Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм образования митотического веретена в клетках высших растений

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизм образования митотического веретена в клетках высших растений"

На правах рукописи

СМИРНОВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ МИТОТИЧЕСКОГО ВЕРЕТЕНА В КЛЕТКАХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Специальность 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва 2004 год.

Работа выполнена на кафедре клеточной биология и гистологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. МБ. Ломоносова

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор Ю.С. Ченцов Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Ю.М. Васильев Доктор биологических наук, профессор С.Г. Васецкий Доктор биологических наук И.Б.Алиева

Ведущая организация - Институт Физиологии растений РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится 19 февраля 2004 года в часов на заседании

диссертационного советаД.501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан-января 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, к.б.н.

E.Н. Калистратова

2004-4 24166

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Во время митоза происходит равномерное распределение и передача эквивалентного наследственного материала от материнской клетки дочерним. В эукариотических клетках эта функция осуществляется при помощи веретена деления, состоящего из антипараллельных систем микротрубочек (МТ), у которых минус-концы сфокусированы в полюсе веретена, а плюс-концы обращены к хромосомам. В результате веретено имеет эллиптическую биполярную форму, и именно биполярность веретена обеспечивает эквивалентное распределение хромосом в дочерние клетки (Wittmann et al.,

Митотическое веретено является структурой, универсальной для всех эукариотических организмов, и поэтому основные принципы его организации сходны для всех типов клеток. Однако еще ранние морфологические исследования показали, что форма веретена различается у разных организмов (Wilson, 1928). Биполярное эллиптическое веретено животных клеток отличается от бочковидного веретена клеток высших растений по форме и по организации полюсов. В полюсе веретена большинства эукариотических клеток находится дискретная структура, фокусирующая МТ и регулирующая число, поведение и распределение МТ в клетке (Andersen, 1999). Эта структура выполняет функции центра организации МТ (ЦОМТ), который обычно представлен центросомой (Brinkley, 1985; Vorobjev and Nadezhdina, 1987; Wittmann et al., 2001). «Классическая» или типичная центросома состоит из центриолей, окруженных аморфным перицентриолярным материалом (ПЦМ), который и выполняет функции ЦОМТ (Brinkley, 1985; Andersen, 1999). Ранние электронно-микроскопические исследования показали, что в клетках высших растений отсутствуют центриоли, и МТ веретена сходятся в обширную, богатую внутриклеточными мембранными пузырьками "полярную" зону (Pickett-Heaps, 1969). Как оказалось, в клетках высших растений также отсутствует структура, которая была бы морфологически сходна с центросомой или составляющими ее компонентами (Baskin and Cande, 1990).

Система МТ в клетках животных и высших растений имеет и другие принципиальные различия. В клетках животного происхождения, в интерфазе МТ образуют радиальную сеть, отходящую от центросомы. В начале митоза интерфазная сеть разбирается и вместо нее формируется эллиптическое биполярное веретено, в каждом полюсе которого находится центросома (Andersen, 1999). В клетках высших растений, в ходе клеточного цикла последовательно формируются четыре системы МТ - кортикальная или радиальная сеть МТ в интерфазе, препрофазное кольцо МТ (ППК) в конце Gj-

2001).

периода, митотическое веретено и

библиотека

Lambert and

Lloyd, 1994). Эти структуры последовательно замещают друг друга в клеточном цикле, и, как правило, новая система собирается «на фоне» деградации и разборки предшествующей системы.

В настоящее время существуют разные точки зрения о происхождении и формировании систем МТ в ходе клеточного цикла у высших растений (Vaughn and Harper, 1998). Долго время доминировала гипотеза Мэзия (Mazia, 1987) о том, что за организацию всех систем МТ в растительных клетках отвечает единый универсальный ЦОМТ, представленный "диффузной центросомой" (Cande, 1990). Затем было высказано предположение, что организация четырех систем МТ регулируется с помощью нескольких специализированных ЦОМТ (Vaughn and Harper, 1998). «Промежуточное» положение между двумя этими точками зрения занимает гипотеза о том, что в ходе клеточного цикла происходит последовательная реорганизация одной системы МТ в другую (Palevitz, 1991). Однако ни одна из этих гипотез не объясняет, каким образом в клетках высших растений формируется митотическое веретено (Маге, 1997; Vaughn and Harper, 1998; Canaday et al., 2000).

Последовавшие во второй половине 90-х годов исследования показали, что веретено может формироваться без участия в этом процессе центросомы или иного ЦОМТ. Формирование веретена происходит вследствие само-организации -способности линейных полимеров формировать упорядоченные структуры из дезорганизованной сети, которая происходит при динамическом взаимодействии между моторными белками и МТ (Mitchison, 1992; Hyman and Karsenti, 1996). Механизм ЦОМТ-независимой организации веретена подтвержден многочисленными данными, полученными in vivo и in vitro. Суть этого процесса состоит в том, что при отсутствии центросомы (ЦОМТ) МТ реорганизуются и формируют упорядоченные конфигурации - конвергентные или радиальные структуры, го которых затем собирается веретено деления (Gaglio et al., 1996, 1997; Heald et al., 1996, 1997; Merdes et al., 1996; Nedelec et aL, 1997; Rodionov and Borisy, 1997; Surrey et al., 2001). Основную роль в этом процессе играют структурные (NuMa - nuclear mitotic apparatus protein) и моторные белки (динеин, кинезины). Вместе в динеином и динактином NuMa образует тримолекулярный комплекс, обеспечивающий схождение и удерживание минус-концов МТ в единый фокус, который впоследствии станет полюсом веретена, независимо от присутствия там центросомы (ЦОМТ). Кинезины принимают участие в сортировке МТ в пучки и поддержание структурной целостности веретена (Mountain and Compton, 2000).

Предположение о том, что формирование митотического веретена в клетках высших растений происходит без участия центросомы путем само-реорганизации МТ,

появилось за несколько лет до того, как были получены данные, подтверждающие возможность такого процесса. Наблюдения за реорганизацией МТ в безъядерных клеточных фрагментах (цитопластах), спонтанно образующихся при выделении на агаровую подложку эндосперма Haemanthus позволили описать стадии реорганизации хаотической сети МТ в упорядоченные структуры (полярные и спиралевидные пучки, полуверетена и биполярные веретеновидные структуры) (Bajer and Mole-Baler, 1986). Этот процесс был назван само-реорганизацией МТ, и высказано предположение, что формирование веретена в клетках сравнимо с трансформацией системы МТ в цитопластах. Однако факты, свидетельствующие о том, что митотическое веретено клеток высших растений формируется ЦОМТ-независимым способом, до последнего времени отсутствовали. Вместе с тем, многие исследователи до настоящего времени придерживаются традиционной точки зрения на вопрос о происхождении митотического веретена в клетках высших растений (включая концепцию диффузной центросомы и множественных специализированных ЦОМТ) (Vaughn and Harper, 1998).

В связи с этим, основной целью данной работы было исследовать механизм формирования митотического веретена в клетках высших растений при отсутствии в них морфологически выявляемой центросомы.

Задачи исследования заключались в том, чтобы

I. Установить, есть ли в полюсах митотического веретена клеток высших растений активно функционирующие ЦОМТ. Для решения этой задачи необходимо исследовать характер восстановления МТ после их экспериментальной разборки.

П. Выявит ь структуры, участвующие в формировании митотического веретена. Для решения этой задачи следует установить и изучить переходные стадии формирования и перестройки веретена при переходе клеток из интерфазы в митоз и из митоза в интерфазу.

III. Установить, присутствуют ли в полюсах митотического веретена высших растений белки, которые локализуются в ЦОМТ других эукариотических клеток.

1) Белки центросомы не участвующие в ЦОМТ-независимой сборке веретена (белки выявляемые антителами МРМ-2 и у-тубулин).

2) Белки участвующие в ЦОМТ-независимой сборке веретена (NuMa и моторные белки МТ).

Полученные в ходе исследования данные позволят сделать заключение о том, каков механизм организации веретена: регулируется ли этот процесс ЦОМТ, расположенным в полюсе веретена, или веретено формируется ЦОМТ-независимым способом.

Научная новизна проведенного исследования состоит в том, что впервые было показано отсутствие в клетках как единого универсального, так и специализированного полюсного ЦОМТ, и предложен механизм альтернативной, ЦОМТ-независимой сборки веретена путем само-организации МТ. Были идентифицированы и охарактеризованы центры конвергенции МТ (ЦКМТ), описана их структура, поведение и закономерности реорганизации. ЦКМТ - это элементарные структурные и функциональные единицы, из которых формируются интерфазная сеть МТ, веретено и фрагмопласт. ЦКМТ являются предшественниками кинетохорных фибрилл (К-фибрилл), которые являются составным компонентом митотического веретена. Избыточное формирование ЦКМТ наблюдается при восстановлении МТ после действия факторов, влияющих на полимеризацию тубулина (ингибиторы, повышенная и пониженная температура). Было установлено, что ЦКМТ играют ведущую роль в реорганизации интерфазной сети в митотическое веретено при переходе из интерфазы в профазу, и в пост-телофазной реорганизации цитоскелета (дифференцировке фрагмопласта и формировании интерфазной сети). Нами впервые была установлена внутриклеточная локализация белка ядерного матрикса и митотического веретена NuMa в клетках высших растений, изучено его распределение при изменении состояния системы МТ. Продемонстрировано участие минус-конец ориентированного моторного белка КСВР в реорганизации полюсов митотического веретена. Полученные данные позволили выдвинуть предположение о том, что функциональное митотическое веретено может формироваться ЦОМТ-независимым способом в результате само-организации МТ. Практическое значение. Полученные в работе данные, касающиеся особенностей формирования и организации цитоскелета в клетках высших растений, носят фундаментальный характер и расширяют представления не только о механизме деления растительных клеток, но имеют и общебиологическое значение. Способность МТ к самоорганизации проявляется in vitro и может быть индуцирована в клетках животного происхождения в экспериментальных условиях, в то время как в клетках высших растений эта способность реализуется в соматических клетках в процессе сборки митотического веретена. Исследования, касающиеся восстановления системы МТ после экспериментально индуцированной деполимеризации с помощью колхицина, оризалина и действия пониженной температуры, имеют прикладное значение, так как связаны с адаптивными свойствами клеток (холодоустойчивость) и искусственной полиплоидизацией (колхицин), а также выявляют механизм действия гербицидов (оризалин). Эти данные могут быть использованы в биоинженерии и биотехнологии. Результаты данного исследования были использованы в учебниках по клеточной

биологии, и используются в лекционных курсах на кафедре клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Апробация диссертационного материала

Материалы настоящего исследования были представлены на конференциях Американского Общества клеточных биологов в 1992, 1994, 1996, 1997, 2003 г., Гордоновской конференции (США) по цитоскелету высших и низших растений в 1993 г., конференции НАТО «Сегрегации хромосом и анеуплоидия» (Греция, 1993), конференции НАТО «Биомеханика активного движения и деления клеток» (Турция, 1994), на конференции «Центросома и полярные тельца» (Санта-Круз, США 1997), IX Международной конференции по эмбриологии растений (Краков, Польша 1999), Международной конференции «Цитоскелет растительных клеток» (Киев, 2002), I Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург 2003).

Структура диссертации. Диссертация изложена на страницах и состоит из 5 глав (гл.1

- Введение, гл.2 - Обзор литературы, гл.3 - Материалы и методика, гл.4 - Результаты, гл.5

- Обсуждение результатов), Выводов и Списка цитированной литературы. Список цитированной литературы содержит 4 отечественных и 423 зарубежных публикаций. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами, 10 схемами и 68 микрофотографиями, которые объединены в 78 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ, Работа была выполнена на изолированных клетках эндосперма Haemanthus katherinae Bak и клетках меристемы корня лука Allium сера L. и пшеницы Triticum aestivum L. (сорт Московская 35).

Эндосперм африканской шарообразной (красной) лилии Haemanthus katherinae Bak. (Scadoxus katherinae Bak) на ранних стадиях дифференцировки выделяли из зародышевого мешка на покровные стекла, покрытые раствором жидкого фитоагара, распластывали под воздействием сил поверхностного натяжения, а затем покрывали сверху пленкой Gelrite. Клетки фиксировали через разные интервалы времени после выделения (от 1 минуты до 6 часов) (Bajer and Mole-Bajer, 1986). Для наблюдений in vivo, покровные стекла прикрепляли к камерам из силикона, смонтированным на предметных стеклах. Пространство между покровным и предметным стеклом заполнялось флюорокарбоновым маслом (F40). Для записи изображений был использован инвертированный микроскоп Nikon снабженный объективами Nikon (Ph 40 х DL NA. 0.55 и Ph 20 х DL NA. 0.40). Изображения записывали на видеосистему JVC VCR модель HR-S4700U, собирали с помощью Apple Video Player (version 1.6.3) и обрабатывали с помощью Adobe Photoshop 4.0. Для измерений длины отростков, изображения собирались

с помощью ATI Video Player, ATI Technologies Inc. 1997 (version 1.0) и анализировались с использованием Scion Image for Windows 95 (Scion Corporation, 1997). ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ОКРАШИВАНИЕ КЛЕТОК ЭНДОСПЕРМА Выявление МТ с помощью окрашивания коллоидным золотом проводили по стандартным методикам (De Mey et al., 1982; Bajer and Mole-Bajer, 1986). Для иммуноцитохимического анализа, препараты инкубировали в растворе кроличьих поликлональных антител к тубулину, а затем в растворе козьих антител к кроличьим IgG, конъюгированных с 15-20 нм или 1-5 нм коллоидным золотом. Для выявления хроматина и хромосом, клетки окрашивали толуидиновым синим. Препараты анализировали с помощью микроскопа Zeiss, оснащенного объективом X 63 Plan Apo NA. 1.4 в сочетании с 522 нм, 550 нм и 570 нм трансмиссионными интерференционными фильтрами и фотографировали на пленку Kodak Technical Pan 2415. Выявление МТ и ассоциированных с ними белков с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии. Антитела МРМ-2 (получены к фосфорнлированным белкам митотических ЦОМТ). Для иммунофлюоресцентного анализа, препараты фиксировали в 100% метаноле при -20°С или инкубировали в буферном растворе РНЕМ рН 6.9, содержащем 60 mM PIPES, 25 шМ HEPES, 10 шМ EGTA, 2 шМ МзС^и 0.5-1% Triton Х-100, а затем фиксировали в 100% метаноле или в

3.7 % параформальдегиде. Затем препараты инкубировали в смеси кроличьих поликлональных антител к тубулину и мышиных моноклональных антител МРМ-2. В качестве вторых антител были использованы козьи антитела к кроличьим IgG, конъюгированные с TRITC и овечьи антитела к мышиным IgG, конъюгированные с ИТ С. Препараты анализировали и фотографировали на пленку Tri-X (Kodak) используя Zeiss микроскоп, оснащенный набором фильтров для двойного флюоресцентного анализа и объективами х40 and x100 UV (Nikon). Антитела к минус-конец ориентированному кинезино-подобному белку КСВР. Фиксация и обработка клеток проводилась в соответствии с описанной выше методикой. Для иммуноцитохимического анализа препараты инкубировали в смеси мышиных моноклональных антител к ß-тубулину и кроличьих поликлональных антител к КСВР, а затем козьими антителами к мышиным IgG, конъюгированными с НТС и ослиными антителами к кроличьим IgG, конъюгированными с Texas Red. Препараты анализировали и фотографировали на пленку Tri-X (Kodak) и Ektachrome Elite 200, используя микроскоп Zeiss оснащенный системой фильтров для двойного флюоресцентного анализа и объективом X 63 Plan Apo 1.4 NA. (Zeiss). Антитела к NuMa (белок ядерного матрикса и митотического веретена) иу-тубулину. Клетки фиксировали и обрабатывали в соответствии с описанным выше

протоколом. Для иммуноцитохимического анализа препараты инкубировали в смеси мышиных моноклональных антител к (J-тубулину и кроличьих поликлональных антителах к NuMa или у-тубулину, а затем с козьими антителами к мышиным IgG, конъюгированными с FITC и ослиными антителами к кроличьим IgG, конъюгированными с Texas Red, и докрашивали DAPI. Препараты анализировали и фотографировали на пленку Tii-X (Kodak) и Ektachrome Elite 200, используя микроскоп Zeiss оснащенный системой фильтров для двойного флюоресцентного анализа и объективом X 63 Plan Apo 1.4 N.A. (Zeiss). Двойное окрашивание на актин и тубулин. Клетки фиксировали в 100% метаноле и обрабатывали по методике описанной ранее. Были использованы мышиные моноклональные антитела к F-актину и кроличьи поликлональные антитела к тубулину. В качестве вторых антител были использованы козьи антимышиные антитела конъюгированные с FITC и ослиные антикроличьи антитела конъюгированные с Texas Red. Клетки фотографировали, используя Zeiss Photoscope III оснащенный Zeiss 63x Plan Apo N.A. 1.4 объективом.

ПОЛУЧЕНИЕ И ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ОКРАШИВАНИЕ КЛЕТОК МЕРИСТЕМЫ КОРНЯ.

Апикальная меристема Allium сера L, Семена лука Allium сера проращивали на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри при 25°С до достижения корешками длины 1 см. Затем проростки использовали для экспериментальных воздействий на систему МТ. 1) Проростки семян инкубировали в 0.2% водном растворе колцемида в течение 1 часа, переносили в воду и инкубировали в течение 1-18 часов. 2) Проростки инкубировали в водном растворе хлоралгидрата в концентрации 0.02 %, 0.04 %, 0.06 %, 0.08 %, 0.1 % и 0.2 % в течение 3, 6, 18 и 24 часов. 3) Проростки инкубировали в 0.01 мМ водном растворе оризалина в течение 1, 2, 3, 6, 12 и 24 часов. После 24 часов инкубации в присутствии оризалина, корешки переносили в воду и инкубировали в течение 1, 2, 3, 6, 12, 18 и 24 часов. 4) Проростки инкубировали в 0.04 мМ водном растворе таксола в течение 2, 4, 6, 9, и 12 часов. Кончики корешков фиксировали в 4 % параформальдегиде, приготовленном на буферном растворе РНЕМ и обрабатывали в растворе 1 % целлюлизина или 0.5 % Cellulase Onozuka. После этого клетки выделяли на покровные стекла. Для иммуноцитохимического анализа препараты инкубировали 1) с мышиными моноклональными антителами к 0 -тубулину, 2) в смеси мышиных моноклональных антител к Р-тубулину и кроличьих поликлональных антител к NuMa. Далее препараты инкубировали с 1) овечьими анти-мышиными IgG, конъюгированными с FITC или 2) в смеси овечьих анти-мышиных IgG конъюгированных с FITC и ослиных анти-кроличьих IgG, конъюгированных с Texas Red.

Апикальная меристема Triticum aestivum L. Семена пшеницы Triticum aestivum L. (сорт Московская 35) проращивали на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри при 25°С до достижения корешками длины 1 см. Затем проростки помещали в водный раствор 0.2% колхицина на 0.5,1,2,3,6, 12,18 и 24 часа, после чего кончики корешков отрезали и фиксировали. После 6 и 24 часов роста в присутствии колхицина, корешки также переносили в воду и инкубировали в течение 1-6,12,18 и 24 часов, а затем фиксировали. Для экспериментов с пониженной температурой, корешки инкубировали 3, 6, 12,18 и 24 часа в контейнерах, помещенных в термос с тающим льдом (около 0°С), а затем фиксировали при комнатной температуре (18-22°С). В качестве контроля использовались корешки, зафиксированные в растворе, охлажденном в термосе со льдом. Фиксация и выделение клеток было таким же, как и для Allium сера. Далее клетки инкубировали с 1) мышиными моноклональными антителами к ct-тубулину, клон DM1A (Sigma), 2) мышиными моноклональными антителами к ацетилированному а-тубулину, клон 6-11В-1 (Sigma), 3) крысиными моноклональными антителами к тирозилированному а--тубулину, клон YL 1/2. Затем клетки инкубировали с ИТС-конъюгированными анти-мышиными IgG, Alexa-конъюгированными анти-крысиными IgG (Molecular Probes) или TRITC-конъюгированными анти-крысиными (Sigma). Препараты анализировали с использованием светового микроскопа Zeiss оснащенного стандартным набором фильтров и объективом Neofluar XI00. Изображения записывали с помощью DC камеры Kodak 260 и анализировали с помощью пакета программ Adobe Photoshop 6.0. Электронная микроскопия ПРОРОСТКИ Triticum aestivum L фиксировали в 2.5% глютаровом альдегиде, постфиксировали в 1% OsO«, помещали в 70% этанол с 2% уранил ацетатом, обезвоживали в этаноле и ацетоне и заключали в эпоновую смолу (Гайер, 1973). Полу-толстые срезы анализировали с использованием фазово-контрастного микроскопа, выбирали клетки на определенных стадиях и переносили их на эпоновые блоки. Ультратонкие срезы были приготовлены с использованием ультратома LKB 3. Образцы анализировали с использованием электронного микроскопа Jeol CX100. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ И ВЕСТЕРН БЛОТИНГ (WESTERN BLOTTING).

Клетки эндосперма Haemanthus суспендировали в стандартном буферном растворе Лэммли (10% глицерин, 5% 2-меракптоэтанол, 2% SDS, 62.5 mM Tris-Cl, pH 6.8). Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и Western blotting проводили по стандартным методикам (Ausubel et al., 1992). Щелочную фосфатазу выявляли с помощью реагента BCIP/NBT (Sigma). Выявление белков, содержащих антиген МРМ-2. Клеточный экстракт анализировали в 7.5%? 10%, 12.5% и в 4-20% градиентном

полиакриламидном гелях. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в течение 2 часов с антителами МРМ-2 разведенными 1:5000, и 1 час с кроличьими антителами к мышиным IgG конъюгированными со щелочной фосфатазой, разведенными 1:10,000. Выявление КСВР и NuMa. Экстракты клеток Haemanthus разделяли в 7.5 % полиакриламидном геле. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали антителами к КСВР разведенными 1:400 или антителами к NuMa разведенными 1:1000. В качестве вторых антител использовали овечьи антитела к кроличьим IgG конъюгированные со щелочной фосфатазой.

Использованные в работе антитела.- Кроличьи поликлональные антитела к тубулину были предоставлены Dr. J. De Меу; антитела МРМ-2 - Dr. P.Rao; антитела к КСВР - Dr. A.S.H. Reddy, антитела к NuMa - Dr. D. Compton; антитела к у-тубулину - Dr. H. Joshi; антитела к тирозилированному тубулину - к.б.н. А. Ходяков. Все другие антитела были коммерческими продуктами от Amersham Science.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫ1Х ЦОМТ

Одним из отличительных признаков центросомы как доминирующего ЦОМТ является инициация роста МТ после экспериментально индуцированной разборки МТ. Так как в клетках высших растений нет морфологически определяемой центросомы (Baskin and Cande, 1990), присутствие ЦОМТ может быть определено по локализации активных центров полимеризации (сборки) МТ. Для определения функционально активных ЦОМТ нами были использованы ингибиторы полимеризации тубулина колхицин и колцемид. Также известны вещества, которые не оказывают прямого воздействия на динамику МТ, однако влияют на их организацию и распределение в клетке. К таким веществам относится транквилизатор хлоралгидрат. Данные, полученные на клетках животных, свидетельствуют о воздействии хлоралгидрата на центросому как ЦОМТ, что в свою очередь ведет к изменению поведения МТ и их способности формировать митотическое веретено (Schatten and Chakrabarti, 1998).

Колхицин вызывает практически полную разборку МТ в клетках меристемы корня Triticum aestivum, в результате чего клетки переходят в состояние К-митоза, Однако такой эффект колхицина на МТ наблюдается только в самые начальные периоды воздействия (до 1 часа). Продолжительное воздействие (2-24 часа) вызывает формирование в клетках немикротрубочковых тубулиновых агрегатов (Utrilla et al., 1989; Apostolakos et al., 1990; Karagiannidou et al. 1995). Несмотря на то, что основной задачей данного исследования было изучение характера восстановления МТ после их деполимеризации, мы также проследили за появлением, реорганизацией и структурными модификациями таких

тубулиновых агрегатов. Через 2-6 часов после начала воздействия, длинные тубулиновые тяжи, расположенные в кортикальной цитоплазме, появляются во всех клетках находящихся на стадии К-метафазы. Во время К-телофазы кортикальные тяжи становятся менее выраженными, в то время как около хромосом появляются короткие тубулиновые пучки. На электронно-микроскопическом уровне кортикальные тяжи представляют собой структуры, состоящие из аморфного фибриллярного материала. Таким образом, короткое действие колхицина индуцирует формирование однородныхпоультраструктуре кортикальныхтубулиновыхтяжей вК-митотических клетках.

Через 24 часа инкубации в присутствии колхицина в интерфазных и К-митотических клетках появляется новый тип структур - игло-подобные пучки. Закрученные в спирали пучки выявляются около хромосом, которые находятся на стадии близкой к К-телофазе. Электронно-микроскопические исследования показали, что в интерфазных клетках присутствует разветвленная сеть компактных структур с выраженной поперечной исчерченностью. В К-митотических клетках было обнаружено несколько типов фибриллярных агрегатов: 1) пучки, состоящие из макротрубочек (каждая диаметром примерно 40 пш); 2 участки цитоплазмы, заполненные аморфным фибриллярным материалом; 3) скопления параллельно уложенных тубулярных структур, выявляемые на продольном срезе, и на поперечном срезе имеющие вид гексагонально уложенных ячеек; 4) разветвленные исчерченные структуры, сходные с теми, которые наблюдались в интерфазных клетках; 5) стопки тонких (диаметром примерно 15 пш) палочко-подобныхтрубочек. Таким образом, длительное действие колхицина вызывает формирование гетерогенныхтубулиновыхагрегатов как в интерфазных, так и К-митотическихклетках.

Тубулиновые агрегаты отличаются не только по времени появления, форме и ультраструктуре. В контрольных клетках меристемы корня Triticum aestivum ацетилированный а-губулин не выявляется в интерфазных и митотических МТ. Однако ацетилированный тубулин появляется в составе индуцированных 24-часовым воздействием колхицина игло-подобных пучков. В то же время, в контрольных клетках антитела к тирозилированному а-тубулину выявляют интерфазную сеть, ППК, веретено и фрагмопласт. Однако кортикальные тяжи, индуцированные 6-часовым воздействием колхицина, не содержат тирозилированный -тубулин. Вместе с тем, тирозилированный -тубулин снова появляется в составе пучков, индуцированных 24-часовым воздействием колхицина. Таким образом, тубулиновые агрегаты отличаются по изотипам тубулина, и длительное воздействиеколхицина индуцирует такую посттрансляционную модификациюа-тубулина как ацетилирование.

Восстановление системы МТ после действия колхицина. Для того чтобы установить, с какими структурами связано восстановление МТ, корешки помещали в раствор с колхицином на 6 часов (для индукции кортикальных тяжей) и 24 часа (для индукции игло-подобных пучков), а затем инкубировали в отсутствие колхицина. После 6-часов действия колхицина, изменения в организации тубулинового цитоскелета наблюдаются через 5-6 часов инкубации в отсутствие агента. В К-митотических клетках уменьшается количество кортикальных тяжей, они разрыхляются и дезорганизуются. Только в тех К-метафазных клетках, где кортикальные тяжи уже отсутствуют, появляются короткие пучки МТ отходящие от хромосом. После удаления колхицина часто формируются двуядерные или многоядерные клетки, ядра которых находятся на разных стадиях клеточного цикла. В таких клетках интерфазное ядро не проявляет признаков активности ЦОМТ, в то время как ядро, находящееся на стадии профазы или ранней прометафазы окружено короткими МТ, отходящими от его поверхности. Через 12-24 часа после начала восстановления МТ, в интерфазных и профазных клетках выявляется типичная для контрольных клеток система МТ. В К-митотических клетках присутствуют многочисленные и различающиеся по длине МТ, отходящие от хромосом. В это же время выявляются клетки (в том числе и полиплоидные), находящиеся на стадии метафазы, анафазы и телофазы, и мало отличающиеся от контрольных клеток по организации системы МТ. Однако встречаются клетки с неравномерным расхождением хромосом, многополюсные анафазы и многополюсные телофазы с аберрантными фрагмопластами.

После 24 часов действия колхицина, изменения в организации тубулинового цитоскелета наблюдаются только через 12 часов инкубации в отсутствии агента. В это время интерфазные и К-митотические клетки содержат частично разрушенные игло-подобные пучки, которые трансформируются в кортикальные тяжи. Через 18-24 часа, в интерфазных клетках присутствует типичная кортикальная сеть МТ. Часто в клетках, находящихся на стадии интерфазы или ранней профазы, выявляются короткие МТ отходящие от ядра. В профазных клетках, в том числе и полиплоидных, присутствует профазное веретено и ППК. К-метафазные клетки содержат многочисленные пучки МТ разной длины, отходящие от хромосом. В это время выявляются клетки на стадии метафазы, анафазы и телофазы, с организацией систем МТ типичной для клеток меристемы, а также многополюсные анафазы и телофазы с аберрантными фрагмопластами.

Полученные данные свидетельствуют о том, после действия колхицина сборка МТпроисходит после разрушения немикротрубочковых тубулиновых агрегатов. Нуклеация и рост новых МТпроисходит от поверхности ядра и от митотических

хромосом. Структур, которые бы выполняли функцию организаторов полюсов веретена не обнаружена Все МТсистемы появляются врезультатеудлинения, взаимодействия и реорганизации новых МТ.

Восстановление МТ после действия колцемида. В клетках меристемы корня Mlium сера колцемид вызывает разборку интерфазных и митотических МТ через 1 час после начала воздействия и переход клеток в К-митоз, однако формирование атипичных тубулиновых агрегатов не наблюдается. После удаления колцемида, МТ начинают восстанавливаться через 5-6 часов. В К-метафазных клетках они выявляются как короткие пучки, отходящие от центромерных районов хромосом. В некоторых клетках отходящие от хромосом МТ взаимодействуют и образуют веретеновидные структуры. В это время наблюдается многополюсное анафазо-подобное расхождение хромосом. Механизм многополюсного митоза в клетках растений неизвестен. Было высказано предположение, что при воздействии на клетки растений антитубулиновых агентов происходит расщепление структур, выполняющих функцию полюса (Hervas and Gimenes-Martin, 1977; Hillman and Ruthman, 1982). Однако, неясно, что имеется в виду под расщеплением, если в полюсах нет никаких дискретных структур, которые могли бы распадаться на отдельные компоненты. Более логичным и обоснованным представляется объяснение, согласно которому многополюсность может возникнуть в результате хаотического роста и случайного взаимодействия МТ, отходящих от кинетохоров. При этом кинетохорные МТ ведут себя подобно щупальцам, ищущим то место, где они могли бы заякориться. Такое заякоривание может произойти при пересечении пучков, идущих от разных хромосом, а также при контакте с органеллами (Bajer et al., 1975). Через 8-9 часов после удаления колцемида выявляются в основном нормальные митотически делящиеся клетки. Вместе с тем, в это время наблюдаются клетки, у которых хромосомы формируют метафазную пластинку, но с менее упорядоченной, чем в контрольных клетках, локализацией хромосом. Веретено таких клеток имеет асимметричные полюса. Один из полюсов представляет собой компактную зону в виде шапочки с одним фокусом схождения, а другой полюс - многочисленные дискретные фокусы схождения. В это время выявляются многополюсные митозы, клетки с неправильной формы фрагмопластом и многоядерные клетки.

Через 18-24 часа снова появляются клетки, у которых выявляются в основном короткие МТ, отходящие от кинетохорных районов хромосом. Однако размер таких клеток в несколько раз превышает размер клеток апикальной меристемы, какая-либо упорядоченная локализация хромосом отсутствует, а количество хромосом превышает диплоидное. В полиплоидных клетках длина МТ отходящих от разных хромосом может

быть различной, что свидетельствует о несинхронности процесса восстановления МТ даже в одной клетке. Следует отметить, что в это же время были обнаружены анафазные клетки с так называемыми "плавающими полюсами" (нарушение правильной ориентации полюсов веретена деления относительно друг друга). В отличие от нормальных анафазных клеток в этих клетках очень мало интерзональных МТ. Также встречаются клетки со звездоподобной организацией МТ вокруг хромосом в телофазе, которая не выявляется в меристематических клетках в контроле. Кроме вышеописанных типов клеток, в это время встречаются нормальные митотически делящиеся клетки на всех стадиях митоза.

После действия колцемида МТвосстанавливаются только от хромосом, что -ведет к появлению как аберрантных, так и нормальныхмитотических веретен. Функционально активныеЦОМТ, которые быучаствовали в организации полюсов веретена, не были обнаружены.

Динамика изменений систему МТ при действии хлоралгидрата. Корешки лука Allium сера L. подвергались действию различных концентраций хлоралгидрата, выбранных на основании экспериментов, проведенных на изолированных клетках эндосперма Haemanthus (Mole-Bajer, 1967,1969). Иммуноцитохимический анализ организации системы МТ в клетках меристемы показал, что во время профазы в клетках присутствовали как нормальные ППК, так и незамкнутое или фрагментированное ППК. Независимо от структуры ППК, в большинстве профазных клеток наблюдалось значительное уменьшение количества околоядерных МТ, принимающих участие в формировании профазного веретена, или даже их полное отсутствие. Следовательно, околоядерные МТ являются более чувствительными к действию хлоралгидрата, чем МТ в составе ППК. Отсутствие МТ веретена в профазе и прометафазе при действии хлоралгидрата на клетки эндосперма Haemanthus было показано с помощью метода электронной микроскопии (Mole-Bajer, 1969).

В присутствии хлоралгидрата метафазные клетки А. сера различались по упорядоченности локализации хромосом и организации МТ веретена. В некоторых клетках локализация хромосом и организация митотического веретена были такими же, как в контрольных клетках. Были обнаружены клетки с относительно упорядоченной локализацией хромосом в метафазной пластинке, но с дезорганизованным веретеном. Кинетохорные фибриллы (К-фибриллы) в составе полуверетен утрачивали параллельную ориентацию. Такое веретено часто веретено сохраняло биполярную организацию, но формировало несколько дискретных фокусов схождения в полюсах. Типичные К-

метафазные клетки имели дисперсное или компактное распределением хромосом. Укороченные К-фибриллы в таких клетках были беспорядочно ориентированны.

Принято считать, что если ингибиторы полимеризации МТ проникают в клетки до разрыва ядерной оболочки, то клетки будут заблокированы в К-митозе на стадии прометафазы, а не метафазы (Rieder and Palazzo, 1992). Однако, как было показано в наблюдениях за делением клеток эндосперма in vivo (Mole-Bajer, 1967), клетки могут переходить в К-метафазу после нормальной метафазы, после чего следует К-анафаза и затем К-телофаза (Deysson, 1975; Rieder and Palazzo, 1992). В связи с этим понятен эффект, который оказывает хлоралгидрат на вступающие в митоз клетки. Те из них, которые еще не продвинулись в метафазу, будут заблокированы в К-митозе на стадии прометафазы. Вместе с тем клетки, уже находящиеся в метафазе и имеющие полноценное веретено, могут реагировать на воздействие следующим образом: 1) МТ веретена дезорганизуются, затем разрушаются, и клетки переходят в К-митоз (промежуточные стадии этого процесса наблюдались при действии хлоралгидрата); 2) веретено разрушается до остаточных К-фибрилл, но ориентация хромосом в метафазной пластинке сохраняется (такие клетки были также обнаружены).

В присутствии хлоралгидрата в корешках A. сера выявляются клетки с нормальным биполярным расхождением хромосом в анафазе и с заметными отклонениями в поведении хромосом и организации МТ. В некоторых клетках плечи хромосом были "вытолкнуты" из зоны веретена, в результате чего они были направлены к периферии цитоплазмы. Такая организация хромосом в полуверетене очень похожа на звездчатую и получила название "double star anaphase" (Deysson, 1975). Появление звездчатых анафаз связывают с формированием избыточных МТ в области полюсов митотического веретена (Deysson, 1975).

Наши результаты показали, что в таких клетках действительно присутствуют многочисленные полюсные МТ, направленные из центра полюсной области к периферии клетки. Как известно, полюсные МТ не обнаруживаются при делении меристематических клеток, однако они характерны для делящихся клеток эндосперма в ана-телофазе (Bajer and Mole-Bajer, 1986).

Одновременно с биполярными анафазами в корешках A. сера выявлялись клетки на стадии К-анафазы (Mole-Bajer, 1967) многополюсные и диффузные анафазы. К-анафазные клетки представляют собой клетки с разделившимися в области кинетохоров, но не разошедшимися хромосомами, лежащими рядом и формирующими так называемое "ski-arrangement" (Rieder and Palazzo, 1992). Как показано в наблюдениях in vivo, (Mole-Bajer, 1967), клетки могут находиться в таком состоянии довольно долго, после чего

может начаться не координированное разделение хромосом на группы (диффузная анафаза) или К-телофаза (реконструкция ядерной оболочки вокруг 4п хромосом).

Наши наблюдения показали, что МТ в К-анафазе представлены короткими К-фибриллами. Соседние пучки взаимодействовали друг с другом и формировали "соединения" между несестринскими кинетохорами, что также было описано на электронно-микроскопическом уровне (Mole-Bajer, 1969).

Во время многополюсной анафазы в клетках А. сера хромосомы расходятся к полюсам - лежащим вне хромосом фокусам схождения МТ, в сторону которых. направлены центромерные участки хромосом. Следует отметить, что распределение хромосом на группы в анафазе не всегда связано с наличием четко выраженных полюсов. В этом случае короткие К-фибриллы формируют скопления в зонах расположения хромосомных групп. Были обнаружены клетки, у которых хромосомы без какой-либо упорядоченной ориентации формировали случайные группы, но МТ выявлялись не в зонах предполагаемых полюсов, как в случае многополюсных анафаз, а между хромосомными группами. Полюса веретена как фокусы схождения МТ в таких клетках отсутствовали. Судя по всему, это именно те клетки, которые были идентифицированы как "диффузные анафазы" (Mole-Bajer, 1967).

Наши результаты показали, что во время диффузной анафазы отсутствуют полуверетена, а МТ располагаются между группами сегрегированных хромосом. Мы также наблюдали клетки, сочетающие элементы как многополюсной (наличие четко выраженных полюсов), так и диффузной (наличие межхромосомных МТ между группами расходящихся хромосом) анафазы.

В связи с этим представляется закономерным вопрос о происхождении многополюсных и диффузных анафаз. Как было показано в наблюдениях за делением клеток эндосперма in vivo (Mole-Bajer, 1967), многополюсная анафаза возникает из практически нормальной метафазной пластинки. К-метафаза может переходить в К-анафазу, а затем в К-телофазу или в диффузную анафазу. Наши наблюдения показали, что при относительно нормальной организации хромосом в метафазной пластинке наблюдается разная степень дезорганизации митотического веретена. Возможно, что именно нарушение ориентации К-фибрилл, их гетерогенность по длине, ведут к их случайному взаимодействию и появлению суб-полюсов и далее к многополюсному расхождению хромосом в анафазе. Что касается судьбы К-метафазных клеток, то разнообразие длины и ориентации К-фибрилл позволяет предположить, что это является одним из факторов, определяющих возможность активного нерегулярного движения хромосом после К-анафазы. Если пучков мало и они короткие, то они не способны к

взаимодействию, необходимому для активного движения хромосом, что ведет к переходу в К-телофазу. Если же пучки многочисленные и разнородные (длинные и короткие), то их случайное взаимодействие может обеспечить такое движение в виде диффузной анафазы. Основные изменения в организации МТ цитоскелета при действии хлоралгидрата показаны на рис. 1.

Таким образом, при дезорганизации системы МТ, индуцированной хлоралгидратом, ингибируется рост перинутеарныхМТи формирование профазного веретена, что ведет к переходу клеток в К-митоз. Следовательно, ядро функционирует какЦОМТдля формирования АЛ" профазного веретена, которое является предшественником митотического веретена.

Рис. 1. Изменения в организации системы МТ в клетках меристемы корня АПпоп сера при действии хлоралгидрата. В профазе происходит уменьшение числа перинуклеарных МТ профазного веретена (IX вплоть до их полного исчезновения. В свою очередь, отсутствие профазного веретена приводит к переходу клеток в К-метафазу (2), а затем в К-телофазу (3). Вместе с тем, в уже существующих метафазных клетках веретено постепенно дезорганизуется (4-8). Дезорганизация веретена связана с нарушением сцепления между соседними К-фибриллами, возможно, за счет деполимеризации нехннегохорных МТ, в результате чего нарушается связь и упорядоченная ориентация К-фибрилл относительно друг друга (4,5). Затем происходит разборка и укорочение кинетохорных МТ (6), что, в свою очередь, может вести к переходу клеток в К-метафазу с разной степенью выраженности остаточных К-фибридп (7,8). Дальнейшее поведение хромосом определяется их пространственной ориентацией, а также ориентацией и длиной отходящих от них К-фибрилл. Последнее, в свою очередь, определяет характер устанавливаемого взаимодействия между МТ. Можно предположить, что на начальных стадиях дезорганизации веретена больше вероятность того, что митоз завершится многополюсной анафазой (9,10) и телофазой (11). На более поздних стадиях дезорганизации возможна диффузная анафаза (12) и далее тел оф аза (11) или переход

в К-телофазу (13). Чем короче остаточные МТ и меньше их число, тем более вероятен последний вариант. Следует отметить, что на стадии анафазы (14, 15) и телофазы (16) хлоралгидрат индуцирует рост МТ, нетипичных для клеток меристемы (избыточных полюсных МТ в анафазе и дополнительных фрагмопластов в телофазе).

Полученные данные показывают, что при восстановлении МТ после действия колхицина и колцемида в полюсах мнтотического веретена клеток меристемы корня отсутствует функционально активный ЦОМТ. Эти данные, а также наблюдения за поведением МТ при действии хлоралгидрата указывают на то, что инициация и рост МТ происходит от ядра и хромосом.

II. ЦЕНТРЫ КОНВЕРГЕНЦИИ МТ (ЦКМТ) И ИХ РОЛЬ В ОРГАНИЗАЦИИ СИСТЕМЫ МТ

Одним из направлений исследования было изучение стадий реорганизации системы МТ в изолированных клетках эндосперма Haemanthus, у которых формирование мнтотического веретена происходит в отсутствие ППК. На ранней стадии развития, эндосперм представляет собой ткань, которая не имеет целлюлозной клеточной стенки. Выделение клеток эндосперма из зародышевых мешков неизбежно ведет к разрыву некоторых клеток и многоядерного синцития. Это приводит к формированию безъядерных цитоплазматических фрагментов (цитопластов) различного размера. Цитопласты среднего и крупного размера хорошо распластываются и в них можно наблюдать внутриклеточный транспорт. МТ в цитопластах проходят цикл реорганизации, который имеет определенные временные и пространственные закономерности (Bajer and Mole-Bajer, 1986). Наши исследования показали, что эти процессы проходят при участии структур, которые мы назвали центрами конвергенции МТ (ЦКМТ). 1. ОРГАНИЗАЦИЯ И СВОЙСТВА ЦКМТ В КЛЕТКАХ ЭНДОСПЕРМА HAEMANTHUS

Типичный ЦКМТ представляет собой конусо-подобный или веерообразный пучок МТ, у которого ярко выражен конвергирующий конец и дивергирующий "хвост". В конвергирующем конце МТ терминируются или ассоциируют латерально. В дивергирующем конце они прямые или слегка изогнутые. Характерным свойством этих структур является разное поведение концов при взаимодействии двух и более ЦКМТ. Конвергирующие концы имеют тенденцию к латеральной ассоциации, а дивергирующие концы - взаимодействовать конец в конец, или стык в стык. Два ЦКМТ при взаимодействии дивергирующих концов сначала формируют структуры, похожие на прометафазное веретено, которое затем трансформируется в фрагмопласто-подобные

образования. Возможно, что промежуточной стадией между двумя этими стадиями было бы наличие каких-то гранулярных структур (например, зерен крахмала) в экваториальной зоне между взаимодействующими концами ЦКМТ, что бы сильно напоминало метафазное веретено. Однако мы никогда не наблюдали такой структуры, и прометафазная организация МТ сразу переходила в биполярный фрагмопласт.

Таким образом, ЦКМТ в эндосперме имеют ярко выраженную функциональную полярность: при их взаимодействии, конвергирующие концы взаимодействуют друг с другом латерально, а дивергирующие - конец в конец. Если предположить, что полярность МТ в составе ЦКМТ у растений такая же, как и в экспериментально индуцированных конусообразных пучках МТ клеток животных (Maekawa et al., 1991), то латеральная ассоциация характерна для минус-концов.

2. ФОРМИРОВАНИЕ ЦКМТ В КЛЕТКАХ И ЦИТОПЛАСГАХ ЭНДОСПЕРМА HAEMANTHUS

Формирование ЦКМТ и их последующая дифференцировка происходит как в клетках эндосперма Haemanthus, так и в спонтанно образованных цитопластах. Сразу же после выделения эндосперма на агаровую подложку, в цитопластах выявляется сеть, состоящая из дезорганизованных и переплетающихся МТ (рис. 2). Через 45 минут после выделения, в крупных цитопластах присутствуют отдельные хаотически ориентированные пучки МТ (ЦКМТ), а через 1-2 часа выявляется система МТ, состоящая из взаимодействующих ЦКМТ. В результате латерального взаимодействия конвергирующих концов и противоположного взаимодействия дивергирующих концов ЦКМТ, формируются веретеновидные структуры. Далее длина МТ в области дивергирующих концов выравнивается, и они образуют фрагмопласто-подобные структуры с клеточной пластинкой. Аналогичные процессы происходят в клетках, находящихся на стадии интерфазы или поздней телофазы-ранней интерфазы, но они становятся более выраженным во время быстрого изменения температурного режима, фактора, влияющего на критическую концентрацию тубулина в клетке (Gaskin et al., 1974; Suprenant and Maish, 1987).

Рис.2. Поведение МТ в цитопластах эндосперма Haemanihus. Сеть МТ (АХ состоящая из хаотически ориентированных МТ выявляется в цитопластах разного размера и формы через 15 минут после выделения. (1) В очень мелких цитопластах, такая сеть сохраняется даже через 2 часа после выделения (Б). (2) В мелких цитопластах сферической формы через 10-20 минут выявляется конусообразный пучок МТ (В). Через 30 минут в цитопластах присутствуют пучки, у которых голова и хвост сближаются, и формируется кольцевидный пучок (Г). Последние могут сохраняться до 1-2 часов, однако к этому времени они чаще всего трансформируются в "замкнутые" спиральные пучки (Д). (3) В средних и крупных цитопластах, дезорганизованная сеть через 10-20 минут замещается системой конусообразных пучков, похожих на полуверетена (ЦКМТ) (Е). При сближении двух пучков, заостренные конвергирующие концы взаимодействуют латерально, а расширенные дивергирующие концы

ассоциируют "конец в конец". В результате отдельные ЦКМТ реорганизуются в систему веретен (Ж). Через 1-1.5 часа, в большинстве цитопластов выявляется система минифрагмолластов с клеточной пластинкой (3).

В настоящее время получен ряд данных, свидетельствующих о том, что одним из свойств МТ является их способность к само-организации, и этот процесс регулируется моторными белками МТ (Mitchison, 1992; Hyman and Karsenti, 1996). Само-организация была воспроизведена в системе in vitro (Heald et al., 1996,1997; Nedelec et al., 1997) и после экспериментального освобождения МТ от центросомы in vivo (McNiven et al., 1984; McNiven and Porter, 1988; Maniotis and Schliwa, 1991; Rodionov and Borisy, 1997). В последнем случае МТ реорганизуются и формируют звездоподобные структуры в отсутствие центросомы. Мы предполагаем, что экспериментально индуцированные бесцентросомные звезды в клетках животных (De Brabander et al., 1986; Maekawa et al., 1991; Verde et al., 1991; Harris et al., 1989; Harris and Clason, 1992; Kallojoki et al., 1992) и ЦКМТ имеют общее происхождение. В ацентросомалъных клетках, в отличие от центросомальных, универсальной МТ конфигурацией формирующейся в процессе самоорганизации, является сегмент звезды, то есть ЦКМТ.

Таким образом, ЦКМТ представляет собой полярный пучок МТ со следующими свойствами: 1) функциональная полярность, выражающаяся в разном поведении

конвергирующих и дивергирующих концов ЦКМТ. Конвергирующие концы ассоциируютлатерально, а дивергирующие—конец в конец; 2) тенденция к формированию стабильных МТ структур, таких как фрагмопласт; 3) отсутствие метафазного типа МТ структур при трансформации прометафазных конфигураций в телофазные (фрагмопласт). Косвенныеданныеуказывают на то, что конвергирующий конец ЦКМТ содержит минус-концы МТ, а дивергирующий конец -плюс-концы МТ. ЦКМТ не только связывают вместе минус концы МТ, но и выполняют функции сортировки полярности и длины МТ. 3. ЦКМТ ЯВЛЯЮТСЯ СТРУКТУРНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ СИСТЕМЫ МТ КЛЕТОК ЭНДОСПЕРМА HAEMANTHUS НА ВСЕХ СТАДИЯХ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

Интерфаза. На этой стадии клеточного цикла, прямые или слегка изогнутые МТ радиально отходят от ядерной оболочки к периферии клетки. Они ассоциированы с поверхностью ядра в виде дискретных фокусов схождения -ЦКМТ, конвергирующие концы которых направлены к ядру.

Профаза. При переходе клеток из интерфазы в профазу происходит постепенная трансформация радиальных МТ в систему пучков, у которых конвергирующие концы обращены от ядерной оболочки в цитоплазму. Первым признаком трансформации является появление плотного скопления МТ вокруг ядра. Отходящие от ядерной оболочки МТ утрачивают радиальную ориентацию и беспорядочно пересекаются друг с другом. При этом количество МТ в центральной цитоплазме уменьшается. Этот процесс, названный формированием «зоны просветления» (clear zone formation) длится несколько часов (Bajer and Mole-Bajer, 1972), и поздние стадии формирования зоны просветления в настоящее время связывают с образованием профазного веретена (Baskin and Cande, 1990). Профазное веретено может иметь различное число полюсов (от одного до четырех и более). Полюса отличаются друг от друга по степени дифференцировки (суженные, расширенные, диффузные, вытянутые, плоские) и состоят из множества более мелких ЦКМТ, однородно ориентированных и близко расположенных по отношении друг к другу. Несмотря на то, что часто встречаются многополюсные профазные веретена, все они трансформируются в биполярные во время прометафазы.

Прометафаза. Прометафаза начинается с разрушения ядерной оболочки. Биполярная К-фибрилла, каждый конец которой ассоциирован с противоположным полюсом веретена, окончательно устанавливает ось веретена и одновременно, дезорганизует конвергентную форму полюса профазного веретена. Характерным признаком ранней прометафазы является наличие большого числа МТ не связанных с кинетохорами. Некинетохорные МТ

можно разделить на две группы. Первая группа представляет собой МТ, которые одним концом ассоциированы с участками К-фибрилл, расположенными в области полюсов. Вторая группа - это свободные ЦКМТ, которые были обнаружены в цитоплазме как вне митотического веретена, так и в тесной связи с ним. В ранней прометафазе полюса все еще имеют четкие суженные контуры, и напоминают большие ЦКМТ. Во время перехода из прометафазы в метафазу, характер взаимодействия МТ в области полюсов сильно меняется. Заостренные полюса расщепляются в поперечном направлении и трансформируются в расширенные полярные области, характеризующиеся наличием множественных суб-полюсов. Каждый суб-полюс сформирован одной или несколькими К-фибриллами, собранными вместе.

Метафаза. Метафазное веретено состоит из отдельных К-фибрилл, каждая из которых имеет структуру, по форме напоминающую еловое дерево (MTFT - microtubule fur tree) (Bajer and Mole-Bajer, 1986). Концы К-фибрилл, дистальные по отношении к хромосомам, заканчиваются в области диффузного скопления МТ, расположенного в полярной области метафазного веретена. Характерным признаком мстафазы является тенденция к расширению метафазной пластинки. В результате, полярные зоны веретена становятся настолько растянутыми, что их трудно идентифицировать. Такая реорганизация полюсов начинается в прометафазе и часто приводит к тому, что конвергенция МТ в области полюсов практически утрачивается. Несмотря на слабо выраженную ассоциацию К-фибрилл в области полюса, многополюсные хромосомные пластинки Y или V типа, никогда не формируются. Если же конвергенция К-фибрилл в области полюса выражена хорошо, дистальные сегменты К-фибрилл изгибаются и заканчиваются в области, условно называемой полярной зоной. С помощью метода видеомикроскопии в полярной области была обнаружена разреженная сеть МТ, в которой можно увидеть отдельно лежащие мелкие ЦКМТ, расположенные вблизи дистальных участков К-фибрилл. Кончики ЦКМТ могут быть ориентированы по направлению к или от К-фибрилл, и часто формируют сложные МТ конфигурации. Несмотря на то, что свободно лежащие ЦКМТ обнаружены в основном в полярной области веретена, они иногда выявляются на клеточной периферии или в тесной ассоциации с плечами хромосом.

Анафаза. Во время анафазы дистальные участки К-фибрилл начинают латерально ассоциировать. В это же время, увеличивается плотность МТ в полярной области. Видеомикроскопический анализ показал, что в ранней и средней анафазе в полярных зонах располагается различное количество случайно ориентированных ЦКМТ. В поздней анафазе или ранней телофазе, полюс может приобретать звездоподобную конфигурацию.

По-видимому, "звезда" состоит из близко расположенных ЦКМТ, конвергирующие концы которых направлены в единый центр.

Телофаза. В ранней телофазе звездоподобная конфигурация полюса веретена становится еще более отчетливой. Новые интерфазные МТ выявляются в непосредственной связи с ядерной оболочкой. Однако это не исключает возможности формирования новых МТ в других клеточных компартментах, например, в периферической цитоплазме. ЦКМТ были выявлены в области между фрагмопластом и ядром, а также в составе самого фрагмопласта. Реорганизация цитоскелета во время перехода из телофазы в интерфазу приводит к постепенному уменьшению плотности МТ вокруг ядра и одновременно к формированию плотной МТ сети, состоящей из ЦКМТ, на периферии цитоплазмы.

МТ структуры, сходные с ЦКМТ, были идентицифированы в кортикальной цитоплазме растительных клеток во время интерфазы (Gunning, 1980), но, как правило, они выявляются при стабилизации МТ таксолом (Mole -Bajer and Bajer, 1983) или восстановлении МТ после их деполимеризации (Cleary and Hardham, 1988; Falconer et al, 1988; Wasteneys and Williamson, 1989). Клетки эндосперма Haemanthus являются единственным объектом, в котором организация ЦКМТ была детально изучена. Наши данные не дают однозначного ответа на вопрос о происхождении ЦКМТ, в особенности тех, которые не связаны с ядерной оболочкой. Инициация роста МТ от поверхности ядра растительных клеток является фактом, подтвержденным многочисленными исследованиями (Lambert, 1993; Vaughn and Harper, 1998; Canaday et al., 2000). Сборка МТ на поверхности ядра может происходить за счет инициации новых МТ из одного общего локуса, в результате чего формируется веерообразная конфигурация. Однако нельзя исключить и возможность спонтанного формирования ЦКМТ в цитоплазме, с последующей ассоциацией минус-концов МТ. Последние данные свидетельствуют о том, что в кортикальной цитоплазме растительных клеток происходит нуклеация и рост как отдельных МТ, так и в виде МТ кластеров (Shaw et al., 2003), которые морфологически сходны с ЦКМТ.

Таким образом, ЦКМТ являются структурными компонентами интерфазной и митотической системы МТ в клетках эндосперма Haemanthus. ЦКМТмогут быть свободными или ассоциированными сядром (хромосомами) или другими МТ. Основной компонентмитотического веретена - К-фибриллапредставляет собой ЦКМТс избыточным количеством изогнутых МТ, врезультате чего она приобретает форму «елового дерева» (MTFT).

4. ИНДУКЦИЯ ОБРАЗОВАНИЯ ЦКМТ

Влияние повышенной температуры на образование ЦКМТ в клетках эндосперма Haemanthus. Повышенная температура (35-37°С) вызывает формирование многочисленных ЦКМТ в отдельных клетках на стадии интерфазы и в подавляющем большинстве клеток на стадии перехода из телофазы в интерфазу. Одним из отличительных признаков этого процесса является упорядоченная направленность (ориентация) ЦКМТ в цитоплазме. Расположение ЦКМТ всегда коррелирует с расположением основной радиальной сети МТ, причем конвергирующие концы ЦКМТ ориентированы по направлению к ядру. Множество ЦКМТ располагаются непосредственно на ядерной оболочке и вблизи нее. Вместе с тем, в большинстве интерфазных клеток избыточное образование ЦКМТ в этих условиях не наблюдается. Вместо этого, отдельные длинные пучки МТ формируют петли и изгибы, которые редко наблюдается в контрольных клетках.

Таким образом,повышениетемпературы индуцирует появлениебольшого количества ЦКМТв клеткахэндосперма на стадиях перехода из интерфазы в митоз и измитоза в интерфазу, то есть в тепериоды клеточного цикла, когда происходит существенные изменения в организацииМТцитоскелета,

Влияние пониженной температуры на формирование ЦКМТ в клетках апикальной меристемы корня Triticum aestivum. Пониженная температура вызывает быструю деполимеризацию МТ, но этот параметр варьирует для разных типов клеток. Известно, что МТ в изолированных клетках эндосперма Haemanthus разбираются при понижении температуры до 0-4°С и быстро восстанавливаются при помещении клеток в условия комнатной температуры (Bajer and Mole-Bajer, 1982). Следовательно, такое воздействие на МТ может быть использовано для установления активности ЦОМТ. ЦКМТ выявляются в клетках меристемы пшеницы Triticum aestivum после инкубации корешков при 0°С (3-72 часа) и фиксации при комнатной температуре (18-22°С). Через 6 часов инкубации при 0°С и последующего восстановления в процессе фиксации, ЦКМТ формируют полярные шапочки в околоядерной области профазных клеток. В К-метафазных клетках ЦКМТ выявляются в области расположения хромосом. Во время телофазы ЦКМТ иногда свободно располагаются в цитоплазме, но в основном ассоциированы с ядерной оболочкой. Через 24 часа инкубации при 0°С, в интерфазных и профазных клетках формируется околоядерная корзинка, состоящая из собранных в кластеры ЦКМТ. Кончики ЦКМТ, ассоциированные с поверхностью ядра, содержат ацетилированный а-тубулин, который не выявляется в составе других МТ структур. В К-

метафазных клетках ЦKMТ, как правило, ассоциированы с хромосомами или располагаются вокруг них.

Таким образом, после действия пониженной температуры. ЦКМТ выявляются в системе МТклеток меристемы. Локализация ЦКМТ указывает на расположение активных сайтов нуклеации МТ, которые при восстановлении МТпосле действия пониженной температуры связаны с ядерной поверхностью и хромосомами. Присутствие ацетилированного а-тубулина в конвергирующих концах связанных с ядром ЦКМТ свидетельствует о том, что, поверхность ядра имеет свойства, сходные с таким ЦОМТ как центросома,

5. РОЛЬ ЦтТ В РАННИХ СТАДИЯХ ФОРМИРОВАНИЯ ВЕРЕТЕНА. НЕЗАВИСИМОСТЬ ХРОМОСОМНОГО И МТ ЦИ^ОВ В ЭНДОСПЕРМЕ HAEMANTHUS

Одним из центральных событий начальных стадий митоза является трансформация интерфазного цитоскелета в митотическое веретено. Это процесс протекает по-разному в центросомальных и ацентросомальных клетках. В центросомальных клетках, плюс-концы астральных МТ расходятся из центросомы (где расположены минус-концы МТ) и, следовательно, в интерфазе ориентированы как к ядру, так и х клеточной периферии. В профазе, две мигрирующие центросомы тащат минус-концы от хромосом, способствуя формированию биполярного веретена (Biinkley, 1985; Vorobiev and Nadezhdina, 1987; Waters and Salmon, 1997). Таким образом, центросома определяет динамику МТ и реорганизацию интерфазного цитоскелета в митотический.

В эндосперме Haemanthus при переходе из интерфазы в митоз, радиальная система МТ, в которой плюс-концы направлены от ядра к периферии клетки (Vantard et aL, 1990), заменяется биполярным веретеном, в котором плюс-концы МТ ориентированы к хромосомам (Eutenauer et al., 1982). Таким образом, по аналогии с центросомальными клетками, ориентация плюс и минус-концов относительно ядра меняется перед метафазой. Однако в эндосперме это происходит в отсутствие подвижной центросомы, и поэтому механизм организации веретена до последнего времени оставался неясным (Baskin and Cande, 1990; Lambert and Lloyd, 1994). Хромосомный и МТ циклы

На протяжении митоза хромосомы постоянно укорачиваются и их толщина возрастает. Укорачивание хромосом зависит от стадии митоза, и является наиболее выраженным в поздней профазе-прометафазе (Bajer, 1958). Мы использовали хромосомный цикл как индикатор продвижения клеток от ранней профазы к прометафазе. Оказалось, что имеет место отчетливая независимость прохождения хромосомного цикла

и цикла дифференцировки и реорганизации МТ. Экстремальная десинхронизация встречалась нечасто, и обычно приводила к серьезным митотическим аномалиям.

Примером экстремальной десинхронизации хромосомного и МТ циклов является клетка, содержащая профазное ядро и дополнительный фрагмопласт. В нормальных условиях, фрагмопласт формируется в интерзоне между сестринскими хромосомами во время анафазы-телофазы Небольшие дополнительные фрагмопласты, расположенные на клеточной периферии или около ядра, типичны для стадии перехода из телофазы в интерфазу. Однако, в данной клетке, профазное ядро сосуществует вместе с интерфазным или телофазным цитоскелетом. Следовательно, хромосомный цикл замедлился или вообще остановился, в то время как цикл дифференцировки МТ цитоскелета продвинулся до телофазы, или же наоборот, хромосомный цикл продвинулся до профазы, в то время как реорганизация интерфазного цитоскелета замедлена. Умеренная десинхронизация циклов является довольно распространенным событием во время профазы и длится до метафазы включительно.

Ранняя-средняя профаза: формирование перинуклеарной корзинки МТ вокруг ядра

Прижизненные наблюдения показали, что от ранней профазы до начала прометафазы в изолированных клетках эндосперма может проходить 15 часов, прометафаза-анафаза длится 3 часа, а переход из телофазы в интерфазу - 4 часа (Bajer and Mole-Bajer, 1972). Таким образом, профаза длится, по крайней мере, в 2 раза дольше, чем все остальные стадии митоза вместе взятые. В ранней профазе в клетках выявлялись множественные кластеры ЦКМТ, ассоциированные с ядерной оболочкой. Распределение кластеров на поверхности ядра не было однородным, и, судя по всему, имело отношение к локализации хромосом в ядре. На следующей стадии, радиальные МТ изменяли направление и ориентацию, и формировали вокруг ядра плотную корзинку, состоящую из МТ, расположенных по касательной к поверхности ядра. На ранних стадиях формирования, такая МТ корзинка присутствовала в клетках одновременно с радиальными МТ. В некоторых клетках длинные радиальные МТ доходили до периферии, где они формировали петли и дугообразные искривления. Средняя-поздняя профаза и дифференцировка перинуклеарной корзинки МТ

На этой стадии МТ корзинка, окружающая ядро в ранней профазе, замещалась разнообразными МТ структурами. Изменения в организации корзинки МТ были связаны с деформациями ядерной поверхности. Выпячивания ядра приводили к отделению и смещению ЦКМТ от поверхности ядра. Это процесс продолжался вплоть до начала разрушения ядерной оболочки. Одновременно с этим, небольшие и случайно ориентированные ЦКМТ выявлялись в цитоплазме вблизи ядра. ЦКМТ с

однонаправленной ориентацией ассоциировали латерально и формировали кластеры. Некоторые ЦКМТ в составе кластеров были ориентированы своими дивергирующими концами в сторону ядра, а конвергирующими концами в сторону периферии клетки. Такие реориентированные кластеры ЦКМТ также латерально ассоциировали и формировали полюса веретена профазного веретена. Таким образом, в ходе дифференцировки околоядерной корзинки МТ происходило отклонение, отделение и перемещение ЦКМТ от ядра. Это приводило к появлению самых разнообразных типов профазного веретена.

Профазное веретено формировалось в средней или поздней профазе и сохранялось до начала прометафазы. Плотная, относительно однородная корзинка без четко выраженных конусовидных образований была названа аполяриым веретеном и выявлялась в 36% клеток. Полярное профазное веретен образовывалось в 64% клеток. Полярное веретено имело от 1 до б конусообразных, приподнятых над ядром или растянутых на его поверхности, скоплении МТ, которые мы определили как полюса. Полюса всегда состояли их множества более мелких ЦКМТ, которые взаимодействовали своими конвергирующими концами. Число профазных клеток с одним полюсом (монополярное веретено) составляло 1%. Примерно половина (49%) профазных клеток имела биполярное веретено, и 14% - многополюсные веретена. Разрушение ядерной оболочки: установление полярности веретена

Клетки на стадии ранней прометафазы наблюдались очень редко, так как эта стадия в данном типе клеток длится около 1 минуты (Bajer, 1957,1958). После разрушения ядерной оболочки, профазное веретено подвергалось значительной реорганизации, приводящей к окончательной корректировке оси веретена. На это процесс оказывала влияние форма профазного веретена и число его полюсов. Как известно, первые признаки деформации и разрыва ядерной оболочки появляются в тех областях ядра, которые обращены к полюсам веретена (Lambert and Bajer, 1975).

Проникновение МТ и даже целых ЦКМТ в область ядра происходило одновременно с тремя другими процессами. Первый из них состоял в случайной ассоциации ЦКМТ с хромосомами и кинетохорами. Следовательно, ЦКМТ функционировали как заготовки для будущих К-фибрилл (Bajer, 1987). Второй процесс заключался в латеральной ассоциации нескольких конвергирующих концов К-фибрилл в полярной области. Эти фибриллы устанавливали основу будущего веретена и определяли его окончательную полярность. Третий процесс сводился к быстрой реорганизации полюсов, которые не входили в рамки установленной основы. Такие полюса сливались друг с другом или с доминирующим полюсом, или элиминировались. Присутствие в

цитоплазме метафазных клеток свободных ЦКМТ может являться результатом такой элиминации. Таким образом, в ходе прометафазы, число полюсов или полярных зон, уменьшалось до двух. Аналогичным образом происходила и реорганизация изначально биполярного веретена, но в гораздо более упрощенном варианте. Аполярные веретена после разрушения ядерной оболочки трансформировались в систему множественных, беспорядочно ориентированных мини-веретен. Каждое мини-веретено состояло из нескольких латерально ассоциированных К-фибрилл. К концу прометафазы, все мини-веретена реориентировались в биполярное метафазное веретено. Стадии формирования и дифференцировки веретена обобщены на рис. 3.

Рис. 3. Стадии дифференцировки митотического веретена в клетках эндосперма НаетапЛи*. (А-О) компактизация аколоодеркых МТ и формирование разных типов профазного веретена. (О-Р) реорганизация профазных веретен в биполярное метафазное веретено. Первая стадия (А-О) осуществляется в ходе двух этапов: во время первого этапа (А-С) радиальная система МТ аккумулируется вокруг ядра и формирует плотную околоядерную корзинку. Во время второго этапа (О) однородная корзинка МТ может трансформироваться в многополюсное (01), биполярное (02) или аполярное (03) профазное веретено. В прометафазе (В) все три типа профазкых веретен неизменно дифференцируются в биполярное метафазное веретено

Следовательно, общим признаком изолированных клеток эндосперма является умеренная десинхронизация хромосомного и МТ циклов. Мы предполагаем, что критическим моментом (checkpoint) для корректировки обеих циклов является прометафаза. Однако возможны несколько механизмов регуляции этого процесса: 1) хромосомы выполняют ведущую роль в сборке веретена (Vernos and Karsenti, 1995), 2) формирование веретена идет независимо от присутствия хромосом (Bajer and Mole-Bajer, 1986). Предыдущие исследования (Bajer and Mole-Bajer, 1986) показали, что в

я

(F).

цитопластах эндосперма происходит последовательная трансформация беспорядочной сети МТ в биполярные веретеновидные пучки (ЦКМТ), сходные с прометафазной организацией К-фибрилл. Стадия метафазной организации пучков не выявляется, и прометафазное веретено без хромосом трансформируется непосредственно в фрагмопласт. Мы предполагаем, что в клетках кинетохоры прерывают и модифицируют цикл МТ и эксплуатируют механику МТ веретена для расхождения. Таким образом, ассоциация плюс-концов МТ с кинетохорами неизбежно ведет к формированию метафазной пластинки. Мы также предполагаем, что ассоциация МТ с кинетохорми частично подавляет (перекрывает) само-организацию МТ, которая бы неизбежно закончилась формированием преждевременного фрагмопласта. Выраженная биполярность каждой К-фибриллы в сочетании с повышенной латеральной ассоциацией предотвращает формирование многополюсного метафазного веретена.

Таким образом, для стадии перехода из интерфазы в митоз является характерным независимость хромосомного и МТ циклов (во время не очень выраженной десинхронизации, оба цикла синхронизируются в прометафазе). Профазное веретено имеет разные формы и конфигурации, а метафазное веретено всегда биполярна Разрушение ядерной оболочки запускает коррекционные механизмы организации веретена. Ассоциированные с ядром ЦКМТ участвуют в организации профазного веретена и используются как заготовки для будущих К-фибрилл, которые, в свою очередь, являются составным компонентом митотического веретена. Мы предполагаем, что формирование и реорганизация веретена являются выражением само-организации МТ, осуществляемой МТмоторными белками (Mitchison, 1992; Нутап and Karsenti, 1996) и модифицированный кинетохорами. 6. РОЛЬ ЦКМТ В РЕОРГАНИЗАЦИИ МТ И ФОРМИРОВАНИИ ОТРОСТКОВ В ПОЗДНЕЙ ТЕЛОФАЗЕ В КЛЕТКАХ ЭНДОСПЕРМА HAEMANTHUS

Изменение формы клеток и вытягивание клеточных отростков является свойством, характерным для многих эукариотических клеток. Наличие твердой целлюлозной клеточной стенки в клетках высших растений препятствует изменению формы клеток. Только эндосперм и экспериментально полученные протопласты не имеют целлюлозной клеточной стенки. В отличие от протопластов, клетки эндосперма после выделения на агаровую подложку, способны изменять свою форму. Этот процесс выражается в формировании цитоплазматических отростков на стадии перехода клеток из телофазы в интерфазу, и происходит одновременно с реорганизацией системы МТ. Цитоплазматические отростки в эндосперме имеют признаки, которые характерны для нейрональных клеток или соматических клеток с избыточной экспрессией MAP

(Weisshaar et al., 1992; Edson et al., 1993; Takemura et al., 1992,1995; Umeyama et al., 1993). Отростки в эндосперме появляются и становятся ярко выраженными через несколько часов после выделения клеток из зародышевого мешка на агаровую подложку. Формирование отростков зависит от времени и идет одновременно с реорганизацией МТ в области фрагмопласта. Организация системы МТ в телофазе

Во время телофазы, в клетках выявляются следующие структуры: первичный фрагмопласт и его производные - вторичный фрагмопласт, дополнительный фрагмопласт и периферическое кольцо МТ. Вторичный и дополнительный фрагмопласты были определены как фрагмопласты на основе их морфологического сходства и происхождения из первичного фрагмопласта (Esau, 1975; Brown and Lemmon, 1997; Brown et al., 1997).

Первичный фрагмопласт представляет собой бочковидную или двойную куполообразную структуру, локализованную в интерзоне. Он представляет собой универсальную конфигурацию, которая всегда возникает между сестринскими хромосомными группами в поздней анафазе или ранней телофазе. Клеточная пластинка в эндосперме формируется в экваториальной зоне первичного фрагмопласта. Первичный фрагмопласт изначально имеет форму замкнутой кольцеобразной, узкой ленты, состоящей в основном из полюсных МТ. Однако, во время последующей дифференцировки в пост-телофазе, первичный фрагмопласт всегда укорачивается и расщепляется на фрагменты.

направлении. Радиальная система МТ появляется в анафазе-телофазе. Периферическое кольцо МТ может формироваться как за счет расщепления вторичного фрагмопласта в области клеточной пластинки, так и дифференцировки радиальной системы. Дополнительные фрагмопласты и цитоплазматические отростки, содержащие пучки МТ появляются на периферии клетки после того, как сформировался вторичный фрагмопласт или периферическое кольцо

Вторичный фрагмопласт формировался на краях первичного. Он появлялся как распространение от центра к периферии боковых сторон первичного фрагмопласта, который постепенно разрастался в ширину и, в конце концов, разделял цитоплазму каждой дочерней клетки на две зоны. Вторичный фрагмопласт обычно формировался в клетках, которые не имели радиальной системы МТ в анафазе-телофазе (Bajer and Mole-Bajer, 1986). Вторичный фрагмопласт на краях экваториальной зоны часто расщеплялся на два полу-фрагмопласта, образуя Y-образную конфигурацию. Затем каждый полу-фрагмопласт распространялся по периферии цитоплазмы вдоль клеточной границы и частично или полностью окружал сестринские ядра, образуя плотное кольцо, состоящее из коротких, параллельных МТ (Morejohn et al. 1987). Мы назвали такую МТ конфигурацию "периферическое кольцо МТ". В клетках с большим объемом цитоплазмы, периферическое кольцо МТ может быть производным радиальной звездоподобной системы МТ. Такая система формировалась одновременно или до того, как появлялся первичный фрагмопласт (Bajer and Mole-Bajer, 1986). Следует отметить, что в некоторых клетках периферическое кольцо МТ развивалось как продолжение вторичного фрагмопласта на одном краю, и как часть звездоподобной системы МТ на другом краю (Bajer and Mole-Bajer, 1986). Таким образом, периферическое кольцо МТ возникало или из Y-образного расщепления и последующего разрастания вторичного фрагмопласта, или из дифференцирующейся звездоподобной системы МТ.

Дополнительные фрагмопласты наблюдались в пост-телофазе чаще всего на периферии клетки. Они возникали из периферического кольца МТ или из вторичного фрагмопласта. Периферическое кольцо МТ часто расщеплялось на фрагменты, состоящие из кластеров ЦКМТ или пучков МТ. Затем дивергирующие концы соседних пучков или ЦКМТ наклонялись и разворачивались внутрь, после чего взаимодействовали конец в конец, формируя небольшие дополнительные фрагмопласты около клеточного края. Пост-телофазная реорганизация фрагмопласта

Первое направление реорганизации происходило в том случае, когда клетки имели небольшой объем цитоплазмы и не формировали звездоподобную систему МТ в анафазе-телофазе. В этом случае, центробежное распространение первичного фрагмопласта приводило к формированию разросшегося вторичного фрагмопласта. Второе направление

запускалось Y-образным расщеплением вторичного фрагмопласта и проходило в сочетании с последующим латеральным распространением каждой половинки фрагмопласта. Такой тип дифференцировки приводил к образованию периферического кольца МТ, которое опоясывало одно или оба сестринских ядра. Третье направление проявлялось в том случае, когда клетки имели большой объем цитоплазмы и формировали звездоподобные МТ конфигурации в анафазе-телофазе. В этом случае, периферическое кольцо МТ возникало как производное этой МТ системы. Независимо от происхождения, периферическое кольцо МТ подвергалось дальнейшей дифференцировке по следующей схеме: кластеризация ЦКМТ, за которой следовало разделение кластеров и формирование МТ пучков и дополнительных фрагмопластов на периферии клетки. Наконец, после 4-5 часов, ЦКМТ (пучки) наблюдались внутри длинных цитоплазматических выростов, которые мы назвали отростками. Они появлялись во время телофазы в 20% клеток через 1-2 часа после выделения, и в 45% клеток через 3-5 часов после выделения (рис. 5). Их длина варьировала от 10 до 130 цш, но большинство отростков имело длину 30-50 цт. Более 90% отростков в терминальной части содержали пучки МТ или ЦКМТ. Длина ЦКМТ в редких случаях превосходила 25 цш, и в большинстве случаев составляла 5-20 цт. МТ почти всегда были организованы как единичные или собранные в кластеры ЦКМТ, у которых дивергирующий конец ориентирован наружу. Обычно очень немного МТ было расположено в сегменте отростка, который соединял терминально расположенный ЦКМТ с телом клетки. Формирование цитоплазматических отростков

Для того чтобы проследить за формированием отростков, мы использовали иммуноцитохимический анализ клеток, зафиксированных через разное время после выделения, в сочетании с наблюдениями за живыми клетками. Обычно этот процесс начинался как реорганизация периферического кольца МТ, через 1-2 часа после выделения. Кольцо фрагментировалось на множественные, плотные комплексы МТ или ЦКМТ. Через 2-3 часа после выделения, пучки и ЦКМТ обнаруживались внутри коротких цитоплазматических выростов или вздутий, похожих на дамеллоподии. Через 4-5 часов появлялись длинные цитоплазматические отростки, в терминальной части которых были расположены пучки МТ или ЦКМТ (рис. 5). Наблюдения in vivo выявили активное динамическое поведение периферической цитоплазмы. Мы наблюдали два типа процессов: образование цитоплазматических отростков из тонких ламеллоподия-подобных участков цитоплазмы и из удлиненных филоподия-подобных выростов.

А В С О Е В

30-40 гтгш1е» а Пег «хтл1оп

5 Ъоига шПег «Кппкш

Рис 5 Зависимая от времени реорганизация МТ цитоскелета при переходе из телофазы в интерфазу Процесс реорганизации цитоскелета был разделен на митоз (профаза-начало телофазы) (стадия А) и четыре стадии пост-телофазы (В-Е) Время между всеми стадиями составляло 90 минут Таким образом, время между стадиями А и Е составляло 6 часов (В) Ранняя телофаза. В клетках присутствует радиальная система МТ и первичный фрагмопласт Начинается дифференцировка вторичного фрагмопласта и периферического

кольца МТ. (С) Поздняя телофаза. Вторичный фрагмопласт и периферическое кольцо дают начало дополнительным фрагмопластам и МТ пучкам на периферии клетки. (Э) Ранняя интерфаза. Появляются многочисленные клеточные отростки, содержащие МТ пучки или ЦКМТ. (Е) Полное разделение дочерних клеток. Радиальные МТ вокруг ядер укорачиваются. Почти все МТ сосредоточены в периферической цитоплазме или в отростках.

Дифференцировка отростков из ламеллоподия-подобных участков цитоплазмы. Цитоплазматические пласты, похожие на ламеллоподии, вытягивались на 10-30 |ЛП от тела клетки. В течение нескольких часов, гладкий край пласта становился перфорированным и трансформировался в несколько цитоплазматических выростов, радиально отходящих от тела клетки. Эти выросты в терминальной области содержали плотные структуры, отражающие свет. Такие структуры не выявлялись в начале наблюдений. Как правило, они были расположены в виде полукруга на краях зоны, занимаемой пластом. Плотные структуры на концах отростков располагались на расстоянии, соответствующем расположению ЦКМТ на фиксированных препаратах. Большинство из них было неподвижно, но некоторые осциллировали как в сторону, так и по направлению от клеточного тела.

Формирование отдельных отростков. Многие пост-телофазные клетки имели филоподия-подобные выросты периферической цитопазмы, которые удлинялись и формировали цитоплазматические отростки. Мы проследили за поведением коротких и тонких цитоплазматических выростов на краю большого выступа периферической цитоплазмы. Короткий и тонкий филоподия-подобный вырост удлинялся, а затем на его кончике появлялось вздутие, отражающее свет. Это плотное вздутие на кончике выроста постепенно увеличивалась в размерах, после чего от него начинал отрастать другой тонкий филоподия-подобный вырост. В какой-то момент наблюдения; от этого же вздутия вытягивался второй вырост. Оба выроста несколько раз втягивались и вытягивались (как бы осциллировали). Измерение длины выроста показало, что его длина за 51 минуту выросла на 16 Цш. Средняя скорость удлинения составила О.Зцш/мин. Однако, удлинение происходило не с постоянной скоростью. Наблюдались периоды быстрого роста (длящиеся до 96 секунд), быстрого укорочения (до 78 секунд) и один длинный период роста (почти 19 минут). Периоды быстрого роста и удлинения наблюдались во время вытягивания и втягивания выростов. Период медленного роста совпадал с формированием и ростом преломляющего свет материала на конце отростка.

Мы предполагаем, что преломляющие свет кончики отростков содержат дистальные концы пучков МТ. Удлинение отростков происходит неравномерно и может быть связано с динамичным поведением МТ.

быть связано с тредмиллингом, а колебательное поведение (рывки) - с динамической нестабильностью. Интересно, что рост отростков в эндосперме и удлинение растительных МТ in vitro (Moore et al, 1997) происходит приблизительно с одной и той же скоростью (2.3 (im/min в эндосперме и 2.1 (im/minв выделенных МТ). Актиновые филаменты

Одновременное выявление в клетках сети актиновых филаментов и МТ показало зависимую от времени пространственную организацию актиновых филаментов и МТ в отростках. Через 1 час после выделения, актиновые филаменты располагались в наружной части цитоплазмы, в то время как МТ занимали ее внутреннюю часть. Через 35 часов после выделения, цитоплазматические отростки содержали как МТ, так и актиновые филаменты. Последние выявлялись как беспорядочная сеть, собирающаяся вокруг пучков МТ на клеточной периферии. Многочисленные капли цитоплазмы, содержащие актиновые филаменты, но не содержащие МТ, окружали тело клетки. Мы не выявили отростков, которые бы содержали только актиновые филаменты, или только МТ.

Таким образом, отростки в пост-телофазных клетках содержат как актиновые филаменты, так и пучки МТ. Расположенные в конце отростка ЦКМТ не связаны с основанием отростка или телом клетки. Этому есть два возможных объяснения. Отростки формируются за счет перемещения от центра к периферии пучков МТ или ЦКМТ и давления на клеточную мембрану. Второе объяснение состоит в том, что ЦКМТ мигрируют в выросты, как бы пред-сформированные актиновыми филаментами. Однако мы не обнаружили ЦКМТ в основании или средней части отростков. Такое расположение можно было бы рассматривать как промежуточную стадию перемещения ЦКМТ в уже сформированный отросток.

Итак, отростки имеют различную длину, и почти всегда содержат ЦКМТ в терминальной части. Наши наблюдения in vivo показывают, что удлинение отростков происходит не с постоянной скоростью. Одним из возможных объяснений является то, что медленный рост происходит в то время, когда идет одновременное удлинение ЦКМТ с одного конца и укорочение с другого конца. Наиболее вероятным молекулярным механизмом такого роста может быть тредмиллинг (Margolis and Wilson, 1978; 1981; 1998), который был подтвержден in vivo в бесцентросомных клеточных фрагментах, полученных из меланофоров (Rodionov and Borisy, 1997) и в кортикальной цитоплазме клеток высших растений (Shaw et al., 2003).

Таким образом, ЦКМТпринимаютучастие вреорганизацииМТцитоскелета при переходе из митоза в интерфазу. Они являются структурами, способными к автономному перемещению в цитоплазме. Мы предполагаем, что механизмом их

перемещения, является удлинение плюс-конца и укорочение минус-конца (treadmilling) МТ. Расположение ЦКМТ относительно тела клетки свидетельствует о том, что они перемещаются в направлении дивергирующего конца ЦКМТ. Следовательно, ЦКМТявляются не только элементарными, структурными единицами (строительными блоками), но и функционально активными образованиями.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в клетках высших растений при отсутствии структурно и функционально определяемой центросомы (ЦОМТ) в полюсах, организации митотического веретена осуществляется с помощью ЦКМТ.

Ш. ВЫЯВЛЕНИЕ ЦОМТ С ПОМОЩЬЮ АНТИТЕЛ К БЕЛКАМ ЦЕНТРОСОМЫ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ

1. Моноклональные антитела М РМ - 2, полученные к митотическим ЦОМТ клеток млекопитающих (Davis et aL, 1983; Davis and Rao, 1987), идентифицируют группу фосфорилнрованных белков, локализованных в ядре во время интерфазы и в центросоме (ЦОМТ) во время митоза во многих эукариотических клетках (Vandre et al., 1984,1986; Hecht et aL, 1987; Keryer et aL, 1987; Millar et aL, 1987,Wordeman et al., 1989; Harper et al., 1990). В клетках высших растений фосфорилированные белки распознаваемые антителами МРМ-2 были выявлены в профазном ядре, цитоплазме митотических клеток (Vandre et al., 1986; Traas et al., 1992), кинетохорах (Binarova et al., 1994) и фрагмопласте (Vandre et al., 1986). Вместе с тем, антитела не выявляли ЦОМТ в полюсах веретена митотических клеток. Было сделано предположение, что окрашиванию полюсов препятствует наличие интенсивного фонового свечения цитоплазмы, которое не может быть устранено в связи с наличием целлюлозной клеточной стенки (Vandre et aL, 1986). Клетки эндосперма Haemanthus не имеют целлюлозной клеточной стенки, поэтому они были использованы для иммунофлюоресцентного анализа распределения антигена МРМ-2 после разных способов фиксации и предварительной экстракции белков с помощью Тритона-Х100.

Идентификация антигена, реагирующего с антителами МРМ-2, в тотальных клеточных экстрактах Электрофорез в 10% полиакриламидном геле тотального клеточного экстракта эндосперма Haemanthus и Western blotting показал наличие группы белков с молекулярной массой от 40 до 200 kD. Эти белки можно условно разделить на группы с массой 40-45 kD, два белка 60-65 kD, группу белков с массой 100-130 kD, и один белок 200 kD. Более высокое разрешение белков с высокой молекулярной массой было

получено на 7.5% геле. Это были белки 100,120 кБ, два белка около 130-140 кБ, и один 200 кБ.

Локализация МРМ-2 реактивного антигена в изолированных клетках эндосперма Фиксация клеток метанолом. Во время интерфазы антитела выявляют белки в составе цитоплазматических гранул, локализованных в околоядерной области, а также диффузно распределенный материал в ядре. Во время перехода из интерфазы в профазу интенсивность ядерного окрашивания антителами возрастает, особенно вблизи ядерной оболочки и вокруг хромосом. Гранулы, содержащие МРМ-2 антиген, распределяются по всей цитоплазме. В профазе МРМ-2 антиген появляется в цитоплазме и в ассоциации с МТ профазного веретена. Клетки на стадии метафазы имеют самое яркое окрашивание цитоплазмы антителами МРМ-2. Однако иммунореактивный материал ассоциирован с МТ К-фибрилл, в результате чего антитела МРМ-2 выявляют митотическое веретено так же отчетливо, как и антитела к тубулину. Во время анафазы интенсивность окрашивания цитоплазмы уменьшается, но К-фибриллы и интерзональные МТ по-прежнему выявляются антителами МРМ-2. В поздней анафазе или ранней телофазе интенсивность окрашивание цитоплазмы уменьшается, однако полюсные МТ и МТ фрагмопласта по-прежнему выявляются антителами МРМ-2. Антитела также выявляют белхи в области клеточной пластинкой. Во время перехода из телофазы в интерфазу, МТ отрастают от ядерной оболочки и формируют радиальную систему. Однако эти МТ уже не выявляются антителами МРМ-2. Иммунореактивность сохраняет только клеточная пластинка и проксимальные участки МТ фрагмопласта.

Обработка клеток перед фиксацией. Предварительная обработка клеток с Тритоном-Х100 в присутствии МТ стабилизирующих буферов позволила избавиться от яркого диффузного свечения цитоплазмы. Во время интерфазы, мы не выявили диффузного окрашивания ядра и гранул в цитоплазме. Во время профазы антиген МРМ-2 был обнаружен в ассоциации с околоядерными МТ веретена, в то время как полюса профазного веретена были скорее антиген-негативными. В прометафазе и метафазе, антитела выявляли центральные районы К-фибрилл, и не выявляли периферические МТ К-фибрилл. Дистальные участки К-фибрилл и сеть МТ в полюсах также не содержали МРМ-2 антиген. Сходное окрашивание наблюдается в анафазе. В целом, полярные области веретена на всех стадиях митоза были скорее антиген-негативными. В телофазе МРМ-2 окрашивали МТ фрагмопласта. Однако окрашивание фрагмопласта было более выраженным, чем после фиксации метанолом. Кроме того, сегменты МТ, дисгальные по отношении к клеточной пластинке, а также и сама клеточная пластинка, не содержали МРМ-2 положительного материала.

Таким образам, в питанных клеточных экстрактах эндосперма Haemanthus антитела МРМ-2 выявляют группу фосфорилированных белков с молекулярной массой от 40 до 200 kD В клетках эндосперма антитела МРМ-2 выявляют белки, которые колокализуются с митотическими МТ. МРМ-2 не выявляют ЦОМТ в полюсахмитотического веретена, независимо от способов фиксации и обработки клеток.

2. ^тубулин был идентифицирован в разных типах клеток высших растений, но его внутриклеточная локализация (ассоциация с МТ по все их длине, присутствие на поверхности ядра и в области кинетохоров) (Liu et al., 1993; Binarova et al., 1998, 2000; Panteris et al., 2000) значительно отличается от той, которая наблюдается в клетках животного происхождения (центросома) (Oakley, 1994). Исследование локализации f-тубулина в клетках эндосперма Haemanthus показало, что во время интерфазы и на всех стадиях митоза, у-тубулин колокализуется с МТ. Ассоциация белка с МТ носит точечный или пунктирный характер. Следует отметить, что мы не наблюдали преимущественной ассоциации тубулина с полюсами митотического веретена или фрагмопластом. Скорее всего, в клетках высших растений у-тубулин выполняет иную функцию, не связанную с инициацией роста новых МТ. Об этом также свидетельствуют данные, согласно которым -

-тубулин колокализуется с индуцированными колхицином паракристаллами тубулина, которые на самом деле не являются МТ (Panteris et al., 2000).

Наши данные свидетельствуют о том, что в клетках эндосперма Haemanthus -тубулин колокализуется с МТ и преимущественногораспределения этого белка в полюсах митотического веретена не наблюдается.

3. Ядерно-полюсной белок NuMa (Nuclear Mitotic Apparatus) является одним из компонентов тримолекулярного белкового комплекса (динеин-динактин-NuMa), который участвует в фокусировании полюсов веретена независимо от присутствия там центросомы (ЦОМТ) (Compton, 1998). Данный белок выявляется в ядре во время интерфазы и в полюсе митотического веретена (центросоме) во время митоза в клетках животных (Tang et al, 1994; Compton et al., 1992; He et al, 1995; Zeng, 2000). Для наших исследований мы использовали антитела к NuMa человека (Compton et al., 1992). Наши данные по локализации белка в выделенных клетках меристемы не согласуются с описанием локализации NuMA полученными другими исследователями (Yu and de la Espina, 1999). Идентификация NuMa в клеточных экстрактах. В экстрактах, полученных из клеток эндосперма Haemanthus, присутствуют белки, распознаваемые антителами к NuMa. Эти белки имеют молекулярную массу 190-210 KD. По-видимому, они являются аналогами NuMa в клетках высших растений.

Локализация №МА в интерфазных и митотических клетках. В изолированных клетках эндосперма Haemanthus в профазе №Ма выявляется в области профазного веретена. В прометафазе, метафазе и анафазе белок локализуется в области веретена, но концентрируется в полюсах. В телофазе №Ма присутствует в околоядерной зоне и в области фрагмопласта.

В клетках меристемы корня АШum сера в интерфазе №МА диффузно распределен в цитоплазме или концентрируется в околоядерной области, и не выявляется в ядре. Отсутствие №1Ма в интерфазном ядре можно объяснить тем, что данные антитела выявляют в клетках растений одну из изоформ белка (Р-изоформа), которая не содержит сигнала ядерной локализации (КЬ8) белка (ОэшрЬп е! а1., 1992). На стадии профазы

выявляется в околоядерной области, при этом отмечается скопление белка в районах полюсов формирующегося веретена, и отсутствие его в области, занимаемой ППК. В метафазных клетках распределение ХиМане является однотипным. Так, в одних клетках занимает область всего веретена, в то время как в других клетках

аккумулируется в зоне полюсов веретена. Во время анафазы диффузный полюс веретена трансформируется в компактный. Белок №МА в это время выявляется в полюсах веретена, а также в экваториальной зоне, где расположены интерзональные МТ. Во время телофазы №иМА колокализуется с МТ фрагмопласта.

Локализации в клетках меристемы корня при разборке МТ оризалином.

Оризалин индуцировал нарушение организации и разборку МТ, в результате чего клетки переходили в К-митоз. Через 1 час после начала воздействия, наряду с К-митотическими клетками, наблюдались все стадии нормального митоза. При исследовании локализации

были выявлены следующие особенности. В интерфазе белок скапливался в виде плотных агрегатов в околоядерной области. Во время профазы белок также аккумулировался в цитоплазме в виде агрегатов, которые иногда достигали крупного размера. Во время метафазы, ХиМа присутствовал в полюсах веретена в клетках, где веретено сохраняло свою структуру, и вокруг хромосом и остаточных МТ веретена в К-метафазных клетках. Клетки на стадии анафазы в это время встречались редко, и имели дезорганизованное веретено с редуцированным числом МТ. В таких клетках выявлялся в полюсах веретена, но его распределение было несимметричным - фактически, при наличии двух полюсов веретена, выявлялся только в одном из них. Более продолжительное воздействие оризалина (3 часа) вызывает полную разборку всех систем МТ и переход клеток в К-митоз. Скопления остаточных МТ или конгломератов тубулина располагались в цитоплазме интерфазных, профазных, К-метафазных и К-телофазных

клеток. Некоторые конгломераты тубулина и ЫиМа были колокализованы, в то время как в других клетках такой закономерности не наблюдалось.

Локализация МиМа при восстановлении системы МТ после удаления оризалина. Через 3-6 часов после удаления оризалина, в интерфазных и К-митотических клетках начинается восстановление МТ. Это проявляется в появлении множества веерообразных пучков МТ. В интерфазных клетках пучки располагались в кортикальной цитоплазме, а в К-митотических клетках - в области расположения хромосом. Четкой колокализации между такими пучками МТ и скоплениями не наблюдалось даже в одной и той же

клетке. Через 12-18 часов восстановления, в клетках наблюдались более длинные веерообразные пучки МТ, которые при взаимодействии друг с другом образовывали крупные кластеры или ЦКМТ. Однако колокализации МиМа и таких кластеров МТ не наблюдалось. В профазных клетках происходило восстановление ППК, и №1Ма располагался в околоядерной области или в полюсах профазного веретена, причем, только в одном из полюсов. В К-метафазных клетках новые МТ отрастали от хромосом, но большинство из них не колокализовалось со скоплениями ИиМа. Через 24 часа после начала восстановления, мы наблюдали длинные МТ отходящие от хромосом, но нормальное митотическое веретено не было сформировано. №Ма диффузно заполнял цитоплазму, образуя небольшие скопления, но никаких закономерностей распределения в связи с МТ не наблюдалось.

Локализации КиМА после стабилизации МТ таксолом. В интерфазных клетках КМа так же, как и в контроле, концентрировался в околоядерной области. На стадии профазы плотность МТ в клетке значительно возрастала, особенно в области ППК. В отличие от контрольных клеток, при действии таксола ИиМА выявлялся в области ППК. На стадии метафазы, плотность МТ в составе веретена увеличивалась по сравнению с контрольными клетками, также увеличивалось количество длинных МТ. В это время КиМа был диффузно распределен в области веретена. Во время анафазы веретено имело больше полюсных МТ, они формировали звездообразные конфигурации в полюсах. Однако локализация была такой же, как и в контрольных клетках. Во время телофазы

колокализовался с МТ фрагмопласта. В тех клетках, где произошло разрастание клеточной пластинки, и фрагмопласт переместился из центральной цитоплазмы к периферии, белок выявлялся там, где ранее располагался фрагмопласт. Следовательно, таксол вызывает сегрегацию МТ и №Ма при дифференцировке и латеральном расширении фрагмопласта.

Локализация при действии хлоралгидрата. В клетках на стадии профазы

распределение концентрируется вокруг ядра, также как и в контрольных клетках.

Иногда он присутствует в виде отдельных несимметричных скоплений на поверхности ядра. На стадии метафазы выявляются клетки с относительно нормальной организацией веретена деления, и клетки с разной степенью нарушений в организации веретена. Распределение NuMa в клетках с дезориентированными К-фибриллами веретена было частично сходно с тем, что наблюдалось в контрольных клетках: белок присутствовал в области веретена, но его аккумуляция в полюсах веретена была выражена гораздо меньше. В К-метафазных клетках NuMA был диффузно распределен в цитоплазме, но иногда формировал отдельные конгломераты. Не все структуры МТ колокализовались со скоплениями NuMA,также как и не все скопленМяЬЗДответствовали расположению МТ. Под действием хлоралгидрата наряду с нормальными биполярными анафазами, наблюдалось многополюсное расхождение хромосом. Сравнивая локализацию NuMa со структурой веретена в анафазе, можно сказать, что во время многополюсной анафазы белок присутствует в составе не всех полюсов многополюсного веретена. В телофазе

был локализован в составе фрагмопласта, однако он также присутствовал в областях, которые занимал фрагмопласт на более ранних стадиях дифференцировки. Следовательно, хлоралгидрат, также как и таксол, вызывает сегрегацию МТ и NuMA,.

Таким образом, в клетках высшихрастений NuMa выявляется в ассоциации с веретеном деления, в полюсе веретена и в составе фрагмопласта, и отсутствует в интерфазном ядре и ППК. При разборке МТ белок аккумулируется в виде конгломератов, и, по-видимому, не участвует в восстановлении новых МТ. Возможно также разобщение колокализации NuMa и МТ, что происходит при дифференцировке фрагмопласта в присутствии таксона и хлоралгидрата. Стабилизация МТтаксолом также индуцирует появление NuMas ППК. NuMa выявляется не во всех полюсах многополюсных веретен, индуцированных оризалином и хлоралгидратом, но всегда локализуется в полюсе биполярного веретена контрольных клеток. Этоуказывает на возможную path NuMa в стабилизации полюсов и обеспечении биполярности веретена

IV. УЧАСТИЕ МОТОРНЫХ БЕЛКОВ В ОРГАНИЗАЦИИ МТ

В растительных клетках обнаружено много моторных белков (Reddy, 2001), среди которых особое место занимает КСВР. Кинезино-подобный калмодулин-связывающий белок (Kinesin-like Calmodulin Binding Protein) - КСВР, был выделен из Arabidopsis thaliana и затем идентифицирован в культуре картофеля и табака. Он принадлежит к семейству белков кинезинов (Reddy et al., 1996) Этот белок является уникальным среди кинезино-подобных белков, потому что содержит калмодулин-связывающий домен,

прилегающий к моторному домену. КСВР является минус-конец ориентированным мотором, и связь его моторного домена с МТ и тубулином является АТФ-зависимой (Song et al., 1997; Narasimhulu et al., 1997; Narasimhulu and Reddy, 1998). Идентификация КСВР в составе клеточных экстрактов. В тотальных клеточных экстрактах эндосперма Haemanthus антитела к КСВР определяют белок с молекулярной массой 140 kD. Аналогичный белок выявляется данными антителами в тотальных экстрактах культуры табака и клетках Arabidopsis thaliana (Bowser and Reddy, 1997). Локализация КСВР в клетках. Выделенные клетки эндосперма фиксировали метанолом или до фиксации инкубировали в МТ стабилизирующем буфере, содержащим детергенты, а затем проводили иммуноцитохимическое окрашивание. Ассоциация КСВР с митотическими МТ хорошо видна уже в средней-поздней профазе. Независимо от способа фиксации, антитела выявляют белок в области профазного веретена. Двойное окрашивание антителами к тубулину и КСВР показывает, что распределение этих белков практически идентично. В прометафазе, профазное веретено трансформируются в бочковидное метафазное веретено. Полярные области такого веретена диффузные и неструктурированные. Локализации КСВР в составе метафазного веретена зависит от способа фиксации и окрашивания. Так, после фиксации метанолом, антитела. ассоциируют со всеми МТ К-фибрилл. Обработка до фиксации позволяет выявить пунктирное окрашивание, локализованное в центральной части К-фибрилл, непосредственно вблизи кинетохоров. Иногда вся центральная часть К-фибрилл, а не только участок, прилежащий к кинетохору, была маркирована антителами. Во время ранней анафазы, когда веретено сохраняет бочковидную форму и диффузное состояние полюсов, КСВР ассоциирован с К-фибриллами и с МТ в интерзональной области. В средней и поздней анафазе, движение хромосом к полюсам часто сопровождается фокусированием К-фибрилл и компактизацией диффузного полюса в конвергентный. Двойное окрашивание показывает, что независимо от способа фиксации и обработки, КСВР аккумулируется в конвергирующем полюсе веретена. Аккумуляция белка в области полюсов сохраняется до средней телофазы. В это время диффузное распределение КСВР выявляется в области цитоплазмы между сестринскими хромосомными группами. Двойное окрашивание антителами к тубулину и КСВР показывает, что белок локализуется в области, занимаемой фрагмопластом. В средней-поздней телофазе, КСВР выявляется в ассоциации с МТ фрагмопласта и ядром Обработка клеток до фиксации значительно снижает интенсивность окрашивания фрагмопласта, и способствует визуализации КСВР в клеточной пластинке.

По нашим данным, в клетках эндосперма Haemanthus КСВР, колокализуясь с МТ профазного и метафазного веретена, концентрируется в полюсе веретена во время анафазы-телофазы. В средней телофазе, белок перераспределяется в область фрагмопласта и клеточной пластинки. Можно предположить, что КСВР играет важную роль в реорганизации веретена в ходе анафазы, путем фокусирования диффузных метафазных полюсов в конвергентные анафазные полюса. Перераспределение КСВР в область полюсов в анафазе происходит в соответствии с установленной полярностью МТ в веретене Haemanthus (Eutenauer et al, 1982; Vantard et al., 1990) и локализацией динеина в клетках культуры млекопитающих (Pfarr et al., 1990; Steuer et al., 1990). Время перераспределения совпадает с трансформацией бочковидного веретена в конвергентное. Мы предполагаем, что в эндосперме Haemanthus КСВР принимает участие в фокусировании полюсов во время анафазы. Это согласуется с биохимическими и моторными свойствами белка. КСВР является минус-конец ориентированным моторным белком (Song et al., 1997), и содержит два МТ связывающих домена: один находится в N-концевом районе, и второй в С-концевом моторном домене (Narasimhulu and Reddy, 1998). Эти свойства позволяют белку связывать соседние МТ, перемещать их по направлению к минус-концам друг друга, и таким образом, обеспечивать их фокусирование. Эти данные (Song et al., 1997; Narasimhulu et al., 1997; Narasimhulu and Reddy, 1998) в сочетании с проведенными наблюдениями, указывают на потенциальное участие данного белка в фокусировании МТ в анафазе. В связи с тем, что веретено состоит из отдельных К-фибрилл, организованных как ЦКМТ, КСВР также может принимать участие в сборке этих структурных компонентов веретена.

Таким образам, минус-конец ориентированныймоторный белокКСВР выявляется в составе митотического веретена в метафазе и перераспределяется к полюсам веретена па стадии анафазы-телофазы, когда диффузный полюс веретена трансформируется в конвергентный. Мы предполагаем,что вэндосперме Haemanthus КСВР принимает участие в фокусировании полюсов во время анафазы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в полюсах митотического веретена клеток высших растений выявляются белки (NuMa, КСВР), которые принимают участие в ЦОМТ-независимой организации митотического веретена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Центры конвергенции МТ (ЦКМТ) являются универсальными структурными образованиями, которые присутствуют в разных типах клеток высших растений.

Начальные стадии их формирования включают в себя латеральное взаимодействие контактирующих МТ, после чего следует сборка-разборка концов МТ. Вместе с тем, нельзя исключить и спонтанную нуклеацию МТ, за которой следует элонгация МТ сегментов. ЦКМТ особенно отчетливо выявляются на таких стадиях как переход из телофазы в интерфазу и из интерфазы в митоз, и индуцируются изменением температурного режима. Кроме этого, сборка ЦКМТ требует определенной пространственной организации сети МТ, о чем свидетельствует характер формирования ЦКМТ в безъядерных клеточных фрагментах эндосперма. К-фибриллы веретена могут рассматриваться как ЦКМТ с избыточным количеством боковых или придаточных МТ, в результате чего К-фибрилла получила название «еловое дерево» (Microtubular Fir Tree -MTFT) (Bajer and Mole-Bajer, 1986). Мы выделяем четыре основных свойства ЦКМТ. Первое свойство - это функциональная полярность, выражающаяся в разном поведении конвергирующих и дивергирующих концов ЦКМТ. Конвергирующие концы ассоциируют латерально, а дивергирующие - конец в конец. Вторым свойством ЦКМТ является тенденция к формированию конечных стабильных МТ структур, таких как замкнутые кольца МТ иди фрагмопласты (Bajer and Mole-Bajer, 1986). Третьим признаком является отсутствие метафазного типа МТ структур при трансформации прометафазных конфигураций в телофазные (фрагмопласт). Четвертым свойством является их автономное поведение, которое выражается в способности ЦКМТ к перемещению. ЦКМТ могут перемещаться как в сторону плюс, так и минус конца. Перемещение вперед дивергирующих концов ЦКМТ происходит в телофазе (возможный механизм - treadmilling), а перемещение вперед конвергирующих концов - в профазе (возможный механизм - отделение от ядерной поверхности и неупорядоченное движение). Мы предполагаем, что все эти свойства ЦКМТ являются основополагающими факторами, регулирующими формирование и реорганизацию веретена.

На основании проведенных исследований и данных литературы, мы предлагаем следующую модель организации митотического веретена. МТ в ацентросомальных клетках высших растений собираются в виде "заготовок" - ЦКМТ. Обычно ЦКМТ находятся в свободном состоянии в цитоплазме (как в большинстве клеток с целлюлозной клеточной стенкой). В клетках с радиальной системой МТ, ЦКМТ конвергирующими концами ассоциированы с ядром. При поступлении сигналов (здесь возможно участие RAN белков) из ядра, ЦКМТ отделяются от поверхности ядра (возможно, при участии катанина). Как только такое отсоединение произошло, начинаются циклические изменения МТ - их само-реорганизация (за счет основных свойств ЦКМТ, указанных выше). В результате, формируются биполярные веретеновидные структуры (при участии

моторных белков, МиМа и т.д.)- Таким образом, ЦКМТ используются как строительные блоки для организации веретена. По существу, они являются предшественниками К-фибрилл Координация этого процесса осуществляется хромосомами, которые в определенный момент "вставляют себя" в цикл МТ путем ассоциации с плюс-концами ЦКМТ. Если этого не происходит (из-за десинхронизации циклов), плюс-концы МТ ассоциируют друг с другом конец в конец, и формируется фрагмопласт. Хромосомы, захватывая плюс-концы МТ, препятствуют взаимодействию плюс-концов МТ и их стабилизации в составе фрагмопласта. Хромосомы инициируют изменение динамического состояния МТ и используют их механические возможности для расхождения к полюсам. При этом присущая МТ структурам тенденция к формированию биполярных структур, реализуется для точной сегрегации хромосом.

ВЫВОДЫ

1. Полюса митотического веретена не являются функционально активными ЦОМТ. Эти функции в клетках меристемы корня выполняют ядро и хромосомы.

A. Ингибитор полимеризации МТ колхицин вызывает разборку МТ в клетках меристемы корня Triticum aestivum и переход клеток в К-митоз. В К-митотических клетках колхицин индуцирует формирование немикротрубочковых тубулиновых агрегатов. После удаления колхицина тубулиновые агрегаты разрушаются, и затем начинается полимеризация МТ. МТ восстанавливаются от ядра и хромосом, что ведет к формированию нормальных биполярных и многополюсных митотических веретен.

Б. Синтетический аналог колхицина колцемид вызывает разборку МТ в клетках меристемы корня Allium сера и переход клеток в К-митоз. После удаления колцемида МТ в митотических клетках восстанавливаются от хромосом, что ведет к организации нормальных биполярных и многополюсных митотических веретен.

B. Ингибитор МТ и ЦОМТ хлоралгидрат подавляет рост МТ от поверхности ядра и формирование веретена в профазе в клетках меристемы корня Album сера, что ведет к переходу клеток в К-митоз. В то же время, хлоралгидрат существенно не влияет на структуру уже сформированного митотического веретена.

Г. Пониженная температура индуцирует разборку МТ в клетках меристемы корня Triticum aestivum. После действия пониженной температуры МТ восстанавливаются в виде ЦКМТ, отрастающих от ядра или хромосом. Конвергирующие концы ЦКМТ, ассоциированные с ядром, содержат ацетилированный а-тубулин.

2. В клетках эндосперма Haemanthus система МТ состоит из элементарных структурных компонентов - ЦКМТ, которые при формировании митотического веретена функционально замещают центросому (ЦОМТ).

А. ЦКМТ имеют следующие свойства: 1) Функциональная полярность, выражающаяся в разном поведении конвергирующих и дивергирующих концов ЦКМТ. Конвергирующие концы ассоциируют латерально, а дивергирующие - конец в конец. 2) Тенденция к формированию конечных и стабильных МТ структур, таких как фрагмопласт. 3) Отсутствие метафазного типа МТ структур при трансформации прометафазных конфигураций в телофазные (фрагмопласт). 4) Способность к автономному перемещению в цитоплазме, путем роста (удлинения) плюс-конца и укорочения минус-конца (treadmilling) МТ.

Б. Одним из характерных признаков перехода из интерфазы в митоз является независимость хромосомного и МТ циклов, которые обычно синхронизируются в прометафазе. Профазное веретено имеет разную форму и конфигурации, а метафазное веретено всегда биполярно. Разрушение ядерной оболочки запускает коррекционные механизмы организации веретена. Ассоциированные с ядром ЦКМТ участвуют в организации профазного веретена и используются как заготовки для будущих К-фибрилд, которые являются составным компонентом митотического веретена.

3. В полюсах митотического веретена клеток высших растений отсутствуют белковые комплексы, которые могли бы выполнять функции диффузной центросомы. Белки центросомы (ЦОМТ) животных клеток присутствуют в клетках эндосперма Haemanthus katherinae. Фосфорилированные белки митотических ЦОМТ, распознаваемые антителами МРМ-2 выявляются в составе митотических МТ. f тубулин присутствует в интерфазных и митотических МТ. МРМ-2 и у-тубулин не выявляются в полюсах митотического веретена.

4. В полюсах митотического веретена клеток высших растений присутствуют белки, которые участвуют в ЦОМТ-независимой организации митотического веретена (NuMa и КСВР).

А. Белок ядерного матрикса и митотического веретена NuMa в клетках эндосперма Haemanthus и меристемы корня АШит сера выявляется в полюсах митотического веретена. NuMa также присутствует в составе фрагмопласта, и отсутствует в ядре и в ППК. Такое распределение NuMa может изменяться при действии агентов, вызывающих деполимеризацию, стабилизацию и дезорганизацию МТ. Деполимеризация МТ

оризалином приводит к необратимой агрегации в цитоплазматические

конгломераты. Стабилизация МТ таксолом вызывает появление №1Ма в П П К и разобщение колокализации №]Ма и МТ в составе фрагмопласта. Разобщение колокализации ИиМа и МТ в составе фрагмопласта также происходит при действии хлоралгидрата. В индуцированных многополюсных митотических веретенах, МиМа выявляется не во всех полюсах. Так как белок всегда присутствует в полюсе биполярного веретена контрольных клеток, можно заключить, что участвует в установлении и

поддержании биполярности веретена.

Б. В клетках эндосперма Haemanthus минус конец-ориентированный кинезиноподобный белок КСВР принимает участие в реорганизации полюсов митотического веретена. Во время метафазы КСВР ассоциирован с МТ веретена, а во время анафазы выявляется в его полюсах. Перераспределение КСВР в полюса коррелирует с трансформацией диффузных полюсов веретена в фокусированные. Следовательно, КСВР стягивает К-фибриллы в фокусированный полюс, что обеспечивает группирование хромосом в ядрах дочерних клеток

5. На основании имеющихся данных, нами была предложена модель независимой от ЦОМТ организации митотического веретена в клетках высших растений. МТ в

клетках высших растений собираются в виде «заготовок» - ЦКМТ. ЦКМТ находятся в свободном состоянии в цитоплазме или ассоциированы с ядром. При вступлении в митоз, ЦКМТ отделяются от поверхности ядра. Они перемещаются в околоядерную цитоплазму, где начинаются циклические изменения МТ - само-реорганизация. В результате, формируются разнообразные веретеновидные структуры. Таким образом, ЦКМТ используются как строительные блоки для организации веретена. Координация этого процесса осуществляется хромосомами, которые после разрушения ядерной оболочки "вставляют" себя в цикл само-организации МТ путем ассоциации с плюс-концами ЦКМТ. Хромосомы инициируют изменение динамического состояния МТ и используют их механические возможности для расхождения к полюсам.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смирнова Е.А. и Ченцов Ю С. 1991. Восстановление микротрубочек в митотических клетках корневой меристемы AПium сера после действия колцемида. Цитология 33:47-54.

2. Smirnova EA, Wawrowsky K.A. and Bajer A.S. 1992. Microtubule nucleating centers reflect microtubule polarity in interphase and mitosis ofhigher plant Haemanthus. Mol. Biol. Cell 3:343a.

3. Smirnova EA and Bajer A.S. 1992. Spindle poles in higher plant mitosis. Cell Motil. Cytoskel. 23:1-7.

4. Bajer A.S., Smirnova E.A and Mole-Bajer J. 1993. Microtubule converging centers. I. Implications for microtubule dynamics in higher plants. NATO ASI Series. Chromosome Segregation and Aneuploidy. B.K. Vig, editor. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg. Vol. H72.225-239.

5. Smirnova EA and Bajer A.S. 1994. Monoclonal antibody against phosphorylated proteins (MPM-2) recognizes mitotic microtubules in endosperm cells ofhigher plant Haemanthus. Mol. Biol. Cell 5:413a.

6. Bajer A.S., Smirnova EA, Wawrowsky KA, WolfR. and Mole-Bajer J. 1994. Microtubule converging centers. II. Implications for microtubule dynamics in higher plants. NATO ASI Series. Biomechanics ofActive Movements and Division ofCells. N. Akkas, editor. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg. Vol. H84:472-478

7. Smirnova EA and Bajer A. S. 1994. Microtubule converging centers and reorganization ofthe interphase cytoskeleton and the mhotic spindle in higher plant Haemanthus. Cell Motil. Cytoskel. 27:219-233.

8. Smirnova EA, Cox D.L. and Bajer A.S. 1995. Antibody against phosphorylated proteins (MPM-2) recognizes mitotic microtubules in endosperm cells ofhigher plant Haemanthus. Cell Motil. Cytoskel. 31:34-44.

9. Smirnova EA and Bajer A. S. 1996. Spindle formation in Haemanthus endosperm is driven by self-organization ofmicrotubule cytoskeleton. Mol. Biol. Cell 7:210a.

10. Smirnova EA and Bajer A. S. 1996. Bundling and translocation ofMT arrays in endosperm of Haemanthus during telophase-interphase transition. Mol. Biol. Cell 7:210a.

11. Smirnova EA, Reddy A.S.N., Bowser J. and Bajer AS. 1997. Distribution of kinesin-like minus-end directed protein during mitosis in endosperm ofhigher plant Haemanthus. Mol. Biol. Cell 8:378a.

12. Smirnova EA and Bajer A.S. 1998. Early stages of spindle formation and. independence of chromosome and microtubule cycles in Haemanthus endosperm. Cell Motil. Cytoskel. 40:22-37.

13. Смирнова ЕА 1998. Организация митотического веретена в клетках высших растений. Физиология растений 45:165-173.

14. Smirnova E.A., Reddy A.S.N., Bowser J. and Bajer A.S. 1998. A minus end-directed kinesin-like motor protein, KCBP, localizes to anaphase spindle poles in Haenumthus endosperm. Cell Motil. Cytoskel. 41:271-280.

15. Rubina, KA., Gulak, P.V., Smirnova, E.A., Starodubov, S.M., and Onishchenko, G.E. 1999. Identification ofthe microtubule organizing centers in interphase melanophores of Xenopus laevis larvae in vivo. Pigm. Cell Res. 12:295-310.

16. Rubina, KA, Gulak, P.V., Smirnova, EA, Starodubov, S.M., and Onishchenko, G.E. 1998. The behavior of the centrosome and microtubules in melanophores of Xenopus laevis larva in vivo. Pigm. Cell Res. 11:258.

17. Rubina, K.A., Gulak, P.V. Smirnova, E.A., Starodubov, S.M., and Onishchenko, G.E. 1998. Identification of microtubule organizing centers in dermal melanophores of Xenopus laevis larvae. Mol. Biol. Cell 9:279a.

18. Smirnova E.A. 1999. Organization ofthe mitotic spindle in higher plants. Acts Biol.Cracov. 41:25.

19. Bajer A.S. and Smirnova EA 1999. Reorganization ofmicrotubular cytoskeleton and formation of cellular processes during post-telophase in Haemanthus endosperm. Cell Motil. Cytoskel. 44:96-109.

20. Смирнова Е.А., Светлицкая О.М. и Ченцов Ю.С. 2002. Нарушение организации митотических микротрубочек в клетках меристемы корешков Allium сера при действии хлоралгидрата. Цитология 44:120-130.

21. Smirnova EA. 2003. Spindle pole formation in higher plant cells. Cell Biol. Int. 27(3):273-274.

22. Lazareva E.M., Polyakov V.Y.,Chentsov Y.S. and Smirnova EA 2003. Time and cell-cycle dependent formation ofheterogeneous tubulin arrays induced by colchicine in Triticum aestivum root meristem. Cell Biol. Intern. 27(8):633-646.

23. Смирнова ЕА, Светлицкая О.М. и Ченцов Ю.С. 2003. Внутриклеточная локализация и предполагаемые функции белка ядерного матрикса и полюса митотического веретена (NuMa) в клетках высших растений. Цитология 45:927-928.

24. Lazareva E., Chentsov Y. and Smirnova E. 2003. Microtubule converging centers appear in the root meristem cells ofwheat Triticum aestivum after exposure to low temperature. Mol. Biol. Celt 14:448a.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 14.01.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 3,0. Тираж 100 экз. Заказ 064. Тел. 939-3890, 939-3891, 928-1042. Тел/Факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В Ломоносова.

РНБ Русский фонд

2004-4 24166

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Смирнова, Елена Александровна

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. МИКРОТРУБОЧКИ (МТ)

1. Общие свойства

2. Различия между МТ животных и растительных клеток

2.1. Реакция МТ на действие ингибиторов полимеризации тубулина

2.2. Молекулярные различия

2.3. Динамическое состояние

3. Структурные MAP(Microtubule Associated Proteins)

МТ растительных клеток

4. Моторные белки МТ растений

4.1. Белки семейства кинезинов

4.2. Семейство динеинов

5. NuMa (Nuclear Mitotic Apparatus Protein)

5.1. Общая характеристика NuMa

5.2. Распределение белка в ходе клеточного цикла животных клеток

5.3. Функции NuMA

5.4. NuMA растительной клетки 24 II. ОРГАНИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ МТ В КЛЕТКАХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

1. ИНТЕРФАЗНАЯ СИСТЕМА МТ

1.1. Радиальная система МТ

1.2. Кортикальная сеть 27 1.2.1 .Структура кортикальной сети

1.2.2. Происхождение кортикальной сети

1.2.3. Функции кортикальной сети

2. ПРЕПРОФАЗНОЕ КОЛЬЦО МТ (ЛПК)

2.1. Структура ППК

2.2. Предполагаемые функции ППК

2.3. Стадии формирования ППК

2.4. Происхождение ППК

2.5. Взаимоотношения между ППК и ядром

3. ВЕРЕТЕНО ДЕЛЕНИЯ

3.1. Общая характеристика структуры веретена деления

3.2. Форма веретена

3.3. Образование веретена

3.4. Структура полюсов веретена

3.5. Молекулярный состав полюсов веретена 40 4. ФРАГМОПЛАСТ

4.1. Свойства фрагмопласта

4.2. Структура фрагмопласта

4.3. Молекулярный состав фрагмопласта

4.4. Происхождение фрагмопласта 47 Ш. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМЕ СБОРКИ ВЕРЕТЕНА В КЛЕТКАХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

1. Общий универсальный центр организации МТ (ЦОМТ)

2. Множественные специализированные ЦОМТ

3. Формирование новых систем МТ из предшествующих структур

IV. НЕЗАВИСИМАЯ ОТ ЦОМТ ОРГАНИЗАЦИЯ ВЕРЕТЕНА В КЛЕТКАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И СИСТЕМАХ IN VITRO.

1. Удаление (инактивация) центросомы экспериментальным путем

2. Дополнительные нецентросомные центры нуклеации МТ

3. Молекулярные основы ЦОМТ-независимой организации полюса веретена

V. СПОНТАННАЯ САМО-ОРГАНИЗАЦИЯ МТ В ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ ЭНДОСПЕРМА HAEMANTHUS

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм образования митотического веретена в клетках высших растений"

Отличительным свойством живых организмов является их способность к пролиферации, которая осуществляется путем митотического деления (митоза). Целью митоза является передача эквивалентного наследственного материала от материнской клетки дочерним. В эукариотических клетках эта функция осуществляется при помощи веретена деления специализированной структуры, состоящей из антипараллельных систем микротрубочек (МТ), у которых минус-концы располагаются в полюсе веретена, а плюс-концы обращены к хромосомам (Mitchison and Salmon, 2001). В результате, веретено имеет эллиптическую биполярную форму, и именно биполярность веретена обеспечивает эквивалентное распределение хромосом в дочерние клетки (Wittmann et al., 2001). Благодаря динамическим свойствам МТ и активности ассоциированных с ними белков, сестринские хромосомы перемещаются к полюсам, где происходит восстановление ядерной оболочки и формирование ядер дочерних клеток. Принцип организации веретена деления один и тот же для всех типов клеток, но форма веретена и особенно структура полюсов может быть различной у разных организмов. Обычно в полюсе веретена находится дискретная структура, сводящая или фокусирующая МТ в одну точку, и регулирзгющая число, поведение и распределение МТ в клетке. Это структура вьтолняет функции центра организации МТ (ЦОМТ), который в большинстве эукариотических клеток представлен центросомой (Pickett-Heaps, 1969; Brinkley, 1985; Vorobjev and Nadezhdina, 1987; Archer and Solomon, 1994; Tassin and Bomens, 1999). «1Слассическая» или типичная центросома состоит из центриолей, окруженных аморфным перицешриолярным материалом (ПЦМ) (Brinkley, 1985; Vorobjev and Nadezhdina, 1987). Однако даже ранние цитологические наблюдения обобщенные Вилсоном (Wilson, 1928) заказывали на то, что полюс веретена деления клеток вьющих растений не имеет четкой организации, хараетерной для клеток животных, и морфогенез веретена у растений протекает со значительными отличиями от аналогичных процессов наблюдаемых в клетках животных. Самое распространенное и общепринятое представление об организации митотического веретена в растительных клетках заключается в том, что веретено имеет бочковидную форму, его полюса расширены и не содержат центриолей. В целом же веретено формируется и функционирует так же, как и в клетках, где в полюсе веретена находится классическая центросома. Такие упрощенные представления, к сожалению, до сих пор можно встретить в научных публикациях. Это может быть связано с определенными стереотипами мышления и автоматическим перенесением информации, ползенной при исследовании закономерностей митоза в животных клетках на клетки растительного происхождения. Немаловажную роль в этом играет и тот факт, что клетки высших растений методически более трудный объект для исследования такого динамического процесса как митоз, так как их практически невозможно использовать для наблюдений in vivo (прижизненные наблюдения, микроинъекции и микрохирургические манипуляции) в связи с наличием целлюлозной клеточной стенки. Единственным исключением является ткань и клетки эндосперма покрытосемянных растений на ранних стадиях дифференцировки (Bajer and Mole-Bajer, 1972). Использование вьщеленных на агаровую подложку клеток эндосперма Haemanthus (Scadoxus) katherinae (Bajer, 1957, 1958, 1968; Inoue and Bajer, 1961) позволило не только получить обширные данные о митозе в растительньпс клетках (Vos et al., 1999), но и внесло значительный вклад в установление общих закономерностей деления эукариотических клеток (Nasmyth et al., 2000). Кроме структуры полюсов веретена, система МТ в клетках животных и высших растений имеет и другие принципиальные различия. В клетках животного происхождения, в интерфазе МТ образуют радиальную сеть, отходящую от центросомы, которая является доминирующим ЦОМТ. В цитоплазме также могут присутствовать свободные МТ, не ассоциированные с центросомой. В начале митоза интерфазная сеть разбираетгся и вместо нее формируется эллиптическое биполярное веретено, в полюсах которого находится центросома (Andersen, 1999 b). В клетках высших растений, в ходе клеточного цикла последовательно формируются четьфе системы МТ кортикальная или радиальная сеть МТ в интерфазе, препрофазное кольцо МТ (ППК) в конце Сз-периода и начале митоза, митотическое веретено и фрагмопласт в митозе (Goddard et al., 1994; Lambert and Lloyd, 1994). Эти структуры последовательно заменяют одна другую, и, как правило, новая система собирается во время разборки предшествующей системы, что значительно отличается от реорганизации МТ в ходе клеточного цикла у животных клеток. Также следует отметить, что ППК и фрагмопласт являются специфическими «растительными» структурами, и не имеют аналогов в клетках животного происхождения. Существует несколько гипотез, объясняющих происхождение и формирование систем МТ в ходе клеточного цикла у растений. Среди них вопрос о происхождении митотического веретена является наиболее спорным и интригующим (Baskin and Cande, 1990; Marc, 1997; Vaughn and Нафег, 1998; Franklin and Cande, 1999; Canaday et al., 2000). Ранние электронно-микроскопические исследования показали отсутствие в полюсах митотического веретена клеток высших растений центриолей (Pickett-Heaps, 1969). Как оказалось, в этих клетках также отсутствует органелла, которая была бы морфологически сходна с центросомой или составляющими ее компонентами (Baskin and Cande, 1990). МТ веретена сходятся в обширную, богатую внутриклеточными мембранными пузырьками "полярн5жэ" зону (Baskin and Cande, 1990). Кроме этого, некинетохорный транспорт (Bajer et al., 1987) перемещает в зону полюсов митохондрии, цистерны аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума, крахмальные включения и некие не идентифицированные гранулы. В области полюсов: также выявляются скопления пучков актиновых филаментов (Mole-Bajer et al., 1988). Вьщеление изолированных центросом из клеток животных (Bornens, 1992) дало возможность исследовать молекулярный состав центросомы (ЦОМТ) и получить коллекцию антител к многочисленным центросомальным белкам (Cande, 1991; Kuriyama, 1992; Kalt and Schliwa, 1993). Однако в связи с отсутствием в полюсах мргготического веретена растительных клеток каких-бы то ни было дискретных структур, аналогичный подход для анализа молекулярного состава полюсов оказался невозможным. Другими словами, митотическое веретено клеток высших растений не содержит морфологически выраженных структур, которые можно было бы вьщелить и использовать для молекулярно-биологического и иммунохимического анализа. Вместе с тем, было высказано предположение, что клетки высших растений могут содержать определенные центросомные белки, диффузно распределенные в полюсах митотического веретена, которые выполняют функцию ЦОМТ (Cande, 1990). Поскольку никаких подходов для вьщеления таких белков из полюсов веретена растительных клеток предложено не бьшо, основное направление исследований сосредоточилось на скриннинге антител к уже известным белкам центросомы животных клеток и установлении их кросс-реактивности с белками растительных клеток. Таким способом некоторые белки центросомы были идентифицированы в клетках высших растений (Chevrier et al., 1992; Liu et al., 1993; Hasezawa and Nagata, 1993; Schmit et al., 1994), но ни один из этих белков не бьш обнаружен в полюсе митотического веретена. В настоящее время, существует несколько гипотез о происхождении митотического веретена в клетках высших растений. 1) Долгое время доминировала гипотеза Мэзия (Mazia, 1987) о том, что за организацию всех систем МТ в растительных клетках отвечает единый универсальный ЦОМТ, представленный "диффузной центросомой" (Cande, 1990). 2) Сборка всех систем МТ высших растений, в том числе и веретена, регулируется несколькими специализированными ЦОМТ

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Смирнова, Елена Александровна

выводы

1. Полюса митотического веретена не являются функционально активными ЦОМТ. Эти функции в клетках меристемы корня выполняют ядро и хромосомы.

A. Ингибитор полимеризации МТ колхицин вызывает разборку МТ в клетках меристемы корня Triticum aestivum и переход клеток в К-митоз. В К-митотических клетках колхицин индуцирует формирование немикротрубочковых тубулиновых агрегатов. После удаления колхицина тубулиновые агрегаты разрушаются, и затем начинается полимеризация МТ. МТ восстанавливаются от ядра и хромосом, что ведет к формированию нормальных биполярных и многополюсных митотических веретен. Б. Синтетический аналог колхицина колцемид вызывает разборку МТ в клетках меристемы корня Allium сера и переход клеток в К-митоз. После удаления колцемида МТ в митотических клетках восстанавливаются от хромосом, что ведет к организации нормальных биполярных и многополюсных митотических веретен.

B. Ингибитор МТ и ЦОМТ хлоралгидрат подавляет рост МТ от поверхности ядра и формирование веретена в профазе в клетках меристемы корня Allium сера, что ведет к переходу клеток в К-митоз. В то же время, хлоралгидрат существенно не влияет на структуру уже сформированного митотического веретена.

Г. Пониженная температура индуцирует разборку МТ в клетках меристемы корня Triticum aestivum. После действия пониженной температуры МТ восстанавливаются в виде ЦКМТ, отрастающих от ядра или хромосом. Конвергирующие концы ЦКМТ, ассоциированные с ядром, содержат ацетилированный а-тубулин.

2. В клетках эндосперма Haemanthus система МТ состоит из элементарных структурных компонентов — ЦКМТ, которые при формировании митотического веретена функционально замещают центросому (ЦОМТ).

А. ЦКМТ имеют следующие свойства: 1) Функциональная полярность, выражающаяся в разном поведении конвергирующих и дивергирующих концов ЦКМТ. Конвергирующие концы ассоциируют латерально, а дивергирующие - конец в конец. 2) Тенденция к формированию конечных и стабильных МТ структур, таких как фрагмопласт. 3) Отсутствие метафазного типа МТ структур при трансформации прометафазных конфигураций в телофазные (фрагмопласт). 4) Способность к автономному перемещению в цитоплазме, путем роста (удлинения) плюс-конца и укорочения минус-конца (treadmilling) МТ.

Б. Одним из характерных признаков перехода из интерфазы в митоз является независимость хромосомного и МТ циклов, которые обычно синхронизируются в прометафазе. Профазное веретено имеет разную форму и конфигурации, а метафазное веретено всегда биполярно. Разрушение ядерной оболочки запускает коррекционные механизмы организации веретена. Ассоциированные с ядром ЦКМТ участвуют в организации профазного веретена и используются как заготовки для будущих К-фибрилл, которые являются составным компонентом митотического веретена.

3. В полюсах митотического веретена клеток высших растений отсутствуют белковые комплексы, которые могли бы выполнять функции диффузной центросомы. Белки центросомы (ЦОМТ) животных клеток присутствуют в клетках эндосперма Haemanthus katherinae. Фосфорилированные белки митотических ЦОМТ, распознаваемые антителами МРМ-2 выявляются в составе митотических МТ. у-тубулин присутствует в интерфазных и митотических МТ. МРМ-2 и у-тубулин не выявляются в полюсах митотического веретена.

4. В полюсах митотического веретена клеток высших растений присутствуют белки, которые участвуют в ЦОМТ-независимой организации митотического веретена (NuMa и КСВР).

А. Белок ядерного матрикса и митотического веретена NuMa в клетках эндосперма Haemanthus и меристемы корня Allium сера выявляется в полюсах митотического веретена. NuMa также присутствует в составе фрагмопласта, и отсутствует в ядре и в ППК. Такое распределение NuMa может изменяться при действии агентов, вызывающих деполимеризацию, стабилизацию и дезорганизацию МТ. Деполимеризация МТ оризалином приводит к необратимой агрегации NuMa в цитоплазматические конгломераты. Стабилизация МТ таксолом вызывает появление NuMa в ППК и разобщение кол окал изации NuMa и МТ в составе фрагмопласта. Разобщение колокализации NuMa и МТ в составе фрагмопласта также происходит при действии хлоралгидрата. В индуцированных многополюсных митотических веретенах, NuMa выявляется не во всех полюсах. Так как белок всегда присутствует в полюсе биполярного веретена контрольных клеток, можно заключить, что NuMa участвует в установлении и поддержании биполярности веретена. Б. В клетках эндосперма Haemanthus минус конец-ориентированный кинезиноподобный белок КСВР принимает участие в реорганизации полюсов митотического веретена. Во время метафазы КСВР ассоциирован с МТ веретена, а во время анафазы выявляется в его полюсах. Перераспределение КСВР в полюса коррелирует с трансформацией диффузных полюсов веретена в фокусированные. Следовательно, КСВР стягивает К-фибриллы в фокусированный полюс, что обеспечивает группирование хромосом в ядрах дочерних клеток

5. На основании имеющихся данных, нами была предложена модель независимой от ЦОМТ организации митотического веретена в клетках высших растений. МТ в клетках высших растений собираются в виде «заготовок» - ЦКМТ. ЦКМТ находятся в свободном состоянии в цитоплазме или ассоциированы с ядром. При вступлении в митоз, ЦКМТ отделяются от поверхности ядра. Они перемещаются в околоядерную цитоплазму, где начинаются циклические изменения МТ — само-реорганизация. В результате, формируются разнообразные веретеновидные структуры. Таким образом, ЦКМТ используются как строительные блоки для организации веретена. Координация этого процесса осуществляется хромосомами, которые после разрушения ядерной оболочки "вставляют" себя в цикл самоорганизации МТ путем ассоциации с плюс-концами ЦКМТ. Хромосомы инициируют изменение динамического состояния МТ и используют их механические возможности для расхождения к полюсам.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Центры конвергенции МТ (ЦКМТ) являются универсальными структурными образованиями, которые присутствуют в разных типах клеток высших растений. Начальные стадии их формирования включают в себя латеральное взаимодействие контактирующих МТ, после чего следует сборка-разборка концов МТ. Вместе с тем, нельзя исключить и спонтанную нуклеацию МТ, за которой следует элонгация МТ сегментов. ЦКМТ особенно отчетливо выявляются на таких стадиях как переход из телофазы в интерфазу и из интерфазы в митоз, и индуцируются изменением температурного режима. Кроме этого, сборка ЦКМТ требует определенной пространственной организации сети МТ, о чем свидетельствует характер формирования ЦКМТ в безъядерных клеточных фрагментах эндосперма. К-фибриллы веретена могут рассматриваться как ЦКМТ с избыточным количеством боковых или придаточных МТ, в результате чего К-фибрилла получила название «еловое дерево» (Microtubular Fir Tree - MTFT) (Bajer and Mole-Bajer, 1986). Мы выделяем четыре основных свойства ЦКМТ. Первое свойство — это функциональная полярность, выражающаяся в разном поведении конвергирующих и дивергирующих концов ЦКМТ. Конвергирующие концы ассоциируют латерально, а дивергирующие — конец в конец. Вторым свойством ЦКМТ является тенденция к формированию конечных стабильных МТ структур, таких как замкнутые кольца МТ или фрагмопласты (Bajer and Mole-Bajer, 1986). Третьим признаком является отсутствие метафазного типа МТ структур при трансформации прометафазных конфигураций в телофазные (фрагмопласт). Четвертым свойством является их автономное поведение, которое выражается в способности ЦКМТ к перемещению. ЦКМТ могут перемещаться как в сторону плюс, так и минус конца. Перемещение вперед дивергирующих концов ЦКМТ происходит в телофазе (возможный механизм-treadmilling), а перемещение вперед конвергирующих концов — в профазе (возможный механизм - отделение от ядерной поверхности и неупорядоченное движение). Мы предполагаем, что все эти свойства ЦКМТ являются основополагающими факторами, регулирующими формирование и реорганизацию веретена.

На основании проведенных исследований и данных литературы, мы предлагаем следующую модель организации митотического веретена. МТ в ацентросомальных клетках высших растений собираются в виде "заготовок" - ЦКМТ. Обычно ЦКМТ находятся в свободном состоянии в цитоплазме (как в большинстве клеток с целлюлозной клеточной стенкой). В клетках с радиальной системой МТ, ЦКМТ конвергирующими концами ассоциированы с ядром. При поступлении сигналов (здесь возможно участие RAN белков) из ядра, ЦКМТ отделяются от поверхности ядра (возможно, при участии катанина). Как только такое отсоединение произошло, начинаются циклические изменения МТ — их само-реорганизация (за счет основных свойств ЦКМТ, указанных выше). В результате, формируются биполярные веретеновидные структуры (при участии моторных белков, NuMa и т.д.). Таким образом, ЦКМТ используются как строительные блоки для организации веретена. По существу, они являются предшественниками К-фибрилл. Координация этого процесса осуществляется хромосомами, которые в определенный момент "вставляют себя" в цикл МТ путем ассоциации с плюс-концами ЦКМТ. Если этого не происходит (из-за десинхронизации циклов), плюс-концы МТ ассоциируют друг с другом конец в конец, и формируется фрагмопласт. Хромосомы, захватывая плюс-концы МТ, препятствуют взаимодействию плюс-концов МТ и их стабилизации в составе фрагмопласта. Хромосомы инициируют изменение динамического состояния МТ и рспользуют их механические возможности для расхождения к полюсам. При этом присущая МТ структурам тенденция к формированию биполярных структур, реализуется для точной сегрегации хромосом.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Смирнова, Елена Александровна, Москва

1. Быстревская В.Б., Онищенко Г.Е. и Ченцов Ю.С. 1981. Ультраструктура митотического аппарата в метафазных клетках при действии 2-меркаптоэтанола на культуру ткани СПЭВ. Цитология .23:745-751.

2. Иванов В.Б. 1987. Пролиферация клеток в растениях. Итоги науки и техники. Серия «Цитология». Москва, ВИНИТИ. Т.5 219с.

3. Поддубная-Арнольди, В.А. 1976. Цитоэмбриология покрытосемянных растений. Основы и перспективы. Издательство «Наука», Москва. 508с.

4. Петрова Т.Ф. 1977. Цитоэмбриология лилейных. Подсемейство Liliodeae. Издательство «Наука», Москва. 214с.

5. Ahmad F.A., Echeverri СЛ., Valee R.B. and Baas P.W. 1998. Cytoplasmic dynein and dynactin are required for the transport of microtubules into the axon. J. Cell Biol. 140:391-401.

6. Amos L.A. and Hirose K. 1997. The structure of microtubule-motor complex. Curr. Opin. Cell Biol. 9:4-11.

7. Andersen S. 1999a. Balanced regulation of microtubule dynamics during the cell cycle: a contemporary view. BioEssays 21:53-60.

8. Andersen S. 1999b. Molecular characteristics of centrosome. Int. Rev. Cytol. 187:51-109.

9. Andreu J.M.and TimashefifS.N. 1982. Tubulin bound to colchicine forms polymers different from microtubules. Proc Natl Acad Sci USA 79:6753-6756.

10. Andreu J.M., Wagenknecht T. and Timasheff S.N. 1983. Polymerization of the tubulin-colchicine complex: relation to microtubule assembly. Biochemistry 22:1556-1566.

11. Apostolakos P., Galatis В., Katsaros C. and Schnepf E. 1990. Tubulin conformation in microtubule-free cells of Vigna sinensis. An immunofluorescent and electron microscopy study. Protoplasma 154:132-143.

12. Archer J. and Solomon F. 1994. Deconstructing the microtubule-organizing center. Cell 76:.589-591.

13. Asada Т., Sonobe S. and Shibaoka H. 1991. Microtubule translocation in the cytokinetic apparatus of cultured tobacco cells. Nature 350:238-241.

14. Asada T. and Shibaoka H. 1994. Isolation of polypeptides with microtubule-translocating activity from phragmoplasts of tobacco BY-2 cells. J. Cell Sci. 107:2249-2257.

15. Asada T., Kuriyama R. and Shibaoka H. 1997. TKRP125, a kinesin-related protein involved in the centrosome-independent organization of the cytokinetic apparatus in tobacco BY-2 cells. J. Cell Scl 110:179-189.

16. Asada T. and Collings D. 1997. Molecular motors in higher plants. Trends Plant Sci. 2:29-37.

17. Astrom H. 1992. Acetylated a-tubulin in the pollen tube microtubules. Cell Biol Int Rep. 16:871-881.

18. Ausubel F.M., Brent R-, Kungston R.E., Moore D.D., Seidman J.D., Smith J.A., and Struhl K. 1992. Short Protocols in Molecular Biology. A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. Wiley and Sons, N-Y.

19. Azimzadeh J., Traas J. and Pastuglia M. 2001. Molecular aspects of microtubule dynamics in plants. Curr. Opin. Cell Biol. 4:513-519.

20. Baas P.W. and Ahmad F.J. 1992. The plus ends of stable microtubules are the exclusive nucleating structures for microtubules in the axon. J. Cell Biol. 116:1231-1241.

21. Baas P.W. and Brown A. 1997. Slow axonal transport: the polymer transport model. Trends Cell Biol. 7:380-383.

22. Bajer A.S. 1957. Cine-micrographic studies on mitosis in endosperm. HI. The origin of the mitotic spindle. Exp. Cell Res. 13:493-502.

23. Bajer A.S. 1958. Cine-micrographic studies on mitosis in endosperm. IV. The mitotic contraction stage. Exp. Cell Res. 14:245-256.

24. Bajer A.S. 1968. Behavior and fine structure of spindle fibers during mitosis in endosperm. Chromosoma. 25:249-281.

25. Bajer A.S. 1982. Functional autonomy of monopolar spindle and its evidence for oscilatory movement in mitosis. J. Cell Biol. 93:33-48.

26. Bajer A.S. 1987. Substructure of the kinetochore and reorganization of kinetochore microtubules during early prometaphase in Haemanthus endosperm. Eur. J. Cell Biol. 43:2334.

27. Bajer A.S. 1990. The elusive organization of the spindle and the kinetochore fiber: a conceptual retrospect. In "Advances in cell biology" (K.R.Miller, Ed.) JAI Press, Greenwich. V.3:65-93.

28. Bajer A. and Ostergren G. 1961. Centromere-like behaviour of non-centromericbodies. I. Neo-centric activity in chromosome arms at mitosis. Hereditas 47:563-98.

29. Bajer A.S. and Mole-Bajer J. 1969. Formation of spindle fibers, kinetochore orientation and behavior of the nuclear envelope during mitosis in endosperm. Chromosoma 27:448-484.

30. Bajer A.S. and Mole-Bajer J. 1972. Spindle dynamics and chromosome movements. Int. Rev Cytol. Suppl. 1. Acad. Press, NY and London. 271 p.

31. Bajer A.S-, Mole-Bajer, J. and Lambert A-M. 1975. Lateral interaction of microtubules and chromosome movement. In "Microtubules and Microtubule Inhibitors" (Borgers M. and DeBrabander M., Eds). Amsterdam, North Holland Publ. Comp., Elsevier. 393-423.

32. Bajer A.S. and Mole-Bajer J. 1982. Asters, poles and transport properties within spindle-like microtubule arrays. Cold Spring Harbor Symp. 46:263-283.

33. Bajer A.S. and Mole-Bajer J. 1986. Reorganization of microtubules in endosperm cells and cell fragments of the higher plant Haemanthus in vivo. J. Cell BioL 102:263-281.

34. Bajer A.S., Vantard M. and Mole-Bajer J. 1987. Multiple mitotic transports expressed by chromosome and particle movements. Forschritte der Zool. 34:171-186.

35. Bakhuizen R-, van Spronsen P.C., Sluiman-den Hertog F.A.J., VenveHoo C.J. and Goosen-de Roo L. 1985. Nuclear envelope radiating microtubules in plant cells during interphase mitosis transition. Protoplasma 128:43-51.

36. Balczon R. 1996. The centrosome in animal cells and its functional homologs in plant and yeast cells. Int. Rev. Cytol. 169:25-82.

37. BaluShka F. and Barlow P.W. 1993. The role of the microtubular cytoskeleton in determining nuclear chromatin structure and passage of maize root cells through the cell cycle. Eur. J. Cell Biol. 61:160-167.

38. Balushka F„ Barlow P.W., Parker J.S. and Volkmann D. 1996a. Symmetric reorganization of radiating microtubules around pre- and post-mitotic nuclei of dividing cells organized within intact root meristem. J. Plant PhysioL 149:119-128.

39. BaluShka F., Volkmann D. and BaHow P.W. 1996b. Nuclear components with microtubule-organizing properties in multicellular eukaryotes: functional and evolutionary considerations. Int. Rev. Cytol. 175:91-135.

40. Balushka F., Barlow P.W., Lichtscheidl I.K. and Volkmann D. 1998. The plant cell body: a cytoskeletal tool for cellular development and morphogenesis. Protoplasma 202:1-10.

41. Banas M., Tiriapur U.K., Charzynska M. and Cresti M. 1996. Some events of mitosis and cytokinesis in the generative cell of Ornithogalum virens L. Planta 199:202-208.

42. Barroso C., Chan J., Allan VM Doonan J., Hussey P. and Lloyd C. 2000. Two kinesin-related proteins associated with the cold-stable cytoskeleton of carrot cells: characterization of a novel kinesin, DcKRP 120-2. Plant J. 24:859-868.

43. Bartels P.G. and Hilton J.L. 1973. Comparison of trifluralin, oryzalin, pronamide, propham, and colchicine treatments on microtubules. Pest. Biochem. Physiol. 3:462-472.

44. Barton N.R. and Goldstein L.S.B, 1996. Going mobile: microtubule motors and chromosome segregation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1735-1742.

45. BaskinT.L 2001. On the alignment of cellulose microfibrils by cortical microtubules: A review and a model. Protoplasma 215:150-171.

46. Baskin T.L and Cande W.Z. 1990. The structure and function of the mitotic spindle in flowering plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41:277-315.

47. Belmont L.D., Hyman A.A., Sawin K.E. and Mitchison T.J. 1990. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell 62:579-589.

48. Bennett M.D. and Smith J.B. 1979. Colchicine-induced paracrystals in the tapetum of wheat anthers. J Cell Sci. 38:23-32.

49. Bench K.G. and Malawista S.E. 1969. Microtubular crystals in mammalian cells. J Cell Biol. 40:95-107.

50. BinarovA P., House B., Dolezel J. and Draber P. 1998. Association of y-tubulin with kinetochore/cenromeric region of plant chromosomes. Plant J. 14:751-757.

51. Binarova P., Cenkovd V., Hause B., Kubatova E., Lys^k 1VL, Dolezel J., Borge L. and Draber P. 2000. Nuclear y-tubulin during acentriolar plant mitosis. Plant Cell 12:433442.

52. Blackman L.M^ Harper J.D.L and Overall R.L. 1999. Localization of a centrin-like protein to higher plant plasmodesmata. Eur. J. Cell Biol. 78:297-304.

53. Bonaccorsi S., Giansanti M.G. and Gatti M. 1998. Spindle self-organization during male meiosis in asterless mutants of Drosophila melanogaster. J. Cell Biol. 142:751 -761.

54. Bornens M. 1992. Structure and function of isolated centrosomes. In "The Centrosome" (V.I.Kalnins, Ed.), Acad. Press, Inc. 1-43.

55. Bowser S.S., McGee-Russell S.M. and Rieder C.L. 1984. Multiple fission in Allogromia sp., strain NF (Foraminiferida): release, dispersal, and ultrastructure of offspring. J Protozool. 31:272-275.

56. Bowser J. and Reddy A.S.N. 1997. Localization of a kinesin-like calmodulin-binding protein in dividing cells of Arabidopsis and tobacco. Plant J. 12:1429-1437.

57. BrinkleyB.R. 1985. Microtubule organizing centers. Ann. Rev. Cell Biol. 1:145172

58. Brown R.C. and Lemmon B.E. 1992. Pollen development in orchids 4. Cytoskeleton and ultrastructure of the unequal pollen mitosis in Phalaenopsis. Protoplasma 167:183-192.

59. Brown R.C., Lemmon B.E. and Olsen OA. 1994. Endosperm development in barley: microtubule involvement in the morphogenetic pathway. Plant Cell 6:1241-1252.

60. Brown R.C., Lemmon B.E- and Olsen OA. 1996. Development of the endosperm in rice (Oryza sativa L.): cellularization. J. Plant Res. 109:301 -313.

61. Brown R.C., Lemmon B.E., Stone B.A. and Olsen O.A. 1997. Cell wall (l-»3)-and (1—>3, l->4)-p-glucans during early grain development in rice (Oryza sativa L.). Planta 202:414-426.

62. Brown R.C. and Lemmon B.E. 1997. Transition from mitotic apparatus to cytokinetic apparatus in pollen mitosis of the slipper orchid. Protoplasma 198:43-52.

63. Brown R.C. and Lemmon B.E. 1998. Division polarity and plasticity of the meiosis I spindle in Cypripedium californicum (Orchidaceae). Protoplasma 203:168-174.

64. Brunet S., Polanski Z., Verlhac M-H„ Kubiak J.Z. and Maro B. 1998. Bipolar meiotic spindle formation without chromatin. Curr. Biol. 8:1231-1234.

65. Bulinski J.C. and Gundersen G.G. 1991. Stabilization and posttranslational modifications of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays 13:285-293.

66. Burk D.H. and Ye Z-H. 2002. Alteration of oriented deposition of cellulose microfibrils by mutation of a katanin-like microtubule-severing protein. Plant Cell 14:21452160.

67. Calarco-Gillam P.D., Siebert M.C-, Hubble R., Mitchison T. and Kirschner M.1983. Centrosome development in early mouse embryos as defined by an auto-antibody against pericentriolar material. Cell 35:621-629.

68. Canaday J., Stoppin-Mellet V., Muterer J., Lambert A-M. and Schmit A-C. 2000. Higher plant cells: gamma-tubulin and microtubule nucleation in the absence of centrosomes. Micr. Res. Techn. 49:487-495.

69. CandeW.Z. 1990. Centrosomes: composition and reproduction. Curr. Opin. Cell Biol. 2:301-305.

70. Carazo-Salas R.E., Gruss O.J., Mattaj LW. and Karsenti E. 2001. Ran-GTP coordinates regulation of microtubule nucleation and dynamics during mitotic-spindle assembly. Nature Cell Biol. 3:228-234.

71. Cassimeris L., Inoue S. and Salmon E.D. 1988. Microtubule dynamics in the chromosomal spindle fiber: analysis by fluorescence and high-resolution polarization microscopy. Cell Motil. Cytoskel. 10:185-196.

72. Centonze V.E. and Borisy G.G. 1990. Nucleation of microtubules from mitotic centrosomes is modulated by a phosphorylated epitope. J. Cell Sci. 95:405-411.

73. Chan A. and Cande W.Z. 1998. Maize meiotic spindles assemble around chromatin and do not require paired chromosomes. J. Cell Sci. 111:3507-3515.

74. Chapin S.J. and Bulinski J.C. 1994. Cellular microtubules heterogeneous in their content of microtubule-associated protein 4 (MAP4). Cell Motil. Cytoskel. 27:133-149.

75. Chen C„ Marcus A., Li W., Hu W., Calzada J-P., Grossniklaus U., Cyr R.J. and Ma H. 2002. The Arabidopsis ATK1 gene is required for spindle morphogenesis in male meiosis. Development 129:2401-2409.

76. Clayton L., Black C.M. and Lloyd C.W. 1985. Microtubule nucleating sites in higher plant cells identified by auto-antibody against pericentriolar material. J. Cell BioL 101:319-324.

77. Cleary A.L. and Hardham A.R. 1988. Depolymerization of microtubule arrays in root tip cells by oryzalin, and their recovery by modified nucleation patterns. Can. J. Bot. 66:2353-2366

78. Cleary A.L., Gunning B.E.S„ Wasteneys G.O. and Hepler P.K. 1992. Microtubule and F-actin dynamics at the division site in living Tradescantia stamen hairs. J. Cell Sci. 103:977-988,

79. Compton D.A. 1998. Focusing on spindle pole. J. Cell Sci. 111:1477-1481.

80. Compton D.A^ Szilak L and Cleveland D.W. 1992. Primary structure of NuMa, an intracellular protein that defines a novel pathway for segregation of proteins at mitosis. J. Cell Biol. 116:1395-1408.

81. Condeelis J. 1993. Life at the leading edge: the formation of cell protrusions. Annu. Rev. Cell Biol. 9:411-444.

82. Cosgrove D.J. 1998. Cell wall loosening by expansins. Plant Physiol. 118:333-339.

83. Cyr RJ. 1994. Microtubules in plant morphogenesis: role of the cortical arrays. Annu. Rev. Cell Biol. 10:153-180.

84. Cyr R.J. and Palevitz B.A. 1995. Organization of cortical microtubules in plants. Curr. Opin. Cell Biol. 7:65-71.

85. Dales S., Hsu K.C. and Nagayama A. 1973. The fine structure and immunological labeling of the achromatic mitotic apparatus after disruption of cell membrane. J Cell Biol. 59:643-660.

86. DassoM. 2001. Running on Ran: nuclear transport and the mitotic spindle. Cell 104:321-324.

87. Davis F.M., Tsao T.Y., Fowler S.K. and Rao P.N. 1983. Monoclonal antibodies to mitotic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2926-2930.

88. Davis F.M. and Rao P.N. 1987. Antibodies to mitosis-specific phosphoproteins. In "Molecular Regulation of Nuclear Events in Mitosis and Meiosis" (R.A. Schlegel, M.S. Halleck and P.N. Rao, Eds.), Academic Press, Inc. 259-293.

89. Dawe K.R, Reed L.M., Yu H-G., Muszynski M.G. and Hiatt E.N. 1999. A maize homolog of mammalian CENPC is a constitutive component of the inner kinetochore. Plant Cell 11:1227-1238.

90. De Brabander M., Geuens G., Nuydens R~, Willebrords R. and De Mey J. 1981. Taxol induces the assembly of free microtubules in living cells and blocks the organizing capacity of the centrosomes and kinetochores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5608-5612.

91. De Mey J., Lambert A.M., Bajer A.S., Moeremans M. and De Brabander M. 1982. Visualization of microtubules in interphase and mitotic plant cells of Haemanthus endosperm with immuno-gold staining method. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1898-1902.

92. Del Casino C., Li Y.Q., MoscateUi A., Scali M., Tiezzi A. and Cresti M. 1993. Distribution of microtubules during the growth of tobacco pollen tubes. Biol Cell. 79:125132.

93. Del Casino C., Bohdanowitcz J., Lewandowska B. and Cresti M. 1999. The organization of microtubules during generative-cell division in Convallaria majalis. Protoplasma 207:147-153.

94. Del Vechio A.J., Harper J.D.I., Vaughn K.C., Baron A.T., Salisbury J.L. and Overall R.L. 1997. Centrin homologues in higher plants are prominently associated with the developing cell plate. Protoplasma 196:224-234.

95. Deysson G. 1975. Microtubules and antimitotic substances. In "Microtubules and Microtubule Inhibitors" (Borgers M. and DeBrabander M., Eds). Amsterdam, North Holland Publ. Comp., Elsevier. 427-451.

96. Dionne M.A., Howard L. and Compton D.A. 1999. NuMa is a component of an insoluble matrix at mitotic spindle poles. Cell Motil Cytosk. 42:189-203.

97. Dixit R, and Cyr RJ. 2002. Spatio-temporal relationship between nuclear-envelope breakdown and preprophase band disappearance in cultured tobacco cells. Protoplasma 219:116-121.

98. Downing K.H. and Nogales E. 1998. Tubulin and microtubule structure. Curr. Opin. Cell Biol. 10:16-22.

99. Doxey D. and Rhodes A. 1951. The effect of the gamma-isomer of benzene hexachloride on plant growth and on mitosis. Ann. Bot. 15:47-52.

100. Duckett C.M. and Lloyd C.W. 1994. Gibberellic acid-induced microtubule reorientation in dwarf peas is accompanied by rapid modification of an a-tubulin isotype. Plant J. 5:363-372.

101. Dustin P. 1978. Microtubules. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York.452p.

102. Earnshaw W.C. 1994. Structure and molecular biology of the kinetochore. In "Microtubules" (J.S. Hyams and C.W. Lloyd, Eds.), Wiley-Liss, New York. 13:393-412.

103. Echeverri C.J., Paschal BJVf., Vaughan K.T. and Vallee R.B 1996 Molecular characterization of the 50-kD subunit of dynactin reveals function for the complex in chromosome alignment and spindle organization during mitosis. J. Cell Biol. 132:617-633.

104. Edson K., Weisshaar B. and Matus A. 1993. Actin depolymerization induces process formation on MAP2-transfected non-neuronal cells. Development 117:689-700.

105. Eigsti O.J. and Dustin P. 1955. Colchicine in agriculture, medicine, biology and chemistry. Iowa State Coll. Press, Aimes, Iowa. 470p.

106. Eleftheriou E.P. 1985. Abundance of microtubules in preprophase bands of some Triticum species. Planta 163:175-182.

107. Emons A.M.C. and Mulder B.M. 1998. The making of the architecture of the plant cell wall: How cells exploit geometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7215-7219.

108. Endow S.A., Chandra R., Komma D.J., Yamamoto A.H. and Salmon E.D. 1994. Mutants of the Drosophila ncd microtubule motor protein cause centrosomal and spindle pole defects in mitosis. J. Cell Sci. 107:859-867.

109. Endow S.A. and Komma D.J. 1996. Centrosome and spindle function of the Drosophila Ncd microtubule motor visualized in live embryos using Ncd-GFP fusion protein. J. Cell Sci. 109:2429-2442.

110. Endow S.A. and Komma D.J. 1998. Assembly and dynamics of an anastral: astral spindle: the meiosis II spindle of Drosophila oocytes. J. Cell Sci. 111:2487-2495.

111. Engle D.E., Doonan J. 11, and Morris N.R. 1988. Cell-cycle modulation of MPM-2 specific spindle pole body phosphorylation in Aspergillus nidulans. Cell Motil. Cytoskel. 10:432-437.

112. EsauK. 1975. Anatomy of seed plants. New York: Jonh Wiley and Sons. 550p.

113. Esponda P., Fonzo S. and TafTarel M. 1982. Presence of macrotubules and their induction by colchicine in grasshopper spermatids. Cell Biol Intl Rep. 6:837-842.

114. Euteneuer U., Jackson W.T. and Mcintosh J.R. 1982. Polarity of spindle microtubules vciHaemanthus endosperm. J. Cell Biol. 94:644-653.

115. Falconer M. and Seagull R. 1987. Amiprophosmethyl (APM:): a rapid, reversible anti-microtubule agent for plant cell cultures. Protoplasma 136:118-124.

116. Falconer MJVL, Donaldson G. and Seagull R.W. 1988. MTOCs in higher plants: an immunofluorescent study of microtubule assembly sites following depolymerization by APM. Protoplasma 144:46-55.

117. Field C., Li R. and Oegema K 1999. Cytokinesis in eukaryotes: a mechanistic comparison. Curr. Opin. Cell Biol. 11:68-80.

118. Flanders D.J., Rawlins D.J., Shaw P.J. and Lloyd C.W. 1990. Nucleus-associated microtubules help determine the division plane of plant epidermal cells: avoidance of four-way junctions and the role of cell geometry. J. Cell Biol. 110:1111-1122.

119. Fosket D.E. and Morejohn L.C. 1992. Structural and functional organization of tubulin. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:201-240.

120. Fowke L.C. 1993. Microtubules in dividing root cells of the conifer Pirtus radiata and the cycad Zamiafurfuracea. Cell Biol. Int. 17:143-151.

121. Fowke L.C., Attree S.M., Wang H. and Dunstan D.I. 1990. Microtubule organization and cell division in embryogenic protoplast cultures of white spruce. Protoplasma 158:86-94.

122. Franklin A.E. and Cande W.Z. 1999. Nuclear organization and chromosome segregation. Plant Cell 11:523-534.

123. Fuge H. and Falke D. 1991. Morphological aspects of spindle fibers mMesostomcr. "microtubular fir-tree" structures and microtubule association with kinetochores and chromatin. Protoplasma 160.39-48.

124. Gaglio T., Saredi A. and Compton DA. 1995. NuMa is required for the organization of microtubules into aster-like mitotic arrays. J. Cell Biol. 131:693-708.

125. Gaglio T., Saredi A~, Bingham J.B., Hasbani MJ., Gill S.R., Schroer T.A. and Compton D.A. 1996. Opposing motor activities are required for the organization of the mammalian mitotic spindle pole. J. Cell BioL 135:399-414.

126. Gaglio T., Dionne M.A. and Compton D.A. 1997. Mitotic spindle poles are organized by structural and motor proteins in addition to centrosomes. J. Cell Biol. 138:1055-1066.

127. Galatis B. and Apostolakos P. 1991. Patterns of microtubule reappearance in root cells of Vigna sinensis recovering from a colchicine treatment. Protoplasma 160:131-143.

128. Gilmer S., Clay P., MacRae T.H. and Fowke L.C. 1999a. Acetylated tubulin is found in all microtubule arrays of two species of pine. Protoplasma 207:174-185.

129. Gilmer S„ Clay P., MacRae T.H. and Fowke L.C. 1999b. Tyrosinated, but not detyrosinated, a-tubulin is present in root tip cells. Protoplasma 210:92-98.

130. Giménez-Abián M.I., Giménez-Martín G., Navarrete M.II. and De la Torre C. 1997. Microtubular structures developed in response to a carbamate herbicide in plant mitosis. Protoplasma 200:65-70.

131. Goddard RH., Wick S.M., Silflow C.D. and Snustad P.D. 1994 Microtubule components of the plant cell cytoskeleton. Plant. Physiol. 104:1-6.

132. Gordon M.B., Howard L. and Compton D.A. 2001. Chromosome movement in mitosis requires microtubule anchorage at the spindle poles. J. Cell Biol. 152:425-434.

133. Granger C.L. and Cyr RJ. 2000. Microtubule reorganization in tobacco BY-2 cells stably expressing GFP-MBD. Planta 210:502-509.

134. Gu X. and Verraa D.P.S. 1996. Phragmoplastin, a dynamin-like protein associated with cell plate formation in plants. EMBO J. 15:695-704.

135. Gu X. and Verma D.P.S. 1997. Dynamics of phragmoplastin in living cells during cell plate formation and uncoupling of cell elongation from the plane of cell division. Plant Cell 9:157-169.

136. Gueth-Hallonet C., Antony C., Aghion J., Santa-Maria A., Lajoie-Mazenc I., Wright M. and Maro B. 1993. y-Tubulin is present in acentriolar MTOCs during early mouse development. J. Cell Sci. 105:157-166.

137. Gunning B.E.S. 1980. Spatial and temporal regulation of nucleating sites for arrays of cortical microtubules in root tip cells of the water fern Azolla pinnata. Eur J Cell Biol. 3:53-65.

138. Gunning B.E.S., Hardham A.R. and Hughes J.E. 1978. Evidence of initiation of microtubules in discrete regions of the cell cortex in Azolla root-tip cells, and a hypothesis on the development of cortical arrays of microtubules. Planta 143:161-179.

139. Gunning B.E.S. and Hardham A.R. 1982. Microtubules. Ann. Rev. Plant Physiol. 33:651-698.

140. Guskin F., Cantor C.R. and Shelanski M.L. 1974. Turbidimetric studies of the in vitro assembly and disassembly of porcine neurotubules. J. Mol. Biol. 89:737-758.

141. Hardham A.R. and Gunning B.E.S. 1978. Structure of cortical microtubule arrays in plant cells. J. Cell Biol. 77:14-34.

142. Hardham A.R. and Gunning B.E.S. 1979. Interpolation of microtubules into cortical arrays during cell elongation and differentiation in roots ofAzolla pinnata. J. Cell Sci. 37:411-442.

143. Haren L. and Merdes A. 2002. Direct binding of NuMa to tubulin is mediated by a novel sequence motif in the tail domain that bundles and stabilizes microtubules. J. Cell Sci. 115:1815-1824.

144. Harper J.D.L, Mitchison JJVL., Williamson R.E. and John P.C.L. 1989. Does the autoimmune serum 5051 specifically recognize microtubule organizing centers in plant cells? Cell Biol. Int. Rep. 13:471-483.

145. Harper J.D.L, Rao P.N. and John P.C.L. 1990. The mitosis-specific monoclonal antibody MPM-2 recognizes phosphoproteins associated with the nuclear envelope in Chlamidomonas reinhardtii cells. Eur. J. Cell Biol. 51:272-278.

146. Harper J.D.L, Fowke L.C., Gilmer S., Overall R.L. and Marc J. 2000. A centrin homologue is localized across the developing cell plate in gymnosperms and angiosperms. Protoplasma 211:207-216.

147. Hetzer iM., Gruss O.J. and Mattaj LW. 2002. The Ran GTPase as a market of chromosome position in spindle formation and nuclear envelope assembly. Nature Cell Biol. 4:177-184.

148. Hillman G. and Ruthman A. 1982. Effect of mitotic inhibitors on the ultrastructure of root meristem cells. Planta 155:124-132.

149. Hirokawa N. 1994. Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 6:74-81.

150. Hirokawa N. 1998. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science 279:519-526.

151. Hirokawa N., Terada S., Funakoshi T. and Takeda S. 1997. Slow axonal transport: the subunit transport model. Trends Cell Biol. 7:384-388.

152. Hirokawa N., Noda Y. and Okada Y. 1998. Kinesin and dynein superfamily proteins in organelle transport and cell division. Curr. Opin. Cell Biol. 10:60-73.

153. HoIIeran E.A., Karki S. and Holzbaur E.L.F 1998. The role of the dynactin complex in intracellular motility. Int. Rev. Cytol. 182:69-109.

154. Hsu H-L. and Yeh N-H. 1996. Dynamic changes of NuMa during the cell cycle and possible appearance of a truncated form of NuMa during apoptosis. J. Cell Sci. 109:277-288.

155. Huang R.F. and Lloyd C.W. 1999. Gibberellic acid stabilizes microtubules in maize suspension cells to cold and stimulates acetylation of a-tubulin. FEBS Let. 443:317-320.

156. Huitorel P. and Kirschner M.W. 1988. The polarity and stability of microtubule capture by the kinetochore. J. Cell Biol. 106:151-159.

157. Hush JJVL, Wadsworht P., CaUaham D.A. and Hepler P.K. 1994. Quantification of microtubule dynamics in living plant cells using fluorescence redistribution after photobleaching. J. Cell Sci. 107:775-784.

158. Hussey P.J., Snustad P.D. and Silflow C.D. 1991. Tubulin gene expression in higher plants. In 'The Cytoskeletal Basis of Plant Growth and Form". (C.W.Lloyd, Ed.), Acad. Press, London. 15-27.

159. Hussey P.J. and Hawkins T.J. 2001. Plant microtubule-associated proteins: the HEAT is off in temperature-sensitive morl. Trends Plant Sci. 6:389-392.

160. Jackson W.T. 1969. Regulation of mitosis II. Interaction of isopropyl N-phenyl-carbamate and melatonin. J. Cell Sci. 5:745-755.

161. Jiang CJ. and Sonobe S 1994. Identification and preliminary characterization of a 65-kDa higher-plant microtubule-associated protein. J. Cell Sci. 105:891-901.

162. Jordan MjV. and Wilson L. 1999. The use and action of drugs in analyzing mitosis. In "Mitosis and meiosis" Methods in Cell Biology (C.L. Rieder, Ed.), Academic Press, San Diego. 61:267-295.

163. JoshilLC. 1998. Microtubule dynamics in living cells. Curr. Opin. Cell Biol. 10:35-44.

164. Joshi H.C. and Palevitz B.A. 1996. Gamma-tubulin and microtubule organization in plants. Trends Cell Biol. 6:41-44.

165. Jensen C.G. 1982. Dynamics of spindle microtubule organization: kinetochore fiber microtubules of plant endosperm. J. Cell Biol. 92:540-558.

166. Kahana J.A. and Cleveland D.W. 1999. Beyond nuclear transport: Ran-GTP as a determinant of spindle assembly. J. Cell Biol. 146:1205-1209.

167. Kallajoki M., Weber K. and Osborn M. 1991. A 210 kDa nuclear matrix protein is a functional part of the mitotic spindle; a microinjection study using SPN monoclonal antibodies. EMBO J. 10:3351-3362.

168. Kallajoki M., Weber K. and Osborn M. 1992. Ability to organize microtubules in taxol treated mitotic PtK2 cells goes with the SPN antigen and not with cenlrosome. J. Cell Sci. 102:91-102.

169. Kallajoki M., Harborth J., Weber K. and Osborn M. 1993. Microinjection of a monoclonal antibody against SPN antigen, now identified by peptide sequences as NuMa protein, induces micronuclei in PtK2 cells. J. Cell Sci. 104:139-150.

170. Harris P.J., Clason E.L. and Prier K.R 1989. Tubulin polymerization in unfertilized sea-urchin eggs induced by elevated temperature. J. Cell Sci. 93:9-17.

171. Harris PJ. and Clason E.L. 1992. Conditions for assembly of tubulin-based structures in unfertilized sea urchin eggs. Spirals, monasters and cytasters. J. Cell Sci. 104:1035-1046.

172. Hatsumi M. and Endow S.A. 1992a. Mutants of the microtubule motor protein, nonclaret disjunctional, affect spindle structure and chromosome movement in meiosis and mitosis. J. Cell Sci. 101:547-559.

173. Hatsumi M. and Endow S.A. 1992b. The Drosophila ncd microtubule motor protein is spindle-associated in meiotic and mitotic cells. J. Cell Sci. 103:1013-1020.

174. He D., Zheng C. and Brinkley B.R. 1995. Nuclear matrix proteins as structural and functional components of the mitotic apparatus. Int. Cell Biol. 162B: 1-73.

175. Heald R., Tournebize R., Blank T., Sandaltzopoulos R-, Becker P., Hyman A. and Karsenti E. 1996. Self-organization of microtubules into bipolar spindle around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature 382:420-425.

176. Heald R., Tournebize R., Habermann A., Karsenti E. and Hyman A. 1997. Spindle assembly in Xenopus egg extracts: respective roles of centrosomes and microtubule self-organization. J. Cell Biol. 138:615-628.

177. Heald R. and Walczak C.E. 1999. Microtubule-based motor function in mitosis. Curr. Opin. Struct. Biol. 9:268-274.

178. Hecht R.M., Berg-Zabelshansky M., Rao P.N. and Davis FJVI. 1987. Conditional absence of mitosis-specific antigens in a temperature sensitive embryonic-arrested mutant of Caenorhabditis elegans. J. Cell Sci. 87:305-314.

179. Hepler P.K. and Jackson W.T. 1969. Isopropyl N-phenylcarbamate affects spindle microtubule orientation in dividing endosperm cells of Haemanthus katherinae baker. J. Cell Sci. 5:727-743.

180. Hervas J.P. and Gimenes-Martin G. 1977. Measurement of multipolar anaphases production by hexachlorcyclohexane in onion root tip cells. Cytobiologie 9:229-239.

181. Kalt A. and Schliwa M. 1993. Molecular components of the centrosome. Trends Cell BioL 3:118-128.

182. Kanai Y., Takemura R., Oshima T, Mori H, lhara Y., Yanagisawa M, Masaki T. and Hirokawa N. 1989. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. J. Cell Biol. 109:1173-1184.

183. Karagiannidou T.H., Eleftheriou E.R., Tsekos I., Galatis B. and Apostolakos P. 1995. Colchicine-induced paracrystals in root cells of wheat (Triticum aestivum L). Annals Bot. 76:23-30.

184. Karki S. and Holzbaur E.L.F. 1999. Cytoplasmic dynein and dynactin in cell division and intracellulat transport. Curr. Opin. Cell Biol. 11:45-53.

185. Karsenti E., Kobayasbi S-, Mitchison T. and Kirschner M. 1984. Role of the centrosome in organizing the interphase microtubule array: properties of cytoplasts containing or lacking centrosomes. J. Cell Biol. 98:1763-1776.

186. Keating T.J. and Borisy G.G. 1999. Centrosomal and non-centrosomal microtubules. Biol. Cell. 91:321-329.

187. Keryer G., Davis F.M., Rao P.N. and Beisson J. 1987. Protein phosphorylation and dynamics of cytoskeletal structures associated with basal bodies in Paramecium. Cell Motil. Cytoskel. 8:44-54.

188. Khodjakov A. and Rieder C. 1999. The sudden recruitment of y-tubulin to the centrosome at the onset of mitosis and its dynamic exchange throughout the cell cycle, do not require microtubules. J. Cell Biol. 146:585-596.

189. Khodjakov A., Cole R.W., Oakley B.R. and Rieder C.L. 2000. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Curr. Biol. 10:59-67.

190. King S.M. 2002. Dyneins motor on in plants. Traffic. 3:930-931.

191. Kirschner M.W. 1980. Implications of treadmilling for the stability and polarity of actin and tubulin polymers in vivo. J. Cell Biol. 86:330-334.

192. Kirschner M. and Mitchison T. 1986. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45:329-342.

193. Knops J, Kosik K.S., Lee G„ Pardee J.D., Cohen-Gould L. and McConlogue L. 1991. Overexprerssion of tau in a nonneuronal cell induces long cellular processes. J. Cell Biol. 114:725-733.

194. Komis G., Apostolakos P. and Galatis B. 2002. Hyperosmotic stress induces formation of tubulin macrotubules in root-tip cells of Triticum turgidum: their probable involvement in protoplast volume control. Plant Cell Physiol. 43:911-922.

195. Kost B. and Chua N-H. 2002. The plant cytoskeleton: vacuoles and cell walls make the difference. Cell 108:9-12.

196. Koury S.T., Bowser S.S. and McGee-Russell S.M. 1985. Ultrastructural changes during reticulopod withdrawl in the foraminiferan protozoan Allogromia sp., strain NF. Protoplasma 129:149-156.

197. Kuang J. and Ashorn C.L. 1993. At least two kinases phosphorylate the MPM-2 epitope during Xenopus oocyte maturation. J. Cell Biol. 123:859-868.

198. Kuang J., Ashorn C.L., Gonzalez-Kuyvenhoven M. and Penkala J.E. 1994. cdc25 is one of the MPM-2 antigens involved in the activation of maturation-promoting factor. Mol. Biol. Cell 5:135-145.

199. Kuriyama R. 1992. Monoclonal antibodies to microtubule-organizing center antigens. In "The Centrosome" (V.I.Kalnins, Ed.), Acad. Press, New-York. 131-165.

200. Maekawa T., Leslie R. and Kuriyama R. 1991. Identification of a minus end-specific microtubule-associated protein located at the mitotic poles in cultured mammalian cells. Eur. J. Cell Biol. 94:255-267.

201. Manfredi J.J. and Horwitz S.B. 1984. Vinblastine paracrystals from cultured cells are calcium-stable. Exp Cell Res. 150:205-212.

202. Maniotis A. and Schliwa M. 19911 Microsurgical removal of centrosome blocks cell reproduction and centriole generation in BSC-1 cells. Cell 67:495-504.

203. Marc J. 1997. Microtubule organizing centers in plants. Trends Plant Sei. 2:223229.

204. Marcus A.I., Li W„ Ma H. and Cyr R.J. 2003. A kinesin mutant with atypical bipolar spindle undergoes normal mitosi s. Mol. Biol. Cell 14:1717-1726.

205. Margolis R.L. and Wilson L. 1978. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady-state in vitro. Cell 13:1 -8.

206. Margolis R.L. and Wilson L. 1981. Microtubule treadmills possible molecular machinery. Nature 293:705-711.

207. Margolis R.L. and Wilson L. 1998. Microtubule treadmilling: what goes around comes around. BioEssays 20:830-836.

208. Masuda H., Sevik M. and Cande W.Z. 1992. In vitro microtubule-nucleating activity of spindle pole bodies in fission yeast Schizosaccharomycespombe: cell cycle-dependent activation in Xenopus cell-free extracts. J. Cell Biol. 117:1055-1066.

209. Masurovsky E.B. and Horwitz S.B. 1989. Ultrastructural effects of colchicine, vinblastine, and taxol in drug-sensitive and multidrug-resistant J774.2 cells. Protoplasma 148:138-149.

210. Mattei X., Romand R. and Thiaw O.T. 1985. Microtubules and macrotubules in fish meiosis. J Ultrastr Res. 91:83-91.

211. Matthies ILJ.G„ McDonald H.B., Goldstein L.S.B. and Therkauf W.E. 1996. Anastral meiotic spindle morphogenesis: role of the non-claret disjunctional kinesis-like protein. J. Cell Biol. 134:455-464.

212. Mazia D. 1984. Centrosomes and mitotic poles. Exp. Cell Res. 153:1-15.

213. Mazia D. 1987. The chromosome cycle and the centrosome cycle in the mitotic cycle. Int. Rev. Cytol. 100:49-92.

214. McClinton R.S„ Chandler J.S. and Callis J, 2001. cDNA isolation, characterization, and protein intracellular localization of a katanin-like p60 subunit from Arabidopsis thaliana. Protoplasma 216:181-190.

215. McDonald H.B., Stewart R-J. and Goldstein L.S.B. 1990. The kinesin-like ncd protein oiDrosophila is a minus end-directed microtubule motor. Cell 63:1159-1165.

216. McKean P.G., Vaughn S., and Gull K. 200L The extended tubulin superfamily. J Cell Sci. 115:2723-2733.

217. McNally F.J., Okawa IC, Iwamatsu A. and Vale R.D 1996. Katanin, the microtubule-severing ATPase, is concentrated at centrosomes. J. Cell Sci. 109:561-567.

218. McNiven M.A., Wang M. and Porter K.R. 1984. Microtubule polarity and the direction of pigment transport reverse simultaneously in surgically severed melanophore arms. Cell 37:753-765.

219. McNiven MA and Porter K.R 1988. Organization of microtubules in centrosome free cytoplasm. J. Cell Biol. 106:1593-1605.

220. Mercies A., Ramyar K., Vechio J.D. and Cleveland D.W. 1996. A complex of NuMa and cytoplasmic dynein is essential for mitotic spindle assembly. Cell 87:447-458.

221. Merdes A. and Cleveland D.W. 1997. Pathways of spindle pole formation: different mechanisms; conserved components. J. Cell Biol. 138:953-956.

222. Merdes A., Heald R^ Samejima K., Earnshaw W.C. and Cleveland D.W. 2000. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMa. J. Cell Biol. 149:851-861.

223. Millar S.E., Freeman M. and Glover D.M. 1987. The distribution of a 'mitosis specific1 antigen during Drosophila development. J. Cell Sci. 87:95-104.

224. Miller M. and Solomon F. 1984. Kinetics and intermediates of marginal band reformation: evidence for peripheral determinants of microtubule organization. J. Cell Biol. 99:70s-75s.

225. Mineyukf Y. 1999. The preprophase band of microtubules: its function as a cytokinetic apparatus in higher plants. Int. Rev. Cytol. 187:1-49.

226. Mitch ison T«J. 1992. Self-organization of polymer-motor systems in the cytoskeleton. Phil. Trans. R: Soc. Lond. B. 336:99-106.

227. Mitchison T.J. and Salmon E.D. 2001. Mitosis: a history of division. Nature Cell Biol. 3:E17-E21.

228. Mitsui 1L, Yamaguchi-Shinozaki IC, Nishikawa K. and Takahashi H. 1993. Identification of a gene family (kat) encoding kinesin-like proteins in Arabidopsis thaliana and the characterization of secondary structure of KatA. Mol. Gen. Genet. 238:362-368.

229. Mitsui IL, Nakatani K., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K., Nishikawa K. and Takahashi H. 1994. Sequencing and characterization of the kinesin-related genes katB and katC of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 25:865-876.

230. Mizuno K. 1993. Microtubule nucleation sites on nuclei of higher plant cells. Protoplasma 173:77-85.

231. Mole-Bajer J. 1967. Chromosome movements in chloral hydrate treated endosperm cells in vitro. Chromosoma (Berl.). 22:465-480.

232. Mole-Bajer J. 1969. Fine structural studies of apolar mitosis. Chromosoma (Berl.). 26:427-448.

233. MoI£-Bajer J. and Bajer A.S. 1983. The action of taxol on mitosis: Modification of microtubule arrangements of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 96:527-540.

234. Mole-Bajer J., Inoue S., and Bajer A.S. 1988. Three-dimensional localization and redistribution of F-actin in higher plant mitosis and cell plate formation. Cell. Motil. Cytoskel. 10:217-228.

235. Mole-Bajer J., Bajer A.S., Zinkowski R.P., Balczon R.D. and Brinkley B.R. 1990. Autoantibodies from a patient with scleroderma CREST recognized kinetochores of the higher plant Haemanthus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:3599-3603.

236. Moore R.C., Zhang M., Cassimeris L. and Cyr R.J. 1997. In vitro assembled plant microtubules exhibit a high state of dynamic instability. Cell Motil. Cytoskel. 38: 278-286.

237. Morejohn L.C., Bureau T.E., Mole-Bajer J., Bajer A.S. and Fosket D.E. 1987. Oryzalin, a dinitroaniline herbicide, binds to plant tubulin and inhibits microtubule polymerization in vitro. Planta 172:252-264.

238. Morejohn L.C. 1991. The molecular pharmacology of plant tubulin and microtubules. In 'The cytoskeletal basis of plant growth and form" (C.W. Lloyd, Ed.), Acad.Press, London. 29-43.

239. Morejohn L.C. and Fosket D.E. 1991. The biochemistry of compounds with anti-microtubule activity in plant cells. Pharmac. Ther. 51:217-230.

240. Moritz M., Braunfeld M.B., Sedat J.W., Alberts B. and Agard D.A. 1995. Microtubule nucleation by y-tubulin-containing rings in the centrosome. Nature 378:638640.

241. Moscateili A., Del Casino C., Lozzi L., Cai G., Scali M., Tiezzi A. and Cresti M.1995. High molecular weight polypeptides related to dynein heavy chains in Nicotiana tabacum pollen tubes. J. Cell Sci. 108:1117-1125.

242. Moudjou M., Bordes N., Paintrand M. and Bornens M. 1996. y-Tubulinin mammalian cells: the centrosomal and the cytosolic forms. J. Cell Sci. 109:875-887.

243. Mountain V., Simerly C., Howard L., Ando A., Shatten G. and Compton D.A. 1999. The kinesin-related protein, HSET, opposes the activity of Eg5 and cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. J. Cell Biol. 147:351-365.

244. Mountain V. and Compton D.A. 2000. Dissecting the role of molecular motors in the mitotic spindle. Anat. Rec. 261:14-24.

245. Na G.C. and TimashefT S.N. 1982. In vitro vinblastine-induced tubulin paracrystals. J Biol. Chem. 257:10387-10391:

246. Narasimhulu S.B., Kao Y.L. and Reddy A.S.N. 1997. Interaction of Arabidopsis kinesin-like calmodulin-binding protein with tubulin subunits: modulation by Ca2+-calmodulin. Plant J. 12:1139-1149.

247. Narasimhulu S.B. and Reddy A.S.N. 1998. Characterization of microtubule binding domains in the Arabidopsis kinesin-like calmodulin binding protein. Plant Cell 10.957-965.

248. Nasmyth IC, Peters J-M. and Uhlmann F. 2000. Splitting the chromosome: cutting the ties that bind sister chromatids. Science 288:1379-1384.

249. Nedelec F.J., Surrey T., Maggs A.C. and Leibler S. 1997. Self-organization of microtubules and motors. Nature 389:305-308.

250. Nemec B. 1903. Über die Einwirkung des Chloralhydrates auf kern und Zellteilung. Jb. wiss. Bot. 39:645-730.

251. NewcombW. 1978. The development of the cells in the coenocytic endosperm of the African blood lily Haemanthus katharinae. Can. J. Bot. 56:483-501.

252. Nick P. 1999. Signals, motors, morphogenesis the cytoskeleton in plant development. Plant Biol. 1:169-179.

253. Nigg E.A. 1991. The substrate of the cdc2 kinases. Sem Cell Biol. 2:261-270.

254. Nishihama R. and Machida Y. 2001. Expansion of the phragmoplast during plant cytokinesis: a MAPK pathway may MAP it out. Curr. Opin. Plant Biol. 4:507-512.

255. Nishihama R-, Ishikawa M^ Araki S., Soyano T., Asada T. and Machida Y. 2001. The NPK1 mitogen-activated protein kinase kinase kinase is a regulator of cell-plate formation in plant cytokinesis. Genes Developm. 15:352-363.

256. Oakley B.R. 1994. y-tubulin. In "Microtubules". (J.S. Hyams and C.W. Lloyd, Eds). Wiley-Liss, NY, Modern Cell Biol. 13:33-45.

257. Ohba TM Nakamura M., Nishitani H. and Nishimoto T. 1999. Self-organization of microtubule asters induced 'mXenopus egg extracts by GTP-bound Ran. Science 284:13561358.

258. Otegui M. and Staehelin A.L. 2000a. Syncytial-type cell plates: a novel kind of cell plate involved in endosperm cellularization of Arabidopsis. Plant Cell 12:933-947.

259. Otegui M. and Staehelin A.L. 2000b. Cytokinesis in flowering plants: more than one way to divide the cell. Curr. Opin. Plant Biol. 3:493-502.

260. Pay A., Resch K, Frohnmeyer H., Fejes E., Nagy F. and Nick P. 2002. Plant RanGAPs are localized at the nuclear envelope in interphase and associated with microtubules in mitotic cells. Plant J. 30:699-709.

261. Palevitz BA 1988, Microtubular fir-trees in mitotic spindles of onion root tips. Protoplasma 142:74-78.

262. Palevitz BA 1991. Potential significance of microtubule rearrangement, translocation and reutilization in plant cells. In "The Cytoskeletal Basis of Plant Growth and Form" (C.W. Lloyd, Ed.), Acad. Press, London. 45-55.

263. Palevitz B.A. 1993a. Organization of the mitotic apparatus during generative cell division in Nicotiana tabacum. Protoplasma 174:25-35.

264. Palevitz B.A. 1993b. Morphological plasticity of the mitotic apparatus in plants and its developmental consequences. Plant Cell 5:1001-1009.

265. Pallas D. and Solomon F. 1982. Cytoplasmic microtubule-associated proteins: phosphorylation at novel sites is correlated with their incorporation into assembled microtubules. Cell 30:407-414.

266. Panteris E., Apostolakos P., Graf R. and Galatis B. 2000. Gamma-tubulin colocalizes with microtubule arrays and tubulin paracrystals in dividing vegetative cells of higher plants. Protoplasma 210:179-187.

267. Pereira G. and Schiebel E. 1997. Centrosome-microtubule nucleation. J. Cell Sci. 110:295-300.

268. Pfarr C.M., Coue M-, Grissom P.M., Hays T.S., Porter M.E. and Mcintosh J.R.1990. Cytoplasmic dynein is localized to kinetochores during mitosis. Nature 345:263-265.

269. Pickett-Heaps J.D. 1967. The effect of colchicine on the ultrastructure of dividing plant cells, xylem wall differentiation and distribution of cytoplasmic microtubules. Dev. Biol. 15:206-236.

270. Pickett-Heaps J.D. 1969. The evolution of the mitotic apparatus: An attempt at comparative ultrastructural cytology in dividing plant cells. Cytobios 3:257-280.

271. Pickett-Heaps J.D., Forer A. and Spurck, T. 1997. Traction fibre: toward a "tensegral" model of the spindle. Cell Motil. Cytoskel. 37:1-6.

272. Pickett-Heaps J.D., Gunning B.E.S., Brown R.C., Lemmon B.E. and Cleary A.L. 1999. The cytoplast concept of dividing plant cells: cytoplasmic domains and the evolution of spatially organized cell division. Am. J. Botany 86:153-172.

273. Piperno G. and Fuler M.T. 1985. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of a-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. J Cell Biol. 101:2085-2094.

274. Piperno G., LeDizet M. and Chang X. 1987. Microtubules containing acetylated a-tubulin in mammalian cells in cultures. J Cell Biol. 104:289-302.

275. Pluta A.F., Mackay AJVL, Ainsztein A.M., Goldberg LG. and Earnshaw W.C. 1995. The centromere: hub of chromosomal activities. Science 270:1591-1594.

276. Prusikiewicz P. and Hanan J. 1989. Lindenmayer Systems, Fractals, and Plants. Berlin, Springer Verlag. 120p.

277. Reddy A.S.N. 2001. Molecular motors and their function in plants. Int. Rev. Cytol. 204:97-178.

278. Reddy A.S.N., Safadi F„ Narasimhulu S.B., Golovkin M. and Hu X. 1996a. A novel plant calmodulin-binding protein with a kinesin heavy chain motor domain. J. Biol. Chem. 271:7052-7060.

279. Reddy A.S.N., Narasimhulu S.B., Safadi, F., and Golovkin M. 1996b. A plant kinesin heavy chain-like protein is a calmodulin-binding protein. Plant J. 10:9-21.

280. Reddy A.S.N., Narasimhulu S.B. and Day LS. 1997. Structural organization of a gene encoding a novel calmodulin-binding kinesin-like protein from Arabidopsis. Gene 204:195-200.

281. Regemorter D. 1926. Les troubles cintetiques dans les racines chloralisees. La Cellule 37:43-73.

282. Rieder C.L. 1982. The formation, structure and composition of the mammalian kinetochore and kinetochore fiber. Int. Rev. Cytol. 79:1-58.

283. Rieder C.L. and Bajer A.S. 1977. Effect of elevated temperature on spindle microtubules and chromosome movements in cultured newt lung cells. Cytobios 18:201-234.

284. Rieder C.L. and Palazzo R.E. 1992. Colcemid and the mitotic cycle. J. Cell Sci. 102:387-392.

285. Rieder C.L. and Salmon E.D. 1998. The vertebrate cell kinetochore and its role during mitosis. Trends Cell Biol. 8:310-318.

286. Rodionov V.L and Borisy G.G. 1997a. Self-centring activity of cytoplasm. Nature 386:170-173.

287. Rodionov V.L and Borisy G.G. 1997b. Microtubule treadmilling in vivo. Science 275:215-218.

288. Rodionov V., Nadezhdina E. and Borisy G. 1999. Centrosomal control of microtubule dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:115-120.

289. Rost T.L., Barbour M.G., Stocking C.R. and Murphy, T.M. 1998 Plant Biology. Wadsworth Publ. Company, An Intern. Thompson Publ. Comp., Belmont, CA. 537p.

290. Rupp G., Bowser S.S., Mannella C.A. and Rieder C.L. 1986. Naturally occurring tubulin-containing paracrystals in Allogrotnia: immunocytochemical identification and functional significance. Cell Motil. Cytoskel. 6:363-375.

291. Sakamura T. 1916. Über die Beeinflussung der Zell- und Kernteilung durch Chloralisierung mit besonderer Berücksichtigung des Verhaltens der Chromosomen. Bot. Mag. (Tokyo). 30:375-399.

292. Salisbury J.L. 1995. Centrin, centrosomes and mitotic spindle poles. Curr. Opin. Cell Biol. 7:39-45.

293. Saltarelli D. and Pantaloni D. 1982. Polymerization of the tubulin-colchicine complex and guanosine 5'-triphosphate hydrolysis. Biochemistry 21:2996-3006.

294. Samuels A.L., Giddings T.H. and Staehelin L.A. 1995. Cytokinesis in tobacco BY-2 and root tip cells: a new model of cell plate formation in higher plants. J. Cell Biol. 130:1345-1357.

295. Saredi A., Howard L. and Compton DA. 1996. NuMa assembles into extensive filamentous structure when expressed in the cell cytoplasm. J. Cell Sei. 109:619-630.

296. Saredi A., Howard L. and Compton DA. 1997. Phosphorylation regulates the assembly of NuMa in a mammalian mitotic extract. J. Cell Sei. 110:1287-1297.

297. Saxton W. M., Stemple D. L., Leslie R. J., Salmon E. D„ Zavortink M. and Mcintosh J. R. 1984. Tubulin dynamics in cultured mammalian cells. J. Cell Biol. 99:2175-2186.

298. Schatten H. and Chakrabarti A. 1998. Centrosome structure and function is altered by chloral hydrate and diazepam during the first reproductive cell cycles in sea urchin eggs. Eur. J. Cell Biol. 75:9-20.

299. Schellenbaum P., Vantard M. and LambertA-M. 1992. Higher plant microtubule-associated proteins (MAPs): A survey. Biol. Cell 76:359-364.

300. Schiebel E. 2000. y-tubulin compexes: binding to the centrosome, regulation and microtubule nucleation. Curr. Opin. Cell Biol. 12:113-118.

301. Schmit A-C., Vantard M„ De Mey J. and Lambert A-M. 1983. Aster-like microtubule centers establish spindle polarity during interphase-mitosis transition in higher plant cells. Plant Cell Rep. 2:285 288.

302. Schmit A-C., Stoppin V., Chevrier V., Job D. and Lambert A-M. 1994. Cell cycle dependent distribution of a centrosomal antigen at the perinuclear MTOC or at the kinetochores of higher plant cells. Chromosoma 103:343-351.

303. Schutze E. and Kirschner M. 1986. Microtubule dynamics in interphase cells. J. Celt Biol. 102:1020-1031.

304. Sharp D.J., Kuriyama R., Essner R. and Baas P.W. 1997. Expression of a minus-end-directed motor protein induced Sf9 cells to form axon-like processes with uniform microtubule polarity orientation. J Cell Sci 110:2373-2380.

305. Sharp D.J., Rogers G.C. and Scholey JJVf. 2000. Microtubule motors in mitosis. Nature 407:41-47.

306. Shaw S.L., Kamyar R. and Ehrhardt D.W. 2003. Sustained vicrotubule treadmilling in Arabidopsis cortical arrays. Science 300:1715-1718.

307. Sherwin Y. and Gull K. 1989. Visualization of detyrosination along single microtubules reveals novel mechanism of assembly during cytoskeletal duplication in trypanosomes. Cell 57:211-221.

308. Simmonds D.H., Conibear E. and Setterfleld G. 1989. Microtubule organization during the cell cycle of cultured Vicia hajastana Grossh. Biochem. Cell Biol. 67:545-552.

309. Smertenko A., Saleh N., Igarashi II., Mori IL, Hauser-Hahn I., Jiang C-J., Sonobe S., Lloyd C. and Hussey P. 2001. A new class of microtubule-associated proteins in plants. Nature Cell Biol. 2:750-753.

310. Smith L.G. 1999. Divide and conquer: cytokinesis in plant cells. Curr. Opin. Plant Biol. 2:447-453.

311. Song IL, Golovkin M., Reddy A.S.N. and Endow S. 1997. In vitro motility of AtKCBP, a calmodulin-binding kinesin protein of Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:322-327.

312. Sparks C.A., Fey E.G., Vidair C.A. and Doxey S.J. 1995. Phosphorylation of NuMa occurs during nuclear breakdown and not mitotic spindle assembly. J. Cell Sci. 108:3389-3396.

313. Staehelin A.L. and Hepler P.K. 1996. Cytokinesis in higher plants. Cell 84:821824.

314. Staiger C J. and Cande Z.W. 1990. Microtubule distribution in dv, a maize meiotic mutant defective in the prophase to metaphase transition. Devel. Biol. 138:231-242.

315. Starling D. 1976. Two ultrastructurally distinct tubulin paracrystals induced in sea-urchin eggs by vinblastine sulphate. J Cell Sci. 20:79-89.

316. Steuer E.R., Wordeman L., Schroer T.A. and Sheetz M.P. 1990. Localization of cytoplasmic dynein to mitotic spindles and kinetochores. Nature 345:266-268.

317. Stoppin V., Vantard IVL, Schmit A-C. and Lambert A-M. 1994 Isolated plant nuclei nucleate microtubule assembly: the nuclear surface in higher plants has centrosome-like activity. Plant Cell 6:1099-1106.

318. Stoppin V., Lambert A-M. and Vantard M. 1996. Plant microtubule-associated proteins (MAPs) affect microtubule nucleation and growth at plant nuclei and mammalian centrosomes. Eur. J. Cell Biol. 69:11-23.

319. Stoppin-Mellet V., Peter C. and Lambert A-M. 2000. Distribution of y-tubulin in higher plants: cytosolic y-tubulin is part og high molecular weight complexes. Plant Biol. 2:290-296.

320. Stearns T. and Kirschner M. 1994. In vitro reconstitution of centrosome assembly and function: the central role of y-tubulin. Cell 76:623-637.

321. Suprenant ICA. and Marsh J.C. 1987. Temperature and pH govern the self-assembly of microtubules from unfertilized sea-urchin extracts. J. Cell Biol. 87:71-84.

322. Surrey T., Nedelec F., Leibler S. and Karsenti E. 2001. Physical properties determining self-organization of motors and microtubules. Science 292:1167-1171.

323. Taimen P., Vijamaa M. and Kallajoki M. 2000. Preferential expression of NuMa in the nuclei of proliferating cells. Exp. Cell Res. 256:140-149.

324. Takanari H., Yosida T., Morita J., Izutsu K. and Ito T. 1990. Instability of pleomorphic tubulin paracrystals artificially induced by Vinca alkaloids in tissue-cultured cells. Biol. Cell 70:83-90.

325. Takanari II., Morita J., Yamanaka H., Yada K., Takahashi A. and Izutsu K. 1994. Effect of acidic pH on the formation of vinblastine-induced paracrystals in Chinese hamster ovary cell. Biol Cell 82:51-57.

326. Takemura R., Okabe S., Umeyama T., Kanai Y., Cowan N.J. and Hirokawa N. 1992. Increased microtubule stability and alpha tubulin acetilation in cells transfected with microtubule-associated proteins MAP1B, MAP2 or tau. J. Cell Biol. 103:953-964.

327. Takemura R., Okabe S., Umeyama T. and Hirokawa N. 1995. Polarity orientation and assembly process of microtubule bundles in nocodazole-treated, MAP2c-transfected COS cells. Mol. Biol. Cell 6:981-996.

328. Tang T.K., Tang C-J-C., Chao Y-J. and Wu C-VV 1994. Nuclear mitotic apparatus protein (NuMa): spindle association, nuclear targeting and differential subcellular localization of various NuMa isoforms. J. Cell Sci. 107:1389-1402.

329. Tassin A-M. and Bornens M. 1999. Centrosome structure and microtubule nucleation in animal cells. Biol. Cell 91:343-354.

330. Thaler C.D. and Haimo L.T. 1996. Microtubules and microtubule motors: mechanisms of regulation. Int. Rev. Cytol. 164:269-327.

331. Theurkauf W.E. and Hawley R.S. 1992. Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of non-exchange chromosomes and the effect of mutations in the nod kinesin-like protein. J. Cell Biol. 116:1167-1180.

332. Traas J.A., Beven A.F., Doonan J.H., Cordewener J. and Shaw P.J. 1992. Cell-cycle-dependent changes in labelling of specific phosphoproteins by the monoclonal antibody MPM-2 in plant cell. Plant J. 2:723-732.

333. Tombes R.M., Peloquin J.G. and Borisy G.G. 1991. Specific association of an M-phase kinase with isolated mitotic spindles and identification of two of its substrates as MAP4 and MAP IB. Cell Regulation 2:861-874.

334. Tousson A., Zeng C., Brinkley B.R. and Valdivia M.M. 1991. Centrophilin: a novel mitotic spindle protein involved in microtubule nucleation. J. Cell Biol. 112:427-440.

335. Twell D., Park S.K., Hawkins T.J., Schubert D., Schmidt R-, Smertenko A. and Hussey P.J. 2002. MOR1/GEM1 has an essential role in the plant-specific cytokinetic phragmoplast. Nature Cell Biol. 4:711-714.

336. Umeyama T., Okabe S., Kanai Y. and Hirokawa N. 1993. Dynamics of microtubules bundled by microtubule associated protein 2C (MAP2C). J. Cell Biol. 120:451465.

337. Utrilla L., Sans J. and De La Torre C. 1989. Colchicine-resistant assembly of tubulin in plant mitosis. Protoplasma 152:101-108.

338. Vale R.D. 2003. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell 112:467-480.

339. Vallee R.B. 1980. Structure and phosphorylation of microtubule-associated protein-2 (MAP2). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3206-3210.

340. Vandre D.D., Davis F.M., Rao P.N. and Borisy G.G. 1984. Phosphoproteins are components of mitotic microtubule organizing centers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:44394443.

341. Vandre D.D., Davis F.M., Rao P.N. and Borisy G.G. 1986. Distribution of cytoskeletal proteins sharing a conserved phosphorylated epitope. Eur. J. Cell Biol. 41:7281.

342. Vandre D.D. and Borisy G.G. 1989. Anaphase onset and dephosphorylation of mitotic phosphoproteins occur concomitantly. J. Cell Sci. 94:245-258.

343. Vandre D.D., Centonze V.E., Peloquin J„ Tombes RM. and Borisy G.G. 1991. Proteins of the mammalian mitotic spindle: phosphorylation/dephosphorylation of M AP4 during mitosis. J. Cell Sci. 98:577-588.

344. Vandre D.D. and Burry RW. 1992. Immunoelectron microscopic localization of phosphoproteins associated with the mitotic spindle. J. Histochem. Cytochem. 40:18371847.

345. Vantard M., Levilliers N., Hill A-M., Adoutte A. and Lambert A-M. 1990. Incorporation of Paramecium axonemal tubulin into higher plant cells reveals functional sites of microtubule assembly. Pnoc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:8825-8829.

346. Vantard M-, Schellenbaum P., Fellous A. and Lambert A-M. 1991. Characterization of maize microtubule-associated proteins, one of which is immunologically related to Tau. Biochemistry 30:9335-9340.

347. Vantard M^ Peter C., Fellous A., Schellenbaum P. and Lambert A-M. 1994. Characterization of a 100-kDa heat-stable microtubule-associated protein from higher plants. Eur. J. Cell Biol. 220:847-853.

348. Vantard M., Cowling R and Delichère C. 2000. Cell cycle regulation of the microtubular cytoskeleton. Plant Mol. Biol. 43:691-703.

349. Vaughn K.C. and Harper J.D. 1998. Microtubule-organizing centers and nucleating sites in land plants. Int. Rev. Cytol. 181:75-149.

350. Verde F., Labbé J.-Q, Dorée M. and Karsenti E. 1990. Regulation of microtubule dynamics by cdc2 protein kinase in cell-free extracts ofXenopus eggs. Nature 343:233-238.

351. Verde F., Berrez J-M., Antony C. and Karsenti E. 1991. Taxol-induced microtubule asters in mitotic extracts of Xenopus eggs: requirement for phosphorylated factors and cytoplasmic dynein. J. Cell Biol. 112:1177-1187.

352. Verde F., Dogterom M., Stelzer E.t Karsenti E. and Leibler S. 1992. Control of microtubule dynamics and length by cyclin A and cyclin B-dependent kinases in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 118:1097-1108.

353. Vernos L and Karsenti E. 1995. Chromosomes take the lead in spindle assembly. Trends Cell Biol. 5:297-301.

354. Volker A., Stierhof Y.D. and Jurgens G. 2001. Cell cycle-independent expression of the Arabidopsis cytokinesis-sprcific syntaxin KNOLLE results in mistargeting to the plasma membrane and is not sufficient for cytokinesis. J. Cell Sci. 114:3001-3012.

355. Vorobjev LA. and Nadezhdina E.S. 1987. The centrosome and its role in organization of microtubules. Int. Rev. Cytol. 106:227-293.

356. Vos J.W., Valster A.H. and Hepler P.K. 1999. Methods for studying cell division in higher plants. In "Mitosis and Meiosis", Methods in Cell Biology (C.L. Rieder, Ed.), Academic Press, San Diego. 61:413-437.

357. Vos J.W., Safadi F, Reddy A.S.N. and Hepler P.K. 2000. The kinesin-like calmodulin binding protein is differentially involved in cell division. Plant Cell 12,979-990.

358. Wade R.H. and Hyman A.A. 1997. Microtubule structure and dynamics. Curr. Opin. Cell Biol. 9:12-17.

359. Wadsworth P. and Salmon E.D. 1986. Analysis of the treadmilling model during metaphase of mitosis using fluorescence redistribution after photobleaching. J. Cell Biol. 102:1032-1038.

360. Walczak C.E. 2000. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 12:52-56.

361. Walzcak C.E., Verma S. and Mitchison T.J. 1997. XCTK2: a kinesin-related protein that promotes mitotic spindle assembly in Xenopus laevis egg extracts. J. Cell Biol. 136:859-870.

362. Walczak C.E., Vernos L, Mitchison T.J., Karsenti E. and Heald R 1998. A model for proposed roles of different microtubule-based motor proteins in establishing spindle bipolarity. Curr. Biol. 8:903-913.

363. Wang H., Cutler A. J. and Fowke L.C. 1991. Microtubule organization in cultured soybean and black spruce cells: interphase-mitosis transition and spindle morphology. Protoplasma 162:46-54.

364. Wasteneys G.O. 2000. The cytoskeleton and growth polarity. Curr. Opin. Plant Biol. 3:503-511.

365. Wasteneys G.O. 2002. Microtubule organization in the green kingdom: chaos or self-order? J. Cell Sci. 115:1345-1354.

366. Wasteneys G.O. and Williamson R.E. 1989. Reassembly of microtubules in Nitella tasmanica: assembly of cortical microtubules in branching clusters and its relevance to steady-state microtubule assembly. J. Cell Sci. 93:705-714.

367. Waters J.C. and Salmon E.D. 1997. Pathways of spindle assembly. Curr. Opin. Cell Biol. 9:37-43.

368. Weisshaar B., Doll T. and Matus A. 1992. Reorganization of the microtubular cytoskeleton by embryonic microtubule-associated protein 2 (MAP2c). Development 116:1151-1161.

369. Welnhofer E.A. and Travis J.L. 1998. Evidence for a direct conversion between two tubulin polymers microtubules and helical filaments in the Foraminiferan, Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 41:107-116.

370. Whittington A., Vugrek O., Wei K.J., Hasenbein N.G., Sugimoto IC, Rashbrooke M.C. and Wasteneys G.O. 2001. MORI is essential for organizing cortical microtubules in plants. Nature 411:610-613.

371. Wick S.M. 1991. The preprophase band. In "The Cytoskeletal Basis of Plant Growth and Form". (C.W.Lloyd, ed.) Acad. Press, London. 231-244.

372. Wick S.M. and Duniec J. 1983. Immunofluorescence microscopy of tubulin and microtubule arrays in plant cells. I. Preprophase band development and concomitant appearance of nuclear envelope-associated tubulin. J. Cell Biol. 97:235-243.

373. Wick S.M. and Duniec J. 1984. Immunofluorescence microscopy of tubulin and microtubule arrays in plant cells. II. Transition between the pre-prophase band and the mitotic spindle. Protoplasma 122:45-55.

374. Wilson E.B. 1928. The cell in development and heredity. NY and London, MacMillan. 1232 p.

375. Witt PJU, Ris H. and Borisy G.G. 1980. Origin of kinetochore microtubules in Chinese hamster ovary cells. Chromosoma 81:483-505.

376. Wittman T„ Wilm M, Karsenti E. and Vernos 1. 2000. TPX2, a novel Xenopus MAP involved in spindle pole organization. J. Cell Biol. 149:1405-1418.

377. Wittman T^ Hyman A. and Desai A. 2001. The spindle: a dynamic assembly of microtubules and motors. Nature Cell Biol. 3:E28-E34.

378. Wolf K. 1996. Acetylation of a-tubulin in male meiotic spindles of Pyrrhocoris apterus, an insect with holokinetic chromosomes. Protoplasma 191:148-157.

379. Wordeman L., Davis F.M„ Rao P.N. and Cande W.Z. 1989. Distribution of phosphorylated spindle-associated proteins in the diatom Stephanopyxis turns. Cell Motil. Cytoskel. 12:33-41.

380. Wymer C.L., Fisher D.D., Moore R.C. and Cyr R.J 1996. Elucidating the mechanism of cortical microtubule reorientation in plant cells. Cell Motil. Cytoskel. 35:162173.

381. Yang C.H., Lambie E.J. and Snyder M. 1992. NuMA: An unusually long coiled-coil related protein in the mammalian nucleus. J. Cell. Biol. 116:1303-1317.

382. Yasuhara H., Muraoka M., Shogaki H„ Mori H. and Sonobe S. 2002. TMBP200, a microtubule bundling polypeptide isolated from telophase tobacco BY-2 cells is a MORI homologue. Plant Cell Physiol. 43:595-603.

383. Yu H-S. and Russell S.D. 1993. Three-dimensional ultrastructure of generative cell mitosis in the pollen tube of Nicotiana tabacum. Eur. J. Cell Biol. 61:338-348.

384. Yu H.-G., Muszynski M.G. and Dawe R.K. 1999. The maize homologue of the cell cycle checkpoint protein MAD2 reveals kinetochore substructure and contrasting mitotic and meiotic localization pattern. J. Cell Biol. 145:25-435.

385. Yu W. and Moreno Dias de la Espina S. 1999. The plant nucleoskeleton: ultrastructural organization and identification of NuMa homologues in the nuclear matrix and mitotic spindle of plant cells. Exp. Cell Res. 246:516-526.

386. Zheng Y., Wong M.L., Alberts B. and Mitchison T. 1995. Nucleation of microtubule assembly by a y-tubulin-containing ring complex. Nature 378:578-583.

387. Zeng C. 2000. NuMa: a nuclear protein involved in mitotic centrosome function. Micr. Res. Techn. 49:467-477.

388. Zhang D., Wadsworth P. and Hepler P.K. 1990. Microtubule dynamics in living dividing plant cells: confocal imaging of microinjected fluorescent brain tubulin. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 87:8820-8824.