Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм пуриновых и пиримидиновых соединений и опухолевый рост

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм пуриновых и пиримидиновых соединений и опухолевый рост"

0 3 9 1

государственный комитет ссср

по народному образованию

ОРДЕНА ДРУЖГ.Ы ПАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖГ.Ы НАРОДОВ имен» ПАТРИСА ЛУМУМПЫ

11.-1 правах рукописи

УДК ()1(»/|2/1—080:(И2.017.1

ТИХОНОВ Юрпн Владпмнроппч

МЕТАБОЛИЗМ ПУ1МШОИЫХ П ПИРПМПДИПОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ОПУХОЛЕВЫЙ РОСТ

(03.0(Ш — биохимия)

а в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в отделе биохимии НИЧ 2-го Московского ордена Ленина Медицинского Института им. II. И. Пи-рогова.

Официальные оппоненты:

чл.-корр. АМН СССР, доктор медицинских наук, профессор Б. Ф. КОРОВКИИ

доктор биологических пауз;, профессор Г. А. ЯРОВАЯ доктор биологических наук, профессор А. А. КОНДРАШИН

Ведущая организация — Московская медицинская академия им. И. М. Сочсшова.

Защита состоится «............» .................................... 1992 года в......часов на заседании специализированного совета Д 053.22.02 при Университете Дружбы Народов им. Патриса Лумумбы по адресу: Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8. Медицинский корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ордена Дружбы народов Университета дружбы (народов им. Патриса Лумумбы по адресу: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 0.

Автореферат разослан «............» .................................... 1991 года.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук, профессор

В. Э. ТОРБЕК

ер )т-;;л

тдел иссергдцкм

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблей*

Раетсритие биохимических механизмов взаимодействия организма и опухоли принадлежит к одно{1 из сгзыих актуальннх проблем товреиенноЛ биологии и медицинц. В первую очередь ото связано с тэм, что г. целостном организме неопластическая трансформация ткани приводит к многочисленный нарушениям метаболических звеньев обмома погреть и энергии в органах, и тканях, непосредственно не затронута! опухолааии процессом, что, ц своь очередь, обуславливает нпрумешт тканевого гомеостаза. Необходимо отметить, что советским ученые принадлежат приоретет в развитии общих подходов и кок-цеп цгЯ к ргз7лгпго метаболической депрессии, вызванной системным влиянием опухолевой ткани на организм и его защитных реакций (Р.Е.Кьпец'Аи!'!, У.УП, .1902; В.С.Шапот, 1975; В.М.Дильиаи, 1083; Г.И.Потапсва и В.С.Шмот,198?).

К настоящему времени получено много дачних о рааносбрязкшс нарушениях об иена веществ, возгопс&кгдех. под шылниим опухолевого процесса. Эти нарупения затрагивают белковый, углеводной, липидшй,

ВОДНО-ЗЛОКТрОЛИТНИЙ И ДруУ'ИО ВИДЫ ССМвИа (Е.Т.Ипуа, 19711 У.З.ЗЬе.ро1, 1979; Я.Йог,е! а1. , 1902). КрОМО ТОГО, В ОПУХОЛЕВОМ

организме наступают специфические изменения в таким, системах, кик реТИКуЛОЭНДОГеЛИалЬНаЯ (й.т.'песег& О.СХпгк, 1961), эндокринная (Е.М.Саиувдд&н, 1973; В.М.Дильиан, 1384), иммунная (Ю.А.УкансыгЛ, В.Г.Пинчук, 1582; В.В.Городилова, М.Н.Воела, 1583) и друг'/л. Другами словзми, метаболическое давление спухолн, окаЕинземос на Функциональное состояние различных систем организма приводит к разнообразны;.! растроПствам тн'остаза, ускоряюцу.м, а во многих случаях и опредклягащш латалышй исход.

Полученные к настоящему времени результаты позволяют оЗсуждатъ конкретные биохимические механизмы взэимодейсгшя опухоли и организма, однако, необходимо отметить, что изучений процессов, протекающих в оргакизме-опухоленосителе на молекулярном уровне находится в начало саоого пути. Дальнейшие исследования в этом направлении цогут иметь большое значение, для понимания этиологии и патогенеза "раковой болезш", а таило для разработки путе!' резистентности организма к развитшанеоштзш (Г.Е.Кэвецкий, 1982),

В ряду систем, ответственных за сохракяшо гсиеостаз«

целостного организма, одно из ключевых иест принадлекгг ферментный системам обмена пуриновых и пиримидиновых соединений. Выполняя "замечательное разнообразие функций" (А.Лешшдкер), oini прншшают участие почти во всех видах обмена, являясь предшественниками нуклеиновых кислот (ПИК), пронеяуточными продуктами биосинтеза углеводов и липидов, компонентами основ1шх коферыентов и переносчиками свободной энергии. Sa последнее десятилетие накоплено . много дашшх о физиологических и регуляторных функциях нуклеотидов и их пронзиодних ' в контроле пролиферзтивной и функциональной активности клеток (t.hoví et ai., 1977)• Особешо пристальное внимание уделяется исследованиям особешюстей обмена пуриновых соединений в лимфоидной ткани и иммунокомпетентных клетках, в которых ои1 играет ретапцую роль в регуляции пролиферации, дафференцировки и осуществлении • функций (С.Н.Храмцова с coaBT¿, 1984,1986; Л.И.ССилановская с соавт., 1987; a.Fetcrs & j.h.Vbbi"

kamp, 1<<-аЗ; A.Cohen & J .Baranfciewicz, 19B6).

Известно, что развитие неоплазмы сопровождается персстройной Функционировать ферментных систем обмена ПИК в самих опухолевых клетках, связанной с резкими изменениями потенциальной активности ферментов биосинтеза нуклеотидов de? novo, реутилизации иуклеозидов и азотистых оснований, а гакяе ферментов их катаболизма (В.С.Шапот, Г.Л.Потапова, 1986; и.ирьег, 1977,1903). С другой стороны, в ряде работ Сило показано, что в ткапях организма-хозяина выявляются нарушения нуклеинового обиена, изменение характера биосинтеза предшественников нуклеиновых кислот, особенностей транспорта через плазматические мембрана различных клеток и дифференциальной ЧуВСТВИТеЛЬКОСТИ К НуКЛеОЗИДаН Ц ОСНОВаШШи (R. Basorga It U.E.Risieleski, 19Í.1; T.Sirasaki & S.Fujit, 1975). ОДНЭКО фраГМЗЦ-тариость этих исследований не позволяют провести как систематизацдо знаний об особенностях содержания и метаболизма нуглеотпдов в тканях, так и комплексную сценку нерусский пуклапнопого обиешз в организме при канцерогенезе.

В то ке время, сопоставление особешюстей нуклеинового обмена в самой опухоли и тканях организма-опухолсноситоля позволяет выяснить N . характер их взаимодействия и определить конкретные иеханизш, благодаря которым каздал опухоль irpe обротает мзтаболкчеекпо преимущества для ее роста (В »(¿.Сапог a Г.И.Потапова, 1986).

Подобный подход нуждается в определении начальных,

промежуточных н конечных субстратов слохных ыктзболичесгаи цепей 15 различных ткаш1Х опухолевого орггкнгиа, а такхе транспортах характеристик пурннових и пнрихшдановых производных в сопостгтлел/л с активностью фериентов их метаболизиа.

Цель и задачи исследования

Цель работа заключалась в изучении обмена пуриноеых и пиртыдипових соеданеииЯ в органах и тканях организма на разных стадиях развития опухолевого процесса и роли иютканепого сопряжения их иетаболизыа и транспорта, опосредуемого эритроцитами крови, в системе становления таииоотноюзннП "опухоль-организм".

Поставленная цель включала в себя решений оледувдо. коккротних задач:

1 - разработку и оптимизации различии"/ методов виоог.оп.фК'ктаиноЯ

жидкостной хроматографии (анмонообмакьсД, обращьшю-^з^коИ п ион-ларноЛ) для анализа качественного и количественного состапэ свободних иуклеотидов, нуклесзидов -л азотистых оснований в биологических образцах.

2 - выявление оснопннх оеобешюстеЛ формирования пула иуринових и

пнртшдиношх ссхздннйниД в печеш и аритровдтох кропи имлей, соответствующих начальной, экспоненшальцсй и стационарной стадияы роста гепатоиы 22, а также асцнтноД опухоли Эрлиха.

3 - исследован?,m динамики интенсивности пкдучеиик иечепнх пуртюшх

и гшримидиноиих нуклесзидов и их оснований ь печень л эритроциты в условиях i. л vivo и i'i vi tro с помои£ью радиолзотошшх н зрсиатогркфмческнх методов исследования с применением проточного радиоизотолного детектора.

4 - изучение тканеспепифичности нуклеотидного состава гялатош 22

в процессе ее развития с пю/гацыо хрсиатогра&гтсских м радионзотопних иетодов исследования,

5 - псследоватшэ характера взаиыоотпсившй меяад раэлмлгаши стадиями.

роста гепатомл и регенерпрущей; после операции частично? гепатэктоыин печенью на уровне? пуршгзвого обмена н сспсставлчнчн с иорфологачосктш ;(а р шет е рис т л к в им прагшферации гопатоцитоп.

6 - изучение основных закономерностей чнтешжгаости транспорт

пурннових соединений в лимфоциты типуез и селезенки юяаей ü

процессе роста гелатомы на основе разработанной формулы расчета метаболического потока соединения в системе

"йрИТрСЦИТЫ-ТИМСЦИТЫ" В УСЛОВИЯХ in vivo.

7 - анализ изменений в метаболических потоках пуриновых соединений из эритроцитов и лимфоциты in vitro, выделенных на разных' стадиях роста геяатоыы, с помощью проточного радиоизотошюго детектировашг в высокоиф1®ктивиой жидкостной хроматографии.

Научная новизна работы

Впервые предпринято систематическое исследование закономерностей обмана пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, нуклеозидов и их оснований в различных органах и тканях организма с опухолью, а также в ткани солидной гепатоыы 22. Для этого били разработаны различные методические подхода к анализу как всего пула ПНК, так и отдельных групп этих соединений в биологических образцах с помощью использования ион-паршах реагентов в ВЭЖХ.

Впервые получены детальные качественные и количествешше характеристик;1, ¡¡улов пуриновых и пиримидиновых производных в печени, эритроцитах, тимоцитах и спленоцитах организма-хозяина в условиях возникновении и роста злокачественной гепатош 22 и асцитного рака Эрлихй. Показано, что различным стадиям развития опухоли сопутствует глубокая перестройка Акционирования ферментных систем обмена пуриновых и пиримидиновых соединений в тканях оргаш!зма, что выражается в резких изменениях состава ШК и характеристик интенсивности транспорта метаболитов о эти ткани.

В работе впервые обнаружена "активация катаболизма пуринов в печени животных в экспоненциальную стадии роста гепатош, что сопровождается возрастанием концентрации проме^'точшх пуриновых метаболитов в ткани печени и, одновременно, в эритроцгггарной франции крови, которые активно ' аккумулируют пуриновыа пуклеозиды ' в основашш. Сравнительная кинетика включения иеченыхпуридов в .печень и эритроциты крови в процессе роста гепатомы подтверждает зто положение. - * -.

Получены новые данные •о роли эритроцитов, как транспортной система переноса ШШ между органами и тканями организма. В -период максимального роста опухоли из состава эритроцитов исчезаэт ключевые метаболиты пуршювого ряда. В то же время, на всех стадиях роста сак солидной гепатош, так и асцитного рака- Эрлнха в эритроцитах

прослеживается одна и та же закономерность: и^конж.нис фо сформированных форм аденшюьых и гуанинсвых нуклеоти до;», связанное с активацией пуриновых ¡стаз.

В работе получены новин данные об особенностях шггаболнч* скогс пула пуриновых и пиримндиновых соединений в ткани растущей геплтоны. Показано значительное повшение фонда гумшнорых нуклеотадоп с-одновременный дефицитом аденилатов, a Taiaj активное аикуиулированио клетками гепатомы пуриновых оснований из крови.

Впервые была исследована •• экспериментальная модель регенерирующей печени после операции частичной гепатгктсиии, выполнешюй на фоне роста опухолевой ткани. Эти позволило вилннть закономерности <1>ормировашш нуклеотидных пулов, как в ткянм. г.очеки, так и в эритроцитах крови гивотшх, соответствуй!'!'!! ачтипации и подавлению пролифератюшой активности гепатоцитов в экспскен/рнкг.ьную и стационарную стадии роста гепатомы в оргаш^зми-опухолокосятолс:.

Разработанная формула расчета метаболических потокоь сс^-дикет'й

ИЗ ЭрИТрсЦИТОЗ В ТИМОЦИТН Я СПЛеНОЦИТЦ В УСЛОВИЯХ ir. vivo 0 ПОМОМ',!.»

импульсного введения меченого соединения позволило излучить характеристики транспорта пуринових нуклесюидов и опм-.лэний, вклмчаигцш в с«бя обратно пропорциональную заг^сиыосп, мелду интенсивностью транспорта гзшогссаитина а тимоцитн и «го внутриклеточной концентрацией в экспоненциальную стада» рост и гепатомы. Длл инозина это соотношение было пряно прэпорцаончлыпдм.

Пр".пщи1шально hobuu является разработанной подход п анализу метаболических потоков соединений мехду различшии клетками с немощью применения проточного радиоизотопг.ого детектирования в ГШЯ. Впаргшо били паПдезы закономерности обмена пуринов в тимоштах и эритроцитах .крови в условиях, опухолевой прогрессии и показан; нэли'ше сопряженной системы транспорта и обмена пуриновых соединений между крьегаагл клеткаш крови и лимфоцитами тонуса, поскольку аккумулированная в эритроцитах метка Сила зарегистрирована т, •пшоцнтах после их ссгшпстной инкубации с ■. эритроцитами, причем в боль-лей степенна виде аденгашшонофос?'£Орной кислоты,'

В результате проведенного анализа , особоняостей формкровиш;; тканоспеци'2гэттолх пулов свободна ШК, и их транспортных характеристик сформулировано представление о функциональной системе мезетканс-^ег, сопряжения иетаболизма пуриновых и плр/лгадШсшх производи», которая включает в себя альтернативные пути их биосинтеза («м- по-/., и

Е^Пу^дц), катаболизш ^-^мюрт а м утилизации и функциошфумцая б рьяшя гомеостааа.

Научно-практическая значимость работы

Работа представляет ссбсЬ экспериментальное исследование закономерностей наруиышй нуклеинового обмена в тканях опухолевого организма. Практическое значение ими ют разработанные хроиатографичеекие методики оптимизации разделения свободных ГШК в биологических образцах, с учетом тканевой и клеточной специфичности состава пуриноиых и 1шрю.мдикошх соединений. Полученные дашше раскрывают одно из звеньев метаболических нарушений при канцерогенезе, и иохут быть использованы для разработки ношх лрл;и;шюь терапии злокачественшх новообразований с помощью естествешшл метаболитов пуринопого и пиримвдшового ряда и аапраьяошшх на регуляцию и коррекцию ферментных систем обмена ПИК в тканях организма и, особошю, иммунокомнетентных орх'анах.

Основные положили, выносимые на зап?1ту

1. Формирование пуршютого и пяриыидшювого пула в печени и гепатоме 22 в процессе со развития в организме обнаруживает тесную взаимозависимость, опосредованную эритроцитами крови, что приводах к качественному я количественному перераспределению состава свободных продаестьенникоп ПК в отих тканях, вклшаюцему в себя:

- активацию биосинтеза гуанглговых. нушгеотидов в галетках гепатомы с од'лоъреыетвы дефицитом адош1латоа (особенно атр ), а такге резкое УБеяачсгае концентрации пуринових оснований, связанное с пснжаююй акиумулкцтЧ ояухолаЕтм клетками адетша, гуакша и гипоксаитина из крови органазма-хозяюта, что укэзыват на специфический характер сииана пуринов в опухолевой ткани.

актиьацк» катаболизма пуринов. в почешу кзшотных в окспоиекциаяьную стадии роста геп&тош с одаовремзшшм накоплением инозина, гипоксантмна, ксашина I! мочевой ¡агслоты к 3-й суткам.

- возрастание концентрации идешшових и гуашшових пуилсотвдов в эритроцитах крови на всех стадиях роста гепатомы.

- резкое увеличение концентрации пуринсвых нуклеозидов 1» оснований ,в эритроцитах в первые трое суток роста гепатомы. . • -

- истечение эритроцитов пуршювши нуклеозвдами и основаниями' к моменту достиденил ¡тетками гепатоиы ыа:;с:^альиой скорости роста

(5-7 сутки после инокуляции опухолевых клеток)-

2. экспоненциальная стадия роста гематомы 22 приводит i подавлению пролиферации гепатоцитов через 42 часа после операции частичной гепатэктомш$^ вызывает активами» катаболизма п/рунсил тгуклеотидов в регенерирующей печени. Стационарная фаъа рост? гепатомы 22 стимулирует пролиферативше процессы а ригонорирушоЛ печени и активирует биосинтез аденляовых и гуаняноних нуклеотадов. Частичная гепатозктомия, вшюлиешая на 5-ые сутки роста гепатомц вызывает увеличение концентрации пуриноьых нуклесшщои п эритроцитах крови ммшеА-опухоленосителей. На 12-и'з суты*. рост& опухоли в эритроцитах резко снижаются концентр/н^ш г у.пшноиих нуклеотидов и ivip и возрастают уровни содержании м-, ш.озина и аденозина.

3. Функциональные и пролиферативше изменения а лиш^цн'тх тимуса и селезенки мышей сзна в процессе рос;та гематомы 22 сопровождаются значительными изменениями внутриклеточного метаболизма пуринов, характер которого, в свои очередь, здвискт от транспортных характеристш? in vivo иуклеозидов и оснований. Ряибаюе внралетше изменения транспортных характеристик были наАдены г, клетках тимуса в 1-5 cyízcH роста опухоли и вклпчалн:

- резкую- активацию интенсивности транспорта пшоксактин» в тимоцити на 3-5 сутки роста гегатсмн.

- обратно пропорциональную завишмость меаду интенсивностью транспорта гипоксантина в тимоцити и его внугрти^леточноП концентрацией и прямо пропорциональную зависимость о тих показателей для инозина в экспоненциальную стада!» роста гопатош.

4. Метаболические потеки пшоксантилз а его ■ промзкодних. аз эритроцитов в лимфоциты чимуса сопряжены с реакциями утилизаци/ пуринов '•ия1у.;»де"-Ф,с'рментвми гимоцлтой и кий ют шражеглгую зависимость от стадии роста опухоли и организме.

5. Ка уровне целостно!1© организма существует система меатканевого сопряжении метаболизма ,. свободам предшественником нуклеиновых кислот, включающая в себя 'альтернативные пугл биосшя'йз^ (de nove и "Saivnq»"), катаболизма, траиепорта и утилизации нуклеотидов, нуклеози^.ов и их оснований, фупкц^ллгруюгдая в гомеостаза.

Апробация работы

Материалы дассергации докладывались на I Всесоюзной конференции "Хроматография н биологии и медицине" (Москва, 1983), III Всесоюзной симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Рига, 1984), v Возсоконом биохимической съезде (Киев, 1985), v Международной Дунайском симшхш.-че по хроматографии (Ялта, 1985), Международном сштоЕиуме "Хроиато1рафия в биологии и медицине" (Москва, 1986), iv Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Алма-Ата, ■ 1987), X Международном симпозиуме "Еиоиедицинское применение хроматографии и электрофореза" (Прага, 1988), Мевдукародноа симпозиуме по гипоксии (Берлин, 1988), Научной конференции Института , биохимии Берлинского Университета ин.Гукбольдта "Метаболизм нуклеотидов и его применение в биоиедицииских исследованиях" (Берлин, 1988), viii Всесоюзной стлюзиумо по целенаправленному изысканна лекарственных вецеств . "Компоненты нуосиновых кислот" (Рига, 190Э), vn Меаднародиом Дунайской симпозиума гю хроматограф:;:: и • электрофорезу (Лейпциг, .1909), Xu Мездупзродноц симпозиуме по структуре и функции аритроцитов (Берлин, 1989), xt 1!ездународаои симпозиуме "Биомедицинокое применение хроматографии к электрофореза" (Таллин, 1990), y Есесомзноц симпозиума по ыолекуллрпо2 жидкостной хроматографии (Рига, 19Э0), 7-м Мездуиароднон симпозиуме "Пурииошй и шрЕыидановый ивтаболизм у человека" (Бониас, Англия, 19Э1).

Публикации результатов исследования

Пс теме диссертации опубликовано 45 основных работ, в том числе 21 работа на английском языке. Получено з авторских свидетельства па изобретения.

. Объем и структура работа

Диссертация состоит из введеш!я, обзора литературы, глава "Материалы и методы исследования", Б глав • экспериментального материала, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена im 20'1 странице, включая 23 таблицы и Б71 . рисунков. Список литературы содержит 54 отечественных и- . ISS зарубежных источников. . . •

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на мыиах-самцах линий сзил/Кч и к;:< массой тела 18-20 г. В качестве эксперименталышх моделей опухолевого рос.'а применяли сингенную солидную гепатому 22 и вицитную опухоль Э/злша. Штамм гепатомц 22 трансплантировали под коасу спмны мшдей сгнл по 0,5-1,0 * Ю7 клеток в 0,5 ил раствор» Хенкса и поддержи.зш сингепными перевивками. Асцитну» опухоль Эрлиха инокулирсьолп и бршную полость интактных мышей линии ш.. Операцию частичной гепатэктомии проводили на шшах с;на по методу ih.Qg.uib ь йпо.-гул (1931).

Все исследования проводили на 'сроках, еоо'лйгетвущлх начальной, экспоненциальной и стационарной ста,дом роста опухолей. Забой гивотных проводили путем докагшт.щли или дислокации й шейшх позвонков. . Материалом для экспериментальных иг.с/.едоыший служили печень, эритроциты и плазма крови шмшй, а так»:' тимус, селезенка и лимфоцита периферической крови. Суспензии тимсявгрнц н спленсцитов готовили в непритертом стеклянном корнчц^ком гомогенизаторе и центрифуп»ровали в градиенте фшадлл-аерогргфшэ (р=1,090 г/ил) при 400 ч в течеше 30 ими.

Киелотораствсришк) фракции (КРФ) исслодонашгых органов н клеток получали методом однократной экстракции 0,6 ы хлорной кислотой с последующей нейтрализацией сулернатантэ кои или к0сэ.5 и фильтрацией через фильтры 0,45 мкм "ишек н-\". Лолученше КРФ биологических образцов использовали для радиоизотглшх и хроьатогрефичсских методов исследования. • . '

Хромтоерарические • лета)ы иоыедо&тия включали . в себя разработку и оптимизацию методик • высопойффоктиш-юй -жидкостной колоночной хроматографии, позволившие проводить одаювременнсе разделений всего класса пуриношх и пиримидиновых нуклеотидов, нуклеозидов и азотистых основзннй в градиентном режиме элг.лротпшя, а такзе набор нзократических методик 'с использованием ион-парных реагентов для анализа фосфорилироваюш. форм пуринов и разделения оснований, нуклеозидов и их ыонофосфатов <Р.Т.Тогузов с соавт., 1987, 1988; А.М.РЛтвпеу вt в1., 196«,; Й.Т,1ади*ау nt а).., 198Э

Уи.У.ПкЬопоу в! й1. , 1970). ВС6 ВИДЫ ЗфОМЗТОГр&фШ! ПрОВО,ЦКЛИ }т

двух модульных хроаатографкческих снстеуах: (США) к

"Рпс»Ф«11" (США) С использованием ПОЛОМОК "уйепИаг-ак с "Моу^Р.-.'..

С ", "Uttrasphere ODS", "Dl tr.u.phere IP" И "Ultrasphere ODS XL". I И

?)1*иоииикопиыи Jtimoöu ьхс^е^овшшя ыитчали в себл подсчет радиоактивности биологических образцов в жидкостном сцинтилляционном счетчике -lü 2boo- u'eckman) и применение проточного радиоизотопного дчтектирсвакия н ВЭХХ.

Для оценки интенсивности включения in vivo меченых пуринов в К PC шгченн, эритроцитов и нлазны крови, а также тиыоцитов и спленоцитов ь процессе роста гепатоны мышам вводили внутрибршинно :?й ti ir.íii до забоя по 10 мкКи с3н]гипоксантина, сЗн]инозина, [14сзоротовой кислоты и с1^сзуридина. Исследуеше КРФ (0,5 мл) растворяли и 5 мл толуолыюго сцинтиллятора в пластиковых флаконах. Результаты получили в единицах распад/ыии (dpm), используя программу счета двойной метки и 14с) и расчетную программу автоиатической компенсации гашения.

В экспериментах in vitro эритроциты и тимоцити выделяли на 3-й и 7-е сутки после инокуляции опухоли. Эритроциты переосаждали В

о

физрастворе до концентрации 6.4 * 10 кл/ил ц инкубировали при комнатной температуре в течение 90 минут с 50 икКи/мл [14С]Нур для мечешш внутриэритроцктарного пула пуринових производных. .Затем эритроциты осаждали и дважды отмывали ь физрастворе. Тимоцити выделяли в градиенте фнколл-верографина.Клетки дважды отмывали в среде 190 и отбирали необходимый объем клеточной суспензии для последующей совместной инкубации. Тимоциты d концентрации 1.6 *Ю3 кл/ил инкубировали с эритроцитами, накопившими с14с]нур, • в концентрации 8 * Ю8кл/мл (соотношение 1/5) в течение 20 и 60 ышцгт при 37°С при непрерывном перемешивании, затеи отделяли их в градиенте фиколл-верографина (р-1,090» 300 g, t=30 шш). Тимоцити и эритроциты дважды отмывали в физрастворе, осаадали и клеточный осадок и среду икз;убации обрабатывали холодной 0.6 !,1 ьсш4 ' для получения КГФ.

Хрсмагографические разделения проводили на системе gold (Beckman). Для управления модулями, сбора, обработки -и вывода на печать хромэтографических дашшх использовали персональный компьютер IBM PC AT И программу GOLD Software. Для обработки радкоиэотошшх . хромэтографических данных через последовательный вход ■ rs,-232 использовали программу "ChromatoGraphice".

Весь материал обрабатывали статистически по методу Стьюдента (Б.Ю.Урбах, 1964). Достоверными считали различия при р l 0,05.

III. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ МССЛВДОВАНШ

1П.1 HypLrtor.nü и ivjpvjwutu/enj ж'лж'1>.1и.?1

в seiXL-ljA:- У'.': (! ■dpn'J.r-Lt::; .

В гепатомах с различной скорость» роста проксхо.дсг гл/Осклл биохимическая перестройка активности ферментов пуршшг.ого н шфимидашового метаболизма, например, резко уполичш.ается штшкс<:тъ ферментов реутилизации г.уринових оснований и /хмрнмид/но:!!«

НуКЛвОЗИДОВ (O.Webi;r, 1977,1963). По НИЩИМ дзшшм, ypouii'll £д(',ш!йа,

гуанина и гипоксантина в составе ткани'гепатомл 22 резко ■ьазрастпыт, что обеспечивает субстратами "За1уац*"-ферменты их утилизами! (Табл.1). С другой сторону, анализ содержания адешнонш кр.;лзотццчи в ткани гепатоми 22, начиная с 7-х суток ее роста почапал, что к* общий уровень в 1,5 раза шме, чем в интактной печени мыщ Б vo время динамика изменешсЛ гуаниновых нуклеотидоь и.у^'СТУ'.ыгмо отличается от таковой аденнлатоь: ксннентрац™ нопо , ди- н •грифосфатов гуанозииа достоверно npeuuaasur энмчетш, 2äp(tK?>.;,iuo дч/» печени, а содеряание gmp в 3-4 раза возрастает на II--I3 «уда; рос vа гепатош (Табл. I).

Снижение концентрации атр, но-ывдшому, спрцн^и i.ic- для неоплазмы и моасот быть связано с низкой актошэстьг гдтеллатедкозы к высокой йктнгшоо'.'ьм amp дезашшагы n гепатомах сй.К'гЬвг в1, al., 19073. Поскольку ИЗ BCUX ИССЯвДОЬЭЮШХ СрОХЬХ КОШ№<ПГ£&ЦЙЯ (ключевого метаболита пуринового ряда) снижается, a ypojjo>fj, инг-зияа возрастает только к Tf-м суткам, то это может свидетель.глюзать о емсокоЯ активности 1МР-де1идрогенагзи, приводящей к накоплении с,иг-. Действительно, ранее было показано, что в гепатснах о разной скорость роста повышается активность тр-дмчщрогвнази и сниглле-.'сл активность 5-НуКЛеОТИДЯЗЫ iY.Natbumeda et «'. .,19ВеЗ. С.'ШДОЯЗТб.ОЫЮ, накопление гуануловых щклеотидов в кл/.-тках г ¡п атомы иод г л указывать на специфически?! характер обмена пуринов а онухолг-ьсЛ ткани.

Одним из главных факторов обмена пиримиданойях нуклестидов и опухолевых клетках слезет стлтат^ значительное иьиененне соотношении путей бисюинтеза de novo '«'"Saiv«yt<'-riyrH к*, биосинтеза со.н<>ьег,1983; В.С.Шапот, Р.И.Потапова, IößC*. Перьнй путь шслша<"г я оябя октившя«» яоиппенса ферме ятоб сии«»з-» • у рп ¡{млатов через отэдн > образования ojwtoboP. кислоты, в второй з.-лутчаетси в реякс«'« активации фосфор;« лирогаания етчобод'ыя пг.ут/.'днисигл нуклеозмдов, г первую очередь урцдина и 'иг/иду на.

Таблица I

Содержание пуриновых и пиримидиновых соединения в КТО ткани гепатомы 22 в процассе ее развития (мкмоль/ЮО г; и + ш; п = 3)

Вреия после инокуляции гепатомы 22 (сутки)

Соединение

1 l t 9 j II .1 13

АТР 94,9 ±9,3 135,4 ±12,В 74,0 ±8,1 57,8±5,4

А DP 50,3 ±6,2 E6,4 ±0,5 48,2 ±5,1 45,8±4,9

АМР ' 53,6 ±5,8 64,2 ±6,2 03,9 18,4 106,8±11,2

ВГР 40,4 ±4,6 35,1 ±3,7 26,5 ±2,3 28,8 ±3 ,1

GDP 20,0 ±2,3 17,9 ±1,6 32,4 ±3,3 17,8±2,1

GtiP 13,4 ±1,5 23,6 ±2,7 35,5 ±3,4 43,7±5,3

IMF- 20,5 ±2,2 13,4 ±1,5 6,8 ±0,8 8,6±1,0

Ade ' 7,0 ±0,8 11,9 ±1,4 6,9 ±0,7 B,5±0,9

Gun 9,8 ±1,1 0,2 ±0,9 4,6 ±0,3 5,2±0,4

Ado 1,7 ±0,1 1,8 ±0,2 2,9 ±0,2 5,5±0,6

lno 0,2 ±0,7 9,6 ±1,0 18,1 ±1,7 9,3±0,B

Hyp 22, S ±2,1 28,6 ±2,3 12,4 ±1,4 14,B±1,6

Xan 4,3 ±0,3 5,4 ±0,5 14,6 ±1,7 1S,5±1,4

Uric А . 3,7 ±0,3 Q,6 ±0,7 11,2 ±1,3 1V,2±1,6

UTP 3.1,9 ±3,2 62,5 ±6,4 44,5 ±4,2 27,2±2,B

UPP 17,6 ±1,5 45,7 ±4,4 56,1 ±5,8- 32,6±4,1

UMP 10,3 ±1,2 6,6 ±0,7 14,3 ±1,3 37,5±3,2 ..

Urd 6,6 ±6,7 17,1 11,9 0,3 ±0,7 10,4±1,1

lira 2,4 ±0,3 0,4 ±1,0 13,8 ±1,8 6,3±0,D

aip " 16,4 ±1,4 21,2 ±2,3 12 ¿4 ±1,3 18,1±2,1

Cyd 12,9 ±1,1 8,3 ±0,6 10,4 ±1,2 11,6±1,3

Cyt 2,9 ±0,2 ¿>,1 ±0,5 3,1 ±0,4 12,411,1

TMP 8,5 ±0,7 16,0 ±1,4 12,8 ±1,3 6,1±0,8

dThd 3,4 ±0,3 1,2 ±0,1 7,0 ±0,6 12,3±1,4

По гюлучаиным нами данным в ткани гепатомы 22 на 7-е и 9-е сутки в 2 раза возрастает уровень птр, а ибр достигает максимальных значений на Э-П сутки ее роста. 13-.е сутки характеризуются высокими значениями ипр и сир, что может быть связано с распадои .яма,-поскольку в эти сроки уже имеются крупные очаги некроза в гепатомз. . На терминальных сроках роста гепатомы в составе КРй . были идентифицированы высокие уровни тимидина, урацяла и цнтозппа.

Исследование, проведетюе с введением меченых метаболитов мыиаи с растущей гепатомой показало возрастание включения С14С]игй и-С14сюго на 9-11 сутки. При этом концентрация свободного урадлна в гепатсие достигала 17 мкымоль/100 г на 9-е сутки. На этих ее 'сроках уровень уридина в печени ыышей-опухоленосителей снизался до самых низких значений.

Тагам образом, (¿ормиронание и урн поп ого V: гшршшдинорого пл'т ^ гепатоме 22 обнаруживает специфические ччрти их метабол-.г.мэ, "1'.''' связано с двумя факторами: с изменением активности ф^рм-шю'э \ у. обмена в опухолевой ткани и с гцвш ¡цией поглоцетл глеткгя/я гепатомы свободных нуклеозидов и оснований.

171.3 Пурю- о%£ и ъ>.р/хч.';и!-:£ч} (.

Известно, что кинетическая крив ¡-.я роста геиатсш 2? т/пч'! характерную для солидных злокачественных генатен з-оЛр,■>.■'!'> п форчу, точка перегиба на которой, соотеетстьугаи; ишссуналыкЛ: . «.крсровтм роста, достигается через 6-8 суток после ¡ш;»с/.- ¡цин т/чслёмос Iслеток (И.11. Сэдотшкова, Л.К.Обухоьа, ЮЛ?.). Иоггоч? н р ..>«>-,->* Ги»л» прогнализиронани метаболические харагл с..р.\( тш'л ну, I лс.тл и якрмыиднюпих иромяиодшк 1.1 печен! оргяги-лы хоия1шп о т.--нча'.'» недель роста гымп-.ш» (Тгбл.2).

и: П1ГИУ Ь'/Р'Ч-.ОЛЫХ сие, ДИН:.' ННЙ и !-Л- V I1

;.'г с-.-пй г ПрСЦ( /с се Г'ОГ.-ГЭ 1с дггк

'.У: и')/,.. <'шО г; м Г - 3)

1 1 ! ш; йог ле ин оку/янди Г'г-П * а О?/' ч 2: я ■Г.!)

Порма ] 1 ; ; Г» 7 Г, ; 1 I ■¡л

ЛТГ-1 ' й,2 . , Иг 1','Г, 1 1 в2. ьо , л ........ , 0-. Г,

1-*, ?, 0,7" 3 1'» , 1 11 , ъ 10,2"

ЛОР ЦП, Г + 1Г1.', »■ 1 39 , 2 > 1 33 10 6 1 ''У 105, , 3.+ 1 А -' , Р +

1?! , г" 1 > 1л,сГ 12 ч В ,4*' 12, 10,-г'

{и^Г* 7 г>, П9, 7 11Ь ] :''1 , ъ * 79 , 7' + " 7о,.Л-

<3 ••> •У, 7 И 10 г> ~ 11 11 ч ^ 1 1 . 0,2

Г: П' "- 1 ? -( 14,1« й 1 И 1 7 .' '' * 2! .7 + , 1 <

I ^ з . л" 0 1 > • 1,2"

гпг 1.4 , л • г.:. 7 ( 10.11 16 « 1? 1. 13 . 7

1, 1. ? 1,7 '2 * — ,сГ л ,'Г о 2 0,9*'

IV,!!' 11., о» « 77, .7 + "Я. , 1 ^ 1 ?,7-<

ч 2 2 . 5 о ,1 ч 1, 1 ..Г

И1Р ?г=, I') ' 20. 7 15,7' 15 17 УМ 17., 7 -Г.

1! 1, ч а , - 1 ,4 2 . 1 '2 > 1 , 7 2 /1

млргс'.га'-» ¡скда.отлдгчг. ,г-улси !• ткльи Ч'.-тгни г, прог;«г< •

I очтз гсп-^'ня.'.ц г.'м-п зчя, что, пэчот.ля с 1-х оу еок ио«;лч пиону : »•.;>' -.-ич к.1:-'; "¡: дх-фи-ит л м^ерхо.-жм -.к- к •..»>

¡.Г'М'мч ¡'.'.¡ншчп р-н ;:ч! !!,•< Л-:) ''/"-'..и тъ х-мютсод. С'дч-:-

временно возрастают уровни монофосфатов аденозина и гуанозшш в снижается к 3-5-ц суткам концентрация ключевого метаболита пуринового рада - инозшшонофосфата (Табл.2).

В то же время, пуриновые нуклеозида н основания, а тагаю конечный продукт катаболизма пуршюв - мочевая кислота - достигают максимальных значений к 3-й суткам роста гепатоиы (Рнс.1). Подобная динамика изменений пуринового пула свидетельствует об активации катаболизма пуринов в печени мышей-опухоленосителей в экспоненциальную стадах» роста гепатомы.

мкмопь/100 г

Вр9до(супс и) '

Рис.1 Уровни содержания 1гуклеозидов и оснований в печени мышей в процессе роста гепатомы 22. •

Исследование интенсивности включения меченых • шюзина и гиноксантина в КРФ печени выявило, что па всех ис следов а ншх сроках мезду интенсивностью включения печеных соединений и уровнями содержания "холодных" субстратов имела иасто обратно пропорциональная зависимость, особенно выраженная для гшоксантппа на 3-5-е сутки роста опухоли (Рис.2). ^

В стационарную фазу роста (9-13 сутки) в КРФ почеш возрастали концентрации макроэргов, гйр, а таювв уровни нуклеозддов в оснований, к 11-и суткам уровень мочевой вдолоти бия такса о, пределах контроля. Следовательно, в реакции ткав» шчсед па разштно опухолевого процесса можно выделить две фазы: фазу активации катаболизма вдешшовых и гуашшоЕых пушшотидов (зксаоневщшьВая -стадия роста опухоли) а фазу активации Ба1у»о»гро2ПЦ1Ш рвутшшзадяп : пуриновшс. оснований (стационарная фаза роста). .••.■''

шсиоль/100 Г VP И (Пйчеш/Плониб)

н 1 3 5 7 Э 11 13

ГГ?-:-,т;т11 [з-Hjsno

; ; ЕМ I

J_

' т ^";1" v.v ""т '"''j

¡"шнннез

10 в в 4 2 О 0.5 1 1,0

Рис.2. Интенсивность вклвчешш с юптоксантина н t3»] инозина и уровни их содержания в КРФ печени на разши. сроках роста гепатоыы.

Дннаглжа изменений уридинсвого нуклеотидного пула п печени шшэй в процессе роста опухоли такге розволяет виде .тать две фазы: фазу катаболизма уридилатов в экспоненциальную стади» и фазу активации биосинтеза пнризшдниов в стационарную стадий роста гепатсш (Табл.3).

Таблица 3

Содерязшгэ гефииндннових соединений в ¡CPS печени "мвзей сзна в процессе роста гепатсин 22 •{шаюль/100 1,;м + ш:п=3)

' Промп после инокуляции гепятс:,п1 22 (сутки)

Нор:.ш | 1 ' ! 3 ! 5 1 7 1 9 i 11 I 13,

UTP 26, Ы- 36,0 + 10,8+ 12,3+ 35,6+ 14,0+ 27,4+ 21,4+

2,4 3 f 3 1,6" 0,9~ 3,2 1,0 п ' ' л. , Л- 2,6

UDP 24,5+ 16,0+ .40,5+ 33,2+ 41,0+ 46,0 + 30,1 + 14,6+

2,6 1,8 3,8 3,2" 4,2 4,0~ 3,6 1.2 .

имг» 22,4 + 34,3+ 56,4+ 52,2 41,4 + 37,1 + 32,2+ 35,6+

2,1" 3,1~ 4,0 5,0" 4,4" •5,2" 2,'а. 3,9"

С»*,!" 6,4+ 12,0+ 13,6+ 16,3+ 12,3+ 23,5+ 1Д.2+

0,3~ 1,3 1,2" 1.7" 1,1" 2,5" 1,4 0,8

Urii 1,&+ 1,5+ 3,7+ 0,0 + 2,7+ 5,2+ 2,0+

0,2 0,1- 0,9 0,4 0,06 0,3. 0,4 0,2"

и га 0,7+ 0,06 1,3+ о ,Г 0,3+ .0,02 __

Так, падение концентрации итр сопровождаемся пропорциональным увеличением уровней 'да- и ыснофосфатов уридтщ. Кроу,а того, на 3-7-е сутки резко возрастает уровень урэдша и скр- п появляется урацил. • Известно, что в печена israefl с солидной гепатоной 22 зкятность. урадпцпшази довольно нлзиаяШ.С.Папот, Г>И,Потапова, /1936). По'

и;а;ш даннш, интенсивность включения с14сэуридина в КРФ печени ниже кснгролыпа величин на всех исследованных сроках, с минимальными знаодиилии на 7-е сутки роста гепатомы. С другой стороны, интенсивность ш'лечения [^сюротовой кислоты в КРг печени держится на низко« уровне в течение всей экспоненциальной стадии роста гепатош и увеличивается только к 9-м суткам (Рис.з).

к

I

[14fС](рго Ш1 ¡[14-QlUrd

' Oililli! ' i ! E?J; ,

¿Шаш* .<

j —

..._______ ^

. Fnc.з. Интенсивность включения с14С]уридина и оротовоП кислоты в KFO печени на разных, сроках роста гепатоны.

Накопление свободного уридина в КРФ печени на 3-й сутки не может Сыть связано с его повышенной аккумуляцией из крови яивотных, поскольку mсличение экзогешюго меченого уридина на этом сроке сус;естве1шо шпеке но. Следовательно это чозот быть вызвано активацией катаболизма уридилатов, т.е. повышением активности пиримидашовой 5-нуклеотидазы. С другой стороны, активное накопление печеночной тканью экзогешюго меченого оротата ыокет быть вызвано только активацией синтеза пиримидиноп da novo. Учитывая высокое содержание смр на этих сроках роста гепатомы, полученные данные коррелируют с выводами В.С.Шапота (1986) о резкой увеличении отношения скорости включения оротат/уридин, как предшественников смр РНК но сравнению с тканями здоровых животных. _

Таким образом, анализ особенностей формирования нуклеотидных пулов в ткаш! печеш опухолевого организма позволяет выдвинуть положение об ответной реакции организма, на рост опухоли, заключающейся в снижении фосфорплированных форм как пуринов, так и

пиримидинов в началышй период роста опухоли, что сопровождается аккумуляцией в печени нуклеозидов и оснований. В стационарную стадию роста гепатомы в печеш! хивотных-опухоленосителей активируются реакции анаболизма нуклеотидов и возрастает интенсивность транспорта уридина и оротовой кислоты.

П7.3 Uemaûoлизл нуклест&ов в эритро^шюх ирови ляией- опухоланссителей

Известно, что эритроциты крови ылекопнтапцях выполняют функцию транспорта свободных ПНК в орга!шзме, являясь аффективной системой доставки нуклеозидов и их оснований тканям, обладавдши ограничешшын возможностями биосинтеза нуклеотидов с/е ною (Koniehi & Ichihara, 1979). С другой СТОРОНЫ, В зрелых. эритроцитах отсутствуют ферменты синтеза пуринов чн novo, я также фермент ксантиноксидаза, катализирующий конечный этап катаболизма пуршювых соединений (Michel i & Ricci, 19ВЗ» Bontemp» et al., 19Bb).

В работе Y.Konishi & a.ichihara было показано, что аритроциты аккумул!фуют и переносят пурины, синтезируемые в печени, причем при регенерации печет! после частичной гепатэктоиии гепатоциты продуцируют в кровяное русло не адении и гуанин, а лтсксантин, шюзин и ксантин, которые накапливаются, соответственно, в эритроцитах.

В наких исследованиях было обнаружено, что на разных стадиях развития двух Timon злокачествешшх опухолей (асцитной опухоли Эрлихэ и солидной гепэтоны 22) в эритроцитах крови wuxefl наблл'дается накопление фосфорилироватшх форм аденозина и гуанозина (Табл.4,з). Динамика распределения моно- ди- и трифосфатов пуринов в эритроцитах шаей с гепатоиой и, в большей степени, с асцитной опухолью Эрлиха свидетельствует об активации киназкых реакций их биосинтеза. Пзвс-стио, что в ретикулоцитах концентрация пуриповых нуклеотидов значительно вы ое, чей d зрелых клетках крови (л.иткг et ai. ,19яа). • По навнм дашпш, d процессе развития опухоли Эрлиха выявляется,, ретикулоцптоз (количество регакулоцитов тз контроле - I.7X ; на 5-е сутки - 3,4* ; па 12-е сутки - 4,8* ' ). однако - его количественные-характеристики не могут - сЗъяснмть . существенного возрастания ; адонплатов и гуапилатов а эритроцитах крсвд в опухолевой орггпэлЕие. . Это может быть связано с активацией киназных реакций фосфоралирова-ния пуринов, направленных на синтез соэтвететвугк^и нуклгстудий.

Таблица 4

Содержание пуриновых соединения в эритроцитах мышей 1ся с трансплантированной асцитной опухолью Эрлиха <нмоль/цл, и + »>

Время после инокуляции опухоли 5 день : 12 день

п - з : п - 4

Соединение Контроль

п - з

атр аор аир отр

сср i

вмр + 1ир ас1е Ас1о ■

1 по 2,2+0.3

1278,4+186,2 149,0+4,5 20,5+1,2 126,2+15,1 18,3+4,7 14,1+1,3 0,8+0.1 ' 0,8+0.2 0,6+0.1

2017,0+163,8 165,2+15,1 62,2+9,3 138,2+21,3 28,3+3,5 22,0+6,2 0,7+0.1 0,8+0.1

2020,6+110,4 421,8+76,2 174,2+62,2 403,9+85,4 44,7+4,9 92,0+17,9 1,5+0.3 6,1+1.9 2,6+1.4

Таблица з

Содержание пуриновых соединений в эритроцитах мъшей сзна . с трансплантированной солидной гепатомой 22 (ныоль/ыл, м + *)

Соединение Контроль п " 3 I Время после инокуляции опухоли 1 з день I 12 день > п ~ 3 • .« ' '' пг- 4 - "

атр 632,6+87,4 686,8+92,8 773,9+81,4.

аор 105,9+11,4 90,2+10,4 103,9+11,4

амр 15,3+2,2 19,5+2,6 23,6+3,1

6тр 37,6+5,4 62,2+8,в 43,6+6,2

вор 17,0+2,9" 22,3+4,4 19,3+3,1

ВНР 3,в£0,3 2,7+0,4 2,9+0,3

м» 1,6*0,2 . — 2,7+0,3

Мо 1,0+0, 3 .0,2+0,01 . — .

Нур 2,6+0,4 . — ■ 2,1+0,4

1по 2,6+0,4 0,4+0,03 2,2+0,3

В экспоненциальной фазе роста гепатош 22 в эритроцитах резко возрастало содержание основных пуриновых метаболитов, при этоы к 5-м

суткаи из состава КРФ исчезали аденин и птоксантин, а аденозин и инозин были идентифицированы в следовых количествах (Табл.з). Поскольку эритроциты являются переносчиками указанных соединений, а. одним из основных их источников в крови животных служит печень

С В. 1-ому & И.1-ГГЛВГ, 19741 У.Коп1вЫ «с А.|сЬ1Ьаг«, 1979], ИХ

накопление в эритроцитах может быть прямо связано с катаболизмом пуринов в печени на ранних сроках роста гепатомы. .Кроме того, интенсивность включения с3нэинозина на всех исследованных сроках не превыпала контрольные величины, а включение с3юпшоксантина имело два выраженных максимума - на 3-й и 9-е сутки роста опухоли, при этом уровень "холодного" гипоксантина на 5-9 сутки снижался до следовых количеств.

Обнаруженное накопление пуриновых нуклеотидов в эритроцитах крови опухолевого организма на разных стадиях развития асцитной опухоли Эрлиха и солидной гепатоиы 22 может быть связано с увеличением "буферной емкости" эритроцитов для пуриновых соединений ' в условиях прогрессии неоплазмы. Вероятно, срабатывают защитные механизмы "удержания" пуриновых соединений в эритроцитах за счет накопления фосфорилированных форм пуклеозидов, которые, как известно, не проходят через плазматическую мембрану. В пользу этого предположения говорит и факт истощения эритроцитов пурияовыми нуклеозидаш и азотистыми основаниями (особенно у мышей с солидной < гепатомой 22) в экспоненциальную фазу роста опухолей, что может быть , вызвано активным захватом предшественников нуклеиновых кислот из эритроцитов крови животных не только опухолевыми, но и другими клетками организма, например, иымунокомпетентшдш, в котори на , ранних стадиях роста гепатомы происходят резкие изменения пуртшового. метаболизма сС.Н.Храицова с соавт.,1986}.

II 1.4 Нетаболи-ческий пул пурин свих соедин&иА & -регенерирующей печени и эрмпроц'ижи крови-, лшей в прог&ссе роста гепатояи 22 .

Регенерирующая после операции ЧГЗ печень грызунов представляет собой удобную для. исследования модель импульсно индуцированного процесса размножения дифференцированных клеток (Н. А. Милютина с соавт.,1966; А.Н.Полшлук, 1983). Поданным Н. АЛШжтиноЯ с, соазт, (1589) пролиферативный процесс в- регенерирующей печэтх мыкей развивается строго закономерно, коррелируя со сроком г.осл* операции.

Авторы работы показали, что вариабельность синтеза ДНК определяется величиной клеточных популяций, последовательно вступащих в Б-фаэу и значительно различающихся у разных мышей. Что касается таких характеристик пролиферативного процесса в регенерирующей печени, как время активации синтеза ДНК в популяции гепатоцитов, скорость продвижения клеток по митотическому циклу, то они достаточно стабильны.

Нами была предпринята попытка оценить формирование нуклеотидного пула в КРФ паренхимы регенерирующей печени и эритроцитах крови животных-опухоленосителей в сопоставлении с морфологическими характеристиками развития пролиферативного процесса в печени.

III.4.1 Морфологические характеристики регенерирующей печени лишей в процессе опухолевого роста.

На 5-е и 12-е сутки роста опухоли проводили операцию частичной гепатэктошш (ЧГЭ), соответственно, на этих же сроках операция ЧГЭ проводилась параллельно у двух груш интактпых мышей. Пролиферативше процессы в печени у контрольных мышей через 42 часа после ЧГЭ развиваются на высоком уровне (около 200Х. митозов). Митотическая активность составляет 35%., и 160%. индекс меченых ядер. Часть гепатоцитов представлена в состоянии постштотической реконструкции (67 %.). У мышей с гепатомой в стадии экспоненциального роста уровень пролиферации гепатоцитов значительно снижен по сравнению с контрольными мышами, хотя фазы процесса совпадают.

Во второй серии эксперимента у контрольных мыпей после ЧГЭ уровень пролиферативной активности гораздо ниже чем в первой ' серки (индекс меченых ядер - 365., митозов - в%., постштозов - 18Х.). В то же время, в стационарной фазе роста опухоли в печени ыышей-опухоленосителей через 42 часа после ЧГЭ паблвдается значительная активация пролиферации гепатоцитов по сравнению с коитролными мышами (индекс меченых ядер - 212Х., митотический индекс - 37Х., индекс постмитозов -106Х.).

Таким образом, ЧГЭ, выполненная на животных в экспоненциальной , стадии роста гепатомы, сопровождается . подавленней уровня •пролиферативных процессов в печени. В то же время, ЧГЭ у швей с гепатомой в стационарной стадии роста генатоиы. приводила к резкой стимуляции размножения гепатоцитов.

III.4.2'Pcaenepifspaiifia печень

Анализ полученных данных позволяет заключить, что подавлешю полиферативной активности гепатоцитов после ЧГЭ в экспоненциальную стадию роста гепатсмы (5-7 сутю!) сопровоадаетсл накопление« в ткани печени как аденшговых, так и гуаниновых нуклеотидов. Причем возрастав» концентрации всех фосфоршвфовашшх фори.

Противоположная картина наблюдается в регенерирующей печени в стационарную фазу роста опухолевой ткани: снижоние шищонтрации всех нуклеотидов адешшового и гуатшового ряда. Уровни содержания нутслеозидов и оснований (за исключешсеи инозина) снижаются и падает концентрация иочевой кислоты.

В работе в.ПагЫгоИ »t ai (1973) был изучен синтез ДШС в гепатоме Морриса чывл на фоне регенерирующей печени крыс после ЧГЭ, а такяо в самой регенерфутачей печсчы. Авторами бил показан транзиторный эффект подавлешш включешш меченого ткыидина в Д11К гепатомы в первые 27 часов после ЧГЭ о последующей стимуляцией синтеза ДНК. Поскольку в ряде работ било выявлено стимулирующее влияние повыиешюго уровня в кровяном русле гормона роста , и глюкагона на регенерацию печени (riootien et" ai.,1970) авторы приходят к шводу, что опухолевой процесс в организме могпю рассматривать как состояние стресса, приводящее и стимуляции процесса регенерации (BarbiraU «t ai.,I973).

В нашем исследова1шн стимуляция регенеращш почет! была выявлена только из поздних сроках роста опухолевой .ткани, тогда как в экспоненциальную фазу роста гепатомы бил зарегистрирован противоположный эффект - подавлешш пролиферативной ■ активности гепатоцитов. Если принять во внимание вывод о состошши стресса, то это состояние в большей степени иозаю отнести к поздгаш срокам развития опухолевого процесса. В то яв время, стадия максимальной скорости роста опухолевых клеток о организма скорее всего связана с усиленной конкуренцией неоплазмы с тканями оргадазма за жизненно выжша метаболиты, в той число а за пуршювыз соединения.

Следовательно, и езду печенью и . растущей . гепатоиой осуществляется "сопряхшшо" обмена, пуриновых соединений, поэтому представлялось необходимым получить ответ на только па вопрос об .изиенешш характера взаииоотиогзкий. «еяду различными фазами роста гепатомы и гепатоцатвми регенерирующей печет!, индуцированными к пролнфсэрацая частичной гепатэктонией, по и об особенностях

формирования пула пуринов в эритроцитах крови в данной экспериментальной модели, осуществляющих транспорт этих соединений.

171.4.3 Эритроциты крови хиВопшх в условиях регенерации печени и роста гепатохи Как било нами показано, в эритроцитах опухолевого организма на ранних стадиях роста как асцитной опухоли Эрлиха, так и солидной гепатомы 22 наблюдается накопление пуриновых нуклеотидов: моно-, ди-и трифосфатов аденозина и гуаиозина.

По полученным данным, операция ЧГЭ, выполненная в опухолевом организме, приводит к аналогичному результату: возрастанию концентрации ди- и трифосфатов аденозина, причем, как в экспоненциальную, так и в стационарную фазы роста гепатомы. С другой стороны, имеются и существенные отличия. Так, на 14-ые сутки роста гепатоыы резко падают уровни содержания втр, бор, и <змр.

Учитывая зарегистрированный параллельно подъем концентрации 1ир и инозина можно предположить, что поздние сроки роста гепатомы, стимулирующие регенераторный процесс в печени, приводят к активации катаболизма гуаннлатов в эритроцитах. Об этом хе свидетельствует и снижение концентрации амр с одновременным увеличением концентрации аденозина. Следовательно, формирование эритроцитарного пула пуриновых соединений зависит от типа размножающихся в организме клеток: стимулированная пролиферативная активность гепатоцитов при репаративной регенерации сопровождается иным статусом и динамикой распределения пуринового пула в эритроцитах крови, чем размножение опухолевых клеток в очаге злокачественного новообразования.

Сравнительный анализ интенсивности включения меченого тимидина в ДНК различных линий гепатом « печени животных в организме-опухоленосителе 1Риг«11пап|1ив »1. ,1970] №гго сЪ «1., 19703 ВЫЯВИЛ сложную картину конкуретных отношений биосинтеза ДНК и пролиферативной активности . клеток' печени и гепатомы, которые включали в себя изменения как количественных характеристик синтеза НК, так и качественных - задержку вступления гепатоцитов в в-период в регенерирующей печени в опухолевой организме. Следовательно, в данной конкретном случае, эритроциты крош следует рассматривать в качестве сопрягающей системы обмена свободных ПНК между двумя очагами пролиферативной активности в организме, отражающими характер конкурсных взаимооТнований тканей с. опухолевыми клетками.

III.4 Сравнительная оценка летаболтеских характеристик

пуринових соединений в лилфоицвшх тилуса и селезенки льааей в процессе опухолевого роста. Одним из специфических признаков действия опухоли на организм является вызываемое ею состояние гашунодепрессии, биохимические механизмы которой до сих пор остаются невыяснешшми СЮ.А.Уманский, 1982; Г.И.Потапова, В.С.Шапот, 1987].

Вместо с тем, определетш активности ферментов в условиях насыщения субстратом не позволяют дать адекватную оценку реальных скоростей метаболических реакций сВ.С.Шалот, Г.И.Потапова,1986]. Кроме того, фактическая доступность пуринових субстратов, состояние транспортных систем переноса пуринов через плазматические мембраны клеток в условиях патологии и могут определять реальные скорости ферментативных реакций и, тем самым, функциональный и пролифератив-ный статус иммунокомпетентных ¡теток.

Нами была проведена. оценка изменений в обмете пурииовых соединений в тимоцитах и спленоцитах мышей в условиях роста опухолевой ткани, исходя из транспортных характеристик гипоксантина и инозина в сопоставлении с внутриклеточным пулом пуринов/ Интенсивность транспорта нур.и ino в тимоцити п спленоциты ("метаболические потоки") вычислялась па основа результатов по включению [Зн]нур и г3нипо в эритроциты и лимфоциты через *5 шшут после внутрибрЕсппшого введения меченых субстратов, с учетом эритроцитарного содержания гипоксантина пинозина. .Для этих целей учитывались дапныа по уровню накопления с3н]нур • и c3H]tno в эритроцитах на всех исследуемых сроках развития опухоли, а также данные по содержанию "холодных" субстратов - нур , и ino в эритроцитах. Посла чего вычисляли относительную молярную долэ а соответствующего экзогенного меченого соединения с учетом его удельной радиоактивности. Вследствие высокой удельной активности меченых с3Ю-пуринов, доля меченого субстрата в его обвей впутриэрнтроцптарноц пуле па препдалл о,2%, поэтому введениэ раДдактшшого пурина в организм тавотного as . оказывало . .влияния на характер его внутриклеточного иегвболхзиа. Используя данные по накоплению с3н]нур п с3нцпо в лгдг^оцитах тшусз а селезенки на исследованных сроках роста ояухоля, ешесяяля реалыша потоки нур и ino в тшгоцяты и сплепоцзти из эритроцитов крови, Расчет проводили по сдэдукузЗ формула: ... .

- :м -

Формула расчета "метаболического потока" гипоксантина и инозина из эритроцитов крови в тимоцити.

l*

Т - 12 *

эр

сэР

где:

т.

эр.

Lb

интенсивность ' транспорта гипоксантина и инозина в лимфоциты тимуса (пмоль/10® кл/час) включение Г5щ Hyp (ino) в тимоциты (распады/шн/106 кл/5 шш).

I.e"1" ■» ВКЛЮЧеШ1е [Зю Hyp (Ino) в эритроциты крови (распады/ыин/ыл/5 мин).

СЭР* = ковдентрация гипоксантина <инозина) в эритроцитах крови (пмоль/мл).

Процесс роста гепатомы 22 у мышей сзна существешшм образом влияет на характеристики транспорта и метаболизма пурииошх соединения в клетка2 органов иммунной системы. Так, в экспоненциальную стадию роста опухоли наблюдалось увеличение интенсивности транспорта исследуемых метаболитов в клетки тимуса: резкая активация поступления нур в тимоциты на з-з сутки роста гепотоны (Рис.а),

Нур

N

1

э 6 7

9 II 13

Д!

I

I

lb в 6 4

т

О 40 80 120 С

_ Ino

: ! I Г

ми&^ииЬШ'.'&л! 1 1 33 !

Рис»4 • Интенсивность транспорта (Т = пыоль/10 кл/60 шш)

Нур и 1по (А) и их внутриклеточное содержание (В)

'* чС=шоль/106' клеток) в тшюцитах шизей с зил в .процессе роста гепатомы 22.

При этом концентрация эндогенного нур возрастала а 50 раз на 1-е сутки и в течение з-5 суток убивала до следовых количеств (Табл.б).

Таблица 6.

Содержание пуршювых соединений и лимфоцитах такуса 1.гшей сгна d процессе роста солидной гепатсмц 22<пмоль/1о6кл; и + mj л-4)

Время после тюкуяяции гепатомы 22 (сутки)

Соединение

Норна

11

13

Ade Gua

Hyp

Xan Ino

Ado

24.0 +2.0

11.1 +2.1

2.7 +0.5

2.6 +0.6

24.2 +3.1

10.9 +0.9

149.9 +16.0

З.О +0.4

29.5 +3.0

13.4 +1.0

16.4 + 1.2

6.6 ♦О.О

10.6 +1.4

6.6 +0.9

5.2 ♦0.7

34.В +4.1

14.4 +2.1

11.3 +1.9

14.6 +2.2

1.9 10.4

55.9 +6.1

23.7 +2.0

19.9 +2.4

4.4 tl.3

40.7 +5.4

52.0 +3.9

16.0 34.2 +2.8 +4.1

* 47.3 +3.8

Í 7.1

+1.B

k - следовые количества (0,1 - 0,4 пмоль/IO кл)

Соотношение транспортных характг^и^так ¡по и его концентраций в тзшоцитах на ранних сроках роста опухоли было шш, чей -у Нур: поступле!ше ino в тиыоцитц только на з-н сутки превышало портлу, тогда как уровень его содерзания возрастал в течешш перЕых трех дней развитая гепатсмы, с последупщш исчезновением из состава КРФ •пшсцитов (Табл.б? Рис.4). Другими словами, ыеаду интенсивностью транспорта нур в тииоциты н его внутриклеточной концентрацией прослеживалась обратно пропорциональная зависимость, тогда пак для ino это соотношение было прямо пропорционзлышы.

Данные по изменению активности ключевых фер'.ентов пуринового i/етаболизма (таких, как АДА, ПН1> и s-H) в тиисцитах в период до достижения Плетками • гепатомы максимальной скорости роста CBarankiewicz t< Cohen, 1907] в сопостпвлегош .с характерен изменений активности этих ферментов при диффбренцировке и созревании тииошгтеп [С.Н.Хргшдова с соавт.,1986з дает основание предположить наличие

7

t

9

г

*

блока в ди$фаренцировке и созревании тимоцнтов в этот период развитии опухоли. Исходя из полученных нами данных, интенсивный транспорт ino наряду с резкий подъемом уровня нур в тимоцитах на первые сутки роста гепатомы свидетельствует об изменении характера активности инозинового цикла в этих клетках, характерной для перехода тимоцитов в s-фазу CA.cohen,i9B43. Это подтверждается низким уровнен Ado в тимоцитах (Табл.г,) в период до з-их суток, который согласуется с данными литературы о повышении активности АДА в тимоцитах через 5 часов н i сутки после инокуляции опухолевых клеток сС.Н.Храмцова с соавт., 1986].

С другой стороны, уже 5-е сутю! роста гепатомы, соответствуйте началу периода максимальной скорости ее роста, характеризовались повышением концентрации в тимоцитах Ado, что соответствует данным о 6-кратном падении активности АДА в этих клетках к этому периоду, а содержание оснований Ade и Gua уменьиалось в два раза по сравнению с нормой (Тэбл.б). При этом концентрация нур н ino в' эритроцитах также значительно снижалась по сравнению с нормой.

Таким образом, в период, предшествующий развитию блока с диффаренццровш; тимоцитов на фоне растущей опухоли, происходит возрастание потоков в эти клетки ino и, в особенности, н>ф, сопряяешюе с транспортной функцией эритроцитов. Необходимо отметить, что скорость поступления Нур в клетки тиыуса била на 1-2 порядка больпз его кощентращш в кшецитах, тогда как для ino эти величины сравнимы. Подобная динамика метаболических потоков nose? свидетельствовать о значительном уенлешш Baivatje-утшшзацип пуршюа (в особешюсти, пшоксанпша) индуцируемом растущей снухолы).

Па более поздних сроках развития гепатош изменения в обмане пуринов характеризовались значительным замедленней интенсивности транспорта Нур и ino с одновременным возрасташхем концентрации пуринових оснований (Табл.6j Рис.4). Результаты согласуйся с дашшш литературы об увелг-гчйшш активности ПН5 в тшецатах. на этях сроках проста гепатош сГ.И.Потапова с соавт, ДЭСбз. Учитывая, что относительно высокие значения 1Ш5-актшшостц регистрировались и неди4фаренцйрова1ших тимоцитах [M.nassaia,i902], результата еввдэте-льствуют. об увеличении доли незрелых клеток в тимусе па тершпшлышх сроках роста опухоли.

Исследования метаболических сдвигов в спленоцитах показали,' что интенсивность транспорта в них Нур была максимальной па з-а . в li-s

сутки, a ino на i-е и 7-е сутки роста гепатош (Рис.эи

Н

1 3 5

7 9 11

13

Ш 011 ! Irio;

25 15

5 0 1 2 3 4 5

Рис.5. Интенсивность транспорта (Т=1шоль/10 кл/60 иш) Нур и ino в сплепоциты umseft сзна в процессе , роста гепатс1з*:22.'

Однако, дозе цакскыалыше 1 эная.епил транспортных величш1 в спленоцнтах б!Ш1 шеи ' уровня их эндогенного пуда. Особенно это заметно для транспорта ino. Высокие уровни мо и Gua достоверно спияалпсь к 5-7 суткам зкеперииепта (Табл.7), Ь ковдептрацил нур резко возрастала па i-з сутют в э раз, с послэдугс^ш мшгениеи к терминальный cpcicau роста опухоли.

Анализ иясюсдася работ показывает, что к э-iai суткам роста гепатош гжппзпость ¿ДА. в т- и п-лшгфоцитах селезенки иызей уцепьпается в 1,5-3,0 раза, а активность о-П в сбс:гх субпопуляциях .тгафзгрггопг, иасбсрот, увеличивается Ь 2-3 раза сГ.И.Потапова с соазт. ,1935; С.11.2р*г!цсза с созэт.,133Бз. Однако хрсиатографяческий епаллз ICPS спдопсцитса пекгзая ппс:с:.1 уровень в ппх мь в период i-з сутс:; с послодуггуш Еоорзстшггсиого концентрации из .7-7 сутки роста ояухояп (Табл.7), Из пссх сро::ах г.з цдогггифгтцпрспзлп пуплзогяд ino, что согласуете;! с пстетзхтаЛ сппяггсстыз фар^зпта ' ГШЗ п клетках стсго ертгз crijпзуспззэ сС.П.Ерсщсзй с соавт. ДЭЗСз.-•• n Согтсэтотпгэ спг.сгЬпиого 'содерегапйл кур в сплепоцотах

его тртгепертэ' пз' репппх- сроках <до 7-их суток» роста rqnarcru' iror^rt сгздотольстг.овать - об'' актазайпи "холостого"

- vn -

p.jiiiua фушидоонированма ino-цикиа: при этом увеличение транспортных поставок экзогенного Нур в лимфоциты с последующим включением его в fcaivage-реавдш сопровождается параллельным ростом активности 5'-Н, приводя к преимущественному дефосф-орилированню образующегося imp. С этим предположением согласуется наблюдение о торможении к 5-ым суткам активности синтеза нуклешюшх кислот в т- и и-лимфоцитах селезенки [С.Н.Храицова с соавт.,1986].

Таблица 7.

Содерхашш нурнновых соедашлшЛ в лимфоцитах селезенки мышей сзна в г.роцассе роста соладиойгепатомы 22 (нмоль/ю кл; м + вц г»-4)

Время после инокуляции генатош 22 (супа;) Соеди- ' Норма ____

пение 1 3 5 7 9 11 13

Ms L 2.7 55 .6 34.0 11, .4 19.0 B1 .0 JÍ7. 0 03.3

♦ 6.2 i5 . 1 +4.2 + 2. 0 <1.0 +9 .4 +6. 0 ♦ 0.9

Oua 23.4 22 .2 19.4 6, .1 15.1 34 .4 24. 5 3S.6

+2.6 +3 .1 + 1.0 +0.7 + 1.4 .0 +3. A +3.2

Hyp 1.6 39 .5 49.0 23, .2 54.6 53 .7 43. 4 14.4

+ 1.3 +4 .1 +3.0 + 3, .4 ♦6.0 +4 .a + 5. 4 +2.1

л íifl 13. s * 36.2 I 126.0 13S .7 26. 0 80.9

+ 1.E> + 13.5 .4 2 +9.9

Ada 14.О - IB.9 30, .4 6.1 9 .1 _

+1.Ü + 2.2 +4 , 12 ♦ 0.5 ♦1 .2

t - следовые количества <o.i - 0.4 тюль/ю^кя)

Тиршшаяьше сроки роста генатош 22 харьптериасьакиоь ьисошш уровнем содержания Ade и Вид, близкими к нормалышы значениями Нур и циькммп ькачеишши интенсивности транспорта пуринов, в особенности Ina (1аГ)л.7). Подобная динамика наблюдалась как в силеноцитах, так и в тимодатах, и, по-видимому, свидетельствует о значительнее! сьякйшш аитишосл! фэршнтшх систьы ал^болмзш пурншо.

Таким образом, функциональнее н пролкфзратнннж: изменения ь лимфоцитах тимуса и селезенки милей cíiía а процессе j>ccra гекатомы 22' сопровоздаш'сп значительными из1.еи<н1ншш внутриклеточного »¡атаоодшма пуринов, характер которого, в choju очьр.-ць, эашггит от транспортных характеристик in vivo нуклеозидои и оонопешгй. Наиболее шрамашша изменения транспортных характеристик были найпшш и клетках тимуса в 1-5 сутки роста опухоли.

Поскольку в проведенной работе рассматривались метаболические потоки в системе "эритроциты-тиыоциты", для более детального исследования метаболических потоков пурииовых соединений в лимфоциты наш был применен метод проточного радиоизотошюго детектирования, позволяющий анализировать отдельные звенья цепей биохимических реакций в клетках.

III.5 МоОелировазше in vitro летаболичеаагс потоков пуриновых соединений из эритроцитов в яилаиияи хишей в условиях развития гепатош 22.

Исходя пз полученных закономерностей интенсивности транспортных потоков пшокс ангина и инозина в тииоциты и спленоциты в условиях in vivo, мы развили идее эрнтроцитарно-эавненмых метаболических потоков в клетки различных органов и тканей, в частности, в органы клхуногепеза, моделируя процессы транспорта экзогенного с^сэпто-ксантипа в тииоциты милей in vitro в условиях, затрагивающих функциональный статус, изданной системы: в экспоненциальной и цпкепмальной стадии роста гепатсмы 22, с использованием пржщипиально косых возможностей, которые дает применение проточного рэдяспзотсппого детектора в высокоэффективной жидкостной хрспатогрс^тп! Cft.Voltkerap, 17093 .

а Сравнительный анализ распределения ыэчепых метаболитов иеаду < эргтгрецптегя п tk¿cisit2isi после их совместней ншеубацни показывает, • что больная часть введенной в зрнтрогрттн , иетлп (в виде с1Лс]нУг) < сосредоточена о c14cíwp. . '

спшэ* . - сгн/1э*

Ркс.б Распределение с1<,с]г.г7> и t^cjAda в тпнощггах (Л) п

- эритроцитах (в), выделеншх на 3 и 7 сутки роста гепатеглд,' при пх сок.-естпоЯ инкубации в течение 60 шгпут, а такие в сродс инкубации (С). : (зрятроцяттд предварительно "нетились с cjHyp).

Причем на 3-й сутки роста опухоли меченый amp идентифицируется только в тимоцитах и среде инкубации, тогда как на 7-е сутки amp был выявлен такяе и в эритроцитах.

На Piic.ii видно, что на 7-е сутки роста гепатош уровень меченого апр значительно накапливается в лимфоцитах тимуса и незначительно возрастает в среде инкубации. С другой стороны, на 3-й сутки роста гепатош, п тимоцитах был идентифицирован меченый адепозин (в эритроцитах и среде инкубации t14c3f>do отсутствовал), а на 7-о сутки меченый аденозин приблизительно поровну был распределен ысхду фракциями тимоцитов и эритроцитов.

Необходимо отметить, что при 20-мин совместной инкубации эритроф1тов и тимоцитов, выделенных на 7-е сутки роста гепатомы, метка идентифицировалась преимущественно в эритроцитарной фракции (в виде amp, ino/Guo и Ado), тогда как 60-шш инкубация приводила к тому, что основная часть моченых соединений обнаруживалась в лимфоцитах 1 шуса, причем помимо перечисленных соединений, входила

ТйКже И ВО фракции IMP/BMP U Мур/Gua (PUC.7).

20 минут

D

¡р

W

3 : iiyp/fiuij

i I I [1 Ino/Guü

,1 I

Е

ui>

ipP/jc:

ia W i

m\ У

A 60 u

инут

в

jHjrp/Gua Ü ! !

1 по/Gilo Ш i !

ШР/НЦР 1 ! 1 ш щ ¡1 ..it,!

! И j !амр 1 щщ

м м I. I. , « • • н ■« А т т т п 1* . '* * • и т т

СРХ/И1 им, и-к/к" «л СРЫ/и'ммм* (3'Х/1аЯ

Рис.7 Распределение с14сэнур в эритроцитах (А) и

тимоцитах (в), выделенных на 7 сутки роста гепатош при их совместной инкубации в течение 20 и 60 иинут

Сравнение радиоизотопных хроматограмм показывает, что при 20*инкубации в среде идентифицируются нуклеозиды и основания, тогда как 60 инкубация приводит к появлению в среде аир, но не нуклеозидов и оснований. Это наблюдение может указываеть с больной степенью вероятности, что в тнмоциты транспортируется не сам меченый пшоксантин, а 'Продукты катаболизма предварительно синтезированных пуринов.

Дагаше, полученные с помощью УФ-детектирования, также указывают па увеличение ко!щептрад!ш в среде шпсубащш свободных нуклеозидов и их оснований. Анализ распределения "холодных" метаболитов пуринового ряда в тиыоцитах, получепных с помощью УФ-ВЭХХ, выявил что к 7-и суткам роста гепатокы, в тиыоцнтах наблюдается общее снижение всех пуршювих метаболитов (более, чем в два раза), а нуклеозиды оденозии и гуанозип исчезают из состава КРФ лимфоцитов тимуса (Гнел).

: Гнс.а Урсягп содар^дап'-Л пурпногшх соединений в ■пшоцктах ггкгсй па 3-й и 7-й день роста гепатсуы 22.

Обращает на себя внимание сравшиае колцеотрзгри "холодных" и адешпгз посколыгу ыечоп.Л адепип тк-.т но был обпаругеи в тюзоцятах, как па 3-й, так и из 7-е супш роста гепатегы.

Получсшгзз результаты позволяют сделать следук.тлс обоб^'-пг,?я.

' Во-первых, провэдешшй эксперимент место считать одгпм из свидетельств наличия сспрлгешюй' систеш транспорта и обмена ПурШЮЕЫХ СС0Д2ПЙПгЗ НЗГДУ КрЗСТЯ.-.Ц КЯЭТКаЮ! кревп П ЛШгфОЮТЯМИ ■тг/сз, поскольку аккумулированная р эритроцитах нотка была зпрзгистрнрсвана в тшгецлтзх после пх совнесткой инкубации с эритроцита!"!, причем о больной стопе пи в вида' аденозшшснофосфсрной 1С* слоты.

Во-вторых, тартппа распределения.меченых и "холодных" пуриповых нетсболптов а пяюцятах (обратно пропорциональная - завистшость для пуклеозлдсп и пх иопофосфатоа) позволяет сделать вывод, что транспорт с14с]Нур •( пли его ыетаболитсо) о '.талфецяты тпиуса сочетая с ревкцпязги его .утилизации впутряклеточными фер^апта»я1, тзгтам, как тпоксаптпи-гуопяп-, а такта адешшфосфср!!бсзилтра!1сферзэяк1.

В-третьих, d гммоцитах опухолевого организма, для которых были показаны глубокие нарушения пуринового обмена при росте экспериментальных гепатоы сС.Н.Храмцова с соавт., 1986], эти изменения могут быть связаш не только с собственно метаболический! реакциями в самих клетках, но и с нарушением транспорта пуриновых метаболитов в системе "эритроциты - тимоциты", так как пуриновый обмэн и в эритроцитах также претерпевает специфические изменения в опухолевом организме. Этот вывод можно сделать на основа распределения меченых и "холодных" пуриновых производных на 3-й и 7о-е сутки роста гепатоыы (Рис.7,в).

Думается, что найденное явление может послужить новым направлением в исследованиях, направленных на поиск биохимических механизмов подавления иммунитета в опухолевом организме, а такаа, в конкретном.случае, в выяснении сложной зависимости между пуриновым метаболизмом и нарушениями в дшМйренцировке и созревании лимфоцитов ииммунокомпет1.лтных органов при возникновении и развитии злокачественных новообразований.

v, РЕКОМЕНДАЦИИ К ПРАКТИЧЕСКОМУ ПРИМЕНЕНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полученные результаты могут использова1ш при планировании исследований, направленных на выяснение роли нуклеинового обмена в тканях организма при организации пролиферативных и деструктивных процессов на ¡экспериментальных моделях и клиническом материале.

Метаболическое давление опухоли на организм, приводящее к нарушению функционального гомеостаза, следует рассматривать в терминах изменений межтканевого сопряжения обмена биополекул, выполняхщих интегративные функции в организме. С этой точки зрения возможны новые подходы к разработке принципов терапии различных заболеваний, особенно злокачественных опухолей и аутоиммунных процессов, эффективный поиск физиологически активных веществ, коррегирупцих шшунодефицитные состояния, а также направленно модулирующих те или иные функции организма через пуриновый и ниримидиновый метаболизм.

Разработанные методы высокоэффективной жидкостной хроматографии предшественников нуклеиновых кислот, а также ряд теоритических положений могут быть использованы на курсах биохимии, иммунологии и

онкологии для более глубокого пояснения интегрирующей роли четаболизма пуриновых и пнримидинових соединишь в органах и тканях п норие, а также при различных формах клшшческой патологии.

vi. выводи

1. IIa уровне целостного организма существует система межтканевого сопряжения метаболизма свободных предшественников ityiuicmtocux ' кислот, вклачакцая ' в себя альтернативные ПУТИ ИХ биосинтеза (dp novo И -Salvent?"), катаболизма, транспорта и утилизацш! нуклеозидов и азотистых оснований, которая фугащиошгрует в режиме метаболического гомеостаза.

2. Развитие опухолевого процесса в организме приводит к трансформации обмена пуриноЕых и иирикндщюсых соединений в печеш!, эритроцитах крови, ли^юцитах Tiuiyca и селезеши организма-хозяина» Эти нарусения вклшаот в себя перестройку активности ферментов биосинтеза нуклеотидов. dt? novo ■ H ферментов реутилпзашш нуклеозидов и оснований, изменение характеристик шпенснгаюстн их. транспорта и катаболизма в клетках. Особшшоста метаболизма свободных продае ствешпжсп нуклеиновых кислот органоспещ!ф;гца1 и зависят от стэд;г! реет л опухоли. ' .

3. Характер обмена нуклеотндсв в тчт'г.: гапатигн сцецн&прн, что х:г.'ра-гйсгтсл п акттгаащш биосинтеза гуяпшюгах нукюоъуюа о •щетках гепзтемы с параллельным cmnteicieu уровня ' здегалзтез (сссбспно атр.), а tains в резкой- увеличение кащентрацнл nyprmcEEJS соцсваниЛ, связаш^-л- с пспипзшгсЛ Егугупуллинся

• cayzwaKsst клоткаки здошша,'. гуаюша я шюкс.аппша из крогяг оргаккзиз-хозяпаз.'' . " •■ . .

4. ^спспзтг-альнпя стадия роста • тсиптс-"! 22 п асцптпоЛ c:ijro.~r Эрллхз 'висглззет':'.

- аяпвэдст кзтвбояима цуряпоз а- почат; гйвотикх с одтгсгрс^зттл' нппсгггогагс:! нлез.тхз, гнпеггеантпна, ксаптшга и иочовоЗ пгслота.

- пезргет¿1213 уро~::гй cr^in'.r.cz'iz. :ii тузитюпих нрглзстпдов в ерггроц'гггх пгепт* из еспх стадиях роста спухолзй.

. - £23ПСО" улзлхпзйгэ 'К01Щ31Гграц-ят" птргптегых Нуклеозлдсв и

- -

оснований в эритроцитах в первые трое суток роста генатош.

- истощение эритроцитов иурпновыми нуклеозидами и основани-яии к моменту достижения клетками гепатомы максимальной скорости роста (5-7 сутли после инокуляции опухоли).

5. Экспоненциальная стадия роста генатомы 22 приводит к подавлению проли.{>ерации генатоцитов через 42 часа после операции частичной гепатэктомии, что сопровоядается возрастанием уровней аденлновых и гуаниновых нуклеотидов с одновременной активацией катаболизма пуриновмх муклеотидов в регенерирующей печени. Стационарная фаза роста гепатомы 22 стимулирует пролифератиьше процессы в реген&рируюцей печени и активирует биосинтез аденшюьых и гуашшовых нуклеотидов. Частичная генатоэктоыия, выполненная на 5-ые сутки роста гепьтоыц вызывает увеличение концентрации пурииовмх иуклеотидов в эритроцитах крови мышей-опухоленосителей, тогда как на 12-ие сутки роста опухоли в эритроцитах значительно снижается концентрация гу аниноьых нуклеотидов и аир и возрастают уровни , инозина и аденозина.

6. Рост гематомы 22 индуцирует изменения транспортных характеристик пуршювых нуклеозидов и оснований в лимфоцитах тимуса и селезенки иыыей, включающих:

резкую активацию интенсивности транспорта пшоксантина в тимоцитм на 3-5 сутки роста гепатомы.

- обратно пропорциональную зависимость между интенсивностью транспорта гшюксангина в тимоцитм и ехх> внутриклеточной концентрацией.

- прямо пропорциональную зависимость этих показателей для инозина в экспоненциальную стадии роста гепатомы.

- снижение интенсивности транспорта пуршювых соединений в пыоциты и сшшюциты и увеличение концентрации пуриновых оснований и нуклеозидов на терминальных сроках роста гепатомы

у. Манду эритроцитами и лимфоцитами тимуса показано наличие системы сопряжения транспорт и обмана нуршшних соединений в реакциях их утилизации "ииада" ферментами пшоцитов, характеристики которой нзийши.т'.я в зависимости ог стадии роста опухоли.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУЕЯШСОВАШШ ПО ТЕ,® ДИССЕРТАЦИИ

1. Анализ ГО ПС б печени и органах иммуногенеза и кроветворения тк:ей на фоне развитии опухоли методом В52Х //Тез. докл. II Всесопзн.спмп. "Нидкостнап хпоиатогргфня". - Черноголовка. 1502. - С.63-64 / соавт. Р.Т.Тогузов, И.С.Мейснер, В.М.Репина.

2. Хроматографический анализ пуриновых и пиримидинових производных органов и тканей человека в диагностике патологических состояний //Тез.докл. I Всесоюзи.конф. "Хроматография в биологии и медицине". - М. - IS83. - С.86-07 / соавт. Р.Т.Тогузов, П.А.Кольцов, М.И.Антонов, Б.Б.Глинка.

3. Применение методов гидкостяой колопосной хрокатогрэф-.т для анализа компонантов КРФ гепатоми 22, органов н ткаисй . мшей-спухолекосителей //Там ко. - C.I42-I43. / соавт. Р.Т.Тогузов, И.С.Кейспеп, В.1.5. Ренина.

4. Хрсматогрг^ичсаагй анализ нуклеозидов и азотистих оснований эритроцитов крови милей в процессе развития солидной гепатоии 22 //Тез.докл. III Всесоюзи.симп. по иолек. • хидкостнсй хроматографа. - Рига. - IS04. - С.52 / соавт. Р.Т.Тогузов, и.С.Мейснер, А.М.Пименов.

s. Способ дифференциальной диагностики рака и язвенной болез:гд яелудка //Авторское свидетельство й II25803. - 1204 /соавт. П.Л.Кольцов, Р.Т.Тогузов, И.Селиванов.

6. Способ определения прижизненной травматиззцил югпял //Авторское свидетельство .'5 II30I30. - 1984 /соавт. II.А.Туманова, Р.Т.Тогузов, В.И.Кряков.

7. Хроиатогргфпеский анализ формирования пулов пуриновых п л::ртЛг ииданссих проксаодЕ« в тканях при организации пролк-^зратаяисго -процесса //' Сб.научи.трудов "ХвоматогроФия в биологии и недшипт". - ?,!. - ISS5 - C.II5-I23 /соавт. Р.Т.Тогузов, А.М.И::>:опез, Н.С.1'сПк;гр, П.Л.Кольцов.

D. Способ прогнозирования рчска рсгг;п;пгя детой с иягзчпсЛ дистрсГ'доП Д(х?ена //Лптсрсксз сЛидстольстао .'-> r_*73ii.7. - г;с,. -/соавт. Р.Т.Тогузов, В.О.Ситников, Б.Ю.Псскудтш.

9. Регуляция г.стгболиома пуриношх и иъ^адыносш: крстг.сдчпх -основа диагаостшот патологических ссстсхпгЛ в .экспегспгзпто и паагитю //'Л. Востшп: АУЛ СССР. - IDÖ6. - К3. - С140-52 /созвт. Р.Т.Тогузов, В.В.Талицкий, И.С.Лойснер, А.И.Пиконсз.

ю- Слределе:шо пуршювых и пирииэдшоБЫХ производных в ссстгвэ KF2 с?;ггшоа л тканей методом' гисскоЬффакпшисй шдксстлсЛ • с'Зоягеш'о-йазпоЯ иси-парной хроматографа //д. Bonn. изд. хкчга. -15Й7. - СЛЗЗ-ГЗЗ /соавт. .*Р.Т.Тогузов, Л.П.Пжмжв,

.'Г.С.Мгйспср, Т.Я.Новикова.

11. Оптимизация разделения пураноинх и шго'.юццшоп'л соединений гтгодс:«. цон-пзвнсЛ образевио-фззисй шсскоо^ФэктивкоЗ птддсстпсй гссмзтографии '(ЕШХ) // У;ф.Сиохит!.луриал. - ISS3. - -C'.35-i0 / ссавт. Р.Т.Тогузов, А.М.Пш:епов, И.С.Мейсппр,

12. Метаболизм пурпповнх соедянегиЯ в тканях опухолевого cprairirvs //Сб.нзучн.трудов "KCMIICHBHTU нуклоцпосмх гаслот. - Рига. I2G3. - С.34-35 .

13. CccC?;:r:cci:i сбмспэ пурипсзгзх соадтею'Я в гепатсиз 22, печени н эритротггга;; крови ?±:пой в прсцассо развития опухоли //3. Вопр,

- 1ЭВЭ. - ''3.- С.125-12Э /ссавт. Р-.Т.Тогузоо, А.М.Ним-тггоз, И.С.ИеСснор. ..

14. Трснспорг м сСпзп яуртювж ссздинзплП в . лнлроцнтах тимуса и селезенгл линии сзна в процессе роста гэпатсяз 22 //2. ?;:спег1г,'..с!—ог.аптл. - 1989. - Т.П. - JH. - С.33-37 /соавт. A'.M.Ifcü'Sircr!, Р.Т.Тогузов. ■

is. Применение обраченно-фазной ВЭ1Х в изучении метаболизма нуклеотидоп в клетках с различной функциональной активностью // Сб.научн.трудов "Хроматография в биололш и медицине". - Ы. -1989 - С.26-32 /соавт. Г.Гербер, А.Вернер, В.Зиме.

16. Анализ пула свободных пуршювых и пиришщиновых нушшозидов и основашиЗ в тимоцптах, Т- и В-лиифоцитах селезенки мышей езнд в процессе роста солидной гепатомы 22 //В. Биохимия. - 1989. -Т.54. - ЛИ. - С. 1057-1865 /соавт. С.Н.Храмцова, В.С.Шапот,

17. Метаболический пул пуршювых соединений в эритроцитах крова нишей в процессе роста перевивных опухолей //Бюлл.эксперим.биол. и мед. - 1990. - К7. - С.39-40 /соавт. Р.Т.Тогузов, A.M.Пименов, Г.Гербер, А.Вернер, В.Зиме.

IB. ВЭХХ анализ пула иуриновых соединений в регенерирующей печени и оритроцитах крови мышей в опухолевом организме //Тез.докл. Y Всесоюзн.симп. по молек. жидкостной хроиато1рафш!. - Рига. 1990. - С.214 /соавт. Р.Т.Тогузов, М.Д.Пташинская, П.А.Карманов, Г.К.Красюк.

19. Application о 1 HPLC In diagnostics of pathologic states In experiments anil clinic //5th Danube Symp.on Chromatogr. — Yalta, U.S.S.ft. - 1985. - P. /with R.Toguzov, P.Koltsov, Yu. Bu tov .

20. New aspects of application of HPLC in biology and medicine //5th Dant'be Symp.on Chronatogr. - Yalta, U.S.S.R. 1905. - P. /with R.loguiov.

21. Natural chromatographic systems in biological object» //Chromatography, The State of Art. - Budapest. - 1905. -P.761—807 /with R.Toguzov.

22. Chromatographic analisis of purine and pyrimidine derivatives from the tissues of animals and humans in experimental and clinical pathology //Chromatography, The State of Art. -Budapest. - 19S5. - P. 7 /nith R.Toguzov, I.S.Heiuner, P.Koltsov.

23. The separation of the major ribonucleotides, nucleosides and bases in revorse-phaee ion-pair chromatography //J.Liquid Chromatogr. - 1986. - V.9. - Jfe. - P.1003-1019 /with A.Pimenciv, R.T.Toguzov.

24. Simultaneous separation of ribonucleotides, nucleosides and bases by ion-pair reverse-phasi- HPLC on columns with radial compression //J.Chromatogr.Eiomed.Appl. — 1986. ~ V.365. — P.221-227 /Hith R.Toguzov, I.Meisner, A.Pimenov.

25. Determination of nucleotides, nucleoside» and nucleobasto In cello of different conplexity by ri»vers;ed-phase end ion-pair HPLC //0.Chromatogr.Bioflted.Appl. - 1987. - V.421. - P.257-265 / with R.Toguzov, A.Piinenov, A.Werner, W.Sieraa, I.Ftepoport, 0.Berber.

26. Separation of nucleotides in cells of different oetabalic complexity by use of reversed-phase and ion-pair HPLC //Chromatography'07. - Budapest, Aled.Kiado. - 1989. -- P.495-503 /Mith A.Werner, H.Schmidt, R.Toguzov, A.Pimenov.

27. Determination of purine derivative pools in mouse tissues during hepatoma 22 growth by HPLC //10th Intern. Вушр.л "Bior.ipd. Appl. Chromatography and Electrophoresis. - Pilsen, CSSR. - 1900, — P.52 /with R.Toguzov, I.Meisner, A.Pimenov.

28. HPLC analysis of purine and pyriraidine compounds of red blood cellst„diagnostic significance //10th Intern.Bymp. XBiomed .Appl. Chromatography and Electroptibresis. - Pllst»n, CSSR. - 1983. - P.53 /with R.Tngulov, V.Prokudin.