп-

, -22-

дунжам слежении о5и ару юн аанвпшЯ сдвиг в соотновенки глкмл -нов в сторону нахопжсжиа аС-1,4-глвкана, Синтезирований Ji-nv>xaH на накапливается в пластидах, а, по-видимому, служит промежуточным продуктом в образовали» запасного крахмала. 8. Для сахарной ссакли предполагаете« новый путь синтеза углеводных полимеров с участием УДФГ-грьнслокатора, локализован- ] . кого а оболочке пластид, . v

Список работ, опуЬлчюьашшх но тоне диссертации

1. Соиеноп И,i.^ Иванов A.A. К. вопросу о сопрвженни синтеза сахарозы и момйраниого переноса УДФГ в . ьякуодах запасающего корна сахарной спекли /Г Регуляция ферментативной активности у растений, 1я80, Горький, над ко ггу, с;бз-£в.

?., Иванов A.A., Семенов к .Л. Иотаьояиаи УДФГ в иаолигюваниих вакуолях нгтасоящогп корни сахарной сиоклы // Теаисы докладов III 1)сого»:шпй конфероицнм молодых ученых, по физиологии растительной кяоткй, ИШ8, Петрозаводск, с.65. - .

3. SbbddoV I.L., IvnnoV A.A. Hetabolisn of UOPGIc in innlated vunuolim fron Miißnt bort tup-root // Ahotreot of f>-t|j ßongrcRS of tli« Peíliífatioii of Кигиропп Snc. юС Plant Phyninl., 11)80,Bplit, Yugoaltiviu, Р.4Й4.

4. CdMOHO» И.л"., Hмшив A.A. D реализации приисл-о точения сихцро-, nocMHTd.'iHoft реакции « злнисаюцен корне сахарной смокли // Рогужц-цин фирмантнгнннойг иктипноети у рисгоннй, МЯО, Горький, иэд-ио ггу, fc.2h-31. ,

б. Сомоноп У.Й., Пватт A.A. иотабожиам УД4Г в шжуолнрной фракции из ипннешецог» корпя емхаркой свеклы // Физиологии растоний, ИМИ . Т.30, тдн.1. i:.l2t|-iya.

П. Иипнон A.A., CoMHH'iti lt. д., Тимошша D.U. Ьидолиниа и некоторая ха|>.1ктгл>чг-гкка цллсткд ю •шшлающого корня сахарной сникли // Фиякслогкк рпг.гоний, 1001, т.30,- »üii.ij, с!нВ4 073. : V. ,Se»«¡ir>v 1.1,., Ivntjuv A.A. 1ШЧ} -nutabo 1 ¡un in atarutff" coepart.-»oiitij of RHifor hrttil. taproou pal'lr; // Abatruutn of Joint НяшЛщ? : оГ C.H.A./C.Ü. Г .H. , J0!H, 'Thw Unlv.of Altiartn. Kdeonton, Cariad«, Р.Й4. ' .

в. Иванон A.A., Сини»'« И,Л., Парамонова H.i». , Сопим А.И. Мета -ПоМзн УДФГ во фракции идаш-^д из занасаюнего хорнн сахарной счвклы // Тозмод дпклздоп нторого г го ид;, Ксесовзноги общостча