Механизмы влияния Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию меланомы

Юрлова, Екатерина Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы влияния Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию меланомы
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизмы влияния Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию меланомы"

005001189

Юрлова Екатерина Ивановна

МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ Т-КАДГЕРИНА НА РОСТ, МЕТАСТАЗИРОВАНИЕ И ВАСКУЛЯРИЗАЦИЮ МЕЛАНОМЫ

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 7 НОЯ 2011

Москва 2011

005001189

Работа выполнена на кафедре биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Трещалина Елена Михайловна кандидат биологических наук, доцент Рубина Ксения Андреевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Киселевский Михаил Валентинович доктор биологических наук, профессор Калинина Елена Валентиновна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 9 декабря 2011 года в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 212.203.13. при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, Медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан « » 2011 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета, д /

доктор биологических наук, профессор , /гл-Е.В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Т-кадгерин - уникальный представитель суперсемейства кадгеринов. Было обнаружено, что экспрессия Т-кадгерина может исчезать при злокачественной трансформации некоторых клеток. Так, снижение или полное отсутствие экспрессии Т-кадгерина было обнаружено в 80% клеточных линий меланомы человека, в то время как Т-кадгерин экспрессируется в нормальных меланоцитах человека [Kuphal S. et al., 2009, Bosserhoff A.K. et al, 2011].

Т-кадгерин не имеет трансмембранного и цитоплазматического доменов и не участвует в обеспечении прочной межклеточной адгезии в отличие от «классических» кадгеринов, а удерживается на плазматической мембране при помощи гликозилфосфатидилинозитольного (ГФИ) якоря [Ranscht В., Dours-Zimmermann М.Т., 1991]. Это свойство, а также локализация в липидных плотах [Doyle D.D. et al., 1998, Philippova M.P. et al., 1998], в местах сосредоточения многих сигнальных молекул (Src киназ, G белков) [Philippova M.P. et al., 1998], свидетельствует об участии Т-кадгерина во внутриклеточной сигнализации. Данное предположение также подтверждают данные об участии других ГФИ-заякоренных белков в активации внутриклеточной сигнализации, а именно, в мобилизации кальция и фосфорилировании тирозина, и регуляции таких процессов как пролиферация клеток и продукция лимфокинов [Fisher G.F. et al., 1990, Bohuslav J. et al., 1995, Airas L. et al, 1997].

Т-кадгерин является рецептором с навигационной функцией, регулирующей направление прорастающих нервов и сосудов к своим мишеням [Fredette B.J, Ranscht В, 1994, Ranscht В, Bronner-Fraser М, 1991, Rubina К. et al, 2007]. Было отмечено, что уровень экспрессии Т-кадгерина повышается при ряде заболеваний, связанных с патологическим ростом сосудов [Kudrjashova Е. et al, 2002]. Исходя из этих данных, было сделано предположение, что Т-кадгерин может принимать участие в регуляции неоангиогенеза при опухолевом росте. Известно, что опухолевый неоангиогенез является важным фактором опухолевой прогрессии, который обеспечивает интернализацию метастазов и инвазивный путь распространения клеток. Подавление роста сосудов является одним из подходов при лечении онкологических заболеваний [Folkman J, 1971]. Роль Т-кадгерина в регуляции неоангиогенеза на этапе прогрессии опухолевого процесса в настоящее время практически не изучена. Кроме того, данные о роли Т-кадгерина в опухолевом росте и метастазировании противоречивы. Так, на клетках карциномы, глиомы и нейробластомы обнаружено снижение пролиферативной и инвазивной способности опухолевых клеток, трансфицированных кДНК Т-кадгерина [Huang Z.Y. et al, 2003, Lee S.W, 1996, Takeuchi T. et al, 2000]. В то же время повышенный уровень экспрессии Т-кадгерина наблюдается в клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы MAHLAVU [Riou Р. et al, 2002, Riou P. ct al, 2006], a также астроцитарных опухолях, гетерозиготных по гену нейрофиброматоз 1 или с инактивированным геном нейрофиброматоз 1 [Gutmann D.H. et al., 2001]. Экспрессия Т-кадгерина была обнаружена в эндотелиальных клетках сосудов, прорастающих в ткань различных ксенографтов опухолей человека: рака простаты человека РС-3, тератокарциномы F9 и рабдомиосаркомы А673 [Wyder L. et al, 2000]. На трансгенных мышах было показано, что инактивация Т-кадгерина приводит к подавлению роста и васкуляризации рака молочной железы [Hebbard L.W. et al, 2008].

механизма этого эффекта in vivo и in vitro показало, что Т-кадгерин, не влияя на пролиферацию, адгезию и апоптоз эндотелиальных клеток, подавляет их миграцию. Таким образом, сделан вывод о том, что Т-кадгерин является ингибитором ангиогенеза в системах in vivo и in vitro [Rubina К. et al., 2007].

Указанные феномены возможной взаимосвязи биохимических процессов, обеспечивающих продукцию Т-кадгерина, и патологических процессов, запускающих неоваскуляризацию и прогрессию опухолевого роста, особенно важны для поиска путей ингибирования метастазирующих и наиболее трудно излечимых опухолей, таких как диссеминированная меланома.

Таким образом, выявление роли Т-кадгерина в запуске механизмов прогрессии опухолей, в частности, меланомы, сопряжённых с регуляцией неоангио- и васкулогенеза, является актуальным и позволит не только дополнить данные о значении опухолевого микроокружения, но и определить критические точки для подавления кровоснабжения на этапе опухолевой профессии. Исследование указанных механизмов является актуальной задачей также в плане поиска новых мишеней для "таргетного" противоопухолевого лечения.

Цель работы: выявить механизмы влияния Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию на примере метастазирующей мышиной меланомы in vitro/in vivo. Задачи исследования:

1. Изучить влияние экспрессии Т-кадгерина на пролиферацию клеток мышиной меланомы in vitro и рост первичного узла in vivo;

2. Определить влияние Т-кадгерина на экспрессию факторов неоангиогенеза в клетках меланомы in vitro и на васкуляризацию первичного узла in vivo;

3. Оценить влияние экспрессии Т-кадгерина в клетках меланомы на пролиферацию и миграцию стромальных клеток в опухоль in vivo и при сокультивировании in vitro;

4. Сравнить клетки мышиной меланомы с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина по их способности к метастазированию и инвазии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной метастазирующей меланомы B16F10 сопряжена с ускорением пролиферации in vitro и роста первичного узла in vivo под кожей у гибридных мышей BDF1. В клетках мышиной меланомы, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, значимо (в 6 раз) возрастает экспрессия c-Met, рецептора фактора роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor, HGF).

2. Клетки меланомы B16F10, экспрессирующие Т-кадгерин, формируют in vivo под кожей у гибридных мышей BDF1 опухолевые узлы, отличающиеся подавленной неоваскуляризацией. Экспрессия Т-кадгерина в клетках меланомы B16F10 in vitro сопряжена с усиленной экспрессией ингибиторов и сниженной экспрессией стимуляторов неоангиогенеза.

3. При экспрессии Т-кадгерина клетки меланомы B16F10 индуцируют усиление миграции стромальных клеток in vitro, a in vivo активируют привлечение их в первичный узел за счёт увеличения экспрессии хемокинов, выполняющих роль хемоаттрактантов для мезенхимальных стромальных клеток.

4. Инвазивный потенциал in vitro и метастатический потенциал in vivo экспрессирующих Т-кадгерин клеток меланомы B16F10 возрастает за счёт усиления экспрессии ММР14 и ряда проонкогенных интегринов.

Научная новизна.

Впервые показано подавление неоангиогенеза in vivo в ткани экспрессирующей Т-кадгерин мышиной метастазирующей меланомы B16F10, сопряжённое с увеличением экспрессии специфических ингибиторов (CXCL 10, angiopoietin 2, procollagen type XVIII alpha 1, chromogramn А) и снижением экспрессии стимуляторов (TGFa и Tie-1) ангиогенеза.

Впервые установлено, что подавление неоваскудяризации меланомы B16F10, перевитой подкожно мышам-гибридам BDF1, проявляется в уменьшении количества прорастающих в первичный опухолевый узел сосудов среднего диаметра и капилляров.

Впервые обнаружен феномен привлечения мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в первичный узел меланомы B16F10, клетки которого экспрессируют Т-кадгерин, и впервые в качестве гипотезы механизма этого феномена предложено увеличение продукции хемокинов под действием Т-кадгерина.

Впервые в рамках последовательного изучения функциональных особенностей клеток in vitro и in vivo получены данные о достоверном усилении агрессивности экспрессирующих Т-кадгерин клеток мышиной метастазирующей меланомы B16F10.

Впервые in vitro и in vivo на примере высоко метастазирующего клона F10 мышиной меланомы В16 составлено интегральное представление о роли белка Т-кадгерина в регуляции пролиферации, инвазии и метастазирования злокачественной опухоли, т.е. в её прогрессии.

Научно-практическая значимость. В результате исследования механизма влияния Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию меланомы выявлены важные факторы, принимающие участие в регуляции злокачественного процесса. Эти факторы дополняют существующую систему знаний в области биохимии регуляторных белков, а также экспериментальной биологии меланомы - одной из наиболее сложных по биологическим характеристикам опухоли. Доказательство стимуляции различных проявлений прогрессии экспрессирующей Т-кадгерин метастазирующей меланомы, сопряжённое с выключением неоваскуляризации, позволяет рассматривать этот рецептор как возможную практическую мишень для противоопухолевой терапии. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на:

1) 3-х международных конференциях (35-ом Международном конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS) (Гётеборг, Швеция, 26 июня - 1 июля 2010); ежегодной конференции Международного Общества генной и клеточной терапии рака (ISCGT) (Корк, Ирландия, 2-4 сентября 2009); 3-ей Международной конференции по ангиогенезу (Амстердам, Нидерланды, 1-3 марта 2007));

2) Совместном заседании кафедры биохимии и молекулярной медицины, научно-исследовательской лаборатории генных и клеточных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей и лаборатории комбинированной терапии опухолей НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ имени H.H. Блохина РАМН 29.09.2011 г.;

3) Научной конференции лаборатории комбинированной терапии опухолей НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ имени H.H. Блохина РАМН 19.10.2011 г.;

4) Заседании кафедры биохимии медицинского факультета РУДН 21.10.2011 г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале, 1 глава в сборнике статей и 10 тезисов докладов.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков, 5 таблиц. Состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение результатов, Список литературы. Список литературы содержит 287 источников, из них 3 отечественных, 284 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Клеточные культуры. В работе использовали клеточную линию мышиной метастазирующей в лёгкие меланомы В16, клон FIO (АТСС® №CRL-6475™), эмбриональные фибробласты мыши NIH/3T3 (АТСС® №CRL-1658™) и мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани мыши (МСК-ЖТ). Культивирование клеточных линий B16F10 hNIH/ЗТЗ in vitro проводили в полной среде RPMI1640 (HyClone, США), а МСК-ЖТ после выделения культивировали в полной среде DMEM (HyClone, США) в соответствии со стандартными условиями. Получение клонов и суммарной популяции клеток меланомы B16F10 с экспрессией Т-кадгерина. Клетки B16F10 стабильно трансфицировали полноразмерной кДНК Т-кадгерина человека, клонированной в плазмиду для эукариотической экспрессии pcDNA™3.1 (Invitrogen, США) с устойчивостью к G418 (Geneticin®) [Rubina К. et al., 2005] с использованием трансфицирующего реагента Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Путём отбора в среде, содержащей селективный антибиотик G418 (Invitrogen, США) в концентрации 2 мг/мл, получали суммарную популяцию клеток мышиной меланомы B16F10, экспрессирующих Т-кадгерин. Клоны с разной экспрессией Т-кадгерина получали путём клонирования суммарной популяции на селективном антибиотике. Для контрольных экспериментов клетки меланомы B16F10 трансфицировали контрольной плазмидой pcDNA™3.1/CAT (Invitrogen, США) с устойчивостью к G418 и путём отбора в среде, содержащей селективный антибиотик G418 в концентрации 2 мг/мл, получали суммарную популяцию контрольных клеток. Контрольный клон клеток получали путём клонирования контрольной суммарной популяции на селективном антибиотике. Уровень экспрессии Т-кадгерина в суммарных популяциях и клонах клеток мышиной меланомы B16F10 подтверждали методом иммуноблоттинга.

Получение клеток МСК-ЖТ из мышей. МСК-ЖТ мыши были выделены из подкожного жира области бёдер самцов линии CBA/C57BL. После измельчения жировую ткань обрабатывали коллагеназой I типа (200 ед/мл, Worthington, США) и протеазой (30 ед/мл, Worthington, США) в среде DMEM в течение часа при температуре 37° С. Затем к суспензии добавляли равный объём полной среды DMEM и центрифугировали (10 минут, 200g). Осадок, в котором находилась фракция стромалыю-васкулярных клеток, ресуспендировали в полной среде DMEM, фильтровали через фильтр с диаметром пор 40 мкм и центрифугировали (5 минут, 200g). Для лизиса эритроцитов к осадку добавляли 9 мл стерильной дистиллированной воды и инкубировали 2 минуты. Затем добавляли 1 мл стерильного 10-кратного PBS (Sigma-Aldrich, США) и центрифугировали (5 минут, 200g). Полученный осадок ресуспендировали в полной среде роста DMEM и высаживали в концентрации 104/мл. Для экспериментов использовали клетки второго пассажа.

Иммуноблоттинг. Экспрессию Т-кадгерина методом иммуноблотинга определяли в клеточных лизатах (суммарные популяции B16F10, клоны B16F10, NIH/3T3, МСК-ЖТ) и в среде культивирования клонов B16F10. Для получения лизатов к клеткам (ЗТЗ,

МСК-ЖТ, B16F10) добавляли холодный лизис - буфер: 50 мМ Tris- HCl (Sigma-Aldrich, США), pH 8, 5мМ EDTA (ApplíChem, Германия), 1% Triton Х-100 (PRS Panreac, Испания), 150 мМ NaCl (PRS Panreac, Испания), Protease Inhibitor Cocktail (1:100) (Sigma-Aldrich, США). Клетки лизировали 15 минут при +4°С. Далее полученный лизат центрифугировали (30 минут, 13,200 об/мин) при +4 °С. Концентрацию тотального белка в лизатах клеток определяли на фотометре Multiscan Ascent (LabSystems, США) по методу Брэдфорд (Bradford) при длине волны 595 нм (Bradford, 1976), Для получения концентрированных кондиционированных клетками клонов B16F10 сред клетки контрольного клона и экспрессирующих Т-кадгерин клонов инкубировали 48 часов в 7 мл полной среды RPMI1640. После этого 4 мл ростовой среды от каждого клона наносили на колонку Centricon 30 кДа (Millipore, США) и центрифугировали (20 минут, 4000 об/мин) при комнатной температуре. В полученный концентрат добавляли Protease Inhibitor Cocktail (1:100), замораживали и хранили на -20°С. Электрофорез белков проводили в присутствии 20% SDS (Sigma-Aldrich, США). Анализируемые образцы смешивали с буфером для нанесения (Laemmli buffer), содержащим 4% ß-меркаптоэтанола (Helicon, Россия), и инкубировали 5 минут при 99°С. После этого образцы наносили на SDS/полиакриламидный гель (7,5%) из расчета 30 мкг белка на лунку. Для определения молекулярных масс белков использовали стандартную коммерческую смесь предокрашенных белков BenchMark™ (Invitrogen, США). После электрофореза перенос белков из геля на Amersham Hybond-P PVDF мембрану (GE Healthcare, Великобритания), предварительно смоченную буфером для электропереноса, осуществляли методом полусухого электроблоттинга. После переноса мембрану промывали в TBS/Tween (150 мМ NaCl, 50 мМ Tris/HCl, pH 7,6, 0,05% Tvveen 20 (PRS Panreac, Испания)), а затем инкубировали в TBS/Tween, содержащем 5% обезжиренное молоко. В качестве первичных антител использовали антитела кролика против Т-кадгерина (1:1000, Biodesign International, США), вторичных: антитела козла против антител кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена (1:10000, Immune Jackson Research, США). Для контроля эквивалентности нанесения белка на гель проводили иммуноблотинг с антителами к изоформам актина (Sigma-Aldrich, США). Для визуализации белка, связавшегося с антителами, использовали двухкомпонентную ECL™ Western Blotting систему (GE Healthcare, Великобритания) и экспонировали мембраны с использованием пленки X-ray Retina ХВМ (Fotochemische Werke, Германия). Денситометрический анализ полученных полос проводили с помощью прибора GS-800 Calibrated Densitometer (Bio Rad, США) и программного обеспечения Quantity One® 4.6 (Bio Rad, США).

Оценка пролиферации клеток клонов B16F10 in vitro. Перед проведением экспериментов клетки B16F10 депривировали в среде RPMI1640, содержащей 0,1% FBS, в течение 24 часов. Оценку пролиферации клонов мышиной меланомы B16F10 осуществляли двумя методами: подсчётом абсолютного числа клеток с помощью прибора CellCounter (Invitrogen, США) и измерением клеточного индекса с помощью системы xCELLigence (Roche, США). В первом случае, клоны B16F10 сажали на 6-луночный планшет в количестве 1х105 на лунку в полной ростовой среде RPMI 1640. Каждые 24 часа (в течение 72 часов) клетки снимали с одной лунки 6-луночного планшета с помощью 0,25% раствора трипсина (HyClone, США) и производили подсчёт абсолютного числа клеток на приборе CellCounter (п=5). Во втором случае, клоны B16F10 сажали на планшеты E-plate (Roche, США). Перед посадкой клеток планшет со 100 мкл полной среды RPMI1640 в каждой лунке помещали на 30 минут в С02-инкубатор, после чего его переносили в RTCA SP Station (Roche, США) и снимали

показатели фона для каждой лунки с помощью RTCA Analyzer (Roche, США). Клетки для эксперимента снимали с чашек с помощью HyQtase (HyClone, США) и считали с помощью прибора CellCounter. В каждую лунку сажали клетки в концентрации 5х103 в 100 мкл полной среды RPMI1640. После чего планшет с клетками помещали в RTCA Station и анализировали динамику роста клонов мышиной меланомы в режиме реального времени (первые 5 часов измерения проводились с интервалом 1 минута, последующие 96 часов - с интервалом 10 минут) (п=3). Анализ полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения RTCA Software 1.2.1 (Roche, США). Оценка распределения клеток клонов B16F10 по фазам клеточного цикла in vitro. Для синхронизации клеточного цикла клетки клонов B16F10 депривировали в среде RPMI1640, содержащей 0,1% FBS, в течение 24 часов. Затем клетки стимулировали полной средой RPMI1640 в течение 48 часов, после чего их снимали с чашек 0,25 % раствором трипсина. Затем суспензию клеток фиксировали ледяным 70%-ным этанолом (2 часа, -20°С) и окрашивали в течение 30 минут при комнатной температуре раствором йодистого пропидия (PI) (на PBS, 50 мкг/мл) (Invitrogen, США), содержащем 200 мкг/мл РНКазы A (Invitrogen, США) и 0,1% Тритона Х100. Содержание ДНК в клетках клонов B16F10 определяли по флуоресценции PI в диапазоне длин волн 600-625 нм (при возбуждении длиной волны 488 нм) методом проточной цитометрии с помощью клеточного сортера MoFlo (DakoCytomation, Дания) (п=3). Данные проточной цитометрии анализировали с помощью программы для математического анализа распределения клеток по стадиям клеточного цикла ModFit LT 3.2 (Verity Software House, США).

Оценка количества клеток клонов B16F10 на разных стадиях некроза и апоптоза in vitro. Клетки клонов мышиной меланомы снимали с чашек при помощи 0,25% трипсина, отмывали в буфере для связывания Аннексина V (BD Biosciences, США) и ресуспендировали в 200 мкл этого же буфера. После этого к клеткам добавляли 5 мкл AnV-PE (Аннексии V - фикоэритрин, BD Biosciences, США) и 10 мкл 7-AAD (BD Biosciences, США) и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. С помощью проточной цитометрии на приборе FACSCanto II™ (BD Biosciences, США) определяли количество аннексии V и 7-AAD - позитивных клеток; аннексии V - позитивных - 7-AAD - негативных клеток; аннексии V и 7-AAD -негативных клеток.

Анализ экспрессии генов в клетках клонов B16F10 in vitro. Выделение РНК из клонов клеток мышиной меланомы осуществляли с помощью RNeasy Mini kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя с добавлением стадии обработки ДНКазой I (Qiagen, Германия) в течение 30 минут при комнатной температуре. Концентрацию и качество выделенной тотальной РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США) с использованием программного обеспечения ND-1000 V 3.7.1 (Thermo Scientific, США). Для последующей процедуры обратной транскрипции отбирали образцы РНК со следующими показателями: 260нм/280нм = 2, 260нм/230нм = 1,8-2,2. Для синтеза кДНК 1 мкг РНК смешивали с 0,5 мкг Oligo (dT)18 primer (0,5 мкг/мкл, Fermentas, США) и инкубировали 5 минут при 65°С. После инкубации к смеси добавляли 4 мкл 5х reaction buffer (Fermentas, США), 0,5 мкл RiboLock™ RNase Inhibitor (40 u/jjl, Fermentas, США), 2 мкл 10 мМ смеси нуклеотидов dNTP mix (Fermentas, США) и инкубировали 5 минут при 37°С. После инкубации в смесь добавляли 2 мкл M-Mul V Reverse Transcriptase (20 и/ц1, Fermentas, США) и инкубировали 60 минут при 37°С. Реакцию останавливали нагреванием смеси до 70°С в течение 10 минут. На клетках клонов мышиной меланомы методом ПЦР в реальном

времени был произведён анализ уровня экспрессии следующих генов (n=5): VEGF А, PDGF В, HGF, EGF, bFGF, uPAR, uPa, c-Met (HGFR), MMP2, MMP9. Гены GAPDH и ß-актин использовали для сравнительной оценки уровня экспрессии исследуемых генов.

Специфические пары праймеры для анализа исследуемых генов были изготовлены фирмой Синтол (Россия), имели следующую последовательность (5'-3') и температуру отжига: GAPDH mouse (60°) прямой GACCCCTTCATTGACCTCAACTAC, обратный TGGTGGTGCAGGATGCATTGCTGA;ök/?№h ß mouse (61°) прямой AGTGTGACGTTGACATCCGTA, обратный GCCAGAGCAGTAATCTCCTTCT; VEGF А mouse (60°) прямой AGAGCAGAAGTCCCATGAAGTGA, обратный TCAATCGGACGGCAGTAGCT; PDGF В mouse (58,5°) прямой TCTCTGCTGCTACCTGCGTCTGG, обратный GTGTGCTCGGGTCATGTTCAAGTC; HGF mouse (60°) прямой TCATTGGTAAAGGAGGCAGCTATA, обратный CTGGCATTTGATGCCACTCTTA; EGF mouse (60°) прямой

CCTGCCCCCTTCCTAGTTTTC, обратный CTCCGTTCTGTTGGTCTACCC; bFGF mouse (58,5°) прямой CGGCATCACCTCGCTTCC, обратный

TGCCCAGTTCGTTTCAGTGC; uPaR mouse (60°) прямой

С GTT ACCTCG AGTGTG CGTCCTG, обратный AGCCTCGGGTGTAGTCCTCATCCT; uPa mouse (53°) прямой GAATGCGCCTGCTGTCC, обратный AGGGTCGCTTCTGGTTGTC; c-Met mouse (60°) прямой

CAACGAGAGCTGTACCTTGACCTTA, обратный GCGGGACCAACTGTGCAT; MMP 2 mouse (53°) прямой AGTTCCCGTTCCGCTTCC, обратный

GACACATGGGGCACCTTCTG; MMP9 mouse (61°) прямой

CTGGACAGCCAGACACTAAAG, обратный CTCGCGGCAAGTCTTCAGAG. Для каждого исследуемого гена приготавливали смесь праймеров (прямого и обратного) в конечной концентрации 5 пкмоль/мкл каждого праймера. Для приготовления одной пробы использовали 10 мкл реакционной смеси, содержащей SYBR Green I (Синтол, Россия), 13 мкл ddH20 (Синтол, Россия), 1 мкл смеси праймеров и 1 мкл кДНК. Для приготовления отрицательного контроля без добавления матрицы (non-template control, NTC) проб вместо кДНК добавляли 1 мкл ddH20. ПЦР в реальном времени проводили на приборе Rotor - Gene™ 3000 (Corbett Research, Великобритания). Анализ кривых амплификации производили с помощью программы Rotor - Gene Analysis Software 6.0 (Corbett Research, Великобритания). Для всех проб использовали 40 циклов амплификации. После проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени полученные данные по значениям порогового цикла для каждого гена обрабатывали согласно формуле: N=2"ÄC* 1000, ДС= CrCfli, где Сг значение порогового цикла для исследуемого гена, Сыг среднее значение порогового цикла для двух генов "домашнего хозяйства", N- результат в относительных единицах.

На матрице РНК с использованием RT2 First Strand Kit (SABiosciences™, США) синтезировали кДНК согласно протоколу фирмы-производителя. Для реакции обратной транскрипции брали 1 мкг РНК. Для проведения реакции ПЦР использовали наборы реагентов RT2 Real-Time™ SYBR Green/Fluorescein PCR master mix (SABiosciences™, США). Для анализа влияния Т-кадгерина на изменение профиля экспрессии в клетках клонов B16F10 были использованы следующие системы анализа экспрессии генов мыши RT2 Profiler PCR Array (SABiosciences™, США), адаптированные для проведения ПЦР на приборе IQ5 (BioRad, США): внеклеточный матрикс и молекулы адгезии, ангиогенные факторы и ингибиторы ангиогенеза, хемокины и их рецепторы. Для нормализации результатов исследования использовали 5 генов "домашнего хозяйства": В2М, HPRT1, RPL13A, GAPDH, АСТВ, входящие в состав набора.

Оценка инвазивного потенциала клеток клонов B16F10 in vitro. За 24 часа до эксперимента клетки клонов мышиной меланомы депривировали в среде RPMI1640, содержащей 0,1% FBS. После чего клетки в концентрации Зх105/мл смешивали с 5 мкл GFR Matrigel™ (Growth Factor Reduced Matrigel, BD Biosciences, США) в соотношении 1:1. После чего из 0,2 мкл полученной смеси формировали капли. После полимеризации капли GFR Матригеля с клетками сверху наносили 5 мкл Matrigel™ (BD Biosciences, США), содержащего факторы роста. После полимеризации чашки заливали полной средой RPMI1640 (Рисунок 1).

., . . , ты , Ростовая среда RPMI

GFR Matrigel™ без факторов роста

-f клетки клонов"

B16F10 _

Matrigel1" с факторами роста

Рисунок 1. Схема формирования капель Матригеля для оценки инвазивного потенциала клеток клонов мышиной меланомы B16F10 in vitro.

Полученные капли фотографировали через 48 часов с помощью микроскопа Leica AF6000 (Leica Microsystems, Германия). В программе Las (Leica Application Suite) AF (Leica Microsystems, Германия) измеряли диаметры капли (Dl и D2) и подсчитывали число клеток, инвазировавших из GFR Матригеля в полный Матригель. Влияние среды роста от клеток клонов B16F10 на миграцию и пролиферацию МСК-ЖТ in vitro. Для оценки пролиферации МСК-ЖТ сажали в концентрации 104/мл на 24-луночный планшет в 500 мкл среды RPMI1640, содержащей 0,1% FBS. В этот же день в верхнюю камеру вставки Transwell® (Millipore, США) сажали клетки клонов B16F10 в концентрации 5х103/мл в 200 мкл полной среды RPMI1640. В качестве контроля в верхнюю камеру сажали клетки NIH/3T3 в той же концентрации, что и клоны меланомы, а также в качестве контроля в верхнюю камеру вносили 200 мкл полной среды RPM11640. В эксперименте использовали вставку с мембраной, диаметр пор в которой составлял 0,4 мкм. На следующий день заменяли среду во вставках с посаженными на них клетками меланомы и NIH/3T3 на RPMI1640, содержащую 0,1% FBS, и помещали в 24-луночный планшет с посаженными клетками МСК-ЖТ (Рисунок 2А). После инкубации в течение 48 часов клетки МСК-ЖТ в нижней камере промывали PBS, фиксировали 4% формальдегидом (PRS Рапгеас, Испания) и окрашивали гематоксилином Майера (Dako, США). На окрашенных препаратах осуществляли подсчёт количества клеток, что отражает влияние ростовой среды от клеток клонов мышиной меланомы на пролиферацию клеток МСК-ЖТ.

А Б

нижняя юшра: МСК-ЖТ

всмиа

верхняя ктщж клетки КЛ0И0» В16 F10 |ЗТЗ ИЛИ 10*» FBS - в К(ЖЦм>Л0|

14вий|н1нл с цнлмвгром 7 ле>|» 0,4 ини

нижняя K.tueiu: tmmt кленов В1ЙЯ10 im или 10s» F6S- вк<ш1|>0то|

верхняя КМЩ1Л; ИСК-ЖI . Д""1«'!»«"

/ пер в иш

МвМОрЛНЛ с I I

BCI.1BK.)

Рисунок 2. Схема эксперимента по изучению влияния среды роста от клеток клонов меланомы В16Р10 на пролиферацию (А) и миграцию (Б) МСК-ЖТ.

Для оценки влияния среды роста от клонов мышиной меланомы на миграцию МСК-ЖТ использовали вставку Transwell® с мембраной, диаметр пор в которой составлял 8 мкм. Мембрану вставки перед экспериментом покрывали коллагеном I (0,1 мкг/мл) (Имтек, Россия). Клетки МСК-ЖТ сажали в концентрации 5х104/мл в верхнюю камеру вставки в 200 мкл среды RPM11640, содержащей 0,1% FBS. В этот же день в лунки 24-луночного планшета сажали клетки клонов мышиной меланомы B16F10 в концентрации 105/мл в 500 мкл полной среды RPMI1640. В качестве контроля в нижнюю камеру сажали клетки N1H/3T3 в той же концентрации, что и клоны меланомы, а также в качестве контроля использовали полную среду RPMI1640. На следующий день заменяли среду в нижних камерах с посаженными на них клетками B16F10 и NIH/3T3 на RPMI1640, содержащую 0,1% FBS, и помещали вставки с посаженными клетками МСК-ЖТ в 24-луночный планшет (Рисунок 2Б). После инкубации в течение 48 часов клетки МСК-ЖТ на нижней стороне мембраны вставки промывали PBS, фиксировали 4% формальдегидом и окрашивали гематоксилином Майера. На окрашенных мембранах осуществляли подсчёт количества клеток, что отражает влияние ростовой среды от клеток клонов мышиной меланомы на миграцию клеток МСК-ЖТ. In vivo модель гематогенно метастазирующей в лёгкие меланомы у мышей. Мышам (BDF1, п=11) подкожно вводили суспензию клеток клонов высокометастазирующей в лёгкие меланомы B16F10 (1х106 клеток в 0,3 мл среды RPMI1640). В течение 28 дней анализировали кинетику опухолевого роста по размерам опухолей (7 измерений). На 29 сутки у мышей извлекали легкие, определяли частоту метастазирования (отношение числа мышей с метастазами к общему числу анализируемых мышей) и легочный коэффициент (отношение средней массы лёгких в опытной группе к средней массе лёгких здоровых мышей). Части первичных узлов погружали в среду Tissue-Tek (Sakura, США), замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -20°С. Образцы первичных узлов мышей использовали для приготовления срезов толщиной 7 мкм. Перед окрашиванием срезы фиксировали в 4% формальдегиде 10 минут при комнатной температуре, промывали PBS и инкубировали 10 минут в 0,2 % растворе Тритона XI00. После инкубации срезы промывали в PBS и наносили нормальную сыворотку крови донора вторых антител (осла) (1:10, Sigma-Aldrich, США), после чего препараты отмывали в PBS. Для двойной окраски срезы последовательно инкубировали в первых антителах: сначала на срезы наносили моноклональные антитела крысы против маркёра эндотелиальных клеток CD31 мыши (1:100, BD Biosciences, США) или против маркёра CD90 мыши (1:100, BD Biosciences, США) на 60 минут, а затем антитела кролика против Т-кадгерина (1:100, Biodesign International, США). В качестве негативного контроля на срезы наносили фракции иммуноглобулинов неиммунной сыворотки крысы и кролика. После отмывки в PBS, срезы помещали в смесь вторых антител осла: против антител крысы, конъюгированных с флюорохромом А1еха488 (Molecular Probes®, Invitrogen, США), и против антител кролика, конъюгированных с флюорохромом А1еха594 (Molecular Probes®, Invitrogen, США) на 60 минут. Ядра клеток докрашивали флюоресцентым красителем DAPI (Sigma-Aldrich, США). После отмывки в PBS срезы заключали в среду Mounting Medium VectashieldTM (Vector Laboratories, США). Полученные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Leica AF6000. Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam и обработки в программе Las AF. На срезах, окрашенных антителами против CD31 и Т-кадгерина, производили подсчет сосудов в 4-5 полях зрения (сосуды среднего диаметра - CD31-положительные образования длиной от 20 до 40 мкм, крупные сосуды - диаметром более 40 мкм и капилляры - диаметром менее 20

мкм, без просвета), количество сосудов в поле зрения соотносили с площадью поля зрения по DAPI. Вклад стромального компонента в прогрессию первичного узла мышиной меланомы оценивали путём подсчёта отношения площади С090-позитивных областей к общей площади среза в программе MetaMorph5.0 (Universal Imaging, США). Для анализа количества очагов некроза срезы после фиксации окрашивали гематоксилином Майера и подсчитывали отношение количества срезов с очагами некроза к общему количеству срезов.

In vivo модель хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона. Для изучения ангиогенеза in vivo была использована модель - хориоаллантоисная мембрана куриного эмбриона по методике, описанной в Angiogenesis Protocols V.46 (West et al., 2003). Оплодотворённые яйца инкубировали при +37° С и 70% влажности. Суммарную популяцию гиперэкспрессирующих Т-кадгерин или контрольных клеток мышиной меланомы B16F10 имплантировали в хориоаплантоисную мембрану куриного эмбриона на 30-31 стадии развития (по Humburger и Hamilton, 1951) в виде суспензии в полной среде RPMI 1640 в концентрации 1 млн. клеток в 500 мкл среды. Хориоаллантоисную мембрану контрольных и экспериментальных эмбрионов анализировали через 3 дня после операции и фотографировали с использованием стереомикроскопа (Olympus SZX 16, камера AxioCam HRc, Zeiss) и программы Axio Vision 3.1.

Завершение экспериментов с животными. Мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза, трупы подвергали замораживанию и кремировали в специализированном подразделении РОНЦ с учетом международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, изложенных в "Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей", ЕЭС, Страсбург, 1985 г. [Ланималогия, 1993], а также требований Хельсинкской декларации и Всемирной медицинской ассоциации (2000) [Большаков О.П. с соавт, 2002].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6,0 (StatSoft, США), применяя непараметрический критерий Манна-Уитни. Данные выражали в виде М±т, где М - среднее арифметическое, am- стандартная ошибка среднего.

Результаты исследований и их обсуждение Анализ экспрессии Т-кадгерина. В результате стабильной трансфекции контрольной плазмидой или плазмидой, содержащей кДНК Т-кадгерина, и последующей селекции на среде, содержащей селективный антибиотик С418, было получено 2 популяции клеток мышиной меланомы В16Р10: суммарная популяция, клетки которой гиперэкспрессируют Т-кадгерин (В 16Б10 Т (+) сумм), и контрольная суммарная популяция, клетки которой не экспрессируют Т-кадгерин (В 16Г10 Т (-) сумм). Экспрессия Т-кадгерина в популяциях клеток В16Р10 определяли методом иммуноблотинга (Рисунок 3).

130 кДа __^^^^

105 кда » Рисунок 3. Экспрессия Т-кадгерина в суммарных

^^^^^ популяциях клеток мышиной меланомы В16Р10.

„,„„„ „.„,„,.,, Клетки НиУЕС использовали в качестве

НЦуЕС В16Г10Т(-) В16Р10Т(+)

сумм сумм положительного контроля.

В результате клонирования клеток суммарных популяций было получено 6 клонов клеток мышиной меланомы В16Р10 с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина и один контрольный клон В16Р10, клетки которого не экспресссируют Т-кадгерин

' (Рисунок 4). Уровень экспрессии Т-кадгерина в полученных клонах определяли с помощью денситометрического анализа. Уровень экспрессии Т-кадгерина в контрольном клоне составляет 0,002 мм\ тогда как в клонах, трансфицированных плазмидой, содержащей кДНК Т-кадгерина, этот уровень варьирует от 3,3 до 34 мм2 (Рисунок 4Б).

А ' Б

Т-кадгерин (105 кДа)

Актин (42 кДа)

№ 1 Ne 2 Ne 3 № 4 контр № 5 Ne 6

Рисунок 4. Экспрессия Т-кадгерина в клонах клеток мышиной меланомы B16F10. А -иммуноблотинг лизатов клеток клонов мышиной меланомы B16F10, Б - денситометрический анализ экспрессии Т-кадгерина в клонах мышиной меланомы, выполненный с помощью программного обеспечения Quantity One 4.6. ОП - оптическая плотность, площадь - площадь одного пикселя.

I Опираясь на данные денситометрического анализа, из полученной панели клонов

было выбрано для дальнейших экспериментов 3 клона: контрольный клон B16F10 Т (-), клетки которого не экспрессируют Т-кадгерин, клон 2 B16F10 Т (+) с низким уровнем экспрессии Т-кадгерина и клон 1 B16F10 Т (++) с высоким уровнем экспрессии Т-кадгерина. В дальнейшем все эксперименты, за исключением модели хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона, выполнены на 3 клонах мышиной меланомы.

Исследование влияния экспрессии Т-кадгерина на пролиферацию клеток клонов мышиной меланомы in vitro. In vitro анализ пролиферации клеток клонов мышиной меланомы и построение кривых роста клонов проводили двумя методами: подсчётом абсолютного числа клеток с помощью прибора CellCounter (Рисунок 5А) и измерением клеточного индекса в режиме реального времени с помощью прибора xCELLigence (Рисунок 5Б).

А Б

Рисунок 5. Кривые роста клонов мышиной клеток с помощью прибора Се11Соип1ег в течение 72 часов (п=5), Б - измерение клеточного индекса на приборе хСЕИ^епсе в течение 96 часов (п=3).

На основании данных, полученных при измерении клеточного индекса, были высчитаны времена удвоения для каждого клона (Таблица 1).

Таблица 1. Время удвоения популяций клеток клонов мышиной меланомы В16П0.

Клон клеток Время удвоения, часы

B16F10 Т (-) 31,7

B16F10 Т (+) 29,8

B16F10 Т (++) 28,4

Двумя методами анализа пролиферации было показано, что in vitro скорость роста клона с высокой экспрессией Т-кадгерина достоверно превышает скорость роста клона с низкой экспрессией Т-кадгерина и контрольного клона (р<0,05). Таким образом, на основании данных in vitro, можно заключить, что экспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы приводит к увеличению пролиферативной активности этих клеток за счет сокращения времени удвоения.

Исследование влияния экспрессии Т-кадгерина на распределение клеток клонов B16F10 по фазам клеточного цикла in vitro. Из данных литературы известно, что экспрессия Т-кадгерина может вызывать задержку в G2 фазе клеточного цикла [Huang Z.Y. et al., 2003]. В связи с этим было проанализировано распределение клеток клонов мышиной меланомы по фазам клеточного цикла методом проточной цитометрии. В ходе анализа не было обнаружено достоверных различий между клонами мышиной меланомы по количеству клеток, находящихся на каждой из трёх исследованных фазах клеточного цикла, то есть изменение соотношения продолжительности индивидуальных фаз клеточного цикла обнаружено не было. Таким образом, экспрессия Т-кадгерина не приводит к изменению структуры клеточного цикла в клетках клонов мышиной меланомы B16F10.

Исследование влияния экспрессии Т-кадгерина на количество клеток клонов B16F10, находящихся на различных стадиях апоптоза и некроза, in vitro. Количество клеток на различных стадиях апоптоза и некроза в культуре клеток клонов мышиной меланомы определяли методом проточной цитометрии. Клетки позитивные и по аннексину V, и по 7-AAD считали клетками мёртвыми или находящимися на поздних стадиях апоптоза. Клетки, позитивные по Аннексину V, но негативные по 7-AAD считали клетками, находящимися на ранних стадиях апоптоза. Клетки, негативные по аннексину V и 7-AAD считали живыми. Было обнаружено, что процент мёртвых клеток и клеток на разных стадиях апоптоза в культуре достоверно не различается между клонами мышиной меланомы. Таким образом, экспрессия Т-кадгерина не влияет на количество мёртвых и апоптотических клеток B16F10 в культуре.

Исследование влияния среды роста клеток клонов B16F10 на МСК-ЖТ in vitro. В

ходе эксперимента было обнаружено, что кондиционированная среда роста от клонов мышиной меланомы B16F10 вне зависимости от экспрессии Т-кадгерина стимулирует миграцию МСК-ЖТ по сравнению со средой роста эмбриональных фибробластов мыши NIH3T3 и стандартной средой с сывороткой для культививирования клеток (р<0,05) (Рисунок 6А). Однако при гиперэкспрессии Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы

стимулирующий эффект среды культивирования от клеток меланомы на миграцию МСК-ЖТ увеличивается в 1,4 раза по сравнению с контрольным клоном (р<0,05) (Рисунок 6А). При анализе влияния Т-кадгерина в клетках меланомы на пролиферацию МСК-ЖТ было обнаружено, что среда роста от экспрессирующих Т-кадгерин клонов имеет тенденцию стимулировать пролиферацию клеток МСК-ЖТ, однако, достоверных отличий обнаружено не было (р>0,05) (Рисунок 6Б).

А Б

Рисунок 6. Влияние кондиционированной среды роста от клеток клонов мышиной меланомы B16F10 на МСК-ЖТ. А - влияние кондиционированной среды роста от клеток клонов мышиной меланомы на миграцию МСК-ЖТ: "достоверно по отношению к контрольному клону клеток, "достоверно по отношению к клонам мышиной меланомы. Б - влияние среды роста от клонов клеток мышиной меланомы на пролиферацию клеток МСК-ЖТ. "достоверно по отношению к клонам мышиной меланомы.

Так как было показано, что Т-кадгерин в клетках СНО, трансфицированных кДНК Т-кадгерина, способен слущиваться с поверхности и может присутствовать в кондиционированной среде [Vestal D.J., Ranscht В., 1992], мы проверили среду роста от клонов мышиной меланомы B16F10 и клеток NIH/3T3 на присутствие растворимой формы Т-кадгерина методом иммуноблоттинга. Т-кадгерина в среде роста от всех использованных типов клеток обнаружено не было. Методом иммуноблотинга также не было выявлено экспрессии Т-кадгерина в клетках NIH/3T3 и МСК-ЖТ. Таким образом, высокий уровень экспрессии T-кадгерина в клетках мышиной меланомы приводит к стимуляции миграции стромальных клеток (МСК-ЖТ) при бесконтактном сокультивировании, но не оказывает влияния на пролиферацию МСК-ЖТ в аналогичных условиях. Было сделано предположение, что клетки меланомы B16F10 секретируют в среду факторы, стимулирующие миграцию МСК-ЖТ.

Исследование влияния экспрессии Т-кадгерина на инвазивиый потенциал клеток клонов B16F10 in vitro. Поскольку инвазия клеток меланомы из GFR Матригеля в полный Матригель сопровождается не только миграцией клеток, но и протеолитичеекой активностью в отношении окружающего матрикса, что приводит к размыванию границы между двумя Матригелями и изменению диаметра капли, мы оценивали диаметры капли после 48 часов инкубации. При оценке влияния Т-кадгерина на инвазивный потенциал клеток мышиной меланомы было обнаружено, что диаметры капель Матригеля с клетками клона мышиной меланомы с высоким уровнем экспрессии Т-кадгерина достоверно больше по сравнению с каплями, в которые были помещены клетки контрольного клона или ююна с низким уровнем экспрессии Т-кадгерина (р<0,05) (Рисунок 7А). Также было обнаружено, что количество клеток клона мышиной

меланомы с высоким уровнем экспрессии Т-кадгерина, инвазировавших из ОРГ1 Матригеля в полный Матригель, достоверно превышает аналогичный показатель для контрольного клона и клона с низким уровнем экспрессии Т-кадгерина (р<0,05) (Рисунок 7Б). Таким образом, гиперэкспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы приводит к увеличению инвазивного потенциала этих клеток.

А Б

Рисунок 7. Влияние экспрессии Т-кадгерина на инвазивный потенциал клеток клонов мышиной меланомы B16F10, 48 часов инкубации: А - диаметры капли Матригеля с клетками клонов мышиной меланомы, Б - количество клеток клонов мышиной меланомы инвазировавших полный Матригель с факторами роста из GFR Матригеля.

Исследование влияния экспрессии Т-кадгерина на профиль экспрессии клеток клонов B16F10 in vitro. Исследование влияния Т-кадгерина на профиль экспрессии клеток клонов мышиной меланомы проводили методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени (VEGF A, PDGF В, EGF, bFGF, HGF, uPAR, uPa, c-Met (HGFR), MMP2, MMP9), а также с использованием коммерческих наборов RT2 Profiler PCR Array (внеклеточный матрикс и молекулы адгезии, ангиогенные факторы и ингибиторы ангиогенеза, хемокины и их рецепторы). Достоверных различий между контрольным клоном и экспрессирующими Т-кадгерин клонами B16F10 по уровню экспрессии следующих генов: VEGF A, PDGF В, bFGF, uPa, uPAR, ММР2 методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени обнаружено не было. мРНК EGF, HGF и ММР9 не детектируется ни в контрольном клоне, ни в Т-кадгерин-экспрессирующих клонах мышиной меланомы. Однако было выявлено, что гиперэкспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы приводит к значительному увеличению экспрессии в этих клетках c-Met, рецептора HGF (Рисунок 8).

4 *

2 3 *р<0,05 Г

а , > I f

I ■ i

» J

ГП ftil ■

BI6FI0 Т(-) B16F10 Т(+) В 6F10T(+- ч

Рисунок 8. Экспрессия c-Met в клонах мышиной меланомы B16F10.

С помощью коммерческого набора RT2 Profiler PCR Array для анализа экспрессии ангиогенных факторов и ингибиторов ангиогенеза было обнаружено, что экспрессия Т-кадгерина приводит к сильному увеличению (более чем в 4 раза) экспрессии 3-х генов: CXCL10, heparanase и Foxfla. Экспрессия chromogranin А и procollagen type XVIII alpha 1 выявляется исключительно в экспрессирующих Т-кадгерин клонах мышиной меланомы и не детектируется в контрольном клоне мышиной меланомы. Также экспрессия Т-кадгерина приводит к небольшому увеличению (более чем в 2 раза) экспрессии 2-х генов: angiopoetin 2 и stabilin 1. Экспрессия Т-кадгерина вызывает значительное подавление экспрессии Tie 1. Также было обнаружено, что экспрессия TGFa присутствует только в контрольном клоне, тогда как в экспрессирующих Т-кадгерин клонах экспрессия TGFa не детектируется. С помощью коммерческого набора RT2 Profiler PCR Array для анализа экспрессии хемокинов и их рецепторов было обнаружено, что экспрессия Т-кадгерина приводит к сильному увеличению (более чем в 4 раза) экспрессии одного гена - CXCL10. Небольшое увеличение экспрессии под влиянием экспрессии Т-кадгерина наблюдается для генов Сс15, Cmtm 3, Nfkb 1 и Cxcl И. Экспрессия Сс1 7, Gdf 5 и 118га выявляется исключительно в Т-кадгерин экспрессирующих клонах мышиной меланомы и не детектируется в контрольном клоне мышиной меланомы. Также было обнаружено, что экспрессия Т-кадгерина приводит к подавлению экспрессии Сс1 9, I18rb, interleukin 16 и ¡nterleukin 4. С помощью коммерческого набора RT2 Profiler PCR Array для анализа экспрессии молекул внеклеточного матрикса и молекул адгезии было обнаружено, что экспрессия Т-кадгерина приводит к сильному увеличению (более чем в 4 раза) экспрессии одного гена - Cadherin 1. Также экспрессия Т-кадгерина приводит к небольшому увеличению (более чем в 2 раза) экспрессии 6 генов: Tgfbi, ММР14, integrin alpha 5, integrin alpha v, integrin beta 3 и integrin alpha E. Экспрессия Pecam 1, Adamts 2 и Lama 3 выявляется исключительно в Т-кадгерин экспрессирующих клонах мышиной меланомы и не детектируется в контрольном клоне мышиной меланомы. Также обнаружено, что экспрессия Т-кадгерина приводит к подавлению экспрессии 2-х генов: Adamts 5 и Lamb 3.

Исследование влияния экспрессии Т-кадгерина на рост первичного узла гематогенно метастазирующей в лёгкие мышиной меланомы В16Р10. На этой модели были проанализированы характеристики роста подкожного первичного узла (размер, васкуляризация и вклад стромального компонента в рост), а также оценивали частоту метастазирования. Влияние Т-кадгерина на рост первичного узла оценивали по анализу кинетики роста опухолей в течение 28 суток (7 измерений). При имплантации клеток с высоким уровнем экспрессии Т-кадгерина наблюдали достоверно наиболее быстрый рост в сравнении с первичными узлами, образованными клетками с низким уровнем экспрессии Т-кадгерина или контрольными клетками (р<0,05) (Рисунок 9). К окончанию эксперимента размер первичного узла, образованного клетками мышиной меланомы с высоким уровнем экспрессии Т-кадгерина, достиг 12068 мм3. Тогда как для первичных узлов, образованных клетками мышиной меланомы В16Р10 с низким уровнем экспрессии Т-кадгерина и клетками контрольного клона этот размер составил 9855 мм3 и 4992 мм3, соответственно. Достоверные увеличение скорости роста наблюдали также у первичных узлов, образованных В16Р10 Т (+) клетками, по отношению к первичным узлам, сформированных В16Р10 Т (-) клетками (р<0,05) (Рисунок 9).

8 12 15 18 21 24

Сутки после инокуляции клеток B16F10 Т (-) —B16F10 Т (+) -*-B16F10 Т (++)

Рисунок 9. Кинетика роста первичных узлов мышиной меланомы B16F10 под кожей мышей BDF1.

Таким образом, экспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы приводит к увеличению скорости роста первичного узла, образованного этими клетками in vivo. Усиление роста первичных узлов in vivo, образованных экспрессирующими Т-кадгерин клетками, может быть объяснено усилением пролиферативного потенциала этих клеток, что показано нами in vitro. При анализе криосрезов первичных узлов мышиной меланомы было обнаружено, что гистологическое строение первичных узлов, образованных Т-кадгерин экспрессирующими клетками, значительно отличается от строения узлов, образованных контрольными клетками. На окрашенных гематоксилином срезах было обнаружено, что значительную долю первичных узлов, образованных Т-кадгерин экспрессирующими клетками, занимают очаги некроза, тогда как в первичных узлах, образованных контрольным клоном клеток, количество таких очагов достоверно меньше (р<0,05) (Рисунок 10).

50%

40%

30%

20%

10%

*р<0,05 t * --

Г*1 ■

B16F10 Т (-) B16F10 Т (+) B16F10 Т (++)

Рисунок 10. Частота очагов некроза на срезах первичных узлов меланомы B16F10 у мышей (п=150).

Таким образом, экспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы приводит к увеличению количества очагов некроза в первичных узлах, образованных экспрессирующими Т-кадгерин клетками. Однако в настоящей работе было показано, что экспрессия Т-кадгерина в клетках меланомы В16F10 in vitro не влияет на количество мёртвых клеток и клеток на разных стадиях апоптоза. Мы предположили, что увеличение некротической гибели клеток первичного узла может быть связано с его недостаточным кровоснабжением.

Исследование влияния экспрессии Т-кадгерина на васкуляризацию первичных узлов мышиной меланомы. Для проверки предположения о влиянии экспрессии Т-кадгерина в клетках меланомы на васкуляризацию первичного узла было проведено окрашивание первичных узлов на маркёр эндотелиальных клеток с последующим подсчётом количества сосудов различного диаметра (СЭ31 - окрашивание) (Рисунок 11 А). Было обнаружено, что количество сосудов среднего диаметра и капилляров на срезах первичных узлов, образованных экспрессирующими Т-кадгерин клетками, достоверно меньше, чем в случае первичных узлов, образованных контрольными клетками мышиной меланомы (р<0,05) (Рисунок 11 Б).

А Б

B16F10 Т (++)

Рисунок 11. Васкуляризация первичного узла меланомы у мышей сосудами различного диаметра (п=150). А - иммунофлуоресцентная окраска криосрезов первичных узлов мышиной меланомы антителами к CD31, Б - подсчёт сосудов различного диаметра на криосрезах первичных узлов мышиной меланомы.

Очевидно, что экспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы BI6FI0 приводит к подавлению васкуляризапии сосудами среднего диаметра и капиллярами первичных узлов, образованных клетками, экспрессирующими Т-кадгерин. Недостаточное кровоснабжение отдельных участков первичных узлов при экспрессии Т-кадгерина, возможно, и является причиной усиления некротической гибели клеток таких узлов. В настоящей работе при анализе экспрессии генов, вовлечённых в процесс ангиогенеза, в клетках клонов мышиной меланомы было обнаружено повышение экспрессии некоторых ингибиторов ангиогенеза при экспрессии Т-кадгерина: CXCL 10, или IP-10 [Angiolillo A.L. et al., 1995, Strieter R.M. et al., 1995, Strieter R.M. et al., 2005]; angiopoietin 2 [Maisonpierre P.C. et al., 1997, Cao Y. et al., 2007]; procollagen type XVIII alpha 1, предшественник ингибитора ангиогенеза - эндостатина [O'Reilly M.S. et al., 1997]; chromogranin А, предшественник ингибитора ангиогенеза вазостатина-l [Belloni D. et al., 2007, Veschini L. et al., 2011]. Также было отмечено подавление экспрессии двух стимуляторов ангиогенеза в клетках мышиной меланомы, экспрессирующих Т-кадгерин: TGFa [Leker R.R. et al., 2009] и Tie-1 [Korhonen J. et al., 1994, Sato M. et al., 1993]. Таким образом, при экспрессии Т-кадгерина в клетках меланомы изменяется соотношение факторов, подавляющих и активирующих ангиогенез, в пользу

ингибиторов ангиогенеза, что, возможно, обуславливает снижение способности этих клеток стимулировать прорастание сосудов в опухоль.

Исследование влияния экспрессии Т-кадгерина на вклад стромального компонента в формирование первичных узлов мышиной меланомы В16Р10.

Поскольку известно, что мезенхимальные стромальные клетки могут вносить свой вклад в опухолевый рост, в настоящем исследовании мы оценили вклад стромального компонента в формирование первичного узла путем окрашивания криосрезов на маркер активированной стромы С090 (Рисунок 12А) и анализа площади, занимаемой стромальным компонентом (С090+ зоны). Было обнаружено, что на срезах первичных узлов, образованных экспрессирующими Т-кадгерин клетками мышиной меланомы, С090-позитивные области занимают достоверно большую площадь, чем в случае первичных узлов, сформированных контрольными клетками (р<0,05) (Рисунок 12Б).

А Б

B16F10 Т (++)

Рисунок 12. Оценка вклада стромального компонента в формирование первичного узла меланомы B16F10 (n=150). А - иммунофлуоресцентное окрашивание криосрезов первичных узлов меланомы антителами к CD90, Б - площадь CD90+ областей на срезах первичных узлов меланомы у мышей.

Данные экспериментов in vitro по анализу миграции стромальных клеток в ответ на стимулирование средой культивирования от клеток меланомы B16F10, а также результаты, полученные при анализе CD90+ областей на срезах первичных узлов меланомы in vivo, свидетельствуют о том, что экспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы приводит к активации и миграции клеток стромы. Кроме того, экспрессия Т-кадгерина вызывает увеличение экспрессии ряда хемокинов: CXCL 10, CCL5, CXCL 11, CCL7, которые являются хемоаттрактантами не только для иммунных, но и для мезенхимальных стромальных клеток [Spaeth Е. et al., 2008]. Также методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени было выявлено достоверное увеличение

экспрессии c-Met, рецептора HGF, в клетках меланомы, гиперэкспрессирующих Т-кадгерина, в то время как мРНК самого HGF не детектировалась ни в одном из клопов меланомы. Ранее в нашей лаборатории было показано методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени, что МСК-ЖТ экспрессируют HGF, причем его экспрессия значительно увеличивается при гипоксии [Efimenko A. Iu. et al., 2010]. Мы предполагаем, что экспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы приводит к увеличению продукции ими хемокинов в первичном узле, по градиенту которых приходят МСК. Приходя в опухоль, МСК оказываются в гипоксических условиях, что вызывает в них усиление экспрессии HGF. HGF, связываясь со своим рецептором c-Met на поверхности клеток меланомы, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, запускает сигнальный каскад в опухолевых клетках, приводящий, по данным литературы, к стимуляции роста меланомы и увеличении инвазивного потенциала [Nakamura Т., 1991, Halaban R. et al., 1993, Matsumoto К. et al., 1991].

Исследование влияния экспрессии Т-кадгерина на метастазнрованнс мышиной меланомы B16F10. Одной из ключевых характеристик опухолевой прогрессии является частота метастазирования. Для оценки параметров метастазирования (частоты метастазирования и лёгочного коэффициента) на 29 сутки мышей умерщвляли, извлекали лёгкие, взвешивали и тестировали их на наличие метастаз. Было обнаружено, что в группе мышей, которым были введены клетки с высоким уровнем экспрессии Т-кадгерина, частота метастазирования была значительно выше (Таблица 2).

Таблица 2. Частота метастазирования мышиной меланомы B16F10 с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина (n=l 1).

Клон клеток Число мышей с метастазами / общее число мышей Процент мышей с метастазами

BI6F10 Т (-) 1/11 9,1 %

B16F10 Т (+) 2/11 18,2%

B16F10 Т (++) 6/11 54,5 %

Показано, что экспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы B16F10 приводит к увеличению частоты метастазирования in vivo. При анализе экспрессии генов молекул адгезии и внеклеточного матрикса в клетках клонов мышиной меланомы с помощью коммерческих наборов PCR Array было обнаружено повышение экспрессии ряда проонкогенных интегринов в экспрессируюгцих Т-кадгерин клетках: ¡ntegrin а5, ¡ntegrin aV, íntegrin аЕ, integrin ß3, а также ММР14. Мы предполагаем, что увеличение экспрессии этих молекул может приводить к усилению метастазирования in vivo. Эти данные коррелируют с результатами, полученными другими авторами, которые обнаружили, что активация ММР14 в клетках меланомы приводит к усилению инвазии этих клеток на коллагеновом матриксе [Hotary K.B. et al., 2003]. Кроме того, было показано, что гиперэкспрессия ß3 субъединицы интегрина в клетках меланомы на ранней стадии радиального роста индуцирует вступление меланомы в фазу вертикального роста, характеризующуюся усиленным ростом, инвазией и метастазированием [Hsu M.Y. et al., 1998].

Влшшпе экспрессии Т-кадгерина на неоапгиогснез в меланоме В1бИ0 па модели хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона. Было исследовано количество сосудов, подрастающих к опухолевым массам, сформированным суммарной популяцией Т-кадгерин гиперэкспрессирующих (В 16Б10 Т (+) сумм) и контрольных (В 16Р10 Т (-) сумм) клеток мышиной меланомы. Средний показатель числа сосудов, подрастающих к опухолевым массам, сформированным гиперэкспрессирующими Т-кадгерин клетками, равен 3,1, аналогичный же показатель для опухолевых масс, сформированных контрольными клетками, равен 7,1 (р<0,01) (Рисунок 13).

■ Т- В16Р10 сумм оТ+ В16Р10 сумм

Рисунок 13. Число сосудов, подрастающих к опухолевым массам, сформированными гиперэкспрессирующими Т-кадгерин (Т+ В16Р10 сумм) и контрольными (Т- В16Б10 сумм) клетками мышиной меланомы В16Р10.

Полученные в работе данные показывают, что Т-кадгерин является важным регулятором прогрессии меланомы В16Р10. Экспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы приводит к усилению их пролиферативной активности и инвазивного потенциала. При введении клеток мышиной меланомы, экспрессирующих Т-кадгерин, мышам подкожно они формируют первичные узлы, в которых подавлена неоваскуляризация, но наблюдается значительное содержание мезенхимальных стромальных клеток. Кроме того, клетки мышиной меланомы с гиперэкспрессией Т-кадгерина обладают большей спонтанной метастатической активностью.

выводы

1. Наличие в клетках мышиной метастазирующей меланомы B16F10 гиперэкспрессии Т-кадгерина приводит к достоверному ускорению пролиферации клеток in vitro в 1,5 раза (р<0,05), а также достоверному ускорению роста первичного узла под кожей у мышей BDF1 в 2,4 раза (р<0,05) и экспрессии рецептора фактора роста гепатоцитов c-Met в б раз (р<0,05).

2. Экспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы B16F10 сопряжена с достоверным подавлением прорастания в ткань первичного узла кровеносных сосудов среднего диаметра (в 1,4 раза) и капилляров (в 1,7 раз) (р<0,05) in vivo на модели метастазирующей в легкие меланомы B16F10 у мышей, а также с подавлением в 2,3 раза (р<0,01) врастания кровеносных сосудов in vivo в узел меланомы на модели хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона.

3. В клетках мышиной меланомы B16F10, экспрессирующих Т-кадгерин, происходит увеличение экспрессии ингибиторов ангиогенеза (CXCL 10, angiopoietin 2, procollagen type XVIII alpha 1, chromogranin А) и подавление экспрессии стимуляторов ангиогенеза (TGFa и Tie-1).

4. Клетки мышиной меланомы B16FI0, экспрессирующие Т-кадгерин, вызывают усиление миграции стромальных клеток in vitro (р<0,05) и увеличение содержания С090-позитивных клеток активированной стромы в первичном подкожном опухолевом узле у мышей BDF1 in vivo (р<0,05).

5. При экспрессии Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы происходит увеличение экспрессии хемокинов CXCL 10, CCL5, CXCL 11, CCL7, выполняющих роль хемоаттрактантов для мезенхимальных стромальных клеток.

6. Инвазивный потенциал in vitro и метастатический потенциал клеток мышиной метастазирующей меланомы B16F10 in vivo возрастают при экспрессии Т-кадгерина (р<0,05).

7. При экспрессии Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы происходит увеличение экспрессии факторов, вовлечённых в процесс инвазии и метастазирования: integrin a5, integrin aV, integrin aE, integrin РЗ и MMP14.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Юрлова Е.И., Рубина К А., Сысоева В.Ю., Шаронов Г.В., Сёмина Е.В., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Т-кадгерин подавляет пролиферацию клеток мышиной меланомы B16F10 in vitro и опухолевый ангиогенез на модели хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона. Онтогенез. 2010; 41 (4): 261-270.

2. Rubina К., Sysoeva V., Semina Е., Kalinina N., Yurlova E., Khlebnikova A., Molochkov V.. Malignant transformation in skin is associated with the loss of T-cadherin expression in human keratinocytes and heterogeneity in T-cadherin expression in tumor vasculature. Tumor Angiogenesis. Под редакцией Ran S. (INTECH). 2011: 123-155.

3. Rubina K.A., Sysoeva V.Yu, Yurlova E.I., Talovskaya E.V., Andronova N.V., Treshalina H.M., Parfyonova Ye.V., Tkachuk V.A. T-cadherin expression in murine melanoma suppresses neovascularization in chorioallantoic membrane model. Сборник тезисов 3-ей Международной конференции по ангиогенезу, Амстердам, Нидерланды, 1-3 марта 2007 г. С. 69.

4. Юрлова Е.И. Исследование роли Т-кадгерина в опухолевом ангиогенезе in vivo и росте опухолевых клеток in vitro. Сборник тезисов 15 Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Москва, 8-11 апреля 2008 г. С. 251-252.

5. Юрлова Е.И., Сысоева В.Ю., Рубина К.А. Исследование роли Т-кадгерина в опухолевом ангиогенезе на модели хорио-аплантоидной мембраны куриного зародыша и росте опухоли in vitro. Вестник Российской академии медицинских наук. 2008; 6. Тезисы докладов V конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 19-22 мая 2008 г. С. 498-499.

6. Юрлова E.H. Исследование роли Т-кадгерина в опухолевом ангиогенезе на модели хорио-аллантоидной мембраны куриного эмбриона. Сборник тезисов XV Школы "Актуальные проблемы биологии развития", Звенигород, 19-24 октября 2008 г. С. 117119.

7. Рубина К.А., Сысоева В.Ю., Калинина Н.И., Юрлова Е.И., Потехина A.B., Ефименко А.Ю., Андронова Н.В., Трещалина Е.М., Парфёнова Е.В., Ткачук В.А. Подавление опухолевого ангиогенеза с использованием плазмидного вектора, содержащего кДНК для экспрессии Т-кадгерина. Сборник тезисов Всероссийской научной конференции с международным участием "Нанотехнологии в онкологии 2008", Москва, 6 декабря 2008 г. С. 164.

8. Юрлова Е.И. Исследование механизма подавления роста опухоли и опухолевого ангиогенеза при гиперэкспрессии Т-кадгерина. Сборник тезисов 16 Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009», Москва, 1318 апреля 2009 г. С. 319.

9. Rubina К., Sysoeva V., Yurlova Е., Semina Е., Parfyonova Y., Tkachuk V. T-cadherin overexpression suppresses proliferation and increase differentiation of murine melanoma cells in culture. Сборник тезисов ежегодной конференции Международного Общества генной и клеточной терапии (ISCGT), Корк, Ирландия, 2-4 сентября 2009 г. С. 21.

10. Yurlova Е., Rubina К., Sysoeva V., Semina Е., Parfyonova Y., Tkachuk V. T-cadherin overexpression in culture of murine melanoma cells suppresses proliferation. The FEBS Journal. 2010. 277 (Suppl 1,35lh FEBS Congress "Molecules of life"):163.

П.Юрлова Е.И., Рубина K.A., Сысоева В.Ю., Ткачук В.А. Использование плазмидного вектора, содержащего кДНК Т-кадгерина, для изменения профиля экспрессии клеток мышиной меланомы. Сборник тезисов конференции с Международным участием "Нанотехнологии в онкологии 2010", Москва, 30 октября 2010 г. С. 71-73.

12. Юрлова E.II., Рубина К.А., Сысоева В.Ю., Ткачук В.А. Экспрессия Т-кадгерина в клетках меланомы стимулирует миграцию мезенхимальных стромальных клеток при сокультивировапии. Сборник тезисов IV Всероссийской научной школа-конференция "Стволовые клетки и регенеративная медицина ", Москва, 24-27 октября 2011г. С. 85-86.

Юрлова Екатерина Ивановна "Механизмы влияния Т-кадгсрина на рост, мстастазмроваиие и васкуляризацшо меланомы"

Цель работы заключалась в выявлении возможных механизмов участия Т-кадгерина в росте, васкуляризации и метастазировании мышиной меланомы in vivo, а также в оценке его влияния на пролиферативные и инвазивные свойства клеток мышиной меланомы B16F10 in vitro и профиль экспрессии факторов, регулирующих ангиогенез, миграцию и инвазию in vitro. Обнаружено, что экспрессия Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы B16F10 приводит к увеличению пролифсративной активности клеток in vitro и стимуляции роста меланомы у мышей с увеличением зоны некроза первичного узла. Показано, что экспрессия Т-кадгерина коррелирует с подавлением неоваскуляризации меланомы, что проявляется в уменьшении числа прорастающих в опухоль сосудов различного диаметра. Ингибирующее влияние экспрессии Т-кадгерина на неоангиогенез в опухоли подтверждено на модели хориоаплантоисной мембраны куриного эмбриона. Обнаружено также, что экспрессия Т-кадгерина в клетках меланомы B16F10 приводит к увеличению количества С090-позитивных клеток в составе первичного узла in vivo, что коррелирует со стимуляцией миграции мезенхимальных стромальных клеток. Выявлено, что клетки мышиной меланомы B16F10 экспрессирующие Т-кадгерин, достоверно интенсивнее метастазируют in vivo и обладают более выраженным инвазивным потенциалом in vitro. Анализ профиля экспрессии хемокинов, а также факторов, регулирующих ангиогенез и адгезию показал, что в клетках мышиной меланомы B16F10, экспрессирующих Т-кадгерин, повышен уровень экспрессии ряда хемокинов, стимулирующих миграцию мезенхимальных стромальных клеток, проонкогенных интегринов и ингибиторов ангиогенеза. Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что Т-кадгерин участвует в регуляции роста, метастазирования и васкуляризации мышиной меланомы B16F10, проявляя свойства фактора прогрессии опухоли.

Yurlova Ekaterina Ivanovna "Mechanisms of the effect of T-cadherin on growth, metastasis and vascularization of melanoma"

The aim of the present study was to identify the possible mechanisms for the participation of Т-cadherin in the growth, vascularization and metastasis of murine melanoma B16F10 in vivo, as well as to assess the impact of T-cadherin on cell proliferation, the ability of melanoma cells for invasion in vitro and their expression profile of the factors that regulate angiogenesis, migration, and invasion in vitro. It was found that the expression of T-cadherin in melanoma cells leads to increased cell proliferation activity in vitro and the increase in the size of the primary nodule; however this was accompanied by increased necrotic cell death in vivo. It was shown that the expression of T-cadherin is correlated with the suppressed neovascularization of the primary melanoma resulting in a decrease in the number of tumor-penetrating blood vessels of different diameters. Inhibitory effect of T-cadherin on tumor angiogenesis was also confirmed using the model of chorioallantoic membrane of chick embryo. Also it was shown that T-cadherin expression in melanoma cells leads to an increase in the number of CD90-positive cells in the primary site in vivo, which correlates with the ability of T-cadherin expressing melanoma to stimulate the migration of mesenchymal stromal cells. In addition, it appeared that T-cadherin-expressins melanoma cells displayed increased metastatic potential in vivo and have more invasive potential in vitro compared with control cells. When analyzing the expression profile of chemokines, as well as factors that regulate angiogenesis and adhesion, it was found that T-cadherin-expressing melanoma cells exhibit elevated level of expression of several chemokines that stimulate migration of mesenchymal stromal cells, prooncogenic integrins and angiogenic inhibitors compared with control cells. Thus, we have shown that T-cadherin is involved in regulation of growth, metastasis and vascularization of murine melanoma act as tumor progression factor.

Подписано в печать:

03.11.2011

Заказ № 6194 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wvvvv.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юрлова, Екатерина Ивановна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура и функции кадгеринов.

1.2. ГФИ-заякоренные белки.

1.3. Т-кадгерин - атипичный представитель кадгеринов.

1.3.1. Роль Т-кадгерина в нейрогенезе

1.3.2. Роль Т-кадгерина в ангиогенезе.

1.3.3. Роль Т-кадгерина в онкогенезе

1.4. Рост и развитие сосудистой сети

1.5. Механизмы опухолевой прогрессии.

1.6. Меланома.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы влияния Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию меланомы"

Т-кадгерин - уникальный представитель суперсемейства кадгеринов. Изначально Т-кадгерин был клонирован из эмбрионального мозга цыплят [Ranscht В., Dours-Zimmermann М.Т., 1991]. Позднее был идентифицирован его гомолог у человека, названный кадгерин-13 [Tanihara Н. et al., 1994], а также была обнаружена экспрессия Т-кадгерина в различных органах и тканях взрослого организма. Максимальный уровень экспрессии Т-кадгерина был выявлен в сердечно-сосудистой [Ivanov D. et al., 2001] и нервной системах [Takeuchi Т. et al., 2000а].

Т-кадгерин не имеет трансмембранного и цитоплазматического доменов и не участвует в обеспечении прочной межклеточной адгезии в отличие от «классических» кадгеринов, а удерживается на плазматической мембране при помощи гликозилфосфатидилинозитольного (ГФИ) якоря [Ranscht В., Dours-Zimmermann М.Т., 1991]. Это свойство, а также локализация в липидных плотах [Doyle D.D. et al., 1998; Philippova M.P. et al., 1998], в местах сосредоточения многих сигнальных молекул (Src киназ, G белков) [Philippova M.P. et al., 1998], свидетельствует об участии Т-кадгерина во внутриклеточной сигнализации. Данное предположение также подтверждают данные об участии других ГФИ-заякоренных белков в активации внутриклеточной сигнализации, а именно, в мобилизации кальция и фосфорилировании тирозина, и регуляции таких процессов как пролиферация клеток и продукция лимфокинов [Fisher G.F. et al., 1990; Bohuslav J. et al., 1995; Airas L. et al., 1997].

Т-кадгерин является рецептором с навигационной функцией, регулирующей направленный рост нервов и сосудов к своим мишеням [Fredette B.J., Ranscht В., 1994; Fredette В J. et al., 1996; Rubina К. et al., 2007]. Было также отмечено, что уровень экспрессии Т-кадгерина повышается при ряде заболеваний, связанных с патологическим ростом сосудов [Kudrjashova

E. et al., 2002]. Исходя из этих данных, было сделано предположение, что Т-кадгерин может принимать участие в регуляции неоангиогенеза при опухолевом росте. Известно, что опухолевый неоангиогенез является важным фактором опухолевой прогрессии, который обеспечивает интернализацию метастазов и инвазивный путь распространения клеток. Подавление роста сосудов является одним из подходов при лечении онкологических заболеваний [Folkman J., 1971; Folkman J., 2008]. Роль T-кадгерина в регуляции неоангиогенеза на этапе прогрессии опухолевого процесса в настоящее время практически не изучена. Кроме того, данные о роли Т-кадгерина в опухолевом росте и метастазировании противоречивы. Так, на клетках карциномы, глиомы и нейробластомы обнаружено снижение пролиферативной и инвазивной способности опухолевых клеток, трансфицированных кДНК Т-кадгерина [Lee S.W., 1996; Takeuchi Т. et al., 2000а; Huang Z.Y. et al., 2003; Mukoyama Y. et aL, 2005]. Было также показано, что экспрессия Т-кадгерина может исчезать при злокачественной трансформации некоторых клеток. Так, снижение или полное отсутствие экспрессии Т-кадгерина было обнаружено в 80% клеточных линий меланомы человека, в то время как Т-кадгерин экспрессируется в нормальных меланоцитах человека [Kuphal S. et al., 2009; Bosserhoff A.K. et al., 2011]. В то же время повышенный уровень экспрессии Т-кадгерина наблюдается в клеточной линии гепатоцеллголярной карциномы MAHLAVU [Riou P. et al., 2002; Riou P. et al., 2006], а также астроцитарных опухолях, гетерозиготных по гену нейрофиброматоз 1 или с инактивированным геном нейрофиброматоз 1 [Gutmann D.H. et al., 2001]. Экспрессия Т-кадгерина была обнаружена в эндотелиальных клетках сосудов, прорастающих в ткань различных ксенографтов опухолей человека: рака простаты человека РС-3, тератокарциномы F9 и рабдомиосаркомы А673 [Wyder L. et al., 2000]. На трансгенных мышах было показано, что инактивация Т-кадгерина приводит к подавлению роста и васкуляризации рака молочной железы [Hebbard L.W. et al., 2008].

На in vivo модели подкожной имплантации Матригеля с продуцирующими Т-кадгерин мышиными фибробластами линии L929 было показано, что в микроокружении имплантата создаётся высокое содержание Т-кадгерина, приводящее к ингибированию начальных этапов ангиогенеза при отсутствии влияния на созревание сосудов. Изучение механизма этого эффекта in vivo и in vitro выявило, что Т-кадгерин, не влияя на пролиферацию, адгезию и апоптоз эндотелиальных клеток, подавляет их миграцию. Таким образом, был сделан вывод, что Т-кадгерин является ингибитором ангиогенеза в системах in vivo и in vitro [Rubina К. et al., 2007].

Таким образом, выявление роли Т-кадгерина в запуске механизмов прогрессии опухолей, в частности, меланомы, сопряжённых с регуляцией неоангио- и васкулогенеза, является актуальным и позволит не только дополнить данные о значении опухолевого микроокружения, но и определить критические точки для подавления кровоснабжения на этапе опухолевой прогрессии. Исследование указанных механизмов является актуальной задачей также в плане поиска новых мишеней для "таргетного" противоопухолевого лечения.

Цель работы: выявить механизмы влияния Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию на примере метастазирующей мышиной меланомы in vitro/in vivo.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Научная новизна.

Впервые показано подавление неоангиогенеза in vivo в ткани экспрессирующей Т-кадгерин мышиной метастазирующей меланомы B16F10, сопряжённое с увеличением экспрессии специфических ингибиторов (CXCL 10, angiopoietin 2, procollagen type XVIII alpha 1, chromogranin А) и снижением экспрессии стимуляторов (TGFa и Tie-1) ангиогенеза.

Впервые установлено, что подавление неоваскуляризации меланомы B16F10, перевитой подкожно мышам-гибридам BDF1, проявляется в уменьшении количества прорастающих в первичный опухолевый узел сосудов среднего диаметра и капилляров.

Впервые в рамках последовательного исследования функциональных особенностей клеток in vitro и in vivo получены данные о достоверном усилении агрессивности экспрессирующих Т-кадгерин клеток мышиной метастазирующей меланомы B16F10.

Научно-практическая значимость.

В результате исследования механизма влияния Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию меланомы выявлены факторы, принимающие участие в регуляции злокачественного процесса. Эти факторы дополняют существующую систему знаний в области биохимии регуляторных белков, а также экспериментальной биологии меланомы -одной из наиболее сложных по биологическим характеристикам опухоли. Доказательство стимуляции различных проявлений прогрессии экспрессирующей Т-кадгерин метастазирующей меланомы, сопряжённое с выключением неоваскуляризации, позволяет рассматривать этот рецептор как возможную практическую мишень для противоопухолевой терапии.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Юрлова, Екатерина Ивановна

выводы

4. Клетки мышиной меланомы B16F10, экспрессирующие Т-кадгерин, вызывают усиление миграции стромальных клеток in vitro (р<0,05) и увеличение содержания С090-позитивных клеток активированной стромы в первичном подкожном опухолевом узле у мышей BDF1 in vivo (р<0,05).

6. Инвазивный потенциал in vitro и метастатический потенциал клеток мышиной метастазирующей меланомы B16F10 in vivo возрастают при экспрессии Т-кадгерина (р<0,05)

7. При экспрессии Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы происходит увеличение экспрессии факторов, вовлечённых в процесс инвазии и метастазирования: integrin а5, integrin аУ, integrin аЕ, integrin |33 и ММР14.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, суммируя полученные в работе результаты в виде схемы на рисунке 38, можно сделать вывод о том, что Т-кадгерин является важным регулятором прогрессии меланомы B16F10. Экспрессия Т-кадгерина приводит к увеличению пролиферативной активности клеток первичного узла меланомы. Кроме того, в экспрессирующих Т-кадгерин клетках также обнаружено увеличение экспрессии ингибиторов ангиогенеза и снижение экспрессии стимуляторов ангиогенеза, что приводит к подавлению неоангиогенеза в опухоли. Определенный вклад, по-видимому, в подавление неоангиогенеза в опухоли под влиянием экспрессии Т-кадгерина вносит показанный для Т-кадгерина ранее механизм контактного ингибирования прорастания сосудов в ткани, клетки которой экспрессируют Т-кадгерин. В результате из-за недостаточного кровоснабжения значительные участки опухоли подвергаются некрозу. Однако, экспрессия Т-кадгерина приводит к увеличению экспрессии клетками первичного узла меланомы ряда хемокинов. И при достижении достаточных размеров первичный узел становится очагом привлечения мезенхимальных стромальных клеток, приходящих в меланому по градиенту секретируемых меланомой хемокинов. Приходящие в опухоль мезенхимальные стромальные клетки под влиянием гипоксии секретируют НСЯ7, тем самым активируя сигнальный каскад с участием рецептора с-Ме1:, который гиперэкспрессирован в клетках меланомы под влиянием экспрессии Т-кадгерина. Запуск сигнального пути с-Ме1/НОР приводит к усилению пролиферации, инвазии и метастазирования меланомы. Дополнительный вклад в усиление инвазии и метастазирования вносит увеличение экспрессии в клетках меланомы проонкогенных интегринов и ММР14, вызванное также экспрессией Т-кадгерина.

Г-кадгерин метастазирование in vivo инвазия in vitro (за счёт усиления экспрессии ряда интегринов и запуска сигнального пути HGF/c-met) некроз in vivo неоангиогенез в опухоли in vivo 'за счёт секреции ингибиторов ангиогенеза)

Очаг некроза пролиферация in vitro рост первичного узла in vivo миграция мезенхимальных стромальных клеток in vivo и in vitro (за счёт секреции хемокинов)

Рисунок 38. Влияние Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию мышиной меланомы B16F10.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юрлова, Екатерина Ивановна, Москва

1. Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных. Основные принципы. Ланималогия. 1993; 1: 29.

2. Пожарисский К.М., Кудайбергенова А.Г., Леенман Е.Е. Патоморфологическая характеристика и особенности меланомы кожи. Прогностические факторы. Практическая онкология. 2001; 4 (8): 23-29.

3. Рубина К.А., Калинина Н.И., Парфёнова Е.В., Ткачук В.А. Т-кадгерин как рецептор, участвующий в регуляции ангиогенеза и ремоделирования кровеносных сосудов. Биологические мембраны. 2007; 24 (1): 65 72.

4. Abdel-Rahman М.Н., Born G., Massengill J., Salem M.M., Davidorf F.H. MET oncogene inhibition as a potential target of therapy for uveal melanomas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010; 51 (7): 3333-3339.

5. Adachi Y., Takeuchi Т., Nagayama Т., Furihata M. T-cadherin modulates tumor-associated molecules in gallbladder cancer cells. Cancer Invest. 2010; 28 (2): 120-126.

6. Ahn G.O., Brown J.M. Role of endothelial progenitors and other bone marrow-derived cells in the development of the tumor vasculature. Angiogenesis. 2009; 12 (2): 159-164.

7. Airas L., Niemela J., Salmi M., Puurunen Т., Smith D.J., Jalkanen S. Differential regulation and function of CD73, a glycosyl-phosphatidylinositol-linked 70-kD adhesion molecule, on lymphocytes and endothelial cells. J Cell Biol. 1997; 136 (2): 421-431.

8. Andreeva A.V., Kutuzov M.A. Cadherin 13 in cancer. Genes Chromosomes Cancer. 2010; 49 (9): 775-790.

9. Angiolillo A.L., Sgadari C., Taub D.D., Liao F., Farber J.M., Maheshwari S., Kleiman H.K., Reaman G.H., Tosato G. Human interferon-inducible protein 10 is a potent inhibitor of angiogenesis in vivo. J Exp Med. 1995; 182(1): 155-162.

10. Augello A., De Bari C. The regulation of differentiation in mesenchymal stem cells. Hum Gene Ther. 2010; 21 (10): 1226-1238.

11. Auguste P., Lemiere S., Larrieu-Lahargue F., Bikfalvi A. Molecular mechanisms of tumor vascularization. Crit Rev Oncol Hematol. 2005; 54 (1): 53-61.

12. Bagley R.G., Weber W., Rouleau C., Yao M., Honma N., Kataoka S., Ishida I., Roberts B.L., Teicher B.A. Human mesenchymal stem cells from bone marrow express tumor endothelial and stromal markers. Int J Oncol. 2009; 34(3): 619-627.

13. Bauer E.A., Uitto J., Walters R.C., Eisen A.Z. Enhanced collagenase production by fibroblasts derived from human basal cell carcinomas. Cancer Res. 1979; 39 (11): 4594-4599.

14. Berx G., Van Roy F. The E-cadherin/catenin complex: an important gatekeeper in breast cancer tumorigenesis and malignant progression. Breast Cancer Res. 2001; 3 (5): 289-293.

15. Blaschuk O.W., Rowlands T.M. Cadherins as modulators of angiogenesis and the structural integrity of blood vessels. Cancer and Metastasis Reviews. 2000; 19 (1-2): 1-5.

16. Blaschuk O.W., Sullivan R., David S., Pouliot Y. Identification of a Cadherin cell adhesion recognition sequence. Dev Biol. 1990; 139 (1): 227-229.

17. Bodnar R.J., Yates C.C., Wells A. IP-10 Blocks Vascular endothelial growth factor-induced endothelial cell motility and tube formation via inhibition of calpain. Circulation Research. 2006; 98 (5): 617-625.

18. Boiler K., Vestweber D., Kemler R. Cell-adhesion molecule uvomorulin is localized in the intermediate junctions of adult intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 1985; 100 (1): 327-332.

19. Bosserhoff A.K., Ellmann L., Kuphal S. Melanoblasts in culture as an in vitro system to determine molecular changes in melanoma. Exp Dermatol. 2011; 20 (5): 435-440.

20. Brakenhielm E,, Veitonmaki N., Cao R., Kihara S., Matsuzawa Y., Zhivotovsky B., Funahashi T., Cao Y. Adiponectin-induced antiangiogenesis and antitumor activity involve caspase-mediated endothelial cell apoptosis. PNAS. 2004; 101 (8): 2476-2481.

21. Braverman I.M., Sibley J. Role of the microcirculation in the treatment and pathogenesis of psoriasis. J Invest Dermatol. 1982; 78 (1): 1217.

22. Breier G., Albrecht U., Sterrer S., Risau W. Expression of vascular endothelial growth factor during embryonic angiogenesis and endothelial cell differentiation. Development. 1992; 114 (2): 521-532.

23. Bremnes R.M., Veve R., Hirsch F.R., Franklin W.A. The E-cadherin cell-cell adhesion complex and lung cancer invasion, metastasis and prognosis. Lung Cancer. 2002; 36 (2): 115-124.

24. Bretscher M.S., Thompson J.N., Pearse B.M.F. Coated pits act as molecular filters. Proc Natl Acad Sci USA. 1980; 77 (7): 4156-4159.

25. Bromhead C., Miller J.H., McDonald F.J. Regulation of T-cadherin by hormones, glucocorticoid and EGF. Gene. 2006; 374: 58-67.

26. Brown D.A., Rose J.K. Sorting of GPI-anchored proteins to glylipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 1992; 68 (3): 533-544.

27. Brown D., Waneck G.L. Glycosyl-phosphatidylinositol-anchored membrane proteins. J Am Soc Nephrol. 1992; 3 (4): 895-906.

28. Brown M.S., Goldstein J.L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science (Washington D.C.). 1986; 232 (4746): 3447.

29. Biihler F.R., Tkachuk V.A., Hahn A.W.A.M., Resink T.J. Low and high density lipoproteins as hormonal regulators of platelet, vascular endothelial and smooth muscle cells interactions: relevance to hypertension. J Hypertension. 1991; 9 (6): 28-36.

30. Cai X.S., Jia Y.W., Mei J., Tang R.Y. Tumor blood vessels formation in osteosarcoma: vasculogenesis mimicry. Chin Med J (Engl). 2004; 117(1): 94-98.

31. Cao Y. Tumor angiogenesis and molecular targets for therapy. Front Biosci. 2009; 14: 3962-3973.

32. Carmeliet P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 2005; 438 (7070): 932-936.

33. Carmeliet P., Jain R.K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 2011; 473 (7347): 298-307.

34. Carmeliet P., Lampugnani M.G., Moons L., Brevario F., Compernolle V., Bono F., Balconi G., Spagnuolo R., Oosthuyse B.,

35. Chan D.W., Lee J.M., Chan P.C., Ng I.O. Genetic and epigenetic inactivation of T-cadherin in human hepatocellular carcinoma cellslnt J Cancer. 2008; 12 (5): 1043-1052.

36. Clapp C., Martial J.A., Guzman R.C., Rentier-Delure F., Weiner RI. The 16-kilodalton N-terminal fragment of human prolactin is a potent inhibitor of angiogenesis. Endocrinology. 1993; 133 (3): 1292-1299.

37. Clark W.H. Tumour progression and the nature of cancer. Br J Cancer. 1991; 64 (4): 631-644.

38. Clark W.H., Goldman L.I., Mastrangelo M.J. Human Malignant melanoma. New York a. o.: Grune and Strtion. 1979; 509.

39. Coate T.M., Swanson T.L., Copenhaver P.F. Reverse signaling by glycosylphosphatidylinositol-linked Manduca ephrin requires a SRC family kinase to restrict neuronal migration in vivo. J Neurosci. 2009; 29 (11): 3404-3418.

40. Connoly D.T., Heuvelman D.M., Nelson R., Olander J.V., Eppley B.L., Delfmo J.J., Siegel N.R., Leimgruber R.M., Feder J. Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angiogenesis. J Clin Invest. 1989; 84 (5): 1470-1478.

41. Cross G.A. Glycolipid anchoring of plasma membrane proteins. AnnuRev. Cell Biol. 1990; 6: 1-39.

42. Davitz M.A., Horn J., Schenkman S. Purification of a glycosyl-phosphatidylinositol-specific phospholipase D from human plasma. J Biol Chem. 1989; 264 (23): 13760-13764.

43. Deindl E., Schaper W. The art of arteriogenesis. Cell Biochem Biophys. 2005; 43 (1): 1-15.

44. Demir R., Yaba A., Huppertz B. Vasculogenesis and angiogenesis in the endometrium during menstrual cycle and implantation. Acta Histochem. 2010; 112 (3): 203-214.

45. Detmar M., Brown L.F., Claffey K.P., Yeo K.T., Kocher O., Jackman R.W., Berse B., Dvorak H.F. Overexpression of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor and its receptors in psoriasis. J Exp Med. 1994; 180 (3): 1141-1146.

46. Distler J.H., Hirth A., Kurowska-Stolarska M, Gay R.E., Gay S., Distler O. Angiogenic and angiostatic factors in then molecular control of angiogenesis. Q J Nucl Med. 2003; 47 (3): 149-161.

47. Drivalos A., Papatsoris A.G., Chrisofos M., Efstathiou E., Dimopoulos M.A. The role of the cell adhesion molecules (integrins/cadherins) in prostate cancer. Int Braz J Urol. 2011; 37 (3): 302306.

48. Du J., Miller A.J., Widlund H.R., Horstmann M.A., Ramaswamy S., Fisher D.E. Mlana/martl and Silv/pMell7/gpl00 are transcriptionally regulated by Mitf in melanocytes and melanoma. Am. J. Pathol. 2003; 163 (1): 333-343.

49. Dvorak H.F. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a critical cytokine in tumor angiogenesis and potential target for diagnosis and therapy. J Clin Oncol. 2002; 20 (21): 4368-4380.

50. Efimenko A.Iu., Starostina E.E., Rubina K.A., Kalinina N.I., Parfenova E.V. Viability and angiogenic activity of mesenchymal stromal cells from adipose tissue and bone marrow in hypoxia and inflammation in vitro. Tsitologia. 2010; 52 (2): 144-154.

51. Eisenhaber B., Bork P., Eisenhaber F. Post-translational GPI lipid anchor modification of proteins in kingdoms of life: analysis of protein sequence data from complete genomes. Protein Eng. 2001; 14 (1): 17-25.

52. Esser S., Lampugnani M.G., Corada M., Dejana E., Risau W. Vascular endothelial growth factor induces VE-cadherin tyrosine phosphorylation in endothelial cells. J. Cell Sci. 1998; 111 (Pt 13): 18531865.

53. Fang S., Salven P. Stem cells in tumor angiogenesis. J Mol Cell Cardiol. 2011; 50 (2): 290-295.

54. Ferrara N., Chen H., Davis-Smyth T., Gerber H.P., Nguyen T.N., Peers D., Chisholm V., Hillan K.J., Schwall R.H. Vascular endothelial growth factor is essential for corpus luteum angiogenesis. Nat Med. 1998; 4 (3): 336-340.

55. Filardo E.J., Brooks P.C., Deming S.L., Damsky C., Cheresh D.A. Requirement of the NPXY motif in the integrin beta 3 subunit cytoplsmic tail for melanoma cell migration in vitro ad in vivo. J Cell Biol. 1995; 130 (2): 441-450.

56. Fischer G.F., Majdic O., Gadd S., Knapp W. Signal transduction in lymphocytic and myeloid cells via CD24, a new member of phosphoinositol-anchored membrane molecules. J Immunol. 1990; 144 (2): 638-641.

57. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implication. N Engl J Med. 1971; 285 (21): 1182-1186.

58. Folkman J. The role of angiogenesis in tumor growth. Semin Cancer Biol. 1992; 3 (2): 65-71.

59. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med. 1995; 1 (1): 27-31.

60. Folkman J. Tumor Angiogenesis: from Bench to Bedside. In: Tumor Angiogenesis. Basic Mechanisms and Cancer Therapy. Marme D., Fusenig N. Springer. 2008: 3-28.

61. Folkman J., D'Amore P.A. Blood vessel formation: what is its molecular basis? Cell. 1996; 87 (7): 1153-1155.

62. Folkman J., Klagsbrum M. Angiogenic factors. Science. 1987; 235 (4787): 442-447.

63. Frater-Schroder M., Risau W., Hallmann R., Gautschi P., Bohlen P. Tumor necrosis factor type alpha, a potent inhibitor of endothelial cell growth in vitro, is angiogenic in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 1987; 84 (15): 5277-5281.

64. Fredette B.J., Miller J., Ranscht B. Inhibition of motor axon growth by T-cadherin substrata. Development. 1996; 122 (10): 3163-3171.

65. Fredette B.J., Ranscht B. T-cadherin expression delineates specific regions of the developing motor axon-hindlimb projection pathway. J Neurosci. 1994; 14 (12): 7331-7346.

66. Gabri M.R., Mazorra Z., Ripoll G.V., Mesa C., Fernandez L.E., Gomez D.E., Alonso D.F. Complete antitumor protection by perioperative immunization with GM3/VSSP vaccine in a preclinical mouse melanoma model. Clin Cancer Res. 2006; 12 (23): 7092-7098.

67. Gardlik R., Celec P., Bernadic M. Targeting angiogenesis for cancer (gene) therapyBratisl Lek Listy. 2011; 112 (8): 428-434.

68. Ghossein R.A., Coit D., Brennan M., Zhang Z.F., Wang Y., Bhattacharya S., Houghton A., Rosai J. Prognostic significance of peripheralblood and bone marrow tyrosinase messenger RNA in malignant melanoma. Clin Cancer Res. 1998; 4 (2): 419-428.

69. Goldstein J.L., Brown M.S., Anderson R.G., Russel D.W., Schneider W.J. Receptor-mediated endocytosis: Concept emerging from the LDL receptor system. Annu Rev Cell Biol. 1985; 1: 1-39.

70. Gomes D.A., Rodrigues M.A., Leite M.F., Gomez M.V., Varnai P., Balla T., Bennett A.M., Nathanson M.H. c-Met must translocate to the nucleus to initiate calcium signals. J Biol Chem. 2008; 283(7): 4344-4351.

71. Goubaeva F., Giardina S., Yiu K., Parfyonova E., Tkachuk V.A., Yang J. T-cadherin GPI-anchor is insufficient for apical targeting in MDCK cells. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 329 (2): 624-631.

72. Gradilone A., Cigna E., Agliand A.M., Frati L. Tyrosinase expression as a molecular marker for investigating the presence of circulating tumor cells in melanoma patients. Curr Cancer Drug Targets. 2010; 10(5): 529-538.

73. Guo T.L., McCay J.A., Zhang L.X., Brown R.D., You L., Karrow N.A., Germolec D.R., White K.L. Jr. Genistein modulates immune responses and increases host resistance to B16F10 tumor in adult female B6C3F1 mice. J of nutrition. 2001; 131 (12): 3251-3258.

74. Halaban R., Rubin J.S., White W. met and HGF-SF in normal melanocytes and melanoma cells. EXS. 1993; 65: 329-339.

75. Hanahan D. Signaling vascular morphogenesis and maintenance. Science. 1997; 277 (5322): 48-50.

76. Hatta K.5 Nose A., Nagafuchi A., Takeichi M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J Cell Biol. 1988; 106 (3): 873-881.

77. Hatta K., Takeichi M. Expression of N-cadherin adhesion molecules associated with early morphogenetic events in chick development. Nature. 1986; 320 (6061): 447-449.

78. Hazan R.B., Kang L., Whooley B.P., Borgen P.I. N-cadherin promotes adhesion between invasive breast cancer cells and the stroma. Cell Adhes Commun. 1997; 4 (6): 399-411.

79. Hazan R.B., Phillips G.R., Qiao R.F., Norton L., Aaronson S.A. Exogenous expression of N-cadherin in breast cancer cells induces cell migration, invasion, and metastasis. J Cell Biol. 2000; 148 (4): 779-790.

80. Hazan R.B., Qiao R.F., Keren R., Badano I., Suyama K. Cadherin switch in tumor progression. Ann N Y Acad Sci. 2004; 1014: 155163.

81. Hebbard L.W., Garlatti M., Young LJ., Cardiff R.D., Oshima R.G., Ranscht B. T-cadherin supports angiogenesis and adiponectin association with the vasculature in a mouse mammary tumor model. Cancer Res. 2008; 68 (5): 1407-1416.

82. Heil M., Eitenmuller I., Schmitz-Rixen T., Schaper W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. J Cell Mol Med. 2006; 10(1): 45-55.

83. Hirschi K.K., D'Amore P.A. Pericytes in microvasculature. Cardiovascular Res. 1996; 32 (4): 687-698.

84. Holash J., Wiegand S.J., Yancopoulos G.D. New model of tumor angiogenesis: dynamic balance between vessel regression and growth mediated by angiopoietins and VEGF. Oncogene. 1999; 18 (38): 5356-5362.

85. Holmgren L., O'Reilly M.S., Folkman J. Dormancy of micrometastases: balance proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression. Nat. Med. 1995; 1 (2): 149-153

86. Hotary K.B., Allen E.D., Brooks P.C., Datta N.S., Long M.W., Weiss S.J. Membrane type I matrix metalloproteinase usurps tumor growth control imposed by the three-dimensional extracellular matrix. Cell 2003;.l 14 (1): 33-45.

87. Houck K.A., Leung D.W., Rowland A.M., Winer J., Ferrara N. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisma. J Biol Chem. 1992; 267 (36): 2603126037.

88. Hsu M.Y., Wheelock M.J., Johnson K.R., Herlyn M. Shifts in cadherin profiles between human normal melanocytes and melanomas. J Invest Dermatol SympProc. 1996; 1 (2): 188-194.

89. Huang Z.Y., Wu Y., Hedrick N., Gutmann D.H. T-cadherin-mediated cell growth regulation involves G2 phase arrest and requires p21 (CIP1/WAF1) expression. Mol Cell Biol. 2003; 23 (2): 566-578.

90. Hug C., Wang J., Shezheen Ahmad N.S., Bogan J., Tsao T., Lodish H.F. T-cadherin is a receptor for hexameric and high-molecularweight forms of Acrp30/adiponectin. Proc Natl Acad Sci. U.S.A. 2004; 101 (28): 10308-10313.

91. Humburger V., Hamilton H.L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 1951; 88 (1): 49-92.

92. Hunter K.W., Crawford N.P.S., Alsarraj J. Mechanisms of metastasis. Breast Cancer Research. 2008; 10 (Suppl 1): 1-10.

93. Hwang R.F., Moore T., Arumugam T., Ramachandran V., Amos K.D., Rivera A., Ji B., Evans D.B., Logsdon C.D. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Res. 2008; 68 (3): 918-926.

94. Hyafil F., Babinet C., Jacob F. Cell-cell interaction in early embryogenesis: a molecular approach to the role of calcium. Cell. 1981; 26 (3 Pt 1): 447-454.

95. Ito H. Chemokines in mesenchymal stem cell therapy for bone repair: a novel concept of recruiting mesenchymal stem cells and the possible cell sources. Mod Rheumatol. 2011; 21 (2): 113-121.

96. Ivanov D., Philippova M., Antropova J., Gubaeva F., Iljinskaya O., Tararak E., Bochkov V., Erne P., Resink T., Tkachuk V. Expression of cell adhesion molecule T-cadherin in the human vasculature. Histochem Cell Biol. 2001; 115 (3): 231-242.

97. Johnson M.D., Kim H.R., Chesler L., Tsao-Wu G., Bouck N., Polverini P.J. Inhibition of angiogenesis by tissue inhibitor of metalloproteinase. J Cell Physiol. 1994; 160 (1): 194-202.

98. Joo Y.E., Rew J.S., Park C.S., Kim S.J. Expression of E-cadherin, alpha- and beta-catenins in patient with pancreatic adenocarcinoma. Pancreatology. 2002; 2 (2): 129-137.

99. Joshi M.B., Ivanov D., Philippova M., Erne P., Resink T.J. Integrin-linked kinase is an essential mediator for T-cadherin-dependentsignaling via Akt and GSK3beta in endothelial cells. FASEB J. 2007; 21 (12): 3083-3095.

100. Joshi M.B., Philippova M., Ivanov D., Allenspach R., Erne P., Resink T.J. T-cadherin protects endothelial cells from oxidative stress-induced apoptosis. FASEB J. 2005; 19 (12): 1737-1739.

101. Jung Y.D., Ahmad S.A., Akagi Y., Takahashi Y., Liu W., Reinmuth N., Shaheen R.M., Fan F., Ellis L.M. Role of the tumor microenvironment in mediating response to anti-angiogenic therapy. Cancer Metastasis Rev. 2000; 19(1-2): 147-157.

102. Kassmeyer S., Plendl J., Custodis P., Bahramsoltani M. New insights in vascular development: vasculogenesis and endothelial progenitor cells. Anat Histol Embryol. 2009; 38 (1): 1-11.

103. Kelley J.L., Rozek S., Seuenram C.A., Schwartz C.J. Activation of human peripheral monocytes by lipoproteins. Am J Pathol. 1988; 130 (2): 223-231.

104. Klopp A.H., Gupta A., Spaeth E., Andreeff M., Marini F 3rd. Concise review: Dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth? Stem Cells. 2011; 29 (1): 11-19.

105. Knorr M., Locher E., Vogt W., Block F., Ferracin H., Levkovits H., Pletcher A. Rapid activation of human platelets by low concentrations of low density lipoprotein via phosphatidylinositol cycle. Eur J Biochem. 1988; 172 (3): 753-759.

106. Knudson W., Biswas C., Toole B.P. Stimulation of glycosaminoglycan production in murine tumors. J Cell Biochem. 1984; 25 (4): 183-196.

107. Koch A.E., Polverini P.J., Kunkel S.L., Harlow L.A., DiPietro L.A., Einer V.M., Einer S.G., Strieter R.M. Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis. Science. 1992; 258 (5089): 1798-1801.

108. Koller E., Ranscht B. Differential targeting of T- and N-cadherin in polarized epithelial cells. J. Biol. Chem. 1996; 271 (47): 3006130067.

109. Kondratiev S., Gnepp D.R., Yakirevich E., Sabo E., Annino DJ., Rebeiz E., Laver N.V. Expression and prognostic role of MMP2, MMP9, MMP13, and MMP14 matrix metalloproteinases in sinonasal and oral malignant melanomas. Hum Pathol. 2008; 39 (3): 337-343.

110. Korhonen J., Polvi A., Partanen J., Alitalo K. The mouse Tie receptor tyrosine kinase gene: expression during embryonic angiogenesis. Oncogene. 1994; 9 (2): 395^103.

111. Kotb A.M., Hierholzer A., Kemler R. Replacement of E-cadherin by N-cadherin in the mammary gland leads to fibrocystic changes and tumor formation. Breast Cancer Res. 2011; 13(5): R104.

112. Kreizenbeck G.M., Berger A.J., Subtil A., Rimm D.L., Gould Rothberg B.E. Prognostic significance of cadherin-based adhesion molecules in cutaneous malignant melanoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008; 17(4): 949-958.

113. Kuphal S., Martyn A.C., Pedley J., Crowther L.M., Bonazzi V.F., Parsons P.G., Bosserhoff A.K., Hayward N.K., Boyle G.M. H-cadherin expression reduces invasion of malignant melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 2009; 22 (3): 296-306.

114. Lee S.W. H-cadherin, a novel cadherin with growth inhibitory functions and diminished expression in human breast cancer. Nature Medicine. 1996; 2 (7): 229-235.

115. Lee Y.J., Kim D.H., Lee S.H., Kim D.W., Nam H.S., Cho M.K. Expression of the c-Met Proteins in Malignant Skin Cancers. Ann Dermatol. 2011; 23 (1): 33-38.

116. Leker R.R., Toth Z.E., Shahar T., Cassiani-Ingoni R., Szalayova I., Key S., Bratincsak A., Mezey E. Transforming growth factor alpha induces angiogenesis and neurogenesis following stroke. Neuroscience. 2009; 163 (1): 233-243.

117. Lemansky P., Fatemi S.H., Gorican B., Meyale S., Rossero R., Tartakoff A.M. Dynamics and longevity of the glycolipid-anchored membrane protein, Thy-1. J Cell Biol. 1990; 110 (5): 1525-1531.

118. Leung D.W., Cachianes G., Kuang W.J., Goeddel D.V., Ferrara N. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science. 1989; 246 (4935): 1306-1309.

119. Li G., Satyamoorthy K., Herlyn M. N-cadherin-mediated intercellular interactions promote survival and migration of melanoma cells. Cancer Res. 2001; 61 (9): 3819-3825.

120. Lisanti M.P., Caras I.W., Gilbert T., Hanzel D., Rodriguez-Boulan E. Vectorial apical delivery and slow endocytosis of a glycolipid-anchored fusion protein in transfected MDCK cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87(19): 7419-7423.

121. Lisanti M.P., Sargiacomo M., Graeve L., Saltiel A.R., Rodriguez-Boulan E, Polarized apical distribution of glycosyl-phosphatidylinositol-anchored proteins in a renal epithelial cell line. Proc Natl Acad Sci USA. 1988; 85 (24): 9557-9561.

122. Liu Z., Li Y., Zhao W., Ma Y., Yang X. Demonstration of vasculogenic mimicry in astrocytomas and effects of Endostar on U251 cells. Pathol Res Pract. 2011; 207 (10): 645-651.

123. Low M. Biochemistry of the glycosyl-phosphatidylinositol membrane protein anchor. Biochem. J. 1987; 244 (1): 1-13.

124. Low M.G. The glycosyl-phosphatidylinositol: a versatile anchor for cell surface proteins. FASEB J. 1989; 3 (5): 1600-1608.

125. Low M.G., Huang K.S. Factors affecting the ability of glycosyl-phosphatidylinositol-specific phospholipase D to degrade the membrane anchors of cell surface protein. Biochem J. 1991; 279 (Pt 2): 483-493.

126. Low M.G., Stiernberg J., Waneck G.L., Flavell R.A., Kincaide P.W. Cell specific heterogeneity in sensitivity of phosphatidylinositol-anchored membrane antigens to release by phospholipase C. Immunol Methods. 1988; 113 (1): 101-111.

127. Maione T.E., Gray G.S., Petro J., Hunt A.J., Donner A.L., Bauer S.I. Carson H.F. Sharpe R.J. Inhibition of angiogenesis by recombinant human platelet factor-4 and related peptides. Science. 1990; 247 (4938): 7779.

128. Marrelli A., Cipriani P., Liakouli V., Carubbi F., Perricone C., Perricone R., Giacomelli R. Angiogenesis in rheumatoid arthritis: a diseasespecific process or a common response to chronic inflammation? Autoimmun Rev. 2011; 10 (10): 595-598.

129. Matsumoto K., Tajima H., Nakamura T. Hepatocyte growth factor is potent stimulator of human melanocyte DNA synthesis and growth. Biochem Biophys Res Commun 1991; 176 (1): 45-51.

130. Matsuyoshi N., Imamura S. Multiple cadherins are expressed in human fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 1997; 235 (2): 355-358.

131. Matsuzaki Y., Hashimoto S., Fujita T., Suzuki T., Sakurai T., Matsushima K., Kawakami Y. Systematic identification of human melanoma antigens using serial analysis of gene expression (SAGE). J Immunother. 2005; 28(1): 10-19.

132. Matteucci E., Bendinelli P., Desiderio M.A. Nuclear localization of active HGF receptor Met in aggressive MDA-MB231 breast carcinoma cells. Carcinogenesis. 2009; 30(6): 937-945.

133. Mayor S., Riezman H. Sorting GPI-anchored proteins. Mol Cell Biol. 2004; 5 (2): 110-120.

134. McAuslan B.R., Bender V., Reilly W., Moss B.A. New functions of epidermal growth factor: stimulation of capillary endothelial cell migration and matrix dependent proliferation. Cell Biol Int Rep. 1985; 9 (2): 175-182.

135. McConville M.J., Ferguson M.A. The structure, biosynthesis and function of glycosylated phosphatidylinositols in the parasitic protozoa and higher eukaryotes. Biochem J. 1993; 294 (Pt 2): 305-324.

136. McDonald D.M., Foss A.J. Endothelial cells of tumor vessels: abnormal but not absent. Cancer Metastasis Rev. 2000; 19 (1-2): 109-120.

137. Mukoyama Y., Utani A., Matsui S., Zhou S., Miyachi Y., Matsuyoshi N. T-cadherin enhances cell-matrix adhesiveness by regulating betal integrin trafficking in cutaneous squamous carcinoma cells. Genes Cells. 2007; 12 (6): 787-796.

138. Mukoyama Y., Zhou S., Miyachi Y., Matsuyoshi N. T-cadherin negatively regulates the proliferation of cutaneous squamous carcinoma cells. J Invest Dermatol. 2005; 124 (4): 833-838.

139. Miiller A., Kloppel C., Smith-Valentine M., Van Houten .J, Simon M. Selective and programmed cleavage of GPI-anchored proteins from the surface membrane by phospholipase C. Biochim Biophys Acta. 2011; in press.

140. Muthukkaruppan V.R., Kubai L., Auerbach R. Tumor-induced neovascularization in the mouse eye. J Natl Cancer Inst. 1982; 69 (3): 699708.

141. Nagar B., Overduin M., Ikura M., Rini J.M. Structural basis of calcium-induced E-cadherin rigidification and dimerization. Nature. 1996; 380 (6572): 360-364.

142. Nieman M.T., Prudoff R.S., Johnson K.R., Wheelock M.J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 1999; 147 (3): 631-643.

143. Nollet F., Kools P., van Roy F. Phylogenetic analysis of the cadherin superfamily allows identification of six major subfamilies besides several solitary members. J Mol Biol. 2000; 299 (3): 551-572.

144. Nose A., Tsuji K., Takeichi M. Localization of specificity determining sites in cadherin cell adhesion molecules. Cell. 1990; 61 (1): 147155.

145. Ogama Y., Ouchida M., Yoshino T., Ito S., Takimoto H., Shiote Y., Ishimaru F., Harada M., Tanimoto M., Shimizu K. Prevalent hyper-methylation of the CDH13 gene promoter in malignant B cell lymphomas. Int J Oncol. 2004; 25 (3): 685-691.

146. O'Reilly M.S., Boehm T., Shing Y., Fukai N., Yasios G., Lane W.S., Flynn E., Birkhead J.R., Olsen B.R., Folkman J. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumour growth. Cell. 1997; 88 (2): 277-285.

147. Ouchi N., Kihara S., Arita Y., Nishida M., Matsuyama A., Okamoto Y., Ishigami M., Kuriyama H., Kishida K., Nishizawa H., Hotta K.,

148. Ozawa M., Ringwald M., Kemler R. Uvomorulin-catenin complex formation is regulated by a specific domain in the cytoplasmic region of the cell adhesion molecule. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87 (11): 4246-4250.

149. Parangi S., O'Reilly M., Christofori G., Holmgren L., Grosfeld J., Folkman J., Hanahan D. Angiogenesis therapy of transgenic mice impairs de novo tumor growth. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93 (5): 2002-2007.

150. Persson A.B., Buschmann I.R. Vascular growth in health and disease. Front Mol Neurosci. 2011; 4: 14.

151. Peyrieras N., Hyafil F., Louvard D., Ploegh H. L., Jacob F. Uvomorulin: a nonintegral membrane protein of early mouse embryo. Proc Nat Acad Sci. USA. 1983; 80 (20): 6274-6277.

152. Philippova M., Banfi A., Ivanov D., Gianni-Barrera R., Allenspach R., Erne P., Resink T. Atypical GPI-anchored T-cadherin stimulates angiogenesis in vitro and in vivo. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2006; 26(10): 2222-2230.

153. Philippova M.P., Bochkov V.N., Stambolsky D.V., Tkachuk V.A., Resink T.J. T-cadherin and signal-transducing molecules co-localize in caveolin-rich membrane domains of vascular smooth muscle cells. FEBS Lett. 1998; 429 (2): 207-210.

154. Philippova M., Ivanov D., Tkachuk V., Erne P., Resink T.J. Polarisation of T-cadherin to the leading edge of migrating vascular cells in vitro: a function in vascular cell motility? Histochem Cell Biol. 2003; 120 (5): 353-360.

155. Philippova M., Joshi M.B., Kyriakakis E., Pfaff D., Erne P., Resink T.J. A guide and guard: the many faces of T-cadherin. Cell Signal. 2009; 21 (7): 1035-1044.

156. Philippova M., Suter Y., Toggweiler S., Schoenenberger A.W., Joshi M.B., Kyriakakis E., Erne P., Resink T.J. T-cadherin is present on endothelial microparticles and is elevated in plasma in early atherosclerosis. Eur Heart J. 2011; 32 (6): 760-771.

157. Pinon P., Wehrle-Haller B. Integrins: versatile receptors controlling melanocyte adhesion, migration and proliferation. Pigment Cell Melanoma Res. 2011; 24 (2): 282-294.

158. Pisacane A.M., Picciotto F., Risio M. CD31 and CD34 expression as immunohistochemical markers of endothelial transdifferentiation in human cutaneous melanoma. Cell Oncol. 2007; 29 (1): 59-66.

159. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999; 284 (5411): 143-147.

160. Puig B., Altmeppen H.C., Thurm D., Geissen M., Conrad C., Braulke T., Glatzel M. N-glycans and glycosylphosphatidylinositol-anchor act on polarized sorting of mouse PrP(C) in Madin-Darby canine kidney cells. PLoS One. 2011; 6 (9): e24624.

161. Qian F., Zhang Z.C., Wu X.F., Li Y.P., Xu Q. Interaction between integrin a5 and fibronectin is required for metastasis of B16F10 melanoma cells. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 333 (4): 1269-1275.

162. Radice G.L., Rayburn H., Matsunami H., Knudsen K.A., Takeichi M., Hynes R.O. Developmental defects in mouse embryos lacking N-cadherin. DevBiol. 1997; 181 (1): 64-78.

163. Rafii S., Lyden D., Benezra R., Hattori K., Heissing B. Vascular and haematopoietic cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy? Nat Rev Cancer. 2002; 2 (11): 826-835.

164. Rahimi N., Kazlauskas A. A role for cadherin-5 in regulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 activity in endothelial cells. Mol Biol Cell. 1999; 10 (10): 3401-3407.

165. Ranscht B., Bronner-Fraser M. T-cadherin expression alternates with migrating neural crest cells in the trunk of the avian embryo. Development. 1991; 111 (1): 15-22.

166. Ranscht B., Dours-Zimmermann M.T. T-cadherin, a novel cadherin cell adhesion molecule in the nervous system lacks the conserved cytoplasmic region. Neuron. 1991; 7(3): 391-402.

167. Rasmussen A.A., Cullen K.J. Paracrine/autocrine regulation of breast cancer by the insulin-like growth factors. Breast Cancer Res Treat. 1998; 47 (3): 219-233.

168. Ren J.Z., Huo J.R. Correlation between T-cadherin gene expression and aberrant methylation of T-cadherin promoter in human colon carcinoma cells. Med Oncol. 2011; in press.

169. Ribatti D. The involvement of endothelial progenitor cells in tumor angiogenesis. J Cell Mol Med. 2004; 8 (3): 294-300.

170. Ribatti D., Vacca A., Nico B., Roncali L., Dammacco F. Postnatal vasculogenesis. MechDev. 2001; 100 (2): 157-163.

171. Riou P., Saffroy R., Chenailler C., Franc B., Gentile C., Rubinstein E., Resink T., Debuire B., Piatier-Tonneau D., Lemoine A.

172. Expression of T-cadherin in tumor cells influences invasive potential of human hepatocellular carcinoma. FASEB J. 2006; 20 (13): 2291-2301.

173. Roberts W.G., Palade G.E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Res. 1997; 57 (4): 765-772.

174. Robinson P.J. Signal transduction by GPI-anchored membrane proteins. Cell Biol Int Rep. 1991; 15 (9): 761-767.

175. Rollins B.J. Chemokines. Blood. 1997; 90 (3): 909-928.

176. Rosen C.L., Lisanti M.P., Salzer J.L. Expression of unique sets of GPI-linked proteins by different primary neurons in vitro. J Cell Biol. 1992; 117(3): 617-627.

177. Rosen E.M., Grant D.S., Kleinman H.K., Goldberg I.D., Bhargava M.M., Nickoloff B.J., Kinsella J.L., Polverini P. Scatter factorhepatocyte growth factor) is a potent angiogenesis factor in vivo. Symp Soc Exp Boil. 1993;47:227-234.

178. Rossi D., Zlotnik A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 2000; 18: 217-242

179. Rubina K., Kalinina N., Potekhina A., Efimenko A., Semina E., Poliakov A., Wilkinson D.G., Parfyonova Ye., Tkachuk V. T-cadherin suppresses angiogenesis in vivo by inhibiting migration of endothelial cells. Angiogenesis. 2007; 10 (3): 183-195.

180. Sachindis A., Mengden R., Locher R., Brunner C., Vetter W. Novel cellular activities for low density lipoprotein in vascular smooth muscle cells. Hypertension (Dallas). 1990; 15 (6 Pt 2): 704-711.

181. Saffell J.L., Doherty P., Tiveron M.C., Morris R.J., Walsh F.S. NCAM requires a cytoplasmic domain to function as a neurite outgrowth-promoting neuronal receptor. Mol Cell Neurosci. 1995; 6 (6): 521-531.

182. Sakai M., Hibi K., Koshikawa K., Inoue S., Takeda S., Kaneko T., Nakao A. Frequent promoter methylation and gene silencing of CDH13 in pancreatic cancer. Cancer Sci. 2004; 95 (7): 588-591.

183. Salomon D., Ayalon O., Patel-King R., Hynes R.O., Geiger B. Extrajunctional distribution of N-cadherin in cultured human endothelial cells. J Cell Sci. 1992; 102 (Pt 1): 7-17.

184. Samija I., Lukac J., Maric-Brozic J., Kusic, Z. Microphthalmia-associated transcription factor and tyrosinase as markers of melanoma cells in blood of patients with melanoma. Croat Med. J. 2004; 45 (2): 142-148.

185. Sato M., Mori Y., Sakurada A., Fujimura S., Horii A. The H-cadherin (CDH13) gene is inactivated in human lung cancer. Hum Genet. 1998; 103 (1): 96-101.

186. Scherer P.E., Williams S., Fogliano M., Baldini G., Lodish H.F. A novel serum protein similar to Clq, produced exclusively in adipocytes. J Biol Chem. 1995; 270 (45): 26746-26749.

187. Scutti J.A.B., Matsuo A.L., Pereira F.V., Massaoka M.H., Figueiredo C.R., Moreira D.F., Belizario J.E., Travassos L.R. Role of SOCS-1 gene on melanoma cell growth and tumor development. Translational Oncology. 2011; 4 (2): 101-109.

188. Seegar T.C., Eller B., Tzvetkova-Robev D., Kolev M.V., Henderson S.C., Nikolov D.B., Barton W.A. Tiel-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin Hgands. Mol Cell. 2010; 37 (5): 643-655.

189. Semenza G.L. Oxygen homeostasis. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2010; 2(3): 336-361.

190. Semina E.V., Rubina K.A., Rutkevich P.N., Voyno-Yasenetskaya T.A., Parfyonova Y.V., Tkachuk V.A. T-cadherin activates Racl and Cdc42 and changes endothelial permeability. Biochemistry (Mosc). 2009; 74 (4): 362-370.

191. Shirakawa K., Wakasugi H., Heike Y., Watanabe I., Yamada S., Saito K., Konishi F. Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer. Int J Cancer. 2002; 99 (6): 821-828.

192. Shweiki D., Itin A., Neufeld G., Gitay-Goren H., Keshet E. Patterns of expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF receptors in mice suggest a role in hormonally regulated angiogenesis. J Clin Invest. 1993; 91 (5): 2235-2243.

193. Shweiki D., Itin A., Soffer D., Keshet E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 1992; 359 (6398): 843-845.

194. Simionescu C., Margaritescu C., Stepan A., Georgescu C.V., Niculescu M., Muntean M. The utility of pi 6, E-cadherin and Ki67 in cervical squamous intraepithelial lesions diagnosis. Rom J Morphol Embryol. 2010; 51 (4): 621-626.

195. Spaeth E., Klopp A., Dembinski J., Andreeff M., Marini F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene Ther. 2008; 15 (10): 730-738.

196. Stagg J. Mesenchymal stem cells in cancer. Stem Cell Rev. 2008; 4 (2): 119-124.

197. Stepniak E., Radice G.L., Vasioukhin V. Adhesive and signaling functions of cadherins and catenins in vertebrate development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2009; 1(5): a002949.

198. Strieter R.M., Kunkel S.L., Arenberg D.A., Burdick M.D., Polverini P.J. Interferon gamma-inducible protein 10 (IP-10), a member of the C-X-C chemokine family, is an inhibitor of angiogenesis. Biochem Biophys Res Commun. 1995; 210 (1): 51-57.

199. Suzuki S., Sano K., Tanihara H. Diversity of the cadherin superfamily: evidence for eight new cadherins in nervous tissue. Cell Regul. 1991; 2 (4): 261-270.

200. Szekanecz Z., Koch A.E. Vascular involvement in rheumatic diseases: 'vascular rheumatology'. Arthritis Res Ther. 2008; 10 (5): 224.

201. Takeichi M. Morphogenetic roles of classic cadherins. Curr Opin Cell Biol. 1995; 7 (5): 619-627.

202. Takeuchi T., Liang SB, Matsuyoshi N., Zhou S., Miyachi Y., Sonobe H., Ohtsuki Y Loss of T-cadherin (CDH13, H-cadherin) expression in cutaneous squamous cell carcinoma. Lab Invest. 2002a; 82 (8): 1023-1029.

203. Takeuchi T., Liang SB, Ohtsuki Y. Downregulation of expression of a novel cadherin molecule, T-cadherin, in basal cell carcinoma of the skin. Mol Carcinogenesis. 2002b; 35 (4): 173-179.

204. Takeuchi T., Misaki A., Sonobe H., Liang S.B., Ohtsuki Y. Is T-cadherin (CDH13, H-cadherin) expression related to lung metastasis of osteosarcoma. Histopathology. 2000b; 37 (2): 193-194.

205. Tanaka R., Koyanagi K., Narita N., Kuo C., Hoon D.S. Prognostic molecular biomarkers for cutaneous malignant melanoma. J Surg Oncol. 2011; 104 (4): 438-446.

206. Tang H.S., Feng Y.J., Yao L.Q. Angiogenesis, vasculogenesis, and vasculogenic mimicry in ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 2009; 19 (4): 605-610.

207. Teng M.W., von Scheidt B,, Duret H., Towne J.E., Smyth M.J. Anti-IL-23 monoclonal antibody synergizes in combination with targeted therapies or IL-2 to suppress tumor growth and metastases. Cancer Res. 2011; 71 (6): 2077-2086.

208. Tlsty T.D., Coussens L.M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 2006; 1: 119-150.

209. Togashi H., Abe K., Mizoguchi K., Takaoka O., Chisaka O., Takeichi M. Cadherin regulates dendritic spine morphogenesis. Neuron. 2002; 35 (1): 77-89.

210. Tolsma S.S., Volpert O.V., Good D.J., Frazier W.A., Polverini P.J., Bouck N. Peptides derived from two separate domains of the matrix protein thrombospondin-1 have anti-angiogenic activity. J Cell Biol. 1993; 122(2): 497-511.

211. Tomita K., van Bokhoven A., van Leenders G., Ruijter E.T.G., Jansen C.F.J., Bussemakers M.J.G., Schalken J.A. Cadherin switching in human prostate cancer progression. Cancer Res. 2000; 60 (13): 3650-3654.

212. Tyan S.W, Kuo W.H., Huang C.K, Pan C.C., Shew J.Y., Chang K.J., Lee E.Y., Lee W.H. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS One. 2011; 6 (1): el5313.

213. Vestal D.J., Ranscht B. Glycosylphosphatidylinositol-anchored T-cadherin mediated calcium-dependent, homophilic cell adhesion. J Cell Biol. 1992; 119(2): 451-461.

214. Vestweber D., Kemler R. Some structural and functional aspects of the cell adhesion molecule uvomorulin. Cell Differ. 1984; 15(2-4): 269-273.

215. Voyno-Yasenetskaya T.A., Dobbs L.A., Erickson S.K. Low density lipoprotein- and high density lipoprotein-mediated signal transduction and exocytosis in alveolar type II cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90 (9): 4256-4260.

216. West D.C., Thompson W.D., Sells P.G., Burbridge M.F. Angiogenesis Assays Using Chick Chorioallantoic Membrane. Methods in Molecular Medicine. 2003; 46: Angiogenesis Protocols Edited by: J. C. Murray. Humana Press Inc., Totowa, NJ.

217. Wittekind C., Neid M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 2005; 69 (Suppl 1): 14-16.

218. Wyder L., Vitality A., Schneider H., Hebbard L.W., Moritz D.R., Wittmer M., Ajmo M., Klemenz R. Increased expression of H/Tcadherin in tumor-penetrating blood vessels. Cancer Res. 2000; 60 (17): 4682-4688.

219. Xu F., Shi J., Yu B., Ni W., Wu X., Gu Z. Chemokines mediate mesenchymal stem cell migration toward gliomas in vitro. Oncol Rep. 2010; 23 (6): 1561-1567.

220. Yap A.S., Brieher W.M., Gumbiner B.M. Molecular and functional analysis of cadherin-based adherens junctions. Annu Rev Cell Dev Biol. 1997; 13: 119-146.

221. Zhang Z., Han Y., Zhang K., Teng L. Investigation of vasculogenic mimicry in intracranial hemangiopericytoma. Mol Med Report. 2011; 4 (6): 1295-1298.

222. Zhao H., Gu X.M. Study on vasculogenic mimicry in malignant esophageal stromal tumors. World J Gastroenterol. 2008; 14 (15): 2430-2433.

223. Zhong Y., Delgado Y., Gomez J., Lee S.W., Perez-Soler R. Loss of H-cadherin protein expression in human non-small cell lung cancer is associated with tumorigenicity. Clin Cancer Res. 2001; 7 (6): 1683-1687.

224. Zhou H., Song X., Briggs M., Violand B., Salsgiver W., Gulve E.A., Luo Y. Adiponectin represses gluconeogenesis independent of insulin in hepatocytes. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 338 (2): 793-799.

225. Zimmer G., Kästner B., Weth F., Bolz J. Multiple effects of ephrin-A5 on cortical neurons are mediated by SRC family kinases. J Neurosci. 2007; 27 (21): 5643-5653.

Информация о работе

Юрлова, Екатерина Ивановна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Механизмы влияния Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию меланомы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы