Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы реализации центральных эффектов цитокинов, индуцированных системным введением эндотоксина

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы реализации центральных эффектов цитокинов, индуцированных системным введением эндотоксина"

РГЗ ол

На правах рукописи

Зубарева Ольга Евгеньевна

МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ ЦЕНТРАЛЬНЫХ ЭФФЕКТОВ ЦИТОКИНОВ, ИНДУЦИРОВАННЫХ СИСТЕМНЫМ ВВЕДЕНИЕМ ЭНДОТОКСИНА

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997-

Работа выполнена в Физиологическом отдела им. И.П. Павлова (руководитель - доктор медицинских наук В.М. Клименко) Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор - академик РАМН Б.И. Ткаченко)

Научный руководитель - доктор медицинских наук

В.М. Клименко

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук

член- корреспондент РАЕН В.Н. Цыган

доктор биологических наук В.Н. Кокряков

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский

Государственный Университет

Защита состоится " щсШ 1997 г. в__часов на заседании

диссертационного ученого совета (К.001.23.01) по защите кандидатских диссертаций при научно-исследовательском институте эксперимонтальной медицины РАМН по адресу; 197376, Санкт- Петербур ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12. Автореферат разослан " Л5 " Л^-ОМ_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктп биологических наук

О.Г. Куликова

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВА! 1ИЯ.

Несмотря на многочисленные доказательства тесной взаимосвязи нервной и иммунной систем, пути и механизмы передами информации от активированной иммунной системы к ЦНС остаются наименее изученным аспектом их взаимодействия. Известно, что мозг реагирует на изменения, происходящие в иммунной системе. Доказано, что введение антигенов приводит к устойчивой перестройке активности нейронов , уровня возбудимости структур и динамики биоэлектрических потенциалов (Клименко, 1972; 1978; 1985; 1993), к изменению метаболизма биогенных аминов в мозге (Dunn, 1988). Показано также, что системное введение эндотоксина вызывает пирогенез, изменение поведения, активацию гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой системы (ГГНС). Опубликованные данные показывают, что эти эффекты в значительной мере опосредуются провоспалительными цитокинами, и, прежде всего, ин-терлейкиНами (ИЛ-1, ИЛ-б) и фактором некроза опухоли (ФНО). Благодаря наличию рецепторов к провоспалительным цитокинам на мембранах глиальных и нервных клеток, также как и клеток иммунных, ИЛ-1, ИЛ-6 м ФНО опосредуют процессы в нервной и иммунной системах и являются универсальными посредниками межсистемных взаимодействий. Однако, конкретные пути поступления информации в мозг и механизмы ответа ЦНС на действие цитокинов изучены недостаточно. Так, отсутствует ясность в вопросе о локализации рецепторов ИЛ-1, опосредующих действие циркулирующего в крови цитокина на интенсивность метаболизма биогенных аминов в мозге. Неизвестно, действуют ли на внутримозговые рецепторы цитокины, прошедшие гемато-энцефалический барьер в определенных местах, или образовавшиеся в мозговом компар-тменте. Сам вопрос об облигатности индукции экспрессии цитоки-

нов за гемато-энцефалическим барьером для инициации реакций ЦНС так же открыт. ЛПС-индуцированный синтез провоспалитель-ных цитокинов а мозге выявлен у мышей и у крыс (Ban, 1992; Gatti, 1992), однако в литературе отсутствуют данные о синтезе провос-палительных цитокинов в мозге животных (например, кроликов) с индивидуальной терморегуляцией и повышенной чувствительностью к действию ЛПС. Несмотря на то, что физиологические реакции, возникающие при введении эндотоксина или провоспалитель-ных цитокинов описаны достаточно подробно, практически не исследована структура нарушения поведения, а также причинно-следственные свяги между отдельными физиологическими процессами. Физиологические эффекты опосредуются нейрохимическими изменениями в мозге, однако, роли каждой из нейромедиа-торных систем в реализации пирогенной, гормональной и поведенческой реакций требуют изучения.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целью работы явилось исследование роли провос-палительных цитокинов в молекулярно-клеточных механизмах взаимодействия нервной и иммунной систем.

ЗАДАЧАМИ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ ЯВИЛИСЬ:

1. Исследование структуры изменения поведения, индуцированного провоспалительными цитокинами.

2. Анализ связи нарушений поведения, вызванных введением ЛГ1С и провоспалительных цитокинов с их пирогенным действием.

3. Исследование участия биогенных аминов гипоталамуса в механизмах реализации физиологических реакций, вызванных действием эндотоксина.

-34. Исследование поведенческих' эффектов ИЛ-1 в условиях селективной блокады нейромедиаторных систем мозга.

5. Изучение роли центральных рецепторов ИЛ-1 в активации метаболизма биогенных аминов в мозге.

6. Изучение качественной и пространственной структуры паттерна синтеза мРНК провоспалительных цитокинов в мозге при нормальной температуре и пирогенной реакции, индуцированной системным введением Л ПС.

г

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Исследование механизмов реализации центральных эффектов цитокинов, индуцированных системным введением эндотоксина позволило установить новые, неизвестные ранее закономерности взаимодействия систем организма:

1. впервые выявлена сложная структура нарушения поведения в ответ на введение провоспалительных цитокинов: показано, что введение ИЛ-1 модулирует поведений в новой обстановке, но не влияет на программы поведения в хорошо знакомой среде;

2. впервые показаны различия порогов активации поведенческой и пирогенной реакций у крыс;

3. впервые показано, что серотонинергические системы мозга опосредуют индуцированное ИЛ-1 нарушение пищевого, но не коммуникативного поведения;

4. впервые доказана роль центральных рецепторов ИЛ-1 в индукции изменений метаболизма дофамина и серотонина переднего гипоталамуса в ответ на системное введение цитокинов;

5. впервые изучен качественно- пространственно- временной паттерн синтеза ИЛ-1. антагониста рецепторов ИЛ-1 (ИЛ-1 p.a.) и ФИО в мозге кроликов с нормальной температурой тела и при пи-

рогенной реакции, индуцированной системным введением эндотоксина; выявлен синтез ИЛ-1 и ИЛ-1 p.a., но не ФИО в гипоталамусе, гиппокампе и коре мозга кроликов с нормальной температурой тела. Показано, что для индукции пирогенных реакций в ответ на введение ЛПС экспрессия в мозге ФИО не обязательна .

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Выполненные фундаментальные исследования вскрывают структурно* функциональную и нейрохимическую организацию реакций мозга, возникающих в ответ на активацию иммунной системы. Полученные данные имеют важное значение для целенаправленной разработки методов нейрофизиологической и фармакологической коррекции нарушений физиологических функций. Полученные результаты имеют большое значение для теории межсистемного взаимодействия при защитных реакциях, существенно пополняют теоретические представления о нейро- иммунных взаимодействиях и служат основой для преподавания соответствующих разделов в курсах физиологии, патофизиологии и биохимии в ВУЗах.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1 Введение ЛПС или экзогенных провоспалительных цитокинов подавляет поведенческие реакции на новые стимулы, хорошо закрепленные программы поведения при этом не страдают. 2. Физиологические реакции в ЦНС, вызванные введением ЛПС и провоспалительных цитокинов развиваются параллельно, имеют разные пороги активации и опосредуются различными нейроме-диаторными механизмами. Нарушение пищевого, но не коммуникативного поведения опосредуется серотонинергическими системами мозга.

-53. В мозге кроликов с нормальней температурой тела обнаружена продукция мРНК пептидов семейства ИЛ-1, но не ФНО. Экспрессия мРНК ФНО отсутствует в мозге кроликов при умеренных пироген-ных реакциях, индуцированных системным введением ЛПС.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ. Материалы диссертации изложены и обсуждены на: 1) 1 - ом съездо Российского общества фармакологов (Волгоград, 1995), 2) Международном конгрессе по нейро- иммунным взаимодействиям (С.-Петербург, 1995); 3) Международном симпозиуме "Цитокины как фактор взаимодействия между нервной и иммунной системами" (Аркашон, 1995); 4) Роесийско- Шведском симпозиуме "Новые исследования в нейробиологии" (Москва, 1996), 5) Международном симпозиуме "Цитокины в мозге - нейролатологические аспекты" (С.-Жан-де-Луз, 1996).

Диссертация апробирована на заседании Физиологического отдела им. И.П.Павлова НИИЗМ РАМН.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме Диссертации опубликовано а работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация содержит введение, обзор литературы, пять глав с описанием собственных экспериментов, обсуждение полученных данных, заключение, выводы и список литературы. Работа Изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 4 Таблицы и 14 рисунков. Библиографический указатель включает 15 отечественных и 186 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на 133 крысах породы Вистар, самцах, массой 180- 230 г и 9 кроликах породы Шиншила, самцах, массой 2,53 кг, содержавшихся в стандартных условиях, со свободным доступом к воде и пище (за исключением экспериментов по исследованию пищевого поведения и поведения в 12-ти лучевом лабиринте).

В качестве тестовой системы при исследовании синтеза мРНК провоспалительных цитокинов у кроликов использовали ЛПС- стимулированные макрофаги, полученные из перитонеальных эксудатов

кроликов. Инкубацию макрофагов с ЛПС проводили в течении 3 чао

сов при 37 С. Инкубационная среда содержала 2,6 мл. взвеси клеток, концентрация 1 млн/мл в среде Хенкса, 0,3 мл фетальной сыворотки и 0,1 мл р- ра ЛПС, концентрация 1 мг/мл.

Стереотаксические операции. Вживление канюль, предназначенных для введений препаратов в боковые желудочки мозга, проводили с помощью стереотаксического аппарата, под общим нембу-таловым наркозом, в дозе 50 мг/кг веса. Координаты ог брегмы: Р 0,5; I. 1,5; Н 3,5. После окончания экспериментов проводился морфологический контроль локализации канюль.

Термометрия. Измерение ректальной температуры проводили электротермометром ТЭМП- 1 (Казань).

Исследования поведения .

Для оценки потребления пищи и воды стандартные пищевые гранулы корма для грызунов взвешивали до начала эксперимента и по его окончании. Потребление воды контролировалось с помощью мерных поилок. Животные не подвергались пищевой и питьевой де-привации.

Тест.^ужак-резидпнт'' применяли для оценки коммуника шиной акгивносш жи§01ных. Экспериментальных крыс рассаживали по од-

ной в лабораторные кюветы на 1,5 часа. За это время животные помечали клетку и после помещения в нее чужака - животного с незнакомым запахом - у экспериментальных животных наблюдалось реакция защиты своей территории, включавшая коммуникативные, агрессивные и защитные паттерны. Длительность теста - 5 минут; фиксировалось время коммуникативных взаимодействий, агрессивных и защитных реакций. Исследование проводили до 3-х раз на каждом животном - резиденте, подсаживаемые чужаки менялись .

Тест "открытое поле" применяли для оценки двигательной активности. Использовали круглое открытое поле, диаметром 1,5 м , разделенное на квадраты со стороной 20 см. Длительность теста 3 минуты. Фиксировалось количество пересеченных квадратов.

Исследование способности крыс ориентироваться в хорошо знакомом пространстве проводили с 12- ти лучевом радиальном лабиринте. Лабиринт представлял собой приподнятую круглую площадку с отверстием в центре от которой отходили 12 лучей- рукавов. Животное пролезало снизу через отверстие на площадке и через один из рукавов выходило наружу. Стимулом движения в лабиринте служило пищевое подкрепление На конце некоторых лучей. Лучи имели двери, открывавшиеся только в сторону внешнего пространства и исключавшие обратное движение. Для повышения мотивации прохождения лучей применяли пищевую депривацмю перед тестом в течении 23 часов. Доступ к воде не ограничивали. В каждом опыте животным давали возможность осуществить до 12- ти проходов лучей . Правильной реакцией считали прохождение подкрепляемого луча, ошибочной - повторное прохождение подкрепляемого луча или посещение неподкрепляемого луча. После 20 дней обучения каждое животное вырабатывало свою программу прохождения лабиринта.

Определение стероидных гормонов в сыворотке крови осуществляли стандартным методом конкурентного связывания в модификации Морозова (1988). Использованные реактивы: хлористый метилен (РЕАХИМ), активированный уголь (Serva) (ФРГ), кортикоотерон (Sigma), радиоактивный меченный^ кортикостерон (ГИПХ, С.- Петербург) , антисыворотка для определения кортикостерона (ФИН, С.- Петербург).

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии использовали для определения биогенных аминов в ткани мозга. Исследовали уровень дофамина (ДА), норадреналина (НА), серотонина (5-ОТ) и их метаболитов - 3,4- диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), З-метокси-4-оксифенил-гликоля (МОФЕГ), 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК). Хроматографиче-ская система состояла из нассса модели 305 Gilson, инжектора Rlieodyne, металлической колонки (4,0x250 мм) с обращено-фазовым сорбентом Spherisorb OOS 2 (Pharmacia, Швеция), ампе-рометрического детектора LC-4B (BAS, США), Измерения биогенных аминов проводили при потенциале стеклоуглеродного электрода +0,75 В относительно хлорсеребряного электрода сравнения. Подвижная фаза состояла из 0,02М цитрат- фосфатного буфера, pH 3,5; 0,2 мМ динатриевой соли ЭДТА, 0,3 мМ - октилсульфоната натрия, 15 % метанола; скорость потока - 0,7 мл/мин. Качественный анализ исследованных соединений проводили по параметрам удерживания, количественный - методом абсолютной градуировки. Концентрации биогенных аминов и их метаболитов рассчитывали в нг/ мг веса ткани . Об активности нейромедиаторНых систем мозга судили по отношению метаболит/медиатор для ДА - системы - ДО-ФУК/ДА и ГВК/ДА, для НА - системы - МОФЕГ/НА, для 5-ОТ -системы -5-ОИУК/5-ОТ !

-g-

Мэтод ревепсцой транскрипции и последующей полимеразной резкции (РТ-ПиР метод) применяли для определения мРНК про-воспалительных цитокинов в ткани могга и культуре перитонеальных макрофагов. Для выделения мРНК из клеток мозга или макрофагов использовали "RNAzot TM В" ("CINNA/BIOTEC LABORATORIES INC.), по инструкции, Реакцию реверсной транскрипции проводили с помощью фермента обратной транскриптазы AMV (Promega), по инструкции. ПЦР реакционная смесь содержала 30 мМ Трис HCl pH 8.8, 16,3 мМ сульфата аммония, 0,01% Nom'det P40-Tween 2mM MgCI, 2 ед. Taq- полимеразы ("Биотех", Москва) и по 200 нг двух специфических праймеров. Праймеры подбирались с помощью программы "Primer - Master, 1.0". по нуклеотидным последовательностям мРНК ИЛ-1- предшественника и ИЛ-1 p.a. и ФНО кроликов, содержавшихся в молекулярном банке данных. Праймеры синтезированы фирмой Бион (Москва). ПЦР проводились на амплификаторе фирмы "Techne" (Великобритания) в 30 циклов при термальном профиле 93°

о о

С, 1 Мин.; 57 С, 1 мин.; 72 С, 1.2 мин. Амплифицированные фрагменты идентифицировали в 1,0 % агарозном геле, обработанном бромистым этидиеМ.

Препараты, использованные для Системных И внутоимозговых введений: эндотоксин (ЛПС; е. coli, сероГип 055;В5), ИЛ-1р (чел., рек., Sclavo', Италия), ИЛ-1р (крыс., Нац. ин-т стандартов, Англия), антагонисг рецепторов ИЛ-1 - ИГ1-1 p.a. ( Стокгольмский ун-т, Швеция), блокатор синтеза серотонина - парахлорфенилаланин (ПХФА, Sigma). Препараты растворяли в апирогенном физиологическом растворе (физ. р-ре). Схемы введения препаратов и дозы различа-. лись в зависимости от задач экспериментов и описаны в соответствующих разделах главы "Результаты".

Статистическую оценку полученных результатов проводили с помощью вычисления Т- критерия Стьдента и корреляционного коэффициента Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Структура изменения поведения, вызванного введением про-

воспалительных цйтокинов.

Для исследования структуры нарушения поведения, вызываемого провоспалительными цитокинами было проанализировано изменение поведения в хорошо знакомом пространстве (12-ти лучевом лабиринте) и в новой обстановке (тест "открытое поле"). Было выявлено, что введение пирогенных доз ИЛ-1(5 (чэл., рек., 8 мкг/жив.) не увеличивает количество ошибок в лабиринте. Анализ ошибок и поведенческой тактики также не выявил отличий между контрольной и опытной группами.

Исследование, проведенное на тех же животных в "открытом поле" (два теста следовали один за другим) выявили, что ИЛ-1|1 снижает число пересеченных квадратов в 2 раза по сравнению с контролем (Р< 0,05).

Сопоставление результатов показывает, что ИЯ-1Ц влияет на поведение в новой обстановке, однако не действует на программы поведения в хорошо знакомой окружающей среде.

2. Физиологические эффекты субпирогенных доз ИЛ-1.

Для проверки гипотезы о независимости нарушений коммуникативного поведения, индуцированных провоспалительными цитокинами, от их пирогенного действия исследована социальная активность крыс в тесте "чужак- резидент" после в/б введения физ, р- ра

или ИЛ-1р (чел., рек.) в субпирогенной дозе (4 мкг/жив.). ИЛ-1р вводили в дозе равной половине пороговой дозы для индукции пи-рогенной реакции. Для проверки специфичности эффектов ИЛ-1 использовали внутримозговые введения ИЛ-1 p.a. (50 мкг в 10 мкл фИз. р-ра) за 20 минут до ИЛ-1р.

Было выявлено, что в/б введение ИЛ-1р в субпирогенной дозе приводит к снижению времени коммуникативных взаимодействий в тесте "чужак- резидент" почти в 2 раза по сравнению с контролем (Р< 0,01), Предварительное енутримозговое введение ИЛ-1 p.a. полностью блокировало эффект.'

Проведенные эксперименты показывают, что нарушение коммуникативной активности крыс наблюдается даже при введении суб-лирогенных доз ИЛ-1(5, что показывает независимость поведенческой реакции от пирогенной. Действие циркулирующего в крови ИЛ-Iß опосредуется внутримозговыми рецепторами этого цитокина, специфичность эффекта выявляется блокадой поведенческой реакции после введения антагониста рецепторов ИЛ-1.

3. Исследование нейромедиагорных механизмов реализации действия эндотоксина на физиологические процессы.

Для анализа участия НА-, ДА- и 5-ÖT- систем гипоталамуса в реакции физиологических систем организма был исследован паттерн изменения метаболизма биогенных аминов, сопровождающий повышение температуры тела, активацию ГГНС и изменение коммуникативной активности крыс, которые вызваются системным введением пороговой и надпороговой доз ЛПС для пирогеннных-реакций. Доза ЛПС 5 мкг/ кг была определена как пороговая (увеличение температуры тела более чем на 0,6 С наблюдалось лишь у 30-40 % животных); в качестве надпороговой дозы применяли 5-кратно уве-

личенную пороговую дозу - 25 мкг/кг. Физиологические реакции к нейромедиаторные изменения тестировали через 2 и 3,5 часа, после введения Л ПС (период наиболее выраженных реакций).

Пирогенная реакция наблюдалась у экспериментальных животных через 2 часа после введения ЛПС а дозе 5 мкг/кг и через 2 и 3,5 часа после введения ЛПС в дозе 25 мкг/кг . Доза 25 мкг/кг вызывала у крыс более выраженные пирогенные эффекты.

Уровень кортикостерона был достоверно выше в крови экспериментальных животных через 2 часа после введения ЛПС в дозе 5 и 25 мкг/кг по сравнению с контрольной группой (соответственно: • 223.2 +27.8; 275." ±18.3; 153 6 + 36.2). Через 3,5 часа после введений уровень кортикостерона в обеих опытных и контрольной группах не отличался.

Снижение времгни коммуникативных взаимодействий в тесте /'чужак- резидент" на 30-50 % наблюдалось в обеих экспериментальных группах и было выражено сильнее через 3,5 часа после введения ЛПС.

Реакции нейромедиаторных систем на введение ЛПС были более выражены в переднем, чем в заднем гипоталамусе. Через 2 часа после введения ЛПС в дозе 25 мкг/ кг наблюдалась активация метаболизма НА в переднем гипоталамусе, о Чем судили по увеличению соотношения МОФЕГ/ НА (табл. 1); через 3,5 часа реакций норадре-нергической системы не отмечено. Изменения метаболизма дофа-минергической и серотонинергической систем переднего гипоталамуса, напротив, были более выражены через 3,5 часа после введения ЛПС в дозах 5 и 25 мкг/кг. У животных в опытных группах имела место дозозависимая активация ДА- и 5-НТ- сис-те л, о чем свидетельствовало увеличение соотношения метаболит/медиатор (табл. 1). Дозозависимое снижение НА и увеличение содержания

метаболита серотонина -5-ОИУК отмечалось в заднем гипоталамусе крыс опытных групп по сравнению с контрольными животными через 3,5 часа после введения ЛПС.

Таблица 1. Реакции биогенных аминов переднего гипоталамуса на

введение ЛПС.

2 часа после введения

физ. р- ра ЛПС, 5 мкг/кг ЛПС, 25 мкг/кг

число животных 7 8 8

МОФЕГ/НА 0,07+0,01 0,10±0,01 0,10+0,007*

ГВК/ДА 0,09+0,01 0,1110,01 0,10+0,01

ДОФУК/ДА 0,25+0,01 0,30+0,03 0,31+0,04

ИУК/5-ОТ 0,81+0,12 0,61+0,08 0,8210,08

3,5 часа после введения

физ. р- ра ЛПС, 5 мкг/кг ЛПС, 25 мкг/кг

число животных 8 9 9

МОФЕГ/НА 0,04+0,01 0,05±0,01 0,05+0,01

ГВК/ДА 0,11±0,01 0,12+0,02 0,14+0,1

ДОФУК/ДА 0,37+0,03 0,56+0,10 * 0,5810,1*

ИУК/5-ОТ 0,70+0,29 1,00±0,06* 1,1910.11**

Р < 0,05; **- Р < 0,01 по сравнению с контрольными животными

Корреляционный анализ структуры изменений физиологических эффектов и нейромедиаторных реакций выявил связь высокого уровня кортикостероидов в крови с высоким содержанием метаболита норадреналина - МОФЁГ в переднем гипоталамусе (г=0,83, Р~0,02) через 2 часа после введения ЛПС (в дозе 25 мкг/кг); через 3,5 часа после введения ЛПС (в дозе 5 мкг/кг) обнаруживалась отрицательная корреляция между температурными реакциями и сог

держанием 5-НТ в переднем гипоталамусе (г—0,8, Р =0,01), а также 5-ОИУК (г=-0,86, Р=0,003) в заднем гипоталамусе. Введение физ. р-ра либо ЛПС в дозе 25 мкг/кг не вызывало достоверных корреляций между этими показателями. Существенной связи между временем коммуникативных взаимодействий и реакциями исследованных ней-ромедиаторных систем не обнаружено.

4. Изучение роли серотонинергических систем мозга в реализации физиологических эффектов ИЛ-1р.

Для выявления участия серотонинергических (5-ОТ) систем мозга ■ в регуляции эффектов эндотоксина и провоспалительных цитокинов проанализированы ИЛ-1 -индуцированные изменения физиологических функций в условиях селективной фармакологической блокады синтеза 5-ОТ в мозге. Ингибитор синтеза серотонина ПХФА .вводили крысам по 250 мг/кг веса тела , в/б в течении 3- х дней, последняя инъекция - за 24 часа до начала экспериментов. ИЛ-1р вводили в желудочки мозга в дозе 60 нг в 8 мкл физ. р-ра за 4 часа до экспериментов.

Нами установлено, что внутримозговое введение ИЛ-1р в дозе 60 нг вызывает снижение потребления воды крысами в 5 раз, пищи в 2 раза по сравнению с контрольными животными. После введения ИЛ- !р животные за 4 часа экспериментов теряют в весе почти в 2 раза больше, чем животные, получавшие инъекции физ. р- ра. В условиях блокады синтеза 5-ОТ ПХФА-ом нарушение потребления пищи и воды не наблюдалось и , как следствие, не происходило потери веса тела. При этом у животных со сниженным синтезом 5-ОТ ИЛ-1-индуцированные пирогенная реакция и нарушение коммуникативной активности не только не блокировались, но были даже нес/сольдо более выражены .

Таким образом, введение ПХФА не влияло на ИЛ-1- индуцированную пирогенную реакцию и нарушение коммуникативного поведения, однако блокировало нарушения пищевого и питьевого поведения, и , как следствие, отменяло снижение веса тела, что доказывает избирательное участие серотонинергических систем мозга в реализации центральных эффектов провоспалительных цитокинов.

5. Роль центральных рецепторов ИЛ-1 в активации метаболизма биогенных аминов в мозге.

Для выявления путей, посредством которых циркулирующий в крови ИЛ-1 вызывает активацию метаболизма биогенных аминов в мозге и роли мозговых рецепторов ИЛ-1 в индукции биохимических изменений, нами исследованы реакции ДА и 5-ОТ систем гип-. покампа, переднего и заднего гипоталамуса на системное введение ИЛ-1 в условиях блокады центральных рецепторов ИЛ-1 антагонистом - ИЛ-1 p.a. ИЛ-1 p.a. вводили в желудочки мозга в дозе 50 мкг. за 20 мин. до системных введений ИЛ-Iß (чел., рек., 4 мкг/жив). Дозу ИЛ-1 подбирали как вызывающую нарушение поведения в тесте "чужак- резидент". Декапитацию и забор структур мозга для определения нейромедиаторов проводили через 30 минут после введения ИЛ-1.

Нами выявлено, что через 30 минут в переднем гипоталамусе животных, получавших иньекции ИЛ-1, наблюдалась активация метаболизма ДА (увеличение соотношения ГВК/ДА) по сравнению с контролем (0,21±0,05 и 0,46+0,09, соответственно), предварительное введение ИЛ-1 p.a. полностью блокировало реакцию (0,23j_n,03). Системное введение ИЛ- Iß приводило также к активации метаболизма 5-ОТ в переднем гипоталамусе (увеличивалось соотношение 5-ОИУК/5-ОТ) в опытной группе по сравнению с кон-

тролем (4,8+0,66 и 2,36+0,65, соответственно). Предварительное! введение антагониста рецепторов ИЛИ блокировало реакцию (2,76+0,28). В заднем гипоталамусе и гиппокампе достоверных отличий по исследованным показателям не выявлено.

Выполненные эксперименты показывают, что мозговые рецепторы ИЛ-1 опосредуют активацию метаболизма ДА и 5-ОТ в переднем гипоталамусе, индуцированную системным введением ИЛ-Iß. Специфичность действия ИЛ-1 на активность нейромедиаторных систем доказывается блокадой эффекта ИЛ-1 p.a..

• 6. Исследование роли мозгового пула ИЛ-1. ИЛ-1 p.a. и ФНО в реализации пирогенеза. вызванного системным введением эндотоксина.

Для выявления роли мозгового пула провоспалительных цитокинов в -индукции пирогенной реакции методом РТ-ПЦР исследован паттерн синтеза мРНК ИЛ-1, ИЛ-1 p.a. и ФНО в гипоталамусе, гиппокампе и коре мозга кроликов с нормальной температурой тела (без введений и после введения апирогенного физ. р-ра) и при пирогенной реакции, индуцированной в/в введением ЛПС. В качестве тестовой системы при проведении РТ-ПЦР реакции использовали определение мРНК ИЛ-1, ИЛ-1 p.a. и ФНО в ЛПС-стимулироваНных перито-неальных макрофагах (известно, что Макрофаги являются основными продуцентами провоспалительных цитокинов).

Проведенные эксперименты выявили синтез мРНК ИЛ-1, ИЛ-1 р.а и ФНО В переживающей культуре стимулированных перитональ-ных макрофагов кроликов после 3-х часов инкубации клеток с ЛПС.

Исследования на кроликах показали, что естественные колебания температуры тела животных после введения физ. р- ра за вре-

о

мя наблюдения не превышали 0,2 С; ведение ЛПС в дозе 500 нг/кг

приводило к повышению температуры более, чем на 1°С уже через 30 минут; через 1,5 и 3,5 часа наблюдалось увеличение температу-

о

ры на 1,5 С и более. Введение ЛГ1С в дозе 5 мкг/кг также вызывало выраженную пирогенную реакцию, повышение температуры наступало, однако, быстрее . Максимальное увеличение температуры на

о

1,9 С зафиксировано через 3,5 часа после введения ЛПС в дозе 5 мкг/кг.

У животных с нормальной температурой тела мРНК ИЛ-1 обнаружена во всех исследованных областях мозга; мРНК ИЛ-1 p.a. обнаружена в переднем гипоталамусе животного, которому вводили физ. р- р и гиппокампе кроликов с введением физ. р- ра и без введений. МРНК ФНО не выявлена у животных с нормальной температурой тела. После введения ЛПС в дозе 500 нг/ кг паттерн экспрессии провоспалительных цитокинов в мозге менялся незначительно: мРНК ИЛ-1 по-прежнему присутствовала практически у каждого животного во всех исследованных структурах, мРНК ИЛ-1 p.a. не выявлена в гиппокампе на ранних сроках (30 минут- 1,5 часа) после введения ЛПС , однако обнаружена в гиппокампе и коре мозга через 4,5 часа после введения ЛПС. МРНК ФНО выявлена в гипоталамусе лишь у одного животного через 4,5 часа после введения ЛПС. Введение ЛПС в дозе 5 мкг/кг приводит к появлению синтеза мРНК ФНО во многих структурах мозга. Через 1,5 часа после введения ЛПС мРНК ФНО выявлена в коре, через 3,5 часа - в гиппокампе, переднем и заднем гипоталамусе.

Таким образом, в проведенном исследовании выявлена продукция мРНК И/1-1 и ИЛ-1 p.a. у кроликов с нормальной температурой тела и при пирогенной реакции, индуцированной внутривенным введением ЛПС в пирогенных дозах.

МРНК ФИО в наших экспериментах нб выявлена у животных с нормальной температурой тела. После введения ЛПС в дозе 500 нг/кг продукция мРНК ФИО наблюдалась лишь в гипоталамусе у одного кролика через 4,5 часа после введения ЛПС (фаза снижения пирогенной реакции). Отсутствие продукции мРНК ФНО на всем протяжении пирогенной реакции, вызванной внутривенным введением ЛПС в дозе 500 нг/ кг показывает, что у кролика для реализации пирогенного эффекта ЛПС наличие синтеза ФНО в мозге необязательно. Обнаружение мРНК ФНО в различных областях мозга только после введения высоких доз ЛПС позволяет гипотетически 1 предположить, что синтез этого цитокина в мозге, возможно, является маркером перехода физиологических реакций в патологический процесс.

ВЫВОДЫ:

1. Бактериальный ЛПС стимулирует клетки иммунной системы, вызывая в них синтез провоспалительных цитокинов (как показывает реакция переживающей культуры перитонеальных макрофагов).

2. Системное введение эндотоксина или экзогенного ИЛ-1 вызывает комплекс поведенческих, температурных и эндокринных реакций в ЦНС.

3. Физиологические реакции в ЦНС , вызванные введением ЛПС и провоспалительных цитокинов развиваются параллельно и имеют разные пороги активации. Наиболее низкие пороги выявлены для поведенческих реакций. Наличие пирогенной реакции не обязательно для индукции нарушения коммуникативного поведения.

4. Выявлена сложная структура нарушения поведения, индуцированного введением экзогенного ИЛ-1. Ведение ИЛ-1 приводит к значительному нарушению поведения в новой обстановке и реакций на

новые стимулы, но не влияет на хорошо закрепленные программы поведения .

5. Системное введение ЛПС приводит к дозозависисмой активации метаболизма биогенных аминов в гипоталамусе. Реакции систем биогенных аминов более выражены в переднем, чем заднем гипоталамусе.

6. Разные физиологические реакции опосредуются различными нейромедиаторными механизмами. Нарушение пищевого, но не коммуникативного поведения , индуцированное центральным введением ИЛ-1 опосредуется серотонинергическими путями мозга.

7. Активации метаболизма биогенных аминов в переднем гипоталамусе, вызванная системным введением ИЛ-1, опосредуется центральными рецепторами ИЛ-1 .

8. В мозге кроликов с нормальной температурой тела, в обычных условиях обнаружена "базовая" продукция мРНК цитокинов семейства ИЛ-1.

9. ФНО не образуется в ЦНС кроликов с нормальной температурой тела и при пирогенной реакции, вызванной введением умеренных доз ЛПС. Выявлена индукция синтеза мРНК ФНО в различных областях мозга при введении высокопирогенных доз ЛПС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Клименко В.М., Зубарева O.E.., Краснова И.Н. Роль внутри-мозговых рецепторов ИЛ-1 в модуляции гомеостатических реакций организма . // Нейрохимия, 1995, т. 12, вып. 2, стр. 16- 22.

2. BiipaöanoBa С В., Зубарева O.E., Клименко В.М. Изменение структупы поведения, обусловленное введением ИЛ-1Р //Успехи физиоло! ических наук, 1994, T.25, №1, 50- 51

3. Клименко В.М., Зубарева O.E., Краснова И.Н., Ефремов

О.М. Влияние внутрижелудочкого введения антагониста рецепторов ИЛ-1 на центральные эффекты ИЛ-1р.//Сб. Тез. 1-го съезда Российского общества фармакологов, 3- 9 октября 1995 г., Волгоград, 1995, стр. 193

V. Klimenko V.M., Zubareva O.E., Krasnova I.N. The action of sub-pyroqenic dose of interleukin-1 on social behavior of rats.// In: International conference on Neuroimrnuno Interaction and Environment, 17-24 July 1995, St. Petersburg, Russia, p.133

5. Zubareva O.E., Tarasov K. V., Klimenko V. M. RT-PCR detection of the pattern of proinflammatory cytokines mRNA production in rabbits peritoneal macrophages induced by endotoxin.//ln: International conference on Neuroimrnuno Interaction and Environment, 17-24 July 1995, St. Petersburg, Russia, p.192.

6. Klimenko V.M., Zubareva O.E., Krasnova I.N., Efremov O.M. The action of subpyrogenic dose of IL-1b on social behavior of the rats.// In: Abstracts of symposium "Cytokines as communication factors between the immune system and the central nervous system", Ar-cachon, September 11-13, 1995, p. 86,

7. Zubareva O.E,, Tarasov K.V., Klimenko V.M. Pattern of IL-1a,p and IL-1 receptor antagonist mRNA in rabbits brain induced by systemic LPS treatment.//ln: Abstracts of 4th Russian-Swedish symposium on "New research in neurobiology", 20th-22nd of may 1996, Moscow, Russia, p. 119.

8. Klimenko V. M., Zubareva O.E , Krasnova I.N., Neuromediators mechanisms of central reactions induced by IL-lp and LPS peripheral treatment.// In: Abstracts of International symposium "Cytokines in the brain: neuropathological aspects", May, 25-28, 1996, Sent-Jean-de-Luz, France, p. 75.

/и.-, iWt?,-Y<„.\<<' icc