Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы внутриклеточной мобилизации кальция в сенсорных нейронах мышей

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы внутриклеточной мобилизации кальция в сенсорных нейронах мышей"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ МІЖНАРОДНИЙ ЦЕНТР МОЛЕКУЛЯРНОЇ ФІЗІОЛОГІЇ

^_____________:___________________________

На правах рукопису

Свічар Наталія Вадимівна

МЕХАНІЗМИ ВНУТРІШНЬОКЛІТИННОЇ МОБІЛІЗАЦІЇ КАЛЬЦІЮ В СЕНСОРНИХ НЕЙРОНАХ МИШЕЙ.

03.00.13 - Фізіологія людини та тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Киев - 1997

Роботу виконано в Міжнародному Центрі молекулярної фізіології НАН України

Наукові керівники: академік КОСТЮК Платон Григорович доктор медичних наук ВЕРХРАТСЬКИЙ Олексій Несторович

Офіційні опоненти: доктор медичних наук СОЛОВЙОВ Анатолій Іванович

кандидат біологічних наук ВОЙТЕНКО Нана Володимирівна

Провідна установа: кафедра фізіології людини та тварин Київського Національного Університету імені Тараса Шевченка.

Захист відбудеться _1997 р. на засіданні спеціалізованної

вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою:

252024 м.Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології їм.

О.О.Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий ¡997 р

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

Сорокіна-Маріна 3.0.

з

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуальність проблеми. Внутрішньоклітинний кальцій на сьогоднішній день розглядається як один із найбільш універсальних регуляторів клітинних функцій. Зміни цитоплазматичної концентрації кальцію забеспечують передачу сигналів від структур плазматичної мембрани до внутрішньоклітинних систем, запускаючи ряд важливих цитоплазматичних процесів, що лежать в основі діяльності клітини. Регуляція рівня внутрішньоклітинної концентрації кальцію ([Са2+]іп ) визначається функціональною активністю структур плазматичної мембрани та внутрішньоклітинних органел. Одним з шляхів підвищення рівня [Са2+]іп є вивільнення його з внутрішньоклітинних кальцієвих депо. Основні параметри цих систем і функції вивчені достатньо добре в м'язевих та секреторних клітинах. В нервових клітинах їх значення вивчено меньше. Крім того, все ще неясними залишаються деякі аспекти взаємозв'язків між різними внутрішньоклітинними депо кальцію. Тому дослідження функцій та механізмів взаємодії внутрішньоклітинних кальцієвих депо без сумніву викликає науковий інтерес.

Мета дослідження полягала у вивченні механізмів внутрішньоклітинної кальцієвої :игналізації, а також можливих шляхів взаємодії різних внутрішньоклітинних кальцієвих депо в сенсорних нейронах задньокорінцевих спінальних гангліїв мишей.

Гуловні завдання.

1. Дослідити властивості кофеїн-чутливого кальцієвого депо в сенсорних нейронах задньокорінцевих спінальних гангліїв мишей.

2. Дослідити властивості інозитолтрифосфат-чутливого депо в указаних нейронах.

3. Дослідити значення мітохондрій як депо внутрішньоклітинного кальцію в сенсорних нейронах.

4. Вивчити можливі механізми взаємозв'язків між різними кальцієвими депо з указаних нейронах.

Паукова новизна. Досліджені властивості кофеїн-чутливого кальцієвого депо в :енсорних нейронах задньокорінцевих спінальних гангліїв мишей. Вперше їстановлено існування інозитолтрифосфат-чутливого депо в нейронах спінальних 'англіїв та вивчені його властивості. Досліджена функціональна роль мітохондрій ік депо внутрішньоклітинного кальцію в сенсорних нейронах задньокорінцевих ¡пінальних гангліїв. Описані зв'язки між різними кальцієвими депо в сенсорних іейронах.

Теоретичне та практичне значення роботи. Проведені дослідження суттєво юповшоють існуючі дані про механизми кальцієвої сигналізації в клітинах нервової

*

системи. Представлені результати дають можливість одержати цілісне уявлення про системи, що приймають участь в мобілізації внутрішньоклітинного іонізованного кальція, а їх прикладення дозволяє коректувати порушення функціонального стану нервової системи.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались і обговорювались на щорічній конференції Європейського нейрофізіологічного товариства (Амстердам, 1995), на семінарах Інституїу фізіології ім. О.О.Богомольця НАНУ (Київ, 1994, 1995, 1996, 1997). За матеріалами дисертації опубліковано 4 роботи.

Обсяг та структура дисертации. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку літератури з 139 найменувань. Робота викладена на 104 сторінках та ілюстрована 20 рисунками.

Декларація конкретного особистого внеску дисертанта в розробку наукових результатів.

1. Встановлено існування інозитолтрифосфат-чутливого депо в нейронах спінальних гангліїв та вивчено його властивості.

2. Досліджена функціональна роль мітохондрій як депо внутріклітинного кальція в сенсорних нейронах задньокорінцевих спінальних гангліїв.

3. Описані зв'язки між різними кальцієвими депо в сенсорних нейронах.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Об'єкт досліджень. Дослідження проводились на свіжоізольованих сенсорних нейронах спінальних задньокорінцевих гангліїв 2-4 місячних мишей. Для отримання ізольованих клітин застосовували стандартну процедуру ферментативної ізоляції. Тварину декапітували під легким ефірним наркозом, після чого вирізали грудні та крижові задньо-корінцеві ганглії. Ганглії вміщували в охолоджений до 4°С розчин Тіроде на 15 - 20 хвилин (склад розчинів наведено нижче). Після відмивання ганглії переносили в силіконізований пеніииліновий флакон з 2 мл підігрітого до 36°С розчину Тіроде з додаванням 1 мг/мл протеази (тип XTV, Sigma, США) та 2 мг/мл колагенази (Wortington, США) і витримували в термостаті при вказаній температурі на протязі 30 хвилин. Після ферментативної обробки ганглії відмивали розчином Тіроде без ферментів кімнатної температури на протязі 10 - 15 хвилин. Для отримання клітинної суспензії ганглії піпетувались за допомогою оплавлених Пастерівських піпеток на протязі 5 хвилин в 1 мл розчину Тіроде. Отриману суспензію розливали по 0,3 мл в пластикові чашки Петрі діаметром 35 мм (Nunk, Данія) і витримували в термостаті при 36°С на протязі 1 години для прикріплення клітин до дна чашки. Клітини використовували в експерименті на протязі 6-8 годин після виділення. Контрольні експерименти

показали, що ізольовані таким методом нейрони зберігають свої основні електрофізіологічні властивості на протязі близько 24 годин.

Флуоресцентне вимірювання внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію. В

експериментах на недіалізованих клітинах використовували мембранопроникну форму барвника (indo-1/AM). Ацетоксиметильний ефір indo-і практично не розчинний у воді, тому спочатку готували маточний розчин барвника в диметилсульфоксиді. Концентрація indo-1/AM в маточному розчині становила ІмМ. Перед експериментом до 2мл розчину Тіроде додавали 10-14 мкл маточного розчину indo-1/AM та 10 мкл 25% димегилсульфоксидного розчину Pluronic F-127 (Molecular Probes Inc., CIIIA) і перемішували з допомогою мікрошейкера. Кінцева концентрація indo-1/AM в розчині Тіроде становила 5-7 мкМ. Неіонний детергент Pluronic F-127 забезпечував підтримання гідрофобних молекул indo-1/AM у вигляді мікродисперсної емульсії, що прискорювало проникнення барвника в клітину. Розчин, що містив indo-1/AM, заливали в чашки Петрі з прикріпленими до дна клітинами і витримували їх в термостаті при 35°С на протязі ЗО - 40 хвилин. Після цього клітини відмивали чистим розчином Тіроде і залишали в термостаті ще на 50

- 60 хвилин для остаточної деестерифікації indo-1/AM. Чашку Петрі з прикріпленними до дна клітинами встановлювали на предметному столику інвертованого мікроскопа (“Люмам-ИЗ”, Росія). Під час всього експерименту чашку перфузували розчином Тіроде з температурою 35°С. Оптична частина установки забезпечувала збудження флуоресценції зонда при довжині хвилі 360 ± 10 нм і реєстрацію його емісії в двох діапазонах: 395-405 (F400) та 490-510 нм [F500) за допомогою двох фотопомножувачів. Сигнали з фотопомножувачів тодавали на вхід аналогового поділювача (DIV100, Burr Broun, США), який в зеальному масштабі часу обчислював співвідношення флуоресцентних сигналів на івох довжинах хвиль:

R = р40(ур500_

Це співвідношення пропорційне концентрації внутрішньоклітинного кальцію і не ¡алежить від концентрації барвника в клітині, що дозволяє обчислити сонцентрацію кальцію за формулою:

Са2+]іп = Kd • В "(R. - Rmin)/(Rmax - R),

іе Kd - константа дисоціації індикатора з кальцієм; В - коефіцієнт, що шзначається оптичними характеристиками установки і дорівнює співвідношенню ї500о/ F-00s (F500o - інтенсивність флуоресценції indo-і при відсутності кальцію, ~500s - інтенсивність флуоресценції indo-і при насичуючій концентрації іонів сальцію); Rmin - співвідношення F400/F500 при відсутності кальцію; Rmax -

£

співвідношення F400/!^00 при насичуючій концентрації іонів кальцію (Grynkiewicz et al. 1985).

Значення констант, що входять в наведену формулу, визначили шляхом внутрішньоклітинної калібровки, як описано в роботі Вільямса і Фея (Williams & Fay, 1990). Для визначення R,™, Rmax і Kd В використовували калібровочні розчини відповідно з концентрацією кальцію, близькою до нуля (10 мМ EGTA), з насичуючою концентрацією (10 мМ Са2+) та з концентрацією кальцію, що дорівнювала 309 нМ (суміш 6 мМ Ca-EGTA + 3 мМ EGTA). Вказані розчини додавали послідовно в чашку Петрі з пофарбованими indo-1/AM клітинами в присутності кальцієвого іонофора (10 мкМ іономіцину) та вимірювали інтенсивність флуоресценції. В іншій серії експериментів калібровку проводили, діалізуючи клітини “внутрішньоклітинними” розчинами, в яких концентрація кальцію була така ж, як і в описаних вище калібровочних розчинах. В обох випадках були отримані близькі за значеннями калібровочні коефіцієнти. Вони дорівнювали: Rmin = 0,05; Rmax = 2,04; KdB = 1007 нМ.

ЕлектрофЬіологічні вимірювання. Для реєстрації [Са2+]ш синхронно з мембранним потенціалом чи трансмембранними струмами (в умовах внутрішньоклітинного діалізу) барвник в концентрації 100 мкм додавали до піпеткового розчину у вигляді K5Índo-l. В цьому випадку внутрішньопіпетковий розчин не містив ніяких кальцієвих хелаторів, окрім самого indo-і. Збір даних та їх аналіз здійснювали за допомогою пакетів програм Tida, версія 5.8 і WinTida, версія 2.6 (Batelle Europa, Німеччина), Excel, версії 4.0 і 5.0 (Microsoft, США), Origin, версія 3.5 (MicroCal Software, США).

Розчини. Базовим зовнішньоклітинним розчином, який застосовували для ізолювання нервових клітин, перфузії експериментальної камери та приготування всіх інших зовнішньоклітинних розчинів був модифікований розчин Тіроде такого складу (в ммоль/л): NaCl - 140, KCl - 2, MgCl2 - 2, СаСІ2 - 2, HEPES - 10, глюкоза

- 10. Для деполяризації мембрани нейронів використовували гіперкалієвий розчин, який містив (в ммоль/л): NaCl - 92, KCl - 50, MgC12 - 2, СаС12 - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10.. Під час синхронного запису [Ca2+]¡n та мембранного потенціалу мікропипетки заповнювали розчином наступнього складу (в ммоль/л): КС1 - 140, NaCl - 10, MgC12 - 4, HEPES - 10, EGTA - 5, K5indo-l - 100 мкмоль/л. Значення pH всіх зовнішьоклітинних розчинів дорівнювало 7.4, внутрішньоклітинних - 7.3.

На протязі всього досліду експериментальна камера перфузувалася підігрітим до 35° - 36°С розчином Тіроде. Для зміни зовнішньоклітинних розчинів довкола вибраної клітини була застосована система швидкої локальної аплікації. Ця система дозволяла здійснювати повну зміну зовнішньооітинного розчину за час, який не

перевищував 200 мілісекунд. Початок та тривалість аплікації того чи іншого розчину контролювалися комп’ютером.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Участь ендоплазматичного ретикулуму в агоніст-іпдуковапому підвищепні концентрації внутрішньоклітинного кальцію.

Агоніст-індуковапе змінеппя внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Агоніст-індуховане підвищення [Са2+]щ в нейронах може відбуватися під час активації ліганд-керованих кальцій-провідних каналів поверхневої мембрани, а також при активації вивільнення кальцію з внутрішньоклітинних депо, зокрема, з ендоплазматичного ретикулуму. В сенсорних нейронах задньо-корінцевих гангліїв механізми агоніст-керованого вивільнення кальцію практично не вивчені. В даній роботі було досліджено механізм генерації кальцієвого сигналу, викликаного аплікацією АТФ. Раніше було встановлено, що АТФ викликає збудження мембрани нейронів ЗКГ (КгіхМаї Н аі. 1983), проте зміни [Са2+]іп в цих клітинах під впливом даного агоніста не розглядалися. Вивчення дії АТФ на рівень внутрішньоклітинного кальцію виконувалось як на діалізованих нейронах в умовах фіксації мембранного потенціалу, так і на інтактних нейронах без застосування внутрішньоклітинного діалізу. Для розділення АТФ-активованого вивільнення кальцію з внутрішньоклітинних кальцієвих депо від трансмембранних кальцієвих струмів, викликаних можливою активацією іонотропних пуринорецепторів, АТФ додавався в безкальцієвому зовнішньоклітинному розчині, де кальцій замінювався на магній еквімолярно. Результати експериментів показали, що аплікація 100 икмоль/л АТФ викликає підвищення концентрації внутрішньоклітинного кальцію в субпопуляції нейронів великого діаметру (рис.ІБ). Амплітуда АТФ-індукованого [Саг+]іп-транзиєнту зростала після калієвої деполяризації в результаті збільшення вмісту кальцію в ендоплазматичному ретикулумі. В нейронах малого діаметру ніяких змін [Са2+]іо у відповідь на аплікацію АТФ не спостерігалося навіть після калієвої деполяризації (рис.ІА). Тому всі подальші екперименти з АТФ проводили на нейронах великого діаметру. Для визначення джерела кальцію, що бере участь в генерації АТФ-активованого збільшення [Са24-]^, були проведені експерименти з блокатором Са2+-АТФази ендоплазматичного ретикулума тапсигаргіном. Інкубація клітин на протязі 20 хвилин в розчині, що містив 20 нмоль/л тапсигаргіна, приводила до повного блокування відповіді на АТФ. Здатність нейрона генерувати кальцієвий транзієнт у відповідь на деполяризацію поверхневої мембрани зберігалась (рис.2). Наступним етапом експеримента стала серія дослідів з визначення типа кальцієвого канала, що опосередковує АТФ-індуковане

Рис. 1. Вплив АТФ на [Са5*]ш в малих (А) та великих (Б) нейронах. АТФ (100 цМ) прикладували в безкальцієвому розчині до та після калієвої деполяризації (позначено стрілкою).

Рис. 2. Блокування АТФ-индукованого вивільнення кальцію тапсигаргіном. Зліва показано контрольні АТФ-индуковані кальцієві транзіснти до та після калієвої деполяризації (позначено стрілкою), праворуч - через 20 хвилин інкубації в розчині, що, містить 20 нмоль/л тапсигаргша.

ивільнення кальцію, за допомогою специфічного блокатора ІРз-чутливих каналів зпарина. Досліди проводились в умовах внутрішньоклітинного діалізу. Гепарин в онцентрації 50мкг/мл додавали до піпеточного розчина. Серія контрольних кспериментів, в яких 100 мкмоль/л АТФ додавали кожні 5 хвилин нутрішньоклітинного діалізу, показала, що на протязі перших 15 хвилин діалізу мплітуда АТФ-активованих кальцієвих транзієнтів суттєво не змінюється (рис.ЗА). даліз нейронів розчином, що містив 50 мкг/мл гепарину, приводив до глективного блокування АТФ-індукованих [Са2+]іп-транзієнтів. Через 15 хвилин іалізу нейронів розчином з гепарином АТФ-індуковані відповіді зникали зовсім, в эй час, як кофеїн-індуковані кальцієві транзієїгги змінювались мало (Рис. ЗБ). аким чином, можна зробити висновок, що в основі вивільнення кальцію з вдоплазматичного ретикулуму під дією АТФ лежить активація інозитолтрифосфат-утливих кальцієвих каналів.

Кофеїн-чутливі кальцієві депо та кальцій-індуковане вивільнення кальцію. аніше в дослідженнях внутрішньоклітинних кальцієвих депо в сенсорних нейронах адньокорінцевих гангліїв (Біиг^оі еґ аі. 1994) було встановлено, що вдогоіазматичний ретикулум цих клітин може забеспечувати посилення альцієвого сигналу за рахунок кальцій-індукованого вивільнення кальцію (СІСЯ), ередумовами активації якого є значний вхід кальцію в цитоплазму з звнішньо клітинного середовища, а також достатнья кількість кальцію в идоплазматичному ретикулумі (ШаЛеу еі аі. 1993). Також була встановлена задуальність кальцій-індукованого вивільнення кальцію. Це дозволяє припустити, № і кофеїн-індуковане вивільнення кальцію також має бути градуальним, оскільки еханізм дії кофеїну полягає в простому зниженні порогу активації СІСІІ. Для становлення градуальності кофеїн-індукованого вивільнення кальцію було роведено експерименти з аплікацією кофеїна різних концентрацій в езкальцієвому розчині. Аплікація 5 ммоль/л кофеїну викликала кальцієвий ранзиєнт з відносно повільним наростанням, що починав знижуватись в рисутності кофеїну. Повторна аплікація кофеїну в тій же концентрації не икликала помітних змін [Са2+]і„, проте підвищення концентрації кофеїну до 10 :моль/л викликало новий кальцієвий транзиєнт навіть більшої амплітуди та з игцою швидкістю наростання. Одержаний результат можна пояснити тим, що ниження ефективності СІСЯ зумовлюється частковим виснаженням запасів альцію в ендоплазматичному ретикулумі, і якщо це дійсно так, то має бути і воротнє явище, тобто при збільшенні запасів кальцію в ендоплазматичному етикулумі ефективність кальцій-індукованого вивільнення кальцію повинна

40(h

c3

U 94.

700

a

и

117

lOOmkM ATP 20mM Caffeine

Рис.З Блокування АТФ-індукованого вивільнення кальцію гепарином. А - контрольні АТФ-індуковані кальцієві транзиєнти при діалізі нейрона внутрішньоклітинним рочином без гепарину. Б - АТФ- і кофеїн-індуковані кальцієві транзиєнти при діалізі нейрона внутрішньоклітинним розчином, що містив 50 мкг/мл гепарину. В обох випадках інтервал між повторними аплікаціями АТФ складав 5 хвилин.

іростати. Раніше було показано, що зростання [Ca2+]jn в результаті входу кальцію то каналах плазматичної мембрани приводить до збільшення його кількості в ¡ндоплазматичному ретикулумі. В наших експериментах різна ступінь завантаження індоплазматичного ретикулуму кальцієм досягалася за рахунок деполяризації слітин гіперкалієвими розчинами з концентрацією калію 20 і 40 ммоль/л. Аплікація ! ммоль/л кофеїну на мембрану нейрона, що знаходився в стані спокою, приводила іо незначного зростання [Са2+]іп. Повторна аплікація кофеїну після відмивання іперкалієвого розчину активувала кальцієвий транзиєнт збільшеної амплітуди. При ібільшенні величини калієвої деполяризації, тобто при зростанні входу кальцію з ювнішньоклітинного середовища і акумуляції його ендоплазматичним іетикулумом, потенціація кофеїн-індукованих кальцієві« транзиєнтів значно іростала. Підвищення вмісту кальцію в ендоплазматичному ретикулумі :упроводжувалося зміщенням вліво кривої “доза - ефект” для кофеїну, в результаті юго концентрація кофеїну, яка викликала половинний ефект, зменшувалась з 5,8 імоль/л до 1,9 ммоль/л (рис 4). Вказані дані свідчать про те, що кількість іонів :альцію в порожнині ендоплазматичного ретикулуму є важливим фактором, який іизначає ефективність кальцій-індукованого вивільнення кальцію. Також було іроведено ряд експериментів, що дозволили дослідити залежність ефективності юфеїн-індукованого вивільнення кальцію від концентрації його в цитоплазмі, шплітуду кальцієвого транзиєнту, викликаного аплікацією 2 ммоль/л кофеїну [ісля деполяризації гіперкалієвим розчином (30 ммоль/л калія) та повернення рівня Ca2+]jn до базального, порівнювали з амплітудою кальцієвого транзиєнту, икликаного аплікацією такої ж дози кофеїну, але при [Са2+],п, що був підвищений ;о 155 нмоль/л за рахунок деполяризації клітини гіперкалієвим розчином з юнцентрацією калію 20 ммоль/л. В останньому випадку ступінь заповненості ндоплазматичного ретикулуму кальцієм була такою ж, чи навіть меншою, ніж іісля аплікації 30 ммоль/л КС1, проте амплітуда кофеїн-індукованого вивільнення :альцію була суттєво більшою (рис.5). Це свідчить про важливу роль рівня [Са2+]іп активації кальцій-індукованого вивільнення кальцію.

Роль мітохоидрій в гомеостазі впутрішньоклітвіпіого кальцію.

Викликані деполяризацією плазматичної мембрани нейронів задньо-орінцевих гангліїв кальцієві сигнали мають складний характер кінетики спаду, що відчить про наявність декількох механізмів зниження рівня кальцію після еполяризації мембрани. Тільки при незначних підвищеннях цитоплазматичної онцентрації кальцію спад [Са2+]іп може бути апроксимований юноекспоненціальною залежністю. При більшій амплітуді кальцієвого сигналу на

caffeine (mM)

Рис. 4. Залежність амплітуди кофеїн-індукованих кальцієвих транзиєнтів від концентрації кофеїну, отримана в контролі (а) та після деполяризації нейронів гіперкалієвим розчином (б).

ЗО mM КС1 20 mM КС1

Рис. 5. Залежність амплітуди кофеїн-індукованих кальцієвих транзиєнтів від цитоплазматичної концентрації іонів кальцію.

фазі його спаду як в малих нейронах, так і в клітинах великого діаметру часто спостерігалося плато, яке не блокувалося інгібітором Са2+АТФази ендоплазматичного ретикулуму тапсигаргіном, що може свідчити про участь в процесі зниження [Са2+]іп після реполяризації паралельно з виведенням кальцію за межі клітини також вивільнення кальцію в цитоплазму з внутрішньоклітинного запасника. При найкоротшій аплікації гілеркалієвого розчину (0.5с) виникав [Са^ііп-транзиєнт відносно невеликої амплітуди, спад якого був моноекспоненціальним. При тривалішій деполяризаії (до 5с) на фазі спаду виникало плато, причому, абсолютне значення амплітуди плато було постійним при всіх тривалостях деполяризації. Зростання тривалості деполяризації приводило тільки до подовження плато. Амплітуда плато в нейронах великого діаметру дорівнювала 250 - 350 нмоль/л, а в малих клітинах - 400 - 500 нмоль/л. Аплікація на мембрану нейрона 3 ммоль/л лантану, який блокує транспорт кальцію через поверхневу мембрану клітини, в фазу плато приводила до зростання [Ca2+Jin, що є додатковим свідченням внутрішньоклітинного вивільнення кальцію під час плато. Потенційним джерелом внутрішньоклітинного вивільнення кальцію в фазу плато можуть бути мітохондрії, тому для вивчення цього питання були поставлені експерименти з мітохондріальним протонофором карбоніл ціанід /я-хлорофеніл-гідразоном (СССР). В фазу спаду кальцієвого сигналу аплікація СССР в клітинах великого і малого діаметру зумовлювала нове підвищення [Са2+]„, значної амплітуди, що свідчить про накопичення значної кількості кальцію в мітохондріях саме в цей період (рис.б). Аплікація СССР на мембрану нейрона, що знаходиться в стані спокою викликала тільки незначне підвищення рівня [Са24']іп. Отже, накопичення іонів кальцію в мітохондріях відбувається під час генерації кальцієвого сигналу. Кількість кальцію, яка вивільнюється мітохондріями під дією СССР збільшувалася по мірі зростання амплітуди кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією гіперкалієвими розчинами з різними концентраціями іонів кальція. Отже, кількість іонів кальцію, які поглинаються мітохондріями, прямо пропорційно залежить від рівня кальцію в цитоплазмі. Після зниження [Са2+]іп нижче критичного рівня мітохондрії починають звільнювати поглинутий кальцій назад в цитоплазму, тобто мітохондрії відіграють роль внутрішньоклітинного кальцієвого Зуфера великої ємності. Підтвердженням саме такої ролі мітохондрій було проведено експерименти з аплікацією гіперкалієвого розчину в присутності протонофора СССР. В таких умовах мітохондрії не можуть поглинати кальцій з цитоплазми завдяки розсіюванню протонного градієнта. Калієва деполяризація в присутності 10 мкмоль/л СССР викликає кальцієвий транзиєнт більшої амплітуди,

10 шкМ СССР

Рис. 6. Вивільнення кальцію, зумовлене аплікацією мітохондріального протонофора СССР в фазу спаду викликаних калієвою деполяризацією (позначено стрілками) кальцієвих транзиєнтів в нейронах великого (А) і малого (Б) діаметру. Аплікація 10 мкмоль/л СССР позначена чорними прямокутниками.

Рис. 7. Зміни амплітуди і кінетики спаду кальцієвого транзиєнту, викликаного аплікацією 50 ммоль/л К.С1 при дії СССР (10 мкмоль/л, позначено чорним прямокутником) в нейронах великого (А) і малого (Б) діаметру.

гз плато на фазі спаду, а також уповільнення початкової швидкості спаду [Са2+]і„, орівняно з контрольним транзиєнтом (рис.7), що свідчить про участь в ормальних умовах мітохондрій в процесі поглинання іонів кальцію під час їх входу з цитоплазми по кальцієвих каналах плазмалеми при умові, що цитоплазматична знцентрація кальцію перевищує порогову величину. Таким чином, згідно іриманих результатів можна зробити висновок про участь мітохондрій в регуляції вня внутрішньоклітинного кальцію, роль яких полягає в обмеженні пікової шлітуди викликаних деполяризацією кальцієвих сигналів за рахунок поглинання ільція що входить в клітину.

Взаємодія між кальцієвими депо.

Відомо, що в різних клітинах інозитолтрифосфат та кальцій можуть івілняти іони Са2+ або з двух окремих кальцієвих депо, або з одного уикціонального відділу ендоплазматичного ретикулума, що має два механізми івільнення кальцію. Експерименти з блокатором ендоплазматичного ретикулума анодином, механізм дії якого полягає у виснаженні запасів кальцію в щоплазматичному ретикулумі за рахунок переходу ріанодинових рецепторів в істійно відкритий напівпровідний стан, показали, що інкубація клітин продовж 15 илин в 50 мкмоль/л ріанодину приводить до блокування як кальцієвих анзиєнтів, викликаних аплікацією АТФ, так і кофеїн-індукованих кальцієвих анзиєнтів (рис.8). В основі вивільнення кальцію з ендоплазматичного ретикулума І дією АТФ лежить активація інозитолтрифосфат-чутливих кальцієвих каналів, му одержані результати надають підстави припустити, що запасник утрішньоклітинного кальцію для інозитолтрифосфат- та кальцій-індукованого вільнення кальцію спільний. Якщо це так, і АТФ та кофеїн викликають вільнення кальцію через різні типи кальцієвих каналів, але із спільного депо, то статньо тривала аплікація АТФ в безкальцієвому розчині повинна зменшувати плітуду кофеїн-індукованих [Са2+]ш-транзиєнтів і навпаки. Дійсно, після тривалої лікації 100 мкмоль/л АТФ спостерігалося майже повне пригнічення кофеїн-іукованих [Са2+]¡„-транзиєнтів, які відновлювалися після перезаповнення депо їіікацісю гіперкалієвого розчшгу. Після виснажливої аплікації кофеїну повністю икало АТФ-індуковане вивільнення кальцію, після чого повторна калієва юляризація перезаповнювала депо і відповідь на АТФ відновлювалась (рис.9). ким чином, дані експерименти свідчать про перехресне виснаження запасів іьцію в ендоплазматичному ретикулумі шляхом поперемінної активації нодинових і ІР3-рецепгорів, що і являється доказом спільності депо для цих двох яхів вивільнення кальцію.

50 цМ Ііуапосііпе

Рис. 8. Блокування АТФ-індукованого вивільнення кальцію ріанодином. А - контрольні АТФ-індуковані кальцієві транзиєнти до і після калієвої деполяризації, Б - через 15 хвилин інкубації нейрона в розчині, що містив 50 мкмоль/л ріанодину.

Рис. 9. Взаємодія АТФ-чутливого і кофеїн чутливого кальцієвих депо. Тривала аплікація АТФ пригнічує кофеїн-індукований кальцієвий транзиєнт (А). Тривала аплікація кофеїну пригнічує АТФ-індукований кальцієвий транзиєнт (Б). Перезаповнення депо шляхом калієвої деполяризації відновлює здатність як АТФ, так і кофеїну до вивільнення кальцію. Стрілками показано аплікацію 50тМ КС1.

Під час аплікації 20 ммоль/л кофеїну виникає кальцієвий транзієнт, імплітуда якого дорівнює амплітуді кальцієвого транзієнта, викликаного іеполяризацією мембрани гіперкалієвим розчином. Рівень [Са2+]ц, при цьому (осягає значення, при якому в мобілізацію кальцію включаються мітохондрії. Але іа відміну від кальцієвого транзієнта, викликаного деполяризацією, плато на спаді :альцієвого сигнала, активованого аплікацією 20 ммоль/л кофеїну, не ¡постерігалось і аплікація 10 мкмоль/л СССР не викликала підвищення [Са2+]ц, рис.ЮА). Аплікація разом з кофеїном 3 ммоль/л лантана, що блокує транспорт :альцію через поверхневу мембрану клітини, уповільнювала спад кальцієвої іідповіді, але, як і наступна аплікація СССР, не приводила до підвищення [Са2+]щ рис.ЮБ). Отримані дані свідчать про те, що мітохондрії не поглинають кальцій, кий вивільнюється з ендоплазматичного ретикулума під дією кофеїну, можливо, наслідок їх просторового відокремлення.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ.

В даній роботі було проведено дослідження основних механізмів

нутрішньоклілінної кальцієвої сигналізації, а також механізмів взаємодії

нутрішньоклітинних кальцієвих депо в первинних сенсорних нейронах

адньокорінцевих гангліїв мишей. Для вимірювання концентрації іонізованого альцію використовувався метод завантаження нейронів мембранопроникною юрмою флуоресцентного барвника indol/AM.

Виходячи з різної швидкості розповсюдження потенціалів дії по аксону, що орелює з розмірами соми, сенсорні нейрони з адньокорінцевих гангліїв іентифікують як ноцицептивні С-нейрони з малим діаметром соми та

еноцицептивні А-нейрони великого діаметра (Waddell & Lawson, 1990). В ході кспериментів було з'ясовано, що функціонально активний ендоплазматичний етикулум, який виконує функції внутрішньоклітинного кальцієвого депо, існує ише в нейронах великого діаметра і відсутній в нейронах малого діаметра, тому редставлені результати про властивості кальцієвих депо ендоплазматичного етикулума відносяться до нейронів з великим діаметром соми.

В представленій роботі вперше описано вивільнення кальцію з вдоплазматичного ретикулума в сенсорних нейронах під дією зовнішньоклітинної илікації АТФ. Про збуджуючу дію АТФ на сенсорні нейрони відомо ще з опередніх досліджень (Salt & Hill, 1983; Krishtal et al. 1983), в яких [Ca2+]in зільшувалась за рахунок активації потенціалзалежних кальцієвих каналів. Наші з слідження показали, що основна частина АТФ-активованого кальцієвого занзієнта в нейронах задньокорінцевих гангліїв представляє собою кальцій, що звільняється з інозитолтрифосфат-чутливого кальцієвого депо. Викликаний АТФ

Рис. 10. А - аплікація СССР (5 цМ) не викликає підвищення [Са2+]ш після аплікації 20 ммоль/л кофеїну. Для порівняння приведено кальцієвий транзієнт, викликаний деполяризацією, амплітуда якого досягає значень амплітуди транзієнта, викликаного кофеїном. Б - після аплікації 20 ммоль/л кофеїну з 3 ммоль/л лантану 5 шМ СССР не викликає підвищення [Са2*]ш (кофеїн аплікувався після гіперкалієвої деполяризації).

Рис.11. Схема регуляції [Са2+]іп у великих нейронах задньокорінцевих гангліїв. ER -эндоплазматичний ретикулум; Mit - мітохондрія; RyR2 - ріанодиновий рецептор 2 типу; ІРЗ - інозитолтрифосфат; IP3R - інозитолтрифосфат-чутливий рецептор; P2yR - пуринорецептор; PL-С - фосфолипаза С.

кальцієвий транзієнт не зникав в безкальцієвому розчині, був чутливий до блокатора Са2+-АТФази ендоплазматичного ретикулума тапсигаргіна, а тоакож блокувався під дією селективного блокатора інозитолтрифосфат-чутливих рецепторів гепарина.

В ході експериментів було встановлено, що кофеїн-індуковане вивільнення кальцію має градуальну природу. Порівняння кальцієвих транзієнтів, викликаних кофеїном різних концентрації дозволило припустити, що вивільнення кальцію при цьому відбувається завдяки активації кальцій-чутливих кальцієвих каналів з різною ймовірністю відкритого стану. З літератури відомо, що швидкий зріст [Са2+]т приводить до відкриття кальцій-чутливих кальцієвих каналів з високою "імовірністю відкритого стану, тгоді як повільний приріст [Са2+]іп викликає активацію каналів з низькою ймовірністю відкривання (Агшізеп еї аі. 1996). Також 5уло визначено, що чутливість СІСЯ-каналов до кофеїну контролюється нгралюмінальною кількістю кальцію. Підвищення внутрішньоклітинної сонцентрації кальцію знижує в гри рази концентрацію кофеїну, яка викликає толовинний ефект. Це показує, що кількість інтралюмінального кальцію може зпливати на здатність кальцієвих каналів, що звільнюють кальцій, активуватися.

Мітохондрії представляють собою ще один внутрішньоклітинний запасник сальцію, що модулює кальцієві сигнали аккумулюванням іонів з цитоплазми у зипадку їх високої концентрації шляхом електрофоретичного переносу через кіітохондріальну мембрану завдяки існуванню значного трансмембранного югенціалу, та вивільненням іонів назад при зниженні концентрації іитоплазматичного кальцію (N10110115, 1986, ШггиЮ є/ аі. 1992). В наших ікспериментах включення мітохондрій в нейрональний кальцієвий гомеостаз іналізувалося за допомогою аплікації мітохондріального протонофора СССР. Іорівняння характеристик кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією в :онтролі та під дією СССР показало, що активність мітохондрій може справляти юдвійний ефект на кальцієвий сигнал: з однієї сторони прискоряти швидку стадію ;пада піка до фіксованого рівня (кілька сотен нмоль/л), і з другої сторони іеретворювати спад в тривале плато, що іноді триває сотні секунд). Ці зміни іредставляють собою, можливо, спочатку захоплення, а потім послідовне повільне звільнення іонів кальцію мітохондріями. Було встановлено, що мітохондрії беруть часть в модуляції викликаних деполяризацією кальцієвих сигналів при підвищенні Са2+]іп більше 400-600 нмоль/л. Здатність мітохондрій захоплювати кальцій була становлена в нейронах як малого, так и великого діаметру. В нейронах малого іаметру плато на фазі спаду кальцієвих транзієнтів встанавлювалось на більш исокому рівні на відміну від нейронів великого діаметру. Виходячи з того, що

плато є результатом динамічної рівноваги між вивільненням кальцію з мітохондрій та виведенням його назовні, можна припустити, що більш низький рівень плато в великих нейронах зв'язан з ефективнішим видаленням кальцію з цитоплазми, тому що в цих нейронах [Ca2+]jn знижується за рахунок роботи не тільки Са2+-АТФази поверхневої мембрани, але й Са2+-АТФази мембрани ендоплазматичного ретикулуму.

В різних типах нейронів інозитолтрифосфат та кальцій можуть вивільняти іони кальцію або з двох окремих кальцієвих депо (в культивованих нейронах гіпокампаСПіауег & Miller, 1990)), або з одного функціонального відділу ендоплазматичного ретикулуму, що має два механізми вивільнення Са2+ (в клітинах PC 12 (Reynolds & Carlen, 1989) та культивованих гранулярних нейронах мозочка (Irving et al. 1992)). В сенсорних нейронах задньокорінцевих гангліїв мишей нами було знайдено, що запасник внутрішньоклітинного кальцію для інозитолтрифосфат- та кальцій-індукованого вивільнення кальцію є спільним. В ході експериментів було встановлено, що мітохондрії не беруть участь в поглинанні кальцію, що вивільняється при CICR, що, ймовірно, можно пояснити їх можливим просторовим відокремленням. Враховуючи отримані результати можна привести наступну схему участі внутрішньоклітинних кальцієвих депо в мобілізації внутрішньоклітинного кальцію в нейронах задньо-корінцевих гангліїв (рис. 11). Більша частина іонів кальцію, що надійшли до клітини зв’язується з швидкими цитоплазматичними буферами, решта Са2+ залишається у вільному стані. При незначному підвищенні [Са2+]іп внаслідок низької частоти імпульсації активованої клітини для видалення кальцію достатніми є механізми його виведення Са2+ -АТФазами плазматичної мембрани, а також поглинання іонів кальцію Са2+ -АТФазами ендоплазматичного ретикулуму во внутрішньоклітинні кальцієві депо ендоплазматичного ретикулуму. При підвищенні [Ca2+]jn до критичних рівней в мобілізації іонів кальцію додатково відбуваються процеси поглинання кальцію мітохондріями, активація кальцій-індукованого вивільнення кальцію, а також кальцій вивільняється при активації ІР3-чутливих каналів ендоплазматичного ретикулума. Посилення кальцієвих транзієнтів внаслідок CICR відбувається при таких значеннях [Са2+]іп, коли починається протилежний процес поглинання іонів кальцію мітохондріями. Співіснування обох процесів можливо лише в умовах їх просторового відокремлення, при цьому кальцій-індуковане вивільнення кальцію забеспечує локальне підсилення кальцієвих транзієнтів в місцях щільнішого контакту ендоплазматичного ретикулуму з поверхневою мембраною, тоді як середній рівень кальцію в цитоплазмі підтримується на меньшому рівні завдяки

мітохондріям. Представлена схема пояснює механізми внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації в нейронах великого діаметру. На відміну від останніх у нейронів малого діаметру провідну роль в терминації кальцієвих сигналів та поверненні [Са2+]і до рівня спокою грають інші механізми, а саме виведення іонів Са2+ у зовнішньоклітинне середовище за рахунок активності плазмалеммної Са-АТФази та захоплення їх мітохондріями у випадку генерації транзієнтів великої амплітуди, тому що С-нейрони не мають функціонально активного ендоплазматичного ретикулуму, що виконує функції внутрішньоклітинного кальцієвого депо. Подібно нейронам великого діаметру мітохондрії в малих нейронах починають поглинати кальцій при досягненні концентрації його іонів 500 нмоль/л і повільно вивільнюють його при зниженні [Са2+]іп нижче 500 нмоль/л, утворюючи плато кальцієвого транзієнта. Після вивільнення з мітохондрій всього кальція його цитоплазматична концентрація повертається до висхідного рівня і від попередньої активності клітини не залишається ніяких слідів. У великих нейронах внаслідок поглинання частини іонів кальцію ендоплазматичним ретикулумом і /тримання їх деякий час (до 10-15 хвилин) слід від попередньої активності клітини ¡берігається довше, ніж в малих нейронах. Відсутність у первинних сенсорних іейронів малого діаметра швидкого захоплення та вивільнення іонів Са2+ ендоплазматичним ретикулумом ставить кальцієву сигналізацію в них у особливу ¡алежність від механізмів підтримання кальцієвого гомеостазу, що локалізовані в їлазмалемі (плазмалемальної Са-АТФази та Ка+/Са2+ обмінника), тоді як у іейронах А-типа ендоплазматичний ретикулум забеспечує лабільність механізмів іегуляції кальцієвого гомеостазу. Таким чином, проведені дослідження (озволили встановити деякі особливості механізмів мобілізації інуїрішньоклітинного кальцію та взаимодії між внутрішньоклітинними .альцієвими депо в різних типах сенсорних нейронів.

ВИСНОВКИ.

1. Функціонально активний ендоплазматичний ретикулум, який виконує іункції внутрішньоклітинного кальцієвого депо, існує лише в неноцицептивних енсорних нейронах великого діаметра і відсутній в ноцицептивних нейронах іалого діаметра задньокорінцевих гангліїв мишей.

2. Вперше показано існування інозитолтрифосфат-чутливих кальцієвих аналів ендоплазматичного ретикулуму в сенсорних нейронах великого діаметру адньокорінцевих гангліїв, що активується під час зовнішньоклітинної аплікації ТФ.

3. Активація кофеїн-индукованого вивільнення кальцію з ендоплазматичного ретикулуму залежить від кількості кальцію, що міститься в ендоплазматичному ретикулумі, а також від цитоплазматичної концентрації кальцію.

4. При підвищенні внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію вище 500 нмоль/л в модуляції кальцієвих сигналів в сенсорних нейронах задньокорінцевих гангліїв як малого, так і великого діаметру, приймають участь мітохондрії, роль яких полягає в обмеженні амплітуди кальцієвих сигналів та подовження їх спаду.

5. Вивільнення кальцію під час активації як інозитолтрифосфат-чутливих рецепторів, так і кальцій-чутливих рецепторів відбувається з спільного резервуара ендоплазматичного ретикулуму.

6. Взаємодія між внутрішньоклітинними кальцієвими депо ендоплазматичного ретикулуму та мітохондріями не виявлено внаслідок їх просторової відокремленності.

7. Механізми мобілізації внутрішньоклітинного кальцію мають деякі відмінності в різних типах сенсорних нейронів задньокорінцевих гангліїв мишей.

Перелік робіт, опублікованих за матеріалами дисертації.

1. A.Shmigol, N.Svichar, P.G.Kostyuk, A.Verkhratsky. (1996) Gradual caffeine-induced Ca2+ release in mouse dorsal root ganglion neurons is controlled by cytoplasmic and luminal Ca2+. Neuroscience 73, 1061-1067.

2. N.Svichar, A.Shmygol, AVerkhratsky & P.Kostyuk. (1997) ATP induces Ca2+ release from InsP3-sensitive Ca2+ stores exclusively in large DRG neurones. Neuroreport 8, 1555 - 1559.'

3. N.Svichar, A.Shmygol, A.Verkhratsky & P.Kostyuk. (1997) InsP3-induced Ca2+ release in mouse sensory neurones. Neuroscience 227, p. 1 - 4.

4. A.Shmigol, N.Svichar, P.Kostyuk & A.Verkharatsky. (1995): “Incremental” caffeine-induced calcium release in mouse sensory neurones. European Journal of Neuroscience, Supple № 8. pill. Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting

Svichar N.V. The mechanisms of intracellular mobilization of calcium in mice sensory neurones. The dissertation (manuscript) is presented in accordance with requirements for the degree of candidate of biological sciences in speciality 03.00.ІЗ.-Physiology of human and animals, The International Center of molecular physiology. National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1997.

The mechanisms of intracellular mobilization of calcium has been studied in two subpopulations of acutely isolated mice dorsal root ganglion (DRG) sensory neurons. The cytoplasmic calcium concentration ([Ca2+]in) was recorded using indo-1 microfluorometry technique. Ca-induced Ca2+ release (CICR) and IP3- induced Ca2+ release (IICR) were found to be functional only in certain types of sensory neuronal cells, presumably in neurones transmitting tactile and proprioceptive information. We have investigated the ATP-induced Ca2+ transients in mouse DRG neurones and conclude that ATP-inducedC transients in DRG neurones are due mostly to calcium release from IP3 sensitive intracellular store. The mitochondria can accumulate Ca ions when their cytoplasmic concentration exceeds a threshold level and, subsequently, release them back when [Ca2+]jn falls below the threshold. Mitochondrial Ca2+ accumulation and release has been found to participate in the shaping of calcium signals in both subpopulations of DRG neurones. We investigated that both ІРз-induced and Ca2+-induced Ca2+ release pathways in sensory neurones may share the common intracellular Ca2+ pool. Mitochondria do not take part in the calcium ions uptake during caffeine-induced increasing of intracellular calcium concentration.

Свичар H.B. Механизмы внутриклеточной мобилизации кальция в сенсорных нейронах мышей. Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13.-Физиология человека и животных, Международный Центр молекулярной физиологии НАН Украины, Киев, 1997.

Эксперименты проводились на свежеизолированных сенсорных нейронах заднекорешковых ганглиев мышей. Для измерения внутриклеточной концентрации кальция использовался метод загрузки клетки мембранопроницаемой формой красителя indo-1/AM. Было выяснено, что функционально активный эндоплазматический ретикулум, выполняющий функции внутриклеточного кальциевого депо, существует только в больших неноцицептивных сенсорных нейронах заднекорешковых ганглиев и отсутствует в сенсорных нейронах малого іиаметра. Впервые было показано существование инозитолтрифосфат-гувствительных кальциевых каналов эндоплазматического ретикулума в сенсорных гейронах большого диаметра заднекорешковых ганглиев, активирующихся при шеклеточной аппликации АТФ. Установлено, что активация кофеин-шдуиированного освобождения кальция из эндоплазматического ретикулума іависит от количества кальция, содержащегося в эндоплазматическом ретикулуме, і также от цитоплазматической концентрации кальция. При повышении шутриклеточной концентрации ионов кальция выше 500 нмоль/л в модуляции :альциевых сигналов в сенсорных нейронах заднекорешковых ганглиев как малого, ак и большого диаметра, принимают участие митохондрии, роль которых состоит і ограничении амплитуды кальциевых сигналов и увеличении длительности их :пада. Освобождение кальция при активации как инозитолтрифосфат-гувствительных рецепторов, так и кальций-чувствитсльных рецепторов происходит із общего резервуара эндоплазматического ретикулума. Взаимодействие между нутрикл сточными кальциевыми депо эндоплазматического ретикулума и штохондриями не обнаружено вследствие их пространственной разобщенности.

иночові слова: кальціометрія, сенсорні нейрони, задньокорінцеві ганглії, кальцієві епо, кальцій-індуковане вивільнення кальцію, інозитолтрифосфат-індуковане ивільнення кальцію, мітохондрії.