Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы влияния радиоволн миллиметрового диапазона слабой интенсивности на мембраны нормальных и опухолевых клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы влияния радиоволн миллиметрового диапазона слабой интенсивности на мембраны нормальных и опухолевых клеток"

г'к5

московский госщ[арсгвеннш лшерситег им. Н.В.яшоносова

БИОЛОГИЧЕСКИ! ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 61Ô.G0S.092

СйВфаОЗ Алексей Юрьзган

ыешизш Влияния рдщтволн юшккегрового дй&зазона

слабой интенсивности на ШШРМШ ношшжх и опухолевых КЛЕТОК

Сгоцв&зьностгь 03.00.02. - Екофзвика

Автсрефэра? диссертация на сшскйшв ученой степени каададата бшгогачвсгаи нзуз

Цоснвэ 1932

Работа выполнена в лаборатории новых физических факторов воздеЕ с г бия и группе биофизики неионязирущих излучений ОВД РАШ и на кафедре общей и теоретический физики медико-биологического факультете Росийского медицинского университета.

Научные руководители: . доктор физико-математических, наук,

профессор В.В.Лаврентьев кандидат биологических наук Л.А.Севастьянова

доктор физихо - математических наук, профессор К.В.Шайтан, кандидат биологических наук А.В.Путышский

Институт .Химической физики РАН 30

Запита соостоится 22 октября 1992 в 15 часоР> на заседакз Специализированного Совета К 053.05.68 при Московском государев венном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москвг Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория "Новая" каф( едры биофизики.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Биологическс

факультета МГУ.

Автореферат разослан 2( сентября 1992 года.

Официальные оппонета:

Ведущая организация:

Ученый секретарь Совета, доктор биологических наук

Б.А.Гуляев

рос;."''

ЗСУДЛгч ■:• вмши.о. . J_

ВВЕДЕНИЕ ^Пальность_те1_а • Изучение действа электро: "ап-стиых нолей :ЭШ), в частности шллгедагрсзого диапазона слабо-; интенсивности исследованный диапазон 0,05 - 12 кВт/см2 ) на биологические сис-'¿ш является одной из срзвнитзллпо поз:л: проблем биофизики. В онце 60-х годов в СССР код руководствам гкед. АН СССР :.Д.Девяткова начались сисгематстессте :!сслэдох<анЕя по данной роблеме. Было обнарукено, что дпя г.с:г"ч>:::.л зфакенных биологи-еских эффектов необходимо соблюдать п.:ра!пгры воздействия: час-оту колебаний, некоторою ггорогову» актзнслькссть а время облу-ения ( Девятков, Голант, Тагер 1933, Девятков, "ецккй, 1985, евятков, 1989, Голант, IS89 и др. ). В го se время, но мнению сследсвателзй, реакций биологических енотом пи воздействие зсводам к известны.'« эффектm локальной зла сб~,е$ гипертермии, эследнее обстоятельство в сочетала с фэкоьсеЕологазй бяологачес-апс эффектов 3Ж позволяло прздзть проблеме фундагвнтальш», Зщебиологаческий характер а сфорггулзройзть концепций об информа-юнном характере действия 3Î.GI йлллжэтрогсго диапазона слабой геенсивности ( Девятков, Голант, ISS3 ). В основе коздвпцнм !зкят предположение, что еевинээ облу^эгоэ 3*71 sssm. организмов еттирует внрабатываешэ органпз.'*ся о: ~г глтйвчетгня тнизяедэя-¡льностью.

Благодаря проведешкн нее твдс8авш» çsixrsEa'ionai Свочопиес-tx эффектов облучения началось снедраïtk использования 3МИ шшгя-¡трового диапазона в клинической прзхгжз { Севастьянова п др. »85, Андреев к др. 1935, Плетнев, I9S5, Девятков, 1989 и др ).

Однако, до настоящего врекаял фззягсо - жкоческий механизм акций биологических систем на облучена» хазясязтбнсивнш БШ лшшетрового диапазона остается неясна ( Дазаткоз, Голант, 83, Девятков, Бецкий, ISS5, Петров, Еецшкй, IS39 ).

Ведутся исследования ьэханнамов сяологитаскпх эффектов диоволн миллиметрового диапазона елабоо авхвнсишюсти Девятков, БецкЕ0,1985, Путв;шс!ш:1,1£31 - IS85, Назарчнов,1981 -91, Prollch,198Q, Grundler et. al.,1983, Gsndl',1983 я др. ) яако, трудности строгого физического огпсен~я взаимодействия Ещ вбой кнтенсивностн с Опоструктур:! ?:» слс-зюсть биологических стен не позволили пока добиться рггащсго усязхэ в объяснении аошнологяи биологичесшк эффектов S°£ï гаялякэзроБэго диапазона збой интенсивности.

Для понимания механизмов действзя Sîffl слабоЗ интенсивности

'йа биологические системы важное значение спеет пдентпЕикация Оноструктур - первичных акцепторов этого вида излучения и изучав физической природа акцепции. Экспериментальные ( Путинский, 196 1-985, ЗСазаринов, 1983, 1991, Мо1гк1п, ег. а1., 1979 ) и теорега-чвские (! РгоЫ1сЬ, 1980. ) исследования указывают на биологическ мембраны, как на один из возможных акцепторов ЭМП слабой интенся ности. ,

Электромагнитное излучение миллиметрового диапазона проникает только в поверхностные слои коки экспериментальных животных й человека, что обусловлено сильным поглощением энергии излученв водой ( 20 дб/мм при X = 7,0 мм ) Поэтому, акцепторными структурами могут быть например, мембраны клеток крови, циркулирующие е капиллярном русле ши мембраны специализированных рецепторов, локализованных на глубине проникновения РЦД в ткани организма. В настоящее время показано, что у облученных ЭМП эритроцитов барьерные свойства мембран модифицируются ( Ильина, и др., 1985

Однако, не известно какие именно изменения происходят-в структурно - функциональной организации мембран в поле РМД слабо интенсивности. Неизвестен так же и механизм акцепции электромагнитного излучения мшишметрового диапазона мембранными структурами, в частности, .лшшдным магриксом.

В то же время, механизмы действия радиоволн милкметрового диапазона на биологические мембраны могут быть изучены с прикене нием современных физических методов, в частности при использован одновременной с облучением образцов регистрации, происходящих в них изменений и постановке метрологического обеспечения экспериментов.

Цели и задачи исследования. Целью биофизических исследований была регистрация и изучение механизмов структурно-функциональных изменений цитоплазматических мембран и модельных мембран в поле ЭМИ миллиметрового диапазона слабой интенсивности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд методических и экспериментальных задач.

Прежде всего требовалолсь разработать метрологическое обесп чение экспериментов» изучить распределения напряженности электро магнитного поля миллиметрового диапазона при изменении частоты ЭМИ в различных экспериментальных ситуациях.

Необходимо было разработать методики изучения физического, состояния биологических и модельных мембран в поле РВД, позволят

да регистрировать как медленные изменения ( в течение десятков гинут ) в суспензиях бпокембран, тек и процессы молекулярной

—О _о

даемаки с характеристическими временами 10 - 10 сек.

Для исследований применяли специально разработанные модифака-даи методик лазерной корреляционной спектроскопш и флуоресцентных юндов с спектральным и временный разрешением при непрерывном и юпульсном возбуздеяпа флуоресценции.

Для обеспечения глетодической чистоты исследований было необходимо изучить особенности процессов, происходящих в водных раст-юрах и суспензиях клеток при действии на них ЗУИ {¿пляжетрового шапазона ( нагрев, тешюмассоперенос, электромагвитофорез в неод-юродных шлях и др. ) при плотности выходной мощности ЭШ'до 2 мВт/см2 -Представлялось важным оценить возмояность рассмотрения ■казанных физических процессов как первичных мехашзшв биологи-:еских эффектов ЕШ на клеточном уровне, во всяком случае, учиты-;ать их влияние при интерпретации результатов экспериментов.

На следующем этапе исследований ставили задачу проведения ка-ественной оценки молекулярной динамики липидного бислоя лшосом -. поле ЗМй миллиметрового диапазона слабой интенсивности. Для рвения поставленной задачи регистрировали некоторые параметры олекулярной дннахтка фосфолшгпдного катрикса лшосом, находащего-я в различном структурном состоянии, определяема тешературой, в оле ИЩ слабой интенсивности.

Задача завераащего этапа бгоф1зпческях исследований сследований состояла в регистрации структурных перестроек лазматических мембран клеток ( клеточных оболочек ) в поле ЗМЙ аллиметрового диапазона слабой интенсивности. Оценивали как вменения структуры мембран оптическими штодеш^, так п ункциональное состояние некоторых систем траяскембрашого эреноса.

зучная новизна работы. Впервые проведены исследования по змеренис пространственного распределения напряженности поля Ш миллиметрового диапазона на различны частотах в ряде модель-я и биологических объектов. Результаты измерений впервые учи-шались при интерпретации данных экспериментов с модельными и тологическими объектами.

Впервые определен температурный эквивалент тушения флуорвс-знции в поле ЭМИ миллиметрового диапазона в различных условиях сспершента.

Впарвге разработана методика исследования суспензий клеток, яшгасом и растворов в поле ЭМИ миллиметрового диапазона с ошогдав лазерной корреляционной спектроскошш. Разработаны конструкции KUES г, позволяющие производить одновременное облучение сусданзий-биоуэибран и модельных систем РВД слабой интенсивности и регистрацию флуоресценции и светорассеивания исследуемых объектов.

Впервые произведены оценки .времени Kopps ляцш (• коеф£шшента трансляционной диффузии ) нормальных и опухолевых клеток в суспензии в поле ЭМИ миллиметрового диапазона при облучении диэлектрическими антеннами.

Впервые использовала техника импульсной поляризационной флуориыатрщ с временным разрешением в сочетании с методом флуоресцентных зондов для определения некоторых параметров молекулярной динамики модельных мембран липосом в поле ЭШ миллиметрового диапазона. Впервые проведена качественная оценка некоторых параметров молекулярной динамики мембран липосом из лещшша в поле РЦЦ слабой интенсивности. Обнаружено, что характер влияния ЭМИ на .мембраны■липосом зависит от их физического состояния до начала облучения. Высказана гипотеза, что действие ВДЦ слабой интенсивности на молекулярную динамику мембран липосом из лецитина наиболее BirpasöEo в области температур структурного перехода типа латерального разделения фаз.

Охарактеризована структурные изменения в мембранах, эритроцитов облученных ЭМИ миллиметрового диапазона слабой интенсивности. Получены ноше данные о механизмах таких изменений.

Впервые изучено влияние ЭМИ миллшетрового даапазона на структуру и транспортные функции клеток саркомы - 37, адаптированных к кизкедеятвльности In vitro. Зарегистрировано ингибированиэ ташчвтя Н3 - тимидина в клетки саркомы - 37 и определены зависимости выраженности проявления данного эффекта от условна облучения ЭШ. Показано, что ЩД слабой интенсивности оказывают заметное влияние на барьерные функции мембран именно в период облучения, на вызывая выраженного последействия.

На«основании анализа собственных результатов и данных литературы впервые сформулирован ряд гипотез, посвященных ыеханиз-|.ш биологических эффектов ЭШ миллиметрового диапазона низкой интансивности.

Научно - практическое значение. Полученные результаты имеют . теоретическое значение для понимания биофизических механизмов и

перспектив развития исследований биологических эффектов ЭМИ миллиметрового диапазона слабой интенсивности и их практического применения.

Впервые проведенные исследования распределения напряженности поля ЭМИ миллиметрового диапазона в близкой зоне облучателя в ряде экспериментальных ситуаций позволяют более корректно интерпретировать результата экспериментов с воздействием РЫД на биологическое и модельные системы, особенно при изменении частоты электромагнитного поля. На основании проведенных нами исследований сфордулирована гипотеза: изменение пространственной организации градиентов температура и напрягенногтя поля в объекте эксперимента с перестройкой частоты ЭМИ ( в'Одюшей зоне* облучателя ) обуславливает зависимость некоторых биологических эффектов НЩ слабой интенсивности от длины водны электромагнитного излучения.

Впервые показанное значительное увеличение коэффициента трансляционной диффузии клеток In vitro в поле 2%М, что является о днем из ватных первичных каханязшв, зопускающих разнообразные эффекты воздействия ВДД шышэгетрового диапазона слабой интенсивности в биологических и модельных системах.

Обнаружено, что облучение различных биологических и модельных мембран в поле ВДД слабой интенсивности сопровождается структурными пере стройкам лзшщщого ма'-ракса и изиепевняш козфоркечиа в функций некоторых иекбраннах белков. Нэханягмом янициапии структурных перестроек могут являться изменения юлекулярвой дашшшш лишдного матргкса, обусловленные высокой чувствительностью кластерных переходных процессов к действию РИД слабой интенсивности. Апробация работы и публикации. Основные материалы диссертации докладывались на: V Всессданон сешанаре "Изучение кэханизмов нетеплового воздействия миллиметровых и субмашЕштровых излучений на биологические объекты * ( Москва, 1983 )» 71 Всесоюзном семинаре "Применение км излучения низкой интенсивности в биологии и медицине" ( йосква, 1986 ), Всесоюзном симпозиуме "Биологические эффекты электронвгнитных шлей" ( Пувдно» 1986 )

По теме диссертации опубликовано 5 работ, список hotojhx приведен в конце автореферата.

Структура и объем работа. Диссертация состоит зга введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов а списка литературы ( 249 ссылок ). Работа излокена на 188 страницах, содержит 51 рас.

- 6 -

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ и метода

7

Источники ЭМП, антенны, метрология. В качестве источника ЭМИ миллиметрового диапазона использовали генераторы промышленного производства Г4 - 141 с диапазоном электронной перестройки частоты 37,50 - 53,57 ГГц. Волноводный тракт содержал необходимые для конкретных экспериментов элементы, в частности, ферритовый вентиль ФВВ1 - II и поляризационный ослабитель АВЧ, а также элементы вол-новодного тракта, сечением 5,2x2,6 мм . Для облучения растворов и суспензий клеток In vitro применяла металлические пирамидальные рупорные и диэлектрические антенны а линзы, изготовленные из тефлона, которые показаны при описании экспериментов.

Клетки облучали в пластиковых чашках. Петри фарш Flow lab. диаметром 32 мм через дно ( толщина дна 0,8 ш ). Суспензии в спектроскопических кюветах облучали, как правило, с помощь» погруженных диэлектрических антэнн пирамидальной и вилкообразной формы. '

Контролировали как падающую, так и отраженную мощность ЭМИ с помощью термисторного ваттметра поглощаемой мощности l£3 - IQÂ с головкой типа М5 - 49.

Для контроля температуры образцов применяли Оезконтактный метод измерения с помоцью экспериментального радиометра миллиметрового диапазона, любезно предоставленного для совместных экспериментов его создателями ( Розенталь и др. I98S ) и с помощью калиброванных миниатюрных терморезисторов. ' г> \ ~>з.

Для измерения пространственного распределения напряженности электрической составляющей электромагнитного поля миллиметрового диапазона применяли экспериментальную установку, в которой в качестве датчика использовался миниатюрный безкорпусный диод Шотки как квадратичный детектор. Установка была любезно предоставлена ее создателями ( Покеда, Буткс и др. 1987 ). В ряде экспериментов использовали установку аналогичного назначения, созданную на основе тунельного диода ГИ103Б в качестве детектора.

Оптические методы. Для изучения процессов, происходящих в водных средах и суспензиях в поле ЭМИ миллиметрового диапазона был создан экспериментальный лазерный корреляционный спектрометр, схема которого,«представлена на рис. I. Луч одночастотного лазера ( I )

Ш 13

3 !=гфм

=±=

Ш

13

10

12

I6 Г .........

и

Вас. I. Схема лазерного корреляционного спектрометра. Пояснения в тексте®

1 2

_^

Й1С. 2. ^стрсйсгво сопряжения лазерного корреляционного спектрометра с генератором электромагнитного излучения для изучения процессов в суспензиях клеток.

Обозначения в тексте.

ЛГН - 303 отразившись от зеркала 31 ( 2 ) и пройдя поляризатор (13) - призму Глана, рассеивался на образце, помещенном в стандартную кварцевую кювету ( 4 ) размером I х I х 4 см. Рассеянный свет проходил через анализатор (15 ) - призму Глана и попадал на зеркало 32 ( 5 ), плоскость которого могла менять ориентацию в пространстве. Отразившись от зеркала З2 рассеянный свет проходил через диафрагмы Д^- и Д^ За системой диафрагм расположен ФЗУ - 39, питаемый от стабилизированного источника питания. Сигнал с ФЗУ подавался на вход измерителя корреляционных характеристик Х6 -4. Сигнвл с выхода коррелометра подавали на осцилограф С7 - 8 и на самописец ЫЕ - 230.

Устройство, схема которого представлена на рисунке 2 позволяло регистрировать динамическое рассеивание света в растворах и суспензиях непосредственно в поле ЭМИ миллиметрового диапазона. Источником ЭМИ служил генератор Г4 - 141 (I). Волвоводный тракт содержал ферритовый вентиль ФВВ1 - II ( 2 ) и механическую.заглушку (3 ). Энергия ЭМИ передавалась на суспензию с помощью диэлектрического пирамидального рупора ( 4 ). Расстояние меаду лучам ла-зера5и передней гранью диэлектрического рупора устанавливалось и контролировалось с точностью до 0,01 мм механической системой ( 6 ). Вся установка была расположена на антивибрационном столе. Генератор ЭМИ имел независимую подвеску.

Измерения флуоресценции при непрерывном возбуждении проводили с использованием спектрофлуориметров Н1ТАСН1 МРР - 4 и НИАСН1 -850 и специально изготовленных приставок к кюветным отделениям, позволяющим производить регистрацию в поле ЭМИ миллиметрового диапазона в условиях термостатирования. Регистрация флуоресценции в Э.ЧЛ производилась с использованием кварцевого капилляра с внутреннем диаметром мм. Для регистрации флуоресценции от суспензии предварительно облученных клеток применяли термостатированную плоскую кварцевую кювету ( 0,1 х 1.x 4 см ) фирмы НеНиа.

Шшроспектрофлуориметрия клеток производилась на сканирующем микроскопе - фотометре МЦФУ - 2. Было предусмотрено облучение ЭМП одновременно с регистрацией флуоресценции.

Для регистрации фяуорсценции с импульсным возбуждением использовали лазерный импульсный флуориметр. В качестве источника возбуждающего света применяли лазер ЛГИ - 21. Флуоресценцию воз-

буздали через дно кюветы, применяла шнохроматор высокого разрешения МБР, использовали в качестве фэтопряешшса ФЭУ - 36. Регистрацию сигнала с фотопряеьиика производила с использованием стробоскопического осциллографа 07-17. Отичэскнй тракт прибора содерзал призмы Глана - Тошсона. Была предусмотрена возможность термостатаровання и перекешшания суспензии клеток при одновременной регистрации флуоресценции в пола ЭМИ.

Изучение светорзссеивания суспензий клеток проводили на лазерном нефелометре. Источником света бил лазер ЛГ - 66. регистрации свэтопропуекания производила на серийном приборе СФ-16 с модафадарованным наш квветннм отдвленеёи на д-шпа волны 416 нм.

Работа с клетка?® In vltto. Клеточный материал забарачи от мышей линий GBA, CBWA 7 F1 ( СВА х С57В1 ), полученных из питомника "Столбовая" РАМН и содержащихся на стандартной рационе вавзрзя.

Использовали суспензш эритроцитов »гкззй линии CBIA клеток асцитных вариантов саркош - 37 и РЕЫ - 5 в раствора Хенк-са. Штачш саркош - 37 и FGSJ - 5 были получена в лаборатории опухолевых штатов ОЩ РАШ.

В пробирка с раствором Хеикса, обьекои 5 мл с гепарином { 50 № I мл ) микропитаткой отбирала 10 ЮСЛ крови из хвостовой вены мышей. Клетки откавали 3 раза цзнтргфупфОЕаннем пра I03 об/кин в растворе Хетсса; зать.4 ресуспецдкровалз и использовала.

При получении сусшнзка сарксгги - 37, пссдэ забора асцитной кидкости клетки отмывали 3-5 раз в раствора Яошсса без красите,®* ( IQ3 об/кин в течении 3 канут - одно центрифугирование ). Затег оценивали ах жизнеспособность по общеизвестной методике с применением витального красителя этиленового синего. «

Клетки ресуспендироьали на вейкере фирма Preset! IE - 326. В случае оптических измерений раствор! профильтровывали через фильтры фиркы Mlllipore Corp. с диаметром пор 0,22 мкм до 5 раз.

Изучение включения Н^-тамгдаша в клетки саркош - 37 производили по общепринятой методике. Применяли среду инкубации: среда 199, среда Игла, сыворотка крупного роганзго скота в объемном соотношении 7:3:1. К лизату клеток добавляла сцинтзлляционнув жидкость ЯС - 8 и определяли Jb - активность на счетчике Hark - III.

При регистрации динамики све топропу екания суспензии эритроцитов облученных ЭМП в изотоническом растворе сахарозы 0,1 мл плотной суспензш клеток из осадков бистро впрыскивали и переме-

-годовали в 2 - 4 мл 10% сахарозы, приготовленной на бидастиллирован-ной, деионизованной воде.

Приготовление лилосом, флуоресцентные зонда, реактивы.

Липосомы приготовляли озвучиванием дисперсий липид - вода ультразвуком на установке Ultrasonlk при мощности 70'Вт, частоте 22 КГц в течении 10 минут. В части экспериментов использовали "спиртовые липосомы", полученные путем быстрого впрыскивания шприцем через тонкую иглу концентрированного раствора фосфолишда в этаноле ( 33 мг/мл ) в интенсивно' перемешиваемый буффер.

Использовали флуоресцентные зонды: I - анилинонафташш - 8 -сульфонат ( АНС ) и 4 - диметиламинохалкон ( ДМХ ) были любезно предоставлены кафедрой биофизики медико - биологического факультета 2МОЯГШ. Человеческий сывороточный альбумин ( ЧСА ) фирмы MERCK. Остальные реактивы марки ХЧ.

Математическая обработка результатов проведена на компьютера IBM PC/AT с использование пакета прикладных программ: STATGRAF, GRAF IN THE BOX.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИЗ ОБСУЖДЕНИЕ

Прежде всего, была поставлена задача, изучить особенности нагрева водных растворов и суспензий клеток In vitro в поле ЭМИ миллиметрового диапазона в различных экспериментальных ситуациях. В частности, в традиционной для экспериментов In vitro схеме: суспензия клеток в чашке Петри облучается ЭМИ через дно с использованием пирамидального металлического рупора с. прямоугольным или круглым раскрывом.

Облучали I мл раствора Хенкса ЭМИ в тефлоновой кювете ( по , форме - чашка Петри ) с внутренним диаметром 30 мм и толщиной д»а 0,5 мм. Генератор Г4-141 работал в режиме импульсной модуляции С частотой I КГц ( прямоугольные импульсы ), частота несущей 42,21 ГГц. Раствор в кювете облучали снизу через через дно кюветы, ка показано на рис. 3, с помощью циллиндрического пирамидального рупора с углом раскрыва 37'. Регистрировали температуру без-контактным способом да тепловому излучению на частоте 42,22 ГГц

t'C

1,5 1,2

0,9

0t6

0,3 0

AHD в растворе ЧСА

8

OrI 0,0в

0,05 0,04 0,02 О

JL/сы2

PbCi 3. Зависимость нагрева раствора -Хенкса от плотности падаипой мощности ЗМЙ при

мВт/си2

Рис. 4. Зависимость глубина тушеная флуоресценции ?/& от плотности пвдатаеймошности Р. 42,22 ГГц.

F

75

50 25

31*С

47*С

\г

АШ в липосомах из лецияшв | |

О 5 10

t ИЯН.

Ric#5. Дянамика тушения флуоресценции F(t) в поле 3fli при. нагреве капилляра термостатом / от 31 до 4?'С /.

£ мин.

Рис; б. Дшашша тушения и возгорания флуоресценции Fit) в ответ на начало f я конец | облучения, АШ в клетках

t - начало облучения, { - конец, саржош - 37. Кривая А;

Динамика нагрева образца -- кривая Б;

'( 7,10 мм ) с помощью экспериментального радиометра миллиметрового -"диапазона.

Изучали зависимость нагрева раствора в кювете от эффективной плотности падащей мощности ( Р ) ЭМИ. Результаты измерений приведены на рис. 3. Как видно из регрессионного анализа •результатов, приведенных на рисунке 3 зависимость нагрева образца от плотности падающей мощности Р имеет вид: Т = 0,03<*0,2) + -0,09(-0,02)Р, где: Т - нагрев раствора по сравнению с контролем '(•С), Р - плотность падающей мощности ЭШ (мВт/см2).

Таким образом, увеличение плотности падащей мощности ЭМИ на I мВт/см2, в данных экспериментальных условиях, должно сопровождаться нагревом суспензии или водного раствора на 0,14"С.

В следующей серии экспериментов изучали зависимость нагрева водного раствора от Р ЭШ, используя известное явление тушения флуоресценции хромофоров в водных растворах при повышении температуры. Использовали флуоресцентный зонд АНС в водном растворе, содержащем ЧСА в концентрации I М. Аликвоту раствора объемом 0,2 мл помещали в кварцевый капилляр с внутренним диаметром 2 мм и помещали в просвет волновода, заведенного в ответное отделение -спектрофлуориметра. В серии из 7 экспериментов изучали зависи-

'мость глубины тушения флуоресценции - { где, F - величина тушения

G

флуоресценции после установления теплового равновесия при облучении ЭМП, G - интенсивность флуоресценции образца до начала облучения в тех же единицах ) от плотности падающей на образец мощности Р. Результаты измерений представлены на рис 4. Как видно из рисунка, регрессинный анализ показывает, что зависимость глубины

тушения - описывается линейной зависимостью: G

F

- = - 1,6 х I0"3(i8,5 X I0"3) + 5,5 X Ю-3(-9,0 X Ю~4)Р ■ G

Определяли термоэквивалент тушения флуоресценции, нагревая капилляр с раствором с помощью проточного термостата. Для АНС в водном растворе ЧСА при данных экспериментальных условиях термоЭквивалент составил 0,38'С на I мВт/см2.

Проведена серия экспериментов с прямым измерением термо-эквивалентв облучения ЭШ с использованием АНС в суспензии липо-сом из яичного лецитина в термостэтируемом капилляре, погруженном в просвет волновода. Результаты измерений представлены на рисунке 5. -При плотности потокамощности 20 мВт/см2 термоэквивалент доставил 7,7'С ( при температуре суспензии до облучения

31 "С ), что составляет 0,38'С на Г мВт/сы2 Р зmí.

Некоторое несоответствие термоэквиваяентов, пзг.?ерзнпых с помощью терморезистора и радиоме гра ( 0,14'С) и флуорккэтра ( 0,38'С ), повидимому обьясняется регистрацией флуоресценции ( в данных условиях эксперимента ) преимущественно с пристеночных областей раствора в капилляре.

Сопоставляли процессы динамки тушения флуоресценции в поле ЭМИ зонда АНС, в суспензия клеток саркокы - 37 и нагрева, зарегистрированного, в описанных вшзе экспериментах с помощью радиометрии. Измерения проводили в традиционной для большинства экспериментов 1л 7ltro ( ) схеме: чашка Петри с суспензий клеток,

облучаемая ЭМИ миллиметрового диапазона снизу, с поиощьо пирамидального металла* >ского рупора с прямоугольным или круглил раскры-вом.

В серии из 15 экспериментов было обнаружено, что в поле ЭМИ; миллиметрового диапазона наблюдается обратгиоэ туазшо флуоресценции АНС в. клетках саркош - 37. При мощности в тракте -

32 мВт ( 12,8 мВт/см^ при применении конического рушгора ) глубина тушения флуоресценции составляет 6.3S ( в присутствии возбуждающего флуоресценцию света ) в 8,4$ в его отсутствии во врз&я развития процесса туиешя.

Кривые динамики тушения и возгорания флуоресценции АШ в клетках саркокы - 37' и нагрева представлены на рисунке 6.

В таблице I представлена динамика процессов нагревания и ох-лаадення водных растворов, тушеная и возгорания флуоресценции АЫ в растворе ЧСА и клетках саркош -37. Как видно из сопоставления количественных показателей одаоэкспонендаальяой ¿одела нагревания растворов и тушения их флуоресценции ( соответственно - охлаздения и возгорания флуоресценции ), тушение флуоресценции полностью определяется нагревом водных сред в ЭМП. Количественные параметры динамики нагрева и охлаздения, а так ке время выхода в стационарное состояние (í\j90 секунд ) вполне сопоставимы для каждой из экспериментальных моделей.

Различие термоэквивалента I kBt/cíí2 падаяпей на образец мощности ЭМИ при измерении с помощью тэргюрезистора п радиометра ( 0,14'С ) и флуориметра ( 0,38* }, повидимому объясняется регистрацией флуоресценции ( в данных условиях эксперимента ) преимущественно с пристеночных областей растворов в капилляра.

Таблица I Динамика тушения в возгорания флуоресценции

в ответ на начало и окончание облучения образцов ЗИП.

Условия Начало облучения Конец облучения

Образец

Чашка Петри

с термодатчиком на

дне

Ш)

-= ехр (-0,06-0,051;)

Т

Бе1= 0,108 Зеа= 2,5x10"' И.® 98,19»

—г- » ехр(-0,038-0,05г)

Зе1= 0,07 1.6Х10"3

Нд= 99,16%

Чашка Петри 1 - Р(г) ' 1 - Р*Ш

- = ехр(0,28-0,031;) ---- ехр(0,25-0,02г)

с клетками ? о Р »

Б - 37 Бе1 = 0,12 Бед= 1,6x10"^ Бр1= 0,047 8рд= 6.1Х10-4

( с АНС )

на дне

е1

Йд = 97,1%

Эе1 йд= 99,23%

•'ез"

Капилляр с

раствором ЧСА с

1 - 1 -

- = ехр(-0,3-0,0441;) --— = ехр(-0,19-0,0бг

Р О Р

Бе1= 0,09 Без= 3,0x10'

Йд= 95,6$

Бе1- 0,14 Бед= 4,4x10 Кд= 95.3%

Обозначения:

Т("С) и Т <г) - соответственно динамика разогрева образцов в поле ЭМИ и охлаждения их после окончания облучения.

Р(1) и Р*(г) * соответственно динамика тушения и возгорания флуоресценции образцов.

Бе1, Бе3, И3 - параметры оценки достоверности модели линейной регресси.

Действительно, теоретические оценки, проведэшша { Ильина, 1979 } показали, что при облучениии различных кювет тепловыделение происходит в тонком слое, обращенном к излучателю ( порядка толщины скин - слоя ). При толщине родного раствора I мм в закрытой кювете в поле ЭМИ 42,22 ГГц при I мВт/см2 максимальный нагрев составляет 0,1'С, а при 10 мВт/см2 - 1*С, средний нагрев в несколько раз меньше.

Таким образом, флуоресцентный метод измерения тэрмоэквивален-та оказывается весьма чувствителен к пристеночным аффектам и является полезным при интерпретации экспериментов по воздействию РИД так называемой "слабой" интекзотвностп на кл гка 1п Ylt.ro.

В следупяей серии экспериментов измеряли пространственное распределение напряженности электрической компоненты { Е ) ЭЫП миллиметрового диапазона в так называемой "ближней зоне" облучателя в ряде типичных экспериментальных ситуаций.

Прежде всего?измеряли пространственное распределение напряженности ЭШ миллиметрового диапазона на различия частотах в чашке Петря, размещенной на диэлектрической линзе пирамидальной руппорной антенны с раскрывом 4 х 4 см. Чешка содержала I мл раствора Хенкса и была рзалещена сгаметрячно относительно граней раскрнза рушора. Датчик ( мпкроантенна на основе диода Шотки } двигался с помощью механической системы по диаметру чашки Петри в объеме явдкоста на расстояния 0,2 мм от дна, как показано на рис.7.

Результаты измерений Е с шагом по частоте ЭШ 0,1 ГГц представлены на рис. 7. Как видно из рзсунка распрэделзнае напряженности поля неоднородно, а характер неоднородности зависит от частоты ЭШ. \

Ш не ограничились модельными системами и шлтнтировзла датчик мышам лиши СБА д. Животных шлнобилизяровали, фиксируя за конечности, наркотизирова ли гексивалш, на участке кожи спина выстригали шерсть, отпрепарировали кожу от подкожной клетчатки и через разрез вводили мшсроантенну вдоль оси тела.Отходящие от датчика проводники припаивались к электрической цепи установки. Для облучения применяли пирамидальный металлический руппор с прямоугольным раскрывом 2 х 2 см, обычно используемый при облучении животных авторши исследований биологических эффектов ( Севастьянова, 1983, 1985, 1987 ) Облучали сшнку пммобили-

¡ш

~]) ш

датчика! вдоль диаметра чашки Пет "

Движение здоль 1етри

Рис. 7, Распределение напряженности 5МП вдоль диаметра чашки Петри в диапазоне частот 42,22 - -42,42 ГГц. 3) В идиентичной чашке Петри произведена измерения, результаты которых представлены на рисунка* 3 и 6. По оси абсцисс - положение датчика вдоль диаметра чашки 3) в 1.11, по оси ординат - напряженность Електроыагнитно-го поля Е ыВ.

кВ

«.3 М

«.5

44.8 из V гщ

Рлс-. .8, Зависимость напряженности поля ШИ под гкии Е от частоты излучения V в "близкой зоне' дельного излучателя.

кожей пирами-

зированного еивотяого в "ближней зоне рупора" { передали грань рупора находится на расстоянии от 0 до 2 до поверхности тела животного ).Измерения проводили при перестройке частоты генератора Г4 - 141 от 37,00 до 44,90 ГГц с шагом 0,1 ГГц. Результаты измерений представлены на рис. 8.

В следующей серии измерений датчик находился под тимусом, предварительно выделенным от в СВД о и подсаженшм подкожно другому животному той: та линии. Измерения производили аналогично.

Из рисунка 8 можно видеть, что при перестройке частоты генератора ЗШ, напряженность поля ( Е ) в ебластг расположения датчика заметно изменяется. Как видно из рисунка 8 изменения Е в зависимости от частота значима при шаге не аире 0,1 ГГц.

Таким образом, обнаружено, что в экспериментальных ситуациях In vitro и In vivo, типичных для изучения биологических эффектов ЭМИ миллиметрового диапазона слабой интенсивности распределение напряЕенности электрической кошоненты ЗШ зависит от частоты электромагнитного излучения. Изменения 'в пространственном распределении Е становятся значимыми уке при перестройке частоты ЭМИ на 0,1 ГГц в диапазоне 42,22 - 42,72 ГГц.

Из общих соображений следует, что пространственная организация Е должна определять распределение микронегрева и процессов электромапштофореза в объеме раствора или суспензии при облучении последних ЭШ милжатрового диапазона. Действительно, в литературе была убедительно продемонстрирована возможность вынужденного перемещения заряженных частиц в растворах и термогравитационной конвекции ( Путвиаский, 1983, Казарзнов, 1983, 1990 ) под действием неоднородных ЭШ миллиметрового диапазона.

В то se время, количественных оценок в еясперзиэнтэ интенсивности конвекции в суспензиях клеток в неоднородном 3МП миллиметрового диапазона сделано не было. Ш вперше применили мощный лазерной корреляционно! спектроскопии для исследования процессов, происходящих в суспензии клеток In vitro при облучении их РИД с использованием погруженных диэлектрических антенн, которые часто применяются при изучении механизмов действия ЭШ миллиметрового диапазона ( Grundler, 1983, Полннков, 1985 и др )

Тефяоновый пирамидальный рупор, согласованный о волноводом помещали в толщу суспензии клеток вертикально вниз на расстояние I мм от проходящего через кввету сфокусированного колиматором

лазерного луча ( рис. 9 ). Регистрировали автокорреляционную функцию рассеянного света под углом 1,5" до начала облучения, во время облучения, а так же после прекращения облучения. Сформированная таким образом модель оказалась чувствительной к действию ЭШ миллиметрового даапазона.

Проводили серию экспериментов по регистрации автокорреляционных функций ( АКФ ) рассеянного света суспензией эритроцитов до облучения, под лучом и после прекращения облучения. Во время переходных процессов начала и прекращения облучения АКФ не регистрировали. На рис.9 представлен вид АКФ в указанных условиях при частоте ЭШ 42,22 ГГц и мощности в тракте 30 мВт. Из рисунка видно, что действие облучения существенно меняет форму G (О. В следующей серии опытов регистрировали зависимость параметров АКФ: времени корреляции ( ) и амплитуды АКФ ( G0 > при нулевой времени задержки. Результаты 4 серий измерений представлены на рисунке 10. Как видно из рисунка, с ростом подводимой мощности ЭМИ время корреляции £~с падает, а амплитуда GQ АКФ ростет. Факт обратимости действия ШД по параметру^ подтверждается результатами 32 экспериментов, при различных значениях подводишй мощности ЭМИ. Амплитуда GQ после прекращения облучения, как правило, ниже исходной, что вероятно объясняется снижением концентрации клеток в области фокусировки лазерного излучения.

Изменения G( ) рассеянного света в суспензии в поле ЭШ было обнаружено не только в суспензиях эритроцитов но и в суспензиях опухолевых клеток: асцитного варианта FEM - Б и саркомы - 37. Рисунок II.

Было проведено по 15 опытов как с FBSi - 5, так и с саркомой - 37 при постоянной плотности потока мощности ЭМИ. Изменения величин ^ и до, во время и после облучения приведены в таблице 2.

Как видно из рисунков 9 и II АКФ рассеянного света в поле ЭШ не содержит полос или пиков, соответствующих неупругому рассеиванию. Поэтому, обнаруженные изменения G(^) могут указывать на отсутствие ( по крайней мере, при нашей геометрии експерзг мента ) анизотропного вынужденного массопереноса.

Известно ( Лебедев и др. 1989 ), что коэффициент трансляционной диффузии (КТД) для случая монодасперстных систем обратно пропорционален- времени корреляции £"с . Увеличение КТД, как в модельных, так и в биологических системах может являться одним иг

0 5 г 9 ?ГиС

Рис, 9, Изменения »^»рассеянного света суспензией эритроцитов: К - интактных, 0 г в поле ЭШ, В - после прекращения облучения.

0 5 10 15 ЙО 25 Р Й1с. 10. Завиужости й(Р) и '^сСР} от подводимой к суспензии ЭрИТрОЦИТОВ мощности /С сЫП.

Таблица 2. Значения суспензий опухолевых клеток РИМ - 5 и саркома - 37.

«з

30 20 10 а

и

ч.

"К

1.Х 3.5 5.28 7.0

о.® гм 4.4 «.и ^ ^

Вю

цля

, II; То же, что на Рис. 9 клеток опухолевого штамма - 5.

е? , I » НМ - 5 Саркома-37

К 3,21 * 1,7 ь 5,07

0 0,45 - 0,09 0,66 1 0,01

в 2,63 * 0,9 5,8 •

возможных механизмов влияния ЭМИ миллиметрового диапазона на электрохимические и биохимические процессы в клетках In vivo и Ш vitro, протекающие с диффузионными ограничениями.

Биологические мембраны являются сложными многокомпонентными системами, поэтому для предварительной оценки влияния ЭШ миллиметрового диапазона на физическое состояние фосфолшшдных мембран допускающей, более или менее однозначную интерпретацию, были использованы липосомы из яичного лецитина.

Показано, что в поле ЭШ (Д = 7,10 ш, Р = 5 мВт/см2 ) вли яние поля проявляется через 2-3 минуты облучения и сохраняются неизменными ( в пределах ошибки измерения ) не протяжении,по край ней мере,20 минут. Действие ЭМИ имеет обратимый характер и исчезает через 2-3 минуты после снятия шля.

На рис.12 представлена зависимость предельного угла вращательных качаний ( ®0 ) флуоресцентного зонда АНС в лнпосомах из лецтина, как в контроле,так и при облучении в течении 2 минут в . поле ЭШ миллиметрового диапазона от температуры суспензии до облучения. Выраженность изменений параметра молекулярной динамики ©0 зависит от фазового состояния мембран ( фазоше перехода типа латерального разделения фаз ) во время облучения, определяемого температурой. Как видно, из рисунка 12 в поле ЭШ значения параметра 0О с изменением температуры испытывают более выраженные, по сравнению с контролем, колебания. Поэтому, не исключенол-что* в когерентном поле ЭШ структурные перестройки, регистрируемые по изменению параметра &0, имеют тенденцию к большей кооперативности, чем в контроле.

Известно, что степень проницаемости модельных и биологических мембран для различных веществ и ионов зависит от времени шэт динамических дефектов на границах кластеров ( Ивков, 1982' ), поэтому проведенные исследования имеют значение для объяснения влияния ЭШ слабой интенсивности на барьерные и иные функции биологических мембран.

Изменения физического состояния лшосом в поле ЭМИ миллиметрового диапазона дают основания предположить, что облучение способно индуцировать структурно - функциональные изменения и в биологических мембранах.

Обнаружено влияние ЭШ миллиметрового диапазона не динамику светопропускания эритроцитов, впрыснутых в интенсивно перемешиваемый ЮТ раствор сахарозы. На рисунке 13 представлена зависимость

21 25 29 33 37 ££

Рис. 12; Зависимость во от от температуры суспензии ли-посом из лецитина в поле Ш1 и до облучения. Время облучения до начала регистрации -2 кинуты. Облучение в термос-_ газированном капилляре.

О 5 10 15 20 25 t

„В1С. 13. Зависимость параметра 1к/1о от интервала времени, прошедшего после окончания облучения плотной суспензии-эритроцитов. Облучение в чашке Петри»

й!С." 14. Влияние <Ш на динамику интенсивности флуоресценции ДЩ при окрашивании живых клеток саркомы - 37. f- нача-облучения, ^ - конец. Кривые: 1,2,3 - различные гхсперк-ментальнне ситуации. ДМХ я 0,1 ьМ. Облучение в чашке Петри;

отношения амшштуд динамики СЕетопропускания суспензий эритроцитов; облученных (10) и контрольных (1к) - 1о/1к; от времени, прошедшего после окончания воздействия ЗМИ. Обнаруженные изменения светопропускания суспензии облученных клеток сопутствуют процессам трансмембранного переноса ионов и отражают состояние мембран эритроцитов.

Для изучения физического состояния мембран эритроцитов, облученных ЭМИ миллиметрового диапазона использовали незаряженный флуоресцентный зонд диметилхалкон ( ДОС ). При облучении суспензии эритроцитов, как с помощью погруженных диэлектрических антенн, так и с помощью металлических рул арных, обнаругивается сдвиг максимума флуоресценции ДМХ ка 3,5 нм в коротковолновую область, сопровождаются ростом интенсивности на 1Ь%. Указанные изменения сопровождаются снижением интенсивности флуоресценции эндогенных триптофаннлов на 15Ж и сдвигом максимума их флуорес- . ценции на 4 нм в коротковолновую область. Характер спектральных изменений, можно интерпретировать как увеличение жесткости микроокружения зонда в мембране облученных эритроцитов.

Оценивали влияние ЭМИ миллиметрового диапазона на структурно - функциональное состояние мембран клеток саркомы - 37. Установлено, снижение включения Н3- тимидана в облученном клеточном материале.

Изучали динамику интенсивности флуоресценции при окрапивании кле'ток саркомы - 37 ДМХ 1п тИ;го при облучении ЭМП. Результаты йре'дставлены на рисунке 14. Как видно из рисунка, проникновение зонда в клетки штенскфицируется во время облучения и стабилизируется на более низком уровне в его отсутствии.

В заключении работы обсувдаются биофизические механизмы: акцепции ЭШ1 миллиметрового диапазона мембранными структурами; трансформации макроскопических эффектов взаимодействия излучения и вещества в макроскопические - биологические эффекты; "резонансных" эффектов. Обсуждается возможность влияния ЭШ слабой интенсивности на эволюцию интерференции квантовых состояний некоторой гипотетической Сиомолекулярной системы.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны ноше подхода к эксшершвнтальномиу изучению ', механизмов действия Э1М миллшетрово^о диапазона слабой интенсивности на биологические и модельные менбрэны, заключающиеся в облучении

и одновременной регистрации шгфорлацш с образца с покощьв методов лазерной корреляционной спектроскопш, лазерной нефэлометряи и флуориматрия ( с применением флуоресцентных зондов ) с временным и спектральным разресешгем при изкеренст пространственного распределения напряженности ЭШ1 в конкретных условиях гр^гэтрия эксперимента, дяэлектрлчвскнх свойств образца и частоты электромагнитного излучения.

2. Показано, что в растворах, в водных суспензиях клеток и липо-ссм в поле Э151 миллиметрового диапазона в "блжяей зоне" от облучателя происходят процессы тугения флуоресценция ( определяемого нагревом ), нагрев ( средней терглоэкв^зален составляет^0,33*0 на

I VВт/сг,!2 ), массоперенос ( когфЕищгэнт трансляцготтоЗ деффузип норлэльшх п опухолевых кязток увеличивается в поле Е'Л! почти на порядок ). Пространственная организация утсазаншх процессов определяется Формой распределения напрягензостн 3!Ш в образце, которая сильно зависят от частоты Э'.ГЛ ( с шагом но угэ 100 НГц ) в глтпч-, ннх модельных системах.

3. Обнаружено, что облучение З.ЧЙ нгдли^етрозого диапазона слабой интенсивности нормальных и опухолэенх клагок ( эритроцитов п клеток сарксш - 37 ) сопровождается структурш:,£1 измеЕЭшшгг упорядоченности лстидного катрпхса а барьер® - тренстортных функций плазматических глекбран. йзтганэгаш в мз^брзяах клеток ишо объяснить действием ЗГШ . з молекулярауа дзнклтку "лшздзого матрикса.

4. Сформулирована гипотеза о возшкноп яэхаякз^э зашгажсти ряда биологических эффектов зш нтлп'.агрового диапазона от частоты излучения . В разках данной гагатезы, проявление зависших' от частоты Э1М биологических эффектов обусловлено созданием в объекта эксперимента опрэдолэ.'шого пространственного распределения напряженности Э1Ш миллиметрового диапазона. Первичный акт взаимодей- . ствия ЭМИ и биоструктур является энергетическим, однако мопет тлеть кесто "информационный" характер биологических эффектов ЗШ, вследствии воздействия пространственного распределения поля акцепторов ( например, рецепторов и точек акупунктуры ).

' Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах.

I. Смирнов A.D., Севастьянова Л.А. Динамика структурных перестроек биологических мембран,под действием радиоволн миллиметрового диапазона нетепловой интенсивности, в га. "ЗНзекты нетешювого воздействия миллиметрового излучения на биологические объекты", Москва, 1983 г., с. 138 - 145.

Z. Смирнов A.D., Севастьянова Л.А. Влияние радиоволн миллиметрового диапазона нетепловой интенсивности на биологические мембраны. Тез. докл. V Всесоюзного семинара "Изучение механизмов нетеплового воздействия миллиметрового и субмиллиметрового излучений на биологические объекты" 1983 г., с. 16.

3. Н.Д. Девятков, Л.А.Севастьянова, Э.С.Зубенкова, А.Г.Бородкина, М.Б.Голант, Т.Б.Реброва, С.В.Зиновьев, Л.З.Балакирева, Г.Б.Смирнова, Н.И.Полянская, А.Ю.Смирнов. Индуцирование биологических процессов миллиметровыми радиоволнами нетепловой интенсивности. Тез. докл. V Всесоюзного семинара "Изучение механизмов нетеплового воздействия миллиметрового и субмиллиметрового излучений на биологические объекты", Москва, 1933, с. 3.

4. Скифнов А.Ю., Севастьянова i.A. Молекулярная динамика фосфо-липидных мембран липосом в поле радиоволн миллиметрового диапазона слабой интенсивности. Тез. докл. VI Всесоюзного семинара "Приме-ненке им излучения низкой интенсивности в биологии и медицине", Москва, 1986 г., с. 50. !

5. Смирнов А.В., Зиновьев C.B.Калашникова Г.Н., Боголюбов В.Ы.

Действие электромагнитного излучения с частотами 420, 540 и 600 ^ МГЦ на течение опухолевого процесса и гибель кивотных с перевивной опухолью РИМ - Б. Вопроси курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры, 1989 г., К2, с. II - 16.

у часток жожительной техники онц рлй

подп. к псч1Г.<?Л1 з.ахаз2$9 тгир*и!00з.сi.