Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранотропные эффекты глюкокортикоидов при остром лимфобластном лейкозе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Мембранотропные эффекты глюкокортикоидов при остром лимфобластном лейкозе"

РГБ ОД

'4 С ГЛ'.П '

lu!

ШШШТЕРСГШ ЗДРйВЭОХРАНЕВ® й КШЩШКЙ ПР01ШЛЕКЮСТИ РОССИЙСКОЙ CSffiffAWflí РЯЗАНСКИЙ ГОСШРСТВБННЫЙ МВДШШ&Ш УЕИБЕТСИГСТ Еиени академика И. П. Павлова

Ш правах рукописи

*тьт>, 53?. 465

БУЛАЕВА Шталин Николаевна

щашникшБ экекгы гдаоЕСгРгшкадсе ери оеяш

ЖЖТЖ-Г-Ш шшш

CS. СЮ. Q,i. ~ бкюаш

А в * ope të s р а т ■ j&ssvpmwz- та ооаосгняэ ученой ототени

неук

Рйзаяъ 1994

Работа выполнена на кафедре молекулярной форшколзгии с курсом радиобиологш Российского Государствзнного медицинского университета.

Научные руководителя - академик РАЙ,

профессор £,Айроев

- й.м.йг А С./^хакив

Официальные оппоненты - 2. м. Я., срофеесар

ЙГ-Узбект

- к. ы. й. Л. Е Дмитриев

Вгдущя организация . - НИИ биологической и

медицинской химии РАМН

Защита состоится " " 1895 года в " " час.

на заседании Диссертационного совета Д 084.67.02. при Рязанском Государственной медицинском университете имени акадекика ПЛ.Павлова (391000, РФ, г.Рязаяь, уд. Высоковольтная, д. 9)

Авторефйрат разослан * * 1094 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Рязанского Государственного медицинского университета

Ученый секретарь * >

Диссертационного совета,

юадидат. биологических наук . Е. А. Рязанова.

ОБЩАЯ ШАКТЕРИСТШ РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЁМЫ Глюесокор?икокл1йге'ropimif (ПО, ~ «зчяная с" "появ^шя" изс" сивтетичееких еншюгов в 50-е годы, пярэко использует «л а клинической практике для лечеаия здокачсствешшх опухолей система крови, а том числе и острого ля».<$обл82тц&г© ©?йкоза (ОДЩ, как часть ко!йшяров?д1ко<1 xtaaorepanici. Их прямекелие гф/слскг^по Еыражнкыы рсгулнруаэды влиянием ¡;а л»ь;-4о- и кйелоиозз, Дсоен-

фекта на нормальное кроветворение. Однако, несмотря ва ¿-"ачн-тслыгые yen охи в терапии лейкозов проблема лочезка отого заболевания остается нерешенной. Действие гормонов ногг? быть нейтрализовано наличием врояденной или приобретенной резистентности организм больного к глюкокортикоидам.- 3 этих случаях гормонн не способнн вызывать лизис лимфоблаетов, и, следовательно, ле«ЙК:«.е СгСгЗЫБЗеТСЛ Ri$sf£'.JSJ«5!SHV>. 8> iO времени иесясдоЕатсШ! vu?:m\sb обг-.з-лт'::, рдогшдаодз: фоблеетев <■ зкзмалЕЯкк ре^-зн'.'лрлсо слзарлта гкгссзк-жшигй (Llpprrsn Я к д?.., JC75, Blocks И Г., ia^ii! " , Antacly Т., О .-"г.г:I С., 1950). О.тгмс достокс-iной между чуЕотЕкклы;ос"ь?л к ГХ-ирагсж "л СРСЗЧ^ОДГК рецегпгоркого аппарата быявлзйо не было. Вошахэо, это объясняется три. что з сс^ержтсз й'-гуплмгтг iw»b цедтороз .» акцепторов гдаггдаргпгксу«, локализацией, сродством и гадячестгэду, что сбусгшшеает гг?го-личеейне трудности в езрэдедзнаи кггтаюй гаиювзгредя аауг-риклегочннх ргцептороа ГЕ. Б оабигах ясслеятяс лег uv^sero, что наряду с внутр!!клеточно54 всжптср;гай скстеетй. каегка-ки-шенк содержат иэ'йражуз участки авчаьаапая сторсл"шас гзрмо-

— 2 -

вое, которые вносят суп^ственный вклад в общее специфическое-связывание стероидов {Сергеев ЕВ. ,1987). В то яе время в принятие до сих пор схешх проведения радиорецепторного анализа значение мембранных иге? связывания ГК ке.учитывается. В ряде работ (Savcsto J. и до. ,1&37, Kiss С.» и др. ,1900, Bulva G. J., Printer a ,1991) сдвигается изменение мембранных и цатозеш»-них феряягов клеток при вознхкаовекки резистентности, сравнивается фенотип кхеток, состс¡вниз плазматических мэмбран. Однако нрвдлагегмиг авторша методические подходы достаточна трудоемки и, как правила, не далг достоверных результатов.

Ш ваше*»? ыпеиив перспеетишш является комплексный метод, обьединтцйй как определение мембранных и цитозольных мест связывания глтзкортйкоивов ' в клетках-миазгнях, так и оценку действия горшков т систем? вторичных мессендяеров.

На основании шшизлгшенного бшш определены цель и задачи проведенного ншн исследовании

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ '

Полью настоящей работы явилось изучение специфического связывания глшасортикоадов я их влияния на систему вторичных мэссеидмгров лям$областов у . больных острым лимфобластным лёй-геозом, различагвдгхся своей чувствительностью к данным горЬЕнзм.

В связи с этим были поставлены; следующие задачи:

1. Иссдадавание сяадафкческого связывания ГК .'внутриклеточными рецепторами и плазматической мембраной дшфоб ластов с взпожзоаанием полныераых производное гормонов (ПЙЬкортизол, ПШ-преявкюазн. 1Ш-д^еыетазоа).

2. Оаредезвике . количества участков связывания —Й-Дексаые* тазона в лимйоблэстах- гормоячувстаителЬяых и ;. гормонрезистент-. еых больных 'с . пришйе1йжм >(одкфицироеанаого радиолигандного -

""нетодаг - -- '- ■-'-- ° ------ ---------- - ■ —

3. Иссгедсваике влияния кктогеяэв ттшеявхава. Л я деке-тран-еульфзта, а такке орахадоновой кжготк на -спстеыг згорзч-шх !.:ессепдггкров (кальция, инозктолтряфосфата и цАМЬ) к значение рН s лим^сбластах.

4. Оцзкка влияния глвкокортикоидов на.ьотогеп-кндушсто-

п рио^емч вторичных иассендгвроз и увоЕне рН лимфойлаетов горыон-чувстзателькьсс к p&iasxestns: бэгьпк^.

Е4УЧНАЯ ЕОЕЙЗЕА РАБОТЫ

В данной работе впервые с применением ББП-анагагав гормонов было изучено специфическое связывание ГК лим&зблзстаии костного ыэзга больньг ОМ о целы» выявления мембранного этапа взаимодействия - и его роли в юягсрецедюи горюнов. Пэлучзгякэ амспераменгальвыз даш» свиквтгдьстзуот, что лгафзэсззты го-дгрулт два ткяа. участков связшшш ГК. отдевзтшв; цггей и трорностье по схпявшот к глж&'яртпкзгдош posaes зга«-ческой цряродк. (fcszsa тзазсд о к&збхошлети учпн особенностей гзаяиегаЁстаяа городов с .рсзяпиашя скггеьгш дафоблаетсэ ttps лсетя&гздвавии рздшвгтаяднсго ака-лщгл,. Выведены изнзрзнин базежьаого и

УйОДВД ¿тогячншс «йсс^идаерс.«, a та*»' рН а 1Ь-

. кзэййь 4jjq. хладсокоргвкэкзда евссобзы Олжировт шй-сгчн-гад.,'-взмеяежш уровяя гсялхцгся, апозпгодтркфссфзтз a jïIj в Jswfefesaaax богшЕьа. .чувстдаельямс к гсрмшйлорзгоя!, в от-гя-чие ст резкстектязс баикна-

Рвзрреатен экспресс-метод cusmcst иадивдуадькой чуветги-телькокн бо.дьныг ОПЛ к гля^окортикоидам в- уеаоввдк m vitra, который- ocgflsas на: 1) проведении модифицированного радколи-

?

- А -

гандного анализа с целью определения истинного количества ца-тозольных рецепторов ГК; 2} изучении изменений ыктогек-индуци-росакного внутриклеточного уровня калымя и икознтол-трифосфа-та, а тагсг рН при действии ГК

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Союзные результаты ксолздоезняя были доложены ка Всероссийской конференции "Внутриклеточная сигнализаций"" (Звенигород, 1233), ка совместных научных конференциях кас^едры молекулярной фармакологии к радиовкологкз! медико-биологического факультета и ПНЗЛ молекулярной фармакологии Российского Госу-дарстзе.-'дсго медтгцинскога Университета.

ПУВЙЖАЦЖ.

1Ь материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИЙ Диссертация состоит из следуюцпх разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и .методов исследования, результаты исследования. и их сбсуз-деш-ю, еыводн и библиографический указатель, Бкхючах-щгй 122 источника. Иллюстративный материал представлен 22 ркеуккамя, 5 таблицами к схемой.

^ ■ МАТЕРИАЛЫ И ШОДЬ! ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на лимфобластах костного мозга больных сстрш ламрэбластнш лейкозом (ОЛЛ), проходящих- курс лечения в 14 гематологическом отделении 1 детской ГКБ (г.Москва). Диагноз устанавливали в соответствии с. Классификацией ВОЗ (1976). Обследовано 47 больниц (19 девочек л 28 мальчиков) в возрасте от 1 года до 9 лет. Их шшю разделить на две группы: у первой группы детей-биопсия проведена с' диагностической целью; у второй - в динамике при повторных рецидивах заболевания.

Клетки получали из костномозгового пуяктата (0.5-1.5 мл),

fîc?opu8 пздехгз&Г» Оч-Ук рзеуспендирйв&лл .Пла-

ченную суспензия ця-пьтт--;-.'/;:.-1 "-reo г т^'л!™--;; •

г:;, ¡й??трк?:,тпруя прз 8Сй* 1С «.ли. RH., 1Ü8SJ-. tísreu

концентрата кл-згсс декадою JU-20

Ллк on; .. :•• . ~т.:~гг"" тт-

лизованных ва 1да>з№&:г:эдкз£ •• .:• ..••;. -/г ь'.г., .■. . ~

'пвп-козгизол. ШТ-аекзэдзтззок п НЗП -предниоолов), ¡coTcpav к* н-к^л t'il.,,^,;—

Е.Ф. к др., 1989). 0.2 мл суслеязка ^инроО-зотоз (10-20у."**кю' мл) инкубировали в тече'.гле чаои в пр{юутст£Ял''С-1Г>-Л-№>1.У553с-л»,

Ф

' С-ПБП-де;;сам-?та"Спа и С-ЛШ-предгшголона гаяцек'гтш.ж в среде шкубацкп сосгавдила от 0.5 до 5x10rM (Духачик A.C., 1ST.31. аш определения-специф15чее:<ого связывания 'С-ПСПгГК в

г-мс;: 00С - > • ■•■хп:.u v'i. •..•■ • Utх лоз: ? ■■■. -ло.-р. х ■„'. .''.

г?ро5 nepeíiO-ч;.^. хх-'/Г "<v- -;v ' ■■■. ••■■ -.vr:;-- -■

5 puivrrop? ■ r -j-хух :>?-■ .. .

саги s í-iawnr ¿Í« •:■ <.;••>/*;•<» WW-.-...

lîiEjLiiïû-'.'" -Л "X x'yxixx V

дастов EinacsaSK ¡ж; розницу меаду hiü^vse^-ü л ,,.» r.u's-

••„i;.-:: ПО ¡X-'-XX.X, .•.;:,;/ Л: к .••.7-^ ая. ЛЙКеаьЮГзЗОЯС

и upcÁHíiw^-u^ i-i-^ï'' x::,ù ' ■ -"v. •' - .. Л".-

гев, связанных дямфобластзмз в присугсгз?« 1СЮ0- rçurs&ro ботка неученых C2GÏJ^iiîx: r.pvw:;: ( гост*?*». i еют.таа-

; гл: ;.

!£с5»*о*зпйз связывапяя-ил^и^ гг. ^■vi.--

цептора'л;! .си;.0:<0;пг,'оь ijp-.-ii.v'.'Wö по г^есп/У?^:,::* : x'r.s но с использование« непохингрных тнлого» r~r..c¿x:¡ П .-«г-ъгд концентрация "'н-корткэола, 3н-прегшзолоиа и *Н-дексймеа,азопа

- 6 - . . составила 2-30 й! (ТЬопразп Е. А. ,1979). К суспензии проинкуби-розанныг с гормвяада клеток добавлялся дигитонин в конечной кзицентрасш 50 >яШ (Ырршап М., 1378) , который вызывал разрушение шабршш. Для определения цитоплазматического связывания ^Н-горшеов отбирали аликвотн (20 ыкл) суспензии клеток и переносили их в пробирка, содержащие 100 ыкл 1.5 мМ МгСХ^в растворе декетрак-покритого угля, тайте льно. перемешивали и оставляли на 15 шш. Далее пробы центрифугировали (15000?. 10 мин) и су-перкатанг радиоиетрирог-алл.

Б данной работе бог разработан и в далькейкем использовался шдифианроваишй радиолигандный метод. Целесообразность его применения определялась необходимость® количественной оценки специфических мест связывания ГК, разлкчащихся сЕоей локализацией (меьйраннызс и цитозольпих) в лиыфобластах. Исследования проводились еле дующие образом. 0.2 ил суспензии лкм-

с

фобласгоз (10-20x10 кд/ил) инкубировали в присутствии насшаэ-пзгй концентрации -^Н-дексазетазона (20 кЫ) в течение часа при 4* С; в присутсгвхщ 100-кратного избытка немеченого дексаиета-зона иди 1 ООО-кратного избытка немеченого ИВЕ-кортизола. Чжло специфических шех связывания для дексаштазока рассчитывали следувдии образок

а) разница-, медду кслкгсгвш* Е-дексамзтазаиа, связакого лим-фсбластаад в отсутствии (обвзв связывание^ и в-лриеутсгнии избытка немеченого дексажгтазока (^специфическое связывание)-егандартяыв радшлиганданЗ к&тод; .

б) разница меазаг количество« %-дексаметазона; саазаного клетками в присутствии ГШ-кортгоола (внутриклеточное -связывание)

и-избытка немечсшсга -дегазаметгЕсиа Снеспецифкче'ское связывание).

¡Ш ацзнки изменений в систег^е; вторичншсуессепддеров ис-

• пользовались следующей меюдкга:. ,,

Сдр^лелсгк^ г: ¡-.-¿гочг-: '. (ГСт. 3;) прово,"илосг. с использованием • Фэдо^сои^и';;:;;-- .с.-а-г "ША-ГУ^М по елздуу.-';?1.': мотодж;' . .'л*:.- г. Л. - ¡V?'/;.

{-: м.О-?Л »«»Н/ЫЛ) ДОбЗВЛЯЛа ¿УЖ

гиг:л-2/,'л'1 i! ' ...г-л т.-? -

и инкубировали 20 мш при 37*0. После этого ¡слетки отаджмя я

спектрофдуоркмет'ре "ШЪаоМ 1.РГ-3" при доджах лс.1'!и ^эбуяд-г-ния Флуоресценции 340 и 385 км и регистрация - 500 Дхя расчета лкутригасто'цюй концентрация кодьцея йспсл^окыйсь формула, огпкггжгая з »¿зтодокг. При исследования влгйг.пщ м:гго-генов на уровень ССа-]; применялся тенкшавалчя А (20 ¡--кг/м). .Гг.'-^г.судъ-'д. {", * ь яр*™».«-"«* '3

¿0 . . л-1 у :">",' ' - ; у .-.'■-■....

ЦК8):. -с-у?"--"".-":" о.чут." '

20(3 Мг.Н) к :;,г.;; .,"„': ■'. бацид: ■.. у ..■••!....; ' -. .

гормоао>; "л :.'Ц':\\"С''С>' нп .т/.^о^л^ог;-'. •

фойй ирОКМ.-у ¡СУТОК о ^ул*:^;,":.:"' 1"!; "1,с.-.- г"у

/■••¡олсду-яум ?.<>*»> иовкаиэгаажта А (Кои Д., «екс-

тр:?.:-.-оу _ чОе--'^! ;:'!. г •■по",

.уровня ССа оцевувэлось тареа 2--3 етгйосге до&игяйояп гекоз.

Лровсдидс-::- С? '."К УГ^У-УЬ-'"^^-» 1'- --""'"V.

КОТ'.рКЙ Г:". ГНУ"у;У . . Ч'..:'.' ' ' ' "Г: Г"

клеток о.;.■. -ч г ?л-,пке. г^аг-гп:--

ПВА-г/Щ Оар-зделопж ^иенсний рН прсгсдвлось с иг.польэсаа-

. вяеи калибровочных кривых флуоресценции BCECF при длине волны возбуждения 500 нм и регистрации - 530 нм (Erinstein S-,1985). Действие митогенов оданивалоь с помощью Кон А (25 мкг/нл), а глккокортикоидов - с псшцью кортизола (3 мкМ) и предлизс.юна (1 мкМ).

Для измерения содержания инозитсл-трифосфата в л;шфоблас-тах использовался метод ионообменной хроматографии на органической смоле D0VEX 1x4 (200-400 меш, формиатлая форма). В качестве метки применялся мио-^Н-инозитол (65 мкКю/мл), которой во время инкубации с клетками встраивается в полярные головки мембранных фосфолипидов. Лимфобласты (3 млн/мл) помещали в 24-ячейнуа плеску и, инкубировали с меченым шгазитодом при 37 ° С в течение 4 часов. Шсле инкубации клетки отмывали от метки средой 199. В каждую лунку добавляли 1 мл среды 199 с 5х102Ы LiCl и проводили инкубацию с исследуешми веществами: Кон А (25 w . /мл) и кортизодоы (3 мкМ). Инкубацию останавливали 1мл горячего 1% SDS/3xlÔ2M ЭДТД. Содержание лунок хорош перемеяквали и отбирали по 100 мкл для тотального счета. Оставшийся лизат помещали в хроматографнческум колонку с 0.5 ici D0WEX 1x4 и определяли концентрации IP, 1Рг , IP^no Heaters а (1989).

Для исследования содержания цАШ в димфобластах после 40-минутной предварительной инкубации при 37 С к пробам, содержащем 1 мд суспензии клеток (10 млн/мл), добавляли исследуемые вещества в объеме 20 мкл или 20 шл раствора Жчкса ( контроль). Исследовали влияние кортизола (3 ыкЦ) и Коя А (25 ыкг/шо на внутриклеточный уровень цАШ после 5, 15, 30 минут инкубации лиыфобластов с указанными соединениями. По окончании инкубации клетки разрушали' в ледяном трис-ЭДТА-буфере (рН-7.5), проба немедленна, померзли ка водяную баня при 90° С

на 3 мин, затем центрифугировали и Í суперяатанте определяли концентрации. цЛШ> с помощью стандартных наборов фкрьги "Anersham" (Федоров RA., 1990).

. Статистическая ..обработка подученных результатов производилась с использованием tкритерия Стысдеггга и Уилкокеона (Лакин Г.Ф. ,1980).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ К ИХ ОКУУД!»«?!.

1. Изучение характера связывания глхкокортикоидов ли :5об-ластамя костного мозга.

Исследование механизмов взаимодействия ГК с ликфобластами позволило выявить существование двух типов участков связывания горюнов, различающихся своей локализацией, количеством и сродством к данный гормонам (ом. табл.1). Полученные результаты свидетельствуют о том, что троиность гормонов к мембраяной ра • цепторной системе подчиняется следующей закономерности: морги-зол > предвиводоа > декоаметазоя. Относительное сро;:с-тао к внутриклеточной рецепторной, систем имеет протквонолодгуз зависимость: дексаметззоя > предавался > коргкгал.

С помощью кодкфицикации радшлкгаидного метода опр^дсяч-акя рецепторов ГК, преддожгяпй вами," у термснревистектщх болышзг выявлено, достоверное ;р<0.05) сmxemte ксли^стга »о« связывания "%-дексаметазона по сравнению с результатом, полу1 чзявим при использовании стандартного радиолигаяднсгс адашза. У гормснчувсгеетедьньп' большее такого жшжашет «е не.5 лод-'coi (рис.1).

Такай обряаом, при гормончуветяитс-льисй Форм? гэбгдогодм вклад мембранных участков в - общее связывание ¡í-декеамс-тазона лимфобластами незначителен. При уменьшении содержания

- н> -

дексаметазоя предиизолоя щэтпзол

внутриклеточные рецепторы

Кд (нМ) £ (пмоль/мг белка) к~х (мест на клетку) 4.8 - 7.2 0.23 - 0.36 6300 7.4- 11,-4 0.29 - 0.41 7100 10.8- 17.4 0.24-0.30 5500

мембранные учйСЧгкгг Сййзыващга

Кд (:,жМ) 2 (пмоль/мг белг.а) ^ (мест па клетку) 0.32-С.% 2.6-3.8 65000 0.34 - 0.42 3.1 -4Д 77000 0ЛЗ-0.17 3.5 - 4.9 85000

Табл. 1 Параметры специфического связывания глюкокортнхоидов япмсЬобластам!! костного мозга

П

£ 50000

к

к

а

5 30ООО

га я

о

10000

А

Рис. 1 . Анализ содержания рецепторов глюкокортикоидов в лимфо-бластах костного мозга с памощыо стандартного (А) п модифицированного (Б) радио,тагандпого метода

I - группа больных с гормончувотвительной

формой ОЛЛ (п = 20); П - группа больных с гормонрезис-тепТиой формой ОЛЛ (п - 8)

гшулрп;с7е?очн1;х рецепторов, которое ксхйт быть вызвано длительные приемом'ГЯ'препаратов,""'либо генетически детерминировано, .вклад мембранного связывания с-тановнтея существенным. Кс-яодьсоваяке ПШ-кортязола в модифицированном методе устраняет мембранное взаимодействие..

Полученные в данной части работы- результаты позволили утверждать, что предложенная нами .модификация радиолигандного мигщл o«iùeiiô^aiU ГК у«кт»я»«т как специфические

мембранные, так и внутрмслеточкые места связывании.

2. Ейияние митогенов на базальный уровень вторичных мес-сендкеров.

Действие Кон А и Dex S на базальпый уровень кальция в . лимфобластах, который составил 125+18 нЫ (п-4), носит дозоза-висимый характер. , увеличение при действии

Нон А до 250f£5 кМ (р<0. 05) и при действии Dex S до 131+il цМ (р<0. Со) наблюдалось при концентрации мктогеков 25 мкг/мл и 0.1 МГ/МЛ соотв^тс-веино, ЧТО ПОДТЕОрЛДТ.'гТСЯ ЛИТерагурННМИ ластики (ГукоЕская А. С. ,1336).

При Поучении влияния зазогечно добавлю кой арагидоновай ¡колоты в концентрации 3 мкМ (Астаакпн Е.К , 1S90) на изменения внутриклеточной концентрации Са в властных "клетках наблю-далсоь бич: трое увеличение ССа'"]1 от базального уровня 125 + 18 нМ до'240 + 25 нМ (р<0.05). Для того, чтоби определить, откуда ионы кальция поступают в цитоплазму клеток при действии АА, были проведены зтеп5рШ.лй7Ы в бескальциевой, среде. Са в инкубационной cf зде связывали EGTA (1 мМ), что привод,'ГЛО it резкому снижниа базального уровня &йу&ресценц«п ■(рис2Б). АА (3 мкМ) ¡¡у .-:::r к улгличеплю внутриклеточной •«•онцентча-

ции конов кальция примерно на 55 t 12 нМ (р<0.05), что

[Са^нМ 240 г

190

140 "-г.

(а)

Змии

[Са*Ч„нМ 140 г

110

80

(б)

Змин

Рис. Я Влияние ЕвТА на индуцированное арахидоновой кислотой (АА) повышение уровня [Са**], в среде, содержащей 1 иМ СаС12 (а) и в бескальциевом буфере (б)

1 — АА (3 мкМ);

2-ЕСТА(1мМ);

.7-СаС12(4.5мМ)

примерно в два раса меньше реакции, ■ наблюдаемой в 'инкуб ацион-кой среде с нормальны! содержшием ионоа Са. Данный факт, а

тш-ийе характерная кинетика Саг*-оТвгта на АА в среде без каль---

ция позволяют предположить, что АА индуцирует выход ионов кальция из внутриклеточных депо клеток. Если в среде с ионами Са на фоне действия. АА к. суспензии клеток добавляли ЕСТ А (1

з 2

мМ), наблюдалось резкое снгокение уровня [Са 1; (рис. 2А), который восстанавливался при добавлении СаС^ за- счет поступления данов кяльция через каналы ллазызтичгскиз жибран. Таким обра-гом, при действии АА на лимфобласты, Са--ответ является суперпозицией двух процессов: транспорта ионов кальция из инкубационной среды в цитоплазму; 'а также выхода Са из внутриклеточных депо-

Добавление АА (З ыкМ) на фоне действия кортизола (3 мкЦ) приводило к росту кальция на 52 ¿13 нМ (р<0.02) от базального

уровня, что напоминает увеличение Са в бескальциевой среде. Полученные результаты свидетельствует о том, что в терапевтической области концентраций кортизол блокирует Са1*-каналы плаьматичеслих меиЗрпц препятствует индуцированному арахкдо-ноеой кислотой входу Са извне в клетки. В то зке время гормон практически не влияет на стимулированный АА выход Са из внутриклеточных депо.

Рост рН под действием Кон А составил в среднем 0.5 единиц от базального уровня 7.1 (р<(3.05) и продолжался в течение б мин от момента внесения препарата. Затем уровень флуоресценции медленно падал и за 20 кяпг достигая исходного значения, выравниваясь с внеклеточным рЕ Влияние Вех Б на значение рН з лшфсбластах значительно менее выражено и не превысает изменения рН на 0.2 единицу (р<0,05). В последующих экспериментах

используется только Кон А.

Шд действием ыитогена Кон А, индуцирующого метаболизм фосфоинозитиддифосфата через активацию фосфолипазы С, наблюдается рост всех фракций инозитолов (1Р, 1Рг , 1Р, )• Концентрация 1Р, и1Р3 возрастает в течение 10 мин, тогда как для роста 1Р требуется лаг-период (рис 3). в

5 ' ХО 15 20 25 30 Вршя- инкубации с штогеном, мин

ТР

-о-—IP,

■1Рс

Рис.3 Влияние конканавадшгз .4(25 ¡.от/мл) ка содержание фа сфоинозитолов в--лвмфоблаетах

Ери определении влияния Кон А на содержание цА!й> в лим-фобластах ~ были обнаружены значатедьшге индивидуальные различия. Добавление митогека в одних случаях (7 наблюдений) приводила к достоверному; снилашш уровня цАШ, в "других (б наблюдений) вызывало увеличение внутриклеточной концентрата: цАМ5. Направленность действия Ваз А ва содержание. цАМФ не коррелировала с полом, Еагрзегак- к формой заболевания обследованных больных.

3. Исследование действия ГК на базальный и митоген-стимули-рованнкй уровень вторичных иессендгоров нрН в лнмфобластах бальных, и-кющих различную чувствительность к гормонам.

Показано, что кортизол (3 мкЩ и преднизолон (1 мкИ) после-предварительной.- инкубации.(30 шш) стимулирую? прирост исходного уровня кальция на 42±13 и 33±9нМ (р<0.05) соответственно. Изучение действия ГК «а митоген-индуцированный уровень 1Сз*\'в- ди*4о£ыастах,.-шгтаго'аозо-,'тт зреиязавяеюяй характер, позволило разделить больных ОДЛ на две группы (рис 4,5). Больные, у которых шгибирующнй эффект кортизола на рост кальция Быраянн-значительно, . относились в основном к первичным (диагноз острого лейкоза поставлен впервые). Отсутствие или слабое кальцийблокирующэе действие, гормоном . митоген-индуцированного ■ уровня кальция- характерно для бальных с рецидивом заболевания. Увеличение продолжительности инкубации клеток с кортт;£СЛСм СЕьпге 30 мин приводило к ПССТёПёнпоыу еншяению митоген-индуцированного уровня кэчьция в лиыфобластах гормончувствительных больных. В то же время инкубация с ПВП-кортизолом свыше 30 мин. практически не изменяла его (рис 6).

Следует отметить существенные индивидуальные различия ответа лимфобластов на ; воздействие препаратов ( в ■пределах 60-307.). В то хе вреда, при повторном определении кальций-ответа клеток у одйого и тога Задзккхг. различна пв- гфевыаади. 10-152, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости ре-, зуль'татов.

Изучение действия гбркспсг визвгло отсутствие достоверного влияния кортизола (3 ъкМ) и преднизоло1га (1' на базаль-ный ураегкь.-дгЯ в..Л1яфбластзх. У части больных ( в основном первичных) после предварительной инкубации с. ГК (30 мин,, 37*0)

-к -

[Са2+]„ нМ 3001-

□ Сотго! Ш Соа А, ЕЭ СсйЬйЬ Соп. А

Рис.. 4 Влияние кортизола на конканавалтышдуцировашюе повышение концентрации хсальция в лымфобласгах больных с гормоно-чувсгвителъной формой острого димфобластного лейкоза

[Са?*]„ нМ 3001-

! I СооЦо! Ш Соп А. О Со-гЫ+СаЙ Г

Рис. 5 Влияние кортаз,ФЛ2>;а- квщштмгаш-индуцпросаэдюе погишеки; концентрации кальция, в лнмфобластах больных с гормонорезис-. тентной формой заболевания

в

Рис.б Зависимость кальцийблокмрующего кействия ЗмкМ кортизола (/) и 3 мкМ ПВП-кортизола (2) от времени преинкубацни с лнмфобластами

Кон А не вызывает /подъема рЕ У бодащх с- рецидивом заболевания гормоны заметного влияния на индукции китогевом роста рН не оказывали.

При исследовании фосфоинозитидного обмана в лимфобласта>; показано, что на базальный уровень 1Р, 1Р2и И^кортизол (3 мкМ) не влияет- йнгибируишэе действие гормона на »диоген-индуцированное увеличение зависят от времени инкубации гормона с димфобластами (рис. 7).

Рис.? Влююие ворвдзоаюШ к ПВП-кор?изола{2)на ый-' ' тоген-индуцированный уровень инозитолтрнфосфата С1РзУ в эавястадста'от ^етет! шгеубацни с птфо-бластами

Достоверное снижение образования Ц^. вайяюдавтся после 1.5 часов предварительной инкубации клеток сТК. Увелич&ике продолжительности инкубаши др 3. часов приводит к-более вкра-■ женвому уровню ешеяия Щ-. В то ж время Ш -кортизон зКа-„ чительно уступав* ейойодшзф сордану- в щчШШоШ активное-

ти. Сравнительное изучение подашляквдего действия корткзола на митоген- индуцированный уровень группах больных с гормон-чувствительной (п-8) и гормонрезйстентной формой (п-7) острого лейкоза показало, что в первой группе больных уровень ^составлял 10-152 от контрольных значений (р<0.02), тогда как во второй группе он достоверно не.менялся. ....

Достоверного влияния кортиэола на базальнай' уровень ЦЛМ5 не выявлено.

На основании полученных результатов можно утверждать, что глюкскортикоиды способны : ингибировать митоген-индуцированный рост вторичных мессендяеров у больных, чувствительных к гормонотерапии. Терапевтический аффект ГК оценивался в клинике Клиническая резистентность совпадала с отсутствием реакции лимфобластов на митогены на фоне действия ГК. Изменения уровней кальция и рН при действий митогенов, подавляемые ГК, относятся к ранним этапам Тгролиферации клеток (яе более 1 часа), что делает эти параметры удобными для определения. Блокада кортиэолом увеличения митогенами концентрации наблюдаемая ПСоле 3 часов инкубации, возможно, относится к геномному эффекту гормонов.

Таким образом, применение модифицированного радиолиганд-' ного анализа дозволяет выявить уменьшение количества цитозояь-ных рецепторов у горыонрезготентшдг лольных. и провести предварительную оценку целесообразности прайн^юя глжкокортшсовдоэ. Одначо, для окончательной постановки диагноза необходима определение влашш ГК на митоген-индуцировагашй уровень кальция, рН и инозитол-трифосфата в лимфобластах больных ОЛЛ.

ВЫВОДЫ

1. Ва люЛобластах костного мозга человека обнаружены мембранные и внутриклеточные места специфического связывания ГК, отличающиеся связывающей емкостью и аффинитетом к различным гормонам. Мембранные участки связывания ГК характеризуются следующими параметрами: Кд - 0.13-0.46 мкМ, Ботах - 2.6-4.9 пмпль/мг белка или в средней 76000 мест/клетку. Относительное сродство убывает в ряду: кортизол > преднизолон > дексамета-80н. Внутриклеточные рецепторы ГК отличаются высоким аффинитетов (Кд не превышает 17.4 н!0 и ограниченной связывающей емкостью ( в среднем 6300 мест/клетку). Тропкость ГК к внутриклеточным рецепторам подчиняется следующей закономерности: дексаметаэон > преднизолон > кертйвдй.

2. На основе модифицированного радойдеандного метода выявлено достоверное снижение (в Ш38? количества (¿ест связывания Н-дексаштазонз в тоф(Э(зларт§х в груцпе больных с резистентной формой заболевания,

. а Изучение особенностей обмена в лимфоблаетах

под действием митогенов (Кон Д й Вех §) К арахидоновой кислоты покааыю, «по эти вещества даозеедакмо првьшахя внутриклеточную концентрацию свободных. ШШ Ьщьщя (СОйД* ) в цитоплазме

8+ -лимфобластов. Увеличение ССа" 3; происходит как за счет входа .

кальция извне, так и вследствие мобилизации Са из внутриклеточных депо.

4. Под действием Кэа А § цитощйзмс клетки набладается рост рН, а также %сех ривитолов.

5. Ранние ■ эффекты ГК, . наблюдающиеся в первые 30 щн. в щгргбировании (в среднем на 40%)

митоген-индуцнрованного подъема уровня кальция и рН в лимфобластах костного мозга гормончувствительных больных. Влияние кортизола на образование 1Р3з лимфобластах. относится к отсроченным эффектам и проявляется через 1.5 часа инкубации.

6. В изученном диапазоне концентраций (0.1-3 ыкМ) корти-зол не влияет на митоген-индуцированный Са- и рН-ответ лимфо-бластов костного мозга больных с горионрезистентной формой острого лшфббластпого дайкота.

7. Оценку индивидуальной чувствительности к ГК при ОМ в условиях in vitro предлагается проводить в два этапа: 1) анализ количества рецепторов ГК с помощью стандартного н модифицированного радиолигандного метода; 2) определение влияния ГК на митоген-индуцированное повышение уровня кальция в лимфобластах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Еулаева Н. Я. , Сергеев П. В., Духанин А. С. Влияние дексаме-тазона на Са+-ответ лимфобластов при остром лимфобластном лейкозе. //Вопр. онкологии. - 1994. - N 3 - с. 36-37,

2. Взаимодействие глшокортикоидов с рецепторами лимфобластов костного мозга при остром лейкозе. /А. С. Духанин, Т. А. Ери-на: а К Бул&ева, В. И. Чгрнов, JL И. Станкевич, В. JL Кондратчик, А. JL Лобановскйй //Билл. экспер. биол. - 199а - N2. - с. 164-165.

3. Исследование Са*-ответа ликфбластов костного изага при остром лейкозе. /А. С. Лузганин, Е Е Бузаева, Е Е. Кувшшский, Т. А. Ерина //Вестник онкол. научн. центра. - 1993. - N6. -с. 24-25.

4. Регуляция кальциевого, обмена в лимфобластах костного мозга человека. Роль рЕ /Н. Е Еулаева, А. С. Духанин, Е. А. Строев, ЕЕ Сергеев //Докл. АЕ - 1994. - т.334,М Б - с. 780-781.

U4.ko7> М OS ГОЗ) " ;

I Рпн« дишлпут. Ратмрстт. Зная ¡ъЩ^^г. T»P«*7fl «W-j