Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы клеточной устойчивости к ингибитору трансляции микроцину С и родственным соединениям

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы клеточной устойчивости к ингибитору трансляции микроцину С и родственным соединениям"

005052571

Тихонов Антон Алексеевич

На правах рукописи

■у/

\т

Механизмы клеточной устойчивости к ингибитору трансляции микроцнну С и родственным соединениям

Специальность 03.01.03 — молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 4 ОКТ 2012

Москва - 2012

005052571

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук и лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук.

Научный руководитель: Северинов Константин Викторович

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Гельфанд Михаил Сергеевич

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем передачи информации имени A.A. Харкевнча Российской академии наук,

заместитель директора но научным вопросам

Каменский Петр Андреевич кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», ведущий научный сотрудник Кафедры молекулярной биологии Биологического факультета

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Российской академии наук

Защита диссертации состоится 26 октября 2012 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном

учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгедьгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д 32.

Автореферат разослан сентября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета ^

канд. фарм. наук Л'С П^овская

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Одном из важнейших проблем современной медицины является возникновение и распространение штаммов патогенных бактерий, устойчивых к антибиотикам. Количество инфекций, плохо поддающихся терапии антибиотиками, растет во всех развитых странах. Помимо очевидных мер, таких как контроль за применением антибиотиков и соблюдение правил больничной гигиены, главным способом борьбы с устойчивыми бактериями является применение новых лекарственных средств. До недавнего времени в качестве основного подхода к разработке новых антибактериальных агентов фармацевтические компаний применяли модификацию уже используемых антибиотиков. Однако этот подход теряет эффективность, поскольку бактерии быстро вырабатывают устойчивость к большинству производных существующих соединений. Более перспективным способом разработки антибиотиков является поиск новых природных антибактериальных агентов, неродственных соединениям, применяемым в медицине.

С другой стороны природные антибактериальные агенты играют важную роль в экологии микробных сообществ. Например, 20% изолятов Escherichia coli из кишечника человека вырабатывают один или несколько микроцинов — пептидных антибиотиков с небольшой молекулярной массой (<10 кДа).

Поэтому, всестороннее исследование структуры, механизмов действия, биологической роли природных антибиотиков, а также механизмов устойчивости к этим соединениям является важной научной и практической задачей.

Диссертационная работа посвящена исследованию природного антибиотика микроцина С (МсС). Это соединение вырабатывается Е. coli и подавляет рост многих видов энтеробактерий в микромолярных концентрациях. МсС представляет собой линейный гептапептид к С-концевому аспартилу которого через N-ацил-фосфорамидную связь присоединен модифицированный остаток АМФ. Внутриклеточной мишенью соединения является аспартил-тРНК-синтетаза. Гены, обеспечивающие синтез МсС, организованы в кластер. Было показано, что гены тссС, тссЕ и mccF микроциновго кластера обеспечивают устойчивость клеток Е. coli к производимому антибиотику. Механизмы действия продуктов генов тссС и тссЕ были подробно изучены в нашей лаборатории, в то время как механизм устойчивости, который обеспечивается геном mccF, не был известен.

V

\

\

Цели н задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение молекулярного механизма действия продукта гена mccF, за счет которого клетки Е. coli приобретают устойчивость к МсС и родственным соединениям, а также поиск функциональных гомологов белка MccF в других микроорганизмах. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Установить MccF-завиеимый механизм устойчивости к МсС.

2) Определить структуру MccF. Охарактеризовать аминокислотные остатки, ответственные за узнавание субстрата и каталитическую активность.

3) На основании полученных данных о механизме действия и структуре MccF предсказать функциональных гомологов MccF в других микроорганизмах.

4) Определить, способны ли предсказанные гомологи обеспечивать устойчивость клеток к МсС и родственным антибиотикам.

Научная новизна н практическая значимость работы. Был установлен механизм MccF-зависимой устойчивости клеток Е. coli к МсС. Было показано, что MccF является сериновой пептидазой, которая детоксифицирует антибиотик за счет гидролиза C-N связи, расположенной между а-карбоксильной группой С-концевого аспартила микроцинового пептида и модифицированным остатком АМФ. Кроме того, MccF гидролизует ингибиторы аминоацил-тРНК-синтетаз (ARS), сходные по структуре с активной формой МсС — аминоацил-сульфамоил-аденозины (aaSA).

Была определена кристаллическая структура MccF в комплексе с МсС и его аналогами. Были найдены аминокислотные остатки, ответственные за специфическое распознавание субстрата и реакцию гидролиза. В частности, в MccF была обнаружена петля, аминокислотные остатки которой определяют специфичность пептидазы к аденилированным соединениям.

На основании полученных структурных данных было предсказано, что ряд гомологов MccF также обладает специфичностью к аденилированным субстратам. Экспериментально было показано, что некоторые из найденных ферментов действительно гидролизуют МсС и aaSA, а также обеспечивают устойчивость клеток к этим соединениям в физиологических условиях. Для одного из гомологов из Bacillus cereus была определена трехмерная структура и охарактеризованы аминокислотные остатки, ответственные за связывание субстрата и каталитическую активность.

Результаты исследования существенно расширяют представления о биохимии серииовых пептидаз и механизмах лекарственной устойчивости бактерий. Физиологическая функция обнаруженной нами группы пептидаз, представители которой обладают высокой специфичностью к аденилированным соединениям, остается неизвестной. За исключением нескольких ингибиторов ARS, современной науке неизвестны природные вещества похожие по строению на субстраты MccF. Поэтому поиск физиологических функций ферментов MccF-группы является интересной задачей для будущих исследований.

Публикации а апробация работы. По результатам работы опубликовано три статьи в международных рецензируемых журналах. Часть результатов работы представлена на конференции «ASBMB annual meeting», april 24 - 28,2010, Anaheim, USA.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: общая характеристика работы, литературный обзор, материалы и методы, результаты работы, заключение, выводы, публикации в журналах, список литературы, список сокращений. Работа изложена на 94х страницах машинописного текста. Работа содержит 30 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемых литературных источников включает 146 наименований.

Содержание работы

Структура и механизм действия МсС. МсС представляет собой модифицированный N-формилированный линейный гептапептид (fMRTGNAD). Альфа-карбоксильный атом С-концевого остатка аспарагиновой кислоты пептида соединен с остатком аденозина через N-ацил-фосфорамидную связь. К фосфорамиду присоединена аминопропильная группа. МсС проникает в чувствительные клетки энтеробакгерий (в том числе Е. coli) через ABC транспортер YejABEF, который узнает пептидную часть соединения. В цитоплазме клетки 6 N-концевых аминокислотных остатков МсС отщепляются в результате совместного действия пептид-деформилазы и олигопептидаз А, В и N. В результате образуется негидролизуеемый аналог аспартил-аденилата — процессированный МсС (рМсС) (рис. 1). Это соединение ингибирует аспартил-тРНК-синтетазу (концентрация полумаксимального ингибирования для AspRS Е. coli — 30 нМ), что приводит к остановке трансляции и роста клеток.

NH,

tMt*l-Aig-Thr-Gly-Asn-Aia-HNv

<

H-f

HjN

микроцин С

A, "

2 Y N-PO H ¿

¿ )

s

NH,

HjN^. HO-^X

o>

O-___ N-'

¿H ¿H

fMel-Arg • TI v -Gty -As rvAla • H N ч^^Дч »

H lí R O

'

fMRTGNAX-SA

процессированный микроцин С

i>.. a u

Y N ■ S- O.

I H ¡I

aaSA

аспартил-АМФ

Рис. 1. Химические структуры микроцина С, его процессированной формы, аспартил-АМФ, ГМЯТОКАХ-ЭА и ааБА. Буквой Я обозначена боковая цепь аминокислоты.

Продукция MccF обеспечивает устойчивость клеток к МсС. В лаборатории Филлипа Морено было показано, что клетки, несущие ген mccF на плазмиде, приобретают устойчивость к МсС1. Чтобы убедится в том, что продукт гена mccF действительно защищает клетки от МсС, мы заклонировали последовательность mccF в экспрессионный вектор рЕТ19Ь. Были подобраны условия экспрессии mccF, при которых большая часть продуцируемого белка находилась в растворимой форме. Культуру клеток Е. coli BL21(DE3), несущих плазмиду

1 González-Pastor, J.E., et al., Structure and organization of plasmidgenes required to produce the translation inhibitor microcin C7. J Bacteriol, 1995.177(24]: p. 7131-40.

рЕТ 19b-mccf, добавляли в расплавленный агар (0,7 %) и заливали в чашки Петри. После застывания агара на газон клеток наносили 2 мкл 100 мкМ раствора МсС. В качестве контрольных культур мы использовали клетки Е. coli B121(DE3), несущие pET19b без вставки (отрицательный контроль), и плазмиду рЕТ19Ь-тссЕ, где тссЕ — это ранее охарактеризованный нами ген устойчивости к МсС (положительный контроль)2 . После нескольких часов инкубации чашек в термостате вокруг точек нанесения раствора антибиотика возникает зона ингибирования роста клеток. Размер этой зоны соответствует уровню устойчивости клеток к соединению. Как показано на рис. 1Б, продукция MccF делает клетки устойчивыми к МсС, что выражается в отсутствии зоны ингибирования роста. В соответствии с предыдущими данными, продукция МссЕ также обеспечивает устойчивость клеток к МсС, а клетки, несущие рЕТ19Ь, чувствительны к нему.

Кроме МсС мы протестировали альбомицин, который ингибирует сериновую тРНК-синтетазу, и три синтетических аналога МсС: MRTGNAD-SA, MRTGNAE-SA, MRTGNAL-SA. Данные химически синтезированные соединения состоят из 6 первых аминокислотных остатков микроцинового пептида и присоединенного с С-конца аспартил- (MRTGNAD-SA). глутамил- (MRTGNAE-SA) и лейцил-сульфамоил-аденозина (MRTGNAL-SA). В результате процессинга синтетических аналогов МсС в цитоплазме Е. coli высвобождаются aaSA, которые ингибируют соответствующие ARS: DSA ингибирует AspRS, ESA — GluRS, а LSA —■ LeuRS3 (рис. 1). Опыт показал, что MccF обеспечивает устойчивость клеток только к MRTGNAD-SA и MRTGNAE-SA (рис. 2А).

Чтобы понять, защищает ли MccF клетки от рМсС и aaSA, мы повторили эксперимент, но в качестве антибиотиков применили LSA и аналог рМсС — DSA (рис. 1). Оказалось, что клетки, которые производят MccF, устойчивы к DSA, но чувствительны к LSA (рис. 2Б).

Таким образом, MccF обеспечивает устойчивость клеток Е. coli к МсС и его синтетическим аналогам, ингибирующим AspRS и GluRS, но не обеспечивает устойчивости к альбомицину и синтетическому аналогу МсС, который ингибирует LeuRS.

2 Novikova, M., et al, МссЕ Provides Resistance to Protein Synthesis Inhibitor Microcin C by Acetylating the Processed Form of the Antibiotic. Journal of Biological Chemistry, 2010. 285(17]: p. 12662-12669.

3 Van de Vijver, P., et al.. Synthetic Microcin CAnalogs Targeting Different Aminoacyl-tRNA Synthetases. J Bacteriol, 2009.191(20]: p. 6273-6280.

MccF детоксифиципует McC in vitro. Для того, чтобы выяснить, способен ли MccF инактивировать МсС и родственные соединения in vitro, были проведены два опыта. В первом опыте был протестирован эффект MccF на реакцию аминоацилирования в экстрактах клеток Е. coli, обработанных МсС и aaSA. В S30 экстракты Е. coli добавляли МсС или DSA, затем добавляли очищенный рекомбинантный MccF, после чего через равные промежутки времени отбирали пробы для проведения реакции аминоацилирования тРНКА!р. В качестве контролей использовали клеточные экстракты без добавления антибиотиков и MccF. Для того, чтобы из МсС в результате процессинга образовался ингибитор AspRS рМсС, перед добавлением MccF экстракт инкубировали с МсС в течении 15 минут. Так как для проявления ингибирующей активности DSA процессинг не нужен, DSA и MccF добавляли в клеточный экстракт одновременно. Во обоих случаях первую пробу для проведения реакции аминоацилирования отбирали сразу после добавления MccF. Как показано на рис. 2В, добавление МсС или DSA приводит к ингибированию реакции аминоацилирования тРНКАф. При добавлении MccF к экстрактам, содержащим антибиотики, уровень аминоацилирования тРНКАф полностью восстанавливается (рис. 2В). Таким образом, устойчивость клеток, которые производят MccF, скорее всего связана с инактивацией МсС внутри клетки. С помощью этого подхода мы выяснили, что MccF не способен инактивировать LSA in vitro, что находится в соответствии с данными, полученными в экспериментах in vivo (рис. 2Г). Также, этим способом было показано, что MccF с низкой эффективностью детоксифицирует SSA, но не действует на ASA, ISA, KSA, FSA, GSA и PSA (данные не представлены).

В другом опыте инкубировали очищенный MccF с МсС, а затем наносили реакционную смесь на газон чувствительных к МсС клеток Е. coli. В качестве контроля МсС инкубировали без добавления фермента. Контрольная реакция подавляла рост клеток, в то время как обработанный MccF антибиотик не действовал на клетки (рис 4Б). Таким образом, рекомбинантный MccF инактивирует МсС не только в клеточном экстракте, но и в системе, состоящей из очищенных компонентов.

■ Микроции С □ MRTCNAD SA

В

45

л 40

о И

>

с 30

с 25

<

20

X 15

ш

7 9 10

У1 5

to

0

• контроль -♦-МсС

-+-OSA —О— DSA+Mccf

0 12 3

время инкубации, часы

ры pbllfiw pblfllifcfc — — _ — '

время инкубации, часы

Рис. 2. MccF детоксифицирует МсС и его аналоги in vivo и in vitro. (А и Б) Площадь зон ингибирования роста вокруг (А] 2 мкл 100 мкМ МсС, 10 мкМ альбомицина и 350 мкМ MRTGNAD-SA, MRTGNAE-SA и MRTGNAL-SA или (Б] 10 мМ DSA и LSA, нанесенных на газон клеток Е. coli BL21(DE3), несущих указанные плазмиды. (В и Г) Аминоацилирование тРНК в S30 экстрактах Е. coli, содержащих или не содержащих MccF. Реакции с добавлением МсС, DSA или LSA инкубировали указанное время, а затем проводили реакцию эминоацилирования. [В] Аминоацилирование tPHKAsp. (Г) Аминоацилирование tPHKUu. Показаны типичные результаты одного из нескольких проведенных экспериментов.

MccF является сериновон пептидазой. Для выяснения природы активности MccF был проведен биоинформатический поиск гомологичных белков. Оказалось, что MccF принадлежит к семейству S66 сериновых пептидаз; ближайшим гомологом этого фермента в Е. coli является LD-карбоксипептидаза (LdcA). Этот фермент отщепляет С-концевой D-аланин от тетрапептида — продукта распада муреина клеточной стенки бактерии. В лаборатории Матиаса Бочтлера были охарактеризованы аминокислотные остатки, составляющие каталитическую триаду

Ьс1сА4. С помощью выравнивания последовательностей МссР и ЬёсА были найдены аминокислотные остатки МссР, соответствующие каталитической триаде ЬёсА (рис. 3). Мы предположили, что МссР является сериновой пептидазой. Чтобы проверить это предположение были поставлены следующие эксперименты.

Keep ESQSH ? LL.-jJv^WE-^flss^BS'"¿ЩЗННШе Фзе ■' -ДпДвіИіД

AgnC5 BBggQ-----

Ld cf. ------------------

нее г — д

1- -> ДоіЦезИ----ЗИ

Lach

А Î

*__ _ _

mccf В МИН ■ МИ Д 1 "1 И— Д | 'ir :Щ-Щу' - ::. • " ~5

AgnCS

LdcA ---------

AgnCS r -§■ гДДя

LccA ------f.tf^HSgec'pt'Î-----------------В Я В

* _

AgnCS К?рас; -ИИУ^МД^ИВФШДССИЯ^Иа^Ыфз- -LS

LdcA ВВП —

* _

Agnes

LdcA

HccF --------

Agnes SYDIPAVF LdCA

Рис. 3. Выравнивание последовательностей MccF и LdcA из E. coli, a также гомолога MccF из Agrobacterium radiobacter. Аминокислотные остатки каталитической триады помечены звездочками.

Мы заменили остаток Эег118 из предсказанной каталитической триады МссР на аланин и показали, что клетки, продуцирующие белок с заменой, чувствительны к ОБА и МсС так же, как и контрольные клетки, несущие плазмидный вектор без вставки (рис. 4А).

4 Korza, H.J. and M. Bochtler, Pseudomonas aeruginosa LD-Carboxypeptidase, a Serine Peptidase with a Ser-His-GIu Triad and a Nucleophilic Elbow. Journal of Biological Chemistry, 2005. 280(49): p. 40802-40812.

Очищенный рекомбинантный MccF®erll8"Ala также не способен инактивировать МсС в in vitro системе, состоящей из очищенных компонентов (рис. 4Б). Таким образом, в полном соответствии с нашим предположением, замена остатка предсказанной каталитической триады полностью дезактивирует MccF.

Для дополнительного подтверждения пептидазной природы активности MccF мы обработали фермент специфическим необратимым ингибитором сериновых пептидаз — фенилметилсульфонил-флоридом (PMSF). После обработки PMSF MccF инкубировали с МсС in vitro. Как видно на рис. 4Б в таких условиях MccF не подавляет антибактериальную активность МсС. Совокупность полученных результатов позволяет сделать заключение, что MccF инактивирует МсС и DSA за счет активности сериновой пептидазы.

■ control

□ MccF

□ MccF PMSF DMccFSef'^-Aia

PET pETmuf pETmccf Serm-Ala McC

Рис. 4. Рекомбинантный MccF детоксифицирует МсС в in vitro системе, составленной из очищенных компонентов. (А) Площадь зон ингибирования роста вокруг 2 мкл 100 мкМ раствора МсС или 10 мМ раствора DSA, нанесенных на газон клеток Е. coli BL21(DE3), которые производят MccF, MccF с заменой Serll8-Ala, а также клеток, несущих рЕТ19 вектор. (Б) Площадь зон ингибирования роста вокруг точек нанесения продуктов реакции инкубации МсС с очищенным MccF, MccF, обработанным 4 мМ PMSF, или с MccFSerll8"Ala.

MccF гидролизует амидную связь между пептидной и нуклеотилной частями MccF. Для

того чтобы выяснить молекулярный механизм действия MccF мы проанализировали продукты реакции MccF с МсС in vitro с помощью МАЛДИ масс-спектрометрии. Масс-спектр препарата МсС содержит два масс-иона, соответствующих МсС (m/z = 1177) и форме МсС, не содержащей N-концевой формильной группы (m/z =1149). После инкубации с MccF эти массивны не детектируются, а вместо них появляются новые масс-ионы со значениями m/z равным

404, 764 и 792 (рис. 5А). Последние две массы соответствуют гептапептиду МсС — MRTGNAD и его формилированной форме, соответственно. Идентификация была подтверждена с помощью тандемного масс-спектрометрического анализа масс-иона с m/z = 764 с последующим анализом спектра фрагментации.

Масс-ион с m/z = 404 соответствует нуклеотидной части МсС, то есть фосфорамид-аденозину, модифицированному аминопропильной группой. Для подтверждения этой идентификации мы провели масс-спектрометрический анализ продуктов инкубации MccF с деформилированным МсС, не содержащим в своем составе аминопропильной группы. Спектр исходного препарата микроцина содержит один масс-ион со значением m/z = 1092. После обработки MccF вместо этого иона появляются масс-ионы со значениями m/z равными 764 и 367 (рис. 5Б). Как описано выше, более тяжелый масс-ион представляет собой деформшшрованную пептидную часть МсС, а масс-ион с m/z = 367 соответствует нуклеотидной части без аминопропильной группы. Таким образом мы подтвердили, что масс-ион с m/z = 404 в спектре продуктов реакции MccF с МсС соответствует нуклеотидной части антибиотика, а масс-ионы со значениями m/z равными 764 и 792 являются гептапептидом МсС и его формилированной формой, соответственно. На основании этих результатов можно заключить, что в результате действия MccF происходит гидролиз C-N связи между альфа-карбонильным атомом С-концевой аминокислоты пептидной части и нуклеотидной частью МсС. Сходные результаты были получены при инкубации MccF с синтетическими аналогами МсС — MRTGNAD-SA и MRTGNAE-SA (данные не представлены).

Инкубация MccF с PSA и ESA приводит к образованию высокотоксичного сульфамоил-аденознна. Мы провели масс-спектометрический анализ продуктов инкубации MccF с различными aaSA. Действие фермента на DSA приводит к исчезновению масс-иона исходного вещества (m/z = 462) и появлению масс-иона с m/z = 367, который соответствует сульфамоил-аденозину (SA) (рис. 5В). Тот же масс-ион появляется в результате инкубации MccF с ESA и SSA, в то время как масс-ионы исходных соединений пропадают из спектра (рис. 5Д и Е). Инкубация MccF с LSA не приводит к изменению масс-спектра этого соединения (рис. 5Г), что соответствует данным, полученным в ходе in vivo и in vitro экспериментов. Мы предполагаем, что, по аналогии с МсС, MccF гидролизует DSA, ESA и SSA по амидной связи, соединяющей карбонильный атом аминокислотного остатка и SA (рис. 7). Масса отщепляемых в этой реакции аминокислотных остатков слишком мала для их идентификации при помощи МАЛДИ-МС. Так

как MccF гидролизует МсС и аналог его процессированной формы — DSA, мы считаем, что рМсС также расщепляется данным ферментом по амидной связи (рис. 7).

Неожиданный результат был получен при нанесении продуктов реакции DSA и ESA с MccF на газон клеток Е. coli. Образец контрольной реакции с ESA (без добавления MccF) не подавляет рост клеток, тогда как при нанесении образца контрольной реакции с DSA образуется небольшая зона ингибирования роста. Нанесение продуктов реакции MccF с DSA или ESA приводит к образованию зоны ингибирования роста клеток большей площади, чем зона под образцом контрольной реакции с DSA. При инкубации MccFSerlI8Ala антибактериальная активность DSA не изменяется (рис. 6А). Таким образом, пептидазная активность MccF приводит к высвобождению из DSA/ESA соединения с высокой токсичностью. При МАЛДИ-МС анализе продуктов реакции мы не обнаружили других масс-ионов, кроме масс-иона SA. По литературным данным SA обладает высокой антибактериальной активностью5. Поэтому мы предположили, что именно MccF-завиеимое образование SA в наших условиях вызывает повышение антибактериального эффекта DSA и ESA. Нанесение одного наномоля химически-синтезированного SA на газон чувствительных к МсС клеток Е. coli приводит к возникновению зоны ингибирования роста равной по размеру "крупной" зоне, которая образуется при нанесении одного наномоля DSA, обработанного MccF (рис. 6Б). Из этих данных следует, что при гидролше DSA и ESA под действием MccF возникает высокотоксичный сульфамоил-аденозин (SA). Другие продукты данной реакции — глутаминовая и аспарагиновая кислоты, как и ожидалось, не подавляют рост клеток (данные не представлены).

Мы изучили действие SA на устойчивые к МсС культуры Е. coli, продуцирующие МссЕ, MccF и AspRS, и обнаружили, что ни один из перечисленных белков не обеспечивает устойчивости к SA (как синтетическому, так и образованному в результате действия MccF) (рис. 6Б). Отсюда следует, что SA и МсС имеют разные механизмы действия, а белки, которые обеспечивают устойчивость к МсС, не защищают клетку от SA.

5 Bloch, A. and С. Coutsogeorgopoulos, Inhibition of protein synthesis by 5'-sulfamoyladenosine. Biochemistry, 1971.10(24): p. 4394-4398.

1149,6

MccF

1120,5

£

792,3 +MCCF 764,3

lL

B

Д

X

300 400 500 600 700 800 300 1000 1100 1200 m/z 300 340 380 420 460 m/z 300 340 380 420 460 m/z

i 347,1

-MccF

+MCCF

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/t 300 340 380 420 460 m/Z 300 340 380 420 460 m/z

Рис. 5. Масс-спектрометрический анализ продуктов инкубации рекомбинантного MccF с МсС, МсС без аминопропильной группы и различными aaSA. (А) МсС, (Б), МсС без аминопропильной группы, (В) DSA, (Г) LSA, (Д) ESA и (Е) SSA инкубировали с рекомбинантным MccF. В качестве контроля использовали реакции без MccF. По оси абсцисс отмечены значения m/z.

■ control

□ MccF

□ MccF PMSF CMccFS*fIU-A!a

□ DSA

О DSA+MccF

DSA ESA pET pETmccf pETmccf pETaspHS

Рис. 6. При MecF-зависимом гидролизе DSA и ESA образуется токсичный сульфамоил-аденозин. (А) Площадь зон ингибирования роста вокруг точек нанесения продуктов реакции DSA или ESA с очищенным MccF, MccF после обработки 4 мМ PMSF и MccFSerll2"Ala. (Б) Площадь зон ингибирования роста вокруг 1 мкл 10 мМ растворов SA, DSA и раствора DSA, обработанного MccF, на газонах клеток Е. coli B121(DE3), несущих указанные плазмиды.

Таким образом, нами был установлен механизм MccF-зависимой устойчивости к МсС. MccF расщепляет C-N связь, расположенную между аминоацильной и нуклеотидной частями МсС и его процессированной формы. Кроме того, MccF расщепляет по той же связи некоторые aaSA, содержащие аминокислоты с полярными отрицательно заряженными боковыми цепями, но не расщепляет aaSA с гидрофобными аминокислотными радикалами (рис. 7).

С помощью описанных выше методов мы показали, что LdcA — ближайший гомолог MccF, закодированный в геноме Е. coli, не защищает клетку от МсС и aaSA и не гидролизует субстраты MccF in vitro (данные не представлены).

Рис. 7. Химические структуры МсС, рМсС, DSA. Стрелкой помечена амидная связь, гидролиз которой катализирует MccF.

Общая структура MccF. Структура MccF была определена с разрешением в 1,2 ангстрема методом одноволновой аномальной дисперсии с использованием кристаллов белка, меченного селеноцистеном. Было обнаружено, что MccF формирует гомодимеры. Мономер MccF состоит из двух доменов. N-концевой домен, состоящий из остатков Pro7-Thrl64, образован четырьмя парапельными бета-тяжами, которые окружены альфа-спиралями. С-концевой домен, который состоит из остатков Lys209-Ser341, представляет собой два бета-листа, к одному из которых примыкают три альфа-спирали. Домены соединены друг с другом длинной петлей, которая образована аминокислотными остатками Argl65-Gly208. Петля образует большое количество связей с доменами белка (рис. 8).

Общая структура MccF идентична опубликованной структуре LdcA из Pseudomonas aeruginosa6. Однако в структуре LdcA отсутствует петля, соединяющая N- и С-концевые домены. Таким образом, этот элемент структуры уникален для MccF. В дальнейшем мы будем называть петлю между двумя доменами каталитической петлей.

6 Korza, H.J. and M. Bochtler, Pseudomonas aeruginosa LD-Carboxypeptidase, a Serine Peptidase with a Ser-His-Glu Triad and a Nucleophilic Elbow. Journal of Biological Chemistry, 2005. 280(49): p. 40802-40812.

McC

pMcC

DSA

Аминокислотные остатки Serl 18, Glu243 и His311, которые составляют каталитическую триаду MccF, расположены в кармане между двуми доменами одного мономера. Один из карбоксилатных кислородов Glu243 образует водородную связь с N1 положением боковой цепи His311. Взаимное расположение аминокислотных остатков позволяет гидроксилу Serl 18 акцептировать протон радикала His311 с образованием алкоксидного аниона, который, в свою очередь, способен к нуклеофильной атаке пептидной связи. Таким образом, топология активного центра подтверждает наш вывод о том, что MccF является сериновой пегтгидазой.

Также была определена кристаллическая структура MccF с заменой каталитического серина на аланин. Структуры MccFSerll8"Ala и MccF дикого типа были почти идентичны друг другу. Следовательно, потеря активности Serll8-Ala мутанта в ходе in vitro и in vivo экспериментов, описанных выше, вызвана исчезновением необходимого для катализа нуклеофильного гидроксила, а не нарушением конформации фермента. Поэтому мы заключили, что кристаллы комплексов MccFSerll8"Ala мутанта с субстратами могут являться хорошей моделью для исследования субстратного связывания фермента дикого типа.

Структура MccF в комплексе с рМсС. Для изучения молекулярных механизмов узнавания субстрата была определена структура комплекса MccFScrl 18"А|а и рМсС. В полученной структуре электронная плотность, соответствующая процессированному микроцину, находится в районе активного центра. По номенклатуре Шектера и Бергера для сериновых пептидаз, мы определяем сайты связывания аденина и боковой цепи аспартила субстрата как, соответственно, Р1 и Р1' сайты MccF7. Узнавание нуклеотида в Р1 сайте фермента опосредовано стэкинг взаимодействиями с индольным кольцом остатка Тгр186, расположенного в каталитической петле. 2'- и 3'-гидроксилы рибозы субстрата связаны водородными взаимодействиями с карбоксильными кислородами Glu277. В дополнение к этому 2'-ОН группа образует пару водородных связей с боковой цепью остатка Arg246, который, в свою очередь, взаимодействует с остатком Serl83. В PI ' сайте MccF один го карбоксильных кислородов боковой цепи аспарагина связан с атомом азота боковой цепи остатка Lys247. Второй карбоксильный кислород взаимодействует с амидной группой радикала Asn220, атомом кислорода боковой цепи Thr221 и гуанидиновой группой остатка Arg254, который расположен в парном мономере MccF (рис. 8В). Фосфорамидатная группа взаимодействует с атомами

7 Schechter, I. and A. Berger, On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem Biophys Res Commun, 1967.27(2): p. 157-62.

пептидного остова фермента. Карбонильный кислород субстрата образует водородые связи с амидными группами остатков АэрПЭ и й1у92, соответсвенно, а один из кислородов фосфорамидной группы контактирует к альфа-амидным азотом Яу91. Эти взаимодействия позволяют стабилизировать оксианион промежуточного комплекса при гидролизе пептидной связи субстрата. Аминопропильная группа рМсС не образует контактов с МссР, поэтому мы предполагаем, что она не участвует а связывании с ферментом.

каталитическая петля

8. Кристаллическая структура МссР. (А) Мономер МссР, отмечены домены, каталитическая петля и аминокислотные остатки каталитической триады. (Б) Димер МссР. (В) Структура активного центра МссР5"'и8'А1а в комплексе с рМсС. Атомы углерода фермента показаны желтым, а атомы углерода в составе рМсС - зеленым.

Важность остатка Тгр186 для связывания субстрата в Р1 сайте МссР и остатков Азп220, Ьуэ247 для связывания субстрата в РГ сайте была подтверждена с помощью сайт-специфического мутагенеза с последующей проверкой ферментативной активности мутантных белков. Было показано, что замена Тгр186 на аланин приводит к полной потере ферментативной активности. Одиночные аланиновые мутанты МссБ по положениям 220 и 247

обладали пониженной каталитической эффективностью по сравнению с ферментом дикого типа, а двойная аланиновая мутация по этим положениям полностью инактивировала фермент. В кристаллических структурах мутантных белков топология активного центра остается неизменной. Поэтому изменение активности фермента связано с исчезновением необходимых для связывания субстрата боковых цепей аминокислот, а не общим нарушением структуры MccF.

Филогенетический анализ S66 семейства пептидаз. Гомологи S66 семейства сериновых пептидаз были найдены с помощью программы PSI-BLAST среди набора полных микробных геномов из базы данных Refseq. Было обнаружено 587 гомологичных последовательностей. Для уменьшения вырожденности выборки близкие последовательности кластеризовали и отобрали из каждой группы по одному гомологу. Затем было проведено множественное параллельное выравнивание отобранных последовательностей с помощью программы MUSCLE. На основании выравнивания было и построено филогенетическое дерево (рис. 9). Белки MccF и LdcA расположены на двух ветвях филогенетического дерева, разделенных множеством ветвей разного порядка. В дальнейшем мы будем называть ветвь, содержащую MccF из Е. coli, MccF-кладой. Представители этой клады содержат в своей последовательности участок, гомологичный каталитической петле MccF из Е. coli. На месте остатка Тгр186 в каталитической петле MccF из Е. coli все белки MccF-клады несут остаток ароматической аминокислоты. Представители двух соседних клад — YocD и ВА_3275 — также содержат длинную междоменную петлю с консервативным ароматическим остатком на месте Trpl86 Е. coli MccF. Согласно выравниванию, другие представители семейства S66 сериновых пептидаз содержат на месте каталитической петли MccF более короткую последовательность, в которой нет консервативных остатков ароматических аминокислот. Так как Тгр186 в MccF из Е. coli взаимодействует с пуриновым кольцом субстрата и, таким образом, определяет специфичность MccF к аденилированным соединениям, мы предположили, что белки, составляющие YocD, ВА 3275 и MccF-клады S66 пептидаз способны связывать и гидролизовать аденилированные субстраты. Следует отметить, что подавляющее большинство геномов, в которых закодированы эти белки, не содержат кластеров гомологов генов синтеза микроцина С. Таким образом, физиологическая функция белков MccF, YocD и ВА 3275 клад не связана с защитой клеток, синтезирующих аналоги МсС, от производимых ими антибиотиков. Три перечисленные клады формируют группу большего порядка на филогенегетическом дереве. Интересно, что в

одном бактериальном геноме могут быть закодированы несколько гомологов MccF из разных клад. К таким бактериям относится группа видов В. cereus. В нее входах В. cereus, В. anthracis, В. thuringiensis, В. mycoides, В. pseudomycoides и В. weihenstephanensis. Большинство отсеквенированных геномов этих видов бактерий кодируют белки из MccF, YocD и BAJ5275-клад, а также близкого гомолога LdcA Е. coli.

Рис. 9. Фрагмент филогенетического дерева S66 семейства сериновых пептидаз. Клады MccF, YocD и Ва_3275 отмечены фоновым цветом. Ветвь гомологов MccF, содержащая клады MccF, YocD и Ва_3275, выделена пунктирной линией. Фиолетовым отмечены MccF из Е. coli и В. anthracis, оранжевым — остальные белки, субстратную специфичность которых определяли in vivo.

Функциональный анализ гомологов MccF. Чтобы проверить белки из YocD, ВА 3275 и MccF-клад на MccF-подобную активность, мы провели следующий эксперимент. Гены, кодирующие представителей каждой клады, заклонировали в экспрессионный вектор pMSCG7.

Среди белков входящих в MccF-кладу мы выбрали белки из В. anthracis и Vibrio cholerae. Из YocD-клады были выбраны белки, закодированные в геномах В. antracis и Listeria monocytogenes. Из представителей клады ВА_3275 мы выбрали белки из В. anthracis, А. radiobacter и S. pneumoniae (рис. 9). Полученными плазмидами трансформировали клетки Е. coli BL21(DE3) и определяли чувствительность клеток с плазмидами к МсС и нескольким aaSA (DSA, ASA, GSA, FSA и PSA) по методу, описанному в части «Продукция MccF обеспечивает устойчивость клеток к МсС». Для более точного измерения каждый антибиотик наносили на газон клеток в нескольких концентрациях. В качестве контроля мы использовали клетки, которые производят MccF из Е. coli, а также клетки, несущие экспрессионный вектор без вставки. В соответствии с раннее полученными данными продукция MccF из Е. coli обеспечивает устойчивость клеток ко всем использованным концентрациям МсС и DSA, но не к ASA, GSA, FSA и PSA. Сходными оказались спектры чувствительности клеток, которые производят белки MccF-клады из В. anthracis и V. cholerae, хотя рост культуры V. cholerae подавлялся самой высокой из использованных концентрацией МсС (1 мМ).

Продукция YocD из В. anthracis и L. monocytogenes не влияет на чувствительность клеток Е. coli к МсС и DSA, но делает клетки полностью или частично устойчивыми к ASA, GSA, FSA и PSA. Клетки Е. coli, производящие ВА 3275 из S. pneumoniae, частично устойчивы к МсС, DSA, FSA, GSA и ASA, но чувствительны к PSA. Сходным спектром чувствительности обладают клетки, которые производят ВА_3275 из В. anthracis. По сравнению с клетками, которые производят ВА_3275 из S. pneumoniae, эти клетки более устойчивы к PSA и менее устойчивы к ASA. Гомолог MccF из ВА_3275-клады, закодированный к геноме A. radiobacter, не влияет на чувствительность клеток к использованным антибиотикам. Результаты этого эксперимента сведены в таблице 1. Таким образом, за исключением гомолога MccF из А. radiobacter, все проверенные белки способны детоксифицировать негидролизуемые аналоги аминоацил-АМФ in vivo в клетках Е. coli. Хотя механизм действия исследуемых ферментов не установлен, гомология с MccF из Е. coli, и способность к детоксификации aaSA in vivo позволяют предположить, что эти белки являются сериновыми пептидазами, которые гидролизуют амидную связь между аминоацильной и нуклеотидной частями МсС и сходных соединений. Следует отметить, что внутри каждой клады проверенные белки имеют сходную специфичность к используемым субстратам. Так, представители MccF-клады гидролизуют aaSA с полярными отрицательно-заряженными радикалами, гомологи YocD гидролизуют aaSA с гидрофобными боковыми цепями, а белки, входящие в ВА_3275-кладу, неспецифичны

и с низкой эффективностью гидролизуют все используемые соединения. Для более подробного изучения мы выбрали гомолог МссР из В. апЛгааз, который принадлежит к МссИ-кладе (рис.

9).

Клада Организм McC DSA GSA ASA FSA PSA

MccF Escherichia coli R R S S S S

Bacillus anlhracis R R S S S S

Vibrio cholerae PR R S S S S

YocD Bacillus anthracis S S PR R R R

Listeria monocytogenes s PR R R R R

ВА_3275 Streptococcus pneumonae PR PR PR PR PR S

Bacillus cereus PR PR PR R PR PR

Agrobacterium radiobacter S S S S S S

Таблица 1. Устойчивость клеток, производящих указанные гомологи MccF, к McC, DSA, GSA, ASA, FSA и PSA. R — клетки полностью устойчивы к антибиотику (зона ингибирования роста отсутствует). PR — клетки частично устойчивы к антибиотику (зона ингибирования роста меньше, чем в случае контрольных клеток, несущих экспрессионный вектор без вставки). S —клетки чувствительны к антибиотику так же, как и контрольные клетки.

Исследование гомолога MccF из В. cereus. Чтобы проверить, способен ли BaMccF гидролизовать aaSA в системе in vitro, мы инкубировали очищенный рекомбинантный фермент с McC, DSA и ESA. Реакционную смесь концентрировали и наносили на газон чувствительных к МсС клеток Е. coli. В качестве контролей мы использовали реакцию с MccF из Е. coli (£cMccF) (положительный контроль), а также инкубировали антибиотики в буфере без добавления ферментов (отрицательный контроль). Как и ожидалось, после инкубации в буфере МсС и DSA подавляли рост клеток, тогда как ESA на клетки не действовал. Инкубация МсС как с £cMccF, так и с äjMccF приводила к исчезновению антибактериальной активности соединения. При нанесении на газон DSA, обработанного £cMccF или ßaMccF образовывалась зона ингибирования роста, значительно превышающая по размеру зону ингибирования роста, которая образуется под действием DSA, инкубированного в буфере без ферментов. Ту же картину мы наблюдали в реакциях, содержащих ESA (рис. 10Б). Нам известно, что исчезновение антибактериальной активности МсС под действием £cMccF обусловлено гидролизом данного соединения по C-N связи между аминоацильной группой и

модифицированным остатком АМФ. írMccF-зависимый гидролиз ESA и DSA идет по той же связи, однако в этом случае одним из продуктов реакции является высокотоксичный сульфамоил-аденозин, который вызывает появление крупных зон ингибирования роста на газоне клеток Е. coli. Так как действие ßaMccF на МсС, DSA и ESA не отличается от действия £cMccF в проведенных экспериментах, мы предполагаем, что MccF из В. anthracis и Е. coli гидролизуют МсС и родственные соединения по одному механизму.

С помощью выравнивания представителей S66 семейства пептидаз были найдены аминокислотные остатки, составляющие каталитическую триаду ßaMccF — Serl 12, Glu235, His303. Мы заменили остатки Serl 12 и His303 из предсказанной каталитической триады ßaMccF на аланины и показали, что клетки, продуцирующие белок с заменами, чувствительны к DSA и МсС так же, как и контрольные клетки, несущие экспрессионный вектор без вставки (рис. 10А). В соответствии с этим, инкубация очищенного рекомбинантного ßaMccFScr"2' Ab. His3t)3-A[a Hg влияла на антибактериальные свойства МсС, DSA и ESA (рис. 10Б). Эти результаты подтверждают наше предположение о том, что ZtoMccF является аналогичной £cMccF сериновой пептидазой.

Чтобы выяснить, инакгивирует ли ВаМссГ субстраты £cMccF в физиологических условиях, мы удалили ген, кодирующий гомолог ZtaMccF, из штамма В. cereus АТСС4342. Этот штамм является близким родственником штамма В. anthracis str. Ames, в геноме которого закодирован SaMccF. Гены rnccF двух штаммов расположены в сходном геномном окружении, а последовательности BaMccF из этих организмов совпадают на 95%. Ночные культуры В. cereus АТСС4342 ДmccF и В. cereus АТСС4342 дикого типа развели в 100 раз средой LB и провели измерение скорости роста культур как в присутствии 0,5 мМ DSA, так и без добавления антибиотика. Как видно на рис. 10В при выращивании в богатой среде В. cereus AmccF растет также быстро как и клетки дикого типа. Добавление DSA приводит к замедлению роста обеих культур, однако клетки дикого типа растут значительно быстрее клеток AmccF. Отсюда мы заключаем, что ген mccF экспрессируется в В. cereus и понижает чувствительность клетки к DSA. Таким образом, ßoMccF способен инактивировать субстраты EcMccF в физиологических условиях. Следует отметить, что рост клеток с удаленным mccF не полностью подавляется добавлением DSA. Так как гомологи MccF из клады ВА_3275 инактивируют DSA in vivo в клетках Е. coli, мы предполагаем, что за наблюдаемый уровень устойчивости клеток В. cereus АТСС4342 AmccF к DSA отвечает белок из клады ВА_3275, закодированный в геноме этого штамма.

ndl

Ш

I

□ DSA, ЮтМ

□ МсС, ЮрМ

□ МсС, 50цМ В МсС, 100цМ В МсС, ImM

рЕТ19

I. anthracis В. anthracis mccF mccF Serll8-Ala/

His303-Ala

1

Iii

без добавления белка

El

□ МсС

□ DSA El ESA

SoMccF Serll8-Ala/ His303-Ala

Рис. 10. (А) BaMccF обеспечивает устойчивость клеток к МсС и DSA за счет пептидазной активности. Площадь зон ингибирования роста вокруг 2 мкл 10, 50, 100 и 1000 мкМ растворов МсС или 10 мМ раствора DSA, нанесенных на газон клеток К coli BL21(DE3), несущих указанные плазмиды, (Б) /iaMccF гидролизует МсС, DSA и ESA in vitro. Площадь зон ингибирования роста вокруг точек нанесения продуктов реакций МсС, DSA и ESA с очищенными рекомбинантными £cMccF, üaMccF, и BaMccFtall2-AWHis5l"-Ah на газон клеток Е. coli BL21(DE3). (В) ÄaMccF способен инактивировать DSA в физиологических условиях. Кривые роста клеток В. сегеих АТСС4342 kmccF и клеток дикого типа в богатой среде с добавлением или без добавления 500 мкМ DSA.

Выводы

1) MccF является сериновой пептидазой, которая обеспечивает устойчивость клеток Е. coli к МсС за счет гидролиза амидной связи между пептидной и нуклеотидной частями антибиотика. Кроме МсС, MccF гидролизует aaSA с полярными отрицательно заряженными аминоацильными группами.

2) Определена структура MccF и выяснена молекулярная природа узнавания субстрата. Специфичность MccF к аденилированным субстратам опосредована остатком ароматической аминокислоты, расположенном в петле между двумя доменами белка.

3) В S66 семействе пептидаз найдена группа гомологов MccF, которые содержат междоменную петлю с консервативным ароматическим остатком. Показано, что некоторые представители этой группы гидролизуют МсС и aaSA. Гомолог MccF из В. anthracis обладает сходным с MccF из Е. coli механизмом действия и в физиологических условиях защищает клетки от химического аналога МсС.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в научных журналах:

1) Tikhonov A, Kazakov Т, Semenova Е, Serebryakova М, Vondenhoff G, Van Aerschot A, Reader JS, Govorun VM, Severinov K. The mechanism of Microcin С resistance provided by the MccF peptidase. Journal of Biological Chemistry. 2010 Dec 3; 285(49): 37944-52.

2) Agarwal V, Tikhonov A, Metlytskaya A, Severinov K, and Nair S. Structure and function of a serine carboxypeptidase adapted for degradation of the protein synthesis antibiotic microcin C7. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2012 Mar 20; 109(12): 4425-30.

3) Nocek B; Tikhonov A; Babnigg G; Minyi Gu; Zhou M; Makarova KS; Vondenhoff G; Aerschot AV; Kwon K; Anderson WF; Severinov K; Joachimiak A. Structural and functional characterization of microcin С resistance peptidase MccF from Bacillus anthracis. Journal of Molecular Biology. 2012 Jul 20; 420(4-5): 366-83.

Тезисы международных конференций:

1) ASBMB Annual Meeting 2010. Self immunity and resistance mechanisms against trojan horse antibiotic - Microcin CI. Vinayak Agarwal, Anton Tikhonov, Maria Novikova, Konstantin Severinov and Satish Nair. April 2010

Подписано в печать:

24.09.2012

Заказ Лг° 7629 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тихонов, Антон Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ;

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Цели и задачи новизна и научная значимость работы

Публикации и апробация работы

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тихонов, Антон Алексеевич

Выводы

1) MccF является сериновой пептидазой, которая обеспечивает устойчивость клетки к МсС за счет гидролиза амидной связи между пептидной и нуклеотидной частями антибиотика. Кроме МсС MccF гидролизует aaSA с полярными отрицательно заряженными аминоацильными группами.

2) Определена структура MccF и выяснена молекулярная природа узнавания субстрата. Специфичность MccF к аденилированным субстратам опосредована остатком ароматической аминокислоты, расположенном в петле между двумя доменами белка.

3) В S66 семействе пептидаз найдена группа гомологов MccF, которые содержат междоменную петлю с консервативным ароматическим остатком. Показано, что некоторые представители этой группы гидролизуют МсС и aaSA. Гомолог MccF из В. anthracis обладает сходной с MccF из Е. coli структурой и механизмом действия и в физиологических условиях защищает клетки от химического аналога МсС.

Публикации в журналах:

Tikhonov A, Kazakov Т, Semenova Е, Serebryakova М, Vondenhoff G, Van Aerschot A, Reader JS, Govorun VM, Severinov K. The mechanism of Microcin С resistance provided by the MccF peptidase. Journal of Biological Chemistry. 2010 Dec 3; 285(49): 37944-52.

Agarwal V, Tikhonov A, Metlytskaya A, Severinov K, and Nair S. Structure and function of a serine carboxypeptidase adapted for degradation of the protein synthesis antibiotic microcin CI. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2012 Mar 20; 109(12): 4425-30.

Nocek B; Tikhonov A; Babnigg G; Minyi Gu; Zhou M; Makarova KS; Vondenhoff G; Aerschot AV; Kwon K; Anderson WF; Severinov K; Joachimiak A. Structural and functional characterization of microcin С resistance peptidase MccF from Bacillus anthracis. Journal of Molecular Biology. 2012 Jul 20; 420(4-5): 366-83.

Заключение

В данной работе с помощью разнообразных методов был подробно изучен механизм действия МссР, за счет которого клетки приобретают устойчивость к МсС. Полученные нами результаты расширяют представления о спектре субстратной специфичности и биохимии сериновых пептидаз. Кроме того, мы обнаружили большое количество гомологов МссР среди бактерий, и показали, что некоторые из найденных гомологов способны гидролизовать субстраты МссР. Эти результаты косвенно указывают на значительное распространение токсичных негидролизуемых аминоацил-аденилатов в бактериальных сообществах. Изучение физиологических функций найденных белков представляется интересной научной задачей. !!" "!!"

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тихонов, Антон Алексеевич, Москва

1. Klevens, R.M., et al., Estimating health care-associated infections and deaths in U.S. hospitals, 2002. Public Health Rep, 2007.122(2): p. 160-6.

2. Kong, K.F., L. Schneper, and K. Mathee, Beta-lactam antibiotics: from antibiosis to resistance and bacteriology. APMIS, 2010. 118(1): p. 1-36.

3. Nikaido, H., Multidrug resistance in bacteria. Annu Rev Biochem, 2009. 78: p. 119-46.

4. Auerbach, T., A. Bashan, and A. Yonath, Ribosomal antibiotics: structural basis for resistance, synergism and selectivity. Trends Biotechnol, 2004. 22(11): p. 570-6.

5. Drlica, K., et al., Quinolone-mediated bacterial death. Antimicrob Agents Chemother, 2008. 52(2): p. 385-92.

6. Poehlsgaard, J. and S. Douthwaite, The bacterial ribosome as a target for antibiotics. Nat Rev Microbiol, 2005. 3(11): p. 870-81.

7. Hurdle, J.G., A.J. O'Neill, and I. Chopra, Prospects for Aminoacyl-tRNA Synthetase Inhibitors as New Antimicrobial Agents. Antimicrob Agents Chemother, 2005. 49(12): p. 4821-4833.

8. Ibba, M. and D. Soil, Aminoacyl-tRNA synthesis. Annu Rev Biochem, 2000. 69: p. 617-50.

9. Hong, K.W., et al., Transfer RNA-dependent cognate amino acid recognition by an aminoacyl-tRNA synthetase. EMBO J, 1996. 15(8): p. 1983-91.

10. Ruff, M., et al., Class II aminoacyl transfer RNA synthetases: crystal structure of yeast aspartyl-tRNA synthetase complexed with tRNA(Asp). Science, 1991. 252(5013): p. 1682-9.

11. Cusack, S., et al., A second class of synthetase structure revealed by X-ray analysis of Escherichia coli seryl-tRNA synthetase at 2.5 A. Nature, 1990. 347(6290): p. 249-55.

12. Eriani, G., et al., Partition of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motifs. Nature, 1990. 347(6289): p. 203-6.

13. Burbaum, J.J. and P. Schimmel, Structural relationships and the classification of aminoacyl-tRNA synthetases. J Biol Chem, 1991. 266(26): p. 16965-8.

14. Arnez, J.G. and D. Moras, Structural and functional considerations of the aminoacylation reaction. Trends Biochem Sci, 1997. 22(6): p. 211-6.

15. Beuning, P.J., et al., Specific atomic groups and RNA helix geometry in acceptor stem recognition by a tRNA synthetase. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(19): p. 10150-4.

16. Ochsner, U.A., et al., Aminoacyl-tRNA synthetases: essential and still promising targets for new anti-infective agents. Expert Opin Investig Drugs, 2007. 16(5): p. 573-93.

17. Giege, R., M. Sissler, and C. Florentz, Universal rules and idiosyncratic features in tRNA identity. Nucleic Acids Res, 1998. 26(22): p. 5017-35.

18. Giege, R., J.D. Puglisi, and C. Florentz, tRNA structure and aminoacylation efficiency. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1993. 45: p. 129-206.

19. Ling, J., N. Reynolds, and M. Ibba, Aminoacyl-tRNA synthesis and translational quality control. Annu Rev Microbiol, 2009. 63: p. 61-78.

20. Nicholas, H.B., Jr. and W.H. McClain, Searching tRNA sequences for relatedness to aminoacyl-tRNA synthetase families. J Mol Evol, 1995. 40(5): p. 482-6.

21. Ibba, M., et al., Transfer RNA identity contributes to transition state stabilization during aminoacyl-tRNA synthesis. Nucleic Acids Res, 1999. 27(18): p. 3631-7.

22. Fersht, A.R. and C. Dingwall, Cysteinyl-tRNA synthetase from Escherichia coli does not need an editing mechanism to reject serine and alanine. High binding energy of small groups in specific molecular interactions. Biochemistry, 1979.18(7): p. 1245-9.

23. Schmidt, E. and P. Schimmel, Mutational isolation of a sieve for editing in a transfer RNA synthetase. Science, 1994. 264(5156): p. 265-7.

24. Ibba, M. and D. Soil, Quality control mechanisms during translation. Science, 1999. 286(5446): p. 1893-7.

25. Farrow, M.A., B.E. Nordin, and P. Schimmel, Nucleotide determinants for tRNA-dependent amino acid discrimination by a class I tRNA synthetase. Biochemistry, 1999. 38(51): p. 16898-903.

26. Eldred, E.W. and P.R. Schimmel, Rapid deacylation by isoleucyl transfer ribonucleic acid synthetase of isoleucine-specific transfer ribonucleic acid aminoacylated with valine. J Biol Chem, 1972. 247(9): p. 2961-4.

27. Jakubowski, H. and E. Goldman, Editing of errors in selection of amino acids for protein synthesis. Microbiol Rev, 1992. 56(3): p. 412-29.

28. Jakubowski, H., Aminoacyl thioester chemistry of class II aminoacyl-tRNA synthetases. Biochemistry, 1997. 36(37): p. 11077-85.

29. Calendar, R. and P. Berg, D-Tyrosyl RNA: formation, hydrolysis and utilization for protein synthesis. J Mol Biol, 1967. 26(1): p. 39-54.

30. Ferri-Fioni, M.L., et al., Identification in archaea of a novel D-Tyr-tRNATyr deacylase. J Biol Chem, 2006. 281(37): p. 27575-85.

31. Wydau, S., et al., GEK1, a gene product of Arabidopsis thaliana involved in ethanol tolerance, is a D-aminoacyl-tRNA deacylase. Nucleic Acids Res, 2007. 35(3): p. 930-8.

32. An, S. and K. Musier-Forsyth, Trans-editing of Cys-tRNAPro by Haemophilus influenzae YbaK protein. J Biol Chem, 2004. 279(41): p. 42359-62.

33. Ahel, I., et al., Trans-editing of mischarged tRNAs. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(26): p. 15422-7.

34. Korencic, D., et al., A freestanding proofreading domain is required for protein synthesis quality control in Archaea. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(28): p. 10260-5.

35. Wilcox, M., Gamma-glutamyl phosphate attached to glutamine-specific tRNA. A precursor of glutaminyl-tRNA in Bacillus subtilis. Eur J Biochem, 1969. 11(3): p. 405-12.

36. Schon, A., H. Hottinger, and D. Soil, Misaminoacylation and trans amidation are required for protein biosynthesis in Lactobacillus bulgaricus. Biochimie, 1988. 70(3): p. 391-4.

37. Schon, A., et al., Protein biosynthesis in organelles requires misaminoacylation of tRNA. Nature, 1988. 331(6152): p. 187-90.

38. Stanzel, M., A. Schon, and M. Sprinzl, Discrimination against misacylated tRNA by chloroplast elongation factor Tu. Eur J Biochem, 1994. 219(1-2): p. 435-9.

39. Curnow, A.W., M. Ibba, and D. Soli, tRNA-dependent asparagine formation. Nature, 1996. 382(6592): p. 589-90.

40. Schulze, J.O., et al., Crystal structure of a non-discriminating glutamyl-tRNA synthetase. J Mol Biol, 2006. 361(5): p. 888-97.

41. Withey, J.H. and D.I. Friedman, A salvage pathway for protein structures: tmRNA and transtranslation. Annu Rev Microbiol, 2003. 57: p. 101-23.

42. Meinnel, T., Y. Mechulam, and S. Blanquet, Methionine as translation start signal: a review of the enzymes of the pathway in Escherichia coli. Biochimie, 1993. 75(12): p. 1061-75.

43. Amberg, R., et al., Selenocysteine synthesis in mammalia: an identity switch from tRNA(Ser) to tRNA(Sec). J Mol Biol, 1996. 263(1): p. 8-19.

44. Putzer, H., et al., Aminoacyl-tRNA synthetase gene regulation in Bacillus subtilis: induction, repression and growth-rate regulation. Mol Microbiol, 1995.16(4): p. 709-18.

45. Sankaranarayanan, R., et al., The structure of threonyl-tRNA synthetase-tRNA(Thr) complex enlightens its repressor activity and reveals an essential zinc ion in the active site. Cell, 1999. 97(3): p. 371-81.

46. Rho, S.B., T.L. Lincecum, Jr., and S.A. Martinis, An inserted region of leucyl-tRNA synthetase plays a critical role in group I intron splicing. EMBO J, 2002. 21(24): p. 6874-81.

47. Wakasugi, K. and P. Schimmel, Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA synthetase. Science, 1999. 284(5411): p. 147-51.

48. Chain, E.B. and G. Mellows, Pseudomonic acid. Part 1. The structure of pseudomonic acid A, a novel antibiotic produced by Pseudomonas fluorescens. J Chem Soc Perkin 1, 1977(3): p. 294-309.

49. Hughes, J. and G. Mellows, Inhibition of isoleucyl-transfer ribonucleic acid synthetase in Escherichia coli by pseudomonic acid. Biochem J, 1978. 176(1): p. 305-18.

50. Kim, S., et al., Aminoacyl-tRNA synthetases and their inhibitors as a novel family of antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol, 2003. 61(4): p. 278-288.

51. Hurdle, J.G., et al., Analysis of mupirocin resistance and fitness in Staphylococcus aureus by molecular genetic and structural modeling techniques. Antimicrob Agents Chemother, 2004. 48(11): p. 4366-76.

52. Sutherland, R., et al., Antibacterial activity of mupirocin (pseudomonic acid), a new antibiotic for topical use. Antimicrob Agents Chemother, 1985. 27(4): p. 495-498.

53. Cookson, B.D., The emergence of mupirocin resistance: a challenge to infection control and antibiotic prescribing practice. J Antimicrob Chemother, 1998. 41(1): p. 11-8.

54. Davey, P., Eradication of nasal carriage of Staphylococcus aureus~is it cost-effective? J Hosp Infect, 1998. 40 Suppl B: p. S31-7.

55. Fujimura, S. and A. Watanabe, Survey of high- and low-level mupirocin-resistant strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in 15 Japanese hospitals. Chemotherapy, 2003. 49(1-2): p. 36-8.

56. Gilbart, J., C.R. Perry, and B. Slocombe, High-level mupirocin resistance in Staphylococcus aureus: evidence for two distinct isoleucyl-tRNA synthetases. Antimicrob Agents Chemother, 1993. 37(1): p. 32-8.

57. Brown, J.R., et al., Horizontal transfer of drug-resistant aminoacyl-transfer-RNA synthetases of anthrax and Gram-positive pathogens. EMBO Rep, 2003. 4(7): p. 692-8.

58. Beaulieu, D. and K.A. Ohemeng, Patents on bacterial tRNA synthetase inhibitors: January 1996 to March 1999. Expert Opinion on Therapeutic Patents, 1999. 9(8): p. 1021-1028.

59. Kanamaru, T., et al., In vitro and in vivo antibacterial activities of TAK-083, an agent for treatment of Helicobacter pylori infection. Antimicrob Agents Chemother, 2001. 45(9): p. 2455-9.

60. Werner, R.G., Uptake of indolmycin in gram-positive bacteria. Antimicrob Agents Chemother, 1980.18(6): p. 858-62.

61. Werner, R.G. and W. Reuter, Interaction of indolmycin in the metabolism of tryptophan in rat liver. Arzneimittelforschung, 1979. 29(1): p. 59-63.

62. Hurdle, J.G., A.J. O'Neill, and I. Chopra, Anti-staphylococcal activity of indolmycin, a potential topical agent for control of staphylococcal infections. J Antimicrob Chemother, 2004. 54(2): p. 549-52.

63. Brown, M.J., et al., The antimicrobial natural product chuangxinmycin and some synthetic analogues are potent and selective inhibitors of bacterial tryptophanyl tRNA synthetase. Bioorg Med Chem Lett, 2002.12(21): p. 3171-4.

64. Hutter, R., et al., Metabolic products of microorganisms. 51. On the mechanism of action of borrelidin-inhibition of the threonine incorporation in sRNAJ. Biochem Z, 1966. 344(2): p. 190-6.

65. Otoguro, K., et al., In vitro and in vivo antimalarial activities of a non-glycosidic 18-membered macrolide antibiotic, borrelidin, against drug-resistant strains of Plasmodia. J Antibiot (Tokyo), 2003. 56(8): p. 727-9.

66. Habibi, D., et al., Borrelidin, a small molecule nitrile-containing macrolide inhibitor of threonyl-tRNA synthetase, is a potent inducer of apoptosis in acute lymphoblastic leukemia. Invest New Drugs, 2011.

67. Ruan, B., et al., A unique hydrophobic cluster near the active site contributes to differences in borrelidin inhibition among threonyl-tRNA synthetases. J Biol Chem, 2005. 280(1): p. 571-7.

68. Paetz, W. and G. Nass, Biochemical and immunological characterization of threonyl-tRNA synthetase of two borrelidin-resistant mutants of Escherichia coli K12. Eur J Biochem, 1973. 35(2): p. 331-7.

69. Oki, T., et al., Cispentacin, a new antifungal antibiotic. II. In vitro and in vivo antifungal activities. J Antibiot (Tokyo), 1989. 42(12): p. 1756-62.

70. Konishi, M., et al., Cispentacin, a new antifungal antibiotic. I. Production, isolation, physico-chemical properties and structure. J Antibiot (Tokyo), 1989. 42(12): p. 1749-55.

71. Snipes, C.E., C.-J. Chang, and H.G. Floss, Biosynthesis of the antibiotic granaticin. J Am Chem Soc, 1979.101(3): p. 701-706.

72. Chang, C.J., et al., Identity of the antitumor antibiotic litmomycin with granaticin A. J Antibiot (Tokyo), 1975. 28(2): p. 156.

73. Katagiri, K., et al., A new antibiotic. Furanomycin, an isoleucine antagonist. J Med Chem, 1967. 10(6): p. 1149-54.

74. Kohno, T., et al., Nonprotein amino acid furanomycin, unlike isoleucine in chemical structure, is charged to isoleucine tRNA by isoleucyl-tRNA synthetase and incorporated into protein. Journal of Biological Chemistry, 1990. 265(12): p. 6931-5.

75. Larsen, T.O., A. Svendsen, and J. Smedsgaard, Biochemical characterization of ochratoxin A-producing strains of the genus Penicillium. Appl Environ Microbiol, 2001. 67(8): p. 3630-5.

76. Moss, M.O., Mycotoxin review 1. Aspergillus and Penicillium. Mycologist, 2002. 16(03): p. 116-119.

77. Dirhaimer, G., Creppy, E.E., Mechanism of action ochratoxin A. IARC Sci Publ, 1991. 115: p. 171-86.

78. Bennett, I., et al., Synthesis and antibacterial properties of beta-diketone acrylate bioisosteres ofpseudomonic acid A. Bioorg Med Chem Lett, 1999. 9(13): p. 1847-52.

79. Broom, N.J.P., et al., The Chemistry of Pseudomonic Acid. 17. Dual-Action C-l Oxazole Derivatives of Pseudomonic Acid Having an Extended Spectrum of Antibacterial Activityf. J Med Chem, 1996. 39(18): p. 3596-3600.

80. Barker, J.J., Antibacterial drug discovery and structure-based design. Drug Discov Today, 2006.11(9-10): p. 391-404.

81. Ziegelbauer, K., P. Babczinski, and W. Schonfeld, Molecular mode of action of the antifungal beta-amino acid BAY 10-8888. Antimicrob Agents Chemother, 1998. 42(9): p. 2197-205.

82. Rock, F.L., et al., An Antifungal Agent Inhibits an Aminoacyl-tRNA Synthetase by Trapping tRNA in the Editing Site. Science, 2007. 316(5832): p. 1759-1761.

83. Nare, B., et al., Discovery of Novel Orally Bioavailable Oxaborole 6-Carboxamides That Demonstrate Cure in a Murine Model of Late-Stage Central Nervous System African Trypanosomiasis. Antimicrob Agents Chemother, 2010. 54(10): p. 4379-4388.

84. Jarvest, R.L., et al., Nanomolar Inhibitors of Staphylococcus aureus Methionyl tRNA Synthetase with Potent Antibacterial Activity against Gram-Positive Pathogens. J Med Chem, 2002. 45(10): p. 1959-1962.

85. Critchley, I.A., et al., Antibacterial Activity of REP8839, a New Antibiotic for Topical Use. Antimicrob Agents Chemother, 2005. 49(10): p. 4247-4252.

86. Kim, S.Y. and J. Lee, 3-D-QSAR study and molecular docking of methionyl-tRNA synthetase inhibitors. Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry, 2003.11(24): p. 5325-5331.

87. Gentry, D.R., et al., Variable Sensitivity to Bacterial Methionyl-tRNA Synthetase Inhibitors Reveals Subpopulations of Streptococcus pneumoniae with Two Distinct Methionyl-tRNA Synthetase Genes. Antimicrob Agents Chemother, 2003. 47(6): p. 1784-1789.

88. Beyer, D., et al., New Class of Bacterial Phenylalanyl-tRNA Synthetase Inhibitors with High Potency and Broad-Spectrum Activity. Antimicrob Agents Chemother, 2004. 48(2): p. 525-532.

89. Isono, K., et al., Ascamycin and dealanylascamycin, nucleoside antibiotics from Streptomyces sp. J Antibiot (Tokyo), 1984. 37(6): p. 670-2.

90. Osada, H. and K. Isono, Mechanism of action and selective toxicity of ascamycin, a nucleoside antibiotic. Antimicrob Agents Chemother, 1985. 27(2): p. 230-3.

91. Osada, H. and K. Isono, Purification and characterization of ascamycin-hydrolysing aminopeptidase from Xanthomonas citri. Biochem J, 1986. 233(2): p. 459-63.

92. Uramoto, M., et al., Isolation and characterization of phosmidosine. A new antifungal nucleotide antibiotic. J Antibiot (Tokyo), 1991. 44(4): p. 375-81.

93. Phillips, D.R., et al., Structure of the antifungal nucleotide antibiotic phosmidosine. The Journal of Organic Chemistry, 1993. 58(4): p. 854-859.

94. Sekine, M., et al., Synthesis of Chemically Stabilized Phosmidosine Analogues and the Structure-Activity Relationship of Phosmidosine. The Journal of Organic Chemistry, 2003. 69(2): p. 314-326.

95. Gause, G.F., Recent studies on albomycin, a new antibiotic. Br Med J, 1955. 2(4949): p. 11779.

96. Benz, G., et al., Constitution of the Deferriform of the Albomycins SI, 62 and e. Angewandte Chemie International Edition in English, 1982. 21(7): p. 527-528.

97. Pramanik, A., et al., Albomycin is an effective antibiotic, as exemplified with Yersinia enterocolitica and Streptococcus pneumoniae. International Journal of Medical Microbiology, 2007. 297(6): p. 459-469.

98. Braun, V., et al., Sideromycins: tools and antibiotics. Biometals, 2009. 22(1): p. 3-13.

99. Braun, V., et al., Intracellular activation of albomycin in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J Bacterid, 1983. 156(1): p. 308-315.

100. Stefanska, A.L., et al., A potent seryl tRNA synthetase inhibitor SB-217452 isolated from a Streptomyces species. J Antibiot (Tokyo), 2000. 53(12): p. 1346-53.

101. Tate, M.E., et al., Adenine N6-substituent of agrocin 84 determines its bacteriocin-like specificity. Nature, 1979. 280(5724): p. 697-9.

102. Gelvin, S.B., AGROBACTERIUM AND PLANT GENES INVOLVED IN T-DNA TRANSFER AND INTEGRATION. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 2000. 51(1): p. 223-256.

103. Kim, H. and S.K. Farrand, Characterization of the acc operon from the nopaline-type Ti plasmidpTiC58, which encodes utilization of agrocinopines A and B and susceptibility to agrocin 84. J Bacterid, 1997. 179(23): p. 7559-72.

104. Ellis, J.G. and P.J. Murphy, Four new opines from crown gall tumours —Their detection and properties. Molecular and General Genetics MGG, 1981.181(1): p. 36-43.

105. MURPHY, P.J. and W.P. ROBERTS, A Basis for Agrocin 84 Sensitivity in Agrobacterium radiobacter. Journal of General Microbiology, 1979.114(1): p. 207-213.

106. Reader, J.S., et al., Major Biocontrol of Plant Tumors Targets tRNA Synthetase. Science, 2005. 309(5740): p. 1533.

107. Penyalver, R., B. Vicedo, and M.M. López, Use of the Genetically Engineered Agrobacterium Strain K1026 for Biological Control of Crown Gall. European Journal of Plant Pathology, 2000. 106(9): p. 801-810.

108. Garcia-Bustos, J.F., N. Pezzi, and E. Mendez, Structure and mode of action of microcin 7, an antibacterial peptide produced by Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother, 1985. 27(5): p. 791-797.

109. Cursino, L., et al., Exoproducts of the Escherichia coli strain H22 inhibiting some enteric pathogens both in vitro and in vivo. Journal of Applied Microbiology, 2006.100(4): p. 821-829.

110. Kurepina, N.E., et al., Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin C51 production and immunity. Molecular and General Genetics MGG, 1993. 241(5): p. 700-706.

111. Guijarro, J.I., et al., Chemical Structure and Translation Inhibition Studies of the Antibiotic Microcin C7. Journal of Biological Chemistry, 1995. 270(40): p. 23520-23532.

112. González-Pastor, J.E., et al., Structure and organization of plasmid genes required to produce the translation inhibitor microcin C7. J Bacteriol, 1995. 177(24): p. 7131-40.

113. Smajs, D., et al., Complete sequence of low-copy-number plasmid MccC7-H22 of probiotic Escherichia coli H22 and the prevalence of mcc genes among human E. coli. Plasmid, 2008. 59(1): p. 1-10.

114. Fomenko, D.E., et al., Microcin C51 plasmid genes: possible source of horizontal gene transfer. Antimicrob Agents Chemother, 2003. 47(9): p. 2868-74.'

115. Gonzalez-Pastor, J.E., J.L. San Millan, and F. Moreno, The smallest known gene. Nature, 1994. 369(6478): p. 281.

116. Roush, R.F., et al., Maturation of an Escherichia coli Ribosomal Peptide Antibiotic by ATP-Consuming N-P Bond Formation in Microcin C7. J Am Chem Soc, 2008. 130(11): p. 3603-3609.

117. Metlitskaya, A., et al., Maturation of the Translation Inhibitor Microcin C. J Bacteriol, 2009. 191(7): p. 2380-2387.

118. Regni, C.A., et al., How the MccB bacterial ancestor of ubiquitin El initiates biosynthesis of the microcin C7 antibiotic. EMBO J, 2009. 28(13): p. 1953-1964.

119. Severinov, K. and S.K. Nair, Microcin C: biosynthesis and mechanisms of bacterial resistance. Future Microbiol, 2012. 7(2): p. 281-289.

120. Novikova, M., et al., The Escherichia coli Yej Transporter Is Required for the Uptake of Translation Inhibitor Microcin C. J Bacteriol, 2007. 189(22): p. 8361-8365.

121. Eswarappa, S.M., et al., The yejABEF operon of Salmonella confers resistance to antimicrobial peptides and contributes to its virulence. Microbiology, 2008.154(2): p. 666-678.

122. Kazakov, T., et al., Escherichia coli Peptidase A, B, or N Can Process Translation Inhibitor Microcin C. J Bacteriol, 2008. 190(7): p. 2607-2610.

123. Metlitskaya, A., et al., Aspartyl-tRNA Synthetase Is the Target of Peptide Nucleotide Antibiotic Microcin C. Journal of Biological Chemistry, 2006. 281(26): p. 18033-18042.

124. Novoa, M.A., et al., Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin C7 production and immunity. J Bacterid, 1986.168(3): p. 1384-1391.

125. Novikova, M., et al., MccE Provides Resistance to Protein Synthesis Inhibitor Microcin C by Acetylating the Processed Form of the Antibiotic. Journal of Biological Chemistry, 2010. 285(17): p. 12662-12669.

126. Agarwal, V., et al., Structural Basis for Microcin C7 Inactivation by the MccE Acetyltransferase. Journal of Biological Chemistry, 2011. 286(24): p. 21295-21303.

127. Fomenko, D., A. Veselovskii, and I. Khmel, Regulation of microcin C51 operon expression: the role of global regulators of transcription. Res Microbiol, 2001.152(5): p. 469-479.

128. Moreno, F., et al., The regulation of microcin B, C and J operons. Biochimie, 2002. 84(5-6): p.

129. Severinov, K., et al., Low-molecular-weight post-translationally modified microcins. Mol Microbiol, 2007. 65(6): p. 1380-1394.

130. Forrest, A.K., et al., Aminoalkyl adenylate and aminoacyl sulfamate intermediate analogues differing greatly in affinity for their cognate Staphylococcus aureus aminoacyl tRNA synthetases. Bioorg Med Chem Lett, 2000. 10(16): p. 1871-4.

131. Belrhali, H., et al., Crystal structures at 2.5 angstrom resolution of seryl-tRNA synthetase complexed with two analogs of seryl adenylate. Science, 1994. 263(5152): p. 1432-1436.

132. Cisar, J.S., et al., Exploiting Ligand Conformation in Selective Inhibition of Non-Ribosomal Peptide Synthetase Amino Acid Adenylation with Designed Macrocyclic Small Molecules. J Am Chem Soc, 2007. 129(25): p. 7752-7753.

133. Schimmel, P., J. Tao, and J. Hill, Aminoacyl tRNA synthetases as targets for new anti-infectives. The FASEB Journal, 1998. 12(15): p. 1599-1609.

134. Ubukata, M.O., H.; Isodo, K., Synthesis and biological activity of nucleoside antibiotics, ascamycin and its amino acid analogs. Nucleic Acids Symp Ser, 1985(16): p. 81-3.

135. Van de Vijver, P., et al., Antibacterial 5 P., et al., 1., ): p. 81-3.adenosines. Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry, 2009.17(1): p. 260-269.

136. Van de Vijver, P., et al., Synthetic Microcin C Analogs Targeting Different Aminoacyl-tRNA Synthetases. J Bacterid, 2009.191(20): p. 6273-6280.

137. Vondenhoff, G.H.M., et al., Extended targeting potential and improved synthesis of Microcin C analogs as antibacterials. Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry, 2011. 19(18): p. 5462-5467.

138. Vondenhoff, G.H.M., et al., Characterization of Peptide Chain Length and Constituency Requirements for YejABEF-Mediated Uptake of Microcin C Analogues. J Bacteriol, 2011. 193(14): p.

139. Korza, H.J. and M. Bochtler, Pseudomonas aeruginosa LD-Carboxypeptidase, a Serine Peptidase with a Ser-His-Glu Triad and a Nucleophilic Elbow. Journal of Biological Chemistry, 2005. 280(49): p. 40802-40812.

140. Page, M. and E. Di Cera, Serine peptidases: Classification, structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences, 2008. 65(7): p. 1220-1236.

141. Schechter, I. and A. Berger, On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem Biophys Res Commun, 1967. 27(2): p. 157-62.521.529.3618-3623.