Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранная АТФаза корневых клеток хлопчатника в норме и при засолении

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Мембранная АТФаза корневых клеток хлопчатника в норме и при засолении"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ «БИОЛОГ»

ИНСТИТУТ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ

^ На правах рукописи

ПВЛЕВЛ ЛЛРИСЛ БОРИСОВНА

МЕМБРАННАЯ АТФаза КОРНЕВЫХ КЛЕТОК ХЛОПЧАТНИКА В НОРМЕ И ПРИ ЗАСОЛЕНИИ

(03.00.12 — физиология растений)

(576.314.2 + 633.51) : 632.12

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1994

Работа выполнена в лаборатории физиологии солеустойч йости растений Института экспериментальной биологии растен АН Республики Узбекистан.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор АЗИМОВ Р. А. кандидат биологических наук ПЛЕХАНОВА Л. С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корреспондент Уз АСХН, профессор САМИ ЕВ X. С. доктор биологических наук МИРСАЛИХОВА Н. М.

Ведущая организация — Ташкентский Государственны университет, кафедры Физиологии растений и Биофизики.

Защита состоится............./.< 1994 г. в............час

на заседании специализированного Совета Д. 015.19.21. пр| Институте экспериментальной биологии растений НПО «Биолог; АН Республики Узбекистан по адресу: 700143, Ташкент, улиц; Ф. Ходжаева, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экспериментальной биологии растений АН Республики Узбекистан.

Автореферат разослан ........................................................................ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемн. В условиях возрастающего засоления земель всё актуальнее становится проблема повшения урожайности сельскохозяйственных культур, возделиваемых в регионах, подверженных засолению. Решение этой задачи требует расширения и углубления знаний о механизма солетолерантности и возможности повышения селеустойчивости растений, особенно их корневой системы. Устойчивость же корневой система растений.к. высок™ концентрациям солей тесно связана с особенностями структуры и функциями её плазматических мембран. Эволюционное приспособление растений к изиеняпзеЯся внешеЯ' среде ило ;по... пути Лорнирования на мембранах но больного числа конных насосоз, основаниях на едином принципе (Полевой, 1969; Болдырев, 1950). Один кз - элоктрогешплй К+-насос. локализован ка плазкалем-уз и осуг.естзляот сго-.о ^ушодпо через ГГ^-трсшслощрущуи АТ5азу плазматической мембрану. Значимость изучения плагмпла?.-мной Н+-А75аз« клеток "\:с~'.х растений связана с ее рояьа я таких аая-нейпих процессах растительного организма как минеральное питание, транспорт ассрмилятоз, я, з конечном счёте, реет и развитие растений. Подтверждением этого является практическое-использование уровня активности сер?ента в качестве показателя продуктивности растений (Воробьев, 1585; Дор^нх^.и др., 1550).

Наконец, изучение £ианолотческих особенностей $укхцлокирования ионного насоса, испольэугсего весоиуэ доли метаболической энергии клетки для перераспределения прэтонсз и ионоз калия нежду цитоплазмой и средой, имеет принципиальнее значение для понимания жизненно важных онергезагнепмнх физико-гкми-ческих процессов в биологических системах.

Особый интерес представляет изучение работы ¡-."-насоса з

г • а

условиях стресса, в частности, солевого. Исследования в этоы

с

направлении помогут познать механизм устойчивости мембран и, в особенности, плазцалехгш корневше клеток. В настоящее вреш мало работ по характеристике ¡Г^-АТЗазы при различных стрессовых воздействиях (Brin'.zin, Thoinley, Roti-Roti , I935jHassi-<3±n et al., 1936; Wataci et el., 1936; Вгц£ееяагш, Jaui -

esch , 1988). lis ЗГИХ работ ЛИШЬ одна (Hassiûin et al.»I9£6 выполнена на хлопчатнике, но изменение свойств фермента в уел виях засоления не зарегистрировано. А к моменту начала наших исследований сведений об ЬГ^-АТВазе хлопчатника в доступной на]

е

литературе совсем не было. j

Цель к задачи работы. В соответствии с вышесказанным была поставлена цель идентифицировать АТЗазу на плазыалемые кор-невюс клеток хлопчатника и связать её характеристику с минеральным составом тканей в норме и при засолении. Для достижения поставленной цели необходимо б!лло репить следущив задачи: « выделить чистые препараты плазмалеммы,

- исследовать свойства ферлента в норме и при засолении,

- сопоставить изиенеш:к свойств £ср.<ента с изменениями ионного состава ткани у разнш: qopM хлопчатника в норме и при засолении среды.

Научная новизна. Елерви« отработан метод выделения плаэ-мьлеиш корневых клеток хлопчатника, позволяйся получить препарат, на 945? обогац&шиП мембранами плазмалеммц. Определён фэсфолипкдный состав мембран. Найдены оптиугльныэ условия функционирования транспортного фермент плазкалетш (pli среда инкубации, состав среди), который на основе кинетических характеристик к кнгкбиторного анализа идентифицирован как Н+-АКаза,

1твечг.г~ая за обмен ионов яалня протоков ««уду клеткой и :редоп. Прове дета сравт:телып.:е исследования свойств АТФази ) коргях проростков четырёх сортов хлопчатника в кор.?е и при жсолени*.

Псактнческля гучноегь. Представленный- в работе метод выделения плазматических кембран хлопчатника расширяет 20змс;гнсс-ги т/ембранологов позволяя не только определять состав мембран в зависимости от вида организма и условия его выращивания, ко к .»зучать <*уняф!0нир02адое и свойства глазмалемлн в различных средах, полях и прочем варьировании условий с цельэ расширения сведений о механизме поступления ионов з клетку.

Установлена взаимосвязь уровня АТЗазной активности изолированных мембран и Ееличины рабочей адсорбирующей поверхности, а такте агг/догицирута-.ей активности интактных корней. Наедено, что степень подавления активности Н+—АТ^ас; момброк у разк>пс сортов хлопчатника коррелирует с уропнем накопления з их тканях натрия и екккеихеи рабочей адсорбирукщеЯ поверхности жта::?:дсс корней» * -

Модифицирован метод рН-теста с целью отбора еолеуетойчнн-"^ проростков хлопчатника.

Апробация. Основные положения диссертационной работы проели апробацию на 1У конференции би.;хш':-'.<оз республик Сродней Азии и Казахстана (1936), 1У Всесоюзном симпозиуме по соле-устойчивости растений (1936), Втором Всесоюзном Совегснни Тч-няткха развития" (1990), II Съезде Всесоюзного оЛ-еот" зоологов растений (1990), 7 лок~есеНи»'и биох:-'"'.'"- з Средней Азтг и Казахстана (1991), .'./е'-дгназ"дн'м Си:«—-о '.изиол -гии, биохимик и генетике солеуст'ОЙт-'з-з"от?" "*й' 199-1 * заседании лабозатсзни физиологии сслоустойчиэости

,кент, 1994).

р

Публика цги. По v?. то ри & лак диссертации опубликовано 8 работ.-

Объём работа. Диссертация изложена на 114 страницах ма-синопиского текста и состоит кз введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы; включает 2 фото, б рисунков, 16 таблиц в тексте. Список литературы содергят 124 ная.:енован;5я, гз Kir* шсс грант» - 83.

УСЛОВИЯ ПРОВИДЕНИЯ ОПЫТОВ К МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Объестог; v.c.слсповптгя слутгнл:* первичные корескк глоп-VSTKI'KS { Gossypixa hirsutua L. ) в основном сорта 1С8-Ф, а в ряде случае* сортов - АН Узбе?скстан-3, ЛН-Еагут-2 и Тапкент-5. Для анализе брал:: отрезт* корня т 0,5 см н"ге П'покотиля. Все далы'с^гге процедуры проводил? при 4°С с рредварттельио стерг-.тгзовамгымг растворатпт. Засоленке создавала дсбавленгег хлоргс-того лгггг'г до после 6-часового набухаьтя семян в гттятель-растворе У.ог.тида-Аи\э??я I.

Вг.'пегР'П'с ггя&мтФЖ'г гх мембран ос уте с твлплтт готодог ль; го го центра*угурогаш'я jts го.чогената tkcw хорек-ков 3-х д»евннх проростков по R.Т.Leonard u C.V7.HotchkiEs , (J??5} с дополнениям го D.P.Brisfcia и R.J.?oolc (1583). По сго1рянгкк гь'дслсгггя еобкраяг штер^гзу, образовавшуюся в слое гчтэтностьв 1,15-1,20 градиента плотности сахарозк, соответствуйте:.: г:ла ручей глот?госта мембран плаз(?с.:ег:?л-\ Согласно датши электронномикроскопического контроля, обогащение выделенной ми-кроссмальной фракции плазмалеммоЯ составило Дальнейшие исследования мембранного препарата проводили с учётом содержания в нем белка, определяемого по методу Лоурк, модифицированному для определения мембранного Селгса (Hartley , 1072).

А??азнуо активность мембранных препаратов плазкалеммн зпрзделяли по количеству неорганического фосфора, образовавшегося при инкубации белка уеыбран в среде, содерусщей суб-;трат АКаз - АК и иены, активирующие работу фермента. Анализы приводились по методу G.L.Peteraon (1978), в осноге котог:: coro ле.тпт образосание синего коотлекса ортоЛосфгта с ыолибде-товол реактивом, регистрируемого споктрофотсмзтриччски. Контролем служил?? пробы, 5 ?'Отлрь?е додедалсульфаг натрия добазляли so начала инкубации.

з лппкяногз ссстяуя нлгу-г-лргга проведу ли методом тонкослойной хроматографии (Нзз:пг?"?, 1072; Эзре-гагэт», >угзв, XS?C) госяе очнеттэт и эгетраг/рогаят'я «fioe^jwrn;-"Он ?'з препарата плая/слегун по (1957). Идйнти'яик?ц:?гз

^ос^лугттрб проводили по цвет!'??:? качественны.? резкгрп? и по их относительно" элг?-;?р0^0рет,.:чес!{0^ подзигкости С-5-* Н:л::ч=с?во гнд??видуальнкх *зс*ол)*пидев определяли по содержания фге'ора г эл*?ате пятой после иикерализации (Ермаков, IS67).

Спреп5ЛРн::е s?r/"/3'h??y tyrne^ аг-стнрнсст/: унта«?:-:-"* проростков хлопчатника проводили по несколько акдокзмекакног/у адтоду з?<спресс-д?:ап:остнкн потенциальной продуктивности рассеки?, Л.Н.Воробьёва и К.Н.Егоровой (1£сЗ). Сравнивалось hs.-.oüor содеряяккэ выделенных исков водорода пр* г?0гяг.ек:!к а раствор проростков разккх сортов хлопчатника, предЕарит-здькз прор™'.-эеегяп: я::бэ з пресно:"!, либо з ергде с ::лор:'ст'-"?' кптр'з:.

'-претк?лен?*е сог.еглЯ-н?'? к ал*'.? ?• нпсс?'£ з

твр'але, вксутанно;? дэ гсстз.тнного веса, ""тол:?'- ::-?-

т*вагг.?онного якчл'/п ("'•тястзэ'., IS^C) з .^-"roi* г"—

31?"?? At; Респл^л?'???? /обвчистан. з^нлз"-*? на язл°?""*

к?'? активности бо'^я'сдггэзчзП ?'ссл~?с"п?'?т": .v'c~~,-rri

геша-частицаш идм нейтронами. „

Определение общей и рабочей удельной адсорбирующей по» верхнос?и корневой системы проводили методом Д.А.Сабшс.на к И.И.Колосова (Третьяков, 1990}, основанном на способности KOf ней адсорбировать вецества из окрукапцей среды (в данном случае метиленовую стпо).

Статисгегческус обработку дашшх проводили по Б.А.Доспс хо'ву (1985) методом характеристики выборки при количественной изменчивости признака. В таблицах представлены средние apiane тичаские биологических опытов и.кх ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЕОДЩДОЕАНИИ К 15Х ОБСУЩЖЕ

I. Выделение плаамелеммы и характеристика ынкросо-ыальной фракции из корешков хлопчатника

Основополагающим этапом исследований явилась раэработк. метода выделения препаратов мембран, обогадёшоас ялаэмалеыкой. К моменту начала нашей работы наиболее четко были отработала методы вцделения мембран хивотлкх объектов. При работе с рас® тельными тканями существующие методики не давали доляяой чистоты и степени обогецения препаратов путными органеллами. Поз« тому в течение нескольких лет нам пришлось заниматься разработкой метода получения плазмаяеммы кореиков хлопчотника с те1 чтобы можно было изучать её строение и свойства.

Большинство методов, испольвуемюс для выделения препа. ратов плазматических мембран, включают механическое разрушение ткани, получение с помощью дифференциального центрифугирования препарата микросоы и разделение фракций мембран разного происхождения. Каждый етап процедура шдодапшя плаваалемкы имеет. больное сначение для качества и количества поручаемого препа-

?

эта, Незначитошше, с первого взгляда, отклонения в методика изменение еолпчишз ионной силы, содержания дпзалонтнкх катио-:ое и валнчини рй растворив как при гомогенизации ткани,, так и а других этапах вуделения макросом) иогут приводить к изменения войстз плазизлем'мы, умзньсенич выхода получателе фракций и кх агрязнекпэ цитоплазмой, друтаги клеточными структурами и Срак»

С самого начала выделения иыбран.тогдай этап метод! тда~ ельно вывэрядся. Так, для укокьсэнкя подкислсния гомогеиата ва-уолярсм сзгзи, пагубна страга*лг.енся на активности фэрмеитов, тактзз, *ггоба кскгхчить сагрдзценга э:г/грлгэз! окулярного про-транстза од^ктрскноплот'лом сод-зригдм при гомогенизации корел~ :оэ, соотногоште ткан^/йу^-эр соблюдали не менее 1:1,5-2, Для 'дало;см: металлов в бу>зр добавляли хедатор ОДТА. Кро:-о того, с ¿злю от::::тм SH -групп к зчбргшссвгзагаих ^ермгнтоз з бу*ор оао-;:лсл мер::сптоо?п;ол9 я з качестве а.чтно::сидз::тоа - агдорб'.дптгг.д

гслота и готаблоулу'тпт калия, яплг.г.тпеся ингкбктзр?;-л <

:£>д5п:.*>лького охигдзиия, которому более сссго под^г-ргдгтед «?::о„-»

мембран. Подю:з зг:5чен:тз имеет рК буфера. при. нэйг-яя*нкх его значениях образуется инт-зр-фаза из мсмбр~н, гнал: ор-•аг&яг-г и все мс-ыбргк:-: суспензии в напзмекнем гиде схазу.т:.з~тся I осадке (при ккслыг зклчзкиях рН сугпягпдт), либо комтнекти .успензим ок^зкваэтея содпбилизирогзгсгхт по везьу общему про-:иркл {при сзлс^ас.^ знзчзю'лх рН ерздл}.

При очиценни инкросомгльной сракцки гсазгэка? raur* х:-:еакоз подвергался дкф*,зрснчийльиоау цен-гг,: !угнрззанм. '/г тапэ работа з качзстзз спорной нами использовалась иэтг^'гг изучения плаамадеимы из парзичкнх корегзэз гузуруза ( Hotshki33 ,1375), позволявшая пэгуч:«:» прасара? ыс-ь-бран, ча

7Of, обогедёшшП плазматическими мембранами. Нам удалось пови-снть степень обогащения модифицировав схему центрифугирования добавлением ряда отапов, а такг.э заменив двуслойнпй градиент сахарозы ка четырёхсложной. Кроне того, введение отмывки микро-ссмальной Фракции калием йодистын no D.P.Briskin u E.J. Poole (1933) позволило регистрировать в препарате избран активность не только периферического фэрмента - фосфатаэы, но и интегрального бежа - АТ£азы. На рис. I представлена схема метода. Путей дифференциального центрифугирования из гоцогената ткани удаляли клоточнаэ стенки, ядра, пластиды и т.д. Из супернатан»

та осаэдалк грубую микросомальнун Фракцию (30 мин)« которую

!

затем обрабатывали калием йодкетш и осаядали в том га режиме. Затем иккрооомальную фракции центрифугировал!: в градиенте плотности сгжфоуц (1,5 часа). Собирали ннтерфазу на границе слоев

л

сахарозы с плотностью 1,15-1,20 г/си. Электронномикроскопкчзс» кий анализ показал, что все мембранные структуры представляют собой везикулы, на 94/5 состояние из мембран плазмалеммы. Введение отмывки мембранного препарата йодисты:.! калием способствует, шдшо, раскрутив везикул. Выход мембрашшх препаратов по белку составлял в среднем 0,2^ от общего белка гомогената ткани или «■ 2 мкг на грамм свежей ткени корнаП. - .

2. Изучение свойств мембранного фермента хлопчатника

После отработки метода получения препарата плазмалёмш била проведена идентификация мембраносвязанного фермента, ис- . следовали его свойства на пресном боне с тем, чтобы сравнить кх отклонение в условиях засоления среду. Нами бала проверена специфичность фср-ю;:?а в отлопении расцепления имстю аденин-куклэозидтрифосфата по сравнению с другими субстратами. Кок вид ко из таб. I, фермент пясвмалекки хлопчатника предпочтительнее

гсыогшт

/

ядра,нле-тсчгас стенки, пластиды

митохондрии, аппарат Гольдаи.

КИГОХ.. АП.ГОДЬДДГ, ¡flfiffOOOaf

14000<

МЖРОССУН

8000Q

М1ИР0С0Ш

^^ 60CC0.Î p-p калия I ¡ - v v 3

йодистого

ия i,

ro и

i— i cGCCO a

----1 3

! i плазудлз:,;

Рис. I Схема "¿деления Kei-.át анкых фракций

всех расцепляет АТФ, т.е. скорее всого фермент монет оказаться

Ш'азой- ' Таблица I

£ос ^огидролзэнпя активность мембран с разными субстратами

Субстрате специфическая ькткеность,!''е:.:спение актив-в присутствии !мшэль Рн'ыг бе лка"*^ * час; 1ности по сравн. Uf/o+ ГО;.;" КС/ t_____! с ATS. %

Зк1! А1Ф ч 8,90 + 0,40 ,

УТС 5,07. + 0,25 ! -43

№ 2,58 + 0,14 | - 71

ЦК 3,83 + 0,20 i - 57

m 3.05+0,30 -59

-«-ALi 0,00 + 0,04 -91

Известно, что гидролиз АТ£ АКазоЯ требует обязательного присутствия дивалентных металлов. При исследовании чувствительности ?ер^ента к солям дивзлснтних металлов при pli 7,0 било выявлено, что глдролмз АГЗ снжался в ряду Кд> Кп) Са и мало зависел от природы анкона (таб. 2). Как известно, катионы одновалентно: металлов повисают уровень АТ£азной активности. В наша опытах мы обнаружили, что селективность фермента з отношении одновалентна катионов аналогична отмеченной для плазматических H+-ATvQ3 из листьев и r.opiefl кукурузы { Perlin, Spfmcv.'icV, 1981; Le -lichelis, Spar,nvrioli , IS8G). Сти^улирувдиЯ Зч^ект одновалентных катионов падал в ряду K>K-Î^>Pa>bi > Со , что является зер-кальнш страданием ряда токсичности гонов, полученного другими евтэрами (Кабанов, 1975). Kpiwe того, как видно из данных таб.2, обработка препаратов мемфлн детергентами но поЕыи&аа v.y. фсрмсн-татиенэй активности, что свидетельствует об отсутствии в препа-

рат&х иеыбран замкнутых везикул правильно:! ориентации, т.е. по-С1*уплэ№:з субстрата к £ер:екту но затруднено. При сравнении работа фермента на ¿оно различать р!1 среди ишеубацнп (от 3 до 9) максимальный урозспь активности бет зарегистрирован при р!1 7,0.

Таблица 2

Влияние ионоз и детергента на АНЗазнуо активность препаратов плазмзязкма из корней хлопчатника

Соли

Специфическая актизн.,!Иэнкая стимуляц.

с

г"

Без добавок ЗУ-'.' ИсСГо

Ыс(ССС11)2

-»- СаС12

^с^+зс-;:: :-;с1 :;к4С1 ГаС1 Ы С1 С:С1

Я ч* П>-)

Я

1мн40ль Рн*мг белка"1• ! по сравн. I -час"1 _! .

0,94+0,03

5,67+0,

5,74+0,32

5,81+0,23

5,23+0,29

2,29+0,13

8,52+0,40

7,74+0,45

7,32+0,32

6,74+0,39

с, 3-^+0,13

б,4с+0,3о

6,16+0,35

с,1С+С,23

гсо

93 99 с'З ЗЭ

1-5 132

115 4С 110

+СС:и Х1+0,0255 трнт'н 5,4343,14 .-Г

Для характеристики любого ^ер^ита из б:г:дпм" оград: кинетические данные его активности. При ¡юлчткчзезузе нее; ниях ш в сзозЯ работе брали экзимэ.ъ~ркь:з отно^ко'Л субсч

АТ5-магнкй в концентрации от 0 до 4,5ыМ. 1!з рие.2 видно, что до Зц\! гидролиз имел линейную зависимость, а далее наступало насыцекке. Представление полученных данных в обратных величинах по метода' 1аЯнуивера-Бориа{1934) подтвердило, что характер криво Г; зависимости скорости ферментативной реакции от концснт» редки Г^-АТБ соответствует уравнению !.!кхаэлиеа»"ентен. Г.пкск-мальная активность мембран проявлялась при концентрации Уд-АТЗ? Зь&. Величина Км равна 0,52. Введение в среду инкубации ионов калия повышало У мах, но мало изменяло Км энзима. Результаты наша кинетических исследований близки кинетические данным, полученный из кэрнеП кукурузы, редиса, свёклы и согласуются с да» нши о значительном влиянии ионов калия ка Кмах и меньшем- на К

Актиеность фермента, Рн мкмоль/мг белка в чао

ЗмМ М^СЬ,

ЗмМ МдС 50м14 КС1.

Концентрация Мд-АТФ, м моль —

К« I. 2 3 Ри&.З График зависимости АТказной активности от концентрации субстрата / Нд-АТ$/

Помтао специфических ATíaa гидролиз ЛТ5 ыогнт осуществлять шибкий спектр не с re ци'1-:*чз о фзсфатаэ. Кззс видно из данных таб.3 уолибдат ewrcwH (ингибитор нзспоци^ичесгачс фосчатаз) дагз несколько повыпал актпвц:сть берменга, что, вероятно, связано с г^-Гектом

и:ноа гуаюния. Отсутствие знечгаоп эффекта от олкгол;:ц:н-:з и нитрата кадия свидетельствует с tc:j, что пнделанкш нами препараты плзг-

малом:,¡ы практически ка кыевт пркмесн мнтзхсндркальккг мембран и т:-

копласта. Таблица 3

Влияние ингибиторов на А?*азнув активность

пяазмалеюгы корней хлопчатника

ингибиторы, .'.¿i !тззвность, !антиэ.псд

Тмкноль' Рн'мг бел-!дзЛствнем __? ^-Г^т-асГ1 1:т5

Еез ингибиторов (B/ÜFIF) ~ол!'.бдат a:.:r.îOHva (M.А.} 0,10 Олугода:?!« (Ол.) йгсг/мл

Нитрат -алмд (Н.Х.) ГС,СО ' Оуабакн (Об) 0.С5

Д^агпслогехсилкгрбодупг.тд С,05

СЯ5Ш '

Зртэв-нздат натрия (O.K.) 0,05

Для хярхгг-эрпстпки ¿v¿ü3S ::спо;:ьгз5а:-!Ы тзг.-

r-з cyaíani - кнгкс;:-:? ?г,и-А?5азн, - бл^атср г^отгн;;^; к i-каля И сргзвзкздат натрмя - спгцг^кч^спЛ 2:-7л:г:»

c-rrj^-s-.jyc-j-.z: ATîaa. Агставкосп, препарата угыбрзк давлгкась оргоаакздатсм и Д£:Д. Всё это сг.^т-злъстнует о про;«,--- * H*,î;T cnçrjrfeî-reexo,'? А Г* i ~ но? "ГТ^ЕН^СТН

3,97+0,44 ICO

9,15+0,50 I0Z

7,61^0,42 53

7,20+0,40 cl

7,If.+0,4l СО ■',03+0, СО

В целом полученные наш данные позволяют сделать выв^д о том, '-.го в мембранных структурах клеток проростков корней хлопчатника присутствует магний-зависимая катион-стинулируемая Н^-АТОаза, близкая по своим свойством к АТФазам плазматических мембран других растений, благодаря которой, вероятно, происходит активный транспорт конов калия в клетки корня.

3. Сравнительное исследование АТ$аэной активности изолированных мембран корешков разных сортов хлопчатника

Чтобы определить значение найденного феряэнта для целостного организма, мы попытались получить более 'полную картину происходя», щих в растении процессов. Для чего в качестве модели исследовали проростки трёх разных сортов хлопчатника. Сортовые особенности культуры предполагают и различие в АТФазной активности, "з таб.4 видно, что на 72 часа роста в контроле наибольший уровень АКвзиой активности отмечен у наиболее быстро растущего сорта Ташкент-б. Серлент этого сорта к наиболее отзывчив на ионы калия. Минимальная отзывчивость отмечена для сорта АН-Уэбекистан-3. Исследование минерального состава проростков покаэало, что сорт Ташкент-б также накапливает келия больше. Т.е. уровень активности фермента и его отзывчивость на калий выше у тех сортов, чьи семена быстрее прорастают к накапливают » своих тканях калий,- Таскент-б >АН-Баяут-2>АН Уэбскистан-3, что указывает на прямую корреляцию интенсивности выделения протонов ¡Г^-АТФазой мембран и поступлением в клетки" калия. Аналогичную зависимость на картофеле отмечали А.А.Дорошенко с соавторами (1990), КП культуральных объектах О.КеигЗ-гггапкаг и Б.0гета1 <1990).

Таблица 4

АТФззевя активность шхаз^деьг-ш корней 72-часошх проростков разных сортов

Объект взделенпя! Состав сродц Юпецкфкч. октгвпооть,!.аг :.:оль Рн*!Отклонение

ши.:бран(ср. длина! еткубоцгл { тг белка"*'чао-^ . {зроол. от

дорн.ггророотков)! ■ ! контроль ! зеооленке ?копт.. £

Ташеат-б ЗыЫ 1ЛдС12 5,30+0,35 3,71+0,35 -50

(9,4 си) +60ь« КСХ 9,54+0,42 5,72+0,30 -40

• .+50^'.: ГлО! 8,11+0,31 4,7а70,40 -41

АН-Беяут-2 ' ... 4,87+0,28 3,89+0,20 -18

(8,7 си) +50кМ КС1 8,28+0,28 ■ 6,28+0,19 -24

+5СмГ4 Г«С1 В,04+0,21 ■ 5,98+0,17 ' -25

АБ-ЗГзбекнстан-З-"-. * 4,77+0,23 • . • 3,43+0,23 -28

" (8,1 см) +501-11 КСХ • 8,01+0,34 5,21+0,20 ; -35

+50кМ 15аС1 7,16+0,38 4,65^0,25 -35

4. Влияние засоления средц корнеобитения хлопчатника на активность кембракной АТЗ-азы

Исследование устойчивости корней проростков нами проведены были на наиболее токсичном для хлопчатника - хлормдком засолении. При этс.„1 было отплачено снижение уровня А'ГЗгзиз" активности и ее стимуляции катионами (рис.З). При этом подавление стимуляции фермента палиеы и натрием было выралкнэ в одинаковой степени. Если исходить us положения, что одновалентное катионы, ста-мулирущие активность фермента, взаимодействуют с его регулятор» Н1л.! (Воробьёв, 1988) или активным центром (Леонтьева,и др. 1980), то причиной уменьшения их эффекта при засоле;пж Xiose? быть изменение структурной организации фермента. ПосхольЕу засоление

/

зкзнзает замедление развитая проростков, стмечскныэ кгменения могли отражать и состокниз фзриента на более ранкюс стадиях развития растений. Но, как видно из рис. 3, при sac о лож: наряду со сниженном удельной активности фермзнта, стмочоннхлу! на более ранних стадиях прорастания семян, сохраняется'катпенная специфичность фермента, свойственная ему только :га белое поздпг? стадии роста.

ИчгкбитсршЯ анализ А"Еазнсй активности мембран засоленного варианта показал снизсние чувствительности фермента ко всеу ис» пытанкш ингибиторам, что такга указывает на воюогикз структур-нка модификации фермента при засолении (рис.4). "аксинальное к:-> глб.ирование ьетпености ертовонадатои натрия ецс раз подтверждает, что к в условиях засолгнпя ш тазеы дало с К%&!Вгззой.

При исследовании кинетачйских sapa кто рястах фс-р"с::та г условиях засоления на:ш Сило отмечено екпзанг.о значение Yzi при зтсы оставалось прзгкиы, значит сродстоо ферь»екта к субстрату при зтса не иаагнкзэсь. (рай.Б). 2то езидотожьегоуе* сб уь-ан**

. 17

» •

Активность фермента, Рн мк мол1-/мг белка в час

8 7 б 5 4

П

Q - контроль

22 ~ засолен. I - ЗмМ MjCIg

II- KCl

III- -"- feCI "37-'-"- KCI.JiaCI

"71

4

Iffi

гш fgjjjgjga

I II Ш 1У

бб часов 72 часа

Рис. 3 Изменение активности АТ^зы в процессе прорастания

семян и при засолении

Акгкгность фермента, Рн кв моль/мг белка в чао

контроль - засоление

Ингибитора

Ъ/т. М.А. Ол. ДЦКД. Об. H.H. _0Л.

РисЛ Влияние ингибиторов на АТФагн/и активность ~____ ________в норне и при засолении

Активность фермента 9 Рщемоль/мг оелка в чао

1 - контроль

2 ~ засоление

.... Концентрация м доли

Рис. 5. График зависимости АТЗазкой активности

мембран от состава среду взращивания проростков

*

шении степени обогащения «¡хзрментом мсмбр-.нкчк белков или снижении скорости оборачиваемости ¡'ос'оферментй под влиянием засоления. А это в значительной степени зависит от состояния фосооли-пвдного огрубения фермента на пяазмалеммв.

Итак, снимание чувствительности фермента к однозалектк;:м котионс ь: и специфическим ингибиторам транспортир АТ'аз, а так'.е снпкгн.че скорости реакции при коизьгеннэм значении Км позволяет предполагать структурное модификации мембранного фермента клсп-чатнкка в условиях засоления.

5. Влияние засоления на фосфолилидн^й состав плазматических мембран корней хлопчатника

Как известке, сохр-с-но*т,"о ферментатигуэн активности плаз-мадемми в значительной степени способствует гидрофобное окружение фзр/ентов мембран ^сс'олипидами. При исследовании со ста га плазмляемми корней хлопчатника было обнаружено 7 фосЬсянпндое •'рис. о), из ко*ер-х< Зкло идентифицировано 5: «ос-'атидная

.Содержание фосфолииядов,^

20 15

10 5

И ✓

/ /

/ /

L

и

И

й у

у

/

ФС

о

контроль

засоление

ФИ

(Н*0,78)<Ж ФЭ (Rf 0,85) ФХ Рис.6. Влияние засоления на содержание фосфолипвдов

в плазмалеше корней хлопчатника

кислота faf 0,95), ФЭ- фосфаткдилэтаноламин fef 0,09), <J>X~ фосфати-дилхолин (Rf 0,41), ФИ- фосфатидшшнозит (ЯГ 0,31), ФС- фос,[атя-дилсерин ( Rí 0,04).'. Два нецдентирицировашшх фосфолипвда имели кг 0,78 и 0,05. При В'.'рацншнки на пресном фоне в составе мембран проростков прзобладал фосфатидш;сорин. 1Сак видно из рис. б, под влиянием засоления качественных изменений не происходит, а наблюдаются существенные количественные отклонения, из которых самым значительн;,:и является возрастание содержания ФХ почти в 2 раза. Известно, что ¿тот фоа|олкпид принимает участие в стабилизации ла-медлярной структура и интактнссти барьера проницаемости мембран (Балли и др.,1989).

Итак, при 1%-и засолении в проростках хлопчатника на 72 trac-a роста, по-видимому, не фсрмируотся efe ncv¿ компенсаторные механизм!.:, а просто происходит модификация обично функционирующих транспортных систем.

G.Сравнение АТФазной активности мембран, рабочей адсорбирующей поверхности и ецидо^яцирущсП способ-• яоети корней раоних по солеустойчисссти сортов хлопчатника

/

В сравнительном аспекте била исследована АТФазная активность плазыалешы трёх разных по солеустойчивости сортов хлопчатника: неустойчивых Ташкент-б и АЯ-Узбеккстан-3 и устойчивого АН-Бая-ут-2. Но связь уровня АТФазной активности корней, степени засоления среди коркеобитания и солеустойчивости растений указывал ряд авторов (Достанова к др.,1380; Тихая и др.,13846). Нам необходимо бьло определить характер стой связи для проростков хлопчатника.

При анализе и обобщении даннж в качестве ведущей била принята концепция, согласно которой более высокая степень устойчивости к внесшему неблагоприятному фактору, обусловливается,

ломимо прочего, способностью растении сохранять нормальшй уро-

/

вень метаболизма (Удовенко, 1930). Как видно из таб.4, меньше всего активность при засолении подавляется у (Терыента сорта АН Баяут-2. Падение активности фэрмента у Ташкент-6 и АН-Узбекистан-3 почти одинаковое «составляет около 35-40;', т.е. степень соле-устоЯчиьостя и величина устойчивости режима работы Н+-ЛТ^азы взаимосвязаны.

Исследовании минерального состава проростков, виртцанньк б условиях засоления, показало значительные различия в величине накопления натрия в тканях проростков разных сортов, коррелируемое с величиной потери калия из тканей корня и его вьтескэниеы э надземние органн проростка - гппокотиль л семядоли. Выгодно отличается ст двух других сорт АН Еаяут-2. Если в корешках ото-го сорта, выраденнмх на пресно« фене, содержание нг-.трия было наибольшим по сравнена*) с двумя другой сортами, то в условиях засоления сказалось, что проростки этого сорта накапливает кггшекь-згз хслйчество натрил. Л.Л.Бof:^:o(I9S9, такг.е стмзчает, что у более приспособленных к засоления растений з тканях накапливается

значительно меньше балластных солей.

Известно, ч'*о. ацидсфкцируацая активность интактных корней

г '

растения - результат работы главна образом Н+-АТ£азн плазмалеимц. ?'етод сравнения ац: ¡дофи:;ирущей активности корней через определение рП среды корнеобитанкя уъе ряд лет используется в качестве теста на интенсивность роста и да-*е последующую продуктивность растений (Воробьев, 1988; Дорошенко и др.,1990). Данные опытов, проведённых нами с помощью этого метода, свидетельствуют о корреляции величина рабочей адсорбирующей поверхности, уровня ацидофицируткцеЯ активности интактиых корней и АТФазноЯ активности вьделегшнх из них препаратов мембран. Это позволяет при рассмотрении особенностей транспортных процессов в корнях хлопчатника при его выращивании в различии* условиях опираться на величину исследованных нами параметров. Мц внесли в методику некоторке дополнения и теперь с се пометь« кожко определять степень стабильности протендви^уцих систем при засолении на интактных корсаках. На рис.7 представлены уровни стабильности протоедвккуцих систом и величины рабочей адсорбирующей поверхности трёх сортов на засоленном фоне внрацивания пророст-

^ хов по сравнению с контрольна. Из' рисунка следует, что проростки Степень сохранения

90 признала по ср. с контр.,%

70 50

30

АТФззная активность Ацвдофицир. активность Рабочая адсорб.поверх.

Сорта хлопчатника

Твш.-б Еаяут-2 Узбск.-З

Рис. 7. Влияния засоления на показатели кореисов хлопчатника

солеустойчивого .сорта АН-Бояут-2 способны в напбольсей степени сохранять в условиях засоления способность к формированию рабочей адсорбирующей поверхности, а такл:е уровень Aliaзной зотив-ности плазыолеюл и зелич^ну адсорбирующей активности иктактных корней. Т.е. состояние ЕротопдБйжущгх систем mozko считать одним из определяйте звеньев механизма солеустойчнзостп хлопчатника.

ВЫВОДЫ:.

1. Разработан метод вдделек;*я препаратов мембран из клеток -корешков хлопчатника, обогаяёщшх на $4% везикулами. плаз-мэлеитш. Препарат содержит 0,2% осщего белка гоыогека-та ткани, основным по содержанию фосфзлпггэдо;.г является фос-фатидклоерин.

2. Преперотн плез.мслегг.ц обладали нуу^еоз^осфохтдродсзвой активностью. Зпвас:г.:ость окоростя гидроллзс ст вяла субстрата, pH среда'инкубация, :.:око- и дшзелептных иоксз показала, что оптк.алькигз условиями роботы фортеатэ явяле-тся pH среда 7,С, содер-янпе »lo-ATC - 3:.¿í, KCl - 50¡áf.

3. Исследованы кинетические херсхтериотх-сл Сзр:.хнтс. Характер зависимости скорости форг.;гнтатавно2 реокцглг от концентрации Mg-ATt соответствовал уравнению Ыглаэллса-тектен, величина Ым равна 0,52, а в присутствии калия - С,45. Вьедзн-е б сред- инкубации калия повышает Унах. 4. Характеристики фермента и полное сохранение чузстзнтельнос-та к o¿Tos£HD~t-Ty ютрля поззо.т-:.:;; гздрелез-

куа активность £зр.:екта швзгалггаа как азгк^гзазгегиуа, -кат;:онс'Г1:'.7л-руе:..7Е Hi-ATiasy, учасявуьеза в изхзнгсге if- насссз слазг.злэ;.г.а. о. ^рсэель £.;-:г:-екссти Н+~АТ1езн изолированных мембран связен

с интенсивность» проростэния семян ресяых сортов хлопчатника е нокошг-гккем в них калия.

6» При засолении среда корнсобитанкя проростков хлопчатника отмечено снижение уровня активности фермента, чузотвптслъ-пости его к одновалентным катионам и ¡шгибкторвм:, что, вс. роятно, является следствием либо модификации структурной организации ферисита, либо - количестве/шах чзкснсни3 фос-фолштдного состава кеглбран.

7. СолеустоЗчивость проростков хлопчатника находятся в зависимости от степени сохранения активности П^-АТСззи мембран и уровня поступления калия и натрия в органы проростков.

8. Установлена полояктельная взаимосвязь уровня АКозноЯ ск-

тлености кс:..бран корней, величины рабочей адсорбирующей поверхности и яц:'-Дофицкруюэдя активности ннтактшос корней. Адаптация проростков хлопчаьникв к засолению находится в прямой гвв::с:х.оста от стабильности уровня АТФазной окт;:тз-нсстд тьви&яегзз! и ьеглеймих свойств корней а целом, а кмешгс, ецодо^кцЕрущеЛ пктнвноста и величины рабочей сд-copöi'py-j'^eil поверхности корегжов. . .

Список работ, свубликовгншх по теме диссертация -

1.Плехснова Л.С., Ибрагимова Э.А., Пвлево Л.Б. Еншппе зесоле-

в2я на вктценость АТСези плазматических кембраи п раствора/юй

^з-глгцерофосфатазной октглшостгУ/Гезксы доил. 1У Всесоюзного

с импезпут .:з по с о 'icj стой-г шости растения. Тзгзинт, 198Сг,о. 70;

2.Азвмов P.A., Плеханове Л.С., Ибрагимова Э.А., Ивлова Л.Б.

Кзтиоп-чувствгтелышя АГСзза плазматических мембрт хлопчотнз-

ка//Тсзпси дохл. Л .Кояференцпн бкохкмлков республик Средне Я

Аз;:.: я Казахстана. Ашхабад. I9QG, о. 221.

3.Ивлсвз Л.Б.» Eiexanoво Л.С. АТОвзноя оклашоль плозамягп

клеток корня хлопчатника при зосолешга//ГезЕсн докл. Второго Всесоюзного Совещания "Генетика развития". Ташкент.I9SQ, T.II с. 65.

4.Ивлева Л.Б., Плеханова Л.С., Азимов P.A. Катаюнстшлулируешя АТФазная активность плазмадемш клеток корня хлопчатника// 2 Съезд Есесоюзн. общества физиологов растений, Ианск. 1Э2С: Ts- • 22СЫ докл. Ч. 2. Уюсква. 1992. с. 82.

5.Плеханова Л.С., Идлева Л.Б., Азимов P.A., Ибрагимова Э.А. АТФазная активность плазматических мембран из корней хлопчатника/ /Физиология растений. 1991. Т.38, & 2, с. 273-285. ' о.Нвлеза Л.Б,., Азимов P.A. АТФазная активность изолированных мембран а ацвдофицирувдая активность штактннх корней проростков хлопчатника в условиях ззсолекдя/Д Конференция бпох^-.аксв республик Средней Азии и Казахстана. Ташкент. 1991. с. 181.

7.&лева Л.Б., Плеханова Л.С. Влияние засоления на катдокстп-ыулируемув АТ4аэнув активность плазмалеммы клеток корня хлоп-чатника/Л-изнологпЕ с биохимия культурных растений.' I2S2. Т. 24, & 5. с. 499-503.

с.Азимов P.A., Холбеков Ю., Ивдеза Л.Е. Влияние засоления на фссфолдивд: плазматической мембраны корешков хлспчетняка//Те-зиси Мецдунзродзюго Сплюзцуиа по физиологии, бкохпыад 2 генетике солеустойчивсоти растений. Тавкект. I9S2. с. 61.-

НОРМА! БА 12ЩАНШ EAPOffliCA ГУЗА й^ОШРШШГ HE4SPAHA А1«аза=н

Гуза м доллар ¡ип:;г прстонлавна харакатлантирувг у.ембрана «кстекадаря буйича твдижотдар утказюгав. 9i% ахазшашша хеа-бсаналара бшая бейлтлзган препаратлар слии пмкснныл бгруэчи 3 клгнле. rysa пэдалвдан пдазмалеима мембраналаркна азратиб олип

* * -i

ycym rtnwaO ^itkhjttjh r/ e,v ip a b a ;t a p tot jrr ^ocifootimfl rapvvitivi Bimc-irsH^n. H+-ATI'a3C m6v. H/teHTK$incenHfl «TunrarsH i.«ew(5paHa <5orra-nm cp?p:?e!'Txnpumtrr aKTHBrorra amqnqnron mpvan nn ejyvxnum mapoHTuwm vnnnr xoocpwpn rsjruv.K «KJiimraH. SepivoRTJrap SKrirp-jrum, yciT'i Teorarrr pa HKxojr^fjpTxa to jib 3 TymraHira xfurTaJmnr oriria'snTV ryrpn dorJiaTW-t ajn^TPTrrau kiypxprmui mapoimoia fppjyewT aifTKRJiprra, fiTjcopriijiTCTOTum cojmnrirpMa hotto noaacn KaTT.ajrarH, wht?kt nn.rtrsffap airaq^ittjnp.tot'^m 3kt7rp?mrb Ba rv33 rasioj^aph ryara ^I'TtFir'nTm-ini ^apa^acn'opaci^arn jrrofriii dorJia-

hhtct anr^.TaH.™.

COTTON S3EELINGS R002 CSLLS AEiBRAIIE ATPase IS UKI/KR KOT-SAIIMS AliD SAUL'S COiJDITIOUS

?rotontranslocating systems of naabranes froa cotton seedlings arc investigated. The method partition of placsa aembranes froa roots of 72-hours groan cotton seedlings is developed. This nethod peraits to obtain preparation of aea-brar.es which contains 94& ncabranca of placxaleni.ua, Phosphc-lipid composition of membranes was determined. Activity of enzyae VPase on xcabranes has been reGistrated. Proper-

ties of ¡nt-aisrane-bound enzyme were 3tudies under non-saline and 3aline conditions. The relation bet7/een ATiase activity level, speed of yrowa cotton germinates and level of potassium accumulation in ones were found. The result indicates that degree of salt-resistance of cctton seedling0 ha3 been direct relation with stabilization at onzyae activity level under ¡Minity conditions, stabilisation level of quantity at specific vrork odcorbcion rcot&urface and stabilisation level of ;icidproduction activity n^tJ/a rcots.