Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы транспорта тромбоцитов в потоке крови под воздействием эритроцитов

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы транспорта тромбоцитов в потоке крови под воздействием эритроцитов"

На правах рукописи

Що^/

Токарев Алексей Александрович

МЕХАНИЗМЫ ТРАНСПОРТА ТРОМБОЦИТОВ В ПОТОКЕ КРОВИ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ЭРИТРОЦИТОВ

Специальность 03.01.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Пущино-2012

2 6 ДПР 2012

005019173

Работа выполнена в ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Атауллаханов Фазоил Иноятович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Лобанов Алексей Иванович (Московский физико-технический институт, г. Долгопрудный)

доктор физико-математических наук Цатурян Андрей Кимович (ведущий научный сотрудник,

Научно-исследовательский институт механики МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва)

Ведущая организация: Физический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова,

Москва

Защита состоится « 16 » мая 2012г. в 15-30 на заседании совета Д002.093.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу:

142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу:

142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3, ИТЭБ РАН. Автореферат разослан «16» апреля 2012 года

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

Ланина Н.Ф.

О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ггуальность темы. Гемостаз — это эволюционно выработанная защитная система ганизма, основная задача которой состоит в минимизации кровопотери при эушении целостности кровеносной системы, т.е. при повреждении стенки какого-бо кровеносного сосуда. В результате работы системы гемостаза повреждённое сто оказывается закрыто гемостатической пробкой, состоящей из прочно легировавших тромбоцитов и фибриновой сети. Эта пробка препятствует теканию крови из сосуда на протяжении всего времени восстановления вреждённых тканей сосудистой стенки, а затем лизируется.

Нарушения работы системы гемостаза приводят к таким смертельно опасным стояниям, как кровоточивость (недостаточность гемостатической реакции) и эмбоз (её избыточность). Ввиду жизненной важности гемостатической системы я организма и опасности нарушений в её функционировании, на исследование гройства, механизмов регуляции гемостаза и разработку способов их коррекции правлены коллосальные усилия учёных всего мира. Традиционно, в первую ередь речь идёт о биохимии процесса: пристально изучается молекулярное тройство всех гемостатических звеньев, механизмы передачи сигнала в них и жду ними и т.д. При этом зачастую за рамками рассмотрения остаётся биофизика омбоцитарного звена, а именно — учёт физических условий кровотока, в котором отекает его работа в организме. Очевидно, что без учёта влияния потока лостное понимание картины работы гемостатической системы в организме возможно.

Поток крови является естественной средой, в которой функционирует система мостаза. Он перемещает компоненты этой системы в пространстве и механически здействует на гемостатическую пробку. Почти половину объёма крови занимают итроциты, биохимически в гемостазе не участвующие. Однако, достаточно давно вестно, что физическое присутствие эритроцитов радикально изменяет характер чения крови и, в частности, поведение в ней тромбоцитов. Присутствие итроцитов в крови, во-первых, приводит к перемещению большинства юмбоцитов из ядра потока в пристеночную область, т.е. к сильной ¡равномерности распределения тромбоцитов поперёк потока (Eckstein et al., 1987; arts et al., 1988). Во-вторых, оно увеличивает вероятность столкновения со стенкой юмбоцита, двигающегося в потоке уже рядом с ней (Goldsmith, 1971). В-третьих, ю сильно увеличивает скорость адгезии тромбоцитов к активной поверхности, 1ковой для тромбоцитов являются обнажённый субэндотелий сосудистой стенки, о компоненты или прочно адгезировавшие тромбоциты (Turitto and Baumgartner, >75; Aarts et al., 1983). Влияние потока на тромбоциты во многом определяется 1кже сдвиговым характером течения крови по сосудам - неравномерностью

распределения линейной скорости течения поперёк потока. Эта неравномерность вызывает постоянные столкновения друг с другом эритроцитов, движущихся по параллельным траекториям, расстояние между которыми меньше размера эритроцита. Столкновения эритроцитов друг с другом приводят к хаотическому перемещению поперёк потока и самих эритроцитов, и плазмы между ними, что сильно усиливает поперечный транспорт в крови - так называемая сдвиговая диффузия, или сдвиговая дисперсия. До настоящего времени механизмы влияния эритроцитов и сдвигового характера течения крови на функционарование как тромбоцитов, так и системы гемостаза в целом, остаются недостаточно понятными.

В виду сложности процессов, протекающих при работе гемостаза в условиях потока крови, хорошим дополнением, а зачастую и самостоятельным методом их исследования является построение математических моделей. Так, модели типа "диффузия-конвекция" с граничными условиями, описывающими адгезию к активной стенке, использовались в исследованиях адгезии тромбоцитов в проточных камерах in vitro (Turitto and Baumgartner, 1975). Применение этих моделей было принципиальным для планирования экспериментов и интерпретации их результатов. Именно на основании математического моделирования указанные авторы пришли к заключению о существовании различных режимов адгезии тромбоцитов из потока — диффузионного и кинетического. Однако, к настоящему моменту эти модели можно считать устаревшими, поскольку они не учитывают недавние экспериментальные отрытия в механизмах адгезии тромбоцитов -стадийность и существенную обратимость адгезии (Kulkami et aJ., 2000). Кроме того, определяемая с помощью этих моделей эффективная константа скорости адгезии оказывается зависящей от скорости сдвига и гематокрита, а значение коэффициента сдвиговой диффузии систематически отличается от измеренного независимыми от адгезии методами (Diller, 1988). Следовательно, указанные модели нуждаются в пересмотре и коррекции.

Неравномерность распределения тромбоцитов поперёк потока в существующих математических моделях либо всецело игнорируется, либо вводится феноменологически. Между тем, известно, что эта неравномерность в значельной степени определяется объёмной долей эритроцитов в крови. Распределение эритроцитов поперёк потока крови неравномерно: их объёмная доля практически всегда максимальна в центре потока и минимальна у стенок. Очевидно, что такое распределение эритроцитов может рассматриваться как вероятная причина неравномерного распределения тромбоцитов. Однако конкретный механизм этой связи недостаточно понятен, а наблюдающаяся в эксперименте степень неравномерности распределения тромбоцитов сильно превосходит оценки, получающиеся в предположении равномерного их распределения в межэритроцитарном пространстве. Уже более 30 лет назад было выдвинуто

предположение, что существенную роль в вытеснении тромбоцитов эритроцитами к стенкам играет собственный размер тромбоцитов, мешающий им поместиться между плотно соприкасающимися в центре потока эритроцитами (В1аскзЬеаг, .Гг. & а1., 1977). Согласно этому предположению, вследствие конечности своего размера тромбоциты сильнее вытесняются из центра ("ядра") потока, чем, например, окружающая эритроциты плазма крови. До настоящего момента это предположение, несмотря на его простоту, не получило теоретического обоснования, но и не было опровергнуто.

Таким образом, механизмы влияния эритроцитов на тромбоциты в потоке крови до сих пор остаются недостаточно понятными. Поэтому цель данной работы состояла в том, чтобы исследовать влияние эритроцитов на распределение тромбоцитов поперёк потока и на их адгезию к активной (т.е. адгезивной — способной поддерживать адгезию тромбоцитов) стенке теоретически - путём построения количественных математических моделей этих процессов, учитывающих физическое взаимодействие тромбоцитов с эритроцитами.

Цель работы: теоретическое исследование роли эритроцитов в регуляции работы тромбоцитарного звена гемостаза.

Задачи исследования:

1. Построить математическую модель неравномерного распределения тромбоцитов поперёк потока крови, учитывающую конечность размера эритроцитов и тромбоцитов.

2. С помощью построенной модели распределения тромбоцитов в потоке крови исследовать роль конечности их размера в процессе вытеснения эритроцитами из ядра потока к стенке.

3. Построить математическую модель адгезии тромбоцитов из потока крови на активную поверхность, учитывающую транспорт тромбоцитов в потоке, их столкновения с эритроцитами вблизи стенки и стадийность адгезии.

4. С помощью построенной модели адгезии тромбоцитов оценить роль их пристеночных столкновений с эритроцитами в процессе доставки на стенку.

Научная новизна. В работе построены количественные математические модели миграции тромбоцитов поперёк потока крови и адгезии тромбоцитов к активной поверхности. Эти модели основаны на учёте механического (физического) воздействия эритроцитов на тромбоциты в условиях потока; математическая модель адгезии тромбоцитов также учитывает новейшие представления о стадийности и обратимости их адгезии. Построенные модели всесторонне верифицированы сравнением с имеющимися экспериментальными данными. Показано, что сильная

неравномерность распределения тромбоцитов поперёк потока крови может возникать исключительно из-за их пассивного вытеснения эритроцитами из ядра потока (где концентрация эритроцитов максимальна) к стенке (где концентрация эритроцитов минимальна), и существенный вклад в этот' процесс вносит собственный размер тромбоцита. Также показано, что доставка тромбоцитов из потока крови на активную поверхность может быть обеспечена исключительно столкновениями тромбоцитов с эритроцитами, происходящими в непосредственной близости от этой поверхности.

Научно-практическое значение работы: достигнуто более глубокое понимание фундаментальных механизмов, управляющих процессами доставки тромбоцитов к месту их адгезии и агрегации. Построенные математические модели миграции тромбоцитов поперёк потока крови и их адгезии могут применяться для интерпретации экспериментальных результатов in vitro тестов функционального состояния тромбоцитов (методы с использованием проточных камер), при проектировании новых приборов для исследования тромбоцитарной адгезии и сепарации крови, а также для построения более сложных математических моделей системы гемостаза - в частности, модели образования и роста тромбоцитарного тромба in vivo.

Положения, выносимые на защиту:

1. Неравномерность распределения тромбоцитов поперёк кровотока в основном обусловлена их пассивным вытеснением эритроцитами из области большего в область меньшего локального гематокрита.

2. Доставка тромбоцитов из потока крови на активную поверхность в основном обеспечивается столкновениями тромбоцитов с эритроцитами, происходящими в непосредственной близости от этой поверхности.

Апробация работы состоялась 10 ноября 2011 г. на заседании проблемной комиссии «Фундаментальные исследования в гематологии, трансплантологии, трансфузиологии: Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; биохимия; биофизика» ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России. Результаты работы докладывались на конференциях: III Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (Москва, 2007), «Моделирование болезней крови» (Франция, 2007), «Зя Европейская летняя школа по биореологии и симпозиум по микро- и наномеханике и механобиологии клеток, тканей и систем» (Болгария, 2009), «Математические модели и численные методы в биоматематике» (Москва, 2011) и «Пятая всероссийская школа-конференция по физиологии кровообращения» (Москва, 2012).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 6 статей в рецензируемых журналах и 3 тезисов в трудах конференций.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав (глава 1 - обзор литературы, глава 2 - методы исследования, глава 3 - результаты и глава 4 -обсуждение), выводов, шести приложений и списка литературы, включающего 291 источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы исследования, сформулированы цели, задачи работы и выносимые на защиту положения, показаны научная новизна и научно-практическое значение работы.

Глава 1 содержит обзор литературы по теме диссертации. Обобщены результаты исследований влияния характеристик потока крови на эффективность работы системы гемостаза в целом и его тромбоцитарного звена в отдельности. В частности, проанализировано влияние основных параметров потока крови — пристеночной скорости сдвига, гематокрита, размера эритроцитов — на

(а) интенсивность сдвиговой диффузии (сдвиговой дисперсии) тромбоцитов,

(б) степень неравномерности распределения концентрации тромбоцитов поперёк потока, (в) скорость адгезии тромбоцитов к активным поверхностям. Рассмотрен молекулярный механизм и существующие математические модели адгезии тромбоцитов. Рассмотрены существующие математические модели формирования неравномерного распределения концентраций эритроцитов и тромбоцитов поперёк потока крови, а также концентрации частиц поперёк направления течения искусственных суспензий. Поскольку в литературе не обнаружено полноценной эйлеровой математической модели формирования неравномерного распределения эритроцитов поперёк кровотока, в Приложении А предложен подход к построению такой модели.

В главе 2 изложены методы исследования, применявшиеся в данной работе: специально созданные математические модели неравномерного распределения тромбоцитов поперёк потока крови и адгезии тромбоцитов к активной поверхности. Обе эти модели учитывают конечность размера тромбоцитов и эритроцитов и физическое влияние эритроцитов на тромбоциты.

Математическая модель неравномерного распределения тромбоцитов поперёк потока крови

Базовые предположения модели:

Предположение 1. Распределение эритроцитов поперёк потока уже известно из

эксперимента или теории. Предположение 2. Распределение эритроцитов поперёк потока не зависит от

присутствия тромбоцитов. Предположение 3. Тромбоциты не могут проникать внутрь эритроцитов и

равномерно распределяются между ними. Предположение 4. Миграция тромбоцитов поперёк потока происходит исключительно вследствие сдвиг-вызванной дисперсии (диффузии).

Поясним эти предположения и их реализацию в модели.

Фиксированностъ распределения эритроцитов. Эритроциты занимают около 40% объёма крови и полностью определяют характер её течения. Напротив, тромбоциты составляют настолько малую примесь к клеточной массе (0.7 об.%), что практически не влияют на движение крови. Это позволяет разделить задачи описания распределения эритроцитов и тромбоцитов. Распределение объёмной доли эритроцитов поперёк потока задавалось аналитически путём интерполяции экспериментально зарегистрированного в стеклянных трубках in vitro (Aarts et al., 1988) распределения "теней" эритроцитов - оболочек эритроцитов, из которых осторожным гипоосмотическим гемолизом удалён гемоглобин. Тени эритроцитов являются стандартными физическими моделями эритроцитов в потоке, поскольку ведут себя аналогично эритроцитам, но оптически прозрачны.

Пространственное распределение тромбоцитов в присутствии эритроцитов: теория доступного объёма. Распределение тромбоцитов между эритроцитами предполагалось случайным. Иначе говоря, полагали, что тромбоциты равномерно распределяются по доступному для них пространству, согласно гипотезе (Blackshear, Jr. et al., 1977). Поскольку размер тромбоцита конечен (несколько микрон), не всё пространство между эритроцитами доступно тромбоцитам, см. рис. 1. Так, при сближении двух эритроцитов на расстояние, меньшее поперечного размера тромбоцита, ни один тромбоцит уже не может попасть между ними, в то время как плазма крови заполняет его полностью. По той же причине центр тромбоцита не может приблизиться к поверхности эритроцита ближе чем на половину толщины тромбоцита. Таким образом, вокруг каждого эритроцита существует слой исключённого объёма. Если обозначить объёмную долю этих слоев (в некотором выделенном микрообъёме) как Ф„, а объёмную долю эритроцитов как Фетс, то доля оставшегося объёма, доступного для тромбоцитов, равна

Ф„=1-Ф*8с-Ф„ (1).

Как следствие, при увеличении Ф^

уменьшение Ф„ происходит гораздо быстрее, чем уменьшение 1 - Фтс.

Поэтому на участке от стенки до оси сосуда (на этом участке локальный гематокрит монотонно увеличивается от значений, близких к нулю, до ~60%

э

при нормальном среднем о гематокрите -40%) падение $ Ф„ гораздо сильнее н снижения 1-ФШс> что и вызывает сильное

обогащение пристеночного слоя тромбоцитами

(ОПСТ).

рШмМ

Рис. X. Схема, иллюстрирующая понятия исключённого и доступного объёмов. С удалением от стенки (слева направо) увеличивается объёмная доля эритроцитов, вызывая резкое уменьшение доли доступного тромбоцитам объёма.

Согласно теории доступного объёма, в стационарном случае

локальная концентрация тромбоцитов прямо пропорциональна локальной доле доступного им объёма: Р(г)~Фа(г), где г е [-1.1] - безразмерная радиальная координата. Поэтому знание зависимости Ф^Ф^с) и профиля распределения эритроцитов поперёк потока Фцвс(г) позволяет легко расчитать профиль распределения тромбоцитов:

Р(г) = ФДФквсВ

О ' <ф«> '

(2)

Здесь (•) - усреднение по

сечению

круглой трубки, т.е. ■ гсЬ-. Главная

характеристика этого профиля — степень обогащения пристеночного слоя тромбоцитами (ОПСТ) - определяется как отношение концентрации тромбоцитов около стенки к их концентрации на оси:

Кы, _ _ Ф.Квс^) Р*. Ф»,^ Ф. (Фиаско)"

В этой работе мы считали профиль распределения эритроцитов известным (из эксперимента или теории), и основная задача состояла в определении зависимости фа(ф.вс). Эта зависимость была найдена путём прямого численного моделирования на уровне отдельных частиц. Вкратце, кубический микрообъём с ребром L заполняли хаотически расположенными и ориентированными эритроцитами, суммарная объёмная доля которых равна Фюс. Форму каждого эритроцита в связанных с ним локальных координатах (х, у, z) задавали уравнением, аппроксимирующим форму человеческого эритроцита (Evans and Fung, 1972; Dupin et al., 2007):

( V

x2+y2

Здесь r¡2 =—-j—; Дадс=3.91 mkm и c=0.405 мкм - главный радиус и минимальная

RBC

полутолщина эритроцита; функция g(r¡ )=1 + 9.66г,2-5.43т-,4 задаёт двояковогнутость формы эритроцита. Для расчёта доли доступного объёма пробный шарик радиуса аР многократно помещали в случайные места этого куба. Долю доступного объёма рассчитывали как отношение числа попыток, когда шарик поместился между эритроцитами (не пересекая ни их границ, ни границ куба), к общему числу попыток М. Параметры L и М выбирали настолько большими (¿=50 мкм, M=L3/( 1 мкм3), чтобы они не влияли на результат. Описанный метод был верифицирован сравнением результатов стохастических расчётов с аналитическими оценками, возможными при ар«с или g=l. В первом случае Фо ~ l-Фмс- Во втором случае начальный наклон зависимости Ф„(ФМС) был расчитан исходя из объёмов эритроцита и окружающего его слоя толщины аР.

При моделировании не учитывали существующую в крови слабую обратимую агрегацию эритроцитов, поскольку (а) она отсутствовала в экспериментах, с которыми мы сравнивали модельные предсказания, (б) она происходит при скоростях сдвига /~50 с1 и ниже (Goldsmith and Turitto, 1986), а ОПСТ наблюдается, когда у выше -200 с"1 (Eckstein et al., 1987; Tilles and Eckstein, 1987) и (в) убедительные экспериментальные данные о влиянии агрегации эритроцитов на ОПСТ отсутствуют (Nash et al., 2008). Физиологический разброс тромбоцитов по размеру и сплюснутость их формы также не учитывали, поскольку (а) главная задача состояла исследовании принципиальной возможности формирования сильно неравномерного распределения тромбоцитов поперёк потока крови вследствие конечности их собственного размера и (б) в абсолютном большинстве экспериментальных работ для исследования ОПСТ в качестве физической модели тромбоцитов использовали искусственные шарики, дисперсия которых по размеру

очень мала, а никаких различий в величине ОПС между шариками и тромбоцитами не обнаружено (см. рис. 5).

Кинетика Muzpaifuu тромбоцитов поперёк потока. Миграция тромбоцитов между эритроцитами в ламинарном сдвиговом потоке происходит вследствие сдвиг-вызваниой дисперсии (диффузии), возникающей из-за непрерывных столкновений эритроцитов друг с другом (Goldsmith, 1971; Goldsmith and Turitto, 1986). Полностью определяя характер течения крови, эритроциты задают также и интенсивность сдвиг-вызванной латеральной дисперсии (диффузии) всех остальных клеток крови и плазмы (Diller, 1988; Zydney and Colton, 1988). Эта интенсивность на 2-3 порядка больше интенсивности броуновской диффузии клеток крови (Goldsmith and Turitto, 1986). Прямые наблюдения (Goldsmith, 1971) и теоретические исследования (Zydney and Colton, 1988; Crawl and Fogelson, 2011) показали, что коэффициенты сдвиговой диффузии тромбоцитов и эритроцитов близки между собой. Поэтому мы задавали их в виде аналитической формулы, аппроксимирующей результаты многочисленных опытов по наблюдению латеральной миграции эритроцитов и других деформируемых частиц в сдвиговом потоке:

Dzc = kRgBc ' У' " (' ~ ®квс)" • (5)

Здесь у - локальная скорость сдвига (с-1); kRlnc =2.646 мкм2, «=0.8. Неравномерность распределения доли доступного для тромбоцитов объёма приводит к различию вероятностей случайного перемещения тромбоцита по и против градиента Ф„. Учёт этого различия позволил нам получить уравнение для вектора диффузионного потока тромбоцитов:

- егас/Ф Р

X = ~DZC ■ gradP + Р • Dzc ■ ' = -Ф„ • Dzc ■ grad—. (6)

а ^а

Это уравнение на микроуровне описывает стремление тромбоцитов равномерно распределиться по доступному для них объёму. На макроуровне оно описывает перераспределение тромбоцитов из областей меньшей доступности в области большей доступности. Изменение концентрации тромбоцитов в потоке в условиях опыта (Yeh and Eckstein, 1994) описывали конвекционно-диффузионным уравнением:

lP+u±P = J±+l}Nr-i.Ni (7)

dt дх Ur г) ' дх К )

Здесь I — время, и(г) - профиль скорости потока (предполагавшийся параболическим), Nr и Nx - компоненты потока (6) в радиальном и аксиальном направлениях, соответственно. Уравнение (7) было обезразмерено и решалось в прямоугольнике [О < д: < 1. l] х [0 < г < l] с начальным условием Р(х, г),=0 = 0, условием на входе Р(г)х^0 =1 и условиями непроницаемости Nr i,.,0 |=0. Nx 0 на остальных границах. Для расчёта времени латеральной миграции отдельной

9

частицы поперёк потока в опыте (Goldsmith, 1971) задача сведена к одномерной, поскольку при движении частицы в установившемся однородном течении действующие на неё латеральные силы не зависят от параллельной потоку координаты х:

Здесь р - плотность вероятности нахождения частицы в радиальной позиции г в момент времени t.

Математическая модель адгезии тромбоцитов к активной поверхности

Условия адгезии тромбоцитов. Мы рассматривали поток крови, содержащий эритроциты и тромбоциты, текущий над "активной" поверхностью, т.е. такой, к которой тромбоциты могут прилипать. Эта система является удобной, давно и широко используемой моделью для экспериментального изучения тромбоцитарной адгезии с помощью проточных камер in vitro (Baumgartner, 1973; Sakariassen et al., 2001). В эксперименте цельную или восстановленную кровь в контролируемых условиях прокачивают над активатором (наиболее физиологичным является вывернутый кусок кровеносного сосуда с обнаженным субэндотелием или подложка с иммобилизованным коллагеном) и регистрируют среднюю поверхностную плотность адгезировавших тромбоцитов как функцию времени. Из результатов серии таких экспериментов находят зависимость начальной скорости адгезии тромбоцитов от пристеночной скорости сдвига, гематокрита, а также от аксиальной координаты. Указанные зависимости характеризуют совокупное действие процессов доставки и связывания тромбоцитов с поверхностью. Использование сильного активатора тромбоцитов — коллагена — и ингибитора циклооксигеназ — аспирина -позволяет исключить или по крайней мере сильно уменьшить влияние выбрасываемых тромбоцитами активаторов - АДФ и ТхА2; генерацию тромбина ингибируют цитратом. В результате тромбоциты активируются только коллагеном и адгезируют на него в монослой.

Стадии тромбоцитарной адгезии. Главная идея данной работы, отличающая её от предыдущих континуальных моделей адгезии тромбоцитов, состоит в рассмотрении этого процесса как многостадийного, состоящего из следующей последовательности событий (рис. 2 А):

I. Транспорт в толще потока. Конвекционный перенос тромбоцита потоком в направлении общего течения крови с одновременным дисперсионным (диффузионным) движением в поперечном потоку направлении.

II. Поверхностные стадии адгезии тромбоцита:

(В)

а) столкновение тромбоцита, движущегося в непосредственной близости от стенки, с эритроцитом или какой-либо другой клеткой крови, в результате чего происходит столновенис тромбоцита с поверхностью;

б) захват тромбоцита поверхностью;

в) торможение захваченного тромбоцита относительно потока при его перемещении по поверхности;

г) отрыв тромбоцита потоком или его остановка и прочное необратимое связывание с поверхностью.

Выделение этих стадий целиком основано на результатах экспериментальных исследований движения тромбоцитов в потоке и при адгезии. Латеральное движение тромбоцитов в присутствии эритроцитов в подробностях изучалось Голдшмитом. Им было показано, что физическое присутствие эритроцитов на несколько порядков увеличивает интенсивность миграции тромбоцитов поперёк потока (стадия [) и частоту их столкновения со стенкой (стадия Ila) (Goldsmith, 1971). Сравнительно недавние исследования показали, что коснувшийся стенки тромбоцит не прилипает к ней прочно сразу, а сначала захватывается через связи GPIba-vWf (стадия 116), что позволяет ему снизить скорость относительно потока (стадия Нв), и только потом прилипает прочно через интегрины или же отрывается потоком (стадия Нг) (Kulkarni et al., 2000). Насколько нам известно, о суммировании этих механизмов в единую математическую модель ранее не сообщалось.

Рис. 2. Транспорт

тромбоцита к стенке, по стенке и от стенки. (А) Последовательность стадий адгезии тромбоцита. Движущийся в толще потока тромбоцит

доставляется в

пристеночный слой сдвиг-вызванной диффузией, выталкивается на

поверхность при очередном неупругом столкновении с какой-либо клеткой крови -например, эритроцитом, - и захватывается поверхностью. Последующее торможение и активация тромбоцита приводят к его остановке и прочному связыванию, в противном случае тромбоцит отрывается потоком. (Б) Соответствующая кинетическая схема. Р -свободно несущиеся потоком вдали от стенки тромбоциты, Р„ - те же тромбоциты вблизи стенки, R - тормозящиеся стенкой (катящиеся или скользящие по ней) захваченные тромбоциты, М -прочно связавшиеся тромбоциты.

1 -

А

Ч

% Vv«

'.V

J "Як. На Стен Ни<* Ш

Перемещение/ __-Г С---|

Jf/я. ^ wtoij активация

Прочное гвание

М

Уравнения модели адгезии. Модель адгезии тромбоцитов была основана на кинетической схеме, показанной на рис. 2 Б, которая соответствует изложенной выше последовательности стадий адгезии. В соответствии с этой схемой, скорость адгезии равна скорости последней стадии процесса:

dM , / ч

— = khmdR\x). (9)

Здесь R(x) - поверхностная концентрация захваченных тромбоцитов, кьы -константа скорости связывания, равная величине, обратной времени активации (Та) интегринов GPIIbllla захваченного тромбоцита. Поверхностная концентрация R подчиняется уравнению сохранения типа "реакция-конвекция", выполняющемуся на активной поверхности:

8R 8R

— + w— = а/(х)в(х)~(кы +kia)R(x)_ (10)

Здесь w - линейная скорость тормозящегося тромбоцита, J(x) - поток тромбоцитов на стенку (число ударов тромбоцитов об участок стенки единичной площади в единицу времени), в(х) - доступность поверхности для связывания, а -эффективность захвата тромбоцита (вероятность захвата тромбоцита, столкнувшегося с полностью свободной стенкой), - константа скорости отрыва захваченного тромбоцита. Поскольку в эксперименте среднее значение w составляет несколько мкм/с, длиной тормозного пути тромбоцита можно пренебречь по сравнению с длинной поверхности адгезии. Характерное время активации тромбоцита Гд~1-3 с, что гораздо меньше продолжительности эксперимента (1-5 минут). Это позволяет предположить квазистационарность R, что даёт

к '

КЬМ + "da

Для расчёта потока тромбоцитов на стенку J мы предположили, что со стенкой сталкиваются только те тромбоциты, что были вытолкнуты на неё из узкого пристеночного слоя при неупругом столкновении с какой-либо клеткой крови (эритроцитом или другим тромбоцитом), двигающейся на немного большем расстоянии от стенки и, соответственно, с большей скоростью (рис. 2 А). В результате необратимого столкновения в вязкой среде частицы, двигающиеся по близким параллельным траекториям, смещаются поперёк потока на расстояние, примерно равное их размеру (Phillips et al., 1992; Nott and Brady, 1994). Поэтому толщину слоя, из которого тромбоцит выталкивается на стенку при столкновении с другой клеткой крови, считали равной размеру этой клетки. Применение теории Смолуховского для расчёта частоты пристеночных столкновений дало

J=QKP, где Q = + e2K2dpVrP. (12)

Здесь - пристеночная скорость сдвига; d№C и dp- главные диаметры эритроцита и тромбоцита, Vmc и VP - их объёмы; К, = ^k,dp и Уdl _

^КВВС 12VP

коэффициенты теории Смолуховского, скорректированные факторами kj и /v;. учитывающими игнорированные при расчёте частоты и эффективности столкновений несферичность частиц и близость стенки; t, = eh(Л,,yw) и е2 = sh(l,yw) - гидродинамические эффективности столкновений "тромбоцит-эритроцит", 1 dp

Л - ——, и "тромбоцит-тромбоцит", ^ = 1 (мы использовали численные

"ЛВС

результаты расчётов эффективностей столкновений "сферических" тромбоцитов и их агрегатов в простом сдвиговом потоке (Tandon and Diamond, 1997) из-за отсутствия таких данных для тромбоцитов и эритроцитов реальной сплющенной формы около стенки):

£л(л,г)=х,(л^уЮ, (13)

где Х.(Л) = -0.2258А3 -0.1579Л2 + 0.7356А+0.1077, У,(Л) = -1.1866Л* +2.7509А1 -2.0556Л. + 0.6411.

Эффективность захвата а предполагали независящей от yw в соответствии с экспериментальными данными о том, что эффективность связывания двух сталкивающихся тромбоцитов (связывающихся через мостики GPIba-vWf-GPIba) резко растёт только при патологических скоростях сдвига выше 5000 с"1 (Huang and Heliums, 1993). Предполагали, что константа скорости прочного связывания къш уменьшается с ростом потому что даже медленное движение тромбоцита препятствует его прочному связыванию. Для простоты мы полагали эту зависимость линейной:

k»*=kL-0r., 04)

где к°ьы и р - константы. Константу скорости отрыва kdei предполагали пропорциональной пристеночной скорости сдвига, поскольку вероятность отрыва тромбоцита потоком прямо пропорциональна пристеночному напряжению сдвига (Wu et al., 1997; Goodman et al., 2005):

(15)

Выражение для скорости адгезии тромбоцитов из уравнения (9) приобрело вид

dM dt

с эффективной константой в виде

= (16)

Kff=aQ-^-- = У-, (17)

к" В

где ка = , 4= ■ Доступность поверхности для связывания расчитывали как 3 8

(18)

где А/„=4/ж^ - плотность монослоя тромбоцитов при 100% покрытии поверхности. Полученные значения М нормировали на Л/т /100% для перевода в % покрытия поверхности и во всех случаях, кроме исследования зависимости М(х), усредняли по всей активной поверхности. Начальное условие для М(х) задавали нулевым.

Транспорт тромбоцитов в потоке описывали уравнениями, аналогичными уравнениям (5-7), со следующими отличиями: 1) неравномерностью распределения эритроцитов поперёк потока пренебрегали, поскольку для использовавшихся в экспериментах проточных камер с просветом 1200 мкм эта неравномерность несущественна; 2) для корректности описания случая нулевого гематокрита в выражение для коэффициента сдвиговой дисперсии тромбоцитов (5) добавили члены, соответствующие сдвиговой дисперсии из-за столкновений "тромбоцит-

тромбоцит" }У?Р) и броуновской диффузии тромбоцита

= —■ (19)

. 2 .

(0^=0.158 мкм2/с). Уравнения в потоке и на стенке были связаны граничным условием

сЛ

Редуцированная модель адгезии. Для исследования регуляции скорости адгезии тромбоцитов их столкновениями с эритроцитами сформулированная выше "полная" модель была частично редуцирована. Редукция состояла в неучёте:

(1) изменения концентрации тромбоцитов в потоке вследствие адгезии,

(2) насыщения поверхности адгезировавшими тромбоцитами и (3) потока тромбоцитов на стенку вследствие их столкновений друг с другом. Для этого в уравнении (16) положили Р=Р0, <9=1 и отбросили второе слагаемое в уравнении (12). Получили аналитические выражения для скорости и величины адгезии:

= кгПР4, где к^ = —---2 шс' ¿Г1ВСФШС. (20)

Во всех расчётах значения параметров в полной и редуцированной моделях были одинаковыми.

Оценка свободных параметров модели. Свободными параметрами модели адгезии были три кинетических параметра - а, ка и а также корректирующие

форм-факторы к) и Для оценки ка и с, из зависимости скорости адгезии от скорости сдвига уравнения (13), (20) были переписаны как

= Л--, где А = а- \ Л\(я)2Л25'^У^Г ^ф^-^-бО I. (21)

АК ~ьК)

Множитель . 60 переводит скорость адгезии в % монослоя/мин. Константы А,

м„

ка и ^ варьировали независимо (см. рис. 9) до достижения хорошего согласия с экспериментальными данными. Для оценки отношения кх: к2 уравнения (20) были переписаны в виде

,,0 12Vrbc ( ]/ + 1/ Л

= вш(М|.+М«Бс)- (22)

Значения а в этих двух случаях были грубо оценены как величина А в уравнении (21), делённая на выражение в скобках, и как куб наклона прямой, аппроксимирующей экспериментальные данные в координатах уравнения (22), соответственно. Затем а немного варьировали до достижения хорошего согласия рассчитанных по полной модели скоростей адгезии с экспериментальными данными во всём диапазоне Д, (см. рис. 9 А), Фшс и dmc{cu. рис. 10 Б).

Решение дифференциальных уравнений

Все дифференциальные уравнения решали численно в пакете COMSOL Multiphysics 3.2а, основанном на методе конечных элементов. Использовали лагранжевы элементы второго порядка. В двухмерных случаях расчётная сетка была триангулярной и неструктурированной, в одномерном - равномерной. Размеры элементов выбирались такими, чтобы дальнейшее измельчение сетки практически не изменяло результат. Максимальную относительную ошибку задавали равной 0.1%.

Результаты работы и их обсуждение представлены в главах 3 и 4, соответственно.

Распределение тромбоцитов поперёк потока крови

Конечность размера тромбоцитов уменьшает долю доступного им объёма на долю исключённого объёма. Основное предположение теории доступного объёма (Blackshear, Jr. et al., 1977) состоит в том, что конечный размер тромбоцитов приводит к сильному уменьшению локальной доли объёма, доступного им между эритроцитами. В то же время, трудность вычисления доли доступного объёма является самым слабым местом этой теории, не позволявшим предыдущим исследователям проверить её количественно (Yeh and Eckstein, 1994). Поэтому мы разработали методику прямого численного эксперимента для вычисления доли

15

доступного объёма Ф„ при различных величинах объёмной доли эритроцитов Фмс и характерного размера тромбоцита ар. Результаты расчётов - зависимость Ф0(Фйгс) при различных аР - ноказаны символами на рис. 3 А. С ростом Фмс величина Ф„ уменьшается гораздо быстрее, чем 1-Ф;гйС, и начальный угол наклона этой зависимости растёт при увеличении ар. Для вычисления профилей распределения тромбоцитов из профилей распределения эритроцитов поперёк потока эти численные результаты были аппроксимированы простой аналитической формулой.

Основной причиной неравномерности распределения тромбоцитов поперёк потока может быть эффект "исключённого и доступного объёмов". Эмпирическая формула

Ф =

ехрС-рФ^с • (2ФКВС +1)) + / 1 + /

(23)

где р=ехр(ар), хорошо аппроксимирует результаты стохастических расчётов юс0?) приf— 0 (рис. 3 А,линии, и Б, символы). Поскольку в большинстве in vitro исследований неравномерности распределения тромбоцитов в качестве их физических моделей использовались микросферы диаметра -2.5 мкм (см. рис. 5 Б), для сравнения с экспериментальными результатами мы положили р=ехр( 1.25)=3.5. Малый параметр / (0 </« 1),

соответствующий значению Ф„ при высоких показателях гематокрита /

1 + /

: / при больших Фис),

введён в уравнение (23) на основании предположения, что упорядочивание или деформирование эритроцитов в толще потока, не учитывавшиеся в стохастических расчётах, могут

1 I Г

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 Объёмная доля эритроцитов ФрЕС Рис. 3. (А) Символы: зависимость доли объёма, доступного для моделирующих тромбоциты микросфер, от объёмной доли эритроцитов при ар=0.01 (•), 1 (■), 1.25 (Т) и 2.5 мкм (♦). Непрерывные и пунктирные кривые построены по уравнению (23) при значениях р= 1, 3, 4 и 12 (сверху вниз), соответственно, и _/= 0; точечная кривая построена при р=4, /=0.1. Доля внеэритроцитарного пространства 1 - Фтс показана штрих-пунктиром. (Б) Зависимость р(ар) и ее аппроксимация функцией р=ехр(ар).

несколько увеличивать Ф„ по сравнению с полученными в наших расчётах величинами. Мы удостоверились в том, что параметр р сильно влияет на ОПСТ, а/ - слабо.

Мы исследовали на качественном уровне вклад эффекта "исключённого и доступного объёмов" в неравномерность распределения тромбоцитов поперёк потока, а также чувствительность степени неравномерности к параметрам р и /. Для этого мы расчитали профили концентрации тромбоцитов при фиксированном распределении эритроцитов и нескольких наборах значений р и / (рис. 4). Оказалось, что увеличение р ведёт к значительному росту смещения тромбоцитов из ядра потока к стенкам (рис. 4 А). Общая форма профилей согласуется с результатами всех известных исследований ОПС тромбоцитами и моделирующими их частицами: пристеночные зоны оказываются сильно обогащены, а центральная -обеднена частицами. Влияние величины параметра / на форму профилей показано на рис. 4 Б. С увеличением/распределение частиц становится немного более равномерным. Пристеночная концентрация тромбоцитов подвержена гораздо меньшему влиянию величины /, чем р, а величина/ гораздо сильнее влияет концентрацию вблизи оси, чем на пристеночную. Т.о., эффект "исключённого и доступного объёмов" действительно может быть ответственней за обогащение пристеночного слоя, и величина этого эффекта в основном определяется размером частиц, который определяет величину параметрар (формула (23)).

Зависимость обогащения пристеночного слоя тромбоцитами (ОПСТ) от гематокрита. На рис. 5 приведено сравнение теоретической (/=0.06, линии) и экспериментальной (символы) зависимости величины ОПСТ от входного гематокрита. На рис. 5 А представлены данные группы проф. Сихма, уникальность которых состоит в одновременном измерении радиальных распределений тромбоцитов и эритроцитов. Поскольку диаметр трубок составлял 3 мм, для прозрачности суспензии использовали тени (оболочки) эритроцитов. Ранние

Рис. 4. Радиальное распределение тромбоцитов (тонкие кривые, левые оси), рассчитанное по уравнениям (2), (23) при различных значениях параметров р {А) и / (Б). Заданное распределение объёмной доли эритроцитов при их средней объемной доле 0.4 показано толстыми линиями (правые оси).

исследования показали, что поведение теней эритроцитов в потоке близко к поведению эритроцитов и что тени являются хорошими физическими моделями эритроцитов. В исследованиях группы проф. Экштейна, рис. 5 Б, условия были более близкими к физиологическим: диаметры трубок и высоты каналов составляли 50-220 мкм, эритроциты были отмытые, но интактные (не лизированные). Однако распределения эритроцитов в этих опытах не регистрировали. Поэтому теоретические значения ОПСТ на рис. 5 А расчитаны исходя из экспериментальныхой серии профилей распределения теней эритроцитов, а на рис. 5 Б - из зависимости объёмной доли теней на оси потока от их объёмной доли на входе в той же серии профилей.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,0 0,2 0,4 0,6

Входной гематокрит/100%, Ф0 Входной гематокрит/100%, Ф0

Рис. 5. Зависимость ОПС тромбоцитами (А) и микросферами, моделирующими тромбоциты, (Б) от гематокрита, расчитанная при р= 3.5,/=0.06 (толстые линии) и полученная в экспериментах in vitro (символы). (А) Распределения СЬС^-фиксированных тромбоцитов в присутствии теней эритроцитов детектировали методом лазерной допплеровской велосиметрии в стеклянных трубках внутреннего диаметра 3 мм и усредняли по пристеночной и центральной зонам (Aarts et al., 1988). Пристеночные скорости сдвига были равны 240 с"1 (л), 760 с"1 (°) и 1200 с'1 (а). Фиксирование тромбоцитов не изменяло их поведения в потоке. Теоретические расчёты проводили по уравнениям (2), (23), расчитанные профили распределения тромбоцитов усредняли аналогично экспериментальным. (Б) Распределения микросфер тромбоцитарного размера (2ар =2.2*2.5 мкм) в присутствии отмытых эритроцитов были получены методом стробоскопической эпифлюоресцентной микроскопии в работах (Tilles and Eckstein, 1987) ((Eckstein et al., 1987) (®) и (Eckstein et al., 1988) (®) при /„ =1630 с"1 и методом заморозки капилляров в работах (Bilsker et al., 1989) (в,ш,ш,в при ^=400, 410, 500 и 900 с"1), (Koleski and Eckstein, 1991) (*, /„=400 с"1) и (Yeh et al., 1994) ( *, /„=555 с"1; *, 700*900 с"1). Если экспериментальные ошибки сообщались в оригинальной работе, то они также указаны. При Ф0=0.15 и 0.4 символы смещены на ±0.01 для уменьшения перекрытия. Теоретические расчёты проводили по уравнениям (3), (23).

Рост ОПСТ при увеличении Ф„вс в расчётах согласуется с экспериментальными результами. И теоретические, и экспериментальные зависимости начинаются из 1 (нет обогащения) при Фйвс =0 и имеют сигмоидный вид. Различие между теоретическими кривыми, представленными на рис. 5 А и Б, обусловлено различием способов расчёта ОПСТ, которые воспроизводят способы обработки соответствующих экспериментальных данных. Согласие теоретических и экспериментальных зависимостей от гематокрита подтверждает, что имеющегося в потоке крови градиента доступного объёма достаточно для формирования сильного ОПСТ.

Экспериментальные данные свидетельствуют также, что ОПСТ усиливается с ростом скорости сдвига (рис. 5 А, символы). Хотя такое поведение можно хорошо описать путём подбора монотонно убывающей зависимости величины/от скорости сдвига (результаты не показаны), исследование механизма возникновения этой зависимости является предметом будущей работы.

Поперечный транспорт тромбоцитов в градиенте доступного объёма. Приведённые выше стационарные расчёты и уравнение (6) показывают, что градиент доступного объёма может быть основной причиной существования "реологического потенциала", феноменологически предложенного (Eckstein and Belgacem, 1991) для описания неравномерности распределения тромбоцитов. Для исследования этого вопроса в нестационарном случае были проведены расчёты процесса перераспределения тромбоцитов. На рис. 6 А показаны траектории отдельных микросфер, моделирующих тромбоциты, в движущейся суспензии теней эритроцитов (Goldsmith, 1971). Как видно, претерпевая частые изменения направления движения в радиальном направлении, с течением времени микросферы постепенно мигрировали к периферии потока. Рис. 6 Б показывает расчитанную радиальную зависимость плотности вероятности нахождения микросферы в последовательные моменты времени, если при t= 0 её положение было равновероятным. С течением времени вероятность нахождения частицы в пристеночной зоне растёт, в приосевой - уменьшается, в согласии с экспериментальной картиной.

Сравнить время миграции в расчёте и эксперименте можно лишь приближённо, поскольку траекторий двух частиц недостаточно для точной оценки этого времени. Микросферы проходили половину расстояния от оси потока до стенки примерно за 20 с. Поскольку время распространения диффузионного (хаотического) процесса пропорционально квадрату расстояния, то время полного перераспределения микросфер поперёк потока в данном опыте можно оценить величиной порядка 22-20 с = 80 с. В расчёте характерные времена изменения плотности вероятности при г='Л и г= 1 составили примерно 0.37to = 7.4 с и 0.78/о~16с, соответственно (рис. 6 В, непрерывные линии). Время полного

19

перераспределения составило (3+5)-?0=60+Ю0с. Эти величины хорошо согласуются с оценёнными из эксперимента.

r/R. 0.1-

Г,мкм

Безразмерная радиальная координата г

Т-1-1-1

2 4 6 8 Безразмерное время t

Рис. 6. Миграция одиночного моделирующего тромбоцит шарика поперек потока. (А) Экспериментальные траектории двух латексных микросфер диаметра 2 мкм в суспензии теней эритроцитов, текущей по трубке радиуса Ro=38.25 мкм (Goldsmith, 1971). Верхняя граница рисунка представляет собой ось потока, нижняя - стенку трубки. Доля теней эритроцитов на входе 0.44, пристеночная скорость сдвига 16 с"1. (Б) Распределение плотности вероятности нахождения частицы в последовательные моменты времени, рассчитанное по уравнению (8) с использованием уравнений (5), (6) и (23). Радиус трубки, пристеночная скорость сдвига и показатель гематокрита соответствовали экспериментальным условиям; значенияр и/были теми же, что и на рис. 5, to было положено равным 20 с. Стационарный профиль {пунктир) рассчитан по уравнению (2). (В) Кинетика плотности вероятности в точках г=0, 'Ли 1. Характерные времена изменения плотности вероятности (0.37 и 0.78 для г=У2 и 1, соответственно) определены по е-кратному уменьшению Р-Р,-

величины

1 -А-

Переходный процесс формирования неравномерного распределения микросфер в потоке суспензии отмытых эритроцитов исследовали в работе (Yeh and Eckstein, 1994). Регистрировали профили распределения шариков в сечении потока через короткое время после переключения источника с резервуара без шариков на резервуар с шариками. Рис. 7 показывает полученные экспериментально (А) и расчитанные для тех же параметров течения (Б) профили распределения частиц. Качественно теоретические и экспериментальные профили похожи: наибольшее обогащение пристеночной зоны происходит в ближайшем ко входу срезе (непрерывные линии), в следующем срезе обогащение меньше (пунктирные линии), а в самом дальнем срезе обогащение отсутствует (точечные линии). Вероятные причины количественных разногласий - более крутое распределение эритроцитов вблизи стенки в эксперименте, чем предполагается в модели, и отклонение профиля скорости от пуазёйлевого, неучтённое в модели. На общие выводы работы эти разногласия не влияют.

Рис. 7. Радиальное распределение шариков радиуса 1.25 мкм, моделирующих тромбоциты, в эксперименте (А) и в теории (Б) на различных расстояниях от входа в трубку. (А) Стационарное распределение эритроцитов устанавливалось в начале каждого эксперимента (Yeh and Eckstein, 1994). Затем источник переключат на такую же суспензию, но с добавлением шариков. Через несколько секунд поток быстро замораживали, и методом эпифлюоресцентной микроскопии регистрировали профили распределения шариков в срезах (штук/мкм2), сделанных на различных расстояниях от входа. Профили из нескольких различных опытов усредняли. Продольные координаты срезов указаны на рисунках в % от длины идеального параболоида, содержащего микросферы в данный момент времени. Эта длина составляла 40 см; длина трубки - 50 см; радиус трубки - 110 мкм; гематокрит 40%. (Б) Расчет проведен по уравнению (7) с использованием уравнений (5), (6) и (23); значения р и/были те же, что и на рис. 5.

Адгезия тромбоцитов из потока крови к активной поверхности

Адгезия в полной и редуцированной моделях. Для идентификации лимитирующей стадии адгезии тромбоцитов мы сравнивали предсказания полной и редуцированной моделей между собой и с экспериментальными данными. Рис. 8 даёт общее представление о том, как происходит адгезия в теории и в эксперименте. На рис. 8 А показаны изолинии концентрации тромбоцитов Р(х,у) в пристеночной - зоне потока (у=0...60 мкм), расчитанные по полной модели для момента времени /=3 мин. Как видно, вдоль активной поверхности образуется узкая область, в которой концентрация тромбоцитов понижена.

100 -,

1—'—1—'—I—'—I

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Аксиальная координатах, 10* мкм

2 4 6 8 10 Время f, минуты

Рис. 8. (А) Распределение концентрации тромбоцитов вблизи активной стенки проточной камеры в момент времени (=3 мин, рассчитанное по полной модели при /,=832 с"'. Свободные параметры равны а=0.12, ка=1000 с"1, 4=0 02, kj=0, ki=\. Концентрация тромбоцитов на входе 3.7410"4 тромбоцитов/мкм3, изолинии показывают концентрации тромбоцитов в потоке (сверху вниз) 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3 и 3.2 х10ч тромбоцитов/мкм3. Рисунок растянут вдоль оси у для ясности, область >>>60 мкм не показана. (Б) Покрытие поверхности тромбоцитами в полной (непрерывная линия) и редуцированной (пунктир) моделях, а также в эксперименте (Turitto and Baumgartner, 1975) (символы) в тот же момент времени. (В) Кинетика степени покрытия, усредненной вдоль всей

22

активной поверхности, в полной (толстая непрерывная линия) и редуцированной (пунктир) моделях. Точками отмечен типичный интервал расчёта начальной скорости адгезии (/=3 мин). Тонкой линией показана концентрация тромбоцитов в около стенки (у=0), нормированная на Р0/Ю 0%.

На рис. 8 Б показана поверхностная плотность адгезировавших тромбоцитов М(х) в тот же момент времени, расчитанная по полной (непрерывная линия), редуцированной (пунктир) моделям и зарегистрированная (Turitto and Baumgartner, 1975) экспериментально (символы). И в эксперименте, и в полной модели покрытие поверхности тромбоцитами лишь незначительно уменьшается вдоль оси х. Жирные кривые на рис. 8 В показывают кинетику М в полной (непрерывная кривая) и редуцированной (пунктир) моделях. Эти модели дают одинаковую начальную скорость адгезии. Как и в редуцированной, в полной модели начальный рост М практически линейный. Затем его скорость падает при приближении М к 100%. Это происходит из-за насыщения поверхности адгезировавшими тромбоцитами (уменьшения доли свободной поверхности 0), а не из-за удаления тромбоцитов из пристеночного слоя при адгезии, т.к. это удаление быстро компенсируется доставкой новых тромбоцитов из толщи потока (тонкая кривая). Наш дальнейший анализ, как и большинство экспериментов, был ограничен начальными временами адгезии - на которых влияние насыщения поверхности мало.

Зависимость скорости адгезии тромбоиитов от скорости сдвига вызвана столкновителъным механизмом их доставки на стенку. Хорошо известно, что с увеличением скорости сдвига и концентрации эритроцитов скорость адгезии тромбоцитов сильно растёт, однако механизм этого явления неясен. Мы проверили гипотезу, что этот механизм состоит в выталкивании тромбоцитов из пристеночного слоя потока на активную поверхность. Для этого мы сравнили предсказания редуцированной и полной математических моделей адгезии при различных пристеночных скоростях сдвига с экспериментальными данными, полученными другими авторами. Как показывает рис. 9А, при а=0.12, ¿„=1000 с", £=0.02 предсказания редуцированной (пунктир) и полной (непрерывная линия) моделей находятся в общем согласии с экспериментальными данными (пустые символы). Различия между двумя теоретическими кривыми незначительны и сравнимы с величиной ошибки эксперимента, что говорит о малости вкладов процессов, которыми мы пренебрегли при редукции.

Чтобы убедиться в независимости влияния параметров a, ka и \ на результаты расчётов, мы исследовали влияние варьирования этих параметров на скорость адгезии, расчитанную по редуцированной модели. Эти параметры определяют: а -эффективность захвата тромбоцита поверхностью, ка - скорость его прочной адгезии при низких скоростях сдвига и q - уменьшение скорости прочной адгезии с ростом скорости сдвига. Рис. 9 Б показывает, что увеличение ка увеличивает

23

максимальную скорость адгезии, в то время как увеличение % уменьшает адгезию при больших, но не при малых скоростях сдвига. Увеличение А, и значит, а, сдвигает всю кривую вверх (не показано, см. формулу (21)). Влияние параметров на разные характеристики этой кривой свидетельствует об однозначности определения свободных параметров модели при описании экспериментальных данных редуцировашюй моделью.

Пристеночная скорость сдвига rw, с"1

Рис.9. (А) Зависимость начальной скорости адгезии тромбоцитов от скорости сдвига, рассчитанная по редуцированной (пунктир), полной (непрерывная линия) моделям при аН). 12, £(,=1000 с'1, 5=0.02, ki=Q, к2=1 и полученная in vitro (пустые символы). Редуцированную модель задавали уравнениями (21) с А=0.2. Уравнения полной модели решали на отрезке /=0..3 мин; полученные значения М были разделены на 3. Экспериментальные скорости адгезии тромбоцитов из цельной кроличьей крови к субэндотелию кроличьей аорты взяты из (Turitto and Baumgartner, 1975; Turitto and Baumgartner, 1979). Через каждый набор экспериментальных данных проведена пунктирная линия; ошибки указаны, если они были приведены. Заполненные символы соответствуют расчётам по «расширенной» версии полной модели при k"tml = , 5 = 1(Г3, /? = 2х10~5 (треугольники) и = 0.01с"1, <5 = 10~\ /3 = 2x10"' (звёздочки). (Б) Скорость адгезии тромбоцитов, рассчитанная по редуцированной модели при А=0.2 и различных значениях ка и

Для исследования справедливости предположения о квазистационарности R (уравнение (11)) мы провели вычисления по «расширенной» версии полной модели, не предполагающей квазистационарности. Для этого уравнение (16) заменили на уравнения (9), (10), правую часть уравнения (19) заменили на aJQ-k^R, а М в уравнении (18) заменили на M+R. Все параметры оставили прежними, а значения

kl„d, 5 и ß выбрали такими, чтобы сохранить величины ка и т.е. чтобы

к". ß выполнялись равенства -^ = £„=10000"' и — = # = 0.02. Поскольку время

активации тромбоцита мало (одна или несколько секунд), мы исследовали быстрый (Kmd=\ с1) и очень медленный (i°w= 0.01 с"1) режимы. На рис. 9 А заполненные символы показывают скорость накопления M+R в этих режимах. Как видно, отличие результатов от предсказываемых моделью, предполагающей квазистационарность R {непрерывная кривая), мало, что говорит о справедливости этого предположения. Таким образом, зависимость скорости адгезии тромбоцитов от скорости сдвига, полученная в моделях и экспериментах, полностью определяется тем, что от скорости сдвига зависит эффективная константа скорости адгезии кф Как показано ниже, то же верно и для зависимости скорости адгезии от гематокрита и размера эритроцитов.

Размер и концентрация эритроцитов определяют скорость адгезии тромбоцитов. Мы продолжили проверку гипотезы, что ведущим механизмом доставки тромбоцитов к активной поверхности являются пристеночные столкновения с эритроцитами. Для этого полученные (Aarts et al., 1983) экспериментальные данные по адгезии человеческих тромбоцитов к субэндотелию человеческой артерии в присутствии эритроцитов человека, кролика и козы построили в координатах уравнения (22) - как функцию главного диаметра эритроцита (рис. 10 А, символы). Оказалось, что все эти данные ложатся приблизительно на одну прямую, проходящую через начало координат; различий между экспериментами, выполненными при разных показателях гематокрита, практически нет. Поэтому мы положили к/=0 и к2= 1. Правая часть уравнения (22) при а=0.022 показана пунктиром на рис. 10 А. Те же экспериментальные данные, но в обычных координатах «адгезия - объёмная доля эритроцитов» показаны на рис. 10 Б (символы). Линии показывают расчёты по редуцированной (пунктир) и полной (непрерывные линии) моделям. Как и в предыдущем разделе, значения ка и ^ были положены 1000 с"1 и 0.02, соответственно.

В целом, предсказания обеих моделей согласуются с экспериментальными данными, а отличия между ними лежат в пределах ошибки эксперимента. Исключения составляют лишь граничные случаи: нулевой гематокрит и большая концентрация крупных эритроцитов. В эксперименте адгезия при нулевом значении гематокрита кажется завышенной по сравнению с экстраполяцией всех трёх экспериментальных кривых из области ненулевого гематокрита, а отношение значений М при гематокритах 40% и 0 на порядок меньше отношения, полученного в аналогичных условиях другими авторами (Turitto and Baumgartner, 1975). Видимое на двух нижних и всех теоретических кривых уменьшение скорости адгезии при

гематокрите выше 40% объясняется тем, что концентрация тромбоцитов в перфузате была пропорциональна (1 - Ф „вс): согласно уравнению (20), это ведёт к зависимости начальной скорости адгезии от гематокрита вида Фквс ■ (1 - Фшс)-Линейная зависимость от гематокрита, наблюдаемая на верхней экспериментальной кривой (□), может быть проявлением неньютоновских свойств, присущих как крови, так и плотной суспензии эритроцитов, таких как уплощение профиля скорости и миграция эритроцитов от стенки. В узких трубках они приводят к гематокрит-зависимому увеличению пристеночной скорости сдвига по сравнению с рассчитанной для пуазсйлевого течения и к обогащению пристеночной зоны тромбоцитами, соответственно. Поскольку просветы проточных камер были больше 1 мм, эти эффекты в данных условиях слабы, и модель их не учитывала.

Рис. 10. Величина адгезии тромбоцитов в зависимости от главного диаметра (А) и объёмной доли (Б) присутствующих эритроцитов, полученная в эксперименте (АаПв е! а1., 1983) (символы) и рассчитанная по редуцированной (пунктирные линии) и полной (непрерывные линии) моделям. Пристеночная скорость сдвига у. = 800 с"1, время г = 5 мин. (А) Экспериментальные данные, полученные при объёмной доле эритроцитов Фявс = 0.2 (■), 0.4 (•) и 0.6 (А), отложены как функция ¿две в соответствии с уравнением (22); наклон теоретической кривой равен а]пкг - 0.28, что при даёт а»0.022. (Б) Те же данные по адгезии тромбоцитов в присутствии человеческих (□), кроличьих (о), и козлиных (Д) эритроцитов и расчёты {линии) при а = 0.022, ка = 1000 с"1, 4 = 0.02, к, = 0,к2= 1.

выводы

1. Построена математическая модель неравномерного распределения тромбоцитов поперёк потока крови, учитывающая конечность размера тромбоцитов и эритроцитов, а также неравномерное распределение эритроцитов поперёк потока.

2. Неравномерность распределения тромбоцитов поперёк кровотока в основном обусловлена их пассивным вытеснением эритроцитами из области большего в область меньшего локального гематокрита.

3. Построена математическая модель адгезии тромбоцитов, учитывающая стадийность и частичную обратимость адгезии, а также пристеночные столкновения тромбоцитов с другими форменными элементами крови.

4. Доставка тромбоцитов из потока крови на активную поверхность в основном обеспечивается столкновениями тромбоцитов с эритроцитами, происходящими в непосредственной близости от этой поверхности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. A. Tokarev, I. Sirakov, G. Panasenko, V. Volpert, E. Shnol, A. Butylin, and F. Ataullakhanov. 2012. Continuous Mathematical Model of Platelet Thrombus Formation in Blood Flow. Russian Journal of Numerical Analysis and Mathematical Modelling, 27 (2): 191-212.

2. Токарев А. А., А. А. Бутылин, Ф. И. Атауллаханов. 2012. Транспорт и адгезия тромбоцитов в сдвиговом потоке крови: роль эритроцитов. Компьютерные исследования и моделирование, 4 (1): 185-200.

3. Tokarev A. A., A. A. Butylin, Е. A. Ermakova, Е. Е. Shnol, G. P. Panasenko, and F. I. Ataullakhanov. 2011. Finite Platelet Size Could Be Responsible for Platelet Margination Effect. Biophysical Journal, 101 (8): 1835-1843.

4. Tokarev A. A., A. A. Butylin and F. I. Ataullakhanov. 2011. Platelet Adhesion from Shear Blood Flow Is Controlled by Near-Wall Rebounding Collisions with Erythrocytes. Biophysical Journal, 100 (4): 799-808.

5. Tokarev A., G. Panasenko and F. Ataullakhanov. 2011. Segregation of Flowing Blood: Mathematical Description. Mathematical Modelling of Natural Phenomena, 6:281-319.

6. Токарев A. A. 2007. Реология тромбоцитарного звена гемостаза: вытеснение тромбоцитов из ядра потока к стенкам сосудов обеспечивается рикошетными столкновениями с эритроцитами. Тромбоз, гемостаз и реология, 4 (32): 39-47.

Тезисы в трудах конференций:

1. Tokarev А., V. Volpert, G. Panasenko, I. Sirakov, E. Shnol, A. Butylin, F. Ataullakhanov. Effect of definite sizes of platelets and erythrocytes on the platelet hemostasis. Scientific program and abstracts of the 3rd Eurosummer School on Biorheology & Symposium on Micro and Nanomechanics and Mechanobiology of Cells, Tissues and Systems. Borovets, Bulgaria, August 29 - September 2, 2009, p. 54.

2. Tokarev A. A., Volpert V. A., Panasenko G. P., Sirakov I., Shnol E. E., Butylin A. A., and Ataullakhanov F. I. Erythrocytes-platelets interactions as a physical basis of hemostasis. Workshop "Modelling of blood diseases". Lyon, France, 2007, p. 16.

3.Токарев А.А. Реология тромбоцитарного звена гемостаза: вытеснение тромбоцитов из ядра потока к стенкам сосудов обеспечивается рикошетными столкновениями с эритроцитами. III Всероссийская научная конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (с международным участием). Москва, 2007, с. 241.

Подписано в печать:

14.04.2012

Заказ № 7168 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Токарев, Алексей Александрович, Пущино

ФГБУ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

61 12-1/838

На правах рукописи

ТОКАРЕВ Алексей Александрович

Механизмы транспорта тромбоцитов в потоке крови под воздействием эритроцитов

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов

Пущино 2012

Содержание

ВВЕДЕНИЕ_ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ__ 9

1.1. Система гемостаза в условиях потока крови_9

1.1.1. Три звена гемостаза работают совместно для уменьшения кровопотери_9

1.1.2. Баланс тромбоцитарного и плазменного звеньев в условиях сдвигового потока _ 10

1.1.3. Характер движения тромбоцитов в потоке_ 14

1.1.3.1. Сдвиг-вызванная диффузия (дисперсия) клеток крови_ 16

1.1.3.2. Неравномерность распределения тромбоцитов поперёк потока _ 18

1.1.4. Влияние скорости сдвига, гематокрита и размера эритроцитов на скорость адгезии тромбоцитов__ 19

1.1.5. Математические модели адгезии тромбоцитов_22

1.2. Механизмы адгезии тромбоцитов к активной поверхности_27

1.2.1. Общая характеристика процесса адгезии тромбоцита из потока крови_27

1.2.2. Рецепторы тромбоцита _ 33

1.2.3. Захват тромбоцита из потока связыванием 6Р1Ьа-у\Л^_34

1.2.3.1. Адгезионная функция пары СР\Ьа-чШ_34

1.2.3.2. Характер движения захваченного тромбоцита по поверхности_35

1.2.3.3. Порог связывания по скорости сдвига_ 36

1.2.3.4. Обратимость захвата при физиологических скоростях сдвига_37

1.2.3.5. Необратимость захвата при патологических скоростях сдвига_38

1.2.3.6. Независимость захвата тромбоцита от его предварительной активации _ 38

1.2.3.7. Различия стадии захвата у мышей и человека_39

1.3. Математические модели сегрегации крови и других суспензий в сдвиговом потоке_40

1.3.1. Влияние присутствия эритроцитов в крови на её течение_40

1.3.2. Латеральная миграция одиночных частиц в потоке_41

1.3.2.1. Одиночные твёрдые частицы и тромбоциты_42

Характер поведения твёрдых частиц в потоке_42

Скорость латеральной миграции твёрдых частиц_43

1.3.2.2. Одиночные деформируемые частицы и эритроциты _46

Характер поведения деформируемых частиц в потоке _ 46

Скорость латеральной миграции деформируемых частиц_49

1.3.2.3. Латеральная миграция эритроцитов в модели Чижевского_ 51

1.3.2.4. Переход от разбавленных суспензий к концентрированным и к крови _ 53

1.3.3. Описание сегрегации суспензий лагранжевыми методами_54

1.3.3.1. Концентрированные суспензии твёрдых частиц _ 54

1.3.3.2. Эритроциты_ 54

1.3.3.3. Тромбоциты_|_ 55

1.3.4. Континуальный подход к описанию сегрегации в суспензиях_ 56

1.3.4.1. Концентрированные суспензии деформируемых частиц и эритроцитов _ 58

Реологические модели крови_ 58

Заданное распределение эритроцитов _60

Микрополярные и микроморфные модели_ 62

Флуктуационная температура крови_ 63

Многофазный континуальный подход_65

1.3.4.2. Концентрированные суспензии твёрдых частиц_ 65

Модель сдвиговой диффузии в концентрированной суспензии_ 66

Модель суспензионного баланса_ 67

1.3.4.3. Неравномерное распределение тромбоцитов_ 70

Модель направленного дрейфа, или "реологического потенциала"_ 71

Модель сдвиговой диффузии для тромбоцитов_71

1.3.5. Заключение по моделям сегрегации крови_ 72

1.4. Постановка задачи._74

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ_ 75

2.1. Математическая модель распределения тромбоцитов поперёк потока _______75

2.1.1. Предположения модели. Исключённый и доступный объёмы_ 75

2.1.2. Уравнения модели __ 78

2.1.3. Стохастический расчёт доли доступного объёма _81

2.1.4. Решение дифференциальных уравнений_ 82

2.2. Математическая модель адгезии тромбоцитов_83

2.2.1. Описание рассматриваемых процессов_83

2.2.2. Уравнения модели _______86

2.2.3. Редуцированная модель адгезии_ 90

2.2.4. Фиксированные параметры модели_._90

2.2.5. Оценка свободных параметров модели_91

2.2.6. Решение дифференциальных уравнений_92

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ_93

3.1. Распределение тромбоцитов поперёк потока крови_93

3.1.1. Конечность размера тромбоцитов уменьшает долю доступного им объёма на долю исключённого объёма ______93

3.1.2. Основной причиной неравномерности распределения тромбоцитов поперёк потока может быть эффект "исключённого и доступного объёмов"_95

3.1.3. Зависимость обогащения пристеночного слоя тромбоцитами (ОПСТ) от гематокрита_________97

3.1.4. Поперечный транспорт тромбоцитов в градиенте доступного объёма_ 99

3.2. Адгезия тромбоцитов из потока крови_103

3.2.1. Адгезия тромбоцитов в полной и редуцированной моделях _ 103

3.2.2. Зависимость скорости адгезии тромбоцитов от скорости сдвига вызвана столкновительным механизмом их доставки на стенку_ 105

3.2.3. Размер и концентрация эритроцитов определяют скорость адгезии тромбоцитов __________ 108

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ_ 110

4.1. Распределение тромбоцитов поперёк потока крови_110

4.2. Адгезия тромбоцитов из потока крови_115

ВЫВОДЫ_ 120

БЛАГОДАРНОСТИ_ 121

ПРИЛОЖЕНИЯ_ 122

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Модель неравномерного распределения эритроцитов поперёк потока крови_122

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Аналитическая аппроксимация профилей распределения эритроцитов поперёк потока_ 124

ПРИЛОЖЕНИЕ В. Вывод уравнения 1-го закона Фика с учётом пространственной неравномерности распределения доли доступного объёма_127

В.1. Вывод по аналогии с 1-м законом Фика_127

В.2. Феноменологический вывод_ 129

ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Стохастический расчёт доли доступного объёма при варьировани объёмной доли эритроцитов и эквивалентного радиуса тромбоцитов __

Г.1. Форма поверхности частиц и её сеточное представление _

Г.2. Алгоритм расчёта _______

Г.З. Тестовые расчёты _______

Г.4. Основные результаты__

ПРИЛОЖЕНИЕ Д. Оценка степени неравномерности распределения

эритроцитов в аксиальной проточной камере_135

Д.1. Миграция эритроцитов из-за их деформации_ 135

Д.2. Столкновительная миграция _ 139

ПРИЛОЖЕНИЕ Е. Вывод выражения для потока тромбоцитов на стенку140 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ_ 144

130

130

132

133

134

ВВЕДЕНИЕ

Гемостаз - это эволюционно выработанная защитная система организма, основная задача которой состоит в минимизации кровопотери при нарушении целостности кровеносной системы, т.е. при повреждении стенки какого-либо кровеносного сосуда. В результате работы системы гемостаза повреждённое место оказывается закрыто гемостатической пробкой, состоящей из прочно агрегировавших тромбоцитов и фибриновой сети. Эта пробка препятствует вытеканию крови из сосуда на протяжении всего времени восстановления повреждённых тканей сосудистой стенки, а затем лизируется.

Нарушения работы системы гемостаза приводят к таким смертельно опасным состояниям, как кровоточивость (недостаточность гемостатической реакции) и тромбоз (её избыточность). Ввиду жизненной важности гемостатической системы для организма и опасности нарушений в её функционировании, на исследование устройства, механизмов регуляции гемостаза и разработку способов их коррекции направлены коллосальные усилия учёных всего мира. Традиционно, в первую очередь речь идёт о биохимии процесса: пристально изучается молекулярное устройство всех гемостатических звеньев, механизмы передачи сигнала в них и между ними и т.д. При этом зачастую за рамками рассмотрения остаётся биофизика тромбоцитарного звена, а именно - учёт физических условий кровотока, в котором протекает его работа в организме. Очевидно, что без учёта влияния потока целостное понимание картины работы гемостатической системы в организме невозможно.

Поток крови является естественной средой, в которой функционирует система гемостаза. Он перемещает компоненты этой системы в пространстве и механически воздействует на гемостатическую пробку. Почти половину объёма крови занимают эритроциты, биохимически в гемостазе не участвующие. Однако, достаточно давно известно, что физическое присутствие эритроцитов радикально изменяет характер течения крови и, в частности, поведение в ней тромбоцитов. Присутствие эритроцитов в крови, во-первых, приводит к перемещению большинства тромбоцитов из ядра потока в пристеночную область, т.е. к сильной неравномерности распределения тромбоцитов поперёк потока. Во-вторых, оно увеличивает вероятность столкновения со стенкой тромбоцита, двигающегося в потоке уже рядом с ней. В-третьих, оно сильно увеличивает скорость адгезии тромбоцитов к активной поверхности, каковой для тромбоцитов являются обнажённый субэндотелий сосудистой стенки, его компоненты или прочно адгезировавшие тромбоциты. Влияние потока на тромбоциты во многом определяется также сдвиговым характером течения крови по сосудам - неравномерностью распределения линейной скорости течения поперёк потока. Эта неравномерность

вызывает постоянные столкновения друг с другом эритроцитов, движущихся по параллельным траекториям, расстояние между которыми меньше размера эритроцита. Столкновения эритроцитов друг с другом приводят к их хаотическому перемещению поперёк потока, что сильно усиливает поперечный транспорт в крови - так называемая сдвиговая диффузия, или сдвиговая дисперсия. До настоящего времени механизмы влияния эритроцитов и сдвигового характера течения крови на функционарование как тромбоцитов, так и системы гемостаза в целом, остаются недостаточно понятными.

В виду сложности процессов, протекающих при работе гемостаза в условиях потока крови, хорошим дополнением, а зачастую и самостоятельным методом их исследования является построение математических моделей. Так, модели типа "диффузия-конвекция" с граничными условиями, описывающими адгезию к активной стенке, использовались в исследованиях адгезии тромбоцитов в проточных камерах in vitro (группы Туритто и Баумгартнера). Применение этих моделей было принципиальным для планирования экспериментов и интерпретации их результатов. Именно на основании математического моделирования указанные авторы пришли к заключению о существовании различных режимов адгезии тромбоцитов из потока - диффузионного и кинетического. Однако, к настоящему моменту эти модели можно считать устаревшими, поскольку они не учитывают недавние экспериментальные отрытия в механизмах адгезии тромбоцитов - стадийность и существенную обратимость адгезии. Кроме того, определяемая с помощью этих моделей эффективная константа скорости адгезии оказывается зависящей от скорости сдвига и гематокрита, а коэффициент сдвиговой диффузии систематически отличается от измеренного независимыми от адгезии методами. Следовательно, указанные модели нуждаются в пересмотре и коррекции.

Неравномерность распределения тромбоцитов поперёк потока в существующих математических моделях либо всецело игнорируется, либо вводится феноменологически. Между тем, известно, что эта неравномерность в значельной степени определяется объёмной долей эритроцитов в крови. Эритроциты распределены поперёк потока крови неравномерно: их объёмная доля практически всегда максимальна в центре потока и минимальна у стенок. Очевидно, что такое распределение эритроцитов может рассматриваться как вероятная причина неравномерного распределения тромбоцитов. Однако конкретный механизм этой связи недостаточно понятен, а наблюдающаяся в эксперименте степень неравномерности распределения тромбоцитов сильно превосходит оценки, получающиеся в предположении равномерного их распределения во внеэритроцитарном пространстве. Уже более 30 лет назад было выдвинуто предположение, что существенную роль в вытеснении тромбоцитов эритроцитами к

стенкам играет собственный размер тромбоцитов, мешающий им поместиться между плотно соприкасающимися в центре потока эритроцитами. Согласно этому предположению, вследствие конечности своего размера тромбоциты сильнее вытесняются из центра ("ядра") потока, чем, например, окружающая эритроциты плазма крови. До настоящего момента теоретического обоснования или опровержения это предположение не нашло, несмотря на его простоту.

Таким образом, механизмы влияния эритроцитов на тромбоциты в потоке крови до сих пор остаются недостаточно понятными. Поэтому цель данной работы состояла в том, чтобы исследовать влияние эритроцитов на распределение тромбоцитов поперёк потока и на их адгезию к активной (т.е. адгезивной - способной поддерживать адгезию тромбоцитов) стенке теоретически - путём построения количественных математических моделей этих процессов, учитывающих физическое взаимодействие тромбоцитов с эритроцитами.

Цель работы: теоретическое исследование роли эритроцитов в регуляции работы тромбоцитарного звена гемостаза.

Задачи исследования:

1. Построить математическую модель неравномерного распределения тромбоцитов поперёк потока крови, учитывающую конечность размера эритроцитов и тромбоцитов.

2. С помощью построенной модели распределения тромбоцитов исследовать роль конечности их размера в процессе вытеснения эритроцитами из ядра потока к стенке.

3. Построить математическую модель адгезии тромбоцитов из потока крови на активную поверхность, учитывающую транспорт тромбоцитов в потоке, их столкновения с эритроцитами вблизи стенки и стадийность адгезии.

4. С помощью построенной модели адгезии тромбоцитов оценить роль их пристеночных столкновений с эритроцитами в процессе доставки на стенку.

Научная новизна. В работе построены количественные математические модели миграции тромбоцитов поперёк потока крови и адгезии тромбоцитов к активной поверхности. Эти модели основаны на учёте механического (физического) воздействия эритроцитов на тромбоциты в условиях потока; математическая модель адгезии тромбоцитов также учитывает новейшие представления о стадийности и обратимости их адгезии. Построенные модели всесторонне верифицированы сравнением с имеющимися экспериментальными данными. Показано, что сильная неравномерность распределения тромбоцитов поперёк потока крови может возникать исключительно из-за их пассивного вытеснения эритроцитами из ядра потока (где концентрация эритроцитов максимальна) к стенке (где концентрация эритроцитов минимальна), и существенный вклад в этот процесс вносит собственный размер тромбоцита. Также показано, что доставка тромбоцитов из потока крови на активную поверхность может быть обеспечена исключительно столкновениями тромбоцитов с эритроцитами, происходящими в непосредственной близости от этой поверхности.

Научно-практическое значение работы. Достигнуто более глубокое понимание фундаментальных механизмов, управляющих процессами доставки тромбоцитов к месту их адгезии и агрегации. Построенные математические модели миграции тромбоцитов поперёк потока крови и их адгезии могут применяться для интерпретации экспериментальных результатов in vitro тестов функционального состояния тромбоцитов (методы с использованием проточных камер), при проектировании новых приборов для исследования тромбоцитарной адгезии и сепарации крови, а также для построения более сложных математических моделей системы гемостаза - в частности, модели образования и роста тромбоцитарного тромба in vivo.

Положения, выносимые на защиту:

1. Нёравномерность распределения тромбоцитов поперёк кровотока в основном обусловлена их пассивным вытеснением эритроцитами из области большего в область меньшего локального гематокрита.

2. Доставка тромбоцитов из потока крови на активную поверхность в основном обеспечивается столкновениями тромбоцитов с эритроцитами, происходящими в непосредственной близости от этой поверхности.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Система гемостаза в условиях потока крови

1.1.1. Три звена гемостаза работают совместно для уменьшения кровопотери

Традиционно принято выделять сосудистое, тромбоцитарное (или сосудисто-тромбоцитарное) и плазменное звенья гемостаза [1,2]. Незамедлительной, но кратковременной реакцией на травму является первичная вазоконстрикция - сокращение гладких мышц стенок сосудов. Она приводит к сужению просвета кровеносного русла и уменьшению кровотока. В случае небольшой травмы вазоконстрикция может остановить кровотечение, но при обширном кровотечении она только снижает кровопотерю. В дальнейшем наступает вторичная вазоконстрикция, секреторно поддерживаемая активированными тромбоцитами. Способность кровеносных сосудов к вазоконстрикции (спазму) различна. Например, диаметр артериолы при констрикции может уменьшиться в 2-3 раза, а прекапиллярный сфинктер может перекрыть вход в капилляр полностью [3].

Одновременно с вазоконстрикцией, т.е. в первые секунды после повреждения, активируется тромбоцитарная система гемостаза. Её главными участниками являются тромбоциты - самые маленькие форменные элементы крови размера около 1 мкм. Они относительно малочисленны (-300 тыс./мкл, что составляет -0.3 об.% крови), но обладают уникальными свойствами. Из потока крови тромбоциты захватываются повреждённым участком сосудистой стенки (на экспонированные в кро