Механизмы инициации транскрипции у мезофильных и термофильных бактерий

Кульбачинский, Андрей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы инициации транскрипции у мезофильных и термофильных бактерий
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы инициации транскрипции у мезофильных и термофильных бактерий"

На правах рукописи

КУЛЬБАЧИНСКИЙ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

МЕХАНИЗМЫ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ У МЕЗОФИЛЬНЫХ И ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 АПР2X9

Москва-2009

003466199

Работа выполнена в Лаборатории. молекулярной генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН (Москва), в сотрудничестве с Общественным институтом здоровья (Public Health Research Institute, Newark, USA), Институтом Ваксмана (Waksman Institute, Piscataway, USA) и Институтом биотехнологии (Institute of Biotechnology, Vilnius, Lithuania).

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАН А.Б. Четверин

д.б.н. Г.В. Шпаковский

д.б.н. М.К. Кухалова

Ведущая организация:

ФГУП Государственный научный центр Российской Федерации Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится 21 апреля на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Учреждения Российской академии наук

Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан «

Ученый секретарь Диссертационного сов кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Транскрипция является первой стадией экспрессии генетического материала в клетках всех организмов. Именно на уровне транскрипции действуют основные механизмы генетической регуляции. Главным ферментом, осуществляющим транскрипцию, является РНК-полимераза (РНКП) -сложная молекулярная машина, обладающая многими каталитическими активностями и способная к разнообразным структурным перестройкам. Структура РНКП и механизм синтеза РНК высоко консервативны у всех организмов, от бактерий до человека. РНКП бактерий имеет наиболее простое строение и может служить удобной моделью для изучения механизмов транскрипции с применением самых современных методов молекулярной биологии.

Наиболее сложной и жестко регулируемой стадией транскрипции является стадия инициации. Инициация транскрипции происходит в специфических участках ДНК - промоторах, - и сама состоит из нескольких стадий. В отличие от ДНК-полимераз, РНКП способна самостоятельно осуществлять инициацию и начинать синтез РНК в отсутствие затравки. В ходе инициации РНКП должна: (1) узнать промотор; (2) расплавить цепи ДНК вокруг стартовой точки транскрипции; (3) связать инициаторные нуклеотиды и начать синтез РНК; (4) разорвать контакты с промотором и перейти к продуктивному синтезу РНК - элонгации транскрипции. Детальный молекулярный механизм инициации транскрипции и механизмы структурных превращений РНКП, происходящих на разных стадиях инициации, во многом остаются неизвестными. Расшифровка данного механизма является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии.

У бактерий все стадии инициации осуществляются холоферментом РНКП, состоящим из кор-фермента (субъедшшчный состав а2рр'со) и фактора инициации -ст-субъединицы, которая диссоциирует при переходе к элонгации транскрипции. Одной из основных функций ст-субъединицы является узнавание промоторов и плавление ДНК в районе стартовой точки транскрипции. В последние годы появились данные, показывающие, что ст-субъедишща может также играть активную роль на последующих стадиях инициации, в том числе, в процессах инициации синтеза РНК и ухода РНКП с промотора. Таким образом, сг-субъединица является одним из основных регуляторов транскрипции, действующим на всех стадиях инициации. Анализ функций а-субъединицы представляет огромный интерес для понимания механизма транскрипции в целом и основных принципов транскрипционной регуляции.

Анализ трехмерной структуры РНКП, проведенный для РНКП термофильных бактерий Т. ациайси.ч и Т. ¡/геторкИш, позволил создать структурные модели промоторного и элонгационного комплексов. Предложенные модели, хотя и не дают исчерпывающей информации о механизмах структурных превращений РНКП на разных стадиях синтеза РНК, позволяют предположить функции различных участков фермента и могут являться основой для расшифровки детального молекулярного механизма транскрипции. Наличие структурных моделей транскрипционных комплексов открывает возможности для исследований конформационной подвижности РНКП на всех стадиях транскрипции, начиная от взаимодействия сг-субъединицы с кор-ферментом, узнавания и плавления

промоторов до структурных перестроек транскрипционного комплекса в ходе инициации транскрипции и механизмов катализа в активном центре РНКП.

Термофильные бактерии являются исключительно интересной моделью для изучения механизмов транскрипции и структурной подвижности РНКП, поскольку, при сохранении консервативного механизма транскрипции, они приобрели особенности, связанные с адаптацией к высоким температурам. В частности, РНКП термофилов обладают повышенной жесткостью структуры и сниженной конформационной . подвижностью, обеспечивающей термостабильность. Сравнительный анализ транскрипционных свойств РНКП термофильных и мезофильных бактерий дает уникальную возможность для поиска функционально-важных участков РНКП, задействованных в узнавании промоторов и в катализе и обеспечивающих адаптивные различия между различными группами бактерий.

Понимание детального механизма транскрипции представляет не только фундаментальный интерес, но имеет и важнейшее практическое значение, поскольку многие заболевания человека связаны с нарушениями процессов инициации и элонгации транскрипции. Кроме того, анализ механизма транскрипции необходим для разработки новых методов подавления активности РНКП, получения новых ингибиторов фермента и антибиотиков, которые могут найти применение в терапии многих инфекционных заболеваний.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлась расшифровка детального молекулярного механизма инициации транскрипции у различных групп бактерий и анализ структурных перестроек РНКП, происходящих в ходе данного процесса. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать новые подходы к анализу структуры РНКП и механизмов узнавания промоторов с использованием аптамеров.

2. Установить молекулярные механизмы взаимодействий РНКП с различными промоторными элементами.

3. Изучить механизм плавления ДНК при образовании открытого промоторного комплекса РНКП и механизмы стабилизации открытого комплекса.

4. Установить механизм инициации синтеза РНК в активном центре РНКП.

5. Исследовать механизм ухода РНКП с промотора.

6. Охарактеризовать молекулярные механизмы, лежащие в основе различий транскрипционных свойств РНКП термофильных и мезофильных бактерий.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате работы получены важнейшие данные о молекулярных механизмах всех стадий инициации транскрипции, а также о механизмах структурных превращений РНКП, происходящих на данных стадиях. Установлены молекулярные механизмы узнавания основных промоторных элементов РНКП, открыт и охарактеризован новый элемент бактериальных промоторов (СОСтА-злемент). Показано, что СООА является промоторным элементом нового типа, который способен определять межвидовые различия в узнавании промоторов РНКП. Показано, что ст-субъединица РНКП содержит функционально-активные участки связывания ДНК и способна узнавать -10, Тй и ССОА-элементы промотора в составе нематричной цепи ДНК. Изучен процесс образования открытого промоторного комплекса РНКП различных мезофильных и термофильных бактерий, показано, что важную роль в

плавлении ДНК играют аминокислотные остатки в участках ст-субъединицы, взаимодействующих с -10 элементом промотора и с кор-фермептом РНКП. Показано, что стабильность промоторных комплексов определяется контактами а-субъедшшцы РНКП с промоторными элементами, а также контактами кор-фермента с ДНК спереди по ходу транскрипции. Изучен механизм инициации синтеза РНК в активном центре РНКП; показано, что в образовании первых связей РНК решающую роль играет ст-субъединица, которая способствует связыванию инициаторных нуклеотидов. Показано, что а-субъединица также играет важную роль в процессе ухода РНКП с промотора при переходе к элонгации транскрипции; установлено, что растущий РНК-транскрипт конкурирует с сг-субъединицей за связывание с кор-ферментом РНКП, что в результате приводит к разрыву контактов с промотором. Выявлены структурные элементы РНКП, обеспечивающие различия в каталитических свойствах РНКП мезофильных и термофильных бактерий. Получен новый тип лигандов к РНКП - аптамеры, - которые открывают широкие возможности для дальнейших исследований механизма транскрипции, а также для создания эффективных ингибиторов фермента.

В целом, полученные в работе данные существенно углубляют наши знания о молекулярных механизмах транскрипции и представляют значительный интерес для понимания основных принципов регуляции генной экспрессии. Кроме большой фундаментальной значимости, результаты работы имеют важное практическое значение и могут найти применение во многих прикладных исследованиях. В частности, открытия, сделанные в работе, могут быть использованы доя создания новых типов промоторов и высокоэффективных систем генной экспрессии, разработки новых стратегий направленной регуляции транскрипции, а также для получения новых ингибиторов РНКП, имеющих терапевтическое значение.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: XX Международном генетическом конгрессе (Берлин, 2008), 1-м Международном форуме по нанотехнологиям, Ш и IV Съездах Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Санкт-Петербург, 2002, Новосибирск, 2008), Летних исследовательских конференциях Федерации Американских обществ экспериментальной биологии (БАБЕВ) (Вермонт, 1997, 2004, 2007), 8-й Международной конференции им. Энгельгардта по молекулярной биологии (Москва, 2006), 17 Съезде французского биофизического общества (Нуан-ле-Фезелье, 2000) и др.

Публикации. По результатам работы опубликовано 15 статей в рецензируемых научных изданиях, 11 тезисов международных и всероссийских конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 251 странице машинописного текста и содержит 96 рисунков и 6 таблиц. Библиография включает 379 названий, в том числе 2 русских и 377 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение аптамеров к РНКП

1.1. Общий метод получения аптамеров

Для изучения взаимодействий РНКП с нуклеиновыми кислотами и различными регуляторными факторами в нашей работе был разработан новый методический подход с использованием аптамеров. Аптамеры - это синтетические однонитевые молекулы ДНК или РНК, специфически узнаваемые белком-мишенью (в данном случае - РНКП) и полученные путем отбора из комбинаторных библиотек олигонуклеотидов (Gold et al., 1995). При отборе - аптамеров была поставлена задача получить лиганды, способные образовывать специфические и стабильные комплексы с каждым из компонентов РНКП: кор-ферментом, а-субъединицей и холоферментом. В качестве мишеней для отбора были выбраны РНКП мезофильной бактерии Escherichia coli и термофильной бактерии Thermus aquaticus. Данные РНКП являются удобными объектами для исследований, так как первая из них хорошо охарактеризована биохимическими и генетическими методами, а для второй известна трехмерная структура.

Рис. 1.1. Общая схема получения аптамеров. (А) Структура библиотеки оцДНК, использованной при отборе (32N -случайный район длиной 32 нт). (Б) Схема эксперимента. Общее количество различных последовательностей, использованных при отборе, составляло ~10ь. ДНК инкубировали с холоферментом, кор-ферментом или а-субъедюницей РНКП, РНКП-ДНК комплексы отделяли от несвязавшейся ДНК при помощи сорбции на нитроцелшолозных фильтрах (НЦ), аффинного связывания РНКП на Ni-агарозе (Ni) или гель-электрофореза (ЭФ). При получении аптамеров к сайту связывания рифампицина (Rif) проводили контр-отбор последовательностей, не связывающихся с РНКП в присутствии Rif

Для получения аптамеров был использован метод, схема которого показана на Рис. 1.1. При отборе использовали библиотеку оцДНК-олигонуклеотидов, имеющих центральный район длиной 32 нт со случайной последовательностью, окруженный районами с фиксированными последовательностями. Смесь олигонуклеотидов инкубировали с РНКП и проводили отбор связавшихся ДНК. Полученные олигонуклеотиды амплифицировали при помощи праймеров, соответствующих константным областям исходной библиотеки, получали оцДНК и использовали ее для следующего раунда отбора (всего проводили 10-12 раундов). Олигонуклеотиды из обогащенной библиотеки клонировали и определяли последовательности индивидуальных аптамеров. Во всех экспериментах были получены высокоаффинные и специфичные аптамеры, которые были использованы в исследованиях взаимодействий РНКП с промоторами и регуляторными факторами.

GGGAGCTCXGAATJJACGCTOA-32H-TTCGACVTGAGGCCCGGATC

Б 23 нт .

оцДНК

случайный район i

Инкубация с РНКП

раундовй^

Отбор (НЦ, Ni,3i)

I | Контр-отбор] Связавшиеся ДНК

Амплификация и получение оцДНК

«Аптамеры

1.2. Аптамеры к кор-ферменту РНКП

1.2.1. Общая характеристика аптамеров

Целью отбора аптамеров к кор-ферментам РНКП Е. coli и Т. aquaticus являлось получение лигандов, связывающихся в различных функционально-важных участках молекулы. Отбор аптамеров к обеим РНКП проводили по стандартной методике (раздел 1.1), варьируя условия связывания и метод разделения олигонуклеотидов. В одном из экспериментов по отбору аптамеров к РНКП Е. coli была поставлена задача получить аптамеры к конкретному участку фермента - сайту связывания антибиотика рифампицина (Rif). В этом случае при проведении селекции в каждом раунде отбирались олигонуклеотиды, которые связываются со свободным кор-ферментом РНКП Е. coli, но не связываются с ним в присутствии Rif (стадия контротбора, Рис. 1.1).

А Б

El TTCGGGGAGGTGGCATGGGGGGGAGGCAGTTA

Е2 AACGCACCGGAGGGAGGACTTTGGGCCATCCT

ЕЗ CGCAGGCCÄGCGGGCGAGGATGGGCCACCCCT

Е4 TGGGTTGTGCAGGAGGGGGTGCCCGTTTAGGT

Е5 GGGTGGGCGGGAAGAGTGGGGTGGAAGAGCGT

Е6 CTTCCGACGATGTAAGTCACCACCCGGCTCAG

Е7 TGTGAGCTGGTGGGGTAGGGGGCTGCGAGAGT

Е8 CTGCCCACCGCTGTAAGGTGTCGCCTCCGTCA

Е9 CTCGCTACAGCAAACGCAGCCTCGAGGGATGG

ЕЮ GGCATCCACGCACTGCGAACCGGTCTGGAGTG

Ell GGAGTGATGCCGCCGCCTGGTTGCCTTGGGAG

Е12 GCATCCAGCAAACGCAGCCGGTTTGGCGCCTA

Е13 GCTACTGCTGGAGCACACCCCGACGGTGAGAG

Рис. 1.2. Последовательности аптамеров к кор-ферменту РНКП. (А) Аптамеры к кор-ферменту РНКП Е. coli. (Б) Аптамеры к кор-ферменту РНКП Т. aquaticus. Приведены последовательности центральной части аптамеров без константных районов. Для каждого из классов показан один из аптамеров. Нуклеотиды, идентичные во всех аптамерах данного класса, выделены серым

В целом, было получено пять различных классов аптамеров к кор-РНКП Т. aquaticus (которые получили название Т1-Т5) и тринадцать классов аптамеров к кор-РНКП Е. coli (Е 1-Е 13) (Рис. 1.2). Аптамеры Е5-Е13 были получены при проведении Rif-направленного отбора. Анализ вторичной структуры аптамеров показал, что большинство из них формируют разнообразные шпильки и G-квартеты (предполагаемая структура аптамеров Т1-Т5 к РНКП Т. aquaticus и аптамера Е5 к РНКП Е. coli показана на Рис. 1.3). Все полученные аптамеры обладают исключительно высоким сродством к кор-РНКП, константы диссоциации (Кд) комплексов составляют Ю-9-10"" М. Комплексы аптамеров с РНКП очень стабильны, их времена полужизни составляют десятки минут. Аптамеры высокоспецифичны к своим мишеням: лиганды к РНКП Т. aquaticus не взаимодействуют с РНКП Е. coli и наоборот. В то же время, большинство аптамеров к РНКП Т. aquaticus способны взаимодействовать с РНКП близкородственной бактерии Thermus thermophilus.

CGTGTGGGCAATGCGGTTGGGTGGGAGACACG CCGCGGCACAGGTTACAGAGCGACAGAAAGCA

tgccactgccagatgtgtaccaagtggggacg TGCGATAGCCGCCCTGGTACATTGGCGTTCCG AGGGTCGGGGGTTGTAG GTGGTGAGGTTGAGAG

ТЗ

Т4

Т5

Е5

с.

„т

л Л

9 I

T-G^-A-T-

т Т

5' СбКЛССТСЛГ.^ЛТЛЛЛ

G Т

c-g

>т-л cy,G-c С Т А А-Т А-Т

g-c c-g A-T а-т

5' 3'

к \

л \ \ а Л I I

g=—f

I ^G

л G С G

c^vc -7 т-g —^

Рис. 1.3. Предполагаемая структура аптамеров к кор-ферменту РНКП. Показана структура аптамеров Т1-Т5 к кор-ферменту РНКП Т. ациаЧсш и одного из аптамеров (Е5) к кор-ферменту Е. соН. На рисунке показаны минимальные варианты аптамеров, полученные путем удаления (частично или полностью) константных районов исходной библиотеки. Аптамеры Т1, Т5 и Е5 имеют структуру в-квадруплексов, стабилизированных короткими шпильками, аптамеры Т2, ТЗ, Т4 формируют структуру шпилек

1.2.2. Районы кор-фермента РНКП, участвующие в связывании аптамеров

Чтобы установить, какие участки РНКП задействованы в узнавании аптамеров, мы исследовали способность аптамеров подавлять взаимодействия РНКП с минимальной матрицей, структура которой соответствует РНК/ДНК гибриду и переднему дуплексу ДНК в элонгационном комплексе (Рис. 1.4 А) (Korzheva et al., 1998). Было установлено, что все полученные в наших экспериментах аптамеры (и в случае РНКП Е. coli, и в случае РНКП Т. aquaticus) подавляют взаимодействия РНКП с минимальной матрицей и, таким образом, взаимодействуют с естественными сайтами связывания нуклеиновых кислот. Аптамеры также подавляют активность кор-фермента РНКП в тесте по транскрипции in vitro и являются высокоспецифичными ингибиторами своих РНКП-мишеней (данные для аптамеров к кор-РНКП Т. aquaticus показаны на Рис. 1.4 Б).

Для более точной локализации сайтов связывания аптамеров было исследовано их взаимодействие с кор-РНКП, содержащими мутации в различных участках главного канала фермента (Рис. 1.5). В случае РНКП Е. coli были

РНК

5 ' -GUAGCGGA-3 ' ДНК

3 1 -CATCGCCTATTGTTAAAGTCTGTCCTGG 5 ' -ACAATTTCAGACAGGACC

Днк - N Т1 ТЗ Т2 Т4 Т5 N

\\\ \ / //

9 нт РНК-

Рис. 1.4. Подавление активности РНКП аптамерами к кор-ферменту. (А) Структура минимальной матрицы. (Б) Подавление активности РНКП Т. aquaticus аптамерами TITS. РНКП инкубировали с минимальной матрицей в отсутствие («-») или в присутствии аптамеров, либо контрольных

олигонуклеотидов, не связывающихся с кор-ферментом (N), и измеряли эффективность удлинения РНК на один нуклеотид (с использованием а- [32P]-UTP). Стрелкой указано положение РНК-продукта длиной 9 нт

использованы ферменты с делениями в доменах (31 и flap («заслонка») р-субъединицы (Kuznedelov et al., 2002b; Severinov and Darst, 1997) и фермент с инсердией 8 аминокислот в домене clamp («зажим») р'-субъединицы (получен в нашей работе, см. раздел 4.3.2), в случае РНКП Т. aquaticus - фермент с делецией участка rudder («шип») Р'-субъединицы (Kuznedelov et al., 2002а). Было показано, что каждая из мутаций нарушает связывание некоторых из аптамеров с РНКП, причем разные мутации влияют на связывание разных аптамеров. В частности, делеция rudder в РНКП Т. aquaticus нарушает связывание аптамеров Т1 и Т4, но не влияет на связывание аптамеров Т2, ТЗ и Т5; из этого следует, что rudder входит в состав сайта связывания аптамеров Т1 и Т4. В целом, полученные данные свидетельствуют, что аптамеры связываются с различными эпитопами в главном канале РНКП, в участках, взаимодействующих с ДНК и РНК в транскрипционных комплексах.

1.2.3. Влияние различных лигандов РНКП на связывание аптамеров

Целью дальнейших экспериментов было установить, могут ли аптамеры быть использованы для изучения взаимодействий РНКП с транскрипционными факторами и низкомолекулярными регуляторами. В качестве модельных лигандов были использованы Rif, ст-субъединица и транскрипционный фактор GreB. Rif связывается внутри главного канала вблизи от активного центра РНКП (Artsimovitch et al., 2005; Campbell et al., 2001). а-субъединица также связывается с кор-ферментом РНКП со стороны главного канала (см. ниже, Рис. 2.1) (Vassylyev et al., 2002). Фактор GreB связывается в области вторичного канала РНКП, в районе, удаленном от сайтов связывания аптамеров (Vassylyeva et al., 2007).

Было показано, что все три исследуемых лиганда способны подавлять взаимодействие различных аптамеров с РНКП (Рис. 1.6). Rif по-разному влияет на взаимодействие аптамеров с РНКП. Связывание некоторых аптамеров (Е1-ЕЗ в случае РНКП Е. coli, Т2, ТЗ и Т5 в случае РНКП Т. aquaticus) нечувствительно к Rif, в то время как связывание остальных (в том числе, всех аптамеров, полученных в эксперименте по Rif-направленному отбору к РНКП Е. coli) эффективно подавляется антибиотиком. Сигма-субъединица ингибирует связывание большинства аптамеров с кор-ферментом РНКП. GreB также способен подавлять связывание некоторых из аптамеров (в частности, Е4, Е9, ЕЮ, Е12), что, вероятно,

Рис. 1.5. Мутации в кор-ферменте РНКП, влияющие на связывание аптамеров.

Показана модель элонгационного комплекса РНКП Т.щиаЧт (КогеИеуа е1 аЦ 2000). ДНК (нематричная и матричная цепи показаны желтым и красным, соответственно) и РНК (оранжевая) располагаются внутри главного канала РНКП. Направление транскрипции указано черной стрелкой. Р- и Р'-субъединицы кор-фермента окрашены зеленым и розовым. Стрелками показаны домены, мутации в которых нарушают связывание аптамеров (расположение мутаций показано черными кружками), а также участок связывания рифампицина (ШО

Rif

Рис. 1.6. Влияние различных лигандов РНКП на связывание аптамеров с кор-ферментом РНКП Е. coli. Приведены кривые подавление связывания аптамеров Е5, Е2 и Е9 рифампицином, сг-субъединицей и фактором GreB, соответственно. РНКП (10 нМ) инкубировали с Rif, ст или GreB в увеличивающихся концентрациях, после чего добавляли радиоактивно-меченый аптамер и измеряли эффективность связывания (методом сорбции на нитро-целлюлозных фильтрах)

-А-Rif, Е5

0.1

10 100 1000 10000 Ингибитор, нМ

объясняется аллостерическим влиянием GreB на структуру сайтов связывания аптамеров. На основе кривых подавления связывания аптамеров (Рис. 1.6) были вычислены Кд для связывания с РНКП Rif, а-субъединицы и GreB, которые составили примерно 1, 10 и 100 нМ, соответственно. Таким образом, измерение подавления связывания аптамерами различными лигандами РНКП может быть напрямую использовано для определения аффинности данных лигандов.

1.3. Аптамеры к ст-субъединице и холоферменту РНКП

Отбор аптамеров к о-субъединицам и холоферментам РНКП Е. coli и Т. aquaticus был проведен по той же схеме, что и отбор аптамеров к кор-ферменту РНКП. Так как, в отличие от кор-фермента, природной функцией а-субъединицы и холофермента РНКП является узнавание специфических промоторных последовательностей, отбор проводили в более жестких условиях (при высокой ионной силе), что позволило полностью подавить неспецифические взаимодействия РНКП с ДНК и получить аптамеры к природным ДНК-связывающим сайтам ст-субъединицы и холофермента. В каждом из четырех экспериментов был получен единственный класс аптамеров, состоящий из сходных последовательностей. Было обнаружено, что все полученные аптамеры содержат в своем составе консервативные промоторные элементы и связываются с РНКП с высокой аффинностью. Это позволило использовать аптамеры в исследованиях механизмов взаимодействий РНКП с промоторами. Подробно свойства данных аптамеров рассматриваются в разделах 2 и 3.

Резюме. Получены и охарактеризованы высокоаффинные и высокоспецифичные аптамеры к кор-ферментам, о-субъединицам и холоферментам РНКП Е. coli и Т. aquaticus. Разработан метод сайт-направленного отбора аптамеров, позволяющий получать аптамеры к участкам связывания других лигандов РНКП. Аптамеры к кор-ферменту РНКП связываются в различных участках внутри главного канала РНКП и являются удобным инструментом для изучения взаимодействий РНКП с ДНК и РНК, транскрипционными факторами и низкомолекулярными регуляторами. Аптамеры ингибируют активность РНКП и могут быть использованы для создания новых эффективных ингибиторов фермента.

2. Механизмы узнавания промоторных элементов РНКП

2.1. Общий механизм узнавания промоторов

Одной из главных задач работы являлось исследование молекулярных механизмов узнавания промоторов холоферментом бактериальной РНКП. Холофермент содержит единственный фактор инициации - ст-субъединицу. В клетках бактерий обычно присутствует несколько разных ст-субъединиц, но большинство промоторов узнается при участии одной, главной ст-субъединицы (ст70 у Е. coli, стА у других бактерий). В составе главных ст-субъединиц имеется четыре эволюционно консервативных района, каждый из которых состоит из несколько подрайонов (1.1 и 1.2; 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 и 2.5; 3.1 и 3.2; 4.1 и 4.2) (Рис. 2.1) (Gross et al, 1998).

Промоторы бактерий содержат несколько специфических элементов, необходимых для их узнавания (Рис. 2.1) (Gross et al., 1998). Наиболее консервативными являются -10 (ТАТААТ) и -35 (TTGACA) элементы, которые расположены на расстоянии примерно 10 и 35 нуклеотидов левее старта транскрипции и узнаются районами 2.3/2.4 и 4.2 ст-субъединицы, соответственно. Некоторые промоторы содержат дополнительный элемент - динуклеотид TG, -который расположен на один нуклеотид левее -10 элемента и узнается районом 2.5 а-субъединицы (промоторы с удлиненной -10 областью) (Barne et al., 1997). Для узнавания таких промоторов не требуется -35 элемента. Наконец, некоторые сильные промоторы содержат А/Т-богатую последовательность, расположенную на расстоянии 50-70 нт от стартовой точки транскрипции, и получившую название UP-элемент. UP-элемент промоторов узнается С-концевыми доменами а-субъединиц (аСТО) РНКП (Рис. 2.1) (Ross et al., 1993).

При взаимодействии РНКП с промотором первоначально образуется «закрытый» промоторный комплекс, в котором ДНК находится в двунитевом состоянии. В процессе изомеризации комплекса ДНК оказывается внутри главного канала фермента, и РНКП осуществляет плавление цепей ДНК в районе стартовой точки транскрипции (от -11 до +2 нт), что приводит к формированию «открытого» промоторного комплекса (см. модель на Рис. 2.1) (Artsimovitch et al., 2004; deHaseth et al., 1998; Gross et al., 1998; Murakami et al., 2002a; Ross and Gourse, 2005). В плавлении ДНК важную роль играют взаимодействия района 2 ст-субъединицы с -10 элементом промотора в составе нематричной цепи ДНК (Рис. 2.1, см. ниже, раздел 4.2) (Fenton et al., 2000; Roberts and Roberts, 1996; Schroeder et al., 2007; Tomsic et al., 2001). Контакты ст-субъединицы с -10 элементом в расплавленном участке ДНК сохраняются в открытом промоторном комплексе и, вероятно, необходимы для поддержания его стабильности. Точная трехмерная структура промоторного комплекса, детальный механизм узнавания перечисленных промоторных элементов, а также роль других участков промоторной ДНК в узнавании промоторов до настоящего времени остаются неизвестны.

Несмотря на то, что ст-субъединица в составе холофермента РНКП играет ключевую роль в узнавании промоторов, в свободном виде она с ними не взаимодействует. Кор-фермент РНКП индуцирует конформационные перестройки ст-субъединицы, в результате которых происходит стимуляция ДНК-связывающей активности ст. В составе холофермента ст-субъединица взаимодействует с Р- и Р'-

Рис. 2.1. Структурная модель промоторного комплекса РНКП. Модель основана на данных о структуре промоторного комплекса РНКП Т. aquaticus низкого разрешения (Murakami et al., 2002а). ДНК показана оранжевым; обозначены -10, TG, -35 и UP-элементы. Передний дуплекс ДНК и участок промотора в районе стартовой точки транскрипции, точная структура которых неизвестна, изображены более светлым цветом. Ион Mg2* в активном центре обозначен сферой алого цвета. ДНК-узнающие районы сг-субъединицы показаны в цвете: район 4.2 - зеленый, районы 2.3 и 2.4 - красные, район 1.2 - синий. Петля, образованная районом 3.2, показана желтым. Звездочками показаны положения флуоресцентных групп, введенных в районы 2.4 и 4.2 в экспериментах по измерению междоменных расстояний в о-субъединице. Остаток Gln260 (Gin 440 у Е. coli) в районе 2.4 показан желтым. Вероятное расположение района 1.1 а, точная структура которого неизвестна, показано полупрозрачной синей линией, a-, ß- и ß'-субъединицы кор-фермента показаны светло-голубым, светло-зеленым и светло-розовым, соответственно. С-концевые домены а-субъединиц (aCTD), контактирующие с ДНК левее -35 элемента, схематично изображены овалами голубого цвета (точное положение этих доменов неизвестно). Обозначены домен flap ß-субъединицы, контактирующий с районом 4 а-субъединицы, домен jaw ß'-субъединицы, а также расположение исследованных в данной работе мутаций в домене clamp (инсерция шести остатков His в положении 216 в РНКП Е. coli, £iß') и в районе switch 2 ß'-субъединицы (замены остатка Arg339 в РНКП Е. coli)

субъединицами кор-фермента (Рис. 2.1). Основным сайтом связывания а с кор-ферментом является спираль-спиральный элемент ß'-субъединицы, расположенный в основании участка rudder в главном канале фермента (аминокислотные остатки 262-309 в РНКП Е. coli) (см. ниже, Рис. 4.4) (Arthur and Burgess, 1998; Vassylyev et al., 2002). Однако, из-за отсутствия данных о структуре сг-субъединицы в свободном состоянии, точные механизмы структурных перестроек ст-субъединицы, происходящих при связывании с кор-ферментом и в ходе узнавания промоторных элементов, остаются неизвестны.

2.2. Стимуляция ДНК-связывающей активности ст-субъединицы кор-ферментом РНКП

Для анализа стимуляции ДНК-связывающей активности ст-субъединицы кор-ферментом РНКП мы исследовали взаимодействие РНКП Е. coli с короткими «нематричными» олигонуклеотидами, соответствующими нематричной цепи промотора и содержащими -10 элемент (ТАТААТ) (Рис. 2.2 А). Ранее было показано, что узнавание нематричных олигонуклеотидов холоферментом РНКП во многом напоминает узнавание -10 элемента в природных промоторах (Магт and Roberts, 1997; Savinkova et al„ 1988).

Для детекции образования комплексов РНКП с нематричными олигонуклеотидами мы использовали метод ковалентных ДНК-белковых сшивок. Было показано, что свободная ст70-субъединица РНКП Е. coli не образует ковалентной сшивки с нематричным олигонуклеотидом при облучении ультрафиолетовым светом (длина волны 254 им) (Рис. 2.2 Б, дор. 5 и 10). В то же время, ст70 в составе холофермента образует сшивку с нематричным олигонуклеотидом (дор. 2); сшивка является специфичной и не образуется в случае контрольного комплементарного олигонуклеотида (дор. 7). Таким образом, кор-фермент Е. coli стимулирует специфическое узнавание нематричного олигонуклеотида сг-субъединицей. При помощи метода ограниченного расщепления белка по остаткам метионина (Grachev et al., 1989) сайт ДНК-белковой сшивки был локализован в консервативном районе 2 о70, который принимает участие в узнавании -10 элемента в природных промоторах. Следовательно, метод сшивки позволяет зафиксировать функционально-важные взаимодействия -10 элемента промотора с районом 2 ст-субъединицы.

Чтобы установить, какая из субъединиц кор-фермента важна для стимуляции связывания ДНК ст-субъединицей, мы провели эксперименты по сшивке в присутствии изолированных ß'- и ß-субъединиц кор-фермента. Было обнаружено, что ß'-субъединица также способна стимулировать образование ковалентной сшивки ст-субъединицы с нематричным олигонуклеотидом, в то время как ß-

Рис. 2.2. Взаимодействие cs-субьсдиницы с олигонуклеотидамн, содержащими -10 элемент промотора.

(A) Нематричный и матричный олигонуклеотида, соответствующие промотору facUV5 в районе -10 элемента (подчеркнут). (Б) Ковалентная сшивка РНКП с радиоактивно-мечеными олигонуклеотидами. ДНК-белковые комплексы разделяли электрофорезом в денатурирующих условиях и идентифицировали при помощи радиоавтографии. Положение свободной ДНК и ДНК-белковых комплексов указано слева от рисунка.

(B) Стимуляция сшивки фрагментами ß'-субъединипы (границы фрагментов указаны над рисунком)

A 5'-ATTGCGTATAATGTGTGGA-3' нематричный (-10)

5'-TCCACACATTATACGCAAT-3' матричный (анти-10)

днк : -10 анти-10

хор j + — —

Р, ß' - ß ! ß' - - Р Р' -

о - + + + + -! + + + +

\ \ \ ! / /

ß'-субьединица

о Ö

со - I

днк-

123456789 10

субъединица такого эффекта не оказывает (Рис. 2.2 Б, дор. 3 и 4); в случае контрольного олигонуклеотида сшивка не образуется (дор. 8 и 9). Использование фрагментов ß'-субъединицы (аминокислоты 1-877 и 820-1407) позволило установить, что для активации связывания ДНК сг-субъединицей необходима N-концевая часть ß'-субъединицы, содержащая основной сайт связывания о, в то время как С-конец ß' образование сшивки не стимулирует (Рис. 2.2 В).

Анализ мутантных вариантов ст-субъединицы с делециями различной длины показал, что для стимуляции сшивки с ДНК кор-ферментом РНКЦ не требуется С-концевой участок ст-субъединицы, содержащий районы 2.5-4.2, а также N-концевой участок, содержащий район 1.1 (данные не приведены). Таким образом, взаимодействия данных районов о с кор-ферментом не нужны для активации узнавания ДНК.

Итак, проведенные эксперименты позволили установить, что конформационные перестройки ст-субъединицы, активирующие узнавание -10 элемента промоторов, происходят в результате взаимодействия а с N-концом ß'-субъединицы кор-фермента РНКП; узнавание -10 элемента может осуществляться достаточно коротким фрагментом с, включающим консервативные районы 1.2 и 2.

2.3. Узнавание -10 элемента промотора сг-субъединицей РНКП

Следующей задачей исследований было установить, способна ли ст-субъединица к узнаванию промоторных последовательностей в отсутствие кор-фермента РНКП и требуются ли для этого серьезные структурные перестройки ст-субъединицы. С этой целью был проведен поиск последовательностей оцДНК (аптамеров), способных взаимодействовать с ст-субъединицами РНКП Е. coli и Т. aqiiaticus (см. раздел 1.3). Полученные в результате аптамеры к ст70-субъединице Е. coli и стА-субъединице T. aquaticus были названы sEcap (от sigma К coli щйатег) и sTap (sigma T. aquaticus aptamer), соответственно. Было обнаружено, что аптамеры имеют в своем составе консервативные мотивы, соответствующие -10 и TG-элементам промотора (Рис. 2.3). В аптамерах к сг70-субъедишще Е. coli содержится консервативный мотив TGTAGAAT. а в аптамерах к стА-субъедшшце Т. aquaticus -TGTA(C/T)AATGGGA (приведена коисенсусная последовательность, в обоих случаях подчерюгут -10 элемент промотора). Анализ мутантных вариантов аптамеров с заменами в данных мотивах показал, что эти мотивы абсолютно необходимы для связывания с РНКП (данные не приведены, см. также Рис. 2.5).

Предполагаемая вторичная структура аптамеров к ст-субъединицам Е. coli (sEcapl) и Т. aquaticus (sTapl) приведена на Рис. 2.4. Аптамер sEcapl образует структуру G-квадруплекса, на 3'-конце которого располагается консервативный

sEcapl GGATGGGTGGGTGGGGAGGTTGTAGACTGTAT

sTapl CACGGCCGGAGTGTATAXTGGGAGCGGTATCG

Рис. 2.3. Последовательности аптамеров к ст-субъединицам РНКП Е. coli (sEcapl) и Т. aquaticus (sTapl). Показаны центральные части аптамеров без константных районов библиотеки. Консервативные участки аптамеров показаны серым, -10 элемент подчеркнут

мотив, а аитамер sTapl имеет структуру шпильки. Аптамеры взаимодействуют с ст-субъединицей с высокой аффинностью (Кд комплексов аптамеров с ст70- и стА-субъединицами составляют 10-20 нМ). Аптамер sEcapl, кроме ст70-субъединицы, способен узнавать стЛ-субъединицу Т. aquaticus. В то же время, аптамер sTapl высокоспецифичен к а-субъединице Т. aquaticus и не взаимодействует с ст-субъединицами Е. coli и других бактерий.

район 2 а

TG -10 элемент

район 1.2 ст

"GGGA" элемент

л Jtc|tacact1ctat3' s'-gagItgTtataatII

\ т с G I Т'Ч I

с—ч—g | -С—t-^G

,ТА С.

З'-G A G

4 A- G

G AJG С G Т

" И I

С T Т G С А

g^—-\-g /

W"A"C

sEcapl

sTapl

Ч/

6-ТИО-б s

Рис. 2.4. Структура аптамеров, узнаваемых с-субъединицами Е. coli и Т. aquaticus. На рисунке приведены минимальные аптамеры, в которых удалены районы, не принимающие участия во взаимодействии с а-субъединицей. -10 и TG-элементы показаны в рамке, синим обозначен GGGA-элемент. Показано положение 6-тио-гуанина в модифицированном sTapl-аптамере, использованном в экспериментах по сшивке

Наличие -10 элемента в составе аптамеров показывает, что ст-субъединицы Е. coli и Т. aquaticus способны узнавать данный элемент в отсутствие кор-фермента РНКП. Чтобы установить механизм узнавания -10 элемента свободной а-субъединицей, было проведено несколько экспериментов. Анализ связывания аптамера sEcapl с делеционными производными ст-субъединиц показал, что для узнавания аптамера достаточно фрагмента а70, содержащего консервативные районы 1.2 и 2 и лишенного N- и С-концевых участков (аминокислоты 94-448). Участок контактов аптамера sEcapl с а70-субъединицей был картирован методом ковалентных ДНК-белковых сшивок. Было показано, что аптамер при облучении ультрафиолетовым светом (254 нм) с большой эффективностью образует сшивку с а-субъединицей. Место сшивки было картировано методом ограниченного расщепления белка по остаткам метионина. Было установлено, что сшивка локализуется в районе 2 а70, в том же участке, что и сшивка нематричного олигонуклеотида с а70 в холоферменте РНКП (см. раздел 2.2).

Нашей следующей задачей было установить, является ли взаимодействие района 2 ст-субъединицы с -10 элементом в аптамерах функционально-значимым. Ранее было показано, что мутации в районе 2.4 ст70-субъединицы Е. coli (в частности, замена Gln440His) способны супрессировать замены в -10 элементе в природных промоторах (Gross et al., 1998). Мы провели аналогичные эксперименты

sTap1/WT

sTap1/Q260H

-12C/WT

100

1000

Рис. 2.5. Замены в -10 элементе в аптамере $Тар1 супрессируются мутациями в районе 2.4 «У^-субъединицы Т. адимкиь. Приведены кривые связывания БТар1-аптамера и его мутантного варианта с заменой Т—»С в первом положении -10 элемента (-12С, данное положение соответствует -12 позиции в промоторах) с <тЛ-субъединицей дикого типа (\\Т) и с с^-субъединицей с заменой <326011 в районе 2.4. Связывание измеряли при различных концентрациях ст-субъединицы методом сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах

[о], нМ

с использованием аптамера sTapl. Было показано, что замена первого остатка Т в -10 элементе в sTapl приводит примерно к 100-кратному падению аффинности данного аптамера к стА-субъединице Т. aquaticus (Кд>1000 нМ, Рис. 2.5). Замена остатка Gin на остаток His в 260 положении в районе 2.4 оА (что соответствует замене Gln440His в о70) не влияет на узнавание исходного аптамера, но значительно улучшает связывание мутантного варианта sTapl (Кд=100 нМ) (Рис. 2.5). Таким образом, мутации в районе 2.4 ст-субъединицы способны супрессировать замены в -10 элементе в аптамерах. Полученные данные свидетельствуют, что узнавание -10 элемента в составе аптамеров свободной а-субъединицей происходит по тому же механизму, что и узнавание данного элемента в промоторах холоферментом РНКП.

2.4. Узнавание TG-элемента

Динуклеотид TG, расположенный слева от -10 элемента в аптамерах к ст-субъединицам Е. coli и Т. aquaticus, напоминает TG-элемент, присутствующий в промоторах с удлиненным -10 элементом, но, в отличие от этих промоторов, не отделен от -10 элемента дополнительным нуклеотидом (Рис. 2.4). Анализ мутантных аптамеров, в которые между TG и -10 элементом был внесен дополнительный нуклеотид, показал, что они также связываются с ст (Табл. 2.1). В то же время, аптамеры, не содержащие TG, не взаимодействуют с сг (Табл. 2.1). Таким образом, свободная а-субъединица способна узнавать TG-элемент в составе аптамеров, причем, в отличие от промоторов, где положение TG строго

Табл. 2.1. Влияние замен в TG-элементе на связывание аптамера sEcapl с а-субъединицсй

а-субъединица sEcapl (Кд, нМ)

TGTAGAAT TGCTAGAAT CCTAGAAT

а™ WT 18,7 69,5 >3000

1-448 22,7 89,0 >3000

аА WT 9,5 >3000

Q260H 20 65,9

В таблице приведены Кд для связывания аптамеров с ст-субъединицами Е. coli (дикого типа и с делецией С-концевой части) и Т. aquaticus (дикого типа и с заменой Q260H). В верхней части таблицы показаны последовательности консервативного участка аптамера с мутациями

фиксировано, узнавание TG в аптамерах может происходить в различных позициях относительно от -1 0 элемента.

Ранее на основании данных о супрессии замен в TG-элементе в промоторах мутациями в ст70-субъединице было показано, что в узнавании данного элемента задействованы районы 2.4 и 2.5 о (Barne et al., 1997; Sanderson et al., 2003). Имеющиеся данные низкого разрешения о структуре промоторного комплекса РНКП Т. aquaticus показывают, что промоторная ДНК в области TG-элемента располагается между районами 2.4 и 2.5 ст (Рис. 2.1), но не позволяют установить роль каждого из районов в узнавании данного элемента (Murakami et al., 2002а).

Мы показали, что фрагмент а70-субъединицы, не содержащий района 2.5 (аминокислоты 1-448), узнает sEcapl-аптамер, содержащий TG-элемеит, с той же аффинностью, что и ст дикого типа, но не узнает sEcapl, лишенный TG-элемента (Табл. 2.1). Таким образом, район 2.5 ст-субъединицы не участвует в узнавании TG в аптамерах. Для выяснения роли района 2.4 в узнавании TG-элемента было проверено, способны ли мутации в данном районе супрессировать замены TG в аптамерах. Было установлено, что замена Gln260His в районе 2.4 стА-субъединицы Т. aquaticus супрессирует замену TG—>СС в sEcapl-аптамере (Табл. 2.1). Это означает, что в узнавании TG в составе аптамеров, соответствующих нематричной цепи промотора, участвует район 2.4 ст-субъединицы. Таким образом, можно предположить, что узнавание TG-элемента в составе двунитевых промоторов осуществляется по обеим цепям ДНК, причем в нематричиой цепи TG узнается районом 2.4, а в составе матричной цепи-районом 2.5 ст-субъединицы.

2.5. Узнавание GGGA-элемепта

Алтамеры к стА-субъедшшце Т. aquaticus, кроме -10 и TG-элементов, содержат консервативный мотив GGGA, расположенный справа от -10 элемента (Рис. 2.4). Нуклеотидные замены в данном мотиве нарушают связывание аптамера с о субъединицей (данные не приведены). Мы предположили, что GGGA может являться новым промоторным элементом, узнаваемым ст-субъединицей РНКП Т. aquaticus. Это предположение было подтверждено в нашей дальнейшей работе (см. раздел 3).

Для локализации района а-субъединицы, взаимодействующего с GGGA-элементом, был использован метод сайт-специфических ДНК-белковых сшивок. Для проведения эксперимента был использован модифицированный аптамер sTapl, в котором во второе положение GGGA-элемента был внесен 6-тио-гуанин (Рис. 2.4). Модифицированный аптамер при фотоактивации (365 нм) образовывал специфичную сшивку с аА-субъединицей, которая подавлялась при добавлении избытка немодифицированного sTapl (Рис. 2.6 А, дор. 1 и 2). Для картирования места сшивки был применен метод химического расщепления белка по остаткам цистеина. В эксперименте была использована <тА-субъединица, содержащая единственный остаток Cys в позиции 132. Было показано, что при расщеплении сл в составе комплекса с радиоактивно-меченым аптамером по остатку Cys 132 место сшивки локализуется в N-концевом фрагменте ст (Рис. 2.6 Б). Так как стА-субъединица с делецией N-концевого района 1.1 (аминокислоты 1-91) также образует сшивку с аптамером (Рис. 2.6 А, дор. 4), можно заключить, что место сшивки располагается между между аминокислотными остатками 92 и 132, что

G WT СО 1 <N O Csí СО

sTapl-конкурент — wrU - -

619 51.9

46.1 41.9

кДа

sTap-1-438 -1-438 -

1-390 -92-438 -

Ч'

т-

sTap-132-438

■ sTap-1-132

1 2 3 4 5

1 2

Рис. 2.6. Картирование участка контакта ОСДтА-элемента в 5Тар1-аптамере с <тл-еубъедотшцей Т. ациайсю. (А) Сшивка сг'-субъединицы с модифицированным эТарЬантамером, содержащим 6-тао-гуанин во втором положении ООвА-элемента (см. Рис. 2.4). Дор. 1 - сшивка с радиоактивно-меченым алтамером в отсутствие конкурентов, дор. 2 — сшивка в присутствии избытка немеченого аптамера, дор. 3 - сшивка в присутствии контрольного неспецифического олигонуклеотида, дор. 4 - сшивка с фрагментом ст 92-438, дор. 5 - сшивка с ст, содержащей остаток цистеина в позиции 132 (вШС). (Б) Картирование участка сшивки при помощи расщепления белка по остаткам цистеина (обработка 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислотой, КТСВА). Слева от рисунка показано положение фрагментов аА-субъеди5пщы - маркеров молекулярной массы. Справа показано положение комплекса зТар1 с N-концевым фрагментом а, а также ожидаемое положение комплекса с С-кощевым фрагментом

соответствует консервативному району 1.2 а-субъединицы. Функции данного района во взаимодействиях с ДНК до настоящего времени оставались неизвестными. Анализ существующих структурных моделей промоторного комплекса показывает, что район 1.2 сг-субъединицы располагается поблизости от участка нематричной цепи ДНК, соответствующего GGGA-элементу (Рис. 2.1). Полученные нами данные позволяют предположить, что район 1.2 ст-субьединицы принимает непосредственное участие в узнавании данного участка промотора (см. ниже, раздел 3).

2.6. Иш ибирование связывания ДНК в свободной ст-субъединице

Ранее было предложено несколько механизмов ингибирования ДНК-связывающей активности в свободной сг-субъединице. Во-первых, было предположено, что связывание а-субъединицы с ДНК ингибируется N-концевым отрицательно-заряженным районом 1.1 (Camarero et al., 2002; Dombroskí et al., 1993). Во-вторых, было показано, что в свободном состоянии с принимает компактную конформацию, в которой районы 2 и 4 сближены друг с другом, что также может приводить к экранированию ДНК-связывающих сайтов (Callaci et al., 1999). Наконец, ингибирование связывания ДНК в свободной а-субъединице может быть связано с локальными изменениями структуры ДНК-связывающих районов, в частности, района 2 (Anthony and Burgess, 2002; Callaci et al., 1998).

Рис. 2.7. Расстояния между доменами 2 и 4 сг-субъединицы в свободном состоянии, в холоферменте, и в комплексе с аптамером sEcapl. Междоменные расстояния в ст70-субъединице Е. coli были измерены методом LRET. Флуоресцентные группы, использованные для измерения, были присоединены к остаткам Cys, внесенным в положения 442 и 596 в районах 2 и 4 а70, соответственно. Приведены расстояния (в ангстремах) в свободной а-субъедшшце, а также в присутствии кор-фермента РНКП, аптамера sEcapl и контрольного неспецифического олигонуклеотида (С)

so -

о? 40 -

Для анализа механизма ингибирования связывания ДНК ст-субъединицей мы использовали аптамеры sEcapl и sTapl, содержащие промоторные элементы. Было показано, что делеции районов 1.1 и 4 в ст-субъединицах Е. coli и Т. aquaticus не изменяют эффективность узнавания аптамеров (данные не приведены). Таким образом, данные районы <т не влияют на узнавание -10, TG и GGGA-элементов в составе аптамеров районами 2 и 1.2 ст-субъедшшцы.

Для анализа конформационных перестроек а, происходящих при связывании аптамеров, был использован метод LRET (Luminescence Resonance Energy Transfer), позволяющий измерять расстояния между флуорофорами, внесенными в различные домены ст. Ранее было показано, что наиболее заметным конформационным изменением при связывании сг70-субъединицы с кор-ферментом Е. coli является увеличение расстояния между доменами 2 и 4 ст (Callaci et al., 1999). Мы проанализировали, изменяются ли расстояния между данными доменами в ст-субъединицах Е. coli и Т. aquaticus при связывании аптамера sEcapl. Данные эксперименты были проведены совместно с лабораторией Т. Гайдука (St. Luis University Medical School, USA). В эксперименте были использованы модифицированные ст70- и стА-субъединицы, содержащие два флуорофора в районах 2 и 4 (Су5 и группа, хелатирующая ион европия). Для присоединения флуорофоров были использованы варианты ст-субъединиц, содержащие два остатка цистеина в районах 2 и 4 (расположение данных остатков показано на Рис. 2.1). В соответствии с опубликованными данными, было показано, что взаимодействие с кор-ферментом сопровождается значительным увеличением расстояния между районами 2 и 4 и в ст'°, и в аА-субъединицах (Рис. 2.7 и данные не приведены). В то же время, связывание аптамера sEcapl не приводит к изменению.расстояния между доменами 2 и 4 ст-субъединицы (Рис. 2.7). Таким образом, сближение доменов 2 и 4 в свободной ст-субъединице также не может являться основным механизмом ингибирования ДНК-связывающей активности ст.

Итак, можно сделать вывод, что ингибирование узнавания ДНК в свободной ст-субъединице не связано с серьезными структурными перестройками ст-субъединицы. Для связывания ДНК, по-видимому, необходимы локальные конформациояяые изменения, непосредственно затрагивающие ДНК-связывающие сайты ст.

Резюме. Кор-фермент стимулирует ДНК-связывающую активность района 2 ст-субъединицы, вероятно, за счет локальных изменений конформации белка, которые индуцируются ß'-субъединицей РНКП. Свободная ст-субъединица способна узнавать промоторные элементы в составе оцДНК-аптамеров, соответствующих нематричной цепи промотора, при этом узнавание -10, TG и GGGA элементов осуществляется районами 2.3/2.4, 2.4 и 1.2, соответственно. Комплекс с с аптамерами является удобной экспериментальной системой для дальнейших структурных исследований механизмов узнавания промоторов.

3. Роль GGGA-элемента в узнавании промоторов РНКП

з.1. Синтетические промоторы на основе аптамеров

Аптамеры к а-субъединице Т. aquaticus содержат в своем составе несколько мотивов (-10, TG и GGGA-элементы), которые специфически узнаются субъединицей. Это позволило предположить, что аптамерные последовательности в двунитевом состоянии могут являться промоторами, узнаваемыми холоферментом РНКП Т. aquaticus. Действительно, было обнаружено, что РНКП Т. aquaticus (а также РНКП родственной бактерии Т. thermophilic) обладает активностью на двушггевых фрагментах ДНК, содержащих последовательности аптамеров (sTapl-4) (Рис. 3.1 А,Б). Исследование механизмов узнавания данных промоторов было проведено совместно с лабораторией К. Северинова (Waksman Institute, USA). Было установлено, что, как и в случае природных промоторов, инициация транскрипции на данных промоторах происходит на расстоянии 6-7 нуклеотидов от -10 элемента. Анализ последовательностей аптамеров показал, что они не содержат -35 элемента,

и, следовательно, этот элемент не нужен для активности аптамерных промоторов (Рис. 3.1 А). Для более подробного анализа был выбран один из промоторов, sTap2. Замена динуклеотида TG не приводила к инактивации промотора (промотор sTap2-TG, Рис. 3.1 В). В то же время, удаление GGGA-элемента (sTap2-GGGA) полностью инактивировало промотор (Рис. 3.1 В, дор. 3). Таким образом, активность РНКП на промоторе sTap2 в отсутствие -35 элемента обеспечивается присутствием GGGA-злеменгга. Анализ точечных замен в GGGA показал, что для его узнавания важны все четыре нуклеотида, входящие в его состав (Рис. 3.1 Г).

В отличие от РНКП Т. aquaticus, РНКП Е. coli не проявляет активности на промоторах, полученных на основе sTap-аптамеров (Рис. 3.1 Б). Это свойство аптамерных промоторов очень необычно, так как большинство известных природных промоторов узнаются РНКП разных бактерий. Было установлено, что аптамерные последовательности не содержат каких-либо специфических элементов, ингибирующих транскрипцию РНКП Е. coli, так как в присутствии -35 элемента данная РНКП способна эффективно транскрибировать аптамерные матрицы (промоторы sTap2+35, sTap2+35-TG и sTap2+35-GGGA, Рис. 3.1 А,В).

Способность к узнаванию GGGA-содержащих промоторов РНКП Т. aquaticus не связана с термофильной адаптацией, так как РНКП Deinococcus radiodurans, близкородственной мезофильной бактерии, также способна узнавать аптамерные матрицы в отсутствие -35 элемента (Рис. 3.1 Д). В то же время, РНКП мезофильной бактерии Bacillus subtilis не активна на этом промоторе (Рис. 3.1 Д). Таким образом, способность узнавать GGGA-содержащие промоторы в отсутствие -35 элемента, по-видимому, характерна для бактерий группы Thermus/Deinococcus.

sTapl »T»p2 аТарЗ aTap4

sTap2 -TG STap2 -GGGft sTap2 +35 sTap2 +35-TG sTap2 ■35-GGGA

AGAATAAACGCTCAACACGGCCGAGI GCTCAGAATAAACGCTCAAGGCCACI AGAATAAACGCTCAAACCGCGCCGA1 TTCGGGAGCTCAGAATAAACGCTCi

GCTCAGAATAAACGCTCAAGGCCACI GCTCAGAATAAACGCTCAAGGCCACI lACGCTCAAGGCCACf GCTC^^^BAACGCTCAAGGCCACI 3GCTCAAGGCCACG

¡GGAGCACCTA 3CACCTA ¡GGAGCACCTA ¡GGAGCACCTA 3CACCTA

Б sTap 1 2 3 4

РНКП ТЕ ТЕ ТЕ ТЕ

1 2 3 4 5 6 7

3 4 5 6 7

см < о <

а. О u ш >7 ю(')

ß 5 к а 1 о ♦ й

Рис. 3.1. Транскрипционные свойства двуннтевых матриц, полученных на основе sTap-аптамеров. (А) Последовательности матриц на основе аптамеров sTapl-sTap4 (сверху) и различные варианты матриц на основе аптамера sTap2 (снизу). Показан участок от -40 до +5 нт относительно старта транскрипции; -35, TG, -10 и GGGA-элементы выделены синим, зеленым, красным и желтым, соответственно. Стрелкой обозначена стартовая точка транскрипции. Матрицы sTapl-sTap4 различаются по длине участка ДНК справа от стартовой точки. (Б) Синтез полноразмерной РНК на аптамерных промоторах sTapl-sTap4 РНКП Т. aquaticus (Т) и Е. coli (Е). (В) Активность РНКП Т. aquaticus и Е. coli на аптамерном промоторе sTap2 с заменами различных элементов. (Г) Влияние точечных замен в GGGA-элементе на активность РНКП Т. aquaticus на sTap2-np0M0T0pe. «Анти-10» - матрица без -10 элемента; «-6С», «-5С», «-4С», «-ЗТ» - матрицы с точечными заменами в GGGA-элементе (номера соответствует позициям относительно старта транскрипции). (Д) Активность PHKll D. radiodnrans и В. subtilis на промоторах sTap2 и sTap2+35. Активность РНКП Т. aquaticus измеряли при 60 °С, активности остальных РНКП - при 37 °С

3.2. GGGA в природных промоторах Т. aquaticus и Т. thermophilus

Анализ опубликованных последовательностей промоторов Т. aquaticus и Т. thermophilus показал, что некоторые из них содержат GGGA-подобные мотивы справа от -10 элемента (Рис. 3.2 А). Биоинформатический анализ промоторов в геноме Т. thermophilus, проведенный совместно с лабораторией М.С. Гельфанда (Институт проблем передачи информации им. A.A. Харкевича РАН, Москва), позволил установить, что мотивы, родственные GGGA-элементу, могут содержаться примерно в 30% всех промоторов, что указывает на важную функциональную роль данного элемента в их узнавании.

А -35 -10

dnaK CTCCCjraSÄ§fiAAAATGCGGCATGTGCGT-BGCc|GGGAGGCGAGG

s20 caagt^KIccttaggcgcagggtgtgctBc|cIgggccctggtt p35,rpso cctggttgaggggacggggaggagggcc—B|ccIgggtaaggctt

p3j caaggtttacaaaatccccgcccccgtcc-Bgcc|gggggcaagga

t rpE GCCCC|GlgBGGGCCCCCGTGTCCCGC- -|§acC|GAGGCCATGGC

РНКП Taq Eco

dnaK < < f- с ^ -nü s о ч -g < < h s « no

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 3.2. Роль GGGA в узнавании природных промоторов РНКП Т. aquaticus. (А)

Последовательности известных промоторов Т. thermophilus и Т. aquaticus, содержащих GGGA-подобные мотивы (Leontiadou et al., 2001; Maseda and Hoshino, 1995; Osipiuk and Joachimiak, 1997; Sato et al., 1988). -35, -10 и GGGA-элементы показаны синим, красным и желтым, соответственно. (Б) Активность РНКП Т. aquaticus и Е. coli на anöÄ"-np0M0T0pe и его мутантных вариантах (стрелкой показана полноразмерая РНК, синтезируемая на данных матрицах). Активность РНКП Т. aquaticus измеряли при 60 °С, активность РНКП Е. coli - при 37 °С

Для изучения роли GGGA в узнавании природных промоторов мы исследовали один из них, промотор гена dnaK, который содержит GGGA-элемент наряду с -10 и -35 элементами. Было показано, что удаление -35 элемента (мутантный промотор dnaK-35) приводит к заметному снижению, а удаление GGGA-элемента (промотор dnaK-GGGA) - почти к полному исчезновению активности РНКП Т. aquaticus на данном промоторе (Рис. 3.2 Б, дор. 1-3). Одновременная замена обоих элементов (промотор dnaK-35-GGGA) полностью инактивирует промотор (дор. 4). Следовательно, GGGA-мотив в промоторе dnaK специфически узнается РНКП Т. aquaticus и способен обеспечивать инициацию транскрипции данной РНКП в отсутствие -35 элемента. РНКП Е. coli обладает заметно меньшей активностью на с/яо^-промоторе, чем РНКП Т. aquaticus. В то же время, замена GGGA не оказывает влияния на эффективность транскрипции РНКП Е. coli тогда как при замене -35 элемента, либо обоих элементов, активность пропадает (Рис. 3.2 Б). Таким образом, GGGA-элемент играет важную роль в узнавании природных промоторов РНКП Т. aquaticus и обеспечивает межвидовые различия в узнавании GGGA-содержащих промоторов РНКП разных бактерий.

3.3. Узнавание GGGA-элемента РНКП Е. coli

Данные, приведенные в предыдущих разделах, показывают, что РНКП Е. coli и Т. aquaticus узнают промоторы, содержащие GGGA-элемент, с разной специфичностью. Эти различия могли бы объясняться различиями в специфичности узнавания участка промотора, соответствующего GGGA-элементу, с-субъединицами Е. coli и Т. aquaticus. Чтобы установить, способен ли район 1.2 ст70-субъединицы Е. coli узнавать GGGA-элемент, была получена химерная ст-субъединица (аеТ), содержащая N-конец, включая район 1.2, от ст70-субъединицы Е. coli, а С-концевую часть - от аА-субъединицы Т. aquaticus. Было показано, что

Рис. 3.3. Узнавание GGGA-элемента Р11КП Е. coli. (А) Активность РНКП Т. aquaticus (сверху) и Е. coli (снизу), содержащих о*, либо стеГ-субъединицу, на промоторах sTap2 и Т7А1. На рисунке показано положение полноразмерной РНК, синтезируемой на sTap2 (RO, от англ. "run off'), и положение РНК, образующейся в результате герминации транскрипции на tR2-терминаторе на матрице Т7А1 (tR2). (Б) Активность РНКП Е. coli и Т. aquaticus на промоторах sTap2+35 (содержит GGGA) и sTap2+35-GGGA (не содержит GGGA). Слева показано положение

полноразмерной РНК (RO), а также абортивных продуктов, образующихся в ходе инициации транскрипции. Активности PHKI1 Т. aquaticus и Е. coli измеряли при 60 °С и 37 °С, соответственно

холофермент РНКП Т. aquaticus, содержащий химерную сеГ-субъединицу, узнает sTap2-np0M0T0p с той же эффективностью, что и РНКП дикого типа (Рис. 3.3 А). В то же время, гибридные холоферменты, состоящие из кор-фермента Е. coli и стА-субъединицы Т. aquaticus, либо химерной сг-субъединицы, не способны узнавать sTap2-np0M0T0p, хотя и обладают нормальной активностью на контрольном промоторе Т7А1 (сильный промотор бактериофага Т7, содержащий -10 и -35 элементы) (Рис. 3.3 А). Таким образом, район 1.2 <т70-субъединицы способен узнавать GGGA в составе промоторов, а неспособность РНКП Е. coli к инициации транскрипции на GGGA-промоторах в отсутствие -35 элемента, по-видимому, определяется свойствами кор-фермента РНКП.

Так как район 1.2 а'0 способен узнавать GGGA-элемент, мы предположили, что данный элемент может играть роль во взаимодействиях холофермента РНКП Е. coli с промоторами, содержащими -35 элемент. Действительно, сравнение транскрипции на промоторах sTap2+35 и sTap2+35-GGGA показало, что удаление GGGA-элемента приводит к изменению общей картины транскрипции и, в частности, к значительному уменьшению количества коротких абортивных продуктов, синтезируемых в ходе инициации (Рис. 3.3 Б). Таким образом, GGGA-элемент играет функциональную роль в узнавании промоторов РНКП Е. coli (см. также ниже, раздел 4.3.1).

3.4. Структурные элементы РНКП, необходимые для узнавания GGGA-содержащих промоторов

Несмотря на то, что сг-субъединицы РНКП Т. aquaticus и Е. coli узнают GGGA-элемент с одинаковой специфичностью, только РНКП Т. aquaticus способна к инициации транскрипции на GGGA-содержащих промоторах в отсутствие -35 элемента. Очевидно, что способность узнавать данный тип промоторов должна

кор Taq

ДНК sTap2 Т7А1

о Taq еТ Taq еТ

RO»-

tR2

РНКП Eco j Taq I

GGGA + - + -

RO»- IP" »

кор Eco

ДНК sTap2 T7A1

CT Taq eT Taq eT

12 3 4

Рис. 3.4. Влияние делеций аСТО. района 4 а и Аар-домена р~ субъединицы на активность РНКП Т. aquaticus на различных типах промоторов. Активность каждой из РНКП на различных промоторах показана в процентах относительно активности РНКП дикого типа на промоторе зТар2 (в случае различных вариантов зТар2), и Т7А1. Уровень активности измеряли по синтезу полноразмерной РНК на каждой из матриц при 60 °С

определяться не только специфическими взаимодействиями ст с GGGA, но и другими свойствами РНКП. Ранее было показано, что в узнавание промоторов РНКП Е. coli могут вносить вклад неспецифические взаимодействия РНКП с промоторной ДНК, в частности, контакты района 4 ст-субъединицы и aCTD с ДНК в участке левее -35 элемента (Davis et al., 2005; Minakhin and Severinov, 2003; Ross and Course, 2005). Кроме того, было показано, что контакты района 4 ст-субъединицы с ДНК зависят от взаимодействий данного домена с доменом flap («заслонка») ß-субъединицы РНКП (Kuznedelov et al., 2002b; Minakhin and Severinov, 2003).

Для анализа возможной роли этих доменов РНКП Т. aquaticus в узнавании GGGA-содержащих промоторов мы исследовали мутантные варианты РНКП с делециями aCTD, района 4 ст и домена flap ß-субъединицы. Активность мутантных РНКП была измерена на различных вариантах sTap2-npoMOTOpa и на контрольных промоторах Т7А1 (промотор с -10 и -35 элементами) и galPÍ (промотор с удлиненным -10 элементом). Было обнаружено, что все три мутантные РНКП не способны к инициации транскрипции на зТар2-промоторе. В то же время, все исследованные РНКП обладают высокой активностью на промоторе galPl, содержащем TG-элемент (Рис. 3.4). Таким образом, исследуемые домены РНКП Т. aquaticus необходимы для узнавания GGGA-содержащих промоторов в отсутствие -35 элемента. Вероятно, роль этих доменов заключается в стимуляции связывания РНКП с промотором за счет неспецифических взаимодействий с ДНК в области -35 элемента и левее от него, причем домен ßflap, по-видимому, стимулирует контакты района 4 с с ДНК (см. модель на Рис. 2.1).

Все три исследуемые делеции (aCTD, ст4 и ßflap) также нарушают узнавание промоторов Т7А1 и sTap2+35-GGGA, которые содержат своем составе -10 и -35 элементы (Рис. 3.4). Таким образом, данные домены необходимы для эффективного узнавания РНКП Т. aquaticus «классических» промоторов -10/-35-класса. Наиболее интересными свойствами обладает промотор sTap2+35, содержащий -10, -35, GGGA-элементы и узнаваемый РНКП Т. aquaticus с наибольшей эффективностью (Рис. 3.4). Было обнаружено, что, в то время как РНКП с делецией района 4 ст-субъединицы не активна на данном промоторе, делеции aCTD и ßflap существенно не влияют на активность РНКП (Рис. 3.4). Таким образом, одновременное наличие

трех промоторных элементов обеспечивает эффективное узнавание промотора РНКП, даже несмотря на отсутствие контактов aCTD с промоторной ДНК и взаимодействий домена ßilap с районом ст4.

Полученные данные показывают, что для узнавания GGGA-содержащих промоторов РНКП Т. aquaticus необходимы aCTD, о4 и ßflap-домены, которые участвуют в неспецифических взаимодействиях с промоторной ДНК. Вероятно, различия в данных взаимодействиях могут являться основной причиной межвидовых различий в узнавании промоторов данного типа.

Резюме. Охарактеризован новый элемент промоторов бактерий, GGGA-элемент, который расположен справа от -10 элемента и узнается районом 1.2 а-субъединицы. GGGA является промоторным элементом нового типа, который способен определять межвидовые различия в узнавании промоторов; данные различия зависят от неспецифических контактов РНКП с промоторной ДНК. GGGA-элемент расширяет список известных промоторных элементов бактерий, включающий также -10, -35, TG и UP-элементы, причем четыре из перечисленных элементов узнаются различными районами с-субъединицы (Рис. 2.1). Наличие большого числа независимо узнаваемых элементов промотора открывает широкие комбинаторные возможности для создания промоторов, обладающих разным уровнем активности. Использованный нами подход с использованием аптамеров может быть применен в дальнейшем для анализа механизмов узнавания промоторов РНКП различных бактерий и поиска новых промоторных элементов.

4. Механизм образования открытого промоторного комплекса РНКП

4.1. Узнавание шпилечных матриц холоферментом РНКП

После первоначального узнавания промотора, РНКП осуществляет плавление ДНК вокруг стартовой точки транскрипции. Вопрос о том, что является движущей силой данного процесса и каким образом происходит стабилизация расплавленного участка ДНК в составе промоторного комплекса, во многом остается неразрешенным. Было показано, что в плавлении промотора и стабилизации открытого комплекса важную роль играют специфические взаимодействия сг-субъединицы с нематричной цепью ДНК в области -10 элемента (Fenton et al., 2000; Gross et al., 1998). Кроме того, известно, что холофермент РНКП способен взаимодействовать с одноцепочечными матрицами, имеющими структуру шпилек, в которых точка инициации транскрипции находится в однонитевом участке. Примерами таких матриц являются ориджины репликации нитчатых бактериофагов (М13, fd) (Higashitani et al., 1997). Было показано, что для узнавания этих матриц наличие промоторных элементов необязательно (Zenkin and Severinov, 2004). Это позволяет предполагать, что способность холофермента РНКП к узнаванию шпилечной структуры ДНК также вносит вклад в плавление промотора и стабилизацию открытого комплекса.

Чтобы выяснить, какие последовательности ДНК являются оптимальными для связывания с холоферментом РНКП, мы провели отбор аптамеров к холоферментам РНКП Е. coli и Т. aquaticus (раздел 1.3). Аптамеры к холоферментам РНКП Е. coli и Т. aquaticus были названы hEcap (от holo К coli aptamer) и hTap (holo Т. aquaticus

hTap12 hEcap5 hEcap6

AGTGAGTGATGGGCTCGTGTTATACTAACTAT TCGGAGGACAGAACCGGTCTCGrGTACAATAA TTTA0TpACACTATATGATCTTACÄTAATAT

5'-С - T C- G G-A -G- С

hTap12

5'-G С С T С G С G G А G Т

А А

'hEcap5 А

UpApU -

-Lg ЬЕСаРб U-i-e^Q.^_)

'-т-'" (JpA+UTP

Рис. 4.1. Структура и транскрипционные свойства аптамеров к холоферменту Р11КП. (А)

Последовательности аптамеров к холоферментам РНКП Т. aquaticus (hTapl2) и Е. coli (hEcap5, ЬЕсарб). Показаны центральные части аптамеров без константных районов библиотеки. Красным и зеленым выделены мотивы, соответствующие -10 и TG-элементам. (Б) Предполагаемая вторичная структура аптамеров. Промоторные элементы (-10 и TG) обозначены красным и зеленым, соответственно. Участок, внесенный в аптамер ЬЕсарб для исследования инициации транскрипции, обозначен синей линией. Стартовая точка транскрипции показана стрелкой; указаны -1 и +1 позиции, которым соответствует динуклеотидная затравка UpA. (Б) Транскрипционная активность РНКП Е. coli на шпилечных матрицах, полученных на основе аптамера ЬЕсарб. WT — исходный аптамер; -TG — аптамер с заменой TG на СС; -ТАСАСТ — аптамер с заменой -10 элемента на ТСАССА. Реакцию проводили в присутствии всех четырех нуклеотидов (с добавлением ct-[32P]-UTP) и затравки UpA

щЯатег), соответственно. Анализ последовательностей аптамеров показал, что большинство из них содержат Тв и -10-элементы промотора (Рис. 4.1 А) и образуют структуру шпилек, в которых Тв-элемент входит в состав двунитевой части, а -10 элемент находится в составе петли в однонитевом состоянии (при этом размер петли различается у разных аптамеров) (Рис. 4.1 Б). Данная структура соответствует структуре расплавленного участка промотора в области -10 элемента.

Аптамеры связываются с РНКП с высокой аффинностью (Кд 1 -5 нМ), которая сравнима с аффинностью холофермента к промоторам. Замены ТО и -10-элементов нарушают узнавание аптамеров (Кд > 100 нМ) и, следовательно, для узнавания аптамеров важна как специфическая шпилечная структура, так и наличие в их составе промоторных элементов.

Аптамеры к холоферментам РНКП Е. соИ и Т. адиснюш имеют сходную структуру (Рис. 4.1 А). Некоторые из изученных аптамеров способны взаимодействовать с обеими РНКП (например, аптамеры 11Есар2, ЬЕсарб). Таким образом, способность узнавать данный тип ДНК-матриц может являться общим

свойством РНКП различных бактерий. В то же время, некоторые из аптамеров специфичны к своей РНКП-мишени (например, аптамеры ЬЕсар5 и ЬТар12 к РНКП Е. coli и Т. aquaticus, соответственно). Вероятно, дальнейший анализ аптамеров может привести к выявлению дополнительных промоторных мотивов, определяющих видоспецифические различия в узнавании промоторов.

Чтобы установить, способны ли аптамеры служить матрицами для специфической инициации транскрипции, мы исследовали транскрипционные свойства одного из аптамеров к холоферменту РНКП Е. coli, ЬЕсарб. В этом аптамере в участок, соответствующий возможной точке инициации транскрипции, было внесено несколько дополнительных нуклеотидов, что позволяло исследовать процесс инициации (Рис. 4.1 А). Было обнаружено, что РНКП Е. coli способна синтезировать на данном аптамере тринуклеотидный РНК-продукт, используя в качестве инициаторных субстратов динуклеотидную затравку (UpA) и следующий за ней нуклеотид (UTP) (Рис. 4.1 Б). Узнавание данной матрицы высокоспецифично, поскольку замена TG элемента нарушает, а замена -10 элемента полностью подавляет специфическую инициацию транскрипции (Рис. 4.1 Б). Таким образом, аптамеры являются удобной моделью для исследования механизмов инициации транскрипции.

Полученные данные показывают, что оптимальными для узнавания холоферментом РНКП являются ДНК-субстраты, имеющие шпилечную структуру, и содержащие в составе шпильки -10 и TG-элементы промотора. Способность узнавать данный тип ДНК-структур, по-видимому, лежит в основе плавления промоторов холоферментом РНКП.

4.2. Механизм открывания промотора

Как уже говорилось выше, детальный механизм плавления ДНК, осуществляемого РНКП в ходе инициации, остается неизвестным. На основе биохимических данных и анализа мутаций в ст10-субъединице РНКП Е. coli было установлено, что важную роль в открывании промоторов играют взаимодействия

- 70

консервативных ароматических аминокислотных остатков в районе 2 с-субъединицы с нематричной цепью ДНК в области -10 элемента (Рис. 4.2) (Fenton et al., 2000; Panaghie et al., 2000; Tomsic et al., 2001). Предполагается, что основную роль в инициации плавления играют остатки Y430 и W433 ст70-субъединицы, которые взаимодействуют с остатком А во втором положении -10 элемента (см. ниже, Рис. 4.4) (Schroeder et al., 2007). В то же время, роль неконсервативных аминокислот района 2, а также участие других районов ст-субъединицы и кор-фермента в плавлении ДНК исследованы не были. Кроме того, оставалось неизвестным, существуют ли межвидовые различия в механизмах открывания промоторов РНКП разных бактерий.

4.2.1. Открывание промоторов РНКП мезофилов и термофилов

Для анализа механизма образования открытого промоторного комплекса и выявления межвидовых различий в инициации транскрипции мы провели сравнение транскрипционных свойств РНКП мезофильных и термофильных бактерий. Ранее было показано, что для РНКП термофильных бактерий характерна сниженная активность (холодочувствительность) при температурах, являющихся оптимальными для ферментов мезофильных бактерий (<37 °С) (Meier et al., 1995;

2.2

мк

2.3

Jt*

390 400 410 420 430 440 450

!_I_I I ......... i |

esIÂKKÏTHFGLQFLDLIQEGHIGLMKAVDKFEÏREGrKFSTyAIWISOAITRSIADCAlîriRIPVH

I.......I. . .|.........I. .■. .1____..............|.|.............

§.......g...e.........fi..ir. .¡j......r............................

В I.........Й-.

.........fi..

IR. .E. IR..É.

.S-RÏ. .lï.rf.

щ.......s.. .s.........q. .m..«...

v.......3 s.........fi-B-f " ■

g. . . R.VG. .ML.....H. . .M......B. .D

T t TT

K.RF.

RPo, 20°C

Рис. 4.2. Выравнивание последовательностей района 2 ст-субъединиц Е. coli (Eco), T. aquaticus

(Taq) и D. radiodurans (Dra). Границы подрайонов района 2 показаны над выравниванием (подрайон 2.1 - зеленый, подрайон 2.2 - синий, подрайон 2.3 - желтый, подрайон 2.4 -сиреневый). Цифрами над выравниванием указаны номера аминокислотных остатков в <т7"-субъединице Е. coli. Звездочками обозначены аминокислотные остатки, замены которых в а70-субъединице нарушают плавление промотора (Fenton et al., 2000; Panaghie et al., 2000; Tomsic et al., 2001). Остатки, отличающиеся в стА-субъединицах T. aquaticus и D. radiodurans от a70-субъединицы E. coli, показаны красным. В нижней части выравнивания показаны последовательности мозаичных вариантов ст70-субъединицы, содержащих различные комбинации замен в районе 2. В нижней строчке показана последовательность района 2 <тА-су6ъединицы В. subtilisa серым цветом обозначены аминокислотные остатки, отличающиеся от a-субъединиц Е. coli, Т. aquaticus и D radiodurans. Данные о плавлении промотора РНКП Е. coli, содержащими мозаичные ст-субъединицы, при 20 °С, приведены справа от выравнивания (RPo - открытый промоторный комплекс). Стрелками под выравниванием показаны неконсервативные остатки, замены которых оказывают наибольшее влияние на температуру плавления промотора

Minakhin et al., 2001; Xue et al., 2000). Было предположено, что данная особенность связана с термофильной адаптацией бактерий, однако, прямых исследований, подтверждающих это, не проводилось. Мы сравнили характеристики промоторных комплексов РНКП нескольких мезофильных и термофильных бактерий, что позволило выявить структурные элементы РНКП, участвующие в плавлении промоторов и стабилизации комплексов, а также установить взаимосвязь между транскрипционными свойствами РНКП и температурной адаптацией бактерий.

В качестве модельных ферментов для исследований были использованы: (1) РНКП термофильных бактерий Т. aquaticus и Т. thermophilus - бактериальные РНКП, для которых известна трехмерная структура, (2) РНКП мезофильной бактерии Е. coli - данная РНКП лучше всего изучена биохимическими и генетическими методами, (3) РНКП мезофильной бактерии D. radiodurans, которая является ближайшим родственником Т. aquaticus и Т. thermophilus (Makarova et al., 2001), - близкое филогенетическое родство этих бактерий позволяет выявить различия в свойствах данных РНКП, непосредственно связанные с различной температурной адаптацией.

Для изучения механизма образования открытого промоторного комплекса РНКП Е. coli, Т. aquaticus и D. radiodurans мы исследовали плавление промоторов данными РНКП при разных температурах (Рис. 4.3). Для детекции плавления ДНК был использован метод футпринтинга перманганатом калия, который позволяет специфически модифицировать тиминовые основания в однонитевой ДНК. Было показано, что, в соответствии с опубликованными данными, РНКП Е. coli способна

кор Eco Taq Dra

а Eco Taq Dra Taq Dca

t, °С M 20 45 65 :o 45 65 20 45 65 20 45 65 20 45 65 M

-3, -5

+3. +4

-ГТ1 -m

§ я !

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 121314151617

Рис. 4.3. Плавление /acUV5-npo.viOTopa РПКП Е. coli (Eco), T. aquaticus (Taq) и D. radiodurans (Dra). Плавление ДНК детектировали при помощи КМ11О4-футпринтинга на промоторном фрагменте, содержащем метку в нематричной цепи. Стрелками указаны продукты расщепления ДНК по остаткам тимина в расплавленной области промотора, цифры обозначают позиции нуклеотидов относительно стартовой точки транскрипции. На крайние дорожки нанесен маркер (М), полученный при расщеплении ДНК по остаткам А и G

открывать промотор как в условиях температурного оптимума (45 °С), так и при более низкой температуре (20 °С) (Рис. 4.3, дор. 2 и 3). В то же время, данная РНКП термочувствительна и не активна при высоких температурах (65 °С) (дор. 4). РНКП T. aquaticus, напротив, открывает промотор при 45 и 65 °С, но не способна к плавлению ДНК при 20 °С (дор. 11-13). РНКП D. radiodurans открывает промотор при 45 °С, но не плавит ДНК при 20 и 65 °С (дор. 14-16). Таким образом, РНКП мезофильной бактерии D. radiodurans проявляет такую же холодочувствительность открывания промоторов, как и РНКП T. aquaticus. Следовательно, вопреки высказанной ранее гипотезе, холодочувствительность открывания промоторов РНКП термофильных бактерий может быть напрямую не связана с с адаптацией клеток к высоким температурам.

Для того, чтобы установить, какой компонент РНКП - кор-фермент или ст-субъединица, - отвечает за наблюдаемые различия в температуре открывания промоторов, мы исследовали плавление ДНК гибридными холоферментами, состоящими из кор-фермента Е. coli и ст-субъединиц Т. aquaticus и D. radiodurans. Было установлено, что данные холоферменты также не способны открывать промотор при 20 °С (Рис. 4.3, дор. 5-10). Таким образом, холодочувствительность открывания промоторов РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans определяется свойствами ст-субъединицы РНКП.

4.2.2. Участки ст-субъединицы, определяющие температуру открывания промоторов

Различия в температуре открывания промоторов РНКП Е. coli, Т. aquaticus и D. radiodurans были использованы для поиска функционально-важных участков ст-субъединицы, задействованных в плавлении промоторов. С этой целью были сконструированы три мозаичных варианта ст70-субъединицы Е. coli с заменой отдельных районов на гомологичные последовательности Т. aquaticus (ст ЕЕТ, ETE и TEE). В ст ЕЕТ была заменена С-концевая часть, включающая районы 3 и 4, в ст ETE - район 2, а в ст TEE - N-концевая часть, включающая район 1 и неконсервативный участок между районами 1 и 2. Анализ плавления промотора РНКП Е. coli, содержащими мозаичные ст-субъединицы, показал, что холодочувствительность открывания промоторов наблюдается только в случае ст-

субъединиц ETE и TEE, а ст ЕЕТ не отличается от 07о-субъединицы по эффективности плавления ДНК при 20 °С (данные не приведены). Таким образом, холодочувствительность открывания промоторов сг-субъединицей T. aquaticus определяется N-концевой частью белка и консервативным районом 2. N-концевая часть ст значительно различается у Е. coli и Т. aquaticus, что затрудняет поиск индивидуальных аминокислотных остатков, ответственных за различия в температуре открывания промоторов. В то же время, в районе 2 огА-субъединицы Т. aquaticus имеется всего 12 аминокислотных замен, а в аА-субъединице D. radiodurans - 10 замен по сравнению с ст70-субъединицей Е. coli (Рис. 4.2).

Для анализа влияния индивидуальных аминокислотных замен в районе 2 на температуру плавления промоторов был получен набор мозаичных вариантов ст70-субъединицы с различными комбинациями замен, присутствующих в разных подрайонах района 2 ст-субъединиц Т. aquaticus и D. radiodurans (Рис. 4.2). Исследование плавления промоторов РНКП, содержащими данные ст-субъединицы, позволило установить, что замены аминокислот в подрайонах 2.3 и 2.4 (ст МЗ, М4 и МЗ-4) не нарушают, а замены в подрайонах 2.1 и 2.2 (ст Ml-2) несколько ослабляют плавление промотора при 20 °С. В то же время, холодочувствительность, характерная для ст-субъединицы Т. aquaticus, наблюдается только в случае ст-субъединиц, содержащих комбинации замен в подрайонах 2.1-2.2 и 2.3 или 2.4 (ст М1-3 и М1-2;4) (Рис. 4.2). Таким образом, холодочувствительность открывания промоторов объясняется комбинированным эффектом аминокислотных замен в различных подрайонах района 2 ст-субъединицы.

Некоторые из этих замен присутствуют также в стл-субъединице мезофильной бактерии В. subtilis (Рис. 4.2). РНКП, содержащая мозаичную ст-субъединицу ЕВЕ с заменой района 2 на соответствующую последовательность В. subtilis, не проявляет холодочувствительности открывания промоторов. Таким образом, замены, присутствующие в стА В. subtilis, не влияют на плавление промоторов. Оставшиеся 6 замен (обозначенные стрелками на рисунке Рис. 4.2 и показанные желтым на Рис. 4.4), которые с наибольшей вероятностью влияют на плавление ДНК, можно разделить на три группы.

1) Замены Q400S, I410Q и M413I затрагивают аминокислоты, взаимодействующие с ß'-субъединицей кор-фермента РНКП (Рис. 4.4). Эффект этих замен, по-видимому, объясняется изменением контактов ст с кор-ферментом, что может приводить к изменению локальной конформации подрайонов 2.3 и 2.4, непосредственно взаимодействующих с ДНК.

2) Замена G425R в подрайоне 2.3 располагается в петле, соединяющей две а-спирали, взаимодействующих с кор-ферментом и с ДНК. Вероятно, эта замена приводит к снижению конформационной подвижности района 2 ст-субъединицы, что затрудняет плавление промотора.

3) Замены K414R и T440N в подрайонах 2.2 и 2.4 затрагивают аминокислоты, которые, по структурным и биохимическим данным, напрямую взаимодействуют с ДНК при узнавании и открывании промотора (Fenton et al., 2000;Tomsic et al., 2001). Данные замены, вероятно, непосредственно влияют на процесс плавления ДНК.

Таким образом, замены неконсервативных аминокислот в различных участках района 2 ст-субъединицы совместно влияют на температуру открывания промоторов, за счет изменения конформационной подвижности ст-субъединицы и

л/м V

Рис. 4.4. Структура района 2 ст-субъединицы РНКП. Рисунок основан на данных о структуре холофермента РНКП Т. thermophilus (Vassylyev et al, 2002). Изображен район 2 ст-субъединицы, подрайоны 2.1, 2.2, 2.3 и 2.4 обозначены теми же цветами, что на Рис. 4.2. Расположение -10 элемента в нематричной цепи ДНК показано пунктирной линией. Консервативные остатки Y430 и W433, взаимодействующие с -10 элементом и инициирующие плавление ДНК, изображены темно-желтым. Боковые цепи остатков, различающихся в ry Е. coli и Т. aquaticus, изображены светло-желтым (замены, влияющие на температуру плавления промотора) и красным (замены, не влияющие на температуру плавления). Темно-синим изображен участок Р'-субъединицы (остатки 263-307), взаимодействующий с районом 2 сг-субъединицы

ее контактов с кор-ферментом и с ДНК. Нами впервые установлено, что неконсервативные аминокислотные остатки с-субъединицы играют важную роль в плавлении промоторов, а их замены у разных бактерий могут обеспечивать изменения в транскрипционных свойствах РНКП.

4.3. Механизмы стабилизации промоторного комплекса

Важной характеристикой промоторного комплекса является уровень его стабильности, от которого зависит эффективность инициации транскрипции. Изменение стабильности промоторных комплексов может служить одним из эффективных механизмов регуляции транскрипции (Gourse et al., 1998; Gross et al., 1998). Анализ различных природных промоторов Е. coli и их мутантных вариантов позволил установить, что стабильность промоторных комплексов РНКП зависит от последовательности промотора; наличие консенсусных промоторных элементов (-10, -35, TG и UP) увеличивает стабильность (Gourse et al., 1998; McClure, 1985). Однако, влияние других участков промотора на стабильность промоторного комплекса исследовано не было. Функции различных структурных элементов РНКП в стабилизации промоторных комплексов также изучены слабо. Было показано, что на стабильность промоторных комплексов влияют мутации в ст-субъединице (Fenton et al., 2000; Gross et al., 1998; Vuthoori et al., 2001), а также в кор-ферменте РНКП Е. coli (Ederth et al., 2002; Nechaev et al., 2000). Таким образом, стабильность комплексов, по-видимому, определяется различными типами контактов РНКП с промоторной ДНК. РНКП разных бактерий могут значительно различаться по стабильности промоторных комплексов. Так, РНКП Е. coli образует на большинстве промоторов очень стабильные комплексы (время полужизни до

нескольких часов) (McClure, 1985). РНКП В. subtilis и Rickettsia prowazekii, напротив, образуют нестабильные комплексы (Aniskovitch and Winkler, 1995; Artsimovitch et al., 2000). Молекулярные механизмы, лежащие в основе данных различий, оставались неизвестны. Задачей данной части нашей работы являлся анализ механизмов стабилизации промоторных комплексов РНКП различных бактерий.

4.3.1. Роль GGGA-элемента в стабилизации промоторных комплексов

Как было показано ранее, важнейшим фактором, определяющим стабильность промоторных комплексов, являются контакты РНКП с консервативными промоторными элементами (Gross et al., 1998; Haugen et al., 2008a; McClure, 1985). В нашей работе был охарактеризован новый промоторный элемент GGGA (см. выше, раздел 3), который также может вносить вклад в стабилизацию связывания РНКП с промотором. Для анализа возможной роли GGGA-элемента в стабилизации промоторных комплексов мы сравнили стабильность промоторных комплексов РНКП Е. coli и T. aquaticus на двух вариантах промотора sTap2, содержащих -35 элемент и различающихся наличием или отсутствием GGGA-элемента (sTap2+35 и sTap2+35-GGGA). Измерение кинетики диссоциации промоторных комплексов РНКП Е. coli в присутствии гепарина (конкурентного ингибитора связывания ДНК) показало, что наличие GGGA-элемента обеспечивает значительную стабилизацию комплексов. Было показано, что замена GGGA на СССТ приводит к уменьшению времени полужизни комплексов примерно в 100 раз, с 60 минут до 40 секунд (Рис. 4.5). Удаление GGGA из промотора также приводит к значительному уменьшению стабильности промоторных комплексов РНКП Т. aquaticus (данные не приведены). Таким образом, проведенные нами эксперименты позволили установить, что GGGA-элемент играет важную роль в инициации транскрипции РНКП разных бактерий, за счет усиления контактов РНКП с промотором.

Стоит отметить, что некоторые промоторы Е. coli (в частности, промоторы рибосомальной РНК, генов биосинтеза аминокислот и нуклеотидов) содержат справа от -10 элемента, в районе, соответствующем GGGA-элементу, C/G-богатый участок (с преобладанием С в нематричной цепи ДНК), который получил название дискриминатора (Travers, 1980). Ранее было показано, что наличие дискриминатора определяет низкую стабильность комплексов, образованных РНКП на таких промоторах (Gourse et al., 1998). Полученные нами данные позволяют утверждать,

GGGA + —

мин. 0 1 3 10 30 60 120 0 1 3 10 30 60 120

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 4.5. Роль GGGA-элемента в стабилизации промоторных комплексов РНКП. Показана кинетика диссоциации промоторных комплексов РНКП Е. coli на промоторах sTap2+35 (содержит GGGA) и sTap2+35-GGGA (не содержит GGGA) в присутствии гепарина. Активность РНКП измеряли по синтезу полноразмерной РНК через увеличивающиеся промежутки времени после добавления гепарина

что нестабильность промоторных комплексов в данном случае определяется нсогггамалыюй последовательностью ДНК в участке дискриминатора и отсутствием стабилизирующих контактов района 1.2 а-субъединицы с нематричной цепью ДНК. Аналогичный вывод был сделан недавно при исследовании механизмов взаимодействий РНКП Е. coli с промоторами рибосомальной РНК (Haugen et al., 2006; Haugen et al., 2008b).

4.3.2. Роль контактов кор-фсрмснта РНКП с ДНК спереди по ходу транскрипции в стабилизации промоторных комплексов

Неспецифические контакты кор-фермента РНКП с различными участками промотора, вероятно, также играют важную роль в стабилизации промоторных комплексов. В то же время, экспериментальные данные о роли данных контактов достаточно фрагментарны. Было показано, что делеция домена jaw («челюсть») ß'-субъедшшцы и мутации в домене ß2 ß-субъединицы в кор-ферменте РНКП Е. coli приводят к заметному снижению стабильности промоторных комплексов (Ederth et al., 2002; Martin et al., 1992; Nechaev et al., 2000). Эти домены, вероятно, контактируют с промоторной ДНК спереди по ходу транскрипции (см. Рис. 1.5 и Рис. 2.1). Кроме того, было обнаружено, что РНКП В. subtilis, которая образует нестабильные промоторные комплексы, имеет более короткий футпринт спереди от стартовой точки транскрипции, чем РНКП Е. coli (Artsimovitch et al., 2000). Это позволяет предположить, что в стабилизацию промоторных комплексов основной вклад вносят контакты кор-фермента с ДНК спереди по ходу транскрипции.

Для поверки этой гипотезы мы исследовали мутации в двух участках кор-фермента РНКП, которые, согласно данным рентгеноструктурного анализа и молекулярного моделирования, контактируют с ДНК спереди от активного центра РНКП (Рис. 2.1). Нами были изучены следующие мутации в кор-ферменте РНКП Е. coli: (1) инсерция восьми аминокислот (His6GlnLeu) в домене clamp («зажим») ß'-субъединицы (fiß'), затрагивающая петлю, которая контактирует с передним дуплексом ДНК в +10, +11 положениях относительно активного центра (Рис. 2.1); (2) точечные замены остатка Arg339 на Lys, Ala и Glu в участке switch2 ß'-субъединицы; этот остаток контактирует с 5'-фосфатом +2 нуклеотида в матричной цепи ДНК в элонгационном комплексе (Рис. 2.1; см. также ниже, Рис. 5.1). Функции данных участков во взаимодействиях РНКП с промоторами ранее не исследовались.

Анализ транскрипции РНКП Qß' на промоторе Т7А1 показал, что инсерция в домене clamp приводит к значительной дестабилизизации промоторных комплексов (Рис. 4.6 А). Транскрипционные свойства РНКП с заменами остатка Arg339 в районе switch2 ß'-субъединицы были исследованы на промоторе ?.PR (Рис. 4.6 Б). Было установлено, что замены Arg339 на Glu и Ala в сильно снижают стабильность промоторного комплекса (время полужизни уменьшается более чем в 100 раз), а замена на Lys имеет более слабый эффект (время полужизни уменьшается в 20 раз). Полученные данные показывают, что район switch2, вероятно, напрямую контактирует с ДНК в промоторном комплексе. Более сильный эффект первых двух замен, по-видимому, связан с тем, что они полностью нарушают контакты района switch2 с ДНК, в то время как в случае третьей замены, оставляющей положительно заряженную аминокислоту в позиции 339, контакты с ДНК сохраняются. В целом, полученные данные указывают на важную роль контактов кор-фермента РНКП с ДНК спереди по ходу транскрипции стабилизации промоторных комплексов.

РНКП WT пр'

гепарин - + - +

20-

12 3 4

1 10 100 Время, мин.

Рис. 4.6. Влияние мутаций в ß'-субъединице РНКП Е. coli на стабильность промоторных комплексов. (А) Влияние инсерции His6GhiLeu в домене clamp ß'-субъединицы (Oß') на стабильность комплексов РНКП на Т7А1-промоторе. Активность РНКП измеряли в отсутствие гепарина или через 5 минут после добавления гепарина (50 мкг/мл). Показан РНК-продукт длиной 20 нт. (Б) Влияние замен остатка Arg339 в районе switch2 на стабильность комплексов РНКП на 1Рк.-промоторе. К промоторным комплексам добавляли гепарин и измеряли активность РНКП через увеличивающиеся промежутки времени (в реакции СрА-ЧЛ?—»CpApU). Активность показана в процентах от активности в отсутствие гепарина

4.3.3. Различия между РНКП Е. coli, Т. aquaticus и D. radiodurans

Следующей задачей нашей работы был поиск структурных элементов РНКП, которые могли бы определять межвидовые различия в стабильности промоторных комплексов. В качестве модельных ферментов были использованы РНКП Е. coli, D. radiodurans и Т. aquaticus. Было установлено, что РНКП Т. aquaticus образует гораздо менее стабильные промоторные комплексы, чем РНКП Е. coli. Так, время полужизни промоторных комплексов Т. aquaticus РНКП на Т7А1 промоторе составляет менее 30 секунд, по сравнению с -60 минутами для РНКП Е. coli (Рис. 4.7 А). Аналогичный результат был получен при исследовании транскрипции РНКП Т. aquaticus на других промоторах, в том числе на природных промоторах данной РНКП (dnaK) и на синтетических промоторах, полученных на основе аптамеров (sTap2). Данная особенность не связана с термофильной адаптацией, так как РНКП мезофильной бактерии D. radiodurans также образует нестабильные промоторные комплексы. Вероятно, низкая стабильность промоторных комплексов РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans может быть связана с особенностями регуляции транскрипции у этих бактерий.

Чтобы установить, какой из компонентов холофермента — кор-фермент или а-субъединица, - определяет обнаруженные различия в стабильности промоторных комплексов, мы исследовали гибридные холоферменты, состоящие из кор-фермента Е. coli и а-субъединиц Т. aquaticus или D. radiodurans. Было установлено, что промоторные комплексы гибридных РНКП обладают промежуточной стабильностью (Рис. 4.7 А). Таким образом, различия в стабильности комплексов РНКП Е. coli, D. radiodurans и Т. aquaticus определяются как ст-субъединицей, так и кор-ферментом РНКП. Различия, определяемые кор-ферментом РНКП, могут быть

Время, мин. Гепарин, мкг/мл

Рис. 4.7. Стабильность комплексов РПКП Е. coli и T. aquaticus на Т7А1-промоторе. (А)

Кинетика диссоциации промоториых комплексов РНКП Е. coli, Т. aquaticus и гибридной РНКП, состоящей из кор-фермента Е. coli и (Асубъединицы Т. aquaticus (при температурах 37, 60 и 45 "С, соответственно). К преформированзшм комплексам РНКП с Т7А1-промотором добавляли гепарин (до 10 мкг/мл) и измеряли активность РНКП через увеличивающиеся промежутки времени. (Б) Стабильность промоторных комплексов РНКП Е. coli, содержащей различные ст-субъедшшцы (ст70, ст*, ЕЕТ, ETE и TEE), в присутствии гепарина (при температуре 45 °С). К промоторным комплексам добавляли гепарин в увеличивающихся концентрациях, образцы инкубировали 10 минут и измеряли активность РНКП. Уровень активности показан в процентах от активности в отсутствие гепарина

связаны с особенностями структуры районов clamp и switch2 ß'-субъсдшшцы, контактирующих с ДНК спереди по ходу транскрипции (см выше, раздел 4.3.2). Действительно, было установлено, что, по сравнению с РНКП Е. coli, РНКП Т. aquaticus в промоторных комплексах имеет укороченный футпринт спереди по ходу транскрипции (Kuznedclov et al., 2003).

Для выявления районов ст-субъединицы, участвующих в стабилизации промоторных комплексов и определяющих различия в стабильности комплексов между РНКП Е. coli и Т. aquaticus, мы исследовали холоферменты, состоящие из кор-фермента Е. coli и мозаичных а-субъединиц ЕЕТ, ETE и TEE (см. выше, раздел 4.2.2). В результате было установлено, что сниженной стабильностью промоторных комплексов обладает только РНКП, содержащая с TEE (Рис. 4.7 Б), в то время как остальные две РНКП не отличаются по стабильности от холофермента Е. coli, ст-субъединица TEE содержит N-концевую часть ст-субъединицы Т. aquaticus, включающую консервативные районы 1.1 и 1.2. Таким образом, межвидовые различия в стабильности промоторных комплексов могут определяться различиями в структуре данных районов ст-субъединицы.

Стоит отметить, что ранее было показано, что на стабильность промоторных комплексов влияют мутации консервативных аминокислот в районе 2 (Fenton et al., 2000), а также мутации в районах 1.1 и 1.2 ст70-субъединицы РНКП Е. coli (Vuthoori et al., 2001). Эффект мутаций в районе 2 был объяснен изменением контактов с -10 элементом и нарушением плавления ДНК, в то время как возможная функциональная роль районов 1.1 и 1.2 ст в стабилизации промоторных комплексов оставалась неясной.

Район 1.1 ст в холоферменте РНКП располагается в ДНК-связывающем канале спереди по ходу транскрипции (Рис. 2.1) (Mekler et al., 2002; Vassylyev et al., 2002). Можно предположить, что этот район влияет на стабильность комплексов за счет

конкуренции с передним дуплексом ДНК при образовании промоторного комплекса. Роль района 1.2 в стабилизации комплексов может объясняться его контактами с кор-ферментом РНКП, а также с промоторной ДНК в области GGGA-элемента (см. Рис. 2.1). Действительно, как было установлено в нашей работе, контакты района 1.2 ст-субъединицы с GGGA обеспечивают значительную стабилизацию промоторных комплексов (раздел 4.3.1). Различия в структуре контактов района 1.2 с ДНК, вероятно, могут определять различия в стабильности промоторных комплексов РНКП разных бактерий.

Резюме. РНКП Е. coli, D. radiodurans и Т. aquaticus различаются по температуре открывания промоторов и стабильности промоторных комплексов. Данные различия не связаны с термофильной адаптацией. Для поиска функционально-важных участков РНКП разработан новый методический подход, который заключается в анализе химерных ферментов, содержащих последовательности, взятые от разных бактерий. Показано, что различия в температуре открывания промоторов разными РНКП определяются неконсервативными аминокислотами консервативного района 2 ст-субъединицы и N-концевой частью ст-субъединицы; различия в стабильности промоторных комплексов определяются N-концевой частью ст-субъединицы, а также кор-ферментом РНКП. Важную роль в стабилизации промоторных комплексов играют специфические контакты ст-субъединицы с участком ДНК правее -10 элемента (в области GGGA-элемента), а также неспецифические контакты кор-фермента с ДНК спереди по ходу транскрипции.

5. Механизм инициации синтеза РНК

5.1. Роль ст-субъединицы в инициации синтеза РНК

Важнейшим отличием РНКП от ДНК-полимераз является способность к инициации синтеза РНК de novo, то есть в отсутствие затравки. Одной из главных задач нашей работы была расшифровка механизма беззатравочной инициации синтеза РНК в активном центре РНКП. Анализ трехмерной структуры холофермента РНКП Т. thermophilus показал, что в непосредственной близости от активного центра фермента располагается петля, образованная районом 3.2 а-субъедикицы (Рис. 5.1). На основании этого было предположено, что данный район ст может принимать непосредственное участие в инициации синтеза РНК (Murakami et al., 2002b; Vassylyev et al., 2002). Для проверки этого предположения мы получили и исследовали ст70-субъединицу Е. coli с делецией аминокислот 513-519 (DDEDSHL) в центральной части петли, образованной районом 3.2 (Рис. 5.1).

Активность РНКП, содержащей мутантную ст-субъединицу, была исследована на промоторе Т7А1, а также на варианте данного промотора, содержащем консенсусные -10 и -35 элементы (T7Alcons). Было показано, что РНКП дикого типа активна на обоих промоторах, при этом в случае T7Alcons образуется значительно большее количество абортивных продуктов (Рис. 5.2, дор. 1 и 2). В то же время, РНКП, содержащая стД513-519, практически неактивна на обеих матрицах (Рис. 5.2, дор. 5 и 6). Контрольные эксперименты показали, что мутация не влияет на открывание промотора (данные не приведены), и, следовательно,

Рис. 5.1. Модель активного центра РНКП в процессе инициации (на основе модели промоторного комплекса РНКП Т. themophilus, (Artsimovitch et al., 2004)). Два иона Mg2' в активном центре изображены сферами алого цвета, темно-красным показана F-спираль ß'-субъединицы. Матричная цепь ДНК — темно-синяя, З'-инициаторный нуклеотид в "i+Г'-сайте активного центра - зеленый, 5'-инициаторный нуклеотид в "¡"-сайте — голубой, ст-субъединица изображена желтым, район 3.2 показан в виде объемной атомной модели. Снизу изображен район switch2 ß'-субъединицы; белым показана структура данного района в кор-ферменте (Zhang et al., 1999), красным — в холоферменте РНКП. Остаток Arg339 (нумерация Е. coli) контактирует с фосфатом в +2 положении матричной цепи ДНК. Синтезируемая молекула РНК показана красным

отсутствие активности у мутантной РНКП должно объясняться дефектами непосредственно в инициации синтеза РНК.

Для проверки этой гипотезы мы измерили активность РНКП с делецией в районе 3.2 ст в присутствии динуклеотидной затравки, соответствующей стартовой точке транскрипции. Наличие затравки значительно стимулировало активность мутантной РНКП (Рис. 5.2, дор. 7 и 8). Таким образом, эффект мутации должен быть связан с нарушением связывания инициаторных субстратов и образования первой фосфодиэфирной связи в ходе инициации.

Для анализа влияний делеции в районе 3.2 ст на связывание субстратов мы измерили кажущиеся Км для инициаторных нуклеотидов в реакции динуклеотидного синтеза на Т7А1 промоторе (ATP+UTP—>pppApU). Было установлено, что делеция практически не влияет на связывание 5'-инициаторного нуклеотида (АТР) (Км 450 мкМ по сравнению с 470 мкМ для РНКП дикого типа, Рис. 5.3). Это согласуется с имеющимися в литературе данными о том, что сайт связывания 5'-инициаторного нуклеотида полностью сформирован кор-ферментом РНКП (Naryshkina et al., 2001). В то же время, делеция района 3.2 приводит к существенному, почти 100-кратному увеличению Км для З'-инициаторного нуклеотида (UTP) (Км 250 мкМ по сравнению с 3,3 мкМ для РНКП дикого типа, Рис. 5.3). Таким образом, район 3.2 ст-субъединицы играет важную роль в инициации синтеза РНК в активном центре РНКП и стимулирует связывание З'-инициаторного нуклеотида.

а WT 513-519

СрА - + - +

Т7А1 W с W с W С W с

/ 16

/ 15

___ 13

— 12

— 11

— 10

— 9

— 5-7

Рис. 5.2. Транскрипционные свойства РНКП coli, содержащей а7°-субъединицу с делецией Д513-519 в районе 3.2. Активность РНКП дикого типа (WT) и РНКП с делецией А513-519 в районе ст3.2 измеряли на промоторе Т7А1 дикого типа (W) и на промоторе Т7А1 cons (С). Транскрипцию проводили в отсутствие (дор. 1,2,5,6), либо в присутствии динуклеотидной затравки (СрА) (дор. 3,4,7,8). 5'-концевая последовательность синтезируемой РНК показана под рисунком. Справа приведены длины абортивных РНК-продуктов,

образующихся в процессе инициации, RO -полноразмерная РНК

12 3 4 5 6 7 8

5'-CAUCGAGAGGGACACGGCGA

5 10 15 20

Анализ трехмерной структуры холофермента РНКП Т. МегторИйш и существующих моделей промоторного комплекса показывает, что район 3.2 а-субъединицы, хотя и находится поблизости, но непосредственно не контактирует с З'-инициаторным нуклеотидом в активном центре РНКП (Рис. 5.1). Таким образом, данный район ст, вероятно, влияет на структуру активного центра по аллостерическому механизму, способствуя формированию сайта связывания инициаторных нуклеотидов.

АТР+иТР — рррАри

Рис. 5.3. Влияние делеции в районе 3.2 ст711-субъединицы на связывание инициаторных нуклеотидов. Км для инициаторных субстратов для РНКП дикого типа (WT) и РНКП с делецией Д513-519 в районе 3.2 ст-субъединицы (А) были измерены в реакции динукпеотидного синтеза на Т7А1-промоторе (схема реакции приведена сверху рисунка). Концентрацию одного из субстратов в ходе каждого эксперимента сохраняли постоянной (1000 мкМ), а концентрацию второго варьировали от 0,1 до 6000 мкМ. По оси ординат показана скорость реакции

х 9

I 8

1 7 1 6 п

~ 5 э

i 4 â 3 * 2 1 0

0,1 1 10 100 1000 [NTP], мкМ

5.2. Роль района switch2 Р'-субъединицы в инициации синтеза РНК

Район 3.2 ст-субъединицы контактирует с участком switch2 [З'-субъединицы РНКП, который, в свою очередь, располагается поблизости от матричной цепи ДНК (Рис. 5.1). Как было показано в нашей работе, контакты данного района с ДНК важны для стабилизации промоторного комплекса (см выше, раздел 4.3.2).

Рис. 5.4. Активность РШСП Е. coli с заменами остатка Arg339 в ß'-субъединице. На рисунке показаны полноразмерные РНК-продукты (RO), синтезируемые на Т7А1-промоторе РНКП дикого типа (R) и РНКП с заменами Arg339 на Glu, Ala и Lys. Реакцию транскрипции проводили в отсутствие (дор. 1-4), либо в присутствии динуклеотидной затравки (дор. 5-8)

Сравнение имеющихся данных о структуре РНКП показывает, что район switch2 имеет разную конформацию в кор-ферменте и в холоферменте РНКП, что, вероятно, объясняется связыванием ст-субъединицы и контактами switch2 с районом 3.2 ст (Рис. 5.1) (Vassylyev et al., 2002; Zhang et al., 1999). Это позволяет предположить, что tr-субъединица влияет на структуру активного центра и на связывание нуклеотидов за счет изменения контактов района switch2 с матричной цепью ДНК, что может как непосредственно влиять на связывание субстратов, так и изменять конформацию других участков активного центра, задействованных в катализе (в частности, F-спирали, Рис. 5.1).

Для проверки этого предположения мы исследовали транскрипционные свойства РНКП Е. coli с мутациями остатка Arg339 в районе switch2, который контактирует с фосфатом в +2 положении матричной цепи ДНК (Рис. 5.1). Было показано, что РНКП с заменами Arg399 на Glu или Ala не способны к синтезу РНК в отсутствие затравки, в то время как РНКП, содержащая в данном положении Lys, не отличается от РНКП дикого типа по эффективности транскрипции (Рис. 5.4, дор. 1-4). Наличие динуклеотидной затравки значительно стимулирует активность РНКП с заменами Arg339 на Glu и Ala (дор. 6 и 7). Следовательно, эти две мутации, как и делеция района 3.2 сг-субъединицы, нарушают образование первой фосфодиэфирной связи РНК, что подтверждает роль района switch2 ß'-субъединицы в передаче конформационных изменений от сг-субъединицы в активный центр РНКП.

Следует отметить, что на стадии элонгации транскрипции роль, аналогичную району 3.2 о-субъединицы, может выполнять РНК-транскрипт, который в районе 58 нуклеотидов от 3'-конца располагается в том же месте, что и район 3.2 а в холоферменте РНКП. Вероятно, контакты синтезируемой РНК с районом switch2 могут вызывать аналогичные конформационные изменения в активном центре РНКП, необходимые для связывания нуклеотидных субстратов.

Резюме. Сигма-субъединица влияет на структуру активного центра РНКП на стадии инициации и аллостерически способствует связыванию З'-инициаторного нуклеотида. Район switch2 ß'-субъединицы, взаимодействующий с районом 3.2 ст и с матричной цепью ДНК в области активного центра, также важен для образования первой фосфодиэфирной связи РНК и, вероятно, участвует в передаче аллостерического сигнала от а-субъединицы в активный центр РНКП.

СрА - +

ß'339 R Е А К R Е А К

1 2 3 4 5 6 7 8

6. Механизм ухода РНКП с промотора

6.1. Роль ст-субъединицы в уходе РНКП с промотора

В процессе ухода с промотора при переходе к элонгации транскрипции РНКП должна разорвать специфические контакты с ДНК, которые образовались на стадии инициации. Наличие этих контактов значительно затрудняет переход к элонгации, результатом чего является абортивная инициация - диссоциация коротких РНК-продуктов без отрыва РНКП от промотора (Hsu, 2002; McClure, 1985). До настоящего времени механизм абортивной инициации и механизмы структурных перестроек РНКП, происходящих при переходе к элонгации, остаются неизвестны.

Молекулярное моделирование показывает, что положение синтезируемого РНК-транскрипта в инициаторном комплексе перекрывается с положением района 3.2 ст-субъединицы в холоферменте РНКП (Рис. 5.1). Это позволяет предположить, что столкновение синтезируемой РНК с данным районом ст может, с одной стороны, являться причиной абортивной инициации, а с другой - способствовать уходу РНКП с промотора, за счет выталкивания ст-субьединицы из главного канала РНКП. Для проверки данной гипотезы мы исследовали процесс перехода к элонгации РНКП Е. coli, содержащей ст70-субъедшшцу с делецией района 3.2 (А513-519). Для анализа синтеза абортивных продуктов различной длины был использован промотор T7Alcons (раздел 5.1). Данный промотор характеризуется очень высоким уровнем абортивного синтеза, что, вероятно, объясняется сильными специфическими взаимодействиями РНКП с консенсусными промоторными элементами (см. раздел 6.2).

Было установлено, что РНКП, содержащая ст-субъединицу с делецией района

3.2, синтезирует на промоторах Т7А1 и Т7АIcons заметно меньшее количество полноразмерных РНК-транскриптов, чем РНКП дикого типа (Рис. 5.2 и Рис. 6.1 А), что свидетельствует о нарушении ухода РНКП с промотора. Мутантная РНКП также синтезирует на промоторе Т7АIcons значительно меньшее количество коротких абортивных продуктов длиной 5-7 нуклеотидов, чем РНКП дикого типа (Рис. 5.2 и Рис. 6.1 Б). Следовательно, район 3.2 в ферменте дикого типа стимулирует диссоциацию коротких РНК-транскриптов, по-видимому, за счет блокирования канала выхода РНК. В то же время, мутантная РНКП с высокой эффективностью синтезирует более длинные абортивные продукты (длиной 10-16 нуклеотидов), количество которых не отличается от РНКП дикого типа (Рис. 5.2). Анализ соотношения абортивных транскриптов длиной 10-16 нуклеотидов и полноразмерной РНК показывает, что у данной РНКП значительно снижена эффективность перехода к элонгации транскрипции (Рис. 6.1 Б). Таким образом, район 3.2 играет важную роль в уходе РНКП с промотора.

Чтобы установить, взаимодействует ли район 3.2 о-субъединицы с 5'-концом синтезируемой РНК в активном центре РНКП, мы провели эксперименты по образованию ковалентных сшивок РНКП с модифицированным аналогом 5'-инициаторного нуклеотида, содержащим реакционно-способную алкилирующую группу в 5'-положении. Было установлено, что в случае холофермента дикого типа ст70-субъединица образует сшивку с модифицированным нуклеотидом (Рис. 6.2, дор. 2). В то же время, сшивка не образуется в случае ст с делецией района 3.2 (Рис. 6.2, дор. 3). Полученные данные подтверждают, что район 3.2 ст находится в непосредственной близости от 5'-конца РНК-транскрипта в ходе инициации.

11 12 13 РНК, HT

Рис. 6.1. Влияние делении в Д513-519 в районе 3.2 с70 на эффективность ухода РНКП Е. coli с промотора. (А) Эффективность синтеза полноразмерной РНК на промоторах Т7А1 и Т7АIcons РНКП дикого типа (WT) и РНКП с делецией Д513-519. Активность измерена в присутствии динуклеотидной затравки (данные из Рис. 5.2, дор. 3,4,7,8). Активность показана в процентах от активности РНКП дикого типа на промоторе Т7А1. (Б) Эффективность синтеза абортивных продуктов различной длины на промоторе Т7АIcons РНКП дикого типа и РНКП с делецией в А513-519. По оси ординат показано отношение количества каждого из РНК-продуктов к количеству полноразмерной РНК (анализ данных из Рис. 5.2)

С — WT А

Р/Р'- ш» «

О-

Рис. 6.2. Ковалентная сшивка ст-субъединицы с 5'-концом РНК-транскрипта в процессе инициации транскрипции. Показаны результаты сшивки 5'-инициаторного нуклеотида с РНКП Е. coli дикого типа (WT) и РНКП с делецией А513-519. Сшивку проводили в комплексе РНКП с Т7А1-промотором, после чего добавляли радиоактивно-меченый З'-инициаторный нуклеотид (UTP). Положение модифицированных субъединиц указано слева

1 2 3

Итак, конкуренция растущей РНК с районом 3.2 ст в ходе инициации является необходимым условием для эффективного перехода к элонгации транскрипции. Вероятно, вытеснение района 3.2 из главного канала РНКП приводит к ослаблению контактов ст-субъединицы с кор-ферментом РНКП, что способствует диссоциации ст-субъединицы и разрыву контактов РНКП с промотором в ходе инициации.

6.2. Стабильность промоторных комплексов и эффективность перехода к элонгации

Так как переход от инициации к элонгации транскрипции сопровождается разрывом контактов РНКП с промотором, эффективность ухода с промотора должна определяться силой данных контактов. Ранее было установлено, что интенсивность абортивной инициации зависит от структуры промотора (Hsu, 2002; Hsu, 2008), однако, систематических исследований взаимосвязи между наличием в промоторе разных типов консенсусных элементов и эффективностью перехода к

элонгации не проводилось. Полученные нами данные показывают, что усиление контактов РНКП с промотором при введении в его состав консенсусных элементов затрудняет переход к элонгации. Так, на промоторе Т7А Icons,

содержащем консенсусные -10 и -35 элементы, РНКП Е. coli синтезирует гораздо большее количество абортивных

продуктов различной длины и меньшее количество

полноразмерной РНК, чем на Т7А1-промоторе дикого типа, содержащем неконсенсусные элементы (Рис. 6.3, дор. 1 и 2). Аналогичное явление

наблюдается при сравнении промоторов sTap2+35 и sTap2+35-GGGA, различающихся наличием GGGA-элемента (см. выше, Рис. 3.3 Б). Измерение стабильности промоторных комплексов показывает, что в случае промоторов, характеризующихся высоким уровнем абортивного синтеза, РНКП Е. coli образует гораздо более стабильные комплексы (Рис. 4.5, данные не приведены).

В случае РНКП 7! aquaticus, как и в случае РНКП Е. coli, введение в промотор консенсусных элементов также приводит к стимуляции абортивного синтеза и увеличению стабильности комплексов (Рис. 3.3 Б и Рис. 6.3). В то же время, эффективность перехода к элонгации РНКП Т. aquaticus оказывается заметно выше (ср. количество абортивных РНК на дор. 2 и 4 на Рис. 6.3). РНКП D. radiodurans также характеризуется более высокой эффективностью перехода к элонгации, чем РНКП Е. coli (данные не приведены). Вероятно, это связано с тем, что промоторные комплексы РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans менее стабильны, чем комплексы РНКП Е. coli.

В целом, результаты работы позволяют утверждать, что усиление контактов РНКП с промотором, за счет введения в него консенсусных элементов, приводит к увеличению стабильности промоторного комплекса и, как следствие, к снижению эффективности перехода к элонгации.

Резюме. Разрыв контактов РНКП с промотором является необходимым условием для перехода к элонгации транскрипции. Конкуренция синтезируемой РНК с районом 3.2 о-субъединицы способствует уходу РНКП с промотора, вероятно, за счет ослабления контактов ст-субъединицы с кор-ферментом РНКП. Эффективность перехода к элонгации транскрипции на разных промоторах определяется силой взаимодействий РНКП с промотором и уровнем стабильности промоторных комплексов.

РНКП Есо Taq

T7A1 S " 5 8 t ё ä я

4W ___

RO -»- ■■мнш

Рис. 6.3. Синтез абортивных и полноразмерных транскриптов на промоторах Т7А1 и T7Alcons РНКП Е. coli и Т. aquaticus.

Положение абортивных и полноразмерного (RO) РНК-продуктов указано слева от рисунка. Реакцию транскрипции проводили при 37 °С для РНКП Е. coli и при 60 °С для РНКП Т. aquaticus

12 3 4

7. Сравнение структуры активного центра РНКП мезофильных и термофильных бактерий

7.1. Различия в скорости синтеза РНК у мсзофилов и термофилов

Известно, что ферменты термофилов обычно проявляют сниженную активность по сравнению с гомологичными ферментами мезофилов при одних и тех же температурах. Это, вероятно, является следствием увеличения жесткости структуры белка, необходимого для повышения термостабильности (Fields, 2001; Golding and Dean, 1998). Таким образом, сравнение каталитических характеристик РНКП мезофилов и термофилов открывает возможность для поиска функционально-важных участков РНКП, задействованных в катализе. Однако, до настоящего времени детальных исследований по сравнению каталитических свойств РНКП родственных термофильных и мезофильных бактерий не проводилось.

Анализ транскрипционных свойств РНКП Е. coli, D. radiodurans, Т. aquaticus и Т. ihemophilus показал, что большинство их различий РНКП в ходе инициации транскрипции (различия в температуре плавления ДНК, стабильности промоторных комплексов и эффективности перехода к элонгации) не связаны с разной температурной адаптацией данных бактерий (разделы 4, 5, 6). В частности, несмотря на различия в температурной адаптации, РНКП D. radiodurans и Т. aquaticus проявляют сходную холодочувствительность в открывании промоторов (раздел 4.2.1). Однако, температурные профили активности данных РНКП значительно различаются (Рис. 7.1). В то время как РНКП мезофильных бактерий Е. coli и D. radiodurans проявляют максимальную активность при 37-45 °С, РНКП термофильных бактерий Т. aquaticus и Т. thermophilus оказываются практически неактивны при этих температурах, оптимум их активности составляет 60-70 °С. Столь сильные различия не могут быть связаны только с холодочувствительностью открывания промоторов, а должны объясняться особенностями каталитических свойств РНКП, которые проявляются на всех стадиях синтеза РНК и являются следствием термофильной адаптации данных бактерий.

Для точного измерения скорости катализа различных РНКП мы использовали минимальную матрицу (Рис. 1.4 А), которая позволяет исследовать удлинение РНК-транскрипта на один нуклеотид, происходящее в ходе единичного каталитического цикла РНКП. Было показано, что РНКП D. radiodurans присоединяет нуклеотид с

120

Рис. 7.1. Активность РНКП Е. coli (Eco), D. radiodurans (Dra) и T. aquaticus (Taq) при различных температурах.

Активность РНКП определяли по синтезу полноразмерной РНК на фрагменте ДНК, содержащем Т7А1-промотор. Для каждой РНКП активность приведена в процентах от максимальной активности в температурном оптимуме

-е-Eco

зо

t,°C

Рис. 7.2. Скорость синтеза РНК различными РНКП. Для определения скорости измеряли кинетику присоединения нуклеотидов на минимальной матрице в реакции: 8 нт РНК + UTP—>9 нт РНК. По оси абсцисс отложено время, по оси ординат - % РНК-продукта длиной 9 нт. Taq - РНКП Т. aquaticus, Dra — РНКП D. radiodurans, Dra F - РНКП Т. aquaticus заменой участка F-петли на последовательность D. radiodurans, Dra Jaw - РНКП с заменой домена jaw, Dra G - РНКП с заменой G-петли, AF - РНКП Т. aquaticus с делецией F-петли. Измерения проводили при [UTP]=1 мМ и температуре 20 °С на аппарате по измерению быстрой кинетики

гораздо большей скоростью, чем РНКП Т. aquat¡cus (Рис. 7.2): время, необходимое для удлинения половины РНК при насыщающей концентрации ЦТР, составляет примерно 10 миллисекунд для РНКП £>. гасИос!игат и 3 с для РНКП Т. ациайст. Различия в скорости катализа оказываются особенно заметны при низких температурах (20 °С и ниже). Следует подчеркнуть, что столь заметная разница в скоростях синтеза РНК является практически единственным различием в транскрипционных свойствах РНКП Т. адиШюия и И. гасИосЬлгат, выявленным в наших экспериментах.

7.2. Структурные элементы РНКП, определяющие скорость синтеза РНК

Различия в скоростях катализа РНКП Т. адиа1киэ и О. гасИо(1игат были использованы нами для поиска функционально-важных районов активного центра, участвующих в катализе. Проведенный недавно анализ трехмерной структуры элонгационного комплекса РНКП Т. №егторЫ1№ позволил предположить, какие структурные элементы фермента могут быть задействованы в синтезе РНК (Рис. 7.3) (Уаззу1уеу е! а1., 2007а; Уаязу1уеу й а1., 2007Ь). Собственно реакция образования фосфодиэфирной связи катализируется двумя ионами магния, связанными в активном центре. Участок связывания ионов магния (ЫАБРБОВ-мотив Р'-субъединицы) абсолютно консервативен в РНКП всех организмов. В связывании нуклеотида в активном центре РНКП в ходе катализа главную роль играют участки О-петли и Р-спирали Р'-субъединицы (показаны на Рис. 7.3 красным и зеленым, соответственно). Изменение структуры данных участков в ходе

Рис. 7.3. Структурные элементы активного центра РНКП, участвующие в присоединении нуклеотидов. На рисунке показана структура активного центра РНКП Т. thermophilic в закрытой конформации в процессе присоединения нуклеотида (согласно данным (Vassylyev et al., 2007b). Два иона магния в активном центре РНКП показаны сферами красного цвета, матричная ДНК окрашена светло-коричневым, присоединяемый нуклеотид (АТР) — черным. F-спираль показана фиолетовым цветом, G-петля - зеленым, F-петля - красным, участок домена jaw - синим. Остатки аминокислот в F-петле, различающиеся в РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans, показаны желтым. Остаток Gin 1046 (который у D. radiodurans заменен на Ala) находится поблизости от остатка Val 1246 в G-петле

катализа приводит к формированию «закрытой» конформации активного центра, обеспечивающей правильную ориентацию нуклеотида (Рис. 7.3). Мутации в G-петле и F-спирали приводят к значительному снижению скорости катализа (Temiakov et al., 2005; Vassylyev et al., 2007). С G-петлей контактирует домен jaw ß'-субъединицы (его фрагмент показан на Рис. 7.3 синим цветом), который может влиять на конформационную подвижность G-петли. Делеция домена jaw в РНКП Е. coli снижает скорость элонгации транскрипции (Ederth et al., 2002). Рядом с G-петлей и F-спиралью располагается участок РНКП, образованный консервативным районом F ß'-субъединицы, причем центральный фрагмент данного участка, F-петля, контактирует с G-петлей в закрытой конформации (Рис. 7.3). Функции F-петли в транскрипции ранее исследованы не были.

Мы предположили, что различия в скорости синтеза РНК РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans могут определяться различиями в структуре перечисленных выше элементов активного центра. Поскольку последовательности участков связывания магния и F-спирали идентичны у Т. aquaticus и D. radiodurans, основной вклад в различия в скорости данных РНКП могут вносить различия в участках G-петли (4 аминокислотные замены), F-петли (9 замен) и jaw-доменэ (36 замен) ß'-субъединицы. Для анализа функциональной роли данных участков были получены химерные варианты РНКП Т. aquaticus, в которых эти участки были заменены на соответствующие последовательности D. radiodurans.

Было показано, что все полученные химерные варианты РНКП являются активными, обладают высокой термостабильностью и не отличаются от РНКП Т. aquaticus на стадиях узнавания промоторов и инициации транскрипции (данные не приведены). В то же время, измерение скорости присоединения нуклеотидов химерными РНКП выявило значительные различия в скорости катализа (Рис. 7.2). Было установлено, что замена G-петли (аминокислотные остатки 1246-1254 в РНКП Т. aquaticus) практически не оказывает влияния на скорость катализа. Замена домена jaw (остатки 1267-1325) приводит к незначительному ускорению синтеза РНК (примерно в 2-3 раза, Рис. 7.2). Наибольший эффект оказывает замена F-петли (остатки 1039-1074), которая приводит к ускорению катализа РНКП Т. aquaticus примерно в 50 раз (Рис. 7.2). Для дальнейшего анализа роли F-петли в катализе был получен мутантный вариант РНКП Т. aquaticus с делецией центрального фрагмента F-петли. Было показано, что эта делеция приводит к сильному снижению скорости синтеза РНК, более чем в 100 раз (Рис. 7.2).

Полученные данные показывают, что участок F-петли играет важнейшую роль в катализе присоединения нуклеотидов РНКП. Вероятно, что F-петля способствует образованию закрытой конформации активного центра РНКП в ходе катализа, за счет контактов с G-петлей (Рис. 7.3 и Рис. 7.4). Замены неконсервативных аминокислотных остатков, различающихся в РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans, могут либо непосредственно влиять на контакты с G-петлей, либо изменять структуру и конформационную подвижность F-петли. Таким образом, скорость работы активного центра РНКП аллостерически регулируется элементами, не принимающими непосредственного участия в связывании нуклеотидов и в катализе образования фосфодиэфирной связи. Изменения в структуре данных участков приводят к значительным изменениям в скорости катализа, что может являться адаптивным механизмом, обеспечивающим различия в активности РНКП разных бактерий.

Резюме. Различия в скорости синтеза РНК РНКП термофильных и мезофильных бактерий определяются различиями в участках РНКП, оказывающих аллостерическое воздействие на структуру активного центра в ходе катализа. В частности, район Р-петли Р'-субъединицы важен для формирования закрытой конформации активного центра в процессе присоединения нуклеотидов.

Рис. 7.4. Механизм синтеза РНК в активном центре РНКП. РНК и присоединяемый нуклеотид (ЫТР) показаны красным, матричная цепь ДНК -черным цветом. Р-спираль, в-петля и Р-петля изображены фиолетовым, зеленым и темно-красным цветами, соответственно; направление движения в-петли в ходе катализа показано пунктирной стрелкой, общее направление транскрипции - сплошной стрелкой. Аминокислотные замены в Р-петле, влияющие на скорость синтеза РНК, схематично показаны желтыми кружками

выводы

1. Исследован механизм инициации транскрипции РНКП мезофильных и термофильных бактерий. Показано, что, при сохранении консервативного механизма инициации, РНКП разных бактерий проявляют значительные различия в узнавании промоторов, свойствах промоторных комплексов и каталитической активности.

2. Разработан новый подход к изучению структуры РНКП и механизмов инициации транскрипции с использованием аптамеров. Получены высокоаффинные и высокоспецифичные оцДНК аптамеры к ст-субъсдинице, холоферменту и кор-ферменту РНКП, которые взаимодействуют с участками связывания нуклеиновых кислот, транскрипционных факторов и антибиотиков. Показапо, что аптамеры являются удобным инструментом для изучения взаимодействий РНКП с нуклеиновыми кислотами и регуляторными факторами, а также для создания новых ингибиторов фермента.

3. Открыт новый элемент промоторов бактерий (ССОА-элемент), который располагается справа от -10 элемента. Данный элемент узнается районом 1.2 ст-субъедшшцы и увеличивает стабильность промоторных комплексов РНКП. Промоторы, содержащие ССйА, узнаются РНКП разных бактерий с разной специфичностью. Межвидовые различия в узнавании СвОА-содержащих промоторов определяются различиями в неспецифических контактах РНКП с промоторной ДНК.

4. Свободная сг-субъединица РНКП содержит функционально-активные участки связывания ДНК и способна узнавать -10, Тв и ССОА-элементы промотора в составе аптамеров, соответствующих нематричной цепи промотора. ДНК-связывагощая активность ст-субьединицы стимулируется Р'-субъединицей кор-фермента РНКП.

5. Холофермент РНКП обладает высокой аффинностью к шпилечным структурам ДНК, содержащим Тй-элемент промотора в двунитевом состоянии и -10 элемент промотора в однонитевом состоянии. Данное свойство РНКП, вероятно, лежит в основе механизма плавления ДНК при образовании открытого промоторного комплекса.

6. Контакты кор-фермента РНКП с промоторной ДНК спереди по ходу транскрипции необходимы для стабилизации промоторных комплексов.

7. Сигма-субъединица влияет на структуру активного центра РНКП на стадии инициации транскрипции. Сигма-субъедшшца способствует связыванию 3'-инициаторного нуклеотида в активном центре РНКП, в частности, за счет контактов района 3.2 с районом 5луксЬ2 Р'-субъединицы, который, в свою очередь, взаимодействует с матричной цепью ДНК в области активного центра.

8. Сигма-субъединица РНКП принимает участие в процессе перехода от инициации к элонгации транскрипции, за счет конкуренции района 3.2 с синтезируемой РНК, что, с одной стороны, является причиной абортивной инициации, а с другой - способствует разрыву контактов РНКП с промотором.

9. Выявлены элементы РНКП, определяющие различия свойств промоторных комплексов РНКП разных бактерий. Установлено, что различия в температуре плавления промоторов определяются аминокислотными остатками района 2 ст-субъединицы, контактирующими с -10 элементом промотора и с кор-ферментом РНКП, а различия в стабильности промоторных комплексов - Ы-концевым районом ст-субъединицы, а также кор-ферментом РНКП. Данные различия не связаны с температурной адаптацией бактерий.

10.Выявлены структурные элементы активного центра РНКП, определяющие адаптивные различия в скорости катализа РНКП термофильных и мезофильных бактерий. Показано, что район Р-петяи р'-субъединицы аляостерически способствует формированию закрытой конформации активного центра в процессе присоединения нуклеотидов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи:

Barinova N., Kuznedelov К., Severinov К., Kulbachinskiv А. 2008. Structural modules of RNA polymerase required for transcription from promoters containing downstream basal promoter element GGGA. J. Biol. Chem. 283: 22482-22489.

Пупов Д.В., Баринова H.A., Кульбачииский A.B. 2008. Анализ PHK-расщепляющей активности РНК-полимераз Е. coli и D. radiodurans. Биохимия т. 73: 903 -908.

Barinova N., Zhilina Е., Bass I., Nikiforov V., Kulbachinskiv A. 2008. Lineage-specific amino acid substitutions in region 2 of the RNA polymerase о subunit affect the temperature of promoter opening. J. Bacteriol. 190: 3088-3092.

Kulbachinskiv A.V. Methods for selection of aptamers to protein targets. 2007. Biochemistry (Moscow) 72:1505-1518.

Sevostyanova A, Feklistov A, Barinova N, Heyduk E, Bass I, Klimasauskas S, Heyduk T, Kulbachinskiv A. 2007. Specific recognition of the -10 promoter element by the free RNA polymerase sigma submit. J. Biol. Chem. 282: 22033-22039.

Zenkin N., Kulbachinskiv A., Yuzenkova Y., Mustaev A., Bass I., Severinov K., Brodolin K. 2007. Region 1.2 of the RNA polymerase sigma subunit controls recognition of the -10 promoter element. EMBOJ. 26: 955-964.

Feklistov A., Barinova N., Sevostyanova A., Heyduk E., Bass I., Vvedenskaya I., Kuznedelov K., Merkiene E., Stavrovskaya E., Klimasauskas S., Nikiforov V., Heyduk Т., Severinov K., Kulbachinskiv A. 2006. A basal promoter element recognized by free RNA polymerase sigma subunit determines promoter recognition by RNA polymerase holoenzyme. Mol. Cell. 23: 97-107.

Kulbachinskiv A.. Mustaev A. 2006. Region 3.2 of the sigma subunit contributes to the binding of the З'-initiating nucleotide in the RNA polymerase active center and facilitates promoter clearancc during initiation. J. Biol. Chem. 281: 18273-18276.

Кульбачииский A.B. 2006. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням. Успехи биологической химии т. 46: 193-224.

Кульбачииский А.В.. Никифоров В.Г., Бродолин K.JI. 2005. Различия контактов РНК-полимераз Е. coli и Т. aquaticus с /асиУ5-промотором определяются кор-ферментом РНК-полимеразы. Биохимия т. 70: 1493 - 1497.

Zenkin N., Kulbachinskiv A.. Bass I., Nikiforov V. 2005. Different rifampin sensitivities of Escherichia coli and Mycobacterium tuberculosis RNA polymerases are rot explained by the difference in the beta-subunit rifampin regions I and II. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 1587-1590.

Kulbachinskiv A.. Feklistov A., Krasheninnikov I., Goldfarb A., Nikiforov V. 2004. Aptamers to E. coli core RNA polymerase that sense its interaction with rifampicin, a subunit and GreB. Eur. J. Biochem. 271: 4921-4931.

Kulbachinskiv A.. Bass I., Bogdanova E., Goldfarb A., Nikiforov V. 2004. Cold sensitivity of thermophilic and mesophilic RNA polymerases. J. Bacteriol. 186:7818-7820.

Кульбачииский A.B.. Ершова Г.В., Коржева H.B., Бродолин K.JL, Никифоров В.Г.. 2002. Мутации в (З'-субьединице РНК-полимеразы Esherichia coli, влияющие на взаимодействие с передним дуплексом ДНК в элонгационном комплексе. Генетика т. 38: 1207-1211.

Kulbachinskiv A.. Mustaev A., Goldfarb A., Nikiforov V. 1999. Interaction with free beta' subunit unmasks DNA-binding domain of RNA polymerase sigma subunit. FEBS Lett. 454: 71-74.

Материалы всероссийских и международных конференций:

Kulbachinskiy A.. Pupov D., Barinova N. "Analysis of promoter recognition by bacterial RNA polymerase using model DNA substrates." XX International Congress of Genetics. "Genetics - understanding living systems". July 12-17,2008, Berlin, Germany.

Миропольская H.A., Кульбачинский A.B. «РНК-полимераза как молекулярная машина: поиск . структурных элементов фермента, определяющих скорость транскрипции.» 1-й Международный форум по нанотехнологиям. 3-5 декабря 2008 г., Москва, Россия.

Кульбачинский А.В.. Пупов Д.В., Баринова Н.А. «Исследование структуры РНК-полимеразы и механизмов узнавания промоторов при помощи аптамеров.» ГУ Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г., Новосибирск, Россия.

Barinova N., Klimasauskas S., Nikiforov V., Kulbachinskiy A.. Artsimovitch I. "Comparison of mesophilic and thermophilic RNA polymerases reveals a structural element controlling catalysis allosterically". FASEB Summer Research Conference "Mechanisms & Regulation of Prokaryotic Transcription". June 23-28, 2007, Vermont Academy in Saxtons River, Vermont, USA..

Epshtein V., Kulbachinskiy A.. Nikiforov V., Mustaev A. "Catalytic mechanism of transcription initiation". FASEB Summer Research Conference "Mechanisms & Regulation of Prokaryotic Transcription". June 23-28, 2007, Vermont Academy in Saxtons River, Vermont, USA.

Кульбачинский А. «Роль сигма-субъединицы РНК-полимеразы в связывании инициаторных нуклеотидов и в уходе с промотора при инициации транскрипции.» 8-я Международная конференция им. Энгельгардта по молекулярной биологии. «РНК-белковые взаимодействия». 19-24 августа 2006 г., Москва, Россия.

Feklistov A., Kulbachinskv A.. Nikiforov V. "DNA aptamers unveil sequence specificity of free sigma factor." FASEB Summer Research Conference "Nucleic Acids Enzymes". June 12 - June 17,2004, Vermont Academy in Saxtons River, Vermont, USA.

Ивановская М.Г., Анцыпович С.И., Рудакова E.A., Кульбачинский A.B. «Взаимодействие РНК-полимеразы Е. coli с олигонуклеотидами-фрагмептами lacUVS-промотора». III Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 26 июня - 1 июля 2002 г., Санкт-Петербург, Россия.

Korzheva N., Mustaev A., Kuznedelov К., Severinov К., Kulbachinskiy A.. Kozlov М., Malhotra A., Nikiforov V., Goldfarb A., Darst S. "DNA and RNA-protein contacts in transcription elongation complex." 17th Annual meeting of the French Biophysical Society «Nucleic acid recognition by enzymes. The case of DNA-dependent polymerases». September 13- 16, 2000, Nouan-le-Fuzelier, France.

Brodolin K.L., Zaychikov E., Denissova L., Heumann H., Kulbachinskv A.. Nikiforov V. "Contacts of RNA polymerase with transcription bubble in open promoter complex." 17th Annual meeting of the French Biophysical Society «Nucleic acid recognition by enzymes. The case of DNA-dependent polymerases». September 13 - 16, 2000, Nouan-le-Fuzelier, France.

Brodolin K.L., Kulbachinskv A.. Severinov K., Nikiforov V. "Formaldehyde as a probe for RNA polymerase-promoter complexes structure." FASEB Summer Research Conference «Transcription initiation in Prokaryotes». July 19 - July 24, 1997, Vermont Academy in Saxtons River, Vermont, USA.

Подписано в печать 16.03.2009 г. Печать на ризографе. Тираж 100 экз. Заказ № 1673. Объем 1,3 п.л. Отпечатано в типографии ООО "Алфавит 2000", ИНН: 7718532212, г. Москва, ул. Маросейка, д. 6/8, стр. 1, т. 623-08-10, www.alfavit2000.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кульбачинский, Андрей Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РНКП: МЕХАНИЗМЫ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ И КАТАЛИЗА.

1. Общий механизм инициации транскрипции.

2. Структура бактериальной РНКП.

2.1. Структура кор-фермента РНКП.

2.2. Структура холофермента РНКП.

2.3. Структура ст-субъедшшцы РНКП.

3. Структурные модели промоторного и элонгационного комплексов.

3.1. Структурная модель промоторного комплекса.

3.2. Структурные перестройки промоторного комплекса в ходе инициации транскрипции.

3.3. Миксопиронин: антибиотик, блокирующий образование открытого промоторного комплекса.

3.4. Структура элонгационного комплекса.

4. Механизм синтеза РНК в активном центре РНКП.

4.1. Реакции, катализируемые РНКП.

4.2. Механизм синтеза РНК: присоединение NTP в активном центре и функция G-петли.

4.3. Механизм транслокации РНКП и функция F-спирали.

4.4. Антибиотики, блокирующие каталитический цикл РНКП.

4.4.1. Стрептолидигин: блокирование образования инсерционного комплекса.

4.4.2. Аманитин: блокирование транслокации РНКП.

5. Регуляция транскрипции факторами, действующими на активный центр РНКП.

5.1. Факторы, регулирующие расщепление РНК в активном центре.

5.1.1. Стимуляция расщепления РНК Gre-факторами.

5.1.2. Регуляция транскрипции белками Gfhl и Rnk.

5.2. Регуляция транскрипции ppGpp и DksA.

5.2.1. Функции ppGpp в регуляции инициации транскрипции.

5.2.2. Функции белка DksA: стимуляция связывания ppGpp.

5.3. Антибиотики, нарушающие связывание ионов Mg2+ в активном центре РНКП.

5.3.1. Тагетитоксин: связывание дополнительного иона Mg2+ в активном центре РНКП.

5.3.2. Рифампицин: нарушение связывания каталитических ионов Mg2+.

5.3.3. Сорангицин — функциональный аналог рифампицина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы инициации транскрипции у мезофильных и термофильных бактерий"

Актуальность проблемы

Транскрипция является первой стадией экспрессии генетического материала в клетках всех организмов. Именно на уровне транскрипции действуют основные механизмы генетической регуляции. Главным ферментом, осуществляющим транскрипцию, является РНК-полимераза (РНКП) - сложная молекулярная машина, обладающая многими каталитическими активностями и способная к разнообразным структурным перестройкам. Структура РНКП и механизм синтеза РНК высоко консервативны у всех организмов, от бактерий до человека. РНКП бактерий имеет наиболее простое строение и может служить удобной моделью для изучения механизмов транскрипции с применением самых современных методов молекулярной биологии.

Наиболее сложной и жестко регулируемой стадией транскрипции является стадия инициации. Инициация транскрипции происходит в специфических участках ДНК -промоторах, - и сама состоит из нескольких стадий. В отличие от ДНК-полимераз, РНКП способна самостоятельно осуществлять инициацию и начинать синтез РНК в отсутствие затравки. В ходе инициации РНКП должна: (1) узнать промотор; (2) расплавить цепи ДНК вокруг стартовой точки транскрипции; (3) связать инициаторные нуклеотиды и начать синтез РНК; (4) разорвать контакты с промотором и перейти к продуктивному синтезу РНК - элонгации транскрипции. Детальный молекулярный механизм инициации транскрипции и механизмы структурных превращений РНКП, происходящих на разных стадиях инициации, во многом остаются неизвестными. Расшифровка данного механизма является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии.

У бактерий все стадии инициации осуществляются холоферментом РНКП, состоящим из кор-фермента (субъединичный состав агРР'со) и фактора инициации - ст-субъединицы, которая диссоциирует при переходе к элонгации транскрипции. Одной из основных функций а-субъединицы является узнавание промоторов и плавление ДНК в районе стартовой точки транскрипции. В последние годы появились данные, показывающие, что сг-субъединица может также играть активную роль на последующих стадиях инициации, в том числе, в процессах инициации синтеза РНК и ухода РНКП с промотора. Таким образом, с-субъединица является одним из основных регуляторов транскрипции, действующим на всех стадиях инициации. Анализ функций а-субъединицы представляет огромный интерес для понимания механизма транскрипции в целом и основных принципов транскрипционной регуляции.

Анализ трехмерной структуры РНКП, проведенный для РНКП термофильных бактерий Thermus aquaticas и Thermus thermophilus, позволил создать структурные модели промоторного и элонгациоиного комплексов. Предложенные модели, хотя и не дают исчерпывающей информации о механизмах структурных превращений РНКП на разных стадиях синтеза РНК, позволяют предположить функции различных участков фермента и могут являться основой для расшифровки детального молекулярного механизма транскрипции. Наличие структурных моделей транскрипционных комплексов открывает возможности для исследований конформационной подвижности РНКП на всех стадиях транскрипции, начиная от взаимодействия ст-субъединицы с кор-ферментом, узнавания и плавления промоторов до структурных перестроек транскрипционного комплекса в ходе инициации транскрипции и механизмов катализа в активном центре РНКП.

Термофильные бактерии являются исключительно интересной моделью для изучения механизмов транскрипции и структурной подвижности РНКП, поскольку, при сохранении консервативного механизма транскрипции, они приобрели особенности, связанные с адаптацией к высоким температурам. В частности, РНКП термофилов обладают повышенной жесткостью структуры и сниженной конформационной подвижностью, обеспечивающей термостабильность. Сравнени транскрипционных свойств РНКП термофильных и мезофильных бактерий дает уникальную возможность для поиска функционально-важных участков РНКП, задействованных в узнавании промоторов и в катализе и обеспечивающих адаптивные различия между различными группами бактерий.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлась расшифровка детального молекулярного механизма инициации транскрипции у различных групп бактерий и анализ структурных перестроек РНКП, происходящих в ходе данного процесса. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

2. Установить молекулярные механизмы взаимодействий РНКП с различными промоторными элементами.

4. Установить механизм инициации синтеза РНК в активном центре РНКП.

5. Исследовать механизм ухода РНКП с промотора.

Научная новизна и практическая значимость работы

В результате работы получены важнейшие данные о молекулярных механизмах всех стадий инициации транскрипции, а также о механизмах структурных превращений РНКП, происходящих на данных стадиях. Установлены молекулярные механизмы узнавания основных промоторных элементов РНКП, открыт и охарактеризован новый элемент бактериальных промоторов (GGGA-элемент). Показано, что GGGA является промоторным элементом нового типа, который способен определять межвидовые различия в узнавании промоторов РНКП. Показано, что а-субъединица РНКП содержит функционально-активные участки связывания ДНК и способна узнавать -10, TG и GGGA-элементы промотора в составе нематричной цепи ДНК. Изучен процесс образования открытого промоторного комплекса РНКП различных мезофильных и термофильных бактерий, показано, что важную роль в плавлении ДНК играют аминокислотные остатки в участках сг-субъединицы, взаимодействующих с -10 элементом промотора и с кор-ферментом РНКП. Показано, что стабильность промоторных комплексов определяется контактами сг-субъединицы РНКП с промоторными элементами, а также контактами кор-фермента с ДНК спереди по ходу транскрипции. Изучен механизм инициации синтеза РНК в активном центре РНКП; показано, что в образовании первых связей РНК решающую роль играет ст-субъединица, которая способствует связыванию инициаторных нуклеотидов. Показано, что ст-субъединица также играет важную роль в процессе ухода РНКП с промотора при переходе к элонгации транскрипции; установлено, что растущий РНК-транскрипт конкурирует с а-субъединицей за связывание с кор-ферментом РНКП, что в результате приводит к разрыву контактов с промотором. Выявлены структурные элементы РНКП, обеспечивающие различия в каталитических свойствах РНКП мезофильных и термофильных бактерий. Получен новый тип лигандов к РНКП — аптамеры, — которые открывают широкие возможности для дальнейших исследований механизма транскрипции, а также для создания эффективных ингибиторов фермента.

В целом, полученные в работе данные существенно углубляют наши знания о молекулярных механизмах транскрипции и представляют значительный интерес для понимания основных принципов регуляции генной экспрессии. Кроме большой фундаментальной значимости, результаты работы имеют важное практическое значение и могут найти применение во многих прикладных исследованиях. В частности, открытия, сделанные в работе, могут быть использованы для создания новых типов промоторов и высокоэффективных систем генной экспрессии, разработки новых стратегий направленной регуляции транскрипции, а также для получения новых ингибиторов РНКП, имеющих терапевтическое значение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Структурные исследования бактериальной РНКП: механизмы инициации транскрипции и катализа

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кульбачинский, Андрей Владимирович

выводы

2. Разработан новый подход к изучению структуры РНКП и механизмов инициации транскрипции с использованием аптамеров. Получены высокоаффинные и высокоспецифичные оцДНК аптамеры к ст-субъединице, холоферменту и кор-ферменту РНКП, которые взаимодействуют с участками связывания нуклеиновых кислот, транскрипционных факторов и антибиотиков. Показано, что аптамеры являются удобным инструментом для изучения взаимодействий РНКП с нуклеиновыми кислотами и регуляторными факторами, а также для создания новых ингибиторов фермента.

3. Открыт новый элемент промоторов бактерий (GGGA-элемент), который располагается справа от -10 элемента. Данный элемент узнается районом 1.2 ст-субъединицы и увеличивает стабильность промоторных комплексов РНКП. Промоторы, содержащие GGGA, узнаются РНКП разных бактерий с разной специфичностью. Межвидовые различия в узнавании GGGA-содержащих промоторов определяются различиями в неспецифических контактах РНКП с промоторной ДНК.

4. Свободная ст-субъединица РНКП содержит функционально-активные участки связывания ДНК и способна узнавать -10, TG и GGGA-элементы промотора в составе аптамеров, соответствующих нематричной цепи промотора. ДНК-связывающая активность ст-субъединицы стимулируется Р'-субъединицей кор-фермента РНКП.

5. Холофермент РНКП обладает высокой аффинностью к шпилечным структурам ДНК, содержащим TG-элемент промотора в двунитевом состоянии и -10 элемент промотора в однонитевом состоянии. Данное свойство РНКП, вероятно, лежит в основе механизма плавления ДНК при образовании открытого промоторного комплекса.

7. Сигма-субъединица влияет на структуру активного центра РНКП на стадии инициации транскрипции. Сигма-субъединица способствует связыванию З'-инициаторного нуклеотида в активном центре РНКП, в частности, за счет контактов района 3.2 с районом switch2 Р'-субъединицы, который, в свою очередь, взаимодействует с матричной цепью ДНК в области активного центра.

9. Выявлены элементы РНКП, определяющие различия свойств промоторных комплексов РНКП разных бактерий. Установлено, что различия в температуре плавления промоторов определяются аминокислотными остатками района 2 ст-субъединицы, контактирующими с -10 элементом промотора и с кор-ферментом РНКП, а различия в стабильности промоторных комплексов — N-концевым районом ст-субъединицы, а также кор-ферментом РНКП. Данные различия не связаны с температурной адаптацией бактерий.

10. Выявлены структурные элементы активного центра РНКП, определяющие адаптивные различия в скорости катализа РНКП термофильных и мезофильных бактерий. Показано, что район F-петли Р'-субъединицы аллостерически способствует формированию закрытой конформации активного центра в процессе присоединения нуклеотидов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне благодарит В.Г. Никифорова за ценные советы, научные дискуссии и критические замечания в процессе выполнения работы, В.А. Гвоздева за переданные им знания, поддержку в течение многих лет и обсуждение данной работы, Е.Д. Свердлова за большую поддержку и стимуляцию научной работы. Автор выражает искреннюю признательность К.Л. Бродолину, И.А. Басс, Е.В. Жилиной, Н.А. Миропольской, Д.В. Пупову, А.К. Севостьяновой за большую помощь работе и непосредственое участие в проведении экспериментов. Автор благодарит Е.С. Богданову, С. Борухова, Н.В. Коржеву, А. Мустаева, А.В. Феклистова, С.И. Шрама и В.Н. Эпштейна за помощь в работе, Н.С. Зенкина, Е.В. Сосунову, Ю.В. Юзенкову за обсуждение работы и полезные советы, И.В. Демидюка и Д.В. Пупова за советы по оформлению диссертации и редактирование текста. Автор благодарен А. Гольдфарбу и К. Северинову за предоставленную возможность выполнения работы в их лабораториях, С. Климашаускасу и всем сотрудникам Лаборатории биологической модификации ДНК Института биотехнологии в Вильнюсе за помощь в проведении экспериментов и гостеприимство. Автор благодарит И. Арцимович, С. Борухова, JI. Минахина, К. Кузнеделова и К. Северинова за предоставление плазмид и препаратов белков. Автор особенно благодарен Ж.М. Горленко, И.А. Басс, А.Н. Лебедеву, С. и Л. Минахиным, С.З. Миндлин, М.А. Петровой и всем сотрудникам ОМГК ИМГ РАН за постоянное внимание, дружеское отношение и огромную всестороннюю подержку в процессе выполнения этой работы.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

BSA - бычий сывороточный альбумин DTT— дитиотреитол dNTP — дезоксирибонуклеозидтрифосфат

EDTA — этилендиаминтетраацетат

IPTG — изопропил-р-тио-Б-галактопиранозид

Мух - миксопиронин

NTP - рибонуклеозидтрифосфат

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

Rif - рифампицин

SDS - додецилсульфат натрия

SELEX - systematic evolution of ligands by exponential enrichment Sor - сорангицин Stl - стрептолидигин Tgt - тагетитоксин а.к. - аминокислотный остаток дцДНК - двухцепочечная ДНК

НК - нуклеиновые кислоты нт - нуклеотидов оцДНК - одноцепочечная ДНК п.н. - пар нуклеотидов

ПААГ — полиакриламидный гель

ПЦР — полимеразная цепная реакция

РНКП - РНК-полимераза

ЭК - элонгационный комплекс

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кульбачинский, Андрей Владимирович, Москва

1. Adelman К, Yuzenkova J, La Porta A, Zenkin N, Lee J, Lis J. T, Borukhov S, Wang M. D, Severinov K. 2004. Molecular mechanism of transcription inhibition by peptide antibiotic Microcin J25. Mol Cell 14: 753-762.

2. Allen P, Worland S, Gold L. 1995. Isolation of high-affinity RNA ligands to HIV-l integrase from a random pool. Virology 209: 327-336.

3. Allen T. A, Von Kaenel S, Goodrich J. A, Kugel J. F. 2004. The SINE-encoded mouse B2 RNA represses mRNA transcription in response to heat shock. Nat Struct Mol Biol 11: 816821.

4. Andreola M. L, Pileur F, Calmels C, Ventura M, Tarrago-Litvak L, Toulme J. J, Litvak S. 2001. DNA aptamers selected against the HIV-l RNase H display in vitro antiviral activity. Biochemistry 40: 10087-10094.

5. Aniskovitch L. P, Winkler H. H. 1995. Instability of Rickettsia prowazekii RNA polymerase-promoter complexes. JBacteriol 177: 6301-6303.

6. Anthony L. C, Burgess R. R. 2002. Conformational flexibility in sigma70 region 2 during transcription initiation. J Biol Chem 277: 46433-46441.

7. Arthur Т. M, Burgess R. R. 1998. Localization of a sigma70 binding site on the N terminus of the Escherichia coli RNA polymerase beta' subunit. J Biol Chem 273: 31381-31387.

8. Artsimovitch I, Landick R. 2000. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc Natl Acad Sci USA 97: 7090-7095.

9. Artsimovitch I, Patlan V, Sekine S, Vassylyeva M. N, Hosaka T, Ochi K, Yokoyama S, Vassylyev D. G. 2004. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell 117: 299-310.

10. Artsimovitch I., Svetlov V, Anthony L, Burgess R. R, Landick R. 2000. RNA polymerases from Bacillus subtilis and Escherichia coli differ in recognition of regulatory signals in vitro. JBacteriol 182: 6027-6035.

11. Bar-Nahum G, Epshtein V, Ruckenstein A. E, Rafikov R, Mustaev A, Nudler E. 2005. A ratchet mechanism of transcription elongation and its control. Cell 120: 183-193.

12. Bar-Nahum G, Nudler E. 2001. Isolation and characterization of sigma(70)-retaining transcription elongation complexes from Escherichia coli. Cell 106: 443-451.

13. Barne K. A, Bown J. A, Busby S. J, Minchin S. D. 1997. Region 2.5 of the Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit is responsible for the recognition of the 'extended-10' motif at promoters. EMBOJ16: 4034-4040.

14. Batada N. N, Westover K. D, Bushnell D. A, Levitt M, Kornberg R. D. 2004. Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proc Natl Acad Sci USA 101: 17361-17364.

15. Berezovski M, Drabovich A, Krylova S. M, Musheev M, Okhonin V, Petrov A, Krylov S. N. 2005. Nonequilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures: a universal tool for development of aptamers. J Am Chem Soc 127: 3165-3171.

16. Berezovski M, Musheev M, Drabovich A, Krylov S. N. 2006. Non-SELEX Selection of Aptamers. J Am Chem Soc 128: 1410-1411.

17. Bianchini M, Radrizzani M, Brocardo M. G, Reyes G. B, Gonzalez Solveyra C, Santa-Coloma T. A. 2001. Specific oligobodies against ERK-2 that recognize both the native and the denatured state of the protein. J Immunol Methods 252: 191-197.

18. Biroccio A, Hamm J, Incitti I, De Francesco R, Tomei L. 2002. Selection of RNA aptamers that are specific and high-affinity ligands of the hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase. J Virol 76: 3688-3696.

19. Blank M, Weinschenk T, Priemer M, Schluesener H. 2001. Systematic evolution of a DNA aptamer binding to rat brain tumor microvessels. selective targeting of endothelial regulatory protein pigpen. J Biol Chem 276: 16464-16468.

20. Bock L. C, Griffin L. C, Latham J. A, Vermaas E. H, Toole J. J. 1992. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature 355: 564-566.

21. Boeger H, Bushnell D. A, Davis R, Griesenbeck J, Lorch Y, Strattan J. S, Westover K. D, Kornberg R. D. 2005. Structural basis of eukaryotic gene transcription. FEBS Lett 579: 899903.

22. Borukhov S., Goldfarb A. 1993. Recombinant Escherichia coli RNA polymerase: purification of individually overexpressed subunits and in vitro assembly. Protein Expr Purif 4: 503-511.

23. Borukhov S., Polyakov A., Nikiforov V., Goldfarb A. 1992. GreA protein: a transcription elongation factor from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci US A 89: 8899-8902.

24. Borukhov S., Sagitov V., Goldfarb A. 1993. Transcript cleavage factors from E. coli. Cell 72: 459-466.

25. Breaker R. R. 1997. DNA aptamers and DNA enzymes. Curr Opin Chem Biol 1: 26-31.

26. Bridonneau P., Chang Y. F., Buvoli A. V., O'Connell D., Parma D. 1999. Site-directed selection of oligonucleotide antagonists by competitive elution. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 9: 1-11.

27. Brodolin K., Mustaev A., Severinov K., Nikiforov V. 2000. Identification of RNA polymerase beta' subunit segment contacting the melted region of the lacUV5 promoter. J Biol Chem 275: 3661-3666.

28. Brodolin K., Zenkin N., Mustaev A., Mamaeva D., Heumann H. 2004. The sigma 70 subunit of RNA polymerase induces lacUV5 promoter-proximal pausing of transcription. Nat Struct Mol Biol 11: 551-557.

29. Brodolin K. L., Studitsky V. M., Mirzabekov A. D. 1993. Conformational changes in E. coli RNA polymerase during promoter recognition. Nucleic Acids Res 21: 5748-5753.

30. Brody E. N., Gold L. 2000. Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J Biotechnol 74:5.13.

31. Brody E. N., Willis M. C., Smith J. D., Jayasena S., Zichi D., Gold L. 1999. The use of aptamers in large arrays for molecular diagnostics. Mol Diagn 4: 381-388.

32. Brown D., Gold L. 1995. Template recognition by an RNA-dependent RNA polymerase: identification and characterization of two RNA binding sites on Q beta replicase. Biochemistry 34: 14765-14774.

33. Brueckner F., Cramer P. 2008. Structural basis of transcription inhibition by alpha-amanitin and implications for RNA polymerase II translocation. Nat Struct Mol Biol 15: 811-818.

34. Bruno J. G., Kiel J. L. 1999. In vitro selection of DNA aptamers to anthrax spores with electrochemiluminescence detection. Biosens Bioelectron 14: 457-464.

35. Buc H., McClure W. R. 1985. Kinetics of open complex formation between Escherichia coli RNA polymerase and the lac UV5 promoter. Evidence for a sequential mechanism involving three steps. Biochemistry 24: 2712-2723.

36. Burgess R. R. 1969. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J Biol Chem 244: 6160-6167.

37. Burgess R. R., Jendrisak J. J. 1975. A procedure for the rapid, large-scall purification of Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase involving Polymin P precipitation and DNA-cellulose chromatography. Biochemistry 14: 4634-4638.

38. Burgstaller P., Jenne A., Blind M. 2002. Aptamers and aptazymes: accelerating small molecule drug discovery. Curr Opin Drug Discov Devel 5: 690-700.

39. Burke D. H., Scates L., Andrews K., Gold L. 1996. Bent pseudoknots and novel RNA inhibitors of type 1 human immunodeficiency virus (HIV-l) reverse transcriptase. J Mol Biol 264: 650-666.

40. Bushnell D. A., Cramer P., Kornberg R. D. 2002. Structural basis of transcription: alpha-amanitin-RNA polymerase II cocrystal at 2.8 A resolution. Proc Natl Acad Sci USA 99: 12181222.

41. Bushnell D. A., Westover K. D., Davis R. E., Kornberg R. D. 2004. Structural basis of transcription: an RNA polymerase II-TFIIB cocrystal at 4.5 Angstroms. Science 303: 983-988.

42. Callaci S., Heyduk E., Heyduk T. 1998. Conformational changes of Escherichia coli RNA polymerase sigma70 factor induced by binding to the core enzyme. J Biol Chem 273: 3299533001.

43. Callaci S., Heyduk E., Heyduk T. 1999. Core RNA polymerase from E. coli induces a major change in the domain arrangement of the sigma 70 subunit. Mol Cell 3: 229-238.

44. Callaci S., Heyduk T. 1998. Conformation and DNA binding properties of a single-stranded DNA binding region of sigma 70 subunit from Escherichia coli RNA polymerase are modulated by an interaction with the core enzyme. Biochemistry 37: 3312-3320.

45. Campbell E. A., Korzheva N., Mustaev A., Murakami K., Nair S., Goldfarb A., Darst S. A. 2001. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial ma polymerase. Cell 104: 901912.

46. Campbell E. A., Muzzin O., Chlenov M., Sun J. L., Olson C. A., Weinman O., Trester-Zedlitz M. L., Darst S. A. 2002. Structure of the bacterial RNA polymerase promoter specificity sigma subunit. Mol Cell 9: 527-539.

47. Campbell E. A, Pavlova O, Zenkin N, Leon F, Irschik H, Jansen R, Severinov K, Darst S. A. 2005. Structural, functional, and genetic analysis of sorangicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Embo J24: 674-682.

48. Carey J, Cameron V, de Haseth P. L, Uhlenbeck О. C. 1983. Sequence-specific interaction of R17 coat protein with its ribonucleic acid binding site. Biochemistry 22: 26012610.

49. Cech C. L, McClure W. R. 1980. Characterization of ribonucleic acid polymerase-T7 promoter binary complexes. Biochemistry 19: 2440-2447.

50. Cerchia L, Duconge F, Pestourie C, Boulay J, Aissouni Y, Gombert K, Tavitian B, de Franciscis V, Libri D. 2005. Neutralizing aptamers from whole-cell SELEX inhibit the RET receptor tyrosine kinase. PLoSBiol 3: el23.

51. Cerchia L, Hamm J, Libri D, Tavitian B, de Franciscis V. 2002. Nucleic acid aptamers in cancer medicine. FEBS Lett 528: 12-16.

52. Chafin D. R, Guo H, Price D. H. 1995. Action of alpha-amanitin during pyrophosphorolysis and elongation by RNA polymerase II. J Biol Chem 270: 19114-19119.

53. Chamberlin M. J. (1976). In RNA polymerase, R. Losiclc, and M. J. Chamberlin, eds. (Cold Srping Harbor, NY, Cold Srping Harbor Lab.), pp. 159-191.

54. Charlton J, Kirschenheuter G. P, Smith D. 1997a. Highly potent irreversible inhibitors of neutrophil elastase generated by selection from a randomized DNA-valine phosphonate library. Biochemistry 36: 3018-3026.

55. Charlton J, Sennello J, Smith D. 1997b. In vivo imaging of inflammation using an aptamer inhibitor of human neutrophil elastase. Chem Biol 4: 809-816.

56. Chatterji D, FujitaN, Ishihama A. 1998. The mediator for stringent control, ppGpp, binds to the beta-subunit of Escherichia coli RNA polymerase. Genes Cells 3: 279-287.

57. Chen H, Gold L. 1994. Selection of high-affinity RNA ligands to reverse transcriptase: inhibition of cDNA synthesis and RNase H activity. Biochemistry 33: 8746-8756.

58. Collett J. R, Cho E. J, Ellington A. D. 2005. Production and processing of aptamer microarrays. Methods 37: 4-15.

59. Conrad R, Keranen L. M, Ellington A. D, Newton A. C. 1994. Isozyme-specific inhibition of protein kinase С by RNA aptamers. J Biol Chem 269: 32051-32054.

60. Conrad R. C, Giver L, Tian Y, Ellington A. D. 1996. In vitro selection of nucleic acid aptamers that bind proteins. Methods Enzymol 267: 336-367.

61. Convery M. A., Rowsell S., Stonehouse N. J., Ellington A. D., Hirao I., Murray J. В., Peabody D. S., Phillips S. E., Stockley P. G. 1998. Crystal structure of an RNA aptarner-protein complex at 2.8 A resolution. Nat Struct Biol 5: 133-139.

62. Cox J. C., Hayhurst A., Hesselberth J., Bayer T. S., Georgiou G., Ellington A. D. 2002. Automated selection of aptamers against protein targets translated in vitro: from gene to aptamer. Nucleic Acids Res 30: el 08.

63. Cramer P., Bushnell D. A., Kornberg R. D. 2001. Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science 292: 1863-1876.

64. Croft J. E., Love D. R., Bergquist P. L. 1987. Expression of leucine genes from an extremely thermophilic bacterium in Escherichia coli. Mol Gen Genet 210: 490-497.

65. Dang C., Jayasena S. D. 1996. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. J Mol Biol 264: 268-278.

66. Darst S. A. 2001a. Bacterial RNA polymerase. Curr Opin Struct Biol 11: 155-162.

67. Darst S. A. 2001b. Bacterial RNA polymerase. Curr Opin Struct Biol 11: 155-162.

68. Davidson E. A., Ellington A. D. 2005. Engineering regulatory RNAs. Trends Biotechnol 23: 109-112.

69. Dombroski A. J. 1997. Recognition of the -10 promoter sequence by a partial polypeptide of sigma70 in vitro. J Biol Chem 272: 3487-3494.

70. Dombroski A. J., Walter W. A., Gross C. A. 1993. Amino-terminal amino acids modulate sigma-factor DNA-binding activity. Genes Dev 7: 2446-2455.

71. Donahue J. P., Turnbough C. L., Jr. 1990. Characterization of transcriptional initiation from promoters PI and P2 of the pyrBI operon of Escherichia coli K12. J Biol Chem 265: 1909119099.

72. Drabovich A., Berezovski M., Krylov S. N. 2005. Selection* of smart aptamers by equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures (ECEEM). J Am Chem Soc 127: 11224-11225.

73. Eaton В. E. 1997. The joys of in vitro selection: chemically dressing oligonucleotides to satiate protein targets. Curr Opin Chem Biol 1: 10-16.

74. Eaton В. E., Gold L., Zichi D. A. 1995. Let's get specific: the relationship between specificity and affinity. Chem Biol 2: 633-638.

75. Eaton В. E., Pieken W. A. 1995. Ribonucleosides and RNA. Annu Rev Biochem 64: 837863.

76. Ebright R. H. 2000. RNA polymerase: structural similarities between bacterial RNA polymerase and'eukaryotic RNA polymerase II. J Mol Biol 304: 687-698.

77. Ederth J., Artsimovitch I., Isaksson L. A., Landick R. 2002. The downstream DNA jaw of bacterial RNA polymerase facilitates both transcriptional initiation and pausing. J Biol Chem 277: 37456-37463.

78. Ellington A. D., Szostak J. W. 1990. Imvitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346: 818-822.

79. Ellington A. D., Szostak J. W. 1992. Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligand-binding structures. Nature 355: 850-852.

80. Epshtein V., Mustaev A., Markovtsov V., Bereshchenko O., Nikiforov V., Goldfarb-A. 2002. Swing-gate model of nucleotide entry into the RNA polymerase active center. Mol Cell 10: 623-634.

81. Espinoza C. A., Allen T. A., Hieb A. R., Kugel J. F., Goodrich J. A. 2004. B2 RNA binds directly to RNA polymerase II to repress transcript synthesis. Nat Struct Mol Biol 11: 822-829.

82. Eulberg D., Buchner K., Maasch C., Klussmann S. 2005. Development of an automated in vitro selection protocol to obtain RNA-based aptamers: identification of a biostable substance P antagonist. Nucleic Acids Res 33: e45.

83. Famulok M. 2005. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Curr Opin Mol Ther 7: Л 37-143.

84. Faraldo M. M., de Pedro M. A., Berenguer J. 1992. Sequence of the S-layer gene of Thermus thermophilus HB8 and functionality of its promoter in Escherichia coli. J Bacteriol 174: 7458-7462.

85. Fenton M. S., Gralla J. D. 2001. Function of the bacterial TATAAT -10 element as single-stranded DNA during RNA polymerase isomerization. Proc Natl Acad Sci U SA 98: 9020-9025.

86. Fenton M. S., Lee S. J., Gralla J. D. 2000. Escherichia coli promoter opening and -10 recognition: mutational analysis of sigma70. EMBO J19: 1130-1137.

87. Fields P. A. 2001. Review: Protein function at thermal extremes: balancing stability and flexibility. Comp Biochem Physiol A Mo I Integr Physiol 129: 417-431.

88. Figueroa-Bossi N., Guerin M., Rahmouni R., Leng M., Bossi L. 1998. The supercoiling sensitivity of a bacterial tRNA promoter parallels its responsiveness to stringent control. EMBO J 17: 2359-2367.

89. Fisher T. S., Joshi P., Prasad V. R. 2002. Mutations that confer resistance to template-analog inhibitors of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 reverse transcriptase lead to severe defects in HIV replication. J Virol 76: 4068-4072.

90. Fitter S., James R. 2005. Deconvolution of a complex target using DNA aptamers. J Biol Chem 280: 34193-34201.

91. Fukuda K., Vishinuvardhan D., Sekiya S., Kakiuchi N., Shimotohno K., Kumar P. K., Nishikawa S. 1997. Specific RNA aptamers to NS3 protease domain of hepatitis С virus. Nucleic Acids Symp Ser: 237-238.

92. Gander T. R., Brody E. N. 2005. Photoaptamer chips for clinical diagnostics. Expert Rev Mol Diagn 5: 1-3.

93. Giver L., Bartel D., Zapp M., Pawul A., Green M., Ellington A. D. 1993. Selective optimization of the Rev-binding element of HIV-1. Nucleic Acids Res 21: 5509-5516.

94. Gnatt A. L., Cramer P., Fu J., Bushnell D. A., Kornberg R. D. 2001. Structural basis of transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution. Science 292: 18761882.

95. Gold L., Brody E., Heilig J., Singer B. 2002a. One, two, infinity: genomes filled with aptamers. Chem Biol 9: 1259-1264.

96. Gold L., Brown D., He Y., Shtatland Т., Singer B. S., Wu Y. 1997a. From oligonucleotide shapes to genomic SELEX: novel biological regulatory loops. Proc Natl Acad Sci USA 94: 5964.

97. Gold L., Polisky В., Uhlenbeck O., Yarns M. 1995. Diversity of oligonucleotide functions. Annu Rev Biochem 64: 763-797.

98. Gold L, Singer B, He Y. Y, Brody E. 1997b. SELEX and the evolution of genomes. Curr Opin Genet Dev 7: 848-851.

99. Gold L, Ziehi D, Smith J. D. 2002b. Modified SELES processes without purified protein (USA).

100. Golden M. C, Collins B. D, Willis M. C., Koch Т. H. 2000. Diagnostic potential of PhotoSELEX-evolved ssDNA aptamers. JBiotechnol 81: 167-178.

101. Golding G. B, Dean A. M. 1998. The structural basis of molecular adaptation. Mol Biol Evol 15: 355-369.

102. Gourse R. L, Gaal T, Aiyar S. E, Barker M. M, Estrem S. T, Hirvonen C. A, Ross W. 1998. Strength and regulation without transcription factors: lessons from bacterial rRNA promoters. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63: 131-139.

103. Gross C. A, Chan C, Dombroski A, Gruber T, Sharp M, Tupy J, Young B. 1998. The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63: 141-155.

104. Hale S. P, Schimmel P. 1996. Protein synthesis editing by a DNA aptamer. Proc Natl Acad Sci USA 93: 2755-2758.

105. Hamaguchi N, Ellington A, Stanton M. 2001. Aptamer beacons for the direct detection of proteins. Anal Biochem 294: 126-131.

106. Hamm J. 1996. Characterisation of antibody-binding RNAs selected from structurally constrained libraries. Nucleic Acids Res 24: 2220-2227.

107. Hamm J, Fornerod M. 2000. Anti-idiotype RNAs that mimic the leucine-rich nuclear export signal and specifically bind to CRMl/exportin 1. Chem Biol 7: 345-354.

108. Hamm J, Huber J, Luhrmann R. 1997. Anti-idiotype RNA selected with an anti-nuclear export signal antibody is actively transported in oocytes and inhibits Rev- and cap-dependent RNA export. Proc Natl Acad Sci USA 94: 12839-12844.

109. Handschin J. C, Wehrli W. 1976. On the kinetics of the rifampicin-RNA-polymerase complex. Differences between crude and purified enzyme fractions. Eur J Biochem 66: 309-317.

110. Hartmann G., Honikel К. O., Knusel F., Nuesch J. 1967. The specific inhibition of the DNA-directed RNA synthesis by rifamycin. Biochim Biophys Acta 145: 843-844.

111. Hartmann R. K., Erdmann V. A. 1989. Thermus thermophilus 16S rRNA is transcribed from an isolated transcription unit. JBacteriol 171: 2933-2941.

112. Hartmann R. K., Ulbrich N., Erdmann V. A. 1987. An unusual rRNA operon constellation: in Thermus thermophilus HB8 the 23S/5S rRNA operon is a separate entity from the 16S rRNA operon. Biochimie 69: 1097-1104.

113. Haugen S. P., Berkmen M. В., Ross W., Gaal Т., Ward C., Gourse R. L. 2006. rRNA promoter regulation by nonoptimal binding of sigma region 1.2: an additional recognition element for RNA polymerase. Cell 125: 1069-1082.

114. Haugen S. P., Ross W., Gourse R. L. 2008a. Advances in bacterial promoter recognition and its control by factors that do not bind DNA. Nat Rev Microbiol 6: 507-519.

115. Haugen S. P., Ross W., Manrique M., Gourse R. L. 2008b. Fine structure of the promoter-sigma region 1.2 interaction. Proc Natl Acad Sci USA 105: 3292-3297.

116. Hermann Т., Patel D. J. 2000. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science 287: 820-825.

117. Hernandez V. J., Hsu L. M., Cashel M. 1996. Conserved region 3 of Escherichia coli final sigma70 is implicated in the process of abortive transcription. J Biol Chem 271: 18775-18779.

118. Hesselberth J., Robertson M. P., Jhaveri S.5 Ellington A. D. 2000. In vitro selection of nucleic acids for diagnostic applications. JBiotechnol 74: 15-25.

119. Heyduk E., Heyduk T. 2002. Conformation of fork junction DNA in a complex with E. coli RNA polymerase. Biochemistry 41: 2876-2883.

120. Heyduk Т., Heyduk E. 2001. Luminescence energy transfer with lanthanide chelates: interpretation of sensitized acceptor decay amplitudes. Analytical Biochemistry 289: 60-67.

121. Hicke B. J., Marion C., Chang Y. F., Gould Т., Lynott С. K., Parma D., Schmidt P. G., Warren S. 2001. Tenascin-C aptamers are generated using tumor cells and purified protein. J Biol Chem 276: 48644-48654.

122. Higashitani A., Higashitani N., Horiuchi K. 1997. Minus-strand origin of filamentous phage versus transcriptional promoters in recognition of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 94: 2909-2914.

123. Hinkle D. C., Mangel W. F., Chamberlin M. J. 1972. Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. IV. The effect of rifampicin on binding and on RNA chain initiation. JMol Biol 70: 209-220.

124. Hirao I., Harada Y., Nojima Т., Osawa Y., Masaki H., Yokoyama S. 2004. In vitro selection of RNA aptamers that bind to colicin E3 and structurally resemble the decoding site of 16S ribosomal RNA. Biochemistry 43: 3214-3221.

125. Hogan B. P., Hartsch Т., Erie D. A. 2002. Transcript cleavage by Thermus thermophilus RNA polymerase. Effects of GreA and anti-GreA factors. J Biol Chem 277: 967-975.

126. Hogg Т., Mechold U., Malke H., Cashel M., Hilgenfeld R. 2004. Conformational antagonism between opposing active sites in a bifunctional RelA/SpoT homolog modulates (p)ppGpp metabolism during the stringent response corrected. Cell 117: 57-68.

127. Homann M., Goringer H. U. 1999. Combinatorial selection of high affinity RNA ligands to live African trypanosomes. Nucleic Acids Res 27: 2006-2014.

128. Horiuchi K. 1997. Initiation mechanisms in replication of filamentous phage DNA. Genes Cells 2: 425-432.

129. Hsu L. M. 2002. Promoter clearance and escape in prokaryotes. Biochim Biophys Acta 1577:191-207.

130. Hsu L. M. 2009. Monitoring abortive initiation. Methods 47: 25-36.

131. Hsu L. M., Vo N. V., Chamberlin M. J. 1995. Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB stimulate promoter escape and gene expression in vivo and in vitro. Proc Natl AcadSci USA 92: 11588-11592.

132. Huang D. В., Vu D., Cassiday L. A., Zimmerman J. M., Maher L. J., 3rd, Ghosh G. 2003. Crystal structure of NF-kappaB (p50)2 complexed to a high-affinity RNA aptamer. Proc Natl AcadSci USAm-. 9268-9273.

133. Jaeger J., Restle Т., Steitz T. A. 1998. The structure of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an RNA pseudoknot inhibitor. EMBOJ11: 4535-4542.

134. Jayasena S. D. 1999. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin Chem 45: 1628-1650.

135. Jensen К. В., Atkinson B. L., Willis M. C., Koch Т. H., Gold L. 1995. Using in vitro selection to direct the covalent attachment of human immunodeficiency virus type 1 Rev protein to high-affinity RNA ligands. Proc Natl AcadSci USA 92: 12220-12224.

136. Jin D. J., Gross C. A. 1988. Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance. J Mol Biol 202: 45-58.

137. Jing N., Rando R. F., Pommier Y., Hogan M. E. 1997. Ion selective folding of loop domains in a potent anti-HIV oligonucleotide. Biochemistry 36: 12498-12505.

138. Jores L., Wagner R. 2003. Essential steps in the ppGpp-dependent regulation of bacterial ribosomal RNA promoters can be explained by substrate competition. J Biol Chem 278: 1683416843.

139. Juang Y. L., Helmann J. D. 1994. A promoter melting region in the primary sigma factor of Bacillus subtilis. Identification of functionally important aromatic amino acids. J Mol Biol 235: 1470-1488.

140. Jung Y. H., Lee Y. 1997. Escherichia coli rnpB promoter mutants altered in stringent response. Biochem Biophys Res Commun 230: 582-586.

141. Kang P. J., Craig E. A. 1990. Identification and characterization of a new Escherichia coli gene that is a dosage-dependent suppressor of a dnaK deletion mutation. JBacteriol 172: 20552064.

142. Kapanidis A. N., Margeat E., Ho S. O., Kortkhonjia E., Weiss S., Ebright R. H. 2006. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science 314: 1144-1147.

143. Kaplan C. D., Kornberg R. D. 2008. A bridge to transcription by RNA polymerase. J Biology 7: 39.31-39.34.

144. Kaplan C. D., Larsson К. M., Kornberg R. D. 2008. The RNA polymerase II trigger loop functions in substrate selection and is directly targeted by alpha-amanitin. Mol Cell 30: 547-556.

145. Kettenberger H., Armache K. J., Cramer P. 2004. Complete RNA polymerase II elongation complex structure and its interactions with NTP and TFIIS. Mol Cell 16: 955-965.

146. Kettenberger H., Eisenfiihr A., Brueckner F., Theis M., Famulok M., Cramer P. 2006a. Structure of an RNA polymerase II-RNA inhibitor complex elucidates transcription regulation by noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol 13: 44-48.

147. Kettenberger H., Eisenfuhr A., Brueckner F., Theis M., Famulok M., Cramer P. 2006b. Structure of an RNA polymerase II-RNA inhibitor complex elucidates transcription regulation by noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol 13: 44-48.

148. Knight R., Yarns M. 2003. Analyzing partially randomized nucleic acid pools: straight dope on doping. Nucleic Acids Res 31: e30.

149. Komissarova N., Kashlev M. 1997a. RNA polymerase switches between inactivated and activated states By translocating back and forth along the DNA and the RNA. J Biol Chem 272: 15329-15338.

150. Komissarova N., Kashlev M. 1997b. RNA polymerase switches between inactivated and activated states By translocating back and forth along the DNA and the RNA. J Biol Chem 272: 15329-15338.

151. Komissarova N., Kashlev M. 1997c. Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded. Proc Natl Acad Sci USA 94: 1755-1760.

152. Korzheva N., Mustaev A., Kozlov M., Malhotra A., Nikiforov V., Goldfarb A., Darst S. A. 2000. A structural model of transcription elongation. Science 289: 619-625.

153. Korzheva N., Mustaev A., Nudler E., Nikiforov V., Goldfarb A. 1998. Mechanistic model of the elongation complex of Escherichia coli RNA polymerase. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63:337-345.

154. Koulich D., Nikiforov V., Borukhov S. 1998. Distinct functions of N and C-terminal domains of GreA, an Escherichia coli transcript cleavage factor. JMol Biol 276: 379-389.

155. Kovacic R. T. 1987. The 0 degree С closed complexes between Escherichia coli RNA polymerase and two promoters, T7-A3 and lacUV5. J Biol Chem 262: 13654-13661.

156. Kramer M. G., Espinosa M., Misra Т. K., Khan S. A. 1999. Characterization of a single-strand origin, ssoU, required for broad host range replication of rolling-circle plasmids. Mol Microbiol 33:466-475.

157. Kramer M. G., Khan S. A., Espinosa M. 1997. Plasmid rolling circle replication: identification of the RNA polymerase-directed primer RNA and requirement for DNA polymerase I for lagging strand synthesis. Embo J16: 5784-5795.

158. Krummel В., Chamberlin M. J. 1992. Structural analysis of ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase. Individual complexes halted along different transcription units have distinct and unexpected biochemical properties. J Mol Biol 225: 221-237.

159. Kubik M. F., Stephens A. W., Schneider D., Marlar R. A., Tasset D. 1994. High-affinity RNA ligands to human alpha-thrombin. Nucleic Acids Res 22: 2619-2626.

160. Kulbachinskiy A, Feklistov A, Krasheninnikov I, Goldfarb A, Nikiforov V. 2004. Aptamers to Escherichia coli core RNA polymerase that sense its interaction with rifampicin, sigma-subunit and GreB. Eur J Biochem 271: 4921-4931.

161. Kulish D, Lee J, Lomakin I, Nowicka B, Das A, Darst S, Normet K, Borukhov S. 2000. The functional role of basic patch, a structural element of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB. J Biol Chem 275: 12789-12798.

162. Kumar A, Malloch R. A, Fujita N, Smillie D. A, Ishihama A, Hayward R. S. 1993. The minus 35-recognition region of Escherichia coli sigma 70 is inessential for initiation of transcription at an "extended minus 10" promoter. J Mol Biol 232: 406-418.

163. Kumar P. K, Machida K, Urvil P. T, Kakiuchi N, Vishnuvardhan D, Shimotohno K, Taira K, Nishikawa S. 1997. Isolation of RNA aptamers specific to the NS3 protein of hepatitis С virus from a pool of completely random RNA. Virology 237: 270-282.

164. Kusser W. 2000. Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitro selections: evolving evolution. JBiotechnol 74: 27-38.

165. Kuznedelov K, Lamour V, Patikoglou G, Chlenov M, Darst S. A, Severinov K. 2006. Recombinant Thermus aquaticus RNA polymerase for structural studies. J Mol Biol 359: 110121.

166. Kuznedelov K, Minakhin L, Niedziela-Majka A, Dove S. L, Rogulja D, Nickels В. E, Hochschild A, Heyduk T, Severinov K. 2002b. A role for interaction of the RNA polymerase flap domain with the sigma subunit in promoter recognition. Science 295: 855-857.

167. Majovski R. С., Khaperskyy D. A., Ghazy M. A., Ponticelli A. S. 2005. A functional role for the switch 2 region of yeast RNA polymerase II in transcription start site utilization and abortive initiation. J Biol Chem 280: 34917-34923.

168. Malhotra A., Severinova E., Darst S. A. 1996. Crystal structure of a sigma 70 subunit fragment from E. coli RNA polymerase. Cell 87: 127-136.

169. Mallik P., Paul B. J., Rutherford S. Т., Gourse R. L., Osuna R. 2006. DksA is required for growth phase-dependent regulation, growth rate-dependent control, and stringent control of fis expression in Escherichia coli. JBacteriol 188: 5775-5782.

170. Mandal M., Boese В., Barrick J. E., Winkler W. C., Breaker R. R. 2003. Riboswitches control fundamental biochemical pathways in Bacillus subtilis and other bacteria. Cell 113: 577586.

171. Markovtsov V., Mustaev A., Goldfarb A. 1996. Protein-RNA interactions in the active center of transcription elongation complex. Proc Natl Acad Sci USA 93: 3221-3226.

172. Marr M. Т., Roberts J. W. 1997. Promoter recognition as measured by binding of polymerase to nontemplate strand oligonucleotide. Science 276: 1258-1260.

173. Martin E., Sagitov V., Burova E., Nikiforov V., Goldfarb A. 1992. Genetic dissection of the transcription cycle. A mutant RNA polymerase that cannot hold onto a promoter. J Biol Chem 267: 20175-20180.

174. Maseda H., Hoshino T. 1995. Screening and analysis of DNA fragments that show promoter activities in Thermus thermophilus. FEMS Microbiol Lett 128: 127-134.

175. Mathews D. E., Durbin R. D. 1990. Tagetitoxin inhibits RNA synthesis directed by RNA polymerases from chloroplasts and Escherichia coli. J Biol Chem 265: 493-498.

176. Mathews D. E., Durbin R. D. 1994. Mechanistic aspects of tagetitoxin inhibition of RNA polymerase from Escherichia coli. Biochemistry 33: 11987-11992.

177. McCauley T. G., Hamaguchi N., Stanton M. 2003. Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules. Anal Biochem 319: 244-250.

178. McClure W. R. 1985. Mechanism and control of transcription initiation in prokaryotes. Annu Rev Biochem 54: 171-204.

179. McClure W. R., Cech C. L. 1978. On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis. J Biol Chem 253: 8949-8956.

180. Mendonsa S. D., Bowser M. T. 2004. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc 126: 20-21.

181. Minakhin L., Nechaev S., Campbell E. A., Severinov K. 2001. Recombinant Thermus aquaticus RNA polymerase, a new tool for structure- based analysis of transcription. J Bacteriol 183:71-76.

182. Minakhin L., Severinov K. 2003. On the role of the Escherichia coli RNA polymerase sigma 70 region 4.2 and alpha-subunit C-terminal domains in promoter complex formation on the extended -10 galPl promoter. J Biol Chem 278: 29710-29718.

183. Morris K. N., Jensen К. В., Julin С. M., Weil M., Gold L. 1998. High affinity ligands from in vitro selection: complex targets. Proc Natl AcadSci USA 95: 2902-2907.

184. Mukhopadhyay J., Das K., Ismail S., Koppstein D., Jang M., Hudson В., Sarafianos S., Tuske S., Patel J., Jansen R., Irschik H., Arnold E., Ebright R. H. 2008. The RNA polymerase "switch region" is a.target for inhibitors. Cell 135: 295-307.

185. Murakami K. S., Darst S. A. 2003. Bacterial RNA polymerases: the wholo story. Curr Opin Struct Biol 13: 31-39.

186. Murakami K. S., Masuda S., Campbell E. A., Muzzin O., Darst S. A. 2002a. Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science 296: 1285-1290.

187. Murakami K. S., Masuda S., Darst S. A. 2002b. Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 A resolution. Science 296: 1280-1284.

188. Murphy M. В., Fuller S. Т., Richardson P. M., Doyle S. A. 2003. An improved method for the in vitro evolution of aptamers and applications in protein detection and purification. Nucleic Acids Res 31: el 10.

189. Nardmann J., Messer W. 2000. Identification and characterization of the dnaA upstream region of Thermus thermophilus. Gene 261: 299-303.

190. Naryshkina Т., Kuznedelov К., Severinov К. 2006. The role of the largest RNA polymerase subunit lid element in preventing the formation of extended RNA-DNA hybrid. J Mol Biol 361: 634-643.

191. Naryshkina Т., Mustaev A., Darst S. A., Severinov K. 2001. The beta 1 subunit of Escherichia coli RNA polymerase is not required for interaction with initiating nucleotide but is necessary for interaction with rifampicin. J Biol Chem 276: 13308-13313.

192. Nechaev S., Chlenov M., Severinov K. 2000. Dissection of two hallmarks of the open promoter complex by mutation in an RNA polymerase core subunit. J Biol Chem 275: 2551625522.

193. Nechaev S., Severinov K. 1999. Inhibition of Escherichia coli RNA polymerase by bacteriophage T7 gene 2 protein. J Mol Biol 289: 815-826.

194. Nickels В. E., Mukhopadhyay J., Garrity S. J., Ebright R. H., Hochschild A. 2004. The sigma 70 subunit of RNA polymerase mediates a promoter-proximal pause at the lac promoter. Nat Struct Mol Biol 11: 544-550.

195. Nikiforov V. G. 1970. Substrate dependent heterogeneity of initiation by RNA polymerase from thermophilic B. megaterium. FEBS Lett 9: 186-188.

196. Nikiforov V. G. 1971. Hybrid RNA polymerases formed from core enzymes and sigma factors of E. coli and thermophilic B. megaterium. FEBS Lett 16: 74-76.

197. Nimjee S. M., Rusconi C. P., Sullenger B. A. 2005. Aptamers: an emerging class of therapeutics. Annu Rev Med 56: 555-583.

198. Nomura M., Gourse R., Baughman G. 1984. Regulation of the synthesis of ribosomes and ribosomal components. Annu Rev Biochem 53: 75-117.

199. Nudler E. 1999. Transcription elongation: structural basis and mechanisms. J Mol Biol 288:1.12.

200. Nudler E., Avetissova E., Markovtsov V., Goldfarb A. 1996. Transcription processivity: protein-DNA interactions holding together the elongation complex. Science 273: 211-217.

201. Nudler E., Kashlev M., Nikiforov V., Goldfarb A. 1995. Coupling between transcription termination and RNA polymerase inchworming. Cell 81: 351-357.

202. Nudler E., Mironov A. S. 2004. The riboswitch control of bacterial metabolism. Trends Biochem Sci 29: 11-17.

203. Nudler E., Mustaev A., Lukhtanov E., Goldfarb A. 1997. The RNA-DNA hybrid maintains the register of transcription by preventing backtracking of RNA polymerase. Cell 89: 33-41.

204. Nutiu R., Li Y. 2005. Aptamers with fluorescence-signaling properties. Methods 37: 16-25.

205. Opalka N., Chlenov M., Chacon P., Rice W. J., Wriggers W., Darst S. A. 2003. Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase. Cell 114: 335-345.

206. Orlova M., Newlands J., Das A., Goldfarb A., Borukhov S. 1995. Intrinsic transcript cleavage activity of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 92: 4596-4600.

207. Osipiuk J., Joachimiak A. 1997. Cloning, sequencing, and expression of dnaK-operon proteins from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Biochim Biophys Acta 1353: 253-265.

208. Padmanabhan K., Padmanabhan K. P., Ferrara J. D., Sadler J. E., Tulinsky A. 1993. The structure of alpha-thrombin inhibited by a 15-mer single-stranded DNA aptamer. J Biol Chem 268: 17651-17654.

209. Pal M., Ponticelli A. S., Luse D. S. 2005. The role of the transcription bubble and TFIIB in promoter clearance by RNA polymerase II. Mol Cell 19: 101-110.

210. Pan W., Craven R. C., Qiu Q„ Wilson С. В., Wills J. W., Golovine S., Wang J. F. 1995. Isolation of virus-neutralizing RNAs from a large pool of random sequences. Proc Natl Acad Sci USA 92: 11509-11513.

211. Panaghie G., Aiyar S. E., Bobb K. L., Hayward R. S., de Haseth P. L. 2000. Aromatic amino acids in region 2.3 of Escherichia coli sigma 70 participate collectively in the formation of an RNA polymerase-promoter open complex. J Mol Biol 299: 1217-1230.

212. Patel D. J., Suri A. K., Jiang F., Jiang L., Fan P., Kumar R. A., Nonin S. 1997. Structure, recognition and adaptive binding in RNA aptamer complexes. J Mol Biol 272: 645-664.

213. Paul B. J., Berkmen M. В., Gourse R. L. 2005. DksA potentiates direct activation of amino acid promoters by ppGpp. Proc Natl Acad Sci USA 102: 7823-7828.

214. Paul В. J, Ross W, Gaal T, Gourse R. L. 2004b. rRNA transcription in Escherichia coli. Annu Rev Genet 38: 749-770.

215. Pemberton I. K, Muskhelishvili G, Travers A. A, Buckle M. 2000. The G+C-rich discriminator region of the tyrT promoter antagonises the formation of stable preinitiation complexes. J Mol Biol 299: 859-864.

216. Perederina A, Svetlov V, Vassylyeva M. N, Tahirov Т. H, Yokoyama S, Artsimovitch I, Vassylyev D. G. 2004. Regulation through the secondary channel—structural framework for ppGpp-DksA synergism during transcription. Cell 118: 297-309.

217. Pestourie C, Tavitian B, Duconge F. 2005. Aptamers against extracellular targets for in vivo applications. Biochimie 87: 921-930.

218. Petach H, Gold L. 2002. Dimensionality is the issue: use of photoaptamers in protein microarrays. Curr Opin Biotechnol 13: 309-314.

219. Polyakov A, Richter C, Malhotra A, Koulich D, Borukhov S, Darst S. A. 1998. Visualization of the binding site for the transcript cleavage factor GreB on Escherichia coli RNA polymerase. J Mol Biol 281: 465-473.

220. Potrykus K, Cashel M. 2008. (p)ppGpp: still magical? Annu Rev Microbiol 62: 35-51.

221. Proske D, Blank M, Buhmann R, Resch A. 2005. Aptamers—basic research, drug development, and clinical applications. Appl Microbiol Biotechnol 69: 367-374.

222. Proske D., Gilch S, Wopfner F, Schatzl H. M, Winnacker E. L, Famulok M. 2002. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. Chembiochem 3: 717-725.

223. Ramirez-Romero M. A, Masulis I, Cevallos M. A, Gonzalez V, Davila G. 2006. The Rhizobium etli sigma70 (SigA) factor recognizes a lax consensus promoter. Nucleic Acids Res 34: 1470-1480.

224. Reiter N. J, Maher L. J, 3rd, Butcher S. E. 2008. DNA mimicry by a high-affinity anti-NF-kappaB RNA aptamer. Nucleic Acids Res 36: 1227-1236.

225. Remold-O'Donnell E, Zillig W. 1969. Purification and properties of DNA-dependent RNA-polymerase from Bacillus stearothermophilus. Eur J Biochem 7: 318-323.

226. Revyakin A, Liu C, Ebright R. H, Strick T. R. 2006. Abortive initiation and productive initiation by RNA polymerase involve DNA scrunching. Science 314: 1139-1143.

227. Ring В. Z., Yarnell W. S., Roberts J. W. 1996. Function of E. coli RNA polymerase sigma factor sigma 70 in promoter-proximal pausing. Cell 86: 485-493.

228. Ringquist S., Jones Т., Snyder E. E., Gibson Т., Boni I., Gold L. 1995. High-affinity RNA ligands to Escherichia coli ribosomes and ribosomal protein SI: comparison of natural and unnatural binding sites. Biochemistry 34: 3640-3648.

229. Roberts C. W., Roberts J. W. 1996. Base-specific recognition of the nontemplate strand of promoter DNA by E. coli RNA polymerase. Cell 86: 495-501.

230. Roberts J. W., Yarnell W., Bartlett E., Guo J., Marr M., Ко D. C., Sun H., Roberts C. W. 1998. Antitermination by bacteriophage lambda Q protein. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63:319-325.

231. Robertson M. P., Knudsen S. M., Ellington A. D. 2004. In vitro selection of ribozymes dependent on peptides for activity. RNA 10: 114-127.

232. Ross W., Gosink К. K., Salomon J., Igarashi K., Zou C., Ishihama A., Severinov K., Gourse R. L. 1993. A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase. Science 262: 1407-1413.

233. Ross W., Gourse R. L. 2005. Sequence-independent upstream DNA-alphaCTD interactions strongly stimulate Escherichia coli RNA polymerase-lacUV5 promoter association. Proc Natl AcadSci USA 102: 291-296.

234. Rowsell S., Stonehouse N. J., Convery M. A., Adams C. J., Ellington A. D., Hirao I., Peabody D. S., Stockley P. G., Phillips S. E. 1998. Crystal structures of a series of RNA aptamers complexed to the same protein target. Nat Struct Biol 5: 970-975.

235. Rozovskaya T. A., Chenchik A. A., Beabealashvilli R. 1982. Processive pyrophosphorolysis of RNA by Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Lett 137: 100-104.

236. Rudd M. D., Izban M. G., Luse D. S. 1994. The active site of RNA polymerase II participates in transcript cleavage within arrested ternary complexes. Proc Natl Acad Sci USA 91: 8057-8061.

237. Rudd M. D., Luse D. S. 1996. Amanitin greatly reduces the rate of transcription by RNA polymerase II ternary complexes but fails to inhibit some transcript cleavage modes. J Biol Chem 271: 21549-21558.

238. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989). Molecular cloning., Cold Spring Harbour Press.).

239. Sanchez R., Roovers M., Glansdorff N. 2000. Organization and expression of a Thermus thermophilus arginine cluster: presence of unidentified open reading frames and absence of a Shine-Dalgarno sequence. JBacteriol 182: 5911-5915.

240. Sanderson A., Mitchell J. E., Minchin S. D., Busby S. J. 2003. Substitutions in the Escherichia coli RNA polymerase sigma70 factor that affect recognition of extended -10 elements at promoters. FEBS Lett 544: 199-205.

241. Sato S., Nakada Y., Kanaya S., Tanaka T. 1988. Molecular cloning and nucleotide sequence of Thermus thermophilus HB8 trpE and trpG. Biochim Biophys Acta 950: 303-312.

242. Schickor P., Metzger W., Werel W., Lederer H., Heumann H. 1990. Topography of intermediates in transcription initiation of E.coli. EmboJ9: 2215-2220.

243. Schneider D., Tuerk C., Gold L. 1992. Selection of high affinity RNA ligands to the bacteriophage R17 coat protein. J Mol Biol 228: 862-869.

244. Schneider D. J., Feigon J., Hostomsky Z., Gold L. 1995. High-affinity ssDNA inhibitors of the reverse transcriptase of type 1 human immunodeficiency virus. Biochemistry 34: 9599-9610.

245. Schroeder L. A., deHaseth P. L. 2005. Mechanistic differences in promoter DNA melting by Thermus aquaticus and Escherichia coli RNA polymerases. J Biol Chem 280: 17422-17429.

246. Schultze P., Macaya R. F., Feigon J. 1994. Three-dimensional solution structure of the thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG). J Mol Biol 235: 1532-1547.

247. Schwartz E. С., Shekhtman A., Dutta K., Pratt M. R., Cowburn D., Darst S., Muir T. W. 2008. A full-length group 1 bacterial sigma factor adopts a compact structure incompatible with DNA binding. Chem Biol 15: 1091-1103.

248. Sen R., Nagai H., Shimamoto N. 2001. Conformational switching of Escherichia coli RNA polymerase-promoter binary complex is facilitated by elongation factor GreA and GreB. Genes Cells 6: 389-401.

249. Severinov K., Darst S. A. 1997. A mutant RNA polymerase that forms unusual open promoter complexes. Proc Natl Acad Sci USA 94: 13481-13486.

250. Severinov K., Fenyo D., Severinova E., Mustaev A., Chait В. Т., Goldfarb A., Darst S. A. 1994a. The sigma subunit conserved region 3 is part of "5'-face" of active center of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem 269: 20826-20828.

251. Severinov K., Soushko M., Goldfarb A., Nikiforov V. 1993. Rifampicin region revisited. New rifampicin-resistant and streptolydigin-resistant mutants in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem 268: 14820-14825.

252. Severinov K., Soushko M., Goldfarb A., Nikiforov V. 1994b. RifR mutations in the beginning of the Escherichia coli rpoB gene. Mol Gen Genet 244: 120-126.

253. Sharp M. M., Chan C. L., Lu C. Z., Marr M. Т., Nechaev S., Merritt E. W., Severinov K., Roberts J. W., Gross C. A. 1999. The interface of sigma with core RNA polymerase is extensive, conserved, and functionally specialized. Genes Dev 13: 3015-3026.

254. Shi H., Fan X., Ni Z., Lis J. T. 2002. Evolutionary dynamics and population control during in vitro selection and amplification with multiple targets. RNA 8: 1461-1470.

255. Shi H., Hoffman В. E., Lis J. T. 1997. A specific RNA hairpin loop structure binds the RNA recognition motifs of the Drosophila SR protein B52. Mol Cell Biol 17: 2649-2657.

256. Shtatland Т., Gill S. С., Javornik В. E., Johansson H. E., Singer B. S., Uhlenbeck О. C., Zichi D. A., Gold L. 2000. Interactions of Escherichia coli RNA with bacteriophage MS2 coat protein: genomic SELEX. Nucleic Acids Res 28: E93.

257. Siddhikol C., Erbstoeszer J. W., Weisblum B. 1969. Mode of action of streptolydigin. J Bacteriol 99:151-155.

258. Smith D., Collins B. D., Heil J., Koch Т. H. 2003. Sensitivity and specificity of photoaptamer probes. Mol Cell Proteomics 2: 11-18.

259. Smith J. D., Gold L. 2004. Conditional-SELEX (USA Patent).

260. Sorenson M. K., Ray S. S., Darst S. A. 2004. Crystal structure of the flagellar sigma/anti-sigma complex sigma(28)/FlgM reveals an intact sigma factor in an inactive conformation. Mol Cell 14: 127-138.

261. Sosunov V., Sosunova E., Mustaev A., Bass I., Nikiforov V., Goldfarb A. 2003. Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBO J 22: 2234-2244.

262. Sosunova E., Sosunov V., Kozlov M., Nikiforov V., Goldfarb A., Mustaev A. 2003. Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gre. Proc Natl Acad Sci USA 100: 15469-15474.

263. Spassky A., Busby S. J., Danchin A., Buc H. 1979. On the binding of tRNA to Escherichia coli RNA polymerase. Eur J Biochem 99: 187-201.

264. Stebbins С. E., Borukhov S., Orlova M., Polyakov A., Goldfarb A., Darst S. A. 1995. Crystal structure of the GreA transcript cleavage factor from Escherichia coli. Nature 373: 636640.

265. Steinberg Т. H., Mathews D. E., Durbin R. D., Burgess R. R. 1990. Tagetitoxin: a new inhibitor of eukaryotic transcription by RNA polymerase III. J Biol Chem 265: 499-505.

266. Steitz T. A. 1998. A mechanism for all polymerases. Nature 391: 231-232.

267. Stojanovic M. N., de Prada P., Landry D. W. 2001. Aptamer-based folding fluorescent sensor for cocaine. J Am Chem Soc 123: 4928-4931.

268. Struck J. C., Toschka H. Y., Erdmann V. A. 1988. Nucleotide sequence of the 4.5S RNA gene from Thermus thermophilus HB8. Nucleic Acids Res 16: 9042.

269. Svetlov V., Vassylyev D. G., Artsimovitch I. 2004. Discrimination against deoxyribonucleotide substrates by bacterial RNA polymerase. J Biol Chem 279: 38087-38090.

270. Tan L., Wiesler S., Trzaska D., Carney H. C., Weinzierl R. O. 2008. Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases. J Biol 7: 40.

271. Tasset D. M., Kubik M. F., Steiner W. 1997. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes. J Mol Biol 272: 688-698.

272. Thomas M., Chedin S., Carles C., Riva M., Famulok M., Sentenac A. 1997. Selective targeting and inhibition of yeast RNA polymerase II by RNA aptamers. J Biol Chem 272: 2798027986.

273. Thompson К. M., Syrett H. A., Knudsen S. M., Ellington A. D. 2002. Group I aptazymes as genetic regulatory switches. BMC Biotechnol 2: 21.

274. Toulokhonov, II, Shulgina I., Hernandez V. J. 2001. Binding of the transcription effector ppGpp to Escherichia coli RNA polymerase is allosteric, modular, and occurs near the N terminus of the beta'-subunit. J Biol Chem 276: 1220-1225.

275. Toulokhonov I., Landick R. 2003. The flap domain is required for pause RNA hairpin inhibition of catalysis by RNA polymerase and can modulate intrinsic termination. Mol Cell 12: 1125-1136.

276. Toulokhonov I., Landick R. 2006. The role of the lid element in transcription by E. coli RNA polymerase. J Mol Biol 361: 644-658.

277. Toulokhonov I., Zhang J., Palangat M., Landick R. 2007. A central role of the RNA polymerase trigger loop in active-site rearrangement during transcriptional pausing. Mol Cell 27: 406-419.

278. Tran К, Gralla J. D. 2008. Control of the timing of promoter escape and RNA catalysis by the transcription factor lib fingertip. J Biol Chem 283: 15665-15671.

279. Travers A. A. 1980. Promoter sequence for stringent control of bacterial ribonucleic acid synthesis. JBacteriol 141: 973-976.

280. Triqueneaux G, Velten M, Franzon P, Dautry F, Jacquemin-Sablon H. 1999. RNA binding specificity of Unr, a protein with five cold shock domains. Nucleic Acids Res 27: 19261934.

281. Tsiang M, Jain A. K, Dunn К. E, Rojas M. E, Leung L. L, Gibbs C. S. 1995. Functional mapping of the surface residues of human thrombin. J Biol Chem 270: 16854-16863.

282. Tsujikawa L, Strainic M. G, Watrob H, Barkley M. D, DeHaseth P. L. 2002. RNA polymerase alters the mobility of an A-residue crucial to polymerase-induced melting of promoter DNA. Biochemistry 41: 15334-15341.

283. Tuerk C, Gold L. 1990. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249: 505-510.

284. Tuerk C, MacDougal S, Gold L. 1992. RNA pseudoknots that inhibit human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Proc Natl Acad Sci USA 89: 6988-6992.

285. Uphoff K. W, Bell S. D, Ellington A. D. 1996. In vitro selection of aptamers: the dearth of pure reason. Curr Opin Struct Biol 6: 281-288.

286. Van de Casteele M, Chen P, Roovers M, Legrain C, Glansdorff N. 1997. Structure and expression of a pyrimidine gene cluster from the extreme thermophile Thermus strain Z05. J Bacteriol 179: 3470-3481.

287. Vassylyev D. G, Sekine S, Laptenko O, Lee J, Vassylyeva M. N, Borukhov S, Yokoyama S. 2002. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature 417: 712-719.

288. Vassylyev D. G, Svetlov V, Vassylyeva M. N, Perederina A, Igarashi N, Matsugaki N, Wakatsuki S, Artsimovitch I. 2005. Structural basis for transcription inhibition by tagetitoxin. Nat Struct Mol Biol 12: 1086-1093.

289. Vassylyev D. G, Vassylyeva M. N, Perederina A, Tahirov Т. H, Artsimovitch I. 2007a. Structural basis for transcription elongation by bacterial RNA polymerase. Nature 448: 157-162.

290. Vassylyev D. G., Vassylyeva M. N., Zhang J., Palangat M., Artsimovitch I., Landick R. 2007b. Structural basis for substrate loading in bacterial RNA polymerase. Nature 448: 163-168.

291. Vassylyeva M. N., Svetlov V., Dearborn A. D., Klyuyev S., Artsimovitch I., Vassylyev D. G. 2007. The carboxy-terminal coiled-coil of the RNA polymerase beta'-subunit is the main binding site for Gre factors. EMBO Rep 8: 1038-1043.

292. Vater A., Jarosch F., Buchner K., Klussmann S. 2003. Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX. Nucleic Acids Res 31: el30.

293. Vater A., Klussmann S. 2003. Toward third-generation aptamers: Spiegelmers and their therapeutic prospects. Curr Opin Drug Discov Devel 6: 253-261.

294. Vieille C., Zeikus G. J. 2001. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol Mol Biol Rev 65: 1-43.

295. Vuthoori S., Bowers C. W., McCracken A., Dombroski A. J., Hinton D. M. 2001. Domain 1.1 of the sigma(70) subunit of Escherichia coli RNA polymerase modulates the formation of stable polymerase/promoter complexes. J Mol Biol 309: 561-572.

296. Vuyisich M., Beal P. A. 2002. Controlling protein activity with ligand-regulated RNA aptamers. Chem Biol 9: 907-913.

297. Wagner R. 2002. Regulation of ribosomal RNA synthesis in E. coli: effects of the global regulator guanosine tetraphosphate (ppGpp). J Mol Microbiol Biotechnol 4: 331-340.

298. Wang D., Hawley D. K. 1993. Identification of a 3'—>5' exonuclease activity associated with human RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci USA 90: 843-847.

299. Wassarman К. M., Saecker R. M. 2006. Synthesis-mediated release of a small RNA inhibitor of RNA polymerase. Science 314: 1601-1603.

300. Weiss S., Proske D., Neumann M., Groschup M. H., Kretzschmar H. A., Famulok M., Winnacker E. L. 1997. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J Virol 71: 8790-8797.

301. Wen J. D., Gray D. M. 2002. The Ff gene 5 single-stranded DNA-binding protein binds to the transiently folded form of an intramolecular G-quadruplex. Biochemistry 41: 11438-11448.

302. Westover К. D., Bushnell D. A., Komberg R. D. 2004. Structural basis of transcription: nucleotide selection by rotation in the RNA polymerase II active center. Cell 119: 481-489.

303. White R., Rusconi C., Scardino E., Wolberg A., Lawson J., Hoffman M., Sullenger B. 2001. Generation of species cross-reactive aptamers using "toggle" SELEX. Mol Ther 4: 567573.

304. Wieland Т., Faulstich H. 1991. Fifty years of amanitin. Experientia 47: 1186-1193.

305. Wilson D. S., Szostak J. W. 1999. In vitro selection of functional nucleic acids. Annu Rev Biochem 68: 611-647.

306. Winter R. В., Morrissey L., Gauss P., Gold L., Hsu Т., Karam J. 1987. Bacteriophage T4 regA protein binds to mRNAs and prevents translation initiation. Proc Natl Acad Sci U S A 84: 7822-7826.

307. Xu W., Ellington A. D. 1996. Anti-peptide aptamers recognize amino acid sequence and bind a protein epitope. Proc Natl Acad Sci U SA 93: 7475-7480.

308. Xue Y., Hogan B. P., Erie D. A. 2000. Purification and initial characterization of RNA polymerase from Thermus thermophilus strain HB8. Biochemistry 39: 14356-14362.

309. Yamamoto R, Baba Т., Kumar P. K. 2000a. Molecular beacon aptamer fluoresces in the presence of Tat protein of HIY-1. Genes Cells 5: 389-396.

310. Yang X., Price C. W. 1995. Streptolydigin resistance can be conferred by alterations to either the beta or beta' subunits of Bacillus subtilis RNA polymerase. J Biol Chem 270: 2393023933.

311. Yarbrough L. R., Wu F. Y., Wu C. W. 1976. Molecular mechanism of the rifampicin-RNA polymerase interaction. Biochemistry 15: 2669-2676.

312. Young B. A., Gruber Т. M., Gross C. A. 2002. Views of transcription initiation. Cell 109: 417-420.

313. Yuzenkova Y., Zenkin N., Severinov K. 2008. Mapping of RNA polymerase residues that interact with bacteriophage XplO transcription antitermination factor p7. J Mol Biol 375: 29-35.

314. Zalenskaya K., Lee J., Gujuluva C. N., Shin Y. K., Slutsky M., Goldfarb A. 1990. Recombinant RNA polymerase: inducible overexpression, purification and assembly of Escherichia coli rpo gene products. Gene 89: 7-12.

315. Zaychikov E., Martin E., Denissova L., Kozlov M., Markovtsov V., Kashlev M., Heumann H., Nikiforov V., Goldfarb A., Mustaev A. 1996. Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. Science 273: 107-109.

316. Zenkin N., Naryshkina Т., Kuznedelov K., Severinov K. 2006. The mechanism of DNA replication primer synthesis by RNA polymerase. Nature 439: 617-620.

317. Zenkin N., Severinov K. 2004. The role of RNA polymerase sigma subunit in promoter-independent initiation of transcription. Proc Natl Acad Sci USA 101: 4396-4400.

318. Zhang G., Campbell E. A., Minakhin L., Richter C., Severinov K., Darst S. A. 1999. Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell 98: 811824.

319. Zhang Z., Blank M., Schluesener H. J. 2004. Nucleic acid aptamers in human viral disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 52: 307-315.

320. Копылов A. M., Спиридонова В. A. 2000. Комбинаторная химия нуклеиновых кислот: SELEX. Молекулярная биология 34: 1097-1113.

321. Лаптенко О. А., Божков А. И., Борухов С. И. 2000. Gre-гомологичные факторы транскрипции GreA-1 и GreA-2 из Thermus thermophilus: клонирование, очистка и анализ функциональной активности. Биологический вестник 4: 3-14.

Информация о работе

Кульбачинский, Андрей Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Механизмы инициации транскрипции у мезофильных и термофильных бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы