Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм автокаталитического нитрозилирования и нитрования аминокислот в составе белков с гидрофобными участками

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизм автокаталитического нитрозилирования и нитрования аминокислот в составе белков с гидрофобными участками"

На правах рукописи

Рафиков Руслан Робертович

МЕХАНИЗМ АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОГО НИТРОЗИЛИРОВАНИЯ И НИТРОВАНИЯ АМИНОКИСЛОТ В СОСТАВЕ БЕЛКОВ С ГИДРОФОБНЫМИ УЧАСТКАМИ

специальность 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на Химическом факультете

Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научный руководитель- доктор биологических наук,

профессор Ванин Анатолий Федорович

Официальные оппоненты доктор химических наук,

профессор Никифоров Григорий Алексеевич

доктор биолог ических наук, профессор Петренко Юрий Михайлович

Ведущая организация' Государственный научный центр по антибиотикам

Министерства промышленности и энергетики РФ

Защита состоится "20" мая 2005 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 в Институте биохимической физики им Н.М Эмануэля РАН по адресу 11991 Москва, ул Косыгина, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им Н Н Семенова РАН

Автореферат разослан /У О^РьА^^сА 2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Смотряева М.А

-Н

•л а

ЧбЧЪ

M36336

Общая характеристика работы

Актуальность исследования.

Оксид азота обладает широким спектром действия на различные защитные и регуляторные системы организма Открытая вначале регуляция N0 сосудистого тонуса, оказалась тишь верхушкой айсберга Сейчас довольно хорошо изучено участие N0 в воспалении, в передаче сигнала в нейронах, в регупяции активности множества ферментов и рецепторов

Молекула N0 является радикалом, однако не обладает высокой реакционноспособностью. характерной для радикала В организме NO может реагировать с высокой скоростью лишь с радикалами и переходными металлами Долгое время реакцию N0 с кислородом исключали из рассмотрения, поскольку эта тримолекулярная реакция имее! низкую эффективность и не может конкурировать с реакциями, в которых участвуют радикалы и ионы переходных меч аилов В последнее время появились рабогы, в которых показано ускорение тримолекулярной реакции NO с кислородом в гидрофобных фазах, присутствующих в организме, таких как липидные частицы, мембраны клеток (Lancaster Jr JR 1997. Недоспасов А , 1998) Благодаря своей гидрофобной природе кислород и N0 накапливаются в гидрофобных веществах, и реакция окисления N0 ускоряется за счет эффекта концентрирования, это явление получило название - «мицеллярный катализ»

Весьма актуальной и неисследованной областью представляется участие белковых гидрофобных участков в «мицеллярном катализе» окисления NO Многие ферменты, в рефляции которых участвует N0, не имеют металлических центров или показано, что N0 не взаимодействует с металлическим центром Поэтому в данных системах возникает вопрос о механизме действия N0 на такие белки

Наиболее распространенным и исследованным механизмом регуляции белков с помощью N0 является образование нитрозонроизводтгого иистеинового остатка -нитрозоцистеина Показано, например, что нитрозилирование цистеина в белке, ответственном за функционирование кальциевых каналов, влияет на выход кальция из скелетной мышцы (Sun J 2003) Однако, на главный вопрос каков механизм образования нитрозоцистеина, если NO и цистеин не реагируют между собой непосредственно ответа до сих пор нет Поэтому, интересной и совершенно неисследованной проблемой является связь между модифицированием с помощью N0 аминокислот в составе белков и окислением N0 в гидрофобных участках белков При окислении NO кислородом, конечным продуктом реакции является N2O3 - вещество, известное как сильнейший нитрозилирующий агент. Таким образом, белки, связанные с мембраной или имеющие гидрофобные участки могут нитрозилировать свои собственные аминокислоты благодаря реакции окисления N0 в этих гидрофобных областях.

Установлено, что низкомолекулярные нитрозотиолы, такие как нитрозоцистеин и нитрозоглугажон, могут играть в организме роль, схожую с N0 Они расслабляют сосуды, уменьшают свертываемость крови; то есть действие этих соединений однонаправлено с действием N0 Однако, время жизни нитрозогиолов в физиологических средах на порядки длиннее, чем у N0 и. кроме того, у них отсутствует многие отрицательные свойства N0. такие как образование пероксинитрита и ингибирование ферментов с металлическими центрами. Механизм образования таких низкомолекулярных тиолов до сих пор дискутируется.

Кроме очень хорошо исследованной модификации с помощью NO цисгеиновых остатков, существует еще одна аминокислота - триптофан, которая является сильным нуклеофилом и может модифицироваться в белках под действием N0 Хотя, на сегодняшний день существует лишь небольшое количество работ, посвященных модификации триптофана оксидом азота, эта область становится, в последнее время, очень привлекательна для исследователей Известно, что нитрозотриптофан расслабляет гладкие мышцы и уменьшает агрегацию тромбоцитов, что говорит о его действии, похожем на действие NO. Механизм образования и распада нитрозотриптофана в физиологических условиях также совершенно не изучен

Огромной проблемой в области исследования N0 является понимание процессов образования и путей деградации такого метаболита N0, как нитротирозин Известно, что нитротирозин является маркером многих патологических процессов в организме Его накопление в клегках наблюдают в месте воспаления, при ишемии-реперфузии и нейродегенеративных заболеваниях Образование нитротирозина, в первую очередь, связывают с образованием пероксинитрита, который получается в реакции N0 с супероксид анионом. Нитротирозин является стабильным метаболитом и его накопление приводит к запуску программной гибели клетки - апоптозу Однако, поскольку и в здоровой ткани наблюдается небольшой уровень нитротирозина, этот факт приводит к тому, что у многих исследователей возникает вопрос о механизме деградации нитротирозина Сейчас большое количество публикаций посвящено поиску путей неинзиматеческого восстановления нитротирозина (Murad Г. 1998) или поиску фермента «денитразы» (Tschiropoulos Н. 200!)

Таким образом, актуальность и перспективность исследования механизмов модификации аминокислотных остатков под действием N0 в белках представляет интерес для широкого круга исследователей связанных с физиологией, биохимией и медициной Цель и задачи исследования. Целью работы было выяснение механизмов автокаталитического нитрозилирования и нитрования белков с гидрофобными участками и исследование обратимости этих процессов. В работе решали следующие задачи

1 Исследовать катализ реакции окисления N0 кислородом в гидрофобных участках белка на примере альбумина крови

2 Показать автокаталитический характер нитрозилирования аминокислотных остатков цисгеина и триптофана в глобулярных белках.

3 Объяснить возникновение низкомолекулярных нитрозотиолов в кровотоке на основании ускорения окисления N0 в альбумине крови.

4 Показать механизм нитрования тирозиновых остатков в белках за счет N0 и сравнить с механизмом нитрования посредством пероксинитрита

5 Исследовать влияние тиолов на процесс нитрования и возможность обратимости нитрования тирозина.

6. На клеточном уровне (Е coli, фибробласты. нейроны) показать участие N0, пероксинитрита и тиолов в нитровании белков.

Научная новизна. Впервые был показан катализ окисления N0 в гидрофобных участках белка и автокаталитическое нитрозилирование и нитрование таких аминокислот, как цисгеин, триптофан и тирозин Показано что N0+ может выходить из гидрофобной фазы белка по трем основным путям, I) прямой перенос на внешний нуклеофил. 2) стабилизация на цистеинс и последующий перенос на внешний нуклеофил 3) стабилизация на триптофане и последующий перенос на внешний нуклеофил Впервые было показано, что N0 может

нитровать тирозин в белках с гидрофобным участком или в мембран-связанных белках через стадию образования нитрозотирозин-интермедиата Показано принципиальное отличие в локализации тирозинов в белке, которые подвергаются нитрованию в случае N0 и пероксинитрита Впервые получены данные о влиянии гиолов на нитрование тирозина в белке и об обратимости этой реакции за счет восстановления нитротирозина тиолами Продемонстрирована принципиальная возможность репарации клеток, поврежденных в ходе нитрозилируещего стресса, за счет увеличения внутриклеточного содержания тиолов Научно-практическое значение. Показанный в работе механизм автокаталитического нитрозилирования открывает новый этап в понимании регуляции активности многих белков при помощи N0 На основе данных о нахождении частицы NO+ в гидрофобной области белков были разработаны синтетические вещества, способные выводить из строя такие белки после реакции с NO+ Это позволило открыть совершенно новый тип антибиотиков. Показан механизм образования нитрозотиолов в кровяном русле На основании данных о денитрующей активности тиолов был разработан синтетический пептид с «денитразной» активностью, который может применяйся в будущем в лечении последствий воспалительных процессов, ишемии-реперфузии, нейродегенеративных процессов Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на Tirsl international conference on the Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide (2000, Сан Франциско, CHIA), Gordon conference Biochemistry of Nitric Oxide (2001, Вентура, США), Second International Conference of the Nitric Oxide Society (2002, Прага, Республика Чехия), The third international conference on the Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide (2004 Hapa. Япония). XIX съезде Физиологического общества им И.П Павлова (2004, Ькатеринбург). III Российском конгрессе по патофизиологии (2004, Москва) Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов эксперимент™, их обсуждения, выводов и списка литературы. Основной материал изложен на » ? страницах машинописного текста, содержит /» рисунков и ty таблиц Список литературы включает(Р^ЙЛсточников

Материалы и методы Приготовление раствора NO в воде.

Раствор N0 приготавливали в безвоздушном стеклянном аппарате путем пропускания очищенного N0 газа через воду Концентрация N0 отслеживалась при помощи селективного N0 электрода Приготовление раствора перокеинитрита.

Для приготовления раствора перокеинитрита использовали методику (Beckman M , 2000) Сначала О 5М р-р NaNCb и О 5М Н2О2 смешивали в равных объемах на холоду Затем, в раствор, стоящий на льду, добавляли 0.5М р-р НС1 и тут же нейтрализовывали с помощью О 5М КОН После этого, путем добавления 2М Tris-HCI буфера, рН раствора доводили до 7 4. Избыток Н2О2 удаляли при помощи МпОг. Синтез защищенных по триптофану "BSA. "'BSA.

Раствор 1мМ BSA (''BSA) в ацетатном буфере с рН=5 0 смешивали с 5мМ N-бромсукцинимидом на 10 минут при 25°С Далее смесь диализовали с фильтром в 12-14кДа в течении 12 часов в 2л буферного раствора (20мМ Tris-HCI, 50mM NaCl, 0 ImM EDTA. ImM C2H5SH и 5% глицерина) За степенью замещения следили по образованию нитрозопроизводного при действии нитрита в кислой среде Сперктоскопическое определение продуктов иитрозилирования BSA. BSA подвергали действию различных концентраций раствора N0 в воде За концентрацией нитрозилированного продукта следили по полосе поглощения либо нитрозоцистеина (^тач=345 нм). либо нитрозотриптофана (Хтлх=330 нм) Перед этим мешающую полос> поглощения от нитрита (Хтах=340 нм) убирали при помощи реакции с 5% сульфаматом аммония Для разделения сигнала от цистеина и триптофана использовали BSA, химически модифицированный по триптофану (WBSA) и цистеину ( BSA). Тонкослойная хроматография производных ANSA.

Тонкослойную хроматографию проводили на аллюминевых подложках с силикагельбО. мобильная фаза была выбрана гексан/эгилацетат 1 ■ 1

Определение коэффициента распределения NO между альбумином и водой.

Для определения Qno для альбумина, холодный (0°С) калибровочный раствор (10 мл. О 1М H2SO4 + 01 M Kl) был дегазирован. После этого в раствор был добавлен альбумин (BSA) (О 1 г сухого вещества) Температура была доведена до 20°С и в реакционную среду был опущен ISO-NO Markïl электрод (WPI Instruments, Waitham. MA). Выделение NO достигалось за счет введения в раствор 0 4 мл 50 mM NaNOn N02 + I + 2Н+ —♦ NO + 1/2Ь + Н20

Эксперименты проводились в безкислородной атмосфере В ходе эксперимента раствор BSA оставался прозрачным, что свидетельствовало об отсутствии процесса агрегации и денатурации альбумина. Определение нитрозотиолов

Для определения общего уровня ни грозотиолов (RSNO) in vitro, нитрозотиолы разлагались путем добавления 1 5 мМ раствора CuCl2. N0. выделяющийся при этом, определяли электрохимически при помощи N0 электрода В качестве стандарта использовали нитрозоглутатион (GS-NO), который получали путем инкубации эквимолярных количеств GSH и NaN02 в кислой среде при температуре 0°С

Определение нитрозотирозина методом Вестерн-блот анализа.

1 мкл образца (растворы альбумина или лизаты клеток и тканей) наносили на нитроцеллюлозную мембрану и сушили в инкубаторе 2 мин при температуре 45°С. После просушивания, мембрану блокировали 5% раствором молока в PBS буфере Первичные антитела в соотношении 1мкл на 1мл раствора 5% молока выдерживали с мембраной в течении 1 часа Затем мембрану промывали 1% раствором Tween20 в PBS буфере. После промывки мембрану выдерживали со вторичными антителами в течение 40 минут Затем мембрану отмывали от вторичных антител 1% раствором Tween20 в PBS буфере и проявляли с помощью субстрата для пероксидазы хрена (SuperSignal Pico West (Pierce)) Сигнал снимали на пленку (Kodak) Проявленную пленку сканировали, плотность сигнала измеряли при помощи программы ImageJNIH. Определение нитротирозина методом HPLC.

К раствору альбумина добавляли трипсин для расщепления белка и инкубировали 15 мин при 37 С После инкубации раствор инжектировали в HPLC «Waters» с колонкой С-18 Xterra Waters В качестве мобильной фазы использовался градиент H2O/CH1CN от 0 до 30% содержания ацетонитрила в мобильной фазе На выходе регистрировали поглощение на /шине волны перехода в нитротирозине Х=545нм. Концентрацию рассчитывали по площади пика

Распределение нитротирозина в белках лизата.

Лизагы, приготовленные по приведенной выше методике, наносили на белковый гель - 12% акриламид в Tris-Glycine буфере (Invitrogen) вместе с маркером молекулярного веса. После прогонки геля в течении 40 минут, гель переносили на нитроцеллюлозную мембрану и далее проводили вертерн-блот анализ белкового нитротирозина по методите описанной выше

Приготовление первичной культуры гиппокампальных нейронов крыс.

Крысят (1-2дня) линии Вистар декапитировали Гиппокамп извлекали, помещали в сбалансированный солевой раствор без Са и Mg2+ (GBSS. Gibco) и измельчали Измельченные гиппокампы инкубировали в растворе Трипсин-EDTA 15 мин при 37 С Клетки диспергировали, суспензию клеток наносили на чашки и инкубировали при 37 С и 5% С02.

Основные результаты и обсуждение

Эффект окружения в белке на реакцию нитрозилирования триптофана и цистеина под действием NO.

BSA и BSA (с модифицированным 34Cys, который не может принять участие в нитрозилировании) экспозировали с водным раствором N0 в Tris-HCl буфере с рН=7 9 Первый спектр записывали немедленно после добавления раствора N0 Далее за ходом реакции нитрозилирования следили через каждые 5 минут Для сравнения использовали две концентрации NO в воде (ЮОцМ и ЮцМ) Чтобы сравнить способность нитрозилирования триптофана в различных соединениях сравнивали CBSA и синтетический пептид -FPRAWTHTGFI В случае цистеина для сравнения с BSA использовали трипегпид -глутатион.

Из данных, представленных на Рис 1 и 2., хорошо видно, что нитрозилирование триптофана протекает намного эффективнее в CBSA, чем в пептиде или отдельной аминокислоте Это подтверждает нашу идею о каталитической активности гидрофобного кора глобулярных белков в нитрозилировании аминокислот этих белков

ЮрМ NO

1

ЮОрМ NO

0.055-] O.OS

0.04

0.03 0.02 0.01

О 90

О 02 »! 0.62

ЭОО J5S 400 4S0 500 Vnm

эоо 3sc <00 «;о 50с Хли

0.025 в 02

ЮГ

400 450

500

<00 450

Рис I Спектры оптического погющения BSA и глутатиона после обработки раствором N0 (10 и ЮОмкМ) Из исходных спектров вычитали полосу поглощения соответствующую нитрозотриптофану

ЮОмМ NO

О.И CM4SA 0.2!»

0,20 0.20-

ол&. 0 IS-

0 10 ' \\ 0 10

0-0S 0.0S-

О.ОО' ^^в**"" — .0-00.

здс lie «¿о «se ' séo sic «ее Km

рврИ^Тф

100

3SO 400

A, я*

10|JM NO

о a»

lie <6o ' iîo lio

lèo

150 400

V-»

459

Pue 2 Спектры погпощепия защищенного по цистеину сBSA и пептида, содержащего триптофан посче обработки раствором NO (Юн 100 мкМ)

Зависимость скорости нитрозилирования от концентрации NO.

Для того, чтобы продемонстрировать эффект нитрозилирования в белках мы построили график зависимости отношения скорости нитрозилирования аминокислоты в BSA к скорости нитрозилирования аминокислоты в составе пептида W=WBsaAVAa от концентрации NO На Рис 3 показано, что при уменьшении концентрации NO отношение стремится к бесконечности, в условиях низких физиологических концентраций N0 в ор|анизме реакция нитрозилирования аминокислот должна идти преимущественно только в белках.

fi»

Cys-NO

1 la' te* [soi ,пм

fer*

Trp-NO

to1 in* i [HO] ,nM

Рис 3 Зависимость отношения скорости нитрозипирования в белке к скорости нитрогипирования в пептиде от концентрации N0

Использование ANSA в качестве зондов для определения N?Cb внутри гидрофобной Фазы белка.

Известные флуоресцентные красители на основе ANSA были применены нами для обнаружения N2O3 по реакции диазотирования ANSA Применялись два ANSA производных с различной гидрофобностью заместителей (см рис 4) Для наблюдения за продуктами реакции диазотирования применялся метод тонкослойной хроматографии При прибавлении раствора N0 к растворам ANSA в результате реакции образуется соединение, которое представляет собой две молекулы ANSA, соединенные диазониевым мостиком Они образуются по реакции присоединения диазоний катиона к другой молекуле ANSA Ьсли раствор N0 добавить в смесь ANSA I и II, то регистрируются продукты смешанного присоединения, что хорошо отражается на хроматограмме Если к этой системе добавить BSA, то в смеси ANSA отсутствуют продукты присоединения гидрофобной ANSA II Это говорит о том, что в отличие от гидрофильной ANSA 1, ANSA 11 реагирует с белком Прореагировав с белком, ANSA II не может уже двигаться в условиях тонкослойной хроматографии, поэтому мы не наблюдаем продуктов ANSA II на хроматограмме Это полностью подтвердает нашу идею о накоплении N2O3 внутри гидрофобных участков белков.

хроматограмме

Кроме того, что ANSA являются удобными соединениями для наблюдения за образованием NiO, внутри белков, мы решили, что способность образовывать диазосоединения внутри белков может приводив к исполыованию таких соединений для инактивации белков Учитывая, что в очаге воспаления активируется синте* N0, представляется возможным использовать ANSA в качестве антибиотика. Нами были проведены эксперименты с микрооргани)мами Bacillus Subtilis . которые имеют в своем составе NO-синтазу и способны продуцировать N0 Действительно было показано, что гибель бацилл составила 3 порядка от исходного их кочичества при экспозиции с 20 мкг/мл дозами гидрофобных ANSA. При уюм 1идрофильные ANSA не оказывали бактерицидного действия на бациллы Кроме того, добавление аргинина, субстрата NOS, вызывало усиление действия ANSA на порядок (в 30 раз), что говорит о NO-природе действия ANSA. Определение коэффициента распределения для NO в системе альбумин/вода. Для того, чтобы напрямую продемонстрировать способность BSA аккумулировать внутри себя N0. мы измерили равновесный коэффициент распределения N0 между водой и альбумином Для этого мы использовали установку для генерации точного количества NO, применяемую нами для калибровки селективного NO-электрода. В ответ на введение в систему альбумина происходило понижение уровня N0 на 1 7 мкМ по сравнению с уровнем N0 в воде рис 6 Для определения объема гидрофобной фазы альбумина мы использовали программу Weblab viewer pro 5.0. которая рассчитывала объем, образованный кластером гидрофобных аминокислотных остатков в альбумине. Пересчитав концентрацию N0 в

гидрофобной фазе на рассчитанный программой объем, и поделив на концентрацию N0 в воде, мы получили искомый коэффициент Ош~120. Следует сказать о больших погрешностях в определении объема гидрофобной фазы с помощью программы, а также возможность существования кислорода внутри сухого альбумина Эти факторы могут завысить реальный коэффициент распределения. Однако, в любом случае, полученный коэффициент показывает, что N0 является гидрофобным газом и имеет сильное сродство к 1идрофобным участкам белка. Реакция с кислородом является тримолекулярной и зависимость ускорения реакции в гидрофобной фазе от коэффициента распределения N0, поэтому, является квадратичной (\¥н/\УН2о-к*(52мо*<Зо2). Если подставить коэффицие1ГГ (}мо~100 в уравнение, то ускорение реакции можно ожидать в 104 раз, что позволяет реакции окисления N0 кислородом конкурировать с другими реакциями N0 в условиях организма.

[ОД/1

àxV

[WQU, Vhx[NO]

О

/

I 1-Н20

I 2-BSA

! 3-plasma

; 4-cwbsa

J

О 10 20 30 40 50 t, sec

Рис б Определение коэффициента распределения NO в системе альбумин/вода

Катализ образования иитрозотиолов под действием BSA насыщенного NO.

Существует большая проблема в понимании механизма образования иитрозотиолов в организме Прямая реакция тиолов с NO не идет, поскольку существует запрет по спину Окисление N0 кислородом долгое время считалось маловероятным процессом, так как реакция является тримолекулярной, а образовавшийся в водном окружении N2O3 быстро гидролизуется водой до нитрита Из этих предпосылок невозможно объяснить наблюдаемые в крови 100 наномолярные количества иитрозотиолов Мы показали, что в гидрофобных участках реакция NO с кислородом ускоряется более чем в 10000 раз и образованный в ходе этой реакции N2O3 защищен от гидролиза гидрофобным окружением Это повышает время жизни N20, в организме и вероятность нитрозилирования тиолов возрастает Действительно, было найдено, что присутствие BSA в растворе N0 приводит к образованию иитрозотиолов, причем эффект зависит от исходной концентрации тиолов рис 6 В качестве тиолов мы использовали наиболее распространенные в организме цистеин и глутатион Переход тиолов под действием альбумина и N0 в нитрозотиолы также объясняет известные эффекты тиолов на давление крови.

/

H

M «в H 70

ОуктМ

У

..4 --

II

i

ОвНяМ

Рис б Катализ образования нитрозотиолов под действием BSA Участие различных путей в переносе NO* из гидрофобной фазы.

Как уже нами было показано ранее, альбумин может аккумулировать NO и ускорять его окисление до N1O3. При этом N1O3 стабилизируется внутри белка, поскольку он экранирован от молекул воды, вызывающих его гидролиз. Это приводит как к нитрозилированию собственных аминокислот, таких как триптофан и цистеин. так и к переносу NO+ на внешние нуклеофилы (ANSA, тиолы) Кроме того, известно, что тиолы обладают возможностью участвовать в реакции транснитрозилирования, когда частица N0+ переходит с одного тиола на другой. Мы рассмотрели, какой путь наиболее предпочтителен для переноса N0+ из гидрофобной фазы Для ответа на этот вопрос нами были синтезированы ковалентно модифицированные альбумины Модификации подвергались аминокислоты Cys34 и Тгр214, входящие в состав альбумина. Это приводило к тому, что модифицированные аминокислоты не могли участвовать в реакции нитрозили^ования Таким образом, были получены, CBSA - модифицированный по цистеину. BSA -модифицированный по триптофану и CWBSA - модифицированный по двум аминокислотам, альбумины Эти модифицированные альбумины сравнивались с немодифицированным BSA по способности производить нитрозотиолы Было выяснено, что даже полностью модифицированный CWBSA способен производить нитрозотиолы приблизительно с 30% эффективностью от ^модифицированного rBSA и WBSA показали приблизительно равную способность образовывать нитрозотиолы с эффективностью около 70% от BSA рис 7 Таким образом получается что при больших концентрациях тиолов (6-20 мМ) вклад каждого и ï путей равновероятен (30-40%) Тогда как при физиологических концентрациях гиолов(<2мМ) в основном происходит прямое нитрозилирование тиолов внутри белка

18 1в

i

«

""BSA

0 -l> » *

•tttffer

0 s

s

10

15

20

G3H, mM

Pue 7 Вклад разчичных путей выхода NО+ из альбумина в синтез нитрозотиояов Тиолы уменьшают время жизни N2O3 внутри белка и способны восстанавливать питрозопроизводные цистеина и триптофана, которые получаются под действием N0

Участие NO в нитровании тирозииовых остатков в белках.

Долгое время считалось, что нитротирозин, образующийся во многих патологических процессах, является лишь маркером пероксинитрита. Пероксинитрит образуется в быстрой реакции N0 с супероксид анионом и является заряженным радикалом. Реакция его с тирозином белков проходит очень быстро и в результате образуется нитротирозин Однако в последнее время широко обсуждаются и другие способы возникновения нитротирозина в белках Мы нашли, Что раствор N0 при добавлении к альбумину приводит к синтезу нитротирозина Для этого мы обрабатывали раствор BSA (25мкМ) раствором N0 (ЮОмкМ) и раствором пероксинитрита (ЮОмкМ) (для положительного контроля) Оказалось, что NO вызывает нитрование тирозина в белке, но эта реакция имеет более медленную кинетику, чем в случае с пероксинитритом (рис 8) Благодаря медленной кинетике мы предположили следующий механизм NO попадая в гидрофобную область альбумина сначала окисляется до^Оч Затем происходи! стадия образования лабильного нитрозотирозина, который далее медленно окисляется кислородом до нитротирозина (рис 8). Чтобы подтвердить эту гипотезу, следует доказать: I- что эта реакция зависит от гидрофобной фазы белка. 2 -зависимость 01 нахождения N2O3 внутри белка

Рис 8 Реакция тирозиповоро остатка с N0 Вестерн-блот анализ образования нитротирозина в альбумине под действием N0 и пероксинитрита

Различие в реакции нитрования тирозина между N0 и пероксинитритом.

Методом ВЭЖХ, независимо 01 вестерн-блот анализа, было показано, чго накопление тирозина в белке имеет разную кинетику в случае N0 и пероксинитрита (рис 9 правый график) Для того, чтобы доказать участие гидрофобной фазы белка в этом процессе, мы обрабатывали клеточный лизат с помощью N0 и пероксинитрита. После обработки, лизат наносился вместе с маркером молекулярного веса на гель, и после прогонки подвергался вертерп-блот анали)у на нитротирозин Из рис 9 видно, что в случае пероксинитрита нитрование идет неселективно, те. ему подвергаются все белки клетки В случае N0 нитруются лишь белки с большой молекулярной массой, те белки, которые имеют большую вероятность образования гидрофобной области внутри

Рис 9 Разтчие в кинетике и целях для нитрования тирозина под действием N0 и пероксынитрита

Помимо альбумина мы исследовали такой белок как СИР в реакции нитрования тирозина Структура ОРР гтредставчяет собой полый цилиндр, внутри которого свободно перемещаются молекулы воды Благодаря такой структуре, С^Р не может образовывать гидрофобные области Обработка ОРР пероксинитритом приводит к нитрованию белка, в то время как обработка N0 никак не влияет на уровень нитротирозина в ОРР Таким образом, нами подтверждено участие гидрофобной фазы в нитровании тирозина под действием N0 Участие тиолов в реакции нитрования шрозипа.

Доказав участие гидрофобной фазы в нитровании тирозина надо также подтвердить влияние Ы203 на этот процесс. Как мы уже установили, внешние нуклеофилы могут уменьшать время жизни и концентрацию Ы20з внутри глобулярных белков, причем на концентрацию N0 внутри белка тиолы не могут оказывать действия Таким образом, используя внешние тиолы для ¡абирания N203 из гидрофобной фазы, мы можем влиять на эффективность нитрования В ходе эксперемента мы выяснили, что цистеин добавленный в раствор сразу же после добавления N0, полностью ингибирует реакцию нитрования тирозина (4й ряд рис 10) Если цистеин добавить по прошествии 30 минут с начала реакции с N0, то это никак не повлияет на реакцию нитрования (Зй ряд рис 10) Это полностью подтверждает нашу гипотезу, поскольку немедленно введенный в реакцию цистеин приводит к быстрому выводу N0+ из белка и предотвращает реакцию нитрозилирования тирозина Позднее добавление цистеина не влияет на скорость нитрования, так как образовавшись, нитрозотирозин далее окисляется в нитротирозин уже без участия Ы20;

Рис 10 Влияние тиолов на реакцию нитрования тирозина в белке

Кроме этого, было сделано важное наблюдение, что в случае действия на альбумин пероксинитрита наблюдается уменьшение сигнала нитро тирозина после обработки апьбумина цистеином (ряд 1 и 2 рис 10) Это наблюдение позволяет нам сделать вывод, что реакция нитрования тирозина является обратимой. Нами был предложен механизм для реакции денитрования, который предусматривает первоначальное двухэлектронное восстановление нитротирозина с помощью тиолов до нитрозотирозина и дальнейшую реакцию транснитрозилирования на следующую молекулу тиола (схема 1)

2)

RSH (H*,e)

Остается вопрос, почему цистеин не участвует в денитровании белка, обработанного NO. Мы предположили, что это происходит потому, что в случае заряженного пероксинитрита атака белка идет со стороны водной оболочки белка, и подвергшиеся этой атаке тирозины также доступны для внешних тиолов, тогда как действие N0 происходит изнутри белка и приводит к нитрованию тирозинов, труднодоступных для внешних тиолов Чтобы подтвердить эти реакции не только in vitro, но и in vivo, мы провели несколько экспериментов на прокариотических и эукариотических клетках

Зависимость уровня нитоотирозина в клетках Е coli от присутствия тиолов в питательных средах.

Клетки Е coli были выращены в среде LB до 0 9 единиц оптической плотности на Х=600нм. После чего клетки были осаждены центрифугированием и вновь рассеяны в различные среды Среда LB содержит обычное количество тиолов; М9 содержит только минералы, глюкозу и не содержит тиолов; M9+Cys аналогична М9 только с добавлением цистеина После инкубации в этих средах в течении 4 часов клетки лизировали, полученный лизат анализировали на общее содержание нитротирозина Было найдено, что в LB и M9+Cys уровень нитротирозина достоверно не различался, а в среде М9, где отсутствовали тиолы, наблюдалось увеличение уровня нитротирозина в ~2 5 раза (рис. II) Если клетки дополнительно обработать 50мкМ NO, то в случае сред LB и M9+Cys увеличение содержания нитротирозина не происходит, а в случае с М9 уровень нитротирозина повышает в I 5 раза Это показывает, что тиолы в клетке необходимы для уменьшения содержания N2O3 в белках и предотвращения нитрования белков

Рис ¡1 Влияние питательной среды на уровень нитротирозина в клетках

Восстановления нитротирозина в культуре нейронов с помощью тиолов при различных нитрозилируюших стрессах.

Мы моделировали два разных нитрозилируюших стресса. В одном случае мы обрабатывали культуру нейронов раствором N0, в другом случае клетки подвергались воздействию пероксинитрита. Для того, чтобы усилить эффект нитрозилируещего стресса, культуру в течении 1 часа отмывали от тиолов сывороткой не содержащей цистеин и метионин. После 40 минут нитрозилируюшего стресса к клеткам добавляли ЮмМ цистеина и инкубировали в течении I часа После этого клетки разрушали, в полученном клеточном лизате определяли уровень нитротирозина Было найдено, что и N0, и пероксинигрит вызывают увеличение уровня нитротирозина в нейронах по сравнению с контролем (рис 12) Однако, цистеин сильно уменьшает уровень нитротирозина только в случае с клетками обработанными

пероксинитритом В контроле также наблюдается уменьшение уровня нитротирозина, но не в такой степени, как в пероксинитритной группе В группе с клетками, обработанными N0, уровень нитротирозина не изменился Данные результаты показывают, что в условиях недостатка по тиолам, стресс вызванный N0 наиболее опасен для клеток, потому что приводит к необратимому нитрованию белков Тогда как нитрование белков вызванное пероксинитритом можно лечить с помощью введения тиолов

Рис 12. Восстановление нитротирозина в клетках при различных нитрозилирующих стрессах

Корреляция между различными способами нитрования белков в клетках и выживаемостью клеток.

Используя такой же протокол, как и в экспериментах с нейронами на клетках мышиных фибробластов мы пытались выяснить не влияние на уровень нитротирозина, а корреляцию с клеточной гибелью. Для этого, после нитрозилирующего стресса и инкубации с тиолами клетки обрабатывали краской, с помощью которой определяли уровень живых клеток Из рис. 13. видно, что эффект тиолов сильнее выражен, если клетки подвергались воздействию пероксинитрита Клетки, обработанные N0, практически не восстанаваются под действием тиолов Известно, что высокий уровень нитрования белков может вызвать перегрузку протеасом, и это приводит к запуску программной гибели клеток - апоптозу. Нитрование большого количества белков приводит к потере их функций и может стать причиной развития некроза клетки. Таким образом, реакция денитрования может улучшить ситуацию для клеток, находящихся перед стадией некроза или апоптоза.

ВНК

control

NO ONOO

Put 13 Влияние нитрошпирующеро стресса и тиолов на выживаемость клеток

Заключение

Проведенные исследования показали, что N0 действительно накапливается в гидрофобных областях белков При этом ускоряется его окисление с помощью кислорода, в результате реакции образуется Nj03, который стабилизирован в гидрофобной фазе. Такая стабилизация N2O3 ведет к самонитрозилированию белком таких сильных нуклеофилов, как цистеиновый и триптофановый остаток. Кроме нитрозилирования собственных аминокислот, глобулярный белок способен переносить N0+ на внешние нуклеофилы, такие как ANSA и тиолы. Реакции с ANSA может приводить к выводу белка из строя, поэтому эти соединения перспективные для использования в качестве антибиотиков Кроме того, современные антибиотики приводят к ингибированию одного фермента, a ANSA инактивирукл сразу множество белков с гидрофобными участками. Было показано, что N0+ может быстро передаваться на внешние тиолы по трем путям; напрямую из гидрофобной фазы, через транснитрозилирование с нитрозоцистеина и нитрозотриптофана белка. Таким образом, уровень N2O3 внутри белка сильно падает в присутствии тиолов. Кроме реакции нитрозилирования было доказано, что N0 приводит к нитрованию тирозиновых остатков в белках с гидрофобной областью Реакция с N0 приводит к медленному накоплению нигротирозина, и тиолы могут ингибировать этот процесс, путем удаления N2Oi из гидрофобной фазы. Показано, что нитрование с помощью пероксини грига и N0 приводит к образованию нитро тирозина с различной локализацией в белке. Кроме того, тиолы способны восстанавливать нигротирозин, однако большую роль в этом процессе может играть локализация нитротирозина Образованный под действием N0 нитротирозин располагается внутри белка и труднодоступен для внешних восстановителей, тогда как заряженный пероксинитрит приводит к образованию нитротирозина на поверхности белка и

такой нитротирозин преимущественно восстанавливается с помощью тиолов. Все эти данные хорошо коррелируют с данными in vivo.

Выводы

1. Впервые было показано, что при инкубации альбумина с раствором N0 (10-IOOOmkM) эффективно нитрозилируются цистеин и триптофан внутри белка и эффективность этого процесса возрастает с уменьшением концентрации N0. Следовательно, при физиологических концентрациях NO процесс нитрозилирования идет только в белках имеющих гидрофобные области

2. Впервые был разработан новый тип антибиотиков на основе [идрофобных синтетических нафталинсульфаниламидов (ANSA), которые приводят к инактивации белков за счет образования кросслингующего реагента с частицей N0+

3. Установлено, что коэффициент распределения N0 между фазами - альбумин/вода равен Q~120. Таким образом, реакция окисления NO внутри гидрофобного участка альбумина должна ускорится как минимум в 104 раз. Различные модифицированные альбумины (BSA, CBSA, WBSA, C,VBSA) способны переносить N0+ на внешний тиол с разной эффективностью, следовательно, передача NO+ идет по тем путям' 1- прямо из гидрофобной области, 2- через Cys34, 3- через Ттр204

4. При мгновенном добавлении тиолов (в течение первых минут после экспозирования белка с N0) образование нитротирозина полностью ингибируется, тогда как добавление тиолов спустя 30 минут не влияет на реакцию нитрования тирозина

5. Было найдено, что в случае гидрофильной частицы - пероксинитрита - белок атакуется со стороны водной фазы и образованные нитротирозины легкодоступны для внешнего восстанавливающего агента. N0 приводит к нитрованию тирозинов внутри белка и тиолы не оказывают восстанавливающего действия на нитротирозин Это приводит к тому, что при уменьшении внутриклеточного уровня тиолов клетки становятся чувствительными к действию N0 на модификацию белков путем их нитрования.

6. Результаты работы позволили установить, что добавление тиолов к клеткам приводит к восстановлению жизнедеятельности клеток, подвергшихся нитрозилирующему стрессу. В случае действия пероксинитрита. как нитрозилирующего реагента, восстановление происходит более полно, чем в случае N0.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

I. Беда Н.В., Гордин В.А., Недоспасов А.А, Рафиков Р.Р , Рафикова О В., Сунцова Т. П. Метод одноэлектронного окисления оксида азота при помощи мицеллярного катализа.// Патент 99119464. Россия. 1999.

2 Nedospasov A., Rafikov R, Beda N., Nudler E An autocatalytic mechanism of protein nitrosylation // Proceedings of the National Academy of Sciences 2000. V.97 N.25. P. 1354313548.

3 Rafikova O., Rafikov R., Nedospasov A, Nudler E Regulation of the nitric oxide cycle in mammals by the hydrophobic phase// The first international conference on the Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide Addendum. San Francisco USA. 2000. P. 16.

4 Beda N V., Gordtn V.A., Nedospasov A.A., Rafikov R.R., Rafikova О V. and Suntsova T.P. A Method for modulating metabolism of nitric oxide, a composition for realizing thereof (variants) and a method for effecting organism. // Patent PCT/RU 00/00362 USA. 2000.

5 Rafikova O., Rafikov R , Nudler F Plasma albumin and S-nitrosothiols formation // Gordon conference: Biochemistry of Nitric Oxide Ventura USA. 2001 P.93

6. Rafikova O., Rafikov R., Nudler E. Catalysis of S-nitrosothiols formation by serum albumin The mechanism and implication in vascular control.// Proceedings of the National Academy of Sciences. 2002. V.99. N.9. P.5913-5918.

7. Rafikova O., Rafikov R., Nudler E. Catalysis of S-nitrosothiols formation by serum albumin the mechanism and implications in vascular tone control.// Second International Conference of the Nitric Oxide Society. Prague. Czech Republic. 2002. P.83.

8 Rafikova O., Rafikov R., Nudler E Control of plasma NO bioactivity by perfluorocarbons. physiological mechanisms and clinical implications//Circulation 2004 V110 N.23. P 35733580.

9 Rafikova О, Rafikov R , Nudler E Catalysis of S-nitrosothiols formation by serum albumin-The mechanism and implication in vascular control.// The third international conference on the Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide. Nara. Japan. 2004. P 117.

10 Rafikova О , Rafikov R , Nudler E Control of plasma NO bioactivity by perfluorocarbons physiological mechanisms and clinical implications // The third international conference on the Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide. Nara. Japan. 2004. P. 192

II. Рафикова О , Рафиков P , Нудлер E. Альбумин плазмы как активное депо оксида азота и катализатор синтеза нитрозотиолов. Роль альбумина в регуляции сосудистого тонуса.// Российский физиологический журнал 2004. Т 90. № 8. С.274-278.

12 Рафикова О, Рафиков Р Перфторуглеводороды как способ контроля уровня оксида азота. Использование для предуперждения и лечения нарушений коронарного кровотока и постишемических повреждений миокарда // Третий Российский конгресс по патофизиологии. Москва. 2004. С. 58

/ ¡П Cf ? С4 (Ci;jL

£-6 78 7

РНБ Русский фонд

2006-4 4643

Подписано в печать 15.04.2005 Объем 1.5 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ № 62 Отпечатано в ООО «Соцве гие красок» 119992, г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к.102

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Рафиков, Руслан Робертович

1. Введение

1.1. Актуальность исследования

1.2. Цель и задачи настоящего исследования

1.3. Научная новизна

1.4. Научно-практическое значение

2. Обзор литераруры

2.1. Введение

2.2. Основные этапы изучения оксида азота

2.3. Синтез N0 в оганизме

2.3.1 N0 - синтазный путь

2.3.2 Несинтазный путь синтеза N

2.4. Общие физико-химические характеристики N

2.5 Активные метаболиты NO

2.6 Окисление NO кислородом

2.7 Окисление NO переходными металлами

2.8 Нитрозилирование белков

2.9 Образование пероксинитрита

2.10 Нитрование белков

2.11 Денитрование нитротирозина

2.12 Выводы литературного обзора

3 Методики экспериментов

3.1 Приготовление раствора NO в воде

3.2 Приготовление раствора пероксинитрита

3.3 Синтез защищенных по триптофану wBSA, cwBSA

3.4 Сперктоскопическое определение продуктов нитрозилирования BSA

3.5 Тонкослойная хроматография производных ANSA

3.6 Определение нитрозотиолов

3.7 Определение нитрозотирозина методом Вестерн-блот анализа

3.8 Определение нитротирозина методом HPLC

3.9 Распределение нитротирозина в белках лизата

3.10 Приготовление первичной культуры гиппокампальных нейронов крыс.

3.11 Определение коэффицента распределения NO (Qno)

4 Результаты и обсуждение

4.1 Эффект окружения в белке на реакцию нитрозилирования триптофана и цистеина под действием N

4.2. Зависимость скорости нитрозилирования от концентрации NO

4.3 Использование ANSA в качестве зондов для определения N203 внутри гидрофобной фазы белка

4.4 Определение коэффициента распределения для NO в системе альбумин/вода

4.5 Катализ образования нитрозотиолов под действием BSA насыщенного NO

4.6 Участие различных путей в переносе N0+ из гидрофобной фазы.

4.7 Участие N0 в нитровании тирозиновых остатков в белках.

4.8 Различие в реакции нитрования тирозина между N0 и пероксинитритом

4.9 Участие тиолов в реакции нитрования тирозина.

4.10 Зависимоть уровня нитротирозина в клетках Е coli от присутствия тиолов в питательных средах

4.11 Восстановления нитротирозина в культуре нейронов с помощью тиолов при различных нитрозилирующих стрессах

4.12 Корреляция между различными способами нитрования белков в клетках и выживаемостью клеток

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм автокаталитического нитрозилирования и нитрования аминокислот в составе белков с гидрофобными участками"

Актуальность исследования. Л) Оксид азота обладает широким спектром действия на различные защитные и регуляторные системы организма. Открытая вначале регуляция N0 сосудистого тонуса, оказалась лишь верхушкой айсберга. Сейчас довольно хорошо изучено участие NO в воспалении, в передаче сигнала в нейронах, в регуляции активности множества ферментов и рецепторов. Молекула N0 является радикалом, однако не обладает высокой реакционноспособностью, характерной для радикала. В организме N0 может реагировать с высокой скоростью лишь с радикалами и переходными металлами. Долгое время реакцию NO с кислородом исключали из рассмотрения, поскольку эта тримолекулярная реакция имеет низкую эффективность и не может конкурировать с реакциями, в которых участвуют радикалы и ионы переходных металлов. В последнее время появились работы, в которых показано ускорение тримолекулярной реакции N0 с кислородом в гидрофобных фазах, присутствующих в организме, таких как липидные частицы, мембраны f; клеток (Lancaster Jr JR. 1997, Недоспасов А., 1998). Благодаря своей гидрофобной природе кислород и NO накапливаются в гидрофобных веществах, и реакция окисления NO ускоряется за счет эффекта концентрирования, это явление получило название «мицеллярный катализ». Весьма актуальной и неисследованной областью представляется участие белковых гидрофобных участков в «мицеллярном KaTajm3e» ..у окисления N0. Многие ферменты, в регуляции которых участвует NO, не имеют металлических центров или показано, что NO не взаимодействует с металлическим центром. Поэтому в данных системах возникает вопрос о механизме действия NO на такие белки.Наиболее распространенным регуляции V Показано, белков с помощью нитрозопроизводного цистеинового и исследованным N0 остатка является механизмом образование в белке, нитрозоцистеина. например, что нитрозилирование цистеина ответственном за функционирование кальциевых каналов, влияет на выход кальция из скелетной мышцы (Sun J. 2003). Однако, на главный вопрос каков механизм образования нитрозоцистеина, если N0 и цистеин не реагируют между собой непосредственно ответа до сих пор нет. Поэтому, интересной и совершенно неисследованной проблемой является связь между модифицированием с помощью NO аминокислот в составе белков и окислением N0 в гидрофобных участках белков. При окислении NO кислородом, конечным продуктом реакции является N2O3 вещество, известное как сильнейший нитрозилирующий агент. Таким образом, белки, связанные с мембраной или имеющие, гидрофобные участки могут нитрозилировать свои собственные аминокислоты благодаря реакции окисления NO в этих гидрофобных областях. Установлено, что низкомолекулярные нитрозотиолы, такие как нитрозоцистеин и нитрозоглутатион, могут играть в организме роль, схожую с NO. Они расслабляют сосуды, уменьшают свертываемость крови; то есть действие этих соединений однонаправлено с действием N0. Однако, время жизни нитрозотиолов в физиологических средах на порядки длиннее, чем у NO и, кроме того, у них отсутствует многие отрицательные свойства N0, такие как образование пероксинитрита и ингибирование ферментов с металлическими центрами. Механизм образования дискутируется. Кроме очень хорошо исследованной модификации с помощью NO цистеиновых остатков, существует еще одна аминокислота триптофан, которая является сильным нуклеофилом и может модифицироваться в таких низкомолекулярных тиолов до сих пор белках под действием NO. Хотя, на сегодняшний день существует лишь небольшое количество работ, посвященных модификации триптофана оксидом азота, эта область становится, в последнее время, очень привлекательна для исследователей. Известно, что нитрозотриптофан расслабляет гладкие мышцы и уменьшает агрегацию тромбоцитов, что говорит о его действии, похожем на действие N0. Механизм образования и распада нитрозотриптофана в физиологических условиях также совершенно не изучен. Огромной проблемой в области исследования N0 является понимание процессов многих и образования и путей деградации такого Его метаболита NO, как нитротирозин. Известно, что нитротирозин является jy маркером реперфузии патологических процессов в организме. накопление в клетках наблюдают в месте воспаления, при ишемиинейродегенеративных в первую очередь, заболеваниях. связывают с Образование образованием нитротирозина, пероксинитрита, который получается в реакции NO с супероксид анионом. Нитротирозин является стабильным метаболитом и его накопление приводит к запуску программной гибели клетки апоптозу. Однако, поскольку и в здоровой ткани наблюдается небольшой уровень нитротирозина, исследователей этот факт приводит вопрос о тому, что многих возникает механизме деградации нитротирозина. Сейчас большое количество публикаций посвящено поиску путей неинзиматеческого восстановления нитротирозина (Murad F. 1998) или поиску фермента «денитразы» (Ischiropoulos Н. 2001). Таким образом, актуальность и перспективность исследования механизмов модификации аминокислотных остатков под действием NO в белках представляет интерес для широкого круга исследователей связанных с физиологией, биохимией и медициной.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Рафиков, Руслан Робертович

1. Впервые было показано, что при инкубации альбумина с раствором NO (10-1000мкМ) эффективно нитрозилируются цистеин и триптофан внутри белка и эффективность этого процесса возрастает с уменьшением концентрации NO.Следовательно, при физиологических концентрациях N0 процесс нитрозилирования идет только в белках имеющих гидрофобные области.2. Впервые был разработан новый тип антибиотиков на основе гидрофобных синтетических нафталинсульфаниламидов (ANSA), которые приводят к инактивации белков за счет образования кросслингующего реагента с частицей NO+.3. Установлено, что коэффициент распределения NO между фазами • альбумин/вода равен Q120. Таким образом, реакция окисления N0 внутри гидрофобного участка альбумина должна ускорится как минимум в 10 раз. Различные модифицированные альбумины (BSA, '^ BSA, "'BSA, '^ "'BSA) способны переносить NO+ на внешний тиол с разной эффективностью, следовательно, передача NO+ идет по тем путям: 1- прямо из гидрофобной области, 2- через Cys^\ 3- через Тгр^"^

4. При мгновенном добавлении тиолов (в течение первых минут после экспозирования белка с N0) образование нитротирозина полностью ингибируется, тогда как добавление тиолов спустя 30 минут не влияет на реакцию нитрования тирозина.5. Было найдено, что в случае гидрофильной частицы -

пероксиьштрита - белок атакуется со стороны водной фазы и образованные нитротирозины легкодоступны для внешнего восстанавливающего агента. N0 приводит к нитрованию тирозинов внутри белка и тиолы не оказывают восстанавливающего действия на нитротирозин. Это приводит к тому, что при уменьшении внутриклеточного уровня тиолов клетки становятся чувствительными к действию N0 на модификацию белков путем их нитрования.6. Результаты работы позволили установить, что добавление тиолов к клеткам приводит к восстановлению жизнедеятельности клеток, подвергшихся нитрозилирующему стрессу. В случае действия пероксинитрита, как нитрозилирующего реагента, восстановление происходит более полно, чем в случае N0.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Рафиков, Руслан Робертович, Москва

1. Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы л две возможные формы стабилизации и транспорта оксида азота в биологических системах Биохимия. 1998. V.63. N7. Р.782793

2. Ванин А.Ф. Окись азота в биологии: история, состояние и перспективы исследования Биохимия. 1998. Т.63. N7. 867869 З.Ванин А.Ф., Барич В.И. Образование нитрозильных комплексов негемового железа (комплексы 2.03) в такнях животных in vivo Биофизика. 1979. V.24. N4. Р.666-670

3. Ванин А.Ф., Стукан Р.А., Манухина Е.Б. Димерные и мономерные формы динитрозильных комплексов железа с тиол содержащими лигандами: физико-химические свойства и вазодилататорная активность Биофизика. 1997. V.42. N1. Р. 10-21 З.Волин М.С., Дэвидсон К.А., Камински П.М., Фейнгерш Р.П., Мохаззаб-Х К.М. Механизмы передачи сигнала оксидант оксид азота в сосудистой ткани Биохимия. 1998. Т.63. N7. 958965 б.Голубев A.M., Васильев А.Э. 151

5. Горрен А.К.Ф., Майер Б. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота Биохимия. —998. —63. —С. 870—880 А.К.Ф., Майер Б. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота Биохимия. —998. —63. —С. Медико-биологические аспекты применения эмульсий перфторуглеродов Пущино. 1983. 136- 63

6. Клигупенко Е.Н., Бижно И.П., Слинченков В.В., Лещев Д.П. О некоторых механизмах действия перфторана в остром периоде термической травмы Перфторорганические соединения в биологии и медицине. 1

8. Кузнецова способность И.Н., Борисова эмульсии И.В. Взаимодействие сыворотки побочные реакции частиц крови и при перфторуглеродной с белками основа функционирования перфторуглеродной "искусственной крови" Биофизика. 1996. Т.41. N1. 178- эмульсий вызывать внутривенном введении Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине. 1997. 65-66

9. Ладилов Ю.В.,Исламов Б.И., Воробьев СИ., Иваницкий Г.Р. Влияние различных доз эмульсии перфторуглеродов на гемодинамику и сократимость ишемического сердца. Бюлл. эксперимент. Биол. и медицины. 1992. Т.6. 593-595

10. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Маленюк Е.Б., Зенина Т.А., Покидешев Е.А. Гипотензивное действие и тканевое распределение донора оксида азота динитрозильных комплексов железа (ДКЖ) Бюл. эксперм. биол. и мед. 1998. V. 125. N1. Р.30-33

11. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Маленюк Е.Б., Зенина Т.Д., Покидешев Е.А. Гипотензивное действие и тканевое распределение донора оксида азота динитрозильных комплексов железа (ДКЖ) Бюл. эксперм. биол. и мед. 1998. V. 125. N1. Р.30-33 64

12. Недоспасов А.А. Биогенный NO в конкурентных отношениях Биохимия. 1998. V.63. N7. Р.881-904

13. Недоспасов А.А. Биогенный N0 в конкурентных отношениях Биохимия. 1998. V.63. N7. Р.881-904

14. Панченко СМ. Состояние системы гемокоагуляции после инфузии эмульсии перфторированных органических соединений Автореф. дис. канд. мед. наук. НИИ гематологии и переливания крови. Ленинфад. 1990

15. Плужнынов Н.Н, Софронов Г.А. Фармокологическая коррекция состояния антиоксидантной системы организма Патофизиология экстремальных состояний. 1993. 108-113

16. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Косицын Н. С Охотин В.Е. Проблема оксида азота в биологии и медицине и принцип цикоичности Москва. 2003

17. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин 1

18. Реутов В.П., Сорокина Москва. 1998

19. Северина СИ. Растворимая гуанилатциклаза в молекулярном механизме физиологических эффектов оксида азота Биохимия. 1998. Т.63. N7. С 939-947 65 В.Е., Косицын Н. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих Е.Г., Охотин В.Е,, Косицын Н. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих

20. Стокле Ж.К., Мюлле Б., Андрианцитохайна Р., Клещев А. кровеносных Гиперпродукция оксида азота в патофизиологии сосудов Биохимия. 1998. Т.63. N7. 976-983

21. Ханевич М.Д., Софронов Г.А., Тиканадзе А.Д. и др. Применение перфторана в неотложной и плановой абдоминальной хирургии Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине. 1997. 112-113

22. Шехтман Д.Г, Сафронова В.Г, Склифас А.Н, Аловская А.А. Модифицирующее соединений нейтрофилов действие эмульсии перфторорганических сред на активность и других коркускулярных Перфторорганические соединения в биологии и медицине. 1

24. Alvarez В., Radi R. Peroxynitrite reactivity with amino acids and proteins Amino Acids. 2003. N3-4. P.295-311 "T-;

25. Ambrosio G., Weisman H.F., Mannisi J.A., Becker L.C. Progressive impairment of regional myocardial perfusion after initial restoration of postischemic blood flow Circulation. 1989. V.80. N6. P. 184661

26. Ambrosio G., Zweier J.L., Flaherty J.T. The relationship between oxygen radical generation and impairment of myocardial energy metabolism following post-ischemic reperfusion J. Mol. Cell Cardiol. 1991. V.23. N12. P. 1359-74

27. Amrani M., Chester A.H,, Jayakumar J., Schyns C.J., Yacoub M.H. Larginine reverses low coronary reflow and enhances postischaemic 66

28. Arnelle D.R., Stamler J.S. N0+, NO, and NO- donation by Snitrosothiols: implications for regulation of physiological functions by Snitrosylation and acceleration of disulfide formation Arch Biochem Biophys. 1995. V.318. N2. P.279-85

29. Arstall M.A., Sawyer D.B., Fukazawa R., Kelly R.A. Cytokine-mediated apoptosis in cardiac myocytes: the role of inducible nitric oxide synthase induction and peroxynitrite generation Circ. Res. 1999. V.85. N9. P.829-40

30. Asahi M., Fujii J., Takao Т., Kuzuya Т., Hon M., Shimonishi Y., Taniguchi N. The oxidation of selenocysteine is involved in the inactivation of glutathione peroxidase by nitric oxide donor J. Biol. Chem. 1997. V.272. N31. P. 19152-7

31. Ascenzi P., Colasanti M., Persichini Т., Muolo M., Polticelli F., Venturini G., Bordo D., Bolognesi M. Re-evaluation of amino acid sequence and structural consensus rules for cysteine-nitric oxide reactivity Biol. Chem. 2000. V.381. N7. P.623-7

32. Askew S.C, Bamett D.J., McAninly J., Williams D.L.H. Catalysis by -r; -н Cu of nitric oxide release from S-nitrosothiols (RSNO) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1995. V2. P.741 -5

33. Aversano Т., Zhou W., Nedelman M., Nakada M., Weisman H. A chimeric IgG4 monoclonal antibody directed against CD 18 reduces infarct size in a primate model of myocardial ischemia and reperfusion J. Am. Coll. Cardiol. 1995. V.25. N3. P.781-8

34. Becker L.B. New concepts V.61.-N3.-P.461-70 in reactive oxygen species and cardiovascular reperfusion physiology Cardiovasc. Res. 2004. 67

35. Beckman J.S., Beckman T.W., Chen J., Marshall P.A., Freeman B.A. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990. V.87. N4. P.1620-4

36. Beda N.V., Suntsova T.P. Micellar catalysis for oxidation of nitric oxide (NO) in the multi-phase systems in vivo FEBS Lett. 1999. V.453. -N1-2.-P.229-35

37. Bertuglia S., Giusti A. Microvascular oxygenation, oxidative stress, NO W. suppression and superoxide dismutase during postischemic reperfusion Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2003. V.285. N3. P.H106471

38. Bloch W., Mehlhom U., Krahwinkel A., Reiner M., Dittrich M., Schmidt A., Addicks K. Ischemia increases detectable endothelial nitric oxide synthase in rat and human myocardium Nitric Oxide. 2001. V.5.-N4.-P.317-33

39. Boyle M.P., Weisman H.F. Limitation of infarct expansion and Ту ventricular remodeling by late reperfusion. Study of time course and mechanism in a rat model Circulation. 1993. V.88. N6. P.287283

40. Brown G.C. Regulation of mitochondrial respiration by nitric oxide inhibition of cytochrome с oxidase Biochim. Biophys. Acta. 2001. V.1504.-N1.-P.46-57

41. Burkart V., Koike Т., Brenner H.H., Imai Y., Kolb H. Dihydrolipoic acid protects pancreatic islet cells from inflammatory attack Agents Actions. 1993. V.38. N1-2. P.60-5 68

42. Campbell D.L., Stamler J.S., Strauss H.C. Redox modulation of L-type calcium channels in ferret ventricular myocytes. Dual mechanism V: regulation by nitric oxide and S-nitrosothiols J Gen Physiol. 1996. V.108.-N4.-P.277-93

43. Cannon R.O. 3., Schechter A.N., Panza J.A., Ognibene P.P., Pease-Fye M.E., Waclawiw M.A., Shelhamer J.H., Gladwin M.T. Effects of inhaled nitric oxide on regional blood flow are consistent with intravascular nitric oxide delivery J. Clin. Invest. 2001. V. 108. N2. P.279-87 "-rj -ч44. Castro L.A., Robalinho R.L,, Cayota A., Meneghini R., Radi R. Nitric oxide and peroxynitrite-dependent aconitase inactivation and ironregulatory protein-1 activation in mammalian fibroblasts Arch. Biochem. Biophys. 1998. V.359. N2. P.215-24

45. Catani M.V., Bemassola F., Rossi A., Melino G. Inhibition of clotting factor XIII activity by nitric oxide Biochem Biophys Res Commun. 1998. V.249. N. 1. P.275-8

46. Choi Y.B., Tenneti L., Le D.A., Ortiz J., Bai G., Chen H.S., Lipton S.A. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation Nat. Neurosci. 2000. N1. P.15-21

47. Cooper C.E. Nitric oxide and iron proteins Biochim. Biophy.s Acta. 1999. V. 1411. N2-3. P.290-309 69

48. Crow J.P., Ischiropoulos H. Detection and quantitation of nitrotyrosine residues in proteins: in vivo marker of peroxynitrite Methods Enzymol. 1996. V.269. P. 185-94.

49. Crow JP, Ischiropoulos H. Detection and quantitation of nitrotyrosine residues in proteins: in vivo marker of peroxynitrite. Methods Enzymol. 1996 V269 PI85-94

50. Csonka C Szilvassy Z., Fulop F., Pali Т., Blasig I.E., Tosaki A., Schulz R., Ferdinandy P. Classic preconditioning decreases the harmful T accumulation of nitric oxide during ischemia and reperfusion in rat hearts Circulation. 1999. V.IOO. N22. P.2260-6

51. Daiber A., Herold S., Schoneich C Namgaladze D., Peterson J.A., Ullrich V. Nitration and inactivation of cytochrome P450BM-3 by peroxynitrite. Stopped-flow measurements prove ferryl intermediates Eur. J. Biochem. 2000. V.267. N23. P.6729-39 63,Depre C Fierain L., Hue L. Activation of nitric oxide synthase by ischaemia in the perfused heart Cardiovasc. Res. -.1997. V.33. N1. -P.82-7

52. Dohi K., Ohtaki H., Inn R., Ikeda Y., Shioda H.S., Aruga T. Peroxynitrite and caspase-3 expression after ischemia/reperfusion in mouse cardiac arrest model Acta Neurochir. Suppl. 2003. V.86. P.87-91

53. Duilio C Ambrosio G., Kuppusamy P., DiPaula A., Becker L.C., Zweier J.L. Neutrophils are primary source of O2 radicals during -4 reperfusion after prolonged myocardial ischemia Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2001. V.280. N6. P.H2649-57

54. Eduardo da Silva-Santos J., Assreuy J. Long-lasting changes of rat blood pressure to vasoconstrictors and vasodilators induced by nitric oxide 70

55. Estevez A.G., Spear N., Manuel S.M., Radi R., Henderson C.E., Barbeito L., Beckman J.S. Nitric oxide and superoxide contribute to motor neuron apoptosis induced by trophic factor deprivation J. Neurosci. 1998. V.18. N3. P.923-31

56. Feelisch M., Rassaf Т., Mnaimneh S., Singh N., Bryan N.S., JourdHeuil D., Kelm M. Concomitant S-, N-, and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo FASEB J. 2002.-V.16.-N13.-P.1775-85

57. Flaherty J.T., Pitt В., Gruber J.W., Heuser R.R., Rothbaum D.A., Burwell L.R., George B.S,, Kereiakes D.J., Deitchman D., Gustafson N., et al. Recombinant human superoxide dismutase (h-SOD) fails to improve recovery of ventricular function in patients undergoing coronary angioplasty for acute myocardial infarction Circulation. 1994. V.89. N5. P. 1982-91

58. Frangogiannis N.G., Lindsey M.L., Michael L.H., Youker K.A., Bressler R.B., Mendoza L.H., Spengler R.N., Smith C.W., Entman M.L. Resident cardiac mast cells degranulate and release preformed TNF-alpha, initiating the cytokine cascade in experimental canine myocardial ischemia/reperfusion Circulation. 1998. V.98. N7. P.699-71

59. Frustaci A., Kajstura J., Chimenti C Jakoniuk I., Leri A., Maseri A., Nadal-Ginard В., An versa P. Myocardial cell death in human diabetes Circ. Res. 2000. V.87. N12. P.l 123-32

60. Furukawa Т., Kohno H., Tokunaga R., Taketani S. Nitric oxidemediated inactivation of mammalian ferrochelatase in vivo and in vitro: possible involvement of the iron-sulphur cluster of the enzyme Biochem. J. 1995. V.310. Pt.2. P.533-8 71 X;

61. Garcia-Ruiz C, Femandez-Checa J.C., Kaplowitz N. Bidirectional mechanism of plasma membrane transport of reduced glutathione in intact rat hepatocytes and membrane vesicles J. Biol. Chem. 1992. V.267. N31. P.22256-64

62. Gaston В., Sears S., Woods J., Hunt J., Ponaman M., McMahon Т., Stamler J.S. Bronchodilator S-nitrosothiol deficiency in asthmatic respiratory failure Lancet. 1998. V.351. N9112. P.1317-9 Ч-"

63. Giraldez R.R., Panda A., Xia Y., Sanders S.P., Zweier J.L. Decreased nitric-oxide synthase activity causes impaired endothelium-dependent relaxation in the postischemic heart J. Biol. Chem. 1997. V.272. N34.-P.21420-6

64. Gladwin M.T., Lancaster J.R., Jr., Freeman B.A., Schechter A.N. Nitric oxides reactions with hemoglobin: a view through the SNO-storm Nat. Med. 2003. N5. P.496-500

65. Gunther MR, Sturgeon BE, Mason RP. Nitric oxide trapping of the tyrosyl radical-chemistry and biochemistry. Toxicology. 2002 V.177-Nl-P.:l-9. SS.Heyndrickx G.R. Myocardial stunning: an experimental act with a large clinical audience Arch. Mai. Coeur. Vaiss. 2003. V.96. N6. P.665-70

66. Hobbs A.J. Soluble guanylate cyclase: the forgotten sibling Trends i:, Pharmacol. Sci. 1997. N12. P.484-91

67. Hobbs A.J., Gladwin M.T., Patel R.P., Williams D.L., Butler A.R. Haemoglobin: NO transporter, NO inactivator or NOne of the above? Trends Pharmacol. Sci. 2002. N9. P.406-11

68. Hogg N. The biochemistry and physiology of S-nitrosothiols Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2002. V.42. P.585-600

69. Hogg N. The kinetics of S-transnitrosationa reversible second-order reaction Anal Biochem. 1999. V.272. N2. P.257-62

70. Huang K.T., Han Т.Н., Hyduke D.R., Vaughn M.W., Van Herie H., Hein T.W., Zhang C, Kuo L., Liao J.C. Modulation of nitric oxide bioavailability by erythrocytes Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. -V.98.-N20.-P.11771-6

71. Huhmer A.F., Nishida C.R., Ortiz de Montellano P.R., Schoneich C. Inactivation of the inducible nitric oxide synthase by peroxynitrite Chem. Re.s Toxicol. 1997. N5. P.618-26

72. Huie R.E., Padmaja S. The reaction of no with superoxide Free Radic. Res. Commun. 1993. V.18. N4. P.195-9

73. Hunt J.F., Fang K., Malik R., Snyder A., Malhotra N., Platts-Mills T.A., Gaston B. Endogenous airway acidification. Implications for asthma 73

74. Jeremy J.Y., Shukla N., Muzaffar S., Handley A., Angelini G.D. Reactive oxygen species, vascular disease and cardiovascular surgery Curr. Vase. Pharmacol. 2004. V.2. N3. P.229-36 98.Jia L., Bonaventura C, Bonaventura J., Stamler J.S. Snitrosohaemoglobin: a d)mamic activity of blood involved in vascular control Nature. 1996. V.380. N6571. P.221-6

75. Kashiba-Iwatsuki M., Yamaguchi M., Inoue M. Role of ascorbic acid in the metabolism of S-nitroso-glutathione FEBS Lett. 1996. V. 389. N 2 P 149-52 74

76. Klatt P., Lamas S. Regulation of protein function by S-glutathiolation in response to oxidative and nitrosative stress Eur. J. Biochem. 2000. V.267.-N16.-P.4928-44 llO.Konorev E.A., Hogg N., Kalyanaraman B. Rapid and irreversible inhibition of creatine kinase by peroxynitrite FEBS Lett. 1998. V.427.-N2.-P.171-4 lll.Konorev E.A., Kalyanaraman В., Hogg N. Modification of creatine kinase by S-nitrosothiols: S-nitrosation vs. S-thiolation Free Radic Biol Med. 2000. V.28. N11. P.1671-8 75

77. Kubes P., Suzuki M., Granger D.N. Nitric oxide: an endogenous modulator of leukocyte adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. -V.88.-N11.-P.4651-5 1 M.Lancaster J.R., Jr. A tutorial on the diffusibility and reactivity of free nitric oxide Nitric Oxide. 1997. N1. P. 18-30

78. Lancaster J.R., Jr. Simulation of the diffusion and reaction of endogenously produced nitric oxide Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994. V.91. N17. P.8137-41

79. Lane P., Hao G., Gross S.S. S-nitrosylation is emerging as a specific and fundamental N86. P.REl

80. Lash L.H., Jones D.P. Renal glutathione transport. Characteristics of the sodium-dependent system in the basal-lateral membrane J. Biol. Chem. 1984. V.259. N23. P. 14508-14 llS.Lee C.I., Liu X., Zweier J.L. Regulation of xanthine oxidase by nitric oxide and peroxynitrite J. Biol. Chem. 2000. V.275. N13. P.9369-76

81. Lincoff A.M., Topol E.J. Illusion of reperfusion. Does anyone achieve optimal reperfusion during acute myocardial infarction? Circulation. 1993. V.88. N 3 P.1361-74

82. Lipton A.J., Johnson M.A., Macdonald Т., Lieberman M.W., Gozal D., Gaston B. S-nitrosothiols signal the ventilatory response to hypoxia Nature. 2001. V.413. N6852. P. 171-4

83. Lipton S.A., Choi Y.B., Pan Z.H., Lei S.Z., Chen H.S., Sucher N.J., Loscalzo J., Singel D.J., Stamler J.S. A redox-based mechanism for the neuroprotective and neurodestructive effects of nitric oxide and related nitroso-compounds Nature. 1993. V.364. N6438. P.626-32

84. Mannick J.B., Schonhoff CM. Nitrosylation: the next phosphorylation? Arch. Biochem. Biophys. 2002. V.408. N1. P. 1-6

85. Mannisi J.A., Weisman H.F., Bush D.E., Dudeck P., Healy B. Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat J. Clin. Invest. 1987. V.79. N5. P.1431-9

86. Manukhina E.B., Smirin B.V., Malyshev I.I., Stoclet .JC, Muller В., Solodkov A.P., Shebeko V.I,, Vanin A.F. Nitric oxide storage in the cardiovascular system Izv. Akad. Nau.k Se.r Biol. 2002. V.9-10. N5. P.585-96

87. Marban E., Koretsune Y., Corretti M., Chacko V..P, Kusuoka H. Calcium and its role in myocardial cell injury during ischemia and reperfusion Circulation. 1989. V.80. N

89. Mori E., Haramaki N., Ikeda H., Imaizumi T. Intra-coronary л administration of L-arginine aggravates myocardial stunning through production of peroxynitrite in dogs Cardiovasc. Res. 1998. V.40. N l P l 13-23

90. Morita K., Sherman M.P., Buckberg G.D., Ihnken K., Matheis G., Young H.H., Ignarro L.J. Studies of hypoxemic/reoxygenation injury: without aortic clamping. V. Role of the L-arginine-nitric oxide pathway: the nitric oxide paradox J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1995. V.l 10. -N4.-Pt.2.-P.1200-ll

91. Muller В., Kleschyov A.L,, Alencar J.L., Vanin A., Stoclet J.C. Nitric oxide transport and storage in the cardiovascular system Ann N Y Acad Sci. 2002. V.962. N5. P. 131-9

92. Nakashima S., Tohmatsu Т., Hattori H., Okano Y., Nozawa Y. Inhibitory action of cyclic GMP on secretion, polyphosphoinositide hydrolysis and calcium mobilization in thrombin-stimulated human platelets Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. V.l35. N3. P.1099-104

93. Park J.L., Lucchesi B.R. Mechanisms of myocardial reperfusion injury Ann. Thorac. Surg. 1999. V.68. N5. P.1905-12

94. Pawloski J.R., Hess D.T., Stamler J.S. Export by red blood cells of nitric oxide bioactivity Nature. 2001. V.409. N.6820. P.622-6

95. Pawloski J.R., Swaminathan R.V., Stamler J.S. Cell-free Circulation. 1998. V.97. N3. P.263-7 ISO.Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide Arch/ Biochem/ Biophys. 1991. V.288. N2. P.4817 ISl.Radi R., Rodriguez M., Castro L., Telleri R. Inhibition of mitochondrial electron transport by peroxynitrite Arch. Biochem. Biophys. 1994. V.308.-N1.-P.89-95

96. Reffelmann and erythrocytic S-nitrosohemoglobin inhibits human platelet aggregation Т., Hale S.L., Dow J.S., Kloner R.A. No-reflow phenomenon persists long-term after ischemia/reperfusion in the rat and predicts infarct expansion Circulation. 2003. V.108. N23. P.2911-7

97. Rogers P.A., Eide L., Klungland A., Ding H. Reversible inactivation of E. coli endonuclease III via modification of its [4Fe-4S] cluster by nitric oxide DNA Repair (Amst). 2003. V.2. N7. P.809-17

98. Rubbo H., Radi R., Trujillo M., Telleri R., Kalyanaraman В., Barnes S., Kirk M., Freeman B.A. Nitric oxide regulation of superoxide and peroxynitrite-dependent lipid peroxidation. Formation of novel nitrogencontaining oxidized lipid derivatives J. Biol. Chem. 1994. V.269. N42. P.26066-75 80

99. Sanchez de Miguel L., Arriero M.M., Farre J., Jimenez P., GarciaMendez A., de Frutos Т., Jimenez A., Garcia R., Cabestrero F., Gomez J., de Andres R., Monton M., Martin E., De la Calle-Lombana L.M., Rico L., Romero J., Lopez-Farre A. Nitric oxide production by neutrophils obtained from patients during acute coronary syndromes: expression of the nitric oxide synthase isoforms J. Am. Coll. Cardiol. 2002. V.39. N5. P.818-25

100. Sato H., Zhao Z.Q., McGee D.S., Williams M.W., Hammon J.W. Jr., Vinten-Johansen J. Supplemental L-arginine during cardioplegic arrest and reperfusion avoids regional postischemic injury J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1995. V.l 10. N2. P.302-14

101. Scalera F., Borlak J., Beckmann В., Martens-Lobenhoffer J., Thum Т., Tager M., Bode-Boger S.M. Endogenous Nitric Oxide Synthesis Inhibitor Asymmetric Dimethyl L-Arginine Accelerates Endothelial Cell Senescence Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2004

102. Scharfstein J.S., Keaney J.F., Jr., Slivka A., Welch G.N., Vita J.A., Stamler J.S., Loscalzo J. In vivo transfer of nitric oxide between a plasma protein-bound reservoir and low molecular weight thiols J. Clin. Invest. 1994. V.94. N4. P. 1432-9

103. Scorza G., Pietraforte D., Minetti M. Role of ascorbate and protein thiols in the release of nitric oxide from S-nitroso-albumin and S-nitrosoglutathione in human plasma Free Radic Biol Med. 1997. V.22. N4. -P.633-42 161.Sen C.K., Tirosh O., Roy S., Kobayashi M.S., Packer L. A positively charged alpha-lipoic acid analogue with increased cellular uptake and more potent immunomodulatory activity Biochem Biophys Res Commun. 1998. V.247. N2. P.223-8 81 -к 4>

104. Sievers R.E., Schmiedl U., Wolfe C.L., Moseley M.E., Parmley W.W., Brasch R.C., Lipton M.J. A model of acute regional myocardial ischemia and reperfusion in the rat Magn. Reson. Med. 1989. V.10.-N2.-P.172-81

105. Singh R.J., Hogg N., Joseph J., Kalyanaraman B. Mechanism of nitric oxide release from S-nitrosothiols J. Biol. Chem. 1996. V. 271. N31.-P. 18596-603

106. Souza J.M., Choi I., Chen Q., Weisse M., Daikhin E., Yudkoff M., Obin M., Ara J., Horwitz J., Ischiropoulos H. Proteolytic degradation of tyrosine nitrated proteins Arch. Biochem. Biophys. 2000. V.380. N2. P.360-6

107. Stamler J.S. Redox signaling: nitrosylation and related target interactions of nitric oxide Cell. 1994. V.78. N6. P.931-6

108. Stamler J.S., Hausladen A. Oxidative modifications in nitrosative stress Nat. Struct Biol. 1998. N4. P.247-9 vT-/

109. Stamler J.S., Jia L., Eu J.P., McMahon T.J., Demchenko I.T., Bonaventura J., Gemert K., Piantadosi C.A. Blood flow regulation by Snitrosohemoglobin in the physiological oxygen gradient Science. 1997. V.276. N5321. P.2034-7

110. Stem M.D., Weisman H.F., Renlund D.G., Gerstenblith G., Hano O., Blank P.S., Lakatta E.G. Laser backscatter studies of intracellular Ca2+ oscillations in isolated hearts Am. J. Physiol. 1989. V.257. N2. Pt.2. P.H665-73 170.Sun J, Xu L, Eu JP, Stamler JS, Meissner G. Nitric oxide, NOC-12, and S-nitrosoglutathione modulate the skeletal muscle calcium release channel/ryanodine receptor by different mechanisms. An allosteric 82 4.

111. Takahashi S.S., Omori Y., Miyazaki H., Yoshino P., Shoji H., Lee M.C., Todoki K., Kamibayashi M., Murakami E. Real-time monitoring of nitric oxide in ischemic myocardium using an NO-selective electrode calibrated by electron spin resonance Life Sci. 2003. V.74. N1. P.75-85

112. Thomas D.D., Miranda K.M., Colton C.A., Citrin D., Espey M.G., Wink D.A. Heme proteins and nitric oxide (NO): the neglected, eloquent chemistry in NO redox signaling and regulation Antioxid. Redox. Signal. 2003. N3. P.307-17

113. Thurich Т., Bereiter J., Schneider M., Zimmer G. Cardioprotective effects of dihydrolipoic acid and tocopherol in right heart hypertrophy during oxidative stress. Arzneimittelforschung. 1998. V.48. N1. V -P.13-6

114. Tsao P.S., Aoki N., Lefer D.J., Johnson G. 3rd., Lefer A.M. Time course of endothelial dysfunction and myocardial injury during myocardial ischemia and reperfusion in the cat Circulation. 1990. V.82. N4. -P.1402-12

115. Tyurin V.A., Liu S.X., Tyurina Y.Y., Sussman N.B., Hubel C.A., Roberts J.M., Taylor R.N., Kagan V.E. Elevated levels of Sjj nitrosoalbumin in preeclampsia plasma Circ. Res. 2001. V.88. N11.-P.1210-5 tf> 83

116. Vanin A.F., Stukan R.A., Manukhina E.B. Dimeric and monomeric forms of dinitrosyl iron complexes with thiol-containing ligands: physico-chemical properties and vasodilator activity Biofizika. 1997. -V.42.-N1.-P.10-21

117. Vanin A.F., Varich V.I. Formation of nitrosyl complexes of nonheme iron (2.03 complexes) in animal tissues in vivo Biofizika. 1979. V.24. N4. P.666-70

118. Vaughn M.W., Kuo L., Liao J.C. Effective diffusion distance of nitric oxide in the microcirculation Am. .J Physiol. 1998. V.274. N5. Pt.2.-P.1705-14

119. Virag L., Scott G.S., Cuzzocrea S., Manner D., Salzman A.L., Szabo C. Peroxynitrite-induced thymocyte apoptosis: the role of caspases and poly (ADP-ribose) synthetase (PARS) activation Immunology. 1998. V.94. N3. P.345-55

120. Vriesman M.F., Haenen G.R. Westerveld G.J., Paquay J.B., Voss H.P., Bast A. A method for measuring nitric oxide radikal scavenging activity. Scavenging properties of sulfur-containing compounds Pharm. World Sci. 1997. V.19. N6. P.283-6

121. Wang P., Zweier J.L. Measurement of nitric oxide and peroxynitrite generation in the postischemic heart. Evidence for peroxynitritemediated reperfusion injury J. Biol. Chem. 1996. V.271. N46. P.29223-30

122. Weisman H.F. Myocardial Reperfusion Injury: The Case Against -b Shadow Boxing J. Thromb. Thrombolysis. 1997. V.4. N1. P.133-5

123. Weisman H.F., Bartow Т., Leppo M.K., Marsh H.C. Jr., Carson G.R., Concino M.F., Boyle M.P., Roux K.H., Weisfeldt M.L., Fearon D.T. 84

124. Wennmalm A, Benthin G, Edlund A, Jungersten L, Kieler-Jensen N, Lundin S, Westfelt UN, Petersson AS, Waagstein F. Metabolism and excretion of nitric oxide in humans. An experimental and clinical study Circ Res. 1993. V.73. N6. P.l 121-7

125. Weyrich A.S., Ma X.L., Lefer A.M. The role of L-arginine in ameliorating reperfusion injury after myocardial ischemia in the cat Circulation. 1992. V.86. N1. P.279-88

126. Whiteman M., Tritschler H., Halliwell B. Protection against peroxynitrite-dependent tyrosine nitration and alpha 1-antiproteinase inactivation by oxidized and reduced lipoic acid FEBS Lett. 1996. V.379.-N1.-P.74-6

127. Wink D.A., Darbyshire J.F., Nims R.W., Saavedra J.E., Ford P.C. Reactions of the bioregulatory agent nitric oxide in oxygenated aqueous media: determination of the kinetics for oxidation and nitrosation by intermediates generated in the N0/02 reaction Chem Res Toxicol. 1993.-V.6.-N1.P.23-7

128. Wink D.A., Kim S., Coffin D., Cook J.C., Vodovotz Y., Chistodoulou D., Jourdheuil D., Grisham M.B. Detection of S-nitrosothiols by fluorometric and colorimetric methods Methods Enzymol. 1999. V.301.-P.201-11

129. Wink D.A., Nims R.W., Darbyshire J.F., Christodoulou D., Hanbauer L, Cox G.W., Laval F., Laval J., Cook J.A., Krishna M.C. Reaction kinetics for nitrosation of cysteine and glutathione in aerobic nitric oxide solutions at neutral pH. Insights into the fate and physiological effects of intermediates generated in the N0/02 reaction Chem Res Toxicol. 1994.-V.7.-N4. P.519-25 85

130. Yasmin W., Strynadka K.D., Schulz R. Generation of peroxynitrite contributes to ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts Cardiovasc. Res. 1997. V.33. N2. P.422-32

131. Zhang Y., Bissing J.W., Xu L., Ryan A.J., Martin S.M., Miller F.J., Jr., Kregel K.C., Buettner G.R., Kerber R.E. Nitric oxide synthase inhibitors decrease coronary sinus-free radical concentration and ameliorate myocardial stunning in an ischemia-reperfusion model J. Am. Coll. Cardiol. 2001. V.38. N2. P.546-54 196.Zou M., Martin C Ullrich V. Tyrosine nitration as a mechanism of selective inactivation of prostacyclin synthase by peroxynitrite Biol. Chem. 1997. V.378. N7. P.707-13

132. Zweier J.L., Flaherty J.T., Weisfeldt M.L. Direct measurement of free radical generation following reperfusion of ischemic myocardium Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987. V.84. N5. P. 1404-7

133. Zweier J.L., Samouilov A., Kuppusamy P. Non-enzymatic nitric oxide synthesis in biological systems Biochim Biophys Acta. 1999. V.1411.-N2-3.-P.250-62

134. Zweier J.L., Wang P., Kuppusamy P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy J. Biol. Chem. 1995. V.270. N1. P.304-7

135. Zweier J.L., Wang P., Samouilov A., Kuppusamy P. Enzymeindependent formation of nitric oxide in biological tissues Nat. Med. .1995.-V.1.-N8.-P.804-9 86