Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гормонов щитовидной железы на лизосомальный аппарат лейкозных клеток

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние гормонов щитовидной железы на лизосомальный аппарат лейкозных клеток"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ

РЯЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА И.П.ПАВЛОВА

г - лп На правах рукописи

' УДК 616.155.3:616.441-008.63]-091.8

£98

Астраханцев Павел Александрович

ВЛИЯНИЕ ГОРМОНОВ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА ЛИЗОСОМАЛЬНЫЙ АППАРАТ ЛЕЙКОЗНЫХ КЛЕТОК

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Рязань - 1998

Работа выполнена в Рязанском государственном медицинском университете имени академика И.П.Павлова

Научный руководитель - заслуженный деятель науки РФ,

академик РАН Е.А.Строев

Официальные оппоненты - д.м.н., профессор И.И.Дубинина

к.м.н. А.В.Дмитриев

Ведущая организация - Московский медицинский

стоматологический институт

Защита состоится « » _ 1998 года в « » часов на заседании Диссертационного Совета Д 084.67.02. при Рязанском государственном медицинском университете имени академика И.П.Павлова. (391000, РФ, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9)

Автореферат разослан « » _ 1998 года.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова (390026, РФ, г. Рязань, ул. Шевченко, д. 34)

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.А.Рязанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

Гормоны являются наиболее важной группой физиологически ктивных соединений, и их влияние на злокачественный рост являет-я актуальной проблемой, имеющей важное значение не только для фундаментальной науки, но и для клинической практики. Важную оль в малигнизации тканей и прогрессии опухолевого роста играют эрмоны щитовидной железы, которые оказывают прямое влияние в ервую очередь на генетический аппарат клеток и изменяют их про-иферативную активность и дифференцировку (Е.А.Строев, 1972, 974; Е.А.Строев, А.А.Никулин, 1974). Особую значимость эта про-лема приобрела в связи со сформировавшейся в последнее время энцелцией развития опухолевого процесса, как результата наруше-ия клеточной дифференцировки (З.А.Бутенко, Н.И.Николаенко, 1991; И.Райхлин, 1993; Н.Нагпв, 1990), что особенно ярко выражено при стрых лейкозах, морфологическим субстратом которых являются изкодифференцированные кроветворные клетки (А. И. Воробьев, 985; ЗАБутенко и соавт., 1989; Г.И.Козинец, 1997; К.3те1:апа е{ а!., 992; С.Сеп/его е\ а1., 1994; 1.Ваитапп е! а!., 1996). Поэтому исследо-ания, раскрывающие наиболее общие эффекты влияния тиреоид-ых гормонов на дифференцировку опухолевых клеток вообще и теток лейкемии в частности, являются весьма актуальными и пер-пекгивными как с теоретической, так и с практической точек зрения, ¡меются сообщения о стимуляции дифференцировки опухолевых петок витамином Э и ретиноевой кислотой (Б-Экза а1., 1991; !.В1аг-эк е! а!., 1992; 1_.в.Сис1аз, 1992; К.Коппо et а1„ 1992), ядерные ре-епторы которых, как и рецепторы йодтиронинов, принадлежат к т.н.

«суперсемейству стероидных/тиреоидных рецепторов» (M.S.Marks el al., 1992; N.Takahashi & T.R.Dreitman, 1992; J.Aguilera, 1993). Однако исследования подобного рода в отношении гормонов щитовидной железы единичны и проведены in vitro (C.Schroeder et al., 1992; Y.Miyoshi, 1994). Несмотря на значительные достижения в клеточной биологии, ультраструктурная организация компонентов лейкозной клетки охарактеризована недостаточно полно (Г.К.Гогичадзе

H.Т.Райхлин, 1990), что прежде всего касается лизосомально-вакурлярной системы - важнейшего критерия степени цитослецифи-ческой дифференцировки лейкоцитов. Дальнейшее изучение особенностей дифференцировки опухолевых клеток в зависимости oi функциональной активности щитовидной железы у онкологически* больных позволит не только расширить представления о гормональной регуляции новообразований, но и откроет перспективы использования йодтиронинов с терапевтической целью в качестве тонки> естественных регуляторов дифференцировки опухолевых клеток.

Цель работы:

Оценить взаимосвязь функциональной активности щитовидной железы и степени развития лизосомального аппарата опухолевы> клеток у больных острыми лейкозами.

Основные задачи исследования:

I. Изучить особенности нарушений тиреоидного статуса у больны> острым миелобластным и острым лимфобластным лейкозами.

2. Проанализировать количественные и качественные особенное™ дифференцировки вакуолярно-лизосомальной системы в целом у дать объективную характеристику лизосомогенеза в опухолевы> клетках у больных острыми лейкозами в условиях различного со держания йодтиоонинов.

3. Охарактеризовать процесс образования специфических (вторичных) нейтрофильных гранул в опухолевых клетках у больных острым миелобластным лейкозом при дефиците йодтиронинов и при нормальном тиреоидном статусе.

4. Выявить основные особенности дифференцировки опухолевых клеток при дефиците йодтиронинов и при нормальном тиреоидном статусе у больных острым лимфобластным лейкозом.

Научная новизна.

Впервые выявлены количественные и качественные особенности дифференцировки лизосомально-вакуолярного аппарата опухолевых клеток при остром миелобластном лейкозе. Дана количественная и качественная характеристика специфического гранулогенеза в опухолевых клетках при остром миелобластном лейкозе в процессе их дифференцировки. Установлено, что у больных острым миелобластным лейкозом при синдроме низкого уровня Т3 в опухолевых клетках наблюдается торможение образования специфических гранул. Охарактеризованы различия степени ультраструктурной дифференцировки в целом опухолевых клеток при нормальном содержании йодтиронинов и при синдроме низкого уровня Т3 у больных острым миелобластным и острым лимфобластным лейкозами. Показана возможность применения системного ультраструктурно-морфометричес-кого анализа опухолевых клеток для дифференциальной диагностики острого миелобластного и острого лимфобластного лейкозов.

Практическая значимость.

Показана информативность сочетания гормональных и электронно-микроскопических исследований в изучении острых лейкозов у человека, что позволяет получить принципиально новые сведения о закономерностях дифференцировки лизосомально-вакуолярной системы клеток лейкемии в условиях нарушения гормонального го-

меостаза. Обнаруженные закономерности нарушения тиреоидного статуса у онкологических больных могут быть использованы в патогенетической терапии острых лейкозов. Полученные данные о нарушениях лизосомогенеза и специфического гранулогенеза могут быть использованы при оценке степени тяжести злокачественного процесса у больных острым миелобластным лейкозом. Разработан метод ультраструктурно-морфометрической дифференциальной диагностики острого миелобластного и острого лимфобластного лейкозов.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы представлены в виде докладов и обсуждены на V Российском съезде специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 1995), на межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 50-летию онкологической службы Рязанской области (Рязань, 1996), на XV! Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 1996), на I Съезде Российского общества патологоанатомов (Москва, 1997), на II Международной научно-практической конференции "Пожилой больной. Качество жизни" (Москва, 1997), на заседании Рязанского отделения Всероссийского биохимического общества (Рязань, 1998).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 227 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 5 глав собственных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 70 отечественных и 164 зарубежных источника. Дис-

роптя! «ла ипгапгтпмплоаиа 10 та(лпш «мм м 71 пигиит»«

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В настоящей работе при помощи биохимических, электронно-микроскопических и морфометрических методов были исследованы образцы периферической крови 43 больных острыми лейкозами (23 мужчины и 20 женщин), госпитализированных в гематологическое отделение Рязанской областной клинической больницы с сентября 1994 по сентябрь 1996 года. Острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) -24 больных, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) - 19 больных. Воз-эастной диапазон пациентов - от 18 до 81 года, средний возраст составляет 45,8±2,8 года. Диагноз устанавливался на основании комплекса клинических, лабораторных и инструментальных методов исследования в соответствии с РАВ-классификацией. Гормональные и электронно-микроскопические исследования проводили в момент постановки диагноза "острый лейкоз" до начала химиотерапии. Сыво-эоточную концентрацию тиреоидных гормонов и электронно-микроскопическое исследование опухолевых клеток проводили в одном об-зазце крови, для чего из локтевой вены в центрифужную пробирку эрали 10 мл крови. Антикоагулянты не применялись. Цельную кровь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин при комнатной ■емпературе. В сыворотке методом радиоиммунологического анали-1а определяли концентрацию Т3 и Т4, концентрацию ТТГ определяли методом иммуноферментного анализа.1 У всех обследованных боль-<ых острыми лейкозами не наблюдалось клинических признаков эн-;окринной патологии, а анамнестические данные свидетельствовали )б отсутствии ранее перенесенных заболеваний щитовидной желе-1Ы. Контрольную группу составили 20 здоровых доноров (10 мужчин и

- Выражаем глубокую признательность сотрудникам радиоизотопной лаборатории }НИЛ РязГМУ за оказанную помощь в проведении радиоизотопных исследований.

10 женщин; средний возраст 44+2,1 года).

После декантирования сыворотки для электронно-микроскопического исследования клетки крови фиксировали в 3,5% глутаровом альдегиде на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) в течение 30 мин (З.А.Бутенко и др., 1974). После двукратного отмывания в том же буфере материал вторично фиксировали в 1% тетраоксиде осмия на

0.1 М фосфатном буфере (pH 7,4) - 60 мин (D.R.Anderson, 1965), обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и ацетоне, пропитывали в смеси ацетона и заливочной среды (1:1). Образцы заключали в заливочную среду, состоящую из аралдита, аралдита М и эпона-812 с использованием в качестве катализатора DMP-30. Полимеризацию проводили при температуре 60°С в течение 24 ч. Полутонкие срезы готовили на ультрамикротоме УМТП-4, окрашивали по методу Романовского. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме УМТП-6, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по E.S.Reynolds (1963), просматривали в электронном микроскопе ЭМ-125К. Морфометрию проводили на позитивных электронограм-мах формата 6x9 см, с изображением опухолевых клеток, снятых при увеличении хб 000. Электронограммы анализировали при помощи стереомикроскопа МБС-9 при конечном увеличении изображения хЗО 000. Оценку ультраструктурного строения лейкозных клеток проводили на основе комплексного стереологического исследования методом точечного счета (E.R.Weibel et ai., 1966) при помощи окулярного стереологического зонда, имеющего 32 линии и 256 узловых точек.

Ультраструктурное изучение основных компонентов опухолевой клетки проводили на основе системного морфометрического анализа, согласно рекомендациям Г.Г.Автандилова (1984; 1990) по специально разработанному алгоритму:

1. Ядерно-цитоплазматическое соотношение (ЯЦС).

2. Соотношение эу- и гетерохроматина в %.

3. Относительная объемная доля ядрышка в ядре.

4. Фактор формы ядра. Определяется по методу С.А.Саптыкова (1976).

5. Характеристика степени развития лизосомально-вакуолярной системы по относительным объемным долям эндоплазматической сети; комплекса Гольджи; лизосом, среди которых отдельно учитывались: первичные лизосомы, аномально сформированные первичные лизо-сомы, вторичные лизосомы, патологических образований лизосо-мального происхождения (тельца Ауэра, гигантские лизосомы). В клетках при ОМЛ определялась относительная объемная доля специфических нейтрофильных гранул, в том числе: незрелого типа и зрелого типа.

6. Относительная объемная доля митохондрий, клеточного центра; вакуолей; липидных включений; фибриллярных образований.

Относительные объемные доли, занимаемые органеллами клетки в цитоплазме (\Л/,-) в % определялись согласно принципу Ое^эве по формуле:

= 100 %,

'; Рт •

где Р-, - число точек, попавших на клеточную структуру,

Рт - общее число точек тестовой системы, приходящихся на цитоплазму клетки.

7. Относительное содержание свободных рибосом определяли в эдинице площади цитоплазмы (0,028 мкм2) в 4 случайных полях зрения.

Системное ультраструктурное морфометрическое исследование проводили у 8 больных ОМЛ (4 - синдром низкого уровня Т3; 4 -нормальное содержание йодтиронинов) и у 8 больных ОЛЛ (4 - син-

ТППМ НИЯКПГП УППЯНЯ То' 4 — НППМЯПкНГЮ Г-ПЛРПЖЯМИР ГППМПНПЙ 1ИИТП-

видной железы). В каждом наблюдении морфометрическому анализу подвергалось не менее 30 опухолевых клеток. Все лейкозные клетки подразделялись на группы согласно общепринятой схеме костномозгового гранулоцито- и лимфоцитопоэза (при ОМЛ выделено 4 группы, при ОЛЛ - 3).

Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики. Достоверность различий оценивалась с использованием ^критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности тиреоидного статуса у больных острыми лейкозами.

Проведенные до начала химиотерапии гормональные исследования позволяют констатировать, что у 81,4% обследованных больных острыми лейкозами наблюдаются нарушения концентраций йодтиронинов и ТТГ (рисунок 1).

518,6+5,93% 1" _ ^_____ 11,63 ±4,89%

11,63±89%

453,49+761%

3-

4,65±3,21%

Рисунок 1. Структура изменений тиреоидного статуса у больных острыми лейкозами. 1 - повышен Тз (3,05±0,18 нмоль/л); 2 - повышен ТТГ (6,58+1,21 МЕД/л); 3 - понижен ТТГ (менее 0,4 МЕД/л); 4 -синдром низкого уровня Тз (0,55±0,9 нмоль/л); 5 - изменений не обнаружено.

У большинства пациентов (53,4Э±7,61%) преобладающим нарушением тиреоидного статуса оказалось состояние, при котором значительно снижена сывороточная концентрация Т3, что не сопровождается клиническими симптомами гипотиреоза. Уровень Т4 у большинства таких больных остается в пределах нормы, а концентрация тиреотропина демонстрирует разнонаправленные изменения, в среднем не отличаясь от контрольных значений {рисунок 2).

гь/л трийодтирогага

-¡ьр "Ч

- V V' Г'

V ; ^

Больные

Доноры

им оль/л 125

ТИРОКСИН

100

75 50 25 0

ш

Больные

Допоры

МЕД/л ТИРЕОТРОПИН

Рисунок 2. Концентрации гормонов при синдроме низкого уровня Тз.

Звездочкой обозначена достоверность отличий от контрольной группы (р<0,05).

Данное состояние описано в литературе как синдром низкого уровня Т3 и встречается не только у онкологических больных, но и при других тяжелых системных заболеваниях нетиреоидной природы (Г.Н.Гороховская и др., 1990; УУ.С.\Мэос1 & .Шатакег, 1992; Р*.Агет е1 а1., 1993). Не удалось обнаружить существенной зависимости частоты развития и степени выраженности синдрома низкого

уровня Т3 от морфологического варианта острого лейкоза, что, по

onoiji ОМ ГИЛНЯГ^ТМ Г*Г>1Л nflTDriL Г~ТГ-1\ ГГЛ-Г г1 ивлпа! ИдДми IMrt W1* плинлгл ' > "

--------п-------- ■ - - ,------ ------- — J — ■ — ' ----»» 'Wl W i IN-

рушения тиреоидного статуса и его общебиологическом значении.

2. Степень ультраструктурной дифференцироеки опухолевых клеток у больных ОМЛ с синдромом низкого уровня Т3 и при нормальном содержании йодтиронинов.

В результате проведенного исследования обнаружено, что наблюдаются значительные различия в распределении лейкоз-ных клеток по группам у больных ОМЛ с синдромом низкого уровня Т3 и при нормальном содержании гормонов щитовидной железы {рисунок 3).

В! синдром низкого уровня ТЗ □ нормальное содержание йодтиронинов

Рисунок 3. Распределение опухолевых клеток при ОМЛ по группам в % согласно степени их ультраструктурной дифференцироеки (Р±тГ).

Достоверность отличий отмечена: * -р<0,05; *** - р<0,001.

При синдроме низкого уровня Т3 преобладают опухолевые клетки I группы, представленные наименее дифференцированными клеточными элементами - миелобластами. Меньше всего обнаружено клеток IV группы, - в которую включались наиболее дифференцированные клетки гранулоцитарного ряда, - лейкоз-ные палочкоядерные и полиморфноядерные нейтрофилы. У

больных ОМЛ с нормальным содержанием гормонов щитовидной

/тус I I пч/о ч/о \jvyj ч^Гу» Б 3 роосч

меньше, а клеток III группы (в которую включены лейкозные мие-лоциты и метамиелоциты) и IV группы соответственно в '1,5 и 4 раза больше, чем при синдроме низкого уровня Т3. Таким образом, уже по анализу распределения опухолевых клеток с различной степенью ультраструктурной дифференцировки видно, что при синдроме низкого уровня Т3 наблюдается более выраженное торможение клеточной дифференцировки, чем у больных ОМЛ с нормальным содержанием йодтиронинов.

При детальном морфометрическом исследовании обнаружено, что лейкозные клетки сохраняют способность к ультраструктурной дифференцировке, поскольку в них сохраняются нормальные тенденции, з частности, к изменению ЯЦС-, которое прогрессивно уменьшается от миелобласта до полиморфноядерного ней-трофила (таблицы 1, 2). Однако при нормальном содержании йодтиронинов уменьшение ЯЦС происходит в большей степени, чем у больных с синдромом низкого уровня Т3: оно достоверно ниже в клетках I, II и IV групп больных без нарушений тиреоидного статуса (таблицы 1,2) ив полиморфноядерных нейтрофилах весьма близко к показателю нейтрофилов здоровых людей (0,266-0,271).

В палочкоядерных и полиморфноядерных нейтрофилах при нормальном содержании йодтиронинов степень компактизации хроматина значительно выше, чем в соответствующих клетках у больных с дефицитом Т3: доля эухроматина почти на 40% меньше по сравнению с аналогичным показателем клеток IV группы больных с синдромом низкого уровня Т3 (таблица 1). Повышение компактизации хроматина сочетается с усложнением формы ядра, уменьшением его размеров и редукции ядрышкового аппарата. Несмотря на

Таблица I. Сравнительная ультраструктурно-морфометрическая характ стика опухолевых клеток I и II групп у больных ОМЛ с синдромом низкого V ня Т3 и без нарушений тиреоидного статуса (М±т)х. _______

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ ПАРАМЕТР I группа (миелобласты) | II группа (промиелоци

нормальный тиреоидный статус синдром низкого уровня Тз нормальный тиреоидный статус синдро низког уровня

1 Ядерно-цитоплазматичес-кое соотношение 1,11+0,15 1,55+0,11* 0,95±0,19 1,06+0,08

2 Доля ядрышка в ядре, % 5,02+0,95 6,27+0,72 5,78+1,51 8,67±1,1

3 Доля эухроматина в ядре, % 65,47±5,75 56,17±1,69* 52,23+3,44 53,26+2,

4 Фактор формы ядра, усл.ед. 7,59+0,21 7,1+0,11* 6,9210,48 7,24+0,:

Относительные объемные доли в 1 цитоплазме (%):

5 Пфинуклеарное нрострапсшо 2,94+0,64 2,27±0,51 1,3±0,25 6,09+1,:

6 Эндоплазматическая сеть 62,8±3,11 54,88+2,62 60,17±4,38 42,97+3,:

7 I Комплекс Тольджи' 2,8±0,49 2,62±0,47 3,66±0,73 5,38±1,:

« Общее содержание лизосом 1,36±0,43 3,92±1,21 3,0±0,25 9,68+1,2

9 Первичные лизосомы 1,36+0,43 3,47±1,17 2,83±0,26 7,78±1,1

№' Аномально сформированные первичные лизосомы 0,89+0,23 - 1,3910,-

И Вторичные лизосомы - и един, клетках л едан. клеши: 2,28+0,:

12 Патологич. структуры лизо-сомалыюго происхождения - - - 2,24±0,i

13 . Митохондрии 12,13+1,5 9,87±0,96 10,51±1,65 12,98±1

14 Клеточный центр 0,99+0,25 в един, клетках 0,6+0,03 0,73±0,'

15 Относительное количество свободных рибосом 11,53±0,62 11,53+0,57 11,11+0,9 12,3+0,

16 Фибриллярные образования - 13,39±3,63 - 3,09±2

17 Вакуоли 5,14±2,27 3,36+0,98 4,59±1,35 9,26+2

отсутствие достоверных отличий по относительной площади ядр ка (таблица 2), при нормальном содержании йодтиронинов час встречаемости нуклеол в клетках III в 1,5, а в клетках IV группы ти в 4 раза меньше, чем при синдроме низкого уровня Т3. Haps ультраструктурными признаками низкой ядрышкозой активное™ свидетельствует о снижении интенсивности синтеза рибонуклес теидов, что является для данных клеток критерием более вью

1 - достоверность различий по сравнению с больными без нарушений тиреоидного статуса отмечена: * -р<0,05; ** - р<0,01; *** -р<0,001.

лица 2. Сравнительная ультраструктурно-морфометрическая характери-

..ТТЛ»».«.» ITT •> JT/ «1ШИ у Г\ЛЛТТ л „.... Лр ~ . . „ . . . -----

шя Т3 и без нарушений тиреоидного статуса (М±т)х.____

I III группа (миелоциты и „ I метамиелоциты) МОРФОМЕТРИЧЕСКИИ | IV группа (палочко- 1 ядерные и полиморфно-ядерные нейтрофилы)

ПАРАМЕТР | нормальный I тиреоидный I статус синдром низкого уровня Tt нормальный тиреоидный статус синдром низкого уровня Т;

Ядерно-шпоплазмагачее- | ой+0 04 кое соотношение I 0,74+0,06 0,36±0,02 0,51±0,06*

Доля ядрышка в ядре, % | 4,25±0,88 6,17±1,05 9,19±2,03 5,92±1,35 i

Доля эухроматина в ядре, % | 60,13+3,9 44,91 ±1,39** 27,88+1,19 46,32±1,93***

Факгорформы ядра, усл.ед. | 6,76±0,14 6,14±0,14** 5,74+0,08 5,48+0,19*

Отпоситсльные объемные доли в цитоплазме (%):

Псринугсгсарное гзроарашшо | 3,8+1,18 5,73±1,75 3,54±0,6 5,48+1,7

Эндоплазматическая сеть б 51,81+2,03 51,18+2,62 50,75+1,32 49,9+4,15

Комплекс Гольджи | 2,81+0,33 1,73+0,32* 1,64±0,19 1,75+0,37

Общее содержание яизосом ! 8,9+1,28 8,69±1,82 A OOJA ЛП •+,OOJ.U.t f 6,3 о±1,89

Первичные лизосомы 1 8,21±1,1б 7,72+1,83 4,53±0,43 5,11+1,34

Аномально сформировал- ве№клетках ные первичные лгоосомы I 1,64±0,61 в един, клетках ведан, клетках

Вторичные лизосомы j 2,08+0,47 1,51±0,29 0,76+0,13 1,88±1,54

Патолопм. струетуры лизо-1 сомалыюго происхождения 1 в един, клетках ведан, клетках -

Общее содержание ene- j у y+j ^ цифических гранул J 1,35±0,33* 21,06+0,82 7,04±3,04***

Незрелые специф. гранулы J 2 04» 0 45 с плотным содержимым i 1,02+0,1 8,71+0,56 1,11+0,28+

Незрелые специф. гранулы J 3 61+0 53 с гомогенным содержимым 1 1,39+0,53 7,63±0,48 5,49+2,91 I

Зрелые специф. гранулы j 3,01+0,34 в един, клетках 4,79+0,3 0,81±0,26**

Митохондрии I 5,47+0,49 11,41+1,5*** 3,25±0,21 9,62+1,4***

Клеточный ueirrp J 0,94+0,27 1,06+0,26 0,53+0,05 0,87+0,24

Относительное количество | 20 51+052 свободных рибосом J 13,69+0,56*** 11,65±0,38 13,8+0,8*

Фибриллярные образования 1 - 26,42±14,34 - 6,91±3,96 |

Вакуоли 1 6,4±1,99 6,94+1,66 4,67+1,56 8,91+3,83

эстоверпость различий по сравнению с больными без нарушений тиреоидного статуса гмечена: * -р<0,05; ** -р<0,01; *** - р<0,001.

степени дифференцировки. Таким образом, в опухолевых клетках больных Grviii с нормальным содержанием йодтиранинов степень дифференцировки ядерного аппарата в целом более высокая, чем у больных с синдромом низкого уровня Т3.

Различия в развитии цитоплазматических органелл также свидетельствуют о более высокой степени ультраструктурной дифференцировки опухолевых клеток у больных с нормальным содержанием гормонов щитовидной железы, у которых относительная объемная доля митохондрий в клетках III и IV групп соответственно в 2 и 3 раза меньше, чем при синдроме низкого уровня Т3 (таблица 2). Снижение количества митохондрий в процессе дифференцировки объясняется преобладанием в зрелых нейтрофилах гликолиза над окислительным фосфорилированием, поскольку эти клетки функционируют в жестких анаэробных условиях воспалительных инфильтратов.

Количество свободных рибосом в цитоплазме клеток грану-лоцитарного ряда также уменьшается, что отражает снижение интенсивности синтеза белка для нужд клетки. У больных ОМЛ с нормальным тиреоидным статусом относительное количество свободных рибосом в миелсцитах, метамиелоцитах и клетках IV группы достоверно ниже, чем у пациентов с синдромом низкого уровня Т3 (таблица 2).

Для оценки степени ультраструктурной дифференцировки опухолевых клеток при ОМЛ наиболее значимым является развитие ли-зосомально-вакуолярной системы - компартмента, в котором образуются цитоспецифические для нейтрофилов ультраструктуры: ли-зосомы и т.н. специфические гранулы. Относительная объемная доля лизосом в клетках II группы больных ОМЛ с синдромом низкогс уровня Т3 достоверно выше, аналогичного показателя пациентов без

нарушений тиреоидного статуса (таблица 1), однако качественные нарушения формировании i мзосом при дефиците йодтиронинов выражены гораздо сильнее. Так в 25% промиелоцитов при синдроме низкого уровня Т3 первичные лизосомы сформированы аномально, более половины всех клеток II группы имеют вторичные лизосомы, активно участвующие в аутофагоцитозе, а примерно каждый 6-ой лромиелоцит содержит патологические структуры лизосомального происхождения. В аналогичных клетках при нормальном содержании йодтиронинов вторичные лизосомы встречаются всего в 14% промиелоцитов, а сформированные аномально первичные лизосомы и патологические структуры лизосомального происхождения не обнаруживаются вовсе.

Наиболее серьезные отличия касаются основных цитоспеци--фических структур клеток нейтрофильного ряда - специфических нейтрсфильных гранул. У больных с нормальным содержанием йодтиронинов специфические гранулы обнаруживаются практически в каждом миелоците и метамиелоците, тогда как при синдроме низкого уровня Т3 - лишь в 21% подобных клеток. Кроме того у больных без нарушений тиреоидного статуса средняя относительная объемная доля данных структур в клетках HI группы более чем на 470% превышает аналогичный показатель у пациентов с синдромом низкого уровня Т3 (таблица 2). В более дифференцированных клетках - IV группы - сохраняется примерно такая же картина: частота встречаемости специфических гранул практически не отличается от предыдущей стадии как при синдроме низкого уровня Т3, так и при нормальном содержании йодтиронинов, а в количественном отношении данные ультраструктуры по-прежнему остаются лучше выраженными у лиц с нормальным тиреоидным статусом, почти на 200% превышая данный параметр больных ОМЛ с син-

дромом низкого уровня Т3 (таблица 2).

Обращает на себя внимание, что комплекс Гольджи в клетках 111 группы у больных с синдромом низкого уровня Т3 развит в достоверно меньшей степени по сравнению с больными без нарушений тире-оидного статуса: при нормальном уровне Т3 средняя относительная объемная доля комплекса Гольджи на 62% больше (таблица 2). Поскольку специфические гранулы, как и любые подобные структуры, образуются в комплексе Гольджи, можно говорить о том, что у больных ОМЛ с синдромом низкого уровня Т3 наблюдается резкое торможение специфического гранулогенеза, который лишь незначительно активизируется на стадии полиморфноядерных нейтрофилов.

3. Степень ультраструктурной дифференцировки опухолевых клеток у больных ОЛЛ с синдромом низкого уровня Т3 и при нормальном содержании йодтиронинов.

При ОЛЛ распределение опухолевых клеток по группам согласно степени ультраструктурной дифференцировки обнаруживает ту же тенденцию, что и при ОМЛ {рисунок 4). При синдроме низкого уровня Т3 преобладают недифференцированные лимфоидные клетки - лимфобласты (I группа), меньше всего - наиболее дифференцированных клеток - лейкозных лимфоцитов (III группа), тогда как при нормальном содержании йодтиронинов наблюдается обратное соотношение: преобладают дифференцированные клетки 111 группы, а лимфобласты составляют самую малочисленную популяцию опухолевых клеток {рисунок 4). Лейкозные пролимфоциты (II группа) занимают и в том и в другом случае промежуточное положение.

Наиболее выраженные различия в степени ультраструктурной дифференцировки опухолевых клеток у больных ОЛЛ при различном тиреоидном статусе касаются строения их ядер. На фоне отсуг-

Н синдром низкого уровня ТЗ !

□ нормальное содержание йодтироттинов |

Рисунок 4. Распределение опухолевых клеток при ОЛИ по группам в % согласно степени их ультраструктурной дифференцировки (Рхт^.

Достоверность обозначена: *** -р<0,001.

тгвия достоверных различий в ЯЦС по каждому из 3-х выделенных спеточных типов у больных с синдромом низкого уровня Т3 и с нормальным тиреоидным статусом обнаружено достоверное снижение ЗЦС от лимфобласта к лимфоциту (р<0,05), что является отражением нормальной тенденции к ультраструктурной дифференциров-се. У больных ОЛЛ с синдромом низкого уровня Т3 лейкозные клетки саждой группы характеризуются ядрами с менее конденсированным (роматином. В каждой из 3-х групп при синдроме низкого уровня Т3 з клетках выше доля эухроматина в ядрах и фактор формы ядра, 1то указывает на меньшую степень их ультраструктурной диффе-зенцировки по сравнению с лейкозными клетками при нормальном содержании гормонов щитовидной железы (таблица 3).

Степень развития ядрышкового аппарата лейкозных клеток -акже выше при синдроме низкого уровня Т3: в лимфобластах и про-чимфоцитах нуклеолы крупнее, чем в соответствующих клетках при ■юрмальном содержании йодтиронинов (таблица 3), встречаются ^осюьерно чащ« и уныраыруюурно билее актины.

Таблица 3. Сравнительная ультраструктурно-морфометрическая характер стика опухолевых клеток I, II и III групп у больных ОЛЛ с синдромом низю уровня Тз и без нарушений тиреоидного статуса (М±т)\

МОРФОМЕГРИЧЕСКИЙ ПАРАМЕТР Г группа (лимфобласты) II группа (пролимфоциты) III группа (лимфоциты'

нормальн тиреоидн статус синдром низкого уровня Тз нормальн тиреоидн статус синдром низкого уровня Т} нормальн тиреоидн статус синдр, низко уровня

I Ядерно-цитоплазматичес-кое соотношение 1,73+0,36 1,56±0,08 1,08+0,08 1,04+0,09 1,18+0,09 1,13±0

2 Доля ядрышка в ядре, % 4,29±0,9 6,55±0,38 * 4,81+0,89 7,69+1,09 # 7,56+1,5 7,16+(

! 3 Доля эухроматина в ядре, % I 52,88±5,07 82,63±1Д6 *** 36,06±1,32 61,45±1,86 *** 32,04±0,95 42,®±; **

4 Фактор формы ядра, усл.ед. 1 8,1910,26 8,69+0,08 I 7,02+0,19 * 1 7,74±0,14 ** 6,32x0,12 7,29±0 **

Относительные объемные доли в | цитоплазме (%):

5 Пфинуклеарное пространство 8,29±3,23 5,72±0,73 5,53±1,74 4,23±0,81 6,05X1,11 6,66+2

6 Эндоплазматическая сеть 41,28±3,78 36,03+2,03 40,34±2,64 39,42±2,43 41,81±1,7 49,38+;

7 Комплекс Гольджи 1,57±0,56 3,86+0,67 * 3,2±0,5 3,38±0,81 1,57+0,56 3,52±1 *

8 Общее содержание лизосом 1,13+0,39 1,53+0,16 1,4±0,26 1,12±0,21 1,82+0,43 ведиа

9 Первичные лизосомы !,08±0,39 1,43+0,16 л 99+0 14 0,88+0,18 1 : п -»о 1,1 и—и,' .*- в

10 Аномально сформированные первичные лизосомы в един. кл. 0,75±0,22 в един. кл. в един. кн. в един. кл. в един.

И Вторичные лизосомы - 0,68+0,36 в един. кл. 0,38+0,08 - в един.

12 Митохондрии 8,86+1,72 12,47±0,91 И,51±124 13,05±Ц5 9,34±1,14 7,5+0,

13 Клеточный центр 0,74 ±0,13 0,64±0,01 1,0±0,27 0,39±0,1 1,51±0,23 ведан.

1 14 Относительное количество свободных рибосом 12,25+0,79 11,69±0,35 11,22±0,43 11,52+0,61 12,21±0,51 10,91±

15 Фибриллярные образования _ 3,18+1,18 _ ведший. _ _

16 Вакуоли 10,52±3,06 7,4+0,9 12,0)±3,66 5,42±1,07 6,46+1,47 5,9510

П Липидные включения - 7,26±2,41 - 3,29±1,01 в едан. кл. ведай

Анализируя степень развития лизосомально-вакуолярной с темы у больных ОЛЛ, следует отметить, что у больных с синдром низкого уровня Т3 в опухолевых клетках обнаруживается значите/

- достоверность различии по сравнению с оольными оез нарушении тиреоидного статуса отмечена: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** -р<0,001.

ное количество вторичных лизосом, которые, контактируя с митохондриями, элементами эндоплазматической сети, комплекса Гольджи, так же как и при ОМЛ демонстрируют активное участие в процессе аутофагоцитоза. У больных с нормальной концентрацией йодтиронинов вторичные лизосомы определяются лишь в единичных пролимфоцитах, а в лейкозных лимфобластах и лимфоцитах вообще не обнаруживаются (таблица 3).

Особо следует отметить наличие в опухолевых клетках у больных с синдромом низкого уровня Т3 таких ультраструктур, как вирусоподобные частицы при ОЛЛ и фибриллярные образования, обнаруживаемые чаще при ОМЛ. Наличие указанных структур в цитоплазме лейкозных клеток сочеталось с тяжелым, подчас стремительно фатальным течением лейкозного процесса. У больных острыми лейкозами с нормальным тиреоидным статусом данные образования не обнаруживались.

3, Ультраструктурно-морфометрическая дифференциальная диагностика ОМЛ и ОЛЛ.

При сравнении всех изученных клеток у больных ОМЛ и ОЛЛ независимо от тиреоидного статуса обнаружено, что при ОМЛ ЯЦС и фактор формы ядра ниже, чем при ОЛЛ {таблица 4). Наиболее информативными среди цитоплазматических органелл являются показатели вакуолярно-лизосомальной системы, которая и в норме раз-зита значительно лучше в миелоидных клетках по сравнению с лим-Зюидными. При ОМЛ выше относительные объемные доли ЭПС и пизосом, обнаруживаются специфические гранулы, отсутствующие в г1имфоидных клетках {таблица 4). Объемная фракция митохондрий зыше при ОЛЛ {таблица 4). Таким образом, предложенный метод тпмиягтдрнмпй пирнш упктпяггггл/ктупм ппууппрпыу кпеток может эыть использован в дифференциальной диагностике ОМЛ и ОЛЛ.

Таблица 4. Сравнительная улътраструктурно-морфометрическая характеристика лейкозиых клеток при ОМЛ и ОЛЛ (М±т)1.

Морфометрический параметр ОМЛ ОЛЛ

1 Ядерно-цитоплазматическое соотношение 0,86±0,04 1,31±0,05***

ЯДРО

2 Доля ядрышка в ядре, % 6,51+0,41 6,48±0,33

3 Доля эухроматина в ядре, % 48,69+1,25 57,32+1,63***

4 Фактор формы ядра, усл. ед. 6,56+0,07 7,67±0,09***

Относительная объемная доля в цитоплазме (в %)

5 Перину клеарное пространство 4,1 ±0,4 5,69+0,49*

6 Эндоплазматическая сеть 52,01±1,03 48,08+1,32*

7 Комплекс Гольджи 2,75+0,24 3,43+0,32

8 Общее содержание лизосом 6,83+0,48 1,43+0,12***

9 Первичные лизосомы 6,04±0,44 1,22+0,1***

10 Аномально сформированные первичные лизосомы 1,5±0,34 1,02+0,29

И Вторичные лизосомы 1,78±0,21 0,92+0,29*

12 Патологические структуры лизосомального происхождения 2,69+0,6 -

13 Специфические гранулы 14+0,92 -

14 Митохондрии 8,23±0,41 11,3±0,54 ***

15 Клеточный центр 0,81±0,08 0,98+0,13

16 Относительное количество свободных рибосом 12,13±0,22 11,68±0,21

17 Фибриллярные образования 12,7+3,26 2,96±0,71*

18 Вакуоли 5,9 Ш,69 7,62+0,75

19 Липидные включения 1,67+0,48 5,45±1,49*

ВЫВОДЫ:

1.У больных ОМЛ и ОЛЛ обнаруживается снижение сывороточной концентрации Т3 при отсутствии достоверных изменений уровня Т4 и ТТГ, что не сопровождается клиническими признаками гипотиреоза (синдром низкого уровня Т3).

2. У больных ОМЛ и ОЛЛ с синдромом низкого уровня Т3 выявлена более низкая степень ультраструктурной дифференцировки опухолевых клеток, чем у пациентов с нормальным содержанием

1 - Достоверность различий отмечена: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.

йодтиронинов. При О МЛ патология дифференцировки затрагивает, преимущественно, вакуолярно-лизосомальную систему клеток, а при ОЛЛ - ядерный аппарат.

3. Нарушения лизосомогенеза в опухолевых клетках при ОМЛ с синдромом низкого уровня Тз выражены в значительно большей степени, чем при нормальном содержании йодтиронинов, и характеризуются появлением аномально сформированных первичных лизосом и патологических структур лизосомального происхождения (тельца Ауэра, гигантские лизосомы). Процесс образования специфических-гранул в опухолевых клетках при ОМЛ с синдромом низкого уровня Тэ протекает гораздо менее интенсивно в количественном отношении и менее полноценно - в качественном, по сравнению с больными ОМЛ без нарушений тиреоидного статуса.

5. При ОЛЛ с синдромом низкого уровня Т3 наиболее существенные нарушения ультраструктурной дифференцировки опухолевых клеток заключаются в торможении процессов уменьшения ядра, компактизации хроматина, редукции нуклеол. Нарушения дифференцировки лизосомально-вакуолярной системы характеризуются повышением интенсивности аутофагических процессов.

I. В подавляющем большинстве лейкозных клеток больных ОМЛ и ОЛЛ при синдроме низкого уровня Т3 обнаруживаются общие ци-топатологические изменения, свидетельствующие о большей злокачественности лейкозного процесса по сравнению с больными без нарушений тиреоидного статуса.

. Системное ультраструктурно-морфометрическое исследование опухолевых клеток позволяет проводить дифференциальную диагностику между ОМЛ и ОЛЛ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Полученные данные о нарушении функции щитовидной железы у больных острыми лейкозами необходимо учитывать при проведении цитостатической терапии.

2. Электронно-микроскопическое исследование в сочетании с системной морфометрией опухолевых клеток позволяет проводить дифференциальную диагностику между ОМЛ и ОЛЛ в диагностически сложных случаях.

3. Различная степень ультраструктурной дифференцировки опухолевых клеток и количественное соотношение выделяемых пс данному принципу клеточных элементов может служить основой для выработки индивидуального подхода в лечении больньо острыми лейкозами.

4. Полученные данные о нарушенях дифференцировки вакуолярно лизосомальной системы опухолевых клеток может быть исполь зовано в клинической гематологии для объективной оценки тя жести лейкозного процесса, контроля за эффективностью цита статической терапии и в прогнозировании течения заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИ1

1. Строев Е.А., Астраханцев А.Ф., Астраханцев П.А. Вакуолярна система лейкемических миелобластов // Актуальные вопрос! медицины и здравоохранения: Сб. научн. тр. РязГМУ. - Рязаж 1995.-С. 132-135.

2. Строев Е.А., Астраханцев А.Ф., Астраханцев П.А. Лизосомы пр острых лейкозах// Аллергия, иммунитет и патология внутренне органов: Тез. докл. научно-практ. конф. - Рязань, 1995. - С. 161

З.Строев Е.А., Астраханцев П.А., Астраханцев А.Ф. Вакуолярна система опухолевых клеток при остром миелобластном лей ко:

// V Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике: Тез. докл. - М., 1995. - С. 275-276.

4. Астраханцев П.А., Астраханцев А.Ф. Методические аспекты электронно-микроскопической морфометрии при гемобластозах II Вопросы клиники, диагностики и коррекции физического состоя-ния организма: Сб. научн. трудов РязГМУ. - Рязань, 1996. - С. 5-8.

5. Строев Е.А., Астраханцев А.Ф., Астраханцев П.А. Системный ульт-раструктурно-морфометрический подход в оценке степени дифференцировки опухолевых клеток при лейкозах // Организация онкологической службы, лечение и реабилитация больных злокачественными новообразованиями основных локализаций: Тез. докл. межрег. научно-практ. конф. - Рязань, 1996. - С. 113-115.

о.Строев Е.А., Астраханцев П.А., Астраханцев А.Ф. Ультраструк-турно-морфометрическая дифференциальная диагностика острых лейкозов // XVI Российская конференция по электронной микроскопии: Тез. докл. - М., 1996. - С. 237.

7. Астраханцев П.А., Астраханцев А.Ф. Электронно-микроскопический метод исследования лейкозов // Новые технологии в диагностике и лечении детей в условиях стационара и поликлиники: Сб. научн. трудов РязГМУ. - Рязань, 1997. - С. 9-11.

3. Астраханцев А.Ф., Астраханцев П.А. Ультраструктурная морфо-метрия опухолевых клеток при лейкозах // 1-й Съезд Российского общества патологоанатомов: Тез. докл. - М., 1997. - С. 16-17.

Э. Астраханцев П.А., Астраханцев А.Ф., Николаев В.В., Приступа A.C., Крупнов Н.М. Нарушения тиреоидного статуса у больных острыми лейкозами старших возрастных групп // Пожилой больной. Качество жизни: Тез. докл. II междунар. научно-практ. конф.- М., 1997.-С. 5.

Тираж 90 экз. 7.05.98 г. Отпечатано о готовых оригиналов заказчика в НПЦ «Информационные технологии», г. Рязань, ул. Гоголя, 28, ком. 34. Тал.: (0912) 21-46-81.