Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Медико-биологические аспекты применения лазерно-корреляционной спектроскопии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Медико-биологические аспекты применения лазерно-корреляционной спектроскопии"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ

На правах рукописи

БАЛАБОЛОВ Сергей Михайлович

УДК 577.3:535

ГДВДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ ЛАЗЕРНО-КОРРЕШЩИОННОй СПЕКТРОСКОПИИ

Специальность: 03.00.02 - биофизика

А в тореферат

диссертации на соискание ученой степей: кандидата физико-математических наук

Ленинград 1980

Работа выполнена в Ленинградском институте

ядерноР физики им. Б.П.Константинова АН СССР.

Научные руководители:

доктор физико-математических наук В.А.Ногкин,

доктор медицинских наук

Ф.С.Носков.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук -

проф. Б.Г.Беленький,

доктор биологических наук -

проф. И.Г.Харитоненко.

Ведущая организация:

Д 003.53.01 при Научно-техническом объединении АН СССР (198103, Ленинград, пр. Огородникова. 26)

С диссертацией можно ознак^ " " """"

Институт молекулярной биологии АН СССР(. Москва)

Защита диссертации состоится в /У часов на заседании специализированного совета

АН СССР. Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В.А.Шкуров

: ОБЩАЯ; ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

i

Актуальность теш.- Успехи современной биологии и медицины so» многом определяются успехами развития инструментальных методов.. Одной из важнейших характеристик биологических систем является1 функция1 распределения- частиц по размерам (ФРР), а среди методов* позволяющих воееЯанавливать ФРР, особо выделяется ые-TQR лазерной коррелтшнвбй спектроскопии (JiKC). Это один из наиболее- экеиресс-шху точных и не возмущающих методов. Возмог-тгоетБ- восстановить ФРР' гетерогенной систеш I/V VITRO выгодно отличает его- от' широко применяемых в лабораторной практике методов: электронной микроскопии (ЭМ), ультрацентрифугирования, малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (ЫРР).

Однако' возможности метода ЛКС применительно к нативным гетерогенные системам проявились только после появления регуляри-зационных процедур обработки экспериментальных данных (ЛКСР). Применение .подобных процедур позволяет достичь существенного качественного прогресса при реыении целого ряда медико-биологических задач.

Цель работы. Целью работы явилась адаптация ЛКС о отлаженной регуляризационвой техникой в биологии и медицине. Мы постарались показать, что ЛКСР позволяет не только восстанавливать ФРР гетерогенных биологических систем, но и анализировать механизмы самих процессов, приводящих к данной гетерогенности. В ходе исследований проводились сопоставления получаемых данных с данными других методов восстанавливающих ФРР (ЭМ, МРР), с результатами специфических иммунологических методов (иммуно-фер-ментный анализ (МФА), встречный иммуно-электрофорез (ВИЭФ), использовались данные другой методики ЛКС - электрофоретического светорассеивания (ЭФС). Целью подобных сопоставлений явилась не столько апробация используемого метода, сколько иллюстрация lex возможностей, которые появляются у исследователей при его применений.

Hвyчrfaя^ новизна работы. Применение ЛКСР, а такзе сопоставление с даккымй ЗФС позволило получить новые Hajчпые и прикладные результата-при иэучении целого ряда медико-биологических оистем:

I. Для систем со взаимодействующими компонентами (на примере липосомальных суспензий с инсулином) показано, что:

а) высокая агрегативная устойчивость инсулин содержащих липссом обеспечивается при соотношении инсулин/липид от 2 до 6 молекул инсулина на 1000 молекул липида,

б) стабилизирующая роль инсулина обусловлена изменением механических свойств мембраны липосои.

П. Для систем с сильно взаимодействующими компонентами (на примере полимеризации глобулярного актина) показано, что предложенный в работе метод "пробных шаров" позволяет осуществить адекватный переход от функции распределения по коэффициентам диффузии к ФБР в случае существенно структурированных систем.

Ш. Для систем с внутренними степенями свободы (на примере молекулы ДНК и линейных полиакриламидов), определены времена релаксации и наклон угловой зависимости нижайших релаксационных мод.

1У. Практическая значимость полученных результатов и ИХ использование.

1. Определение оптимальных еоатноиеиий индудив/липид обеспечивает возможность налаживания рраизводотва декарстввндах препаратов с инсулином для пераральнагй введения, о длительни« сроком хранения,

2. Разработка методики,, позволяющей следить аа патогенезом инфекционного, заболевания I/V VITRO ц обладающей реальными диагностическими вааманнаотями -дает практической медицине абсолютно новый меяад исследования сывороток крови (а также и других биологических зщкоотей), ре «требующий специфических антител и значительно упрощающий процедуру лабораторного обследования. По предложенной методике осуществляется анализ сывороток крови в ЛМИ им. Павлова, Лен. Пед, Ин-те, Pas. Гепатологиче-ском Центре 123 ЛССР.

3. Продемонстрированные возможности оценки гетерогенности биологических систем, позволяют рекомендовать ЛКСР дда определения чистоты биологических препаратов в микробиологичеакой промышленности.

Апробация работы и публикации. Результаты работы доложены в виде пленарных и стендовых докладов на следующих Всесоюзных и Международных конференциях и съездах: ХП Всесоюзная биофизическая конференция по когерентной и нелинейной оптике (Москва, 26-29 августа 1985 года); Симпозиум "физико-химические свойства биополимеров в растворах и клетках" (Пущино, 23-26 сентября 1985 года); ХП Всесоюзная конференция по высокомолекулярным соединениям (Алма-Ата, 15-19 октября 1985 года); Симпозиум института им. Сеченова АН СССР "Инструментальные методы в физиологии и биофизике" (Ленинград, 4-6 апреля 1986 года); international Symposium of Viral Hepatitis and. Liver Disease (London, Barbican) Centre, 26-28 May, 1987).

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, в которой дан обзор по методам анализа спектров квазиупруго рассеянного света и одновременно по объектам анализа, из четырех глав, приложения, заключения и списка цитированной, литературы, содержит 143 страниц машинописного текста, 37 рисунков, таблиц, 181 библиографическое наименование, кавдая из четырех глав диссертации завершается выводами; в заключение приводятся общие вывода, резюмирующие основные результаты работы.

Основное содержание работы

Глава I. ФИЗИЧЕСКИЕ И МАТЕМАТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТОДА ЛКС

Первая глава содержит основы электромагнитной теории рас' сеяния света и теории методов ЛКС. Излагаются принципы работы спектрометра оптического гетеродинирования - установки, на которой получены основные экспериментальные результаты.

Суть метода ЛКС заключается в измерении ае спектра света,

1м = (X) а спектра флуктуаций интенсивности излучения,

Фототок на выходе ФЭУ пропорционален /£ и,следовательно,

спектр фототока пропорционален Г/^j . В отличие от спектра

флуктуаций напряженности электрического поля, спектр флуктуаций интенсивности сосредоточен в низкочастотной области, таким об-разои,спектр фототока, который повторяет форму. Т-'^ш), удобно анализировать радиотехническими методами.

При рассеивании монохроматической, линейно поляризованной волны на системе идентичных частиц, диффузионное уширение спектра света пропорционально коэффициенту трансляционной диффузии исследуешх частиц. Если в растворе находятся частицы о различными коэффициентами диффузии, то спектр рассеянного света представляет собой сушу лоренцевских кривых разной полуширины.

Метод ЛКС используется в трех основных вариантах: I. метод гомодинирования» П. метод гетеродинирования, Ш. метод электрофоретического светорассеяния (ЭФС). В первой случав регистрируется спектр флуктуаций интенсивности непосредственно исследуемого излучения. При гетеродинировании регистрируется спектр флуктуаций интенсивности излучения, состоящего из интересующего нас излучения е0(Ъ) и опорного монохроматического пучка ЯеСМ иного большей интенсивности,в качестве которого обычно используется то не самое лазерное излучение, которым облучается исследуемая система (см. рис. I):

£(■(■) Ес(£)3 причем •

ёаф >>ЕС<1). (3)

. Если статистика излучения

лазера; б) рассеянного раствором броуновски движущихся идентичных сферических невзаимодействующих частиц; в) спектр, фототока; г) спектр фототока при направленном движении частиц.

/-®

2ШШЭ

1

Ж

Рис. I. Схеш экспериментов';

I. НОС П. ЗФС. ФЭУ - бото-электроиный уииокитель,СК - -спектроанализатор, Ф - на-""питель.

Е. Спекяральшй состав рассеянного света, а) одномо-дового монохроматического

а

е

г

гауссова, то метод гомодинирования позволяет получить либо ту же, либо меньшую информацию об исследуемой системе, чем метод гетеродинирования. Уменьшение информации связано с тем, что при гомодинировании мы узнаем лишь амплитуду корреляционной функции, но теряем информацию о ее фазе.

В данном исследовании мы пользуемся методом гетеродинирования, а не гомодинирования, в силу следующих соображений:

1. метод гетеродинирования позволяет увеличить отношение сигнал/шум в два раза}

2. в методе гетеродинирования нет опасности наложения на гомодинный спектр спектра от паразитного гетеродинирования и соответственно требования к обеспыливании изучаемых систем менее жесткие;

Б. в методе гетеродинирования при измерении спектральных характеристик легче восстановить ФРР при анализе многомодальных систем, тан как нет свертки отдельных мод друг с другом;

4. в.методе гетеродинирования сохраняется информация о направленном движении частиц.

Метод ЭФС основан на измерении доплеровского смещения спектра при движении частиц под действием электрического поля,позволяя измерять не только коэффициент трансляционной диффузии, но и распределение по электрофоретяческим подвижностям частиц в растворе. Оптическая схема установки, собранная по гетеродинной схеме, легко перестраивается на ЭФС или гомодинирование. В работе дано краткое описание блок-схемы и оптической схемы установки, на которой проводились все эксперименты.

Вырааение для гетеродинного спектра в случае полидисперсной системы имеет вид:

где //ФУ - функция распределения числа частиц по коэффициентам диффуани,

(л/ю ■ ¡«-а»!А(п, г=2>г ■ 9*).

Для получения информации о рассеивающей системе необходимо

найт А/(Х>) , т.е. разложить спектр Т(Ш) на составляющие его лоренцевские кривые. Задачи типа (4) принадлежат к классу некорректно поставленных задач и характеризуются сильной неустойчивостью решения по отношению к малый вариациям экспериментальных данных, т.е. при отличии двух экспериментальных спектров 1<(и>) и 1г.(и)) лишь статистическим разбросом значений спектральной интенсивности соответствующие точные решения /1,(Г) и /1&(Г) могут отличаться сколь угодно сильно.

Используемый коми метод поиска устойчивых решений некорректных задач типа (4) основан на замене исходной неустойчивой задачи, близкой ей задачей, корректной в обычном сшсле. Ищется сглаженное, неотрицательное решение, причем в качестве параметра сглаживания выступает степень дискретности искомого решения.

В данной диссертации для обработки экспериментальных данных, получаемых методом ЛКС, использовалась программа обработки, ранее опробированная на калибровочных системах - монодисперсных и полидисперсных латексах, при исследовании ФРР изопреновых ка-учуков. Для исследования нативных биологических систем до данного исследования программа не применялась, в связи со сложностью интерпретации восстанавливаемых ФРР. Поэтому диссертация построена по принципу постепенного усложнения ' исследуемых систем и максимально возможному сопоставлению получаемых результатов с данными других методов.

Глава П. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ИНСУЛИНА НА АГРЕГАЦИОННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ СУСПЕНЗИЙ

В последние годы большое внимание уделяется созданию липо-сомалышх форм лекарственных препаратов, позволяющих осуществить направленный транспорт лекарств и заменить инъекционные способы введения на пероральные.

В данной главе методы ЛКС : ЛКСР и ЭФС применены для исследования лкцетинхолестериновых липосом с инсулином. Цели проведенного исследования:

I. изучение агрегационного состояния липосомальной суспензии в процессе хранения; •

2. исследование механизма агрегационной устойчивости;

3. Определение возможностей ЛКСР в восстановлении ФРР гетерогенной системы и сопоставление получаемых результатов с данными других методов.

От функции распределения рассеивающей способности по гидродинамическим радиусам, восстанавливаемой ЛКС можно перейти к ФРР, если сделать модельные предположения о рассеивающей способ-поста частиц,. Сопоставление получаемой таким образом ФРР при выборе модели полых сфер с данными ЭМ обнаруживает хорошее совпадение результатов (рис. 2).

//(Д^аткМ

Рис. 2. Распределение по размерам лецитин-холестериновых липосом с инсулином, приготовленных за 1,5 месяца до измерений.

Концентрация липида 10 иг/мл, соотношение лецитин-холестерин 7:3 (по пассе), концентрация инсулина в исходной смеси 1,6 иг/мл фосфатного оуфера. I - распределение восстановлено из спектра рассеянного света} 2 - распределение получено из электронных микрофотографий, сделанных на электронном микроскопе ЖЬ1005.

Электронные микрофотографии были получены методом негативного контрастирования фосфорновольфрамовой кислотой. Кривые распределения строили по данным измерений диаметров не менее 1800 везикул.

В начальный момент исследования все липосомальные суспензии обладали сходными по виду ФРР и близкими по величине средними радиусами. Критерием, характеризующим агрегационную устойчивость липосоиальных суспензий является отношение среднего радиуса везикул в конечный момент исследования к исходному среднему радиусу. Как видно из рис. 3, липосомальные препараты» для

которых п. в 2 * 6, обладают высокой аг-регационной устойчивостью. По-видимому, связанный с липосома-ми инсулин меняет характер взаимодействия везикул, препятствуя слиянию липосом, вследствие увеличения жесткости бислоя "армированием" мембраны макромолекулами белка. Эффект снижения стабилизирующей роли инсулина при п в 10 связан с тем, что агрегация дипосомальной суспензии,обусловленная в значительной степени липид-липид-ным взаимодействием при малом количестве инсулина, в случае избытка гормона осуществляется за счет белок-белкового взаимодействия.

Методом ЭФС были получены распределения везикул по подвкк-. ностнм (см. рис, 4), причем добавление инсулина существенно не влияло на величину средней ЗФП везикул, приводя лишь к некоторому увеличению гетерогенности системы по подвикносяи.

Полученные данные свидетельствуют о том,,что для получения суспензий лкпосом с высокой агрегациониой устойчивостью имеется

Рис. 3. Зависимость относительного из~< менения среднего радиуса суспензий ли-посом от содержания инсулина (П- - число молекул инсулина в 1000 молекул липосом, цифры у точек - номер образца)

область оптимальных соотношений инсулин/ липид, причем связанный с липосомамн инсулин существенно не изменяет зарядового состояния поверхности везикул, а стабилизирующая роль инсулина обусловлена изменением механических характеристик мембраны с сохранением средней величины подвижности везикул.

уцм*8/(смс) 4 в

го ы л? 2/5-

Рис. 4. Влияние инсулина на распределение липосом по электро-форетической подвижности уч ; I, В - суспензия липосом без инсулина; 8, 4 - в присутствии 1,6 мг/мл инсулина; концентрация липосом: 1,8 - 10,2,4 - 80 мг/мл.

Глава Ш. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ СО ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИМИ КОМПОНЕНТАМИ И ВНУТРЕННИМИ СТЕПЕНЯМИ СВОБОДЫ

Метод ЛКС является, по-видимому, единственным методом, позволяющим исследовать функцию распределения частиц по размерам в кинетическом эксперименте ¿л- ^Иго , Подобные исследования связаны с анализом сложной системы: полидисперсной, со взаимодействующими компонентами, с вкладом конформационной динамики. В данной главе проведена оценка возможностей метода ЛКСР при экспериментах по самосборке глобулярного актина и при исследовании объектов с внутренними степенями свободы (макромолекулы линейных полимеров и ДНК).

Исследование полидиоперсных растворов актина

Важная роль актина как биологического полимера и его мно~

гофункциональность на клеточном уровне и в организме в целом ■ стимулируют исследования этого белка. Эксперименты по исследованию кинетики полимеризации свидетельствуют о ее сложной зависимости от присутствия в растворе ионов магния, кальция, калия, от их концентрации, от изначального присутствия фибрилл в растворе.

В данном исследовании уделено основное внимание следующим проблемам;

I. измерение "микровязкости", т.е. исследованию движения частиц в растворе с большой вязкостью;

П. стадии зародышеобразования при полимеризации.

Прямо связать измеряемые ЛКСР коэффициенты, диффузии с размерами рассеивателей невозможно, так как при полимеризации глобулярного актина резко возрастает вязкость раствора, что свидетельствует о возрастании мезчастичного взаимодействия. Однако вязкость, измеренная в вискозиметре, учитывает все возможные взаимодействия при перемещении частицы на большие расстояния и определяется в основном количеством крупных фибрилл, их размерами и взаимодействием. При изучении методом ЛКСР, диффузии макромолекул мелких по сравнению с фибриллами необходимо учитывать пространственные масштабы перемещения исследуемых частиц.

Полуколичественно учесть изменение вязкости растворителя для олигомеров в системе, содержащей и фибриллы и олигомеры, можно с помощью "пробных частиц", размер которых примерно такой же, как у олигомеров, а концентрация на несколько порядков меньше концентрации белка.

На рис. 5,а приведена "микроскопическая вязкость", . рассчитанная как отношение определяемого ЛКСР коэффициента диффузии к известному радиусу латекса. При изменении пространственного масштаба измерения, т.е. при изменении угла рассеяния, меняется расстояние', на котором исследуется диффузия "пробных частиц".При ц^-о, при увеличении масштаба перемещений латекса величина "микроскопической вязкости" значительно возрастает, стремясь к визкозпиетрической.

На рис. 5,6 представлено сравнение концентрационных зависимостей вязкости раствора актина по данным визкозщетрии и мето-

да "пробных частиц". При экстраполяции к нулевым концентрациям оба метода дают одинаковый результат. При увеличении исходной

за ¿з т гг0 в'

^ • А •Дяетзюгер

I'

V

V* «¡г 4ЯГ

хся'е/л

-Л» »-Л»

Рис» 5. Концентрационная и угловая зависимости вязкое-, сей , . А - угловая зависимость вязкости. Б -концентрационные зависимости Вязкостен 1я раствора В-актина, содержащего I мМ Мд.Сбя(<), и раствора

-актина (2); вязкость измерена методом "пробных частиц", $ = 90°.

концентрации глобулярного актина степень отличия "микро" и "макро" вязкости друг от друга связана со степенью полимеризации белка, в свою очередь, зависящей от ионных условий и от концентрации белка.

Для упомянутого выше примера полимеризации глобулярного актина концентрации 2,7 мг/мл, полимеризовавшегося в присутствии 0,2 мМ МуСВг,, в течение 2 ч. 40 мин будем полагать, что эффективная вязкость образца равна (2^0,5) пауз. Тогда высокочастотная компонента 603 Гц соответствует тпансляционной диффузии рассеивателей с небольшими гидродинамическими радиусалз.

Полученные значения эффективной вязкости образца позволяют определить гидродинамический радиус олигомера, а предположение, что толщины фибриллы а олигомера одинаковы, позволяет определить длину олигомера.

Таким образом, полимеризация начинается с появления олнго-меров, длина которых зависит от ионных условий и концентрации белка. В процессе полимеризации длина олигомеров возрастает с 10-13 нм до 0,1 г^км, т.е. система обязательно проходит стадия эародыаеобразования. Полная обратимость полимеризации и соог-

ветствие прямой и обратной кинетики подтверждают, что ассоциация и диссоциация глобул актина идет только на концах фибрилл.

Изучение крупномасштабной динамика макромолекулярных структур

ЛКС представляет уникальную возможность исследования кон-формации макромолекул в растворе при относительной флуктуации размеров порядка единицы, в диапазоне характерных времен от секунд до миллисекунд. Наиболее удобным объектом для изучения ВД являются статистические клубки линейных макромолекул - полимеров и биополимеров. __

Первый кумулянт Г корректно определяется в эксперименте и легко интерпретируется теоретически. Но наиболее фундаментальными характеристиками является не Г* , представляющее собой слож-ныг.1 образом взвешенное среднее время релаксации, всех внутренних иод клубка, а времена релаксации (ВР) мод в отдельности.

Теоретически охарактеризовать моды можно только в рамках достаточно грубых приближений:

1. без учета гидродинамического взаимодействия или с предварительным усреднением этого взаимодействия^

2. лишь в & условиях^

3. без учета запрета на самопересечение.

Экспериментальные возможности изучения ВР появились только

с развитием регулярных методов анализа, позволяющих разделить вклады в спектр динамических процессов с различными релаксационными временами. Разделение вклада в спектр от чисто диффузи- ■ онной йоды я вклада от релаксационных мод возможно лишь в области £ í . При меньших £ вклад релаксационных мод в рассеяние слишком мал, а при'больших £ слишком много релаксационных иод дают примерно одинаковый вклад и их невозмокно отличить друг от друга. При вклад дает в основном нижайшая ре-

лаксационная мода, и этот вклад достаточно велик.

При анализе угловой зависимости и Г/ (у.) исследу-

емих образцов низкочастотная составляющая вела себя по закону Г0 = £>г у.11 а высокочастотная экстраполировалась к положительный конечным значениям. Таким образом, мы определили характер-

ные по экстраполяции к $--0 . На рис. 6 показана

зависимость в <9 условиях от гидродинамического размера клубка. Обращает на себя внимание универсальность Цг1' результатов, полученных на образцах совершенно разной природы. Во всех случаях выполняется предсказываемый теорией закон:

№ -

К£Г_.

(5)

ю-

в/.

/

1 /

а '

/

/

■Г /

о '

1

1

в /

/

0 /

/

$

/

/

1

/

' • ■ '"14 -1-1 ■ I < 1Ч|

однако с коэффициентом пропорциональности К в два раза больше теоретического.

На рисунке приведена зависимость ^первой моды набухшего клубка от его гидродинамического размера. Время релаксации нижайшей моды в О условиях примерно в 2,5 раза меньше, чем у клубка с таким ке гидродинамическим размером в хорошем растворителе.

В настоящее время не существует теории,способной "дать количественные

предсказания ВР не только с' учетом объемных взаимодействий, но и в # условиях. Обсуждая на качественном уровне экспериментальные " данные, выделим два основных момента. Как видно лз рис, б, в О -условиях имеет место универсальная зависимость (5). Зависимость такого вида соблюдается и для набухших клубков полимеров разного' молекулярного веса при фиксированном качестве растворителя»

Рис. б. Зависимость времени релаксации V, первой внутренней мода от гидродинамического радиуса клубка

& - условия: О - линейный поли-акриламид, I - ДНК (123/, о - полистирол /149/,О - полис?

полистирол

/148/,хороший растворитель:0- ли-цейный полиакриламид, ----- теоретическая зависимость от пм, согласно теории Роуза-Зимма.

Наклон зависимости Г/ (({■*) имеет смысл коэффициента диффузии, описываемого первой кодой, этот наклон примерно в 2 раза больше наклона чисто трансляционной моды.

Из приведенных в данной главе результатов можно, сделать следующие выводы,

1. Наиболее широко распространенный метод изучения внутренней динамики полимеров, а именно, изучение угловой зависимости первого кумулянта спектров (или корреляционных функций) рассеянного света,имеет ограниченные возможности.

2. Возможные причины расхождения экспериментальных значений первого кумулянта с теоретически рассчитанной зависимостью Г(?) связаны с систематической недооценкой первого кумулянта из-за невозможности наблюдать в одной полосе измерений все внутренние релаксационные йоды, характерные времена которых могут отличаться на несколько порядков.

3. Применение регуляризирующей процедуры к анализу экспериментальных кривых при изучении внутренней динамики полимеров. позволяет получить прямую информацию о временах релаксации самых крупномасштабных внутренних движений в полимерах.

4. Показано, что измеренный экспериментально наклон угло- . вой зависимости нижайшей релаксационной моды отличается от наклона чисто диффузионной мода, что свидетельствует о необходимости точного учета гидродинамического взаимодействия.

5. Экспериментальное время релаксации нижайшей внутренней, мода в два раза отличается от предсказаний существующей теории.

Глава Д. ПРИМЕНЕНИЕ ЛКС В ВИРУСОЛОГИИ И ИММУНОЛОГИИ

В нашем исследовании мы постарались показать, что использование регуляризационных процедур для обработки экспериментальных данных позволяет ЛКС анализировать состав сывороток крови, а получаемый объем информации достаточен для диагностически выводов.

В рабохе исследовались сыворотки крови людей "доноров1) полученные со станции переливания крови,и больных гепатитом "В". Диагноз установлен на основании клиники и затем подтвержден различным иммунохкмическими анализами (ВЙЭФ, ИФА, РИА и т.п.).

N2

Ш N2 N3

СрвАосип*'

"Донорами" мы называем практически здоровых людей, у которых отсутствуют какие-либо клинические показатели какого-нибудь заболевания, их кровь также проверена на НВзАд . методом ЙФА.

Достаточно благоприятные условия эксперимента с "донорскими сыворотками" обеспечиваются при разведении в 50-200 раз. При таких разведениях интенсивность рассеивания достаточно высока для используемого метода, т.е. обеспечивается необходимое соотношение сигнал-шум, с другой стороны, концентрация понижена для уменьшения числа агрегатов. При таких разведениях все исследованные нами сыворотки здоровых людей имели характерное распределение (см, ркс. 7) с отсутствием заметного вклада в рассея- . ние от частиц с размерами в интервале приблизительно 100-20 нм. Размер мелкодисперсной фракции различен у различных доноров, но средний размер с высокой степенью достоверности всегда меньше 18 нм. Появление частиц с размерами, попадающими в интервал от 20 до 100 нмд при достаточном их количестве мозет' быть зафиксировано ЛКСР. Чувствительность ЛКСР зависит как от молекулярного веса Т вируса, так и от уровня различных фракций сыворотки крови.

Вирус гепатита В и субвирусные структуры

имеют размеры, хорошо РйС' 7- ФРР СНБ0РОТКИ КР0ВИ доио-ов-вписывающиеся в "окно размеров" донорских сывороток, в крови они находятся в сравнительно больном количестве, в течение длительного времени. <

С целью выявления достоверности сопоставимости результа-

ЮО ■*)>«

20«-

1 К"/' У

/ У/

>100 от ЮО 0о29нм метяи» 20««

120 Мт

122 17 т

107 Чш

18» |»к»

тов ЛКСР с результатами серологических исследований нами был проведен модельный эксперимент по изучению .сыворотки больного Гепатитом В методами ЛКСР, ЭМ, ультрацентрифугирования в. сочетании с иммунологическими тестами - как видно из- рис. 8. Изменения в ФРР при ультрацентрифугировании хорошо коррелируют с данными ИФА и ВИЭФ. Проведенный в диссертации анализ полученных разными методами результатов, показывает, что метод ЛКСР применим для обнаружения при информации как самого вируса, так ц его структур.

Количество частиц , обнаруживаемое ЛКСР по самым пессимистическим оценкам, меньше количеств, обнаруживаемых методом, используемый для массового обследования доноров - ВИЭФ, уступая лабораторным методам с моноклональными антителами,- РИА, ИФА, РИГА. Порог чувствительности ЛКСР. можно оценить и теоретически - по результатам расчетов по рассеивающей способности различных компонент сыворотки крови больного гепатитом В и модельным экспериментам по разрешению ЛКСР компонент, отличающихся по размеру в В-5 раз. Метод способен обнаружить частицы Дейна при их концентрации НЕ>ъЛд {01~ Ю12

частиц в мл. ---—— ~

Данная чувствительность используемого метода рассчитана на случай прямого наблюдения вирусных и субвирусных структур, т.е. с учетом заметного маскирующего действия других структур, пред-

•Рис. Изменение ФРР сыворотки крови при ультрацентрифугировании.

ставленных в том яе растворе. Подчеркнем, однако, что ЛКСР не является только еще одним новым серологическим методом, ценность которого следует оценивать по его трудоемкости и чувствительности,ЛКСР может дать информацию и о таких процессах, которые в принципе недоступны методам, основанный на взаимодействии антигена с антителами. •

На рис. 9 приведены гистограммы распределения частиц по рассеивающей способности для больных различными формами гепатита В и хронических бессимптомных носителей. Обращает на себя внимание, что:1. в "окне размеров',' существующем у здоровых людей, обнаруживаются частицы;

2. при поло-нительнои анализе в гистограммах сывороток больных имеется широкое распределение частиц размером 23-42 нм;

3. при Н&зйуотрицательном анализе; не обнаруживаются частицыиразмер которых мог бы соответствовать размерам вирусных или субвирусных структур гепатита В.

Такии образом, ЛКСР применима для реаения ряда задач стоящих перед вирусологами и иммунологами. Чувствительность метода по самым пессимистическим оценкам не уступает используемым в практике, а отсутствие предварительной подготов-

500 100 50

Рис. 9. ФРР сывороток крови больных различными формами гепатита В,

ки образца, универсальность, возможность получения информации о процессах, недоступных исследованию серологическими методами, позволяет сделать следящие выводы:

1. метод ЛКСР применим для изучения инфекционных процессов;

2. получаемые ЛКСР данные о наличии или отсутствии вирусе-кии, об уровне вирусеуии в сыворотке крови - объективны, чувствительность метода достаточно высока.

Предложенные в данной главе принципы прямого обнаружения вирусамии легли в основу создаваемой методики автоматизированного массового скрининга.

Приложение

Применение ЛКСР и ЭФС для исследования эритроцитарных диагностикумов.

В приложении показано, что применение методов ЛКС при постановке реакции непрямой аглютинизации позволяет значительно повысить чувствительность реакции, уменьшить количество используемых ингредиентов и время реакции.

ЖС позволяет контролировать степень сенсибилизации эритроцитов. Полученные в приложении результаты позволяют рекомендовать ЖС для широкого использования в лабораторной практике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Весь материал, представленный к защите, а также сопоставление с данными другой ЛКС методики (ЭФС) , позволяет не только восстанавливать ФРР гетерогенных биологических систем, но и анализировать сами процессы, приводящие к данной гетерогенности.

Получены следующие резуль/аты биофизического содержания, которые условно можно систематизировать в трех направлениях.

В области фундаментальных исследований:

а) впервые проведено сопоставление экспериментальных результатов по внутренней динамике полимерных клубчов с предсказаниями теории Роуза-Зимма для гчрокого класса макромолекул (ДНК полиак-риламиды, полистиролы); наблюдаемое расхождение теории и эксперимента подтверждает высказываемые ранее предположения о недопустимости ряда упрощений, сделанных в теории, в частности. игнорирование запрета на самопересечение полимерной цепи и предварительного усреднения тензора гидродинамического взаимодействия;

б) изучен механизм стабилизирующей роли инсулина в агрега-ционной устойчивости липидных мембран; показано, что наиболее вероятным механизмом является изменение механических свойств мембраны при встраивании инсулина;

в) изучен механизм ассоциации и диссоциации актина в кино-тическом эксперименте; показана обратимость процессов и наличие стадии эародытеобразования при ассоциации.

В области разработки новых методик:

а) разработан метод "пробных шаров", позволяющий осуществить адекватный переход к функции распределения по размерам от функции распределения по коэффициентам диффузии в случае существенно структурированных систем.

В области прикладных исследований:

а) определены оптимально соотношения состава липоссм, обеспечивающие длительный срок хранения лекарственных препаратов с инсулином;

б) разработана методика, позволяющая следить за патогенезом инфекционного заболевания.

Все описанные вше работы приводились в Отделе молекулярной и радиационной биологии ЛИЯФ АН СССР под непосредственным руководством д.ф.-м.н. В.А.Носкина, работа над медицинскими приложениями ЛКСР осуществлялась под руководством д.м.н., профессора Ф.С.Носкова (НИИЭК им.Паетера).

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. С.М.Балабонов, П.Д.Добычин, Е.А.Долгинова, Ю.Ш.ДОашковский,

A.Н.Россельс. Применение метода оптического смешения для определения агрегационной устойчивости липосом с инсулином. // Биологические мембраны. - 1985. - №2. С.Г76-180.

2. С.М.Балабонов, Е.А.Долгинова, А.Д.Лебедев, Ю.Ш.Машковский,

B.А.Носкин, А.Н.Россельс. Влияние инсулина на физико-химические характеристики лецитин-холестериновых липосом. // Физическая химия. 1987. №6. С.1875-1878.

3. С.М.Балабонов, Е.А.Долгинова, Ю.Ш.Машковский, В.А.Носкин, А.Д.Лебедев,' А.Н.Россельс. Изучение агрегационной устойчивости липосомальных суспензий с помощью лазерной корреляционной спектроскопии. // "Инструментальные методы в физиологии

и биофизике". 1987. C.I93-I96.

4. П.Д.Добычин, А.В.Ломакин, Н.ГЛ'евх, В.А.Носкин, С.М.Балабонов, Исследование полидиспереных растворов актина методами квазиупругого светорассеяния. // Ленинград. 1984. 16 с. (Препринт/ Ленинградский институт ядерной физики № 1022).

5. П.Д.Добычин, А.В.Ломакин, Н.Г.Мевх, В.А.Носкин, С.М.Балабонов. Исследование полидисперсных растворов актина методами квазиупругого светорассеяния .// Биополимеры и клетка. 1986. Т.2.

* I. С. 23-29.

б! S.M.Balabonov, M.A.Ivanova, S.I.Klenin, A.V.Lomakin, V.A.Mo-lotkov, V^A.Woskin. Quasieloatic light Bcattering study of lineer flexible macromoleculee dynamics. // Leningrad, 1986. 37 p. (Praprint/ Leningrad Nuoleer Physios Inst? tutesNo.1152.

7. С.М.Балабонов, М.А.Иванова, С.И.Кленггн, А.В.Ломакин, В.А.Молотков, В.А.Носкин. Особенности динамики макромолекул по данным метода квазиупругого светорассеяния .// Биофизика. 1987. W 6. С. 933-948,

8. С.М.Балабонов, А.Ф.Блюгер, Р.К.Елигулашвили, Е.Ю.Карзова, Г.П.Новоселов, В.А.Носкин, Ф.С.Носков, В.С.Омельченко,В.Н.Ти-товский, Е.П.Шувалова, А.А.Яковлева, А.М.Яковлев. Возможности методов, восстанавливающих функцию распределения частиц

по размерам в вирусологии и иммунологии // Ленинград. 1987. 24с. (Препринт/ Ленинградский институт ядерной физики, № 1330).

9. А.Я.Лебедев, Ф.С.Носков, В.А.Носкин, С.М.Балабонов. Лазерная корреляционная спектроскопия при изучении электрофоретической подвижности биологических объектов в растворах .//"Инструментальные методы в физиологии и биофизике". 1987. С. 189-192.

РТП ЛШФ,зак.857,тирЛ00,уч.-изд.л.1; 6/1X-1988г. .M-2I49I Бесплатно