Материально-энергетический баланс и кинетика роста клеточных популяций

Минкевич, Игорь Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Материально-энергетический баланс и кинетика роста клеточных популяций
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Материально-энергетический баланс и кинетика роста клеточных популяций"

На правах рукописи

МИНКЕВИЧ ИГОРЬ ГЕОРГИЕВИЧ

МАТЕРИАЛЬНО-ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ БАЛАНС И КИНЕТИКА РОСТА КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ на примере микроорганизмов

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва - 2004 г.

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН (ИБФМ РАН), г. Пущино Московской обл.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Доктор физико-математических наук профессор Ризниченко Галина Юрьевна Доктор физико-математических наук Вавилин Василий Александрович Доктор технических наук профессор Бирюков Валентин Васильевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино Московской обл.

Защита состоится 19 февраля 2004 г. в 1530 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу:

119992 г. Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан января 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук профессор

Т.Е.Кренделева

2004-4 23961

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Популяции микроорганизмов и клеток тканей представляют большой интерес для биофизических исследований. Многие свойства микробных клеток, в особенности эукариотических, аналогичны свойствам клеток высших организмов. Клеточная культура, выращиваемая в строго контролируемых условиях, с точки зрения ряда ее свойств является физической моделью отдельной клетки, поскольку межклеточные взаимодействия в ней намного слабее, чем в тканях. Такой объект может поддерживаться и изучаться в течение длительного времени при относительно небольших затратах на эксперимент. Физико-математические исследования клеточных популяций важны с точки зрения и фундаментальной науки, и приложений. Микроорганизмы занимают одно из важнейших мест в биосфере Земли. В последние десятилетия культуры микроорганизмов и клеток тканей широко используются в биотехнологии, как промышленной, так и (микроорганизмы) экологической. Несмотря на то, что такие исследования широко проводятся в течение десятков лет, ряд важных проблем в этой области остаются недостаточно разработанными. Сюда относятся интегральные закономерности клеточной энергетики, контролирующие распределение вещества и энергии в процессе роста популяции, а также кинетические закономерности роста, учитывающие ее гетерогенность по ключевым физиолого-биохимическим показателям. Вследствие сложности объекта основное внимание при его изучении уделялось подходам, основанным на представлении о микробной популяции как «точечном» объекте (описываемом сосредоточенной моделью) и, как правило, мало учитывавшим роль законов сохранения в динамике этого объекта. Следствием было смещение акцентов в сторону «точечной» кинетики в ущерб стехиометрии и биоэнергетике. Предпринятые нами исследования направлены на развитие знания в этой области.

Цель исследования. Основная цель нашей работы - развитие интегральных подходов в биоэнергетике и кинетике клеточных популяций, позволяющих выявить общие закономерности баланса вещества и энергии, динамики роста популяций на основе энергетических характеристик метаболизма клеток, с учетом физиологической гетерогенности популяции, и применение этих подходов к исследованию культур микроорганизмов.

Эта общая задача состоит из следующих этапов.

1. Разработка теоретических основ анализа материально-энергетического баланса, а также ионного баланса клеточного метаболизма.

2. Применение этого подхода к теоретическому исследованию роста микробных культур и образования ими продуктов

3. Экспериментальные исследования энергетики и кинетики роста микробных культур, основанные на теории материально-энергетического баланса.

4. Разработка базовой распределенной математической модели роста клеточной популяции, нахождение и исследование ее решений для случая, когда рост зависит от концентрации одного из субстратов.

5. Выявление новых аспектов «точечной» динамики клеточных популяций.

При разработке теории материально-энергетического баланса ставилась задача получить адекватный объекту и работоспособный подход, обладающий концептуальной ясностью, дающий возможность максимально просто и эффективно получать реалистичные значения энергетических показателей процесса роста клеточных популяций на основании данных биохимических исследований. Нам представлялось важным разграничить роль трех факторов, определяющих биоэнергетику роста: 1) законы сохранения вещества и энергии, 2) вариабельность метаболических путей и 3) кинетика биохимических реакций.

Научное значение и новизна работы. В исследованиях роста клеточных популяций издавна существует разобщение между описанием характеристик популяции, с одной стороны, и свойств отдельных клеток и субклеточных систем, с другой. В математическом моделировании динамики популяций имеет место смещение акцентов в сторону таких традиционных подходов, как ферментативная кинетика и модели, основанные на обыкновенных дифференциальных уравнениях. Соотношения баланса вещества и энергии мало учитываются при построении моделей роста.

Наша работа вносит качественно новые моменты в эту область. Мы предлагаем компактный подход, выделяющий своего рода прочный «скелет» в клеточном метаболизме, рамки, в пределах которых существует биологическое разнообразие клеток и клеточных сообществ. Этот подход использует физико-химические свойства органических соединений как материала, из которого состоит клетка, свойства, которые обусловливают связь потоков вещества в метаболизме с передачей энергии и ее использованием в клетке. Он делает картину метаболических потоков и их связей легко понимаемой и пригодной для эффективного использования в конкретных расчетах. Этот подход дает возможность редукции количественных характеристик роста клеток и их популяций, то есть их сведения к характеристикам субклеточных систем.

Кинетические закономерности роста клеточных популяций действуют в жестких рамках, определяемых материально-энергетическим балансом. Это не снижает высокую сложность-биологического объекта, но вносит в его функционирование ту определенность, которая ранее недостаточно учитывалась. В

частности, нами показано, что скорость затрат энергии на поддержание клеток является важным фактором не только баланса, но и кинетики их роста. Из нашей работы следует вывод, что любая математическая модель роста популяции клеток должна учитывать соотношения материально-энергетического баланса.

Нами разработан метод описания динамики точечных моделей с помощью изохрон в фазовом пространстве. Впервые найдены и исследованы как стационарные, так и нестационарные решения модели для возрастного распределения клеток с учетом взаимного влияния среды и клеток. Нахождение таких решений выводит распределенные модели на уровень рабочего аппарата исследователя, занимающегося фундаментальными и прикладными задачами в области биотехнологии и экологии.

В работе получены следующие новые результаты.

1) Впервые разработано общее понятие восстановленности для любого химического соединения и предложена универсальная единица восстановленно-сти - редоксон.

2) Впервые разработаны строгие понятия парциальных обменов как частей целостного метаболизма клетки, основанные на параллельном делении метаболических потоков.

3) Впервые сформулирована полная система уравнений материально-энергетического баланса, учитывающая одновременно движение редоксонов в метаболизме и баланс двух видов промежуточных переносчиков энергии -макроэргических связей и протонов-носителей высокого трансмембранного электрохимического потенциала.

4) Впервые дан общий анализ ионного баланса роста клеточных популяций и на его основе разработан и осуществлен новый способ непрерывного культивирования - бистат.

5) Впервые в распределенной модели роста клеточных популяций случайность динамики роста отдельной клетки учтена в наиболее компактной форме как сконцентрированная по времени в момент деления клеток.

6) Впервые получено и исследовано решение системы уравнений, описывающей динамику возрастного распределения клеток одновременно с влиянием концентрации субстрата (системы из уравнения в частных производных, интегрального и интегро-дифференциального уравнений).

7) Впервые дан изохронный портрет клеточной популяции.

Практическое значение работы

Разработанный нами метод материально-энергетического баланса является эффективным исследовательским инструментом для интегрального описания

популяций клеток. Он может быть применен и для описания популяций многоклеточных организмов. Этот подход позволяет упростить рассмотрение динамики клеточных популяций, исключив из этого рассмотрения факторы, не влияющие на изучаемые характеристики. Например, если изменение метаболических путей не действует на затраты АТФ на конструктивный обмен, то такое изменение не должно учитываться при вычислении величины выхода биомассы из субстрата. Этот подход позволяет найти реалистичные оценки величин выходов биомассы или органических продуктов из субстрата на основе биохимической информации о метаболизме данного субстрата. Он является основой технологических расчетов режимов культивирования, например, в случае высоких концентраций биомассы. Он позволяет также осуществлять мониторинг растущей популяции в режиме реального времени, что является источником качественно новой информации о процессе ее жизнедеятельности. Новый способ культивирования - бистат, разработанный нами на основе ионного и материально-энергетического балансов роста, обеспечивает устойчивое культивирование во всем диапазоне концентраций влияющего на рост субстрата S, в том числе при тех значениях S, которые неосуществимы известными методами (хе-мостат, турбидостат, рН-ауксостат). Разработанная нами базовая распределенная модель роста микробной популяции и решения конкретной распределенной модели для системы «клетки-среда» выявляют ряд новых свойств поведения клеточных популяций с учетом их физиологической гетерогенности, что также важно в приложениях к технологическим процессам. Наконец, изохронный портрет популяций и других динамических объектов позволяет определить время достижения стационарного состояния системы с заданной точностью.

Апробации работы. Результаты работы доложены и обсуждены в 22 сообщениях на 18 отечественных и зарубежных конференциях разных лет: 1st International Symposium on Advances in Microbial Engineering (Marianske Lazne, Czechoslovakia, 1972), Ш Всесоюзное совещание по управляемому биосинтезу и биофизике популяций (Красноярск, 1973), Всесоюзные конференции по лимитированию и ингибированию процессов роста и микробиологического синтеза (Пущино, 1976, 1980 - 2 сообщения), Седьмая Всесоюзная конференция по калориметрии (Черноголовка, 1977), Всесоюзные совещания по непрерывному культивированию микроорганизмов (Москва, 1978, Киев, 1981-2 сообщения), съезды Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980, Алма-Ата, 1985 - 2 сообщения), International Symposia on Continuous Cultivation of Microorganisms (Prague, 1978, Hradec Kralove, Czechoslovakia, 1987 - 5 сообщений), FEMS International Symposia (Hradec Kralove, Czechoslovakia, 1981, Пу-

щино, 1983 - 2 сообщения), 1 Всесоюзное совещание по культивированию клеток животных и человека (Пущино, 1983), 1 международная школа по автоматизации научных исследований (Пущино, 1985), IV Всесоюзная конференция "Управляемое культивирование микроорганизмов" (Пущино, 1986 - 2 сообщения), Всесоюзная конференция «Биоконверсия-88» (Рига, 1988), 15th International Symposium on Yeasts (Riga, 1991), Международная конференция «Математика, компьютер, образование» (Пущино, 2003).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 51 публикациях, из которых в рецензируемых изданиях 46 (22 в отечественных и 24 в зарубежных изданиях).

Структура и объем работы. Результаты работы изложены в пяти главах. Глава 1 представляет собой обзор литературы по теме диссертации. В ней описаны экспериментальные методы, применяемые при исследовании роста микробных культур, основные экспериментальные результаты и теоретические подходы, относящиеся к росту микроорганизмов и известные к началу соответствующих наших исследований. Глава 2 посвящена описанию разработанного нами физико-химического подхода (метода материально-энергетического баланса - МЭБ) к описанию баланса вещества и энергии в процессе метаболизма клеток. Основой этого подхода являются новая система отсчета термодинамических характеристик веществ-участников метаболизма и принцип разделения метаболизма на парциальные обмены. В главе 3 описаны приложения метода материально-энергетического баланса к росту микробных популяций. Выведены общие закономерности, описывающие перераспределение вещества и энергии субстратов в процессе роста и образования продуктов жизнедеятельности клеток. Дано решение ряда конкретных теоретических и прикладных задач, относящихся к энергетике метаболизма в целом, к связи между его стехиометри-ческими и скоростными характеристиками. Изложены принципы теории ионного баланса и основы разработанного нами нового способа непрерывного культивирования микроорганизмов - бистата. Глава 4 посвящена экспериментальным исследованиям новых или недостаточно изученных свойств баланса и кинетики роста микробных популяций. Полученные зависимости скоростей метаболических процессов и выхода биомассы интерпретируются на основе теории материально-энергетического баланса. В главе 5 описаны разработанная нами базовая математическая модель роста микробных популяций и решения, полученные для одного из вариантов этой модели. Модель является распределенной, и ее решения обладают новыми свойствами по сравнению с решениями сосредоточенной модели. В этой же главе описаны приложение понятия изохро-

ны к сосредоточенным моделям микробного роста и математическая модель бистата. Завершают основной текст диссертации Заключение и Выводы. Кроме того, имеется Приложение - таблицы материально-энергетических характеристик химических соединений и биомассы микроорганизмов, содержащие данные, на которых основаны положения Главы 2. Объем основного текста 190 стр., Приложения 30 стр. Список литературы содержит 417 названий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В ГЛАВЕ 1 дан обзор научной информации, относящейся к теме диссертации и опубликованной к началу соответствующих наших исследований.

Описаны способы непрерывного культивирования микробных популяций, обеспечивающие постоянство, устойчивость и воспроизводимость свойств объекта исследования - хемостат, рН-ауксостат и другие. Современная техника культивирования позволяет стабилизировать температуру, рН, рОг и другие параметры среды в ферментерах - специальных биореакторах, где происходит рост культуры. Даны определения количественных характеристик роста, отражающих а) скоростной аспект - удельные скорости роста биомассы, потребления субстратов, образования продуктов, б) стехиометрический аспект - выходы биомассы и продуктов по отношению к субстратам, прежде всего, имеющим отношение к получению клетками энергии (органический субстрат, кислород и другие аналогичные субстраты), в) состав биомассы - элементный и макромо-лекуляриый.

Описаны первые попытки сформулировать элементный баланс роста микробных культур, основанный на законе сохранения вещества по всем химическим элементам (Тамия, 1932; Клифтон, 1939; Баттли, 1960 и др.). Эти попытки выявили факт связи между количествами потребляемых субстрата и кислорода, позволили понять некоторые свойства этой связи, по не дали обобщенного описания материального баланса роста и его связи с балансом энергии.

Баланс энергии исследовался отдельно. Большое внимание уделялось измерениям тепловыделения микроорганизмов (Dubnmfaut, 1856; Pasteur, 1864, 1875; Rubner, 1911; Meyerhof, 1911; Terroine et al, 1925; Calvet, 1945 и др.). Эффективность и скорость ассимиляции энергии субстрата клетками изучались различными калориметрическими методами. Таусон (1933) определял теплоту сгорания микробной биомассы и сравнивал ее с количеством энергии потребленного субстрата. В последние десятилетия XX века были разработаны специальные подходы и аппаратура для калориметрии клеточных популяций, которые дали возможность измерять тепловыделение при росте клеток в малых

объемах сред и в ферментерах (Cooney et al., 1969,1978; Poole et al., 1973; Aiba et al., 1975; Volesky et al., 1981,1982; Marison et al., 1987; Kleeffet al., 1995 и др.). Тепловыделение всегда вызывало повышенный интерес как характеристика, от которой ожидали особенной информации о метаболизме. Сам факт такого ожидания является проблемой, заслуживающей отдельного изучения.

Некоторые исследователи (Servizi, Bogan, 1963; McCarthy, 1965; Payne et al., 1967) использовали известный в химии факт - приблизительную пропорциональность между количеством кислорода, прореагировавшего при сгорании органических соединений, и изменением свободной энергии Гиббса G и энтальпии Я в ходе этого процесса (Thornton, 1917; Kharash, Sher, 1925). Это было начало исследований в области, названной нами материально-энергетическим балансом метаболизма клеток, роста микроорганизмов. Эти работы содержали в себе часть того, что вошло в разработанную нами теорию, но не довели данную линию исследований до получения полной и завершенной концепции, а также широких ее приложений. В частности, Payne ввел единицу восстановлен-ности, которую он назвал «доступный электрон» (available electron) и которая имела недостаточно четкое определение и ограниченную применимость.

Важным шагом в понимании влияния метаболизма клеток на кинетику и баланс роста популяции явилось разделение потребленного энергетического субстрата на две части, затрачиваемые на рост и на поддержание клеток (Du-claux, 1898; Иерусалимский, 1963; Маге et al., 1963; Pirt, 1965). Это разделение привело к формулам, описывающим связь удельной скорости потребления субстрата и выхода биомассы с удельной скоростью роста

где «максимальный» выход, т% - скорость затрат субстрата на поддержание клеток. Многие эксперименты подтвердили с большой точностью это соотношение для органических субстратов и для кислорода (Herbert, 1958; Martin, Hempfling, 1976). Стаутхамер с сотр. (1970) сделал следующий шаг - он разделил затраты АТФ в клетке по этому принципу (на рост и на поддержание клеток), введя тем самым биохимическую интерпретацию подобного разделения. Но связь продукции и затрат АТФ с потоками вещества в метаболизме оставалась невыясненной. Кроме того, были получены экспериментальные данные о

взаимосвязи q%w. ¡л, показывавшие изменение парам ¿зГфЮявв зависимости от вида лимитирующего рост субстрата (Pirt, 1982). Удовлетворительного

объяснения эти данные не получили. Зависимость от условий среды оставалась малоисследованной.

В литературе опубликовано большое количество математических моделей полиферментных систем и клеточных (главным образом, микробных) популяций (Романовский, Степанова, Чернавский, 1975; Иваницкий, Кринский, Сель-ков, 1978; Вавилин, Васильев, 1979; Бирюков, Кантере, 1985; Рубин, Пытьева, Ризниченко, 1987; Варфоломеев, Калюжный, 1990; Паников, 1991; Рубин, 2000 и др.). В главе 1 дан их обзор. Отмечено, что модели делятся на 1) неструктурированные и структурированные (последние учитывают влияние внутриклеточных переменных на динамику популяции) и 2) сосредоточенные (описывающие состояние популяции конечномерным вектором концентраций и поэтому использующие обыкновенные дифференциальные уравнения, ОДУ) и распределенные, описывающие множество клеток с помощью функции распределения и использующие уравнения в частных производных, УрЧП. Модели с ОДУ чаще используются исследователями, их разнообразие шире, они легче поддаются исследованию. Однако точечные модели уступают распределенным по возможностям отражения физиологической гетерогенности популяции (различий в возрасте, величине клеток, содержанию в них ключевых соединений). Распределенные модели имеют недостатки в формулировке системы уравнений, сложны для исследования, и поэтому отсутствовали детальные исследования поведения их решений для биофизически интересных ситуаций, когда имеет место существенное взаимное влияние клеток и их среды.

В последнем разделе главы 1 описан векторно-матричный подход к составу химических соединений и стехиометрии химических реакций (Лпб, 1965; Степанов и др., 1976). Этот подход имеет большие возможности для применения к отдельным реакциям и системам из любого числа реакций. До наших работ он не использовался в биоэнергетике.

В ГЛАВЕ 2 изложены принципы физико-химического подхода, разработанного нами для описания балансов вещества и энергии в клеточном метаболизме в их тесной взаимосвязи. Этот подход основан на уникальном свойстве органических соединений, о котором упомянуто в Главе 1 - приблизительной пропорциональности теплоты сгорания и изменения стандартной свободной энергии при сгорании этих веществ количеству кислорода, прореагировавшего в ходе этого процесса. Это количество О2 связано с элементным составом химического соединения через величину, названную нами степенью восстанов-ленности вещества. Именно единица восстановлепности имеет приблизительно

одинаковую энергетическую ценность в органических соединениях. Поэтому потребовалось наиболее общее и корректное определение восстановленности.

Наша работа в этой области началась с общего уравнения элементного баланса роста и с расширения введенного Payne (1967) понятия доступного электрона (электрона, принадлежащего орбиталям, обеспечивающим межатомные связи в молекуле и переходящего на свободный кислород в процессе сгорания вещества). Поскольку этот подход имел ограниченные возможности и не обеспечивал необходимый уровень корректности используемых понятий, нами был разработан новый подход к определению восстановленности. Он основан на введении альтернативной системы отсчета для состава веществ и их термодинамических потенциалов. До сих пор в химической термодинамике использовалась одна система отсчета - от чистых веществ, имеющих заданное стандартное состояние. Это Н2, О2, N2 (газы), С (графит), Р и S (в определенных кристаллических модификациях) и т.д., все при 25°С (298,15 К) и давлении 1 атм. Этим веществам по соглашению приписываются нулевые значения потенциалов образования (энтальпии Н, свободной энергии Гиббса G и др.). Лишь немногие из этих веществ непосредственно участвуют в метаболизме клеток, причем только кислород является распространенным метаболитом. Поэтому мы предложили использовать другую систему отсчета, связанную с иным набором веществ, которые рассматриваются как образующие данное химическое соединение.

Элементный состав любого химического соединения может быть представлен как вектор в конечномерном пространстве, число измерений которого равно числу химических элементов плюс единица (последняя соответствует электрону как дополнительной материальной компоненте для ионов). Например, глюкоза, триметиламии, ацетат-ион и ион аммония имеют в такой системе состав: СбН^Ов. СзНбМ], СгНзОге], NiH^e.i (обозначения отличаются от традиционных написанием единицы как атомного числа и указанием заряда как числа дополнительных или удаленных электронов). Атомы и избыточные (либо недостающие) электроны представляют собой линейно независимые базисные векторы в пространстве всех возможных элементных составов химических соединений. Мы назвали этот традиционный базис химическим. Обозначая его компоненты (С, Н, О, N, Р, Fe, Mg, Na и т.д.) как ej, вектор элементного состава

и заряда любого соединения S записывается следующим образом: S = ,

где а} координаты состава (числа атомов и дополнительных электронов в молекуле).

Согласно свойствам векторного пространства, базисом в нем может быть также любой другой набор такого же числа линейно независимых элементов этого пространства. В данном случае это означает, что вместо набора атомов химических элементов плюс электрон можно взять в качестве базиса любую совокупность такого же числа веществ (электронейтральных или ионов), которая должна также удовлетворять требованию линейной независимости. Это означает, что ни одно из веществ нового базиса не может быть в отношении своего элементного состава быть получено с помощью формальной химической реакции из остальных веществ этого же базиса. Обозначая новый набор базисных векторов через мы получили представление состава любого вещества

как вектора, разложенного по другому базису: - новые ко-

ординаты состава (числа молекул веществ нового базиса, необходимые для образования данного вещества из них). Каждый из базисных векторов одной системы разлагается по другому базису: . Эквивалентность

обоих базисов имеет место, если определители матриц не равны нулю.

В качестве нового базиса мы предложили следующую совокупность веществ: 1) двуокись углерода и вода, которые соответствуют нулевому уровню энергии, доступной клеткам при использовании ими органических субстратов; 2) аммоний, ортофосфат и сульфид водорода, в которых азот, фосфор и сера имеют электронное состояние, наиболее близкое к их состоянию в большинстве биополимеров клетки; 3) металлы и галогены в максимально ионизированной форме; 4) протон. Все вещества взяты в стандартном водном состоянии, принятом в биохимии (25°С, 1 атм, рН = 7): Н4", НС03", ШД НР04", ЦБ, Ре3+, Си2+, СГ и т. д. Эту совокупность веществ Е; мы назвали физиологическим базисом (Ф-базисом).

Для того, чтобы Ф-базис обладал свойством полноты, он должен содержать свободный кислород. Кислород отнимается от прочих , чтобы образовать органические соединения; при этом возникает свойство, которого не было у НгО, НСОз", НРО4", Бе3+ и др. - восстановленность. Удобно определить базисное вещество (БВ), связанное с Ог, так, чтобы его вложение (положительное значение соответствующей компоненты вектора S) соответствовало восстановлению остального набора и чтобы одна единица такого БВ соответствовала одному электрону, переходящему на кислород при окислении - процессе, об-

ратном образованию восстановленного вещества. Это БВ было определено нами как — ^Ог и названо новым термином «редоксон» (RO).

В обычном, «химическом» базисе состав соединения определяется атомными числами а-^ в Ф-базисе - величинами а^, которвгс связанв1 с а^ соотношением <2; = • Число RO в молекуле вещества любого состава равно

ако = ае- + 4ас + ан-2ао-Зсгн+... (2)

Примеры значений «дометан этанол глюкоза пируват" Ь-лейцин^" С02 02

Показано, что в химических реакциях действует закон сохранения числа единиц базисных веществ - сумма единиц каждого БВ для всех субстратов (с учетом стехиометрических коэффициентов) равна такой же сумме для продуктов. В химическом базисе это - известные законы сохранения вещества по химическим элементам и сохранения заряда. В Ф-базисе это означает, в частности, закон сохранения восстановленности (числа RO). Молекула свободного кислорода имеет -4 RO; это означает, что она нейтрализует 4 редоксона восстановленного вещества при его окислении.

Для разработки термодинамических основ материально-энергетического баланса бвшо необходимо пересмотреть определения термодинамических потенциалов с точки зрения их связи с балансом вещества и энергии в процессе химических реакций, имеющих конечные значения скоростей и идущих в неравновесных условиях. Это было сделано для случая, когда учитывалось только химическая неравновесность. Уравнения баланса энергии и баланса вещества:

В (3) учтены три возможный механизма обмена энергией - поток тепла, перенос потоками вещества и работа, в (4) - два механизма изменения количества ь го вещества - массообмен с окружающей средой и химические реакции. Далее

введена обобщенная функция состояния Y(U,x, N),,

скорость изменения во вре-

мени которой равна

^ = +У—^ + ^ (5)

Л ди а к дхк Ж ^дЫ; л ( }

Из (3) - (5) было найдено, что существует функция Г = Л (и, Ж, я) такая, что

¿И , . , ГМ пи! »1п т тП\Л 1

(6)

Эта функция является обобщенной энтальпией и равна

Я= U+ W{x) + Const,

где W - потенциал сил Д. Соотношение (6) справедливо всегда, когда существует потенциал W, и не требует постоянства давления, температуры и т.д. «Обычная» энтальпия.//= U+pVявляется частным случаем этого обобщенного термодинамического потенциала. На этой основе введено и понятие обобщенной свободной энергии

G= U+ Ж(х)-TS+ Const, которая при Т= Const удовлетворяет тому же соотношению, что и «обычная» свободная энергия Гиббса:

= Этот подход к образованию термодинамических потенциалов

позволил сделать ряд обобщений и уточнений термодинамических соотношений. Его преимуществом является использование скоростей вместо дифференциалов, благодаря чему становится явным различие величин, характеризующих содержание вещества и энергии в системе, и потоков (например, тепла). Вышеописанное определение энтальпии и свободной энергии (как в обобщенной форме, так и для «обычных» НИG) подчеркивает связь этих функций с балансом вещества и энергии в открытых системах и является обоснованием используемого нами термин «энергетический уровень редоксона».

Введение Ф-базиса позволило определить энергетический уровень химических соединений относительно точки отсчета, связанной с нижним концом дыхательной цепи. На основе векторно-матричного подхода получены формулы для изменения величины любого термодинамического потенциала Z (то есть Я, G и т.д.) в ходе реакции:

** = I>kZe(Sk) = £vkZ6( Sk) (7)

где к - номер вещества-участника процесса, - векторы состава этих веществ, - стехиометрические коэффициенты, - потенциалы образования веществ в химическом базисе и в Ф-базисе. Соотношение (7) справедливо как для действующих значений потенциала так и для его стандарт-

ных значений Z°. Равенство (7) было использовано для получения формулы расчета Д2Г0 в реакции образования любого вещества S из базисных веществ Ej, то есть для нахождения стандартных значений свободной энергии Гиббса G и энтальпии Н относительно нуля Ф-базиса. Такие расчеты были сделаны для ряда веществ, представляющих те классы органических соединений, которые участвуют в метаболизме как субстраты, продукты, интермедиаты или мономеры-лекул (углеводороды, спирты, органические кислоты, моно- и дисахариды, аминокислоты и др.). Соответствующие стандартные значения G и Нразделены на число редоксонов в молекуле aRQ. Полученные вели н а -рактеризуют энергетический уровень редоксонов в рассматриваемых веществах.

Значения как GR0, так и Нко у органических соединений, участвующих в метаболизме, оказались близкими к постоянным величинам, что ожидалось нами, исходя из пропорциональности теплот сгорания количеству присоединенного кислорода (см. выше). Средние значения для водного стандартного состояния равны, соответственно, 115,6 и 111,8 кДж/экв. RO, средний разброс -4% и 2% от этих средних. Это свойство отсутствует у неорганических соединений, а также у некоторых видов органических веществ (например, хлороргани-ческие соединения), нетипичных для метаболизма клеток. Отдельно в этом отношении стоит свободный кислород как вещество, связанное с определением Ф-базиса. Молекула 02 содержит -4 RO, причем GRO(02) = ЯКО(02) = 0.

Таким образом, метаболизм клеток представляет собой движение редоксо-нов от вещества к веществу на приблизительно одинаковом энергетическом уровне. (Исключение составляют электрон-транспортные цепи (см. ниже), а также одно- или двухуглеродные соединения с напряженной конфигурацией орбиталей). Исходя из этого, мы предположили, что энергетический уровень RO в биомассе клеток имеет ту же величину. Поскольку величина G для биомассы не определена, в качестве меры энергетического уровня RO рассматривалась только энтальпия. Измерения, сделанные с нашими образцами биомассы

и пересчет литературных данных показали Н около 114-115 кДж/экв. RO

(близко к Н низкомолекулярныхсоединений).

Приблизительное равенство значений GR0 в разных органических соединениях, а также закон сохранения редоксонов, объясняют тот факт, что метаболические реакции, в которых не участвует кислород, в той или иной степени близки к состоянию равновесия. Отклонения от равновесия происходят за счет

того, что значения б110 участников реакции по-разному отклоняются от среднего значепия этой величины. С другой стороны, в мембзанных электрон-транспортных цепях редоксопы в процессах окисления «опускаются» от стандартного энергетического уровня (восстановленные пиридиновые нуклеотиды и другие переносчики восстановленности) в конечном счете до нуля, соответствующего воде. При функционировании таких цепей возможно и «поднятие» ре-доксонов (например, у фотосинтезирующих организмов). Возможность такого большого изменения энергетического уровня имеется только для транспортируемых редоксонов (1-2 на молекулу переносчика) за счет того, что небольшая разница средних уровней (7Я0 у восстановленной и окисленной форм переносчика сосредоточивается на переносимых RO. В неорганических соединениях (например, пара нитрит-нитрат) редоксоны имеют энергетический уровень заметно отличающийся от среднего для органических веществ. Это определяет возможность участия таких соединений в качестве акцепторов или доноров восстановленности для электрон-транспортных цепей на участках, расположенных «выше» их нижнего конца, соответствующего воде. Поскольку функционирование таких цепей состоит именно в переносе восстановленности, а передача электронов является лишь частью этого процесса, то имеет смысл рассматривать их как редоксон-транспортные цепи.

Концепция термодинамики химических реакций в Ф-базисе разрабатывалась нами для приложений к метаболизму. Однако она имеет и более общее значение. Понятие редоксона объединяет «старое» (кислородное) и «новое» (электронное) определение окисления-восстановления. Вычисление констант равновесия реакций в Ф-базисе проще, чем в химическом, так как значения базисных веществ Ф-базиса (вода, двуокись углерода, протон, аммоний и т.д., равны нулю.

В ГЛАВЕ 3 изложена теория материально-энергетического баланса роста клеточных популяций и образования ими продуктов метаболизма, физико-химические основы которой описаны в Главе 2. В Главе 3 также описан ряд приложений этой теории.

Использование Ф-базиса позволило унифицировать энергетическую картину метаболизма. Согласно сказанному в Главе 2, в общем случае хемогетеро-трофного роста на органическом субстрате метаболизм может быть представлен как перераспределение редоксонов согласно схеме рис. 1А. Согласно закону сохранения редоксонов,

длт8 = ДЛТВ + Д^р + ДЛТ0 (8)

Члены левой и правой частей (8) означают числа ЯО, соответственно, потребленного субстрата, образованных биомассы и органических продуктов метаболизма и редоксонов, прошедших по дыхательной цепи. Последние в конечном счете уничтожаются отрицательными ЯО кислорода, их энергия превращается в тепло. Остальные редоксоны сохраняются в образованных биомассе и органических продуктах.

Рис. 1. Схема материально-энергетического баланса хемогетеротрофного роста клеточных популяций. А - перераспределение редоксонов субстрата в процессе метаболизма. Б - парциальные обмены и связь между ними через протоны с высоким потенциалом (Н+) и макроэргические связи (МЭС). Обозначения парциальных обменов: 1 - конструктивный, 2 - дыхательный, 3 - продуктный, ПК - поддержание клеток. Штриховая линия изображает нулевой энергетический уровень Ф-базиса.

Именно редоксоны дают корректную количественную меру, позволяющую сопоставить потоки в столь разных метаболических путях. Существенная близость их энергетических уровней в субстратах и биомассе позволяет использовать в качестве обобщенной характеристики эффективности роста величину Т7Х/5 = ДЛ^В/ДЛГ5 , которая представляет собой энергетический выход биомассы из субстрата. Аналогичная величина характеризует выход продукта из субстрата: т)т = ДЛГр/ДЛГ8.

Энергетические выходы связаны с выходами по массе

'Р/Б

Пр/э

(9)

О'вГв <7рГр

где - доля углерода в массе соответствующего вещества,

среднее число ЯО на 1 атом С в его молекуле (степень восстановленности углерода данного соединения или биомассы). Значения сг3, сгР и ур однозначно заданы элементным составом соответствующих веществ. Нами обнаружено, что для биомассы различных микроорганизмов значения весьма ста-

бильны и имеют значения 0,46 (±5%) и 4,2 (±3%). (Исключение составляют микроорганизмы, способные к сверхсинтезу липидов - у них в условиях, вызывающих накопление липидов в биомассе величины сгв и /в возрастают.) Точные значения для биомассы данного организма, выращенного в заданных условиях, находятся с помощью анализов элементного состава выращенной биомассы. Соотношения (8) могут использоваться для нахождения энергетических выходов или из экспериментально измеренных выходов по массе или для предсказания возможных выходов по массе с помощью теоретически рассчитанных величин

Значения энергетического выхода биомассы Т]-^ являются наиболее адекватным критерием сравнения эффективности роста на различных субстратах, поскольку в отношении единицы измерения числителя и знаменате-

ля имеют одинаковую энергетическую ценность. В то же время энергосодержание единицы массы разных субстратов существенно различается в зависимости от их восстановленности. Поэтому, например, реальная (измеренная по эффективность роста микроорганизмов на н-алканах в 1,5 раза ниже, чем на углеводах (0,4 и 0,6), тогда как выход по массе, напротив, на н-алканах вдвое выше, чем на углеводах (1,0 и 0,5). При одном и том же значении выход по массе пропорционален восстановленности субстрата сгд^ (см. (9)).

Рост биомассы клеток всегда требует затраты энергии, которая получается за счет дыхания или (при брожении) образования органических продуктов. Поэтому всегда Следовательно, верхней оценкой величины энергетического выхода биомассы является неравенство В противном случае гетеротрофный рост должен был бы проходить при потреблении тепла из среды (вечный двигатель второго рода) с выделением образованного клетками свободного кислорода. Значение Т7х/8= ' никогда не может быть достигнуто и, тем более превышено.

Уравнение (8) оценивает баланс метаболизма как «черного ящика». В то же время концепция редоксонов является эффективным инструментом для анализа внутриклеточного материально-энергетического баланса. Она позволяет выразить в строгой количественной форме характеристики роста популяции через характеристики клеточного метаболизма, в частности, получить более точные оценки выхода биомассы. Для этого нами был рассмотрен баланс промежуточных переносчиков энергии в клетках, таких, как макроэргические связи (МЭС) в нуклеозидтрифосфатах и других соединениях, а также ионы, обла-

дающие высоким значением трансмембранного электрохимического потенциала (ТЭП).

Поскольку в метаболизме имеются участки, связанные с запасанием энергии в форме МЭС и ТЭП и участки, где эта энергия потребляется, то возникла проблема такого разделения метаболизма на парциальные (частные) обмены, которое наиболее удобно для анализа потоков МЭС и ТЭП. Решением этой задачи является принцип параллельного деления метаболизма, состоящий в следующем. Каждый парциальный обмен есть совокупность биохимических реакций, осуществляющих преобразование субстрата в биомассу (конструктивный обмен), органический продукт (продуктный обмен) или полное окисление (дыхательный обмен). Каждый такой обмен сбалансирован по всем веществам, кроме носителей МЭС и ТЭП. Поэтому потоки ЯО субстрата, входящие в каждый парциальный обмен, равны соответственно потоку ЯО образованной биомассы, органического продукта и потоку ЯО, идущему по дыхательной цепи. Ряд биохимических реакций при этом включается одновременно в два или более парциальных обмена, а общий поток, идущий через каждую такую реакцию, разделяется на соответствующее число частей. Это деление имеет лишь балансовый (стехиометрический) аспект - в кинетическом плане каждая реакция регулируется как единый процесс.

В наиболее сжатой форме потоки через три парциальных обмена изображены на рис. 1Б, причем параллельные горизонтальные участки следует считать идущими на приблизительно одинаковой высоте, изображающей энергетический уровень ЯО. На рис. 2 дан пример трех парциальных обменов для случая роста на глюкозе.

Конструктивный обмен переводит энергию субстрата в энергию, запасенную в веществе новообразованной биомассы. Кроме того, клеткам нужна дополнительная энергия для обеспечения прохождения конструктивного обмена и для поддержания существующей биомассы. Поэтому конструктивный обмен всегда затрачивает энергию МЭС и ТЭП, превращая ее в тепло и таким образом обеспечивая необратимый поток от субстрата до биомассы. Дыхательный обмен, напротив, служит источником ТЭП и МЭС. Продуктный обмен может быть либо источником, либо потребителем внутриклеточных переносчиков энергии, либо ни тем, ни другим, в зависимости от пары субстрат-продукт. В частности, при сбраживании глюкозы продуктный обмен является анаэробным источником МЭС, получаемых путем субстратного фосфорилирования.

Рис. 2. К понятию парциальных обменов. Схема продуктного (1), дыхательного (2) и конструктивного (3) обменов при росте микроорганизмов на глюкозе. ЭМП - путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, ЦТК - цикл трикарбоновых кислот. ЩУК -щавелевоуксусная кислота.

Существует также расход МЭС, связанный с поддержанием клеток (cell maintenance). Это еще один парциальный обмен, связанный с круговоротом вещества в клетке (деградация макромолекул и их повторный синтез, утечки градиентов веществ через мембраны и активный транспорт в противоположном направлении для восстановления этих градиентов и т.д.). Скорость такого круговорота полностью или частично независима от роста биомассы.

Равенство количеств образованных и использованных МЭС и высокоэнергетических протонов является важнейшим фактором общего энергетического баланса клеток. Использование этой концепции можно видеть на примере аэробного роста на органическом субстрате в отсутствие заметных количеств органических продуктов. Введем обозначения:

- число макроэргических связей, необходимых для прохождения количества вещества, содержащего 1 экв. ЯО, через конструктивный обмен, <Х>Н - отношение числа ЯО, прошедших по всей электрон-транспортной цепи к числу протонов, получивших ВВ1СОКИИ

Фм - отношение числа протонов, перенесенных в обратном направлении (вдоль градиента ТЭП) к числу образованных МЭС, (Н7Р!), Ч'п = 1/ФмФ

м^н

эффективность образования МЭС в окислительном обмене,

близкая к 1/2 Р/О,

- удельные скорости потребления субстрата, роста биомассы и дыхания (все в экв. ЯО на 1 экв. ЯО существующей биомассы в час), гм - поток Н* через АТР-азную систему, генерирующую МЭС (экв. Н* на 1 экв. ЯО существующей биомассы в час),

- удельные скорости затрат на поддержание клеток и диссипацию в виде утечек, соответственно, высокоэнергетических протонов (экв. Н7экв. ЯО ч) и макроэргических связей (экв. МЭС/экв. ЯО ч).

Тогда материально-энергетический баланс роста популяции клеток описывается следующими уравнениями баланса ЯО, МЭС и высокоэнергетических протонов:

'8 = И + гО (10)

»Ъ/фн = гм + Хн (Н)

гм/Фм = /Л'в + Хм (12)

Отсюда следуют выражения для , аналогичные (1):

(13)

где

(14)

Аналогичные результаты получены нами для случая анаэробного роста, когда источником МЭС является исключительно продуктный обмен (например, при сбраживании углеводов), для хемогетеротрофного роста в общем случае, когда

функционирует дыхательная цепь и одновременно имеет место образование восстановленных продуктов метаболизма.

У микроорганизмов, ассимилирующих одноуглеродные соединения, существуют отдельные электрон-транспортные системы, связанные с окислением метана и метанола (у дрожжей они локализованы в пероксисомах, а не в митохондриях). Эти системы имеют слабое сопряжение с процессами запасания энергии, либо такое сопряжение вообще отсутствует. Метод МЭБ позволяет легко учесть эти особенности метаболизма. Вместо уравнения (10) имеет место:

^ =М+ 'Ы + го (15)

где г0 И г01 - скорости потоков RO через основную электрон-транспортную цепь и дополнительную, ответственную за окисление, например, метанола. Значения Тд! и ^ жестко связаны стехиометрией соответствующих реакций: г01 = Тогда в случае, когда цепь 2 не запасает энергию окисления ее субстрата, вместо формул (14) получаются аналогичные выражения, но у появляется множитель в числителе, а у в знаменателе. Это означает снижение максимального выхода и увеличение скорости затрат на поддержание клеток.

Отдельный интерес представляет исследование энергетики фотосинтези-рующих микроорганизмов, у которых источником энергии является не субстрат, а свет. Нами был исследован рост пурпурных бактерий, обладающих только одной фотосистемой. У этих организмов имеет место процесс анокси-генного фотосинтеза. Среди субстратов, необходимых для их роста, обязательно присутствует источник восстановленности, например, лактат или водород. Свет служит источником энергии для образования МЭС и протонов с высоким ТЭП. Для этих организмов нами введено понятие энергетического (фотосинтетического) парциального обмена. Его осуществляют переносчики редоксонов, обеспечивающие их циклический переход от низкоэнергетического состояния (НЭС) к высокоэнергетическому (ВЭС) и обратно. Переход НЭС—>ВЭС происходит за счет энергии поглощенных фотонов. Обратный переход сопряжен с переносом протонов против градиента ТЭП. Запасенная энергия затем преобразуется в энергию МЭС (АТР). Затем оба вида переносчиком используются в конструктивном обмене и процессах поддержания клеток. На рис. 3 показаны схемы конструктивного и энергетического метаболизма пурпурных бактерий, а также их взаимосвязи в общем балансе роста.

Анализ, подобный описанному выше, показал, что формулы (13) являются общими. Они описывают взаимосвязь скорости потребления субстрата и выхо-

Рис. 3. Материально-энергетический баланс фотосинтезируюших микроорганизмов с одной фотосистемой (I). 1 - конструктивный обмен. 2 - энергетический (фотосинтетический) обмен. 3 - связь между парциальными обменами через протоны с высоким потенциалом (Н+) и макроэргические связи (МЭС). ВЭС и НЭС, соответственно, - высоко- и низкоэнергетическое состояния первичных стабильных продуктов фотосинтеза, ПК - поддержание клеток.

да биомассы с удельной скоростью роста для любого субстрата, если он служит источником энергии для продвижения редоксонов по конструктивному обмену и для поддержания клеток. Таким источником является восстановленный химический субстрат для хемотрофных организмов, свет для фотосинтетиков. Эти же формулы справедливы и для субстратов - акцепторов редоксонов, прежде всего для кислорода, поскольку поток RO в начале дыхательного обмена равен потоку в его конце. Формулы типа (14) отличаются для случаев, когда источник

энергии - химическое соединение или свет, когда присутствуют или нет органические продукты, но структура этих формул во всех случаях аналогична (14).

Отсюда видно, что скорость энергетических затрат на поддержание клеток ти™ и максимальный энергетический выход биомассы (выход по RO в отсутствие вышеупомянутых затрат) Т}^ имеют простое выражение через биоэнергетические характеристики метаболизма. Эти характеристики по т$(някн1тягв течение десятков лет исследователями, применяющими экспериментальные методы высокого уровня, специфические для каждого из конкретных участков метаболизма (Уотсон, 1978; Ленинджер, 1974, 1993; Спирин, 1971; Скулачев, 1989; Рубин, 2000). Метод материально-энергетического баланса позволил произвести «сборку» этих результатов и получить интегральную картину преобразования энергии при росте клеточных популяций.

Опубликованные в литературе данные о стехиометрии транспорта протонов через мембраны при функционировании электрон-транспортных цепей, имеющих три точки сопряжения, дают известные значения: еТН1" = Фн = 1/6,

Н7Р, = Фм = 4 (Elston, Wang, Oster, 1998), откуда Р/2е"== 2/(ФмФн) = 3. Были выполнены работы по подсчету числа МЭС, необходимых для конструктивного обмена (Оига, 1972; Stouthamer, 1973). Исходными данными для них послужили многочисленные сведения о биохимических реакциях, начинающихся с мета-болизации глюкозы или этанола, и кончающихся синтезом белка, нуклеиновых кислот, липидов и т.д. Затраты МЭС были рассчитаны этими исследователями на 1 г сухого вещества биомассы микроорганизмов типичного состава. Мы пересчитали эти затраты на 1 экв. RO биомассы и получили, что должно

иметь значения 0,1-0,2 экв. МЭС/экв. RO. Подстановка в (14) дает 77^ = 0,88-0,94. Наибольший энергетический выход, достигнутый в экспериментах, проведенных многочисленными исследователями, равен 0,63; он был получен при использовании моно- и дисахаридов, прежде всего, глюкозы и сахарозы. Поскольку рост на углеводах является очень хорошо изученным процессом, есть основания полагать, что = 0,6-0,63 - реальный верхний предел энергетической эффективности роста.

Возможны два объяснения расхождения этого значения с более высокими оценками, указанными выше. 1) Не все затраты МЭС были учтены при подсчете их расходом на конструктивный обмен. При этом имеется возможность существования еще не известных затрат. 2) Существует гипотеза (Tempest et al.,

1976), согласно которой расходы энергии на поддержание клеток имеют слагаемое, пропорциональное удельной скорости роста. Тогда

Отсюда нами получено, что в формуле (14) для т™ величины и Хн меняются на Хмо и /Гно»ав *7х/5 величинЯ^меняется на Хт+Хн\!фм • Составляющие скоростей затрат на поддержание клеток, пропорциональные /л, с точки зрения баланса и кинетики роста клеточных популяций ведут себя так же, как обычные затраты МЭС на биосинтез вещества клеток, хотя их физический смысл кардинально отличается от последних. Из модифицированной формулы (14) для Цяъ = 0>6 получено: ЧЕ^ +Хт равно 1 при 4*0 = 1,5 и 0,67 при Т0 = 1. Для Ч'д = 0,1-0,2 значение %т + ЛГн^м лежит в пределах 0,7-0,9. Это на порядок выше, чем что указывает на необходимость специальных исследований для выявления природы процессов, описываемых слагаемыми , и механизмов регуляции, ответственных за их пропорциональность удельной скорости роста.

Разработанный нами подход позволил предсказывать реально достижимые значения выходов биомассы для организмов, использующих различные источники вещества и энергии при росте. Исходной величиной для получения таких оценок служит значение максимального энергетического выхода = 0,6. При использовании различных субстратов, в том числе и в случае фотосинтези-рующих микроорганизмов, конструктивный метаболизм различается начальными стадиями потребления субстрата, приводящими к «стандартным» метаболическим путям. Учет этих стадий не требует рассмотрения полной картины биохимических реакций. Этот учет дает поправку к полученному нами значению для конкретного субстрата. Таким образом нами были получены оценки максимального выхода клеток по редоксонам и по массе при росте различных микроорганизмов на метане, метаноле и этаноле, а также выхода биомассы пурпурных бактерий из поглощенного света при хемоавто-трофном росте на лактате и водороде. Для метана, метанола, этанола и лактата эти оценки совпадают с наибольшими экспериментально достигнутыми значениями. Рост пурпурных бактерий на водороде пока еще мало изучен, и теория предсказывает более высокие значения, чем полученные экспериментально. Получены также оценки наибольших выходов различных продуктов метаболизма из различных субстратов.

Теория материально-энергетического баланса роста клеточных популяций дала ряд других приложений, имеющих биофизическое и биотехнологическое значение. Выявление связей между различными потоками вещества и энергии, входящими в метаболизм и выходящими из него, позволило определить информативность различных измерений, проводимых с клеточными популяциями, и применимость параметров, измеряемых датчиками, для управления процессом культивирования.

Одно из этих приложений касается тепловыделения клеточных популяций. Конструктивный обмен протекает на энергетическом уровне, близком к постоянному. Тепловыделение при аэробном росте клеток в отсутствие продуктов метаболизма обусловлено только редоксонами, идущими через дыхательный обмен. Поэтому количество выделенного тепла при аэробном росте пропорционально количеству потребленного кислорода с универсальным коэффициентом, определяемым общим средним значением энтальпии RO в органических веществах.

Связь между потоками редоксонов, входящими в метаболизм и выходящими из него, в общем случае гетеротрофного роста описывается уравнением:

Гь = М + г0 + гР (17)

где Гр - удельная скорость образования продукта метаболизма, экв. RO на 1 экв. RO существующей биомассы в час). (17) - обобщение уравнения (10). Это означает, что измеряя три из этих величин, можно вычислить четвертую. Баланс углерода дает аналогичное уравнение, в котором вместо г0 участвует скорость выделения Если субстрат или продукт ионизирован, то измерение скорости подачи титрующего агента и запись баланса электрического заряда дают третье уравнение. Нами исследованы условия, при которых использование таких уравнений обеспечивает достаточную точность косвенных измерений, использующих такие уравнения. Была создана установка «ферментер-ЭВМ», использующая этот подход для мониторинга процесса культивирования микроорганизмов. Эта установка описана в Главе 4. Она использовалась при исследованиях роста дрожжей.

На основе теории баланса получены также формулы, описывающие рост микроорганизмов при высоких (порядка 100 и более г сухого вещества на литр) концентрациях биомассы, закономерности переключения лимитирования роста с одних субстратов на другие.

Наряду с балансом редоксонов нами исследованы ионный баланс и динамика содержания ионов в среде при росте клеточных популяций. Для рассмотрения баланса ионов в общем виде нами введена нумерация всех ионов, участ-

вующих в процессе, причем номера 1 и 2 присвоены Н* и ОН". Большинство ионных процессов в среде представляют собой присоединение или отщепление протона: I" + ^ О /"+1, где / - номер вида иона, п - его заряд. Для каждого / заряд изменяется в пределах Прочие ионные процессы нами не

рассматривались. Тогда для /^2:

(18)

где - скорость разбавления по ьму подаваемому потоку среды, Б - общая скорость разбавления, Г" - скорость обмена с потоком газа. Поскольку скорости ассоциации-диссоциации ионов на порядки выше, чем скорости метаболических процессов, соотношения между различными ионными формами в куль-туральной жидкости, совпадают с аналогичными соотношениями в отсутствие клеток с точностью е, где е«1 - отношение характерных времен метаболических и ионных процессов. Для протонов (/ = 1) из условия электронейтральности получено:

Ч ¡гз

(19)

где - удельный заряд биомассы, - общая концентрация всех форм ионов /-го вида, 7} (С7|) - их средний заряд (рассчитан нами в общем вид е^, - константа диссоциации воды.

Соотношения (18) и (19) позволили вывести уравнения динамики процесса непрерывного культивирования клеточных популяций в рН-статированных условиях. В случае, когда среды подаются двумя потоками, причем один из потоков имеет рН, равный величине уставки регулятора рН, а второй поток (£>2) служит титрантом, имеет место соотношение: ¡¿С = АИгде Л = (|Гш|ДСт)/ ¡Аг|, числитель А описывает титрующую способность потока

ЛЬ.Аг-1

Л, +

сумма (с учетом зарядов веществ) стехиомет-

рических коэффициентов, относящихся к субстратом, продуктам и к образованию клеточного заряда. Значение Л^ оценено на основе элементного состава биомассы клеток и ионизованности субстратов и продуктов метаболизма. На-

пример, при росте на электронейтральном субстрате в отсутствие ионизованных нелетучих продуктов с использованием аммония в качестве источника азота Ху практически равно доле азота в биомассе.

Из найденных соотношений следует, что автоматический регулятор поддерживает поток среды 2 (титранта) равным D2 — fjX/A. Исходя из этого, нами выведены уравнения динамики популяции при рН-статированном росте, отличающиеся от широко используемых (Глава 5). На этой основе нами разработан новый метод непрерывного культивирования - бистат, аппаратурная реализация которого описана в Главе 4. Бистат является обобщением существовавших ранее методов непрерывного культивирования - хемостат (Novick, Scillard, 1950) и рН-ауксостат (Печуркин с соавт., 1969, Martin, Hempfling, 1976). В рН-статированном хемостате поток титранта много меньше основного потока среды с субстратами, имеющего рН, равный или близкий к рН в ферментере. В рН-ауксостате, напротив, среда с субстратами и титрант - один и тот же поток. В бистате оба потока имеют значения равные друг другу или одного порядка величины. Функциональное отличие бистата состоит в том, что он обеспечивает устойчивое непрерывное культивирование во всем диапазоне концентраций субстратов (рис. 4).

I II III S

Рис. 4. Зоны устойчивости работы различных методов непрерывного культивирования. Хемостат устойчиво работает только в зоне I, рН-ауксостат для многих субстратов - только в зоне III. Бистат устойчиво работает при всех 8, в том числе и в зоне И, что важно для достоверного измерения кинетических параметров зависимости

Приложениям теории материально-энергетического баланса посвящен раздел 8 Главы 3, а также Глава 4.

В ГЛАВЕ 4 описаны проведенные нами экспериментальные исследования кинетики роста микробных культур. Постановка этих экспериментов, обработка

полученных данных и интерпретация результатов существенно основывались па наших теоретических исследованиях материально-энергетического и ионного баланса роста клеточных популяций.

Объектами исследования были этанолассимилирующие дрожжи Candida validd(Pichiamembranifaciens), Candida utilis, Candida maltosa, метанолассими-лирующие дрожжи Hansenulapolymorpha, метанолассимилирующие бактерии Methylobacillus viscosus. В экспериментах использовалась аппаратура для непрерывного культивирования микроорганизмов (ферментеры, системы регулирования), разработанная и изготовленпая в СКБ БП (ныне ИБП РАН, Пущино). Эта аппаратура была существенно модернизирована разработками нашей лаборатории - подразделения ИБФМ РАН. Сюда относятся системы подачи сред, системы для измерения скоростей расхода титранта и дыхания культуры, аппаратурные схемы для рН-ауксостата и бистата, а также комплекс «Ферментер-ЭВМ». Анализы концентраций биомассы, ее элементного состава, концентраций этанола и метанола в среде осуществлялись стандартными методиками. Эксперименты по одновременному измерению скоростей дыхания и тепловыделения проводились на аппаратуре Института биотехнологии (Лейпциг, Германия), дооборудованной по схеме, разработанной автором данной работы.

При обработке данных экспериментов использовались математические модели роста, включающие в себя соотношения материальпо-энергетического баланса. Параметры моделей находились методами поиска линейной и нелинейной регрессии, основанными на минимизации остаточной суммы квадратов отклонений теоретических кривых от экспериментальных данных. Использовалась разработанная нами компьютерная программа поиска нелинейной регрессии, применимая для обработки нескольких серий данных, полученных в разных экспериментах (в общем случае поставленных по разным схемам), если эти данные относятся к одному и тому же объекту и описываются общей моделью.

Главной целью проведенных экспериментальных исследований микробных культур было выявление новых закономерностей кинетики и энергетики их роста, взаимоотношения этих аспектов жизнедеятельности популяций одноклеточных. При постановке экспериментов существенно использовались результаты теории материально-энергетического баланса. Большое внимание уделялось влиянию затрат энергии на поддержание клеток на эффективность и скорость роста культур, а также зависимости этих затрат от условий среды.

Кроме того, ставилась цель непосредственной экспериментальной проверки соотношения между дыханием и тепловыделением микроорганизмов. Измерения впервые проводились с синхронной культурой дрожжей (Candida

maltosa, субстрат - этанол), и подтвердили существование пропорциональности между этими величинами. Измеренный коэффициент пропорциональности был равен 103.118.9 кДж/экв. RO, что близко к универсальной в е л и ч ин5е0= 1 1 2 кДж/экв. RO. Кроме того, нами были проанализированы данные из литературы об одновременных измерениях тепловыделения и дыхания микроорганизмов. Среднее значение отношения «тепло/кислород», найденное нами по этим дан-

ПЛ

ным равно 122 кДж/экв. RO, что также близко к НS". Это подтверждает общий результат теории материально-энергетического баланса.

Было проведено сравнительное изучение непрерывного роста метан олас-симилирующих дрожжей Hansenula polymorpha при непрерывном росте в хе-мостате при лимитировании органическим субстратом в трех вариантах, когда субстратом являлся метанол, этанол или глюкоза. Определялись значения выхода биомассы при различных скоростях роста, элементный состав биомассы. На основе этих данных находились значения максимального выхода биомассы

Jj5s и скорости расхода субстрата на поддержание клеток ms. Эти величины

затем пересчитывались в материально-энергетические: í7^s и . Результаты:

субстрат yffl *x/s _m VX/S «s»4"1

метанол 0,43 0,31 0,023 0,031

этанол 0,65 0,37 0,011 0,019

глюкоза 0,52 0,59 0,021 0,019

Отсюда видно, что наивысшая эффективность роста (наибольшая степень ассимиляции энергии субстрата) имеет место на глюкозе. Более высокий выход клеток по массе на этаноле обусловлен более высокой восстановленностью этого субстрата по сравнению с глюкозой и не отражает эффективность включения энергии субстрата в биополимеры клеток. Поскольку из 6 RO метанола два уходят в пероксисомальную окислительную цепь, и этот процесс не сопряжен с запасанием энергии, то д = 1 /3. Поэтому скорость затрат редоксонов на поддержание клеток т™ на метаноле в 1/(1 — д) = 3/2 раза выше, чем на этаноле и глюкозе. Этот фактор, однако, недостаточен для объяснения значений которые должны были бы быть одинаковы на глюкозе и этаноле (около 0,6) и быть 0,6х(2/3) = 0,4 на метаноле. Возможное объяснение значений Т)х/5 состоит втом, что /я™ зависит от ц вследствие (16), причем коэффициент пропорциональности отличается для разных субстратов. В таком случае вышеприведенные значения скоростей расходов на поддержание клеток представляют собой

постоянные составляющие ws и m™. Из этих результатов видны новые аспекты биоэнергетики клеток, следствием чего могут быть новые постановки биохимических экспериментов для изучения структуры расходов энергии на поддержание клеток и их регуляции.

Среди факторов, влияющих на рост клеточных популяций, температура занимает особое место, так как это неспецифический фактор, влияющий на весь метаболизм. В литературе опубликован ряд исследований зависимости удельной скорости роста различных микроорганизмов от температуры В них обнаружено, что эта зависимость часто имеет вид кривой Аррениуса

= С + где Е - энергия активации, Т- абсолютная температура. При некоторых значениях зависящих от вида микроорганизмов, эта зависимость обнаруживает излом вследствие скачкообразного изменения значений Е и С. Одновременное исследование зависимостей ц и Ух/s от до наших работ почти не проводилось (к началу наших работ в этом направлении имелась лишь одна публикация: Kuhn et al., 1980).

Нами исследовалась температурная зависимость максимальной скорости роста и выхода биомассы дрожжей С. valida и С. utilis при росте на этаноле. Для С. valida найдено, что fi и Kx/s имеют изломы при одних и тех же значениях f (30 и 36°С) и подчиняются закону Аррениуса вплоть до предельно высоких для значений роста температуры (>36°С), где происходит резкое падение обеих величин. С. utilis показала изломы зависимости Аррениуса для ц при 26 и 30°С. Имеющиеся экспериментальные данные показали, что при 26 и 32°С имели место также изломы температурной зависимости Аррениуса для константы насыщения удельной скорости роста, Aj. Отмирание клеток и образование продуктов метаболизма не наблюдались вплоть до значений близких к предельно высокой для роста. Нами показано, что зависимость с высокой точностью описывается формулой, выведенной из соотношений материально-энергетического баланса:

где к^ и ку, зависят от температуры по закону Аррениуса, каждая со своей энергией активации. При этом для кК энергия активации не меняется во всем диапазоне исследованных температур (19-42°С), а для испытвает скачкообразные изменения при 26 и 30°С. Изломы этих температурных зависимостей могут быть связаны с переключением «узкого места» метаболизма.

(20)

В исследованиях роста микробных популяций в течение десятилетий существовала точка зрения, что рост лимитируется только одним из субстратов, имеющихся в среде, и что смена лимитирующего фактора при изменении концентраций субстратов в среде носит характер переключения. В 70 - 80 годы появились немногочисленные работы, в которых экспериментально было показано существование режимов одновременного лимитирования роста двумя и более субстратами (Cooney et al., 1976; Hueting, Tempest, 1979; Egli, 1982 и др.). Нами было предпринято исследование непрерывного роста дрожжей С. valida при одновременном лимитировании этанолом и аммонийным азотом. Изучали влияние соотношения углерода к азоту ran в подаваемой среде на величину выхода биомассы из этанола, содержание азота, общего белка и нуклеиновых кислот в биомассе. Каждый такой эксперимент проводился в серии стационарных режимов непрерывного культивирования при заданном значении удельной скорости роста /л. Было найдено, что данный микроорганизм плавно реагирует на относительное снижение содержания азота в среде (повышение C/N). Между режимами роста, лимитированного одним из этих субстратов, находится область двойного лимитирования. В ее пределах концентрации обоих субстратов поддерживаются культурой на весьма низком уровне и, соответственно, обе влияют на рост. При увеличении Гс/n имеет место постепенное снижение выхода биомассы и содержания азотсодержащих компонентов клеток. Последнее обеспечивает поддержание концентраций двух субстратов в окружающей клетки среде на низком уровне в пределах диапазона В противном случае между режимами односубстратного лимитирования углеродом и азотом имел бы характер резкого переключения при одном значении С точки зрения биоэнергетики представляет интерес снижение Ttfas при постепенном переходе к лимитированию роста азотом при условии fi = Const (рис. 5). Согласно уравнениям (13) и (14), оно может происходить вследствие снижения эффективности окислительного фосфорилирования или увеличения расходов энергии на

поддержание клеток т™. Третья возможная причина снижения г]^ - образование продуктов метаболизма - в этом опыте отсутствовала. В этих экспериментах нами впервые получены контуры зоны двойного лимитирования роста

(рис. 5). Показано, что ее ширина невелика при высоких скоростях роста и резко возрастает при низких

Рис. 5. Зависимость выхода дрожжей С. valida из этанола по массе, ix/S> и по редоксонам, та также концентраций этанола, S, и азота, С, в культуральной жидкости от отношения углерода к азоту г^ в подаваемой среде, г^ и г^ -граничные значения зоны двойного лимитирования обоими субстратами. При rC/N ** rON рост лимитирован только этанолом, при > г^ - только азотом.

Одной из важных проблем энергетики и кинетики роста микробных культур является сравнение характеристик их роста в области лимитирования и ин-гибирования субстратом. В нашей работе изучалось действие концентраций двух субстратов - энергетического (этанол) и минерального (цинк) на удель-

ную скорость роста ц и выход биомассы из этанола Yyj§ при непрерывном росте дрожжей С. valida. Концентрация этанола S изменялась во всем диапазоне значений, при которых возможен рост культуры - от нескольких мг/л до 65 г/л. Концентрация цинка С изменялась от 0,4 до 54 мг/л, что позволило охватить области лимитирования, ингибирования роста цинком и плато значений /ли

Рис. 6. Удельная скорость роста ц и выход биомассы J^/g дрожжей С. valida при непрерывном культивировании на этаноле в режимах бистата и рН-ауксостата. А - зависимость /л и Y^/s от концентрации субстрата. Б - зависимость в области лимитирования (верхняя ветвь) и ингибирования роста субстратом (нижняя ветвь).

Î^/S между ними. Влияние S представлено на рис. 6. На основе этих данных разработана математическая модель роста, учитывающая влияние концентраций обоих субстратов на и скорость затрат этанола на поддержание клеток ms. Уравнения модели составлены нами с учетом требований теории материально-энергетического баланса.

• Подавляющее большинство моделей роста микробных культур принимают, что концентрации субстратов влияют на удельную скорость роста культуры (Перт, 1978; Паников, 1991). В этом случае при S = 0 и С = 0 должно быть (1 = 0, qs=m$*Q, что противоречит основным законам химической кинетики. Поэтому нами принято, что концентрации субстратов S и С влияют не на fi, а на скорость потребления этанола qs в мультипликативной форме:

Эта зависимость носит феноменологический характер. Она учитывает возможность 8-образной зависимости при низких концентрациях субстратов, субстратного ингибирования, а также изменения содержания ключевых ферментов при разных значениях 5 (множитель (1 + )).

Принято, что концентрации этанола и цинка влияют на скорость затрат энергии на поддержание клеток:

ms = ms +mSE + wiSZn,

(22)

где ms - постоянная составляющая скорости затрат на поддержание клеток, mSE = bS - член, определяемый влиянием этанола. roSZa(C) — слагаемое, зависящее от концентрации цинка: ,raSZn = 0 при Ci < С< С% (пределы, в которых цинк не влияет на ms) и возрастает линейно при С < С\ (fflszn(^) = (С, - С)) и С>С2 (mSZn(C) = 8ш(С-С2)).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием уравнений (21), (22), а также соотношений = V^X/S = l/^X/S +ms/f! (см.(1)). Вышеописанная модель с найденными для нее значения параметров баланса и кинетики роста дрожжей С. valida дала высокую точность приближения экспериментальных данных. С другой стороны, замена выражения (24) на постоянный член ms = тя® (обычное представление скорости затрат на поддержание клеток) приводила к неудовлетворительному количественному описанию экспериментальных данных. Отсюда следует, что концентрации субстратов могут существенно влиять на скорость процессов, не сопряженных с ростом биомассы клеток. В этом случае возможна неоднозначная взаимосвязь между выходом биомассы и удельной скоростью роста полученная нами впервые и показанная на рис. 6Б. Верхняя ветвь соответствует росту в условиях лимитирования этанолом и нелимитированному росту при S < 1 г/л, вертикальная часть «петли» - росту при 1< S< 18 г/л (при этом Ц остается близкой к постоянной, тогда как на уже влияет слагаемое нижняя ветвь -росту при еще более высоких S, где влияет |i субстратное

ингибирование скорости метаболизма), и увеличение затрат на поддержание клеток.

В ГЛАВЕ 5 описаны математические модели микробных культур, разработанные нами с учетом теории материально-энергетического баланса, а также с учетом физиологической гетерогенности клеточных популяций. Даны решения этих моделей, показывающие свойства, не описанные ранее.

Подавляющее большинство существующих моделей являются сосредоточенными и используют обыкновенные дифференциальные уравнения для описания кинетики роста микробных культур. При этом, как правило, первичной характеристикой, зависящей от концентраций веществ, присутствующих в среде, считается удельная скорость роста. Влияние метаболизма на рост и образование продуктов также описывается концентрациями ферментов и интермедиа-тов, как если бы они были гомогенно распределены по всему объему, занимаемому клетками и внеклеточной средой. Это является существенным огрублением реальности. Кроме того, существуют индивидуальные характеристики клеток, такие как возраст, объем, которые также не учитываются традиционными моделями. К началу наших исследований существовали распределенные модели, использовавшие уравнения в частных производных для функций распределения клеток по возрасту и т.д. Однако получение и исследование решений этих уравнений далеко отставало от результатов, полученных для точечных моделей с ОДУ. Кроме того, формулировки этих моделей содержали некорректности в отношении краевых условий. Нами были поставлены следующие задачи: дать корректную формулировку базовой модели микробной культуры как распределенной системы, исследовать решение одного из вариантов этой модели на уровне, сравнимом с исследованиями точечных моделей. Нами были также поставлены задачи: изучить временное масштабирование переходных процессов в непрерывных культурах и разработать подход для отображения в фазовом пространстве временных свойств моделей с ОДУ; исследовать динамику разработанного нами бистата.

При исследовании временного масштаба переходных процессов в хемоста-те нами была использована теорема Тихонова (1954). Для этого уравнения динамики хемостата были приведены к безразмерной форме, где масштабные множители имели порядок величины, соответствующий стационарным значениям концентраций биомассы и субстрата, а также скорости разбавления:

Тогда, представляя <73 в виде = <7таху(5) (^тах - максимальное значение и вводя безразмерные константы

мы получили следующие уравнения:

Обычно микробные культуры имеют ~ 1-10 мг/л, а подаваемая концентрация субстрата ^ имеет порядок 1-10 г/л. Поэтому £~10~2 —10"4«!, то есть система (25) является сингулярно возмущенной. Соответственно, ее нестационарные решения имеют две компоненты, различающиеся по масштабу скоростей в 1/е раз. За время ~ е решение (23) сходится к решению следующей системы уравнений:

Отсюда следует, что в результате быстрого переходного процесса состояние микробной культуры в хемостате приходит в одну из точек линии медленного движения (ЛМД), описываемой первым уравнением (24). Всюду на этой линии с точностью 8 ^(.у)* = 1, то есть 95(5)ЛГ = .О50 (абсолютная скорость потребления субстрата равна скорости его подачи), абсолютная скорость роста биомассы /¿У" = (и^о — . Вследствие этого динамика концентрации биомассы

вдоль ЛМД приобретает простой вид, поскольку на ЛМД уравнение для х ста-&

новится линейным:

Л'

На рис. 7 показан фазовый портрет системы уравнений для хемостата для случая (субстратное ингибирование,

Хорошо видно сгущение траекторий в окрестности ЛМД (линия Ш, которая расположена очень близко к горизонтальной изоклине I). Нами впервые выявлены вышеописанные динамические свойства ЛМД для непрерывных культур микроорганизмов.

Для отображения временного масштаба переходных процессов на фазовой плоскости нами был разработан метод изохрон. Изохрона определена нами следующим образом. Пусть на фазовой плоскости задана некоторая (базовая) линия В, не совпадающая ни с одной из траекторий динамической системы. Тогда линия А на фазовой плоскости, такая, что для перемещения от любой точки, принадлежащей А, вдоль траектории до соответствующей точки, принадлежа-

щей В, требуется одно и то же время, называется изохроной. В качестве базовой линии нами использовался прямоугольник с центром в стационарной точке хе-мостата. При этом, поскольку базовая линия была замкнутой, определение изо-хроны было дополнено требованием, чтобы после пересечения В траектория никогда не покидала область D фазовой плоскости, ограниченную базовой линией. Тогда пересечение линии В траекторией означает достижение стационарного состояния с требуемой точностью.

Рис. 7. Фазовый портрет (слева) и изохронный портрет (справа) системы дифференциальных уравнений, описывающих динамику хемостата. S - устойчивый узел, В - область, ограниченная базовой линией изохрон (прямоугольник с центром в точке S). Особые линии: I - горизонтальные изоклины, II - вертикальная изоклина, III - линия медленного движения, IV - сепаратриса, V - руптриса. Зачерненная область расположена между изохронами, соответствующими значениям времени = 3 и 4, чтобы подчеркнуть разрыв изохрон вдоль руптрисы.

Возможна ситуация, когда траектории, входя в прямоугольник через одну из его сторон, затем выходят из него и окончательно входят через другую сторону. В этом случае существуют такие значения начальных координат, что малое их изменения приводит к скачкообразной смене стороны прямоугольника,

через которую траектории окончательно входят в область D, ограниченную базовой линией. Это приводит к разрыву изохрон вдоль траектории, которая входит в D и после этого соприкасается с линией В, но не выходит из D. Для такой траектории нами предложен термин «руптриса» (ruptrix - разрывающая).

Изохронный портрет системы уравнений для хемостата для случая субстратного ингибирования дан на рис. 7. Форма изохрон, близкая к параллельным друг другу прямым, отражает тот факт, что время, необходимое для перехода от изохроны до базовой линии, затрачивается главным образом при движении вдоль ЛМД.

Влияние скорости подачи среды на временной масштаб переходных процессов хорошо видно при исследовании устойчивости бистата - разработанного нами нового метода непрерывного культивирования, который, в отличие от хе-мостата, поддерживает режимы роста со скоростью, приближающейся к максимальной. Уравнения динамики бистата получены из уравнений для концентраций биомассы X и субстрата Я, отражающих две особенности этого метода культивирования: 1) имеются два сравнимых по величине потока подаваемой среды и 2) поток Д задан экспериментатором, тогда как £)2 самой культурой, поскольку он одновременно служит фактором поддержания заданного рН см. выше раздел о ионном балансе):

(25)

(26)

Необычная форма правых частей (25) и (26) (члены с X2 и ХЯ ) обусловлена вышеуказанной зависимостью .02 от [1. Стационарные решения этой системы найдены в явном виде. Для (см. также (1))

эти решения зависят от скорости потока по каналу 1, как это изображено на рис. 8А. Исследование устойчивости стационарного решения системы (25)-(26) (рис. 8Б) показало, что собственные значения матрицы линеаризованной системы (25)-(26), и ¿2, различаются в раз, если удельная скорость роста примерно вдвое (или более) меньше своей максимальной величины. С приближением к своему максимуму сближаются, вследствие чего исчезает различие масштабов скоростей переходных процессов.

о o.i 0.2 ол ол ал о 0.1 иг ол о.< o.s

Рис. 8. Динамика бистата (случай ms = 0, Yx/s=Yyys=Const),. А - зависимости стационарных значений скорости подачи среды-титранта D2, концентраций биомассы Xи субстрата S, удельной скорости роста ¡л от жестко заданной скорости Д подачи среды, имеющей рН равный уставке регулятора. Б - зависимость собственных значений линеаризованной системы дифференциальных уравнений для ХиБв окрестности стационарной точки от Д.

Следующая часть Главы 5 посвящена распределенным моделям клеточных популяций. Основой таких моделей является уравнение неразрывности для функции распределения числа клеток по их физиологическим характеристикам: возраст, размер, содержание различных клеточных компонент (McKendrick, 1926; Von Foerster, 1959; Fredrickson et al., 1967; Bell, Anderson, 1967, Романовский, Степанова, Чернавский, 1984, и др.). В различных работах используется различное количество и разные типы этих характеристик. Не менее важная часть таких моделей - их граничные условия, которые также являются уравнениями, но не дифференциальными, а интегральными. В отличие от уравнения неразрывности, они не поддаются решению в общем виде. Модели, которые включают размер клеток и содержание в них различных веществ, содержат некорректности в формулировках граничных условий, отражающих процесс деления клеток. В частности, это касается сбалансированности деления по общему количеству каждого вещества, содержащегося в клетке до и после деления.

Нами сформулирована базовая распределенная модель клеточной популяции в двух вариантах - для делящихся и почкующихся клеток. В качестве переменной, описывающей величину клетки, выбран ее объем. Это позволяет корректно учесть баланс массы в метаболизме клеток, используя концентрации веществ, которые необходимы как кинетические переменные. В общем случае функция распределения концентрации числа клеток имеет вид: ,

где 8С - вектор внутриклеточных концентраций, V - объем клетки, г - ее возраст, * - время. Уравнение неразрывности для п:

где /^(8с,у,Г,/) и /¡(8с,у,Г,/) - скорости изменения объема клеток и концентрации 1-го вещества в них, И^(8С,У,Г,^), Л/(вс,у,Г,/) и Б - скорости деления, отмирания и протока среды. Граничное условие при т = 0 сформулировано нами следующим образом: 00 00 00

О О

где >у(8с,у,//8с',у',г') - пшитиюсш. вшряитносш того, что одна из дочерних клеток имеет параметры (8с,у) при условии, что материнская клетка имеет параметры (в,.',у',г'). Такая форма граничного условия позволяет учесть случайные возмущения переменных V и при росте каждой отдельной клетки, сконцентрировав эти возмущения в моментах времени, соответствующих делению клеток. Величина щ при всех (вДу1,-^удовлетворяет условию:

]л|Аеи{«с,у,*/ве,,1-',1')=1 (29)

Для среды, окружающей клетки, нами получено следующее уравнение:

(30)

где ве - вектор внеклеточных концентраций, V - полный объем суспензии клеток, Уех - объем внеклеточной среды, / - поток среды, 80 - ее состав, Н -вектор скоростей внеклеточных реакций, катализируемых секретируемыми ферментами, и - вектор скоростей обмена между клетками и окружением. Величина Уех выражается через V следующим образом:

где - доля объема V, занятая клетками. Величина и = III +, где член

= £ с _ уи + у

¿1 ' 0 V е е1

описывает транспорт веществ между средой и клетками (ф - удельная скорость транспорта ьго вещества), a ^ учитывает баланс концентраций веществ в клетках при случайных скачках 8С в момент деления. Для упрощения модели без потери ее возможностей нами было введено условие, что случайные скачки по 5С1 и v при делении клеток происходят равновероятно в обе стороны относительно значений $С1' и у'/2 (,ус|' и V1 относятся к материнской клетке):

И^'+Дз^.^у'+Ду',? = '-Дзс^ у'-Ду',

Г/в^.у'.г'

(33)

Соотношения (33) обеспечивают равенство нулю ^ и приводят к упрощению уравнения (29):

+ -УС)

1~<Рс 1~<Рсп V. О

(34)

О у0 0

Аналогичная модель сформулирована нами для почкующихся клеток.

Уравнения (27), (28), (34) вместе с условиями (29) и (33), а также заданными начальными значениями представляют собой полную систему, описывающую динамику клеточной популяции как распределенной системы. Эта модель полностью подготовлена к любой конкретизации при выборе той или иной совокупности ключевых веществ и реакций, определяющих скорости основных метаболических потоков. Поэтому она представляет собой большой ряд конкретных распределенных моделей клеточных популяций.

Простейшая модель в этом ряду учитывает распределение клеток только по возрастам. Даже в случае, когда влияние состава среды на клетки не учитывается, решение уравнения для п[г,{), когда Ж зависит от времени, связано с математическими сложностями. Нами впервые найдено решение подобной системы уравнений в ее полном виде:

, 00

• = -|и(г,ф3(5,г>?г + - 5)

Начальные условия:

<й> г!*

(35)

(36)

(37)

(38)

Поскольку W оказывает намного более сильное влияние на возрастной состав популяции, чем qs, решение уравнений (35)—(37) находилось для случая,

когда q$ зависит только от 5: =qmSl{Ks + S + S2/Ki). Для W принята зависимость от возраста клеток в виде ступенчатой функции: W = AQ{t — T), где ©(х) = 0 при х < 0 и 1 при х > 0. Эта зависимость хорошо описывает экспериментальные данные (Zeuthen, 1964) . Влияние среды на деление клеток в данной задаче взято как зависимость T(s). Важным моментом в данной модели является согласование величин W и qs, поскольку масса клеток должна удваиваться в течение жизненного цикла. Среднее время жизненного цикла клеток равно Т + 1/А.. Условие удвоения массы за это время и зависимость q$(S) (см. выше) дают: T(S)=Tq + T^/S + T2S, где Т0, Tj и Т2 зависят от параметров культуры (qm, А, Ks и др.).

Нами получены решения этой модели, соответствующие как стационарным режимам роста, так и переходным процессам при установлении таких режимов. Стационарное решение было найдено и исследовано аналитически. Нестационарные решения были получены с помощью численного интегрирования системы (35)—(38). При анализе полученных р^тпри™ чи Ир. пользовали зависимость общей численности клеток от времени

и нормированную на N(t) функцию распределения клеток по возрастам v(r,i) = n(j,t)/N(t), которая описывает только возрастной состав популяции и не со/» >

держит информации о ее численности

Стационарное решение имеет вид:

v ' D A + D

N=D(S{-S)/P(S)

v(r)=2Dexp[- Dt - А{т - T(S))Q(t - r(s))]

(39)

(40)

(41)

Значение подставляемое в (40) и (41), находится из (39). Полученные соотношения позволили сделать ряд выводов о влиянии параметров на кинетику культуры. В частности, зависимость к(т) «сшита» из двух экспонент. При 0 < Г< Г падение v происходит только за счет выноса клеток потоком среды, а при г> Г еще и за счет деления клеток.

Для переходных процессов показано, что распределенная модель, как и сосредоточенная, имеет при »резко различающийся масштаб скоростей переходных процессов. В обезразмеренной распределенной системе уравнений линия медленного движения описывается, как и в сосредоточенной системе, соотношением /?(5)М = 1. Обезразмеренная система использовалась нами для получения численных решений.

Численные решения выявили ряд особенностей поведения микробной культуры, которые качественно отличаются от описываемых сосредоточенными моделями. Эти особенности видны на рис. 9. Начальные условия этих переходных процессов - большая концентрация субстрата и наличие возрастной синхронизации (у(г,0) - узкий пик вблизи г = 0). Важным параметром, описывающим популяцию клеток, является Он характеризует отношение

1200

400 О

■Л © .:

1.2

5: о.

к/4-"-

l^r-

0.6

-- 0.4 К

-- 0.2 О

«о

1200 800 400 0

Sfj" N ■

Л © '

Л, 1 . 1 м .

2 1.5

1 г г

0.5 0

12 ' 8 4 0

1 ©

■ Pi

0.8 0.6

0.4^

0.2 0

Рис. 9. Установление стационарного режима непрерывного культивирования в хемостате. Ось абсцисс - безразмерное время. Слева - концентрации субстрата S и клеток N, справа - возраст Т, при котором W скачком переходит из 0 в А / 0, и нормированное возрастное распределение v(r,f) при т = 0. Начальные условия - 5(0)=1000, #(0)=0,1, культура при t = 0 синхронизована (v(r,0) = Const при 0 < г < ОД и v(r,0)=0 при остальных г), а и б - АТ0 =1, в и г -ЛГ0=Ю.

возрастного интервала, в течение которого клетки готовятся к делению, к разбросу возрастов деления 1¡А. Графики рис. 9 относятся к случаям, когда этот разброс порядка Г (а и б) и когда он на порядок меньше Г (в и г).

Колебания в начальный период времени имеют место вследствие

начальной синхронности культуры. Они затухают из-за разброса возрастов деления при т>Т. В этот же период времени имеют место и колебания N(1), но они мало заметны, так как значения Лг(/) сами невелики. При а = 1 эти колебания успевают затухнуть до того, как 5 снизится и приблизится к стационарным значениям. На рис. 10 видно, как начальный пик V расплывается, и при значении безразмерного времени * = 2" устанавливается стационарная форма т(г), соответствующая (41). Затем снижение 5 до значений порядка приводит

к резкому увеличению Г(5). В результате установившееся распределение перестает соответствовать стационарной форме, соответствующей новым условиям

роста. Это означает возникновение новой синхронности, происходящей не от изменения существующего v(r), а от изменения аттрактора - стационарного v(r) для новых условий. После этого новая синхронность затухает с новым, более длительным периодом колебаний.

При а = 10 вследствие относительной малости разброса возрастов деления синхронность не успевает затухнуть ко времени снижения S до значений порядка Ks . Это снижение проявляется в усилении колебаний v(0,f) и в резком снижении их периода.

Аналогичные явления обнаружены при других начальных условиях. Выявлен также механизм возрастной автосинхронизации несинхронной культуры при изменении концентрации подаваемого субстрата . Последние результаты объясняют полученную экспериментально синхропизацию микробных культур в так называемой «фазированной культуре» (phased culture, Dawson, 1965).

В случае, когда имеет место субстратное ипгибирование роста, распределенная модель, как и сосредоточенная, имеет особую точку на плоскости , обладающую свойствами седла, хотя ее нельзя считать седлом в том же смысле, как это определено для ОДУ. Нами изучена динамика распределенной модели для случаев, когда исходное возрастное распределение синхронное, а «траектория» системы уравнений {N(t),S(t)} проходит вблизи «седла». Поскольку данный объект имеет бесконечное число степеней свободы, кривая {N(t)JS(t)} является проекцией {«(i,r)},5(i) на плоскость {NJS}. Такие кривые были найдены нами численно. Они имеют спиралевидную самопересекающуюся форму. Такое поведение характеризует отличие распределенной системы от соответствующей сосредоточенной, в которой колебания

Заключение

Теория материально-энергетического баланса роста клеточных популяций (МЭБ) представляет собой новый взгляд на биоэнергетику клеточных популяций. Она дает исследователям эффективный рабочий аппарат для количественного описания перераспределения вещества и энергии субстратов роста в вещество и энергию клеток и продуктов метаболизма, а также генерации метаболического тепла. Теория МЭБ выделяет небольшое число факторов, влияющих на соотношение выходных потоков клеточного метаболизма. Это стехиометриче-ские коэффициенты сопряжения потоков редоксонов (RO) и потоков высокоэнергетических протонов (ВЭП) и макроэргических связей (МЭС), а также скорость кругооборота вещества в клетках. Выведенный нами закон сохранения редоксонов определяет жесткие рамки, в которых действуют кинетические за-

висимости метаболических потоков от факторов внешней среды и регулятор-ных связей внутри клеток. Методы теории МЭБ получили ряд приложений: предсказание максимальных достижимых значений выхода биомассы, постановка экспериментов по изучению роста микроорганизмов и анализ их результатов, разработка нового метода непрерывного культивирования и метода мониторинга роста микробных культур, расчет метаболического тепловыделения, разработка математических моделей роста клеточных популяций с учетом закономерностей материально-энергетического баланса.

Формулирование и изучение распределенной модели роста микроорганизмов позволило выявить ряд необычных динамических свойств этого объекта. Затухание синхронности - известное явление, не получившее, однако, ранее детального физико-математического описания. С другой стороны, возникновение синхронности - явление более сложное. Нами выявлены механизмы ее возникновения, которые не были сформулированы ранее в сколько-нибудь явной форме. Это может дать импульс разработке практических методов получения синхронных культур с помощью не травмирующих воздействий, что, в свою очередь, перспективно для разработки необычных технологических режимов выращивания продуцентов различных химических соединений.

Выводы

1. Разработаны принципы теории материально-энергетического баланса живых клеток и клеточных популяций. Сформулировано понятие общей единицы восстановленности - редоксона. Разработан принцип деления метаболизма клеток на парциальные обмены - конструктивный, дыхательный, продукт-ный, поддержание клеток. Разработаны модификации основной схемы парциальных обменов, приложимые, в частности, к фотосинтезирущим организмам. Введены интегральные энергетические характеристики парциальных обменов. Сформулирована система уравнений материально-энергетического баланса метаболизма, описывающая взаимосвязь парциальных обменов через переносчики энергии.

2. На основе теории материально-энергетического баланса:

а) Найдены зависимости энергетических выходов биомассы и продуктов метаболизма от характеристик парциальных обменов и скорости роста.

б) Получены максимальные значения выходов клеток и продуктов метаболизма при росте на различных источниках вещества и энергии.

в) Получены значения зависящей и не зависящей от скорости роста популяции компонент скорости затрат энергии на поддержание клеток.

г) Обоснована в общем виде и подтверждена экспериментально универсаль-

ная пропорциональная взаимосвязь между тепловыделением и потреблением кислорода популяцией микроорганизмов.

д) Сформулирован принцип построения математических моделей роста клеточных популяций, основанный на сочетании 1) кинетических зависимостей метаболических потоков от факторов внешней среды и 2) соотношений материально-энергетического баланса между этими потоками.

а) Новый метод непрерывного культивирования - бистат, имеющий преимущества перед ранее известными методами.

б) Методические основы мониторинга роста микробных культур.

4. Экспериментальные исследования роста микробных популяций и интерпретация полученных данных в терминах теории материально-энергетического баланса показали, что кинетическая зависимость скорости роста от концентрации субстрата 5 связана с влиянием 5 не только на скорость потребления субстрата, но и па отдельные парциальные обмены, в том числе на процессы поддержания клеток. На этой основе разработана математическая модель, описывающая кинетику роста микробной культуры с высокой точностью.

5. Изучены динамические свойства сосредоточенной модели непрерывной культуры микроорганизмов, показано существование быстрых и медленных переходных процессов в этом объекте. Разработано понятие изохроны, которое позволяет дополнить фазовый портрет динамической системы ее изохронным портретом. Показано, изохроны могут иметь разрывы вдоль некоторых фазовых траекторий. В области быстрых переходных процессов угол наклона изохрон по отношению к траекториям невелик.

6. Разработана базовая распределенная модель популяции микроорганизмов. Исследованы решения системы уравнений для распределения клеток по возрасту и концентрации субстрата, влияющего на скорость деления клеток. Выявлены динамические свойства решений этой системы, аналогичные свойствам сосредоточенной модели - временное масштабирование переходных процессов, существование неустойчивых стационарных решений со свойствами седла. Выявлены, с другой стороны, свойства этих решений, качественно отличающиеся от свойств сосредоточенной системы - колебательный характер переходных процессов, зависимость периода колебаний от концентрации субстрата в среде, окружающей клетки, возможность не только зату-

хания возрастной синхронности, но и возникновения ее заново с последующим затуханием.

Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность своим учителям с физического факультета МГУ и ФИАН РАН, коллегам с кафедры биофизики биологического факультета МГУ, коллегам и соавторам из Института биохимии и физиологии микроорганизмов и других институтов за полученные от них знания, поддержку, плодотворное творческое сотрудничество.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых изданиях

1. Минкевич, И.Г., Д.С. Чернавский, О синхронизации культур микроорганизмов в мягких периодическихусловиях. Биофизика, 1969.14: 564-566.

2. Минкевич, И.Г., Г.П. Попков, В.К. Ерошин, Теоретическая оценка элементного баланса при росте микроорганизмов на н-алканах и соответствующих спиртах. Прикладная биохимияимикробиология, 1972.8:160-166.

3. Минкевич, И.Г., В.К. Ерошин, Расход кислорода и воды приросте микроорганизмов. Известия АН СССР. Серия биологическая, 1972(2): 245-254.

4. Minkevich, I.G., V.K. Eroshin, Productivity and Heat Generation ofFermentation under Oxygen Limitation. Folia Microbiologica, 1973.18:376-385.

5. Минкевич, И.Г., В.К. Ерошин, Квопросу орасходе кислорода и тепловыделении приросте микроорганизмов. Известия АН СССР. Серия биологическая, 1973(3): 414-415.

6. Minkevich, I.G., V.K. Eroshin, Energetic Indices ofAerobic Microbial Growth Studia Bio-physica, 1975. 49:43-52.

7. Минкевич, И.Г., В.К. Ерошин, Закономерности внутриклеточногоматериально-энерге-тического баланса роста микроорганизмов. Успехи совр. биологии, 1976.82:103-116.

8. Minkevich, I.G., V. Eroshin, К., Intracellular Growth Balance and Its Influence on Growth Characteristics of Microbial Cultures. Stidia Biophysica, 1976.59(1): 67-75.

9. Erickson, L.E., I.G. Minkevich, V.K. Eroshin, Application of Mass and Energy Balance Regu-

larities in Fermentation. Biotechnology and Bioengincering, 1978.20:1595-1621.

10. Erickson, L.E., V.D. Kuvshinnikov, I.G. Minkevich, V. Eroshin, K., Comparison ofYieldCoef-ficients Estimated from Measurements of Nitrogen, Organic Substrate, Biomass and Oxygen

during Yeast Growth. Journal of Fermentation Technology, 1978.56:524-531.

11. Кувшинников, В.Д., A.B. Воробьев, В.К. Ерошин, И.Г. Минкевич, Изучениеэффективно-сти и удельной скорости роста дрожжей Hansenula polymorpha на метаноле при непрерывном культивировании. Прикладная биохимия и микробиология, 1978.14: 366-372.

12. Erickson, L.E., I.G. Minkevich, V.K. Eroshin, Utilization of Mass-Energy Balance Regularities in the Analysis ofContinuous Culture Data. Biotechnol. Bioeng., 1979.21: 575-591.

13. Minkevich, I.G., LI. Utkina, Time Scale in the Dynamics of Continuous Cultivation of Microorganisms. Biotechnology and Bioengineering, 1979.21:357-391.

14. Минкевич, И.Г. Ионный баланс при культивировании клеточных популяций в пространственно-гомогенной среде. Биофизика, 1979.24:712-716.

15. Минкевич, И.Г., В.К. Ерошин, Влияние метаболизма клеток на скорость подачи среды прирН-статированном культивировании. Биофизика, 1979.24: 879-884.

16. Мицкевич, И.Г. Соотношение между энергетикой и восстановлеенностъю органических веществ как важный фактор энергетического баланса в метаболизме. Биофизика, 1980. 25: 675-679.

17. Eroshin, V.K., I.G. Minkevich, On the Upper Limit of Mass Yield of an Organic Product from an Organic Substrate. Biotechnology and Bioengineering, 1982.24:2263-2265.

18. Нгуен, т.Ф.Т., Т. И. Чистякова, И.Г. Минкевич, В. К. Ерошин, О росте термотолерантных дрожжей Candida valida при непрерывном культивировании на этаноле,. Микробиология, 1982.51:456-462.

19. Minkevich, I.G., Physico-Chemical Properties of Organic Compounds and the Energetics of Metabolism. Journal ofTheoretical Biology, 1982.95: 569-590.

20. Chistyakova, T.I., I.G. Minkevich, V.K. Eroshin, Growth of the Thermotolerant Yeast, Candida valida, on Ethanol: Dependences of Maximal Growth Rate and Cell Biomass Yield on Temperature. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 1983.18:225-228.

21. Minkevich, I.G., Mass-Energy Balancefor Microbial Product Synthesis - Biochemical and Cul-turalAspects. Biotechnology and Bioengineering, 1983.25:1267-1293.

22. Neubert, M., I.G. Minkevich, Microbial Gas Balance Measurements: Basic Interrelations and Error Estimation. Acta Biotechnologica, 1984.4:313-322.

23. Минкевич, И.Г., Л .Г. Лысенко, В.Д. Кувшинников, В.К. Ерошин, Исследованиероста микроорганизмов на основе материально-энергетического баланса с использованием ЭВМврежимереального времени Acta Biotechnologica, 1984. 4: 25-35.

24. Мутафов, СБ., И.Г. Минкевич, В.К. Ерошин, Исследование энергетических показателей эффективности роста дрожжей Hansenula polymorpha на различных субстратах. Acta Biotechnologica, 1984.4:125-136.

25. Мутафов, СБ., В.К. Ерошин, И.Г. Минкевич, Исследование физиологическиххарактери-стик и технологических показателей роста Candida utilis на среде с этанолом. Acta Biotechnologica, 1984.4:255-266.

26. Minkevich, I.G., Estimation of Available Efficiency of Microbial Growth on Methanol and Ethanol. Biotechnology and Bioengineering, 1985.27: 792-799.

27. Minkevich, I.G., M. Neubert, Influence of Carbon Dioxide Solubility on the Accuracy of Measurements ofCarbon Dioxide Production Rate by Gas Balance Technique. Acta Biotechnologica, 1985.5(2): 137-143.

28. Мутафов, СБ., X.JI. Родригес, И.Г. Мипкевич, Влияние температуры на максимальную удельную скорость роста дрожжей Candida utilis на средах с этанолом и глюкозой. Прикладная биохимия и микробиология, 1985.21(1): 85-91.

29. Minkevich, I.G., The Effect of Automatic pH Maintenance on Steady State Cultivation. Regimes and Their Stability. Acta Biotechnologica, 1986.6:175-187.

30. Mutafov, S.B., I.G. Minkevich, Temperarture Effect on the Growth ofCandida utilis VKM-Y-2332on Ethanol. Comptes Rendus de l'Academie Bulgare des Sciences, 1986.39:71-74.

31. Крыницкая, А., И.Г. Мипкевич, В К. Ерошин, Влияние двойноголи-митирования органическим субстратом и аммонием нарост дрожжей Candida valida в хемостате. Прикладная биохимияи микробиология, 1987. 23:163-168.

32. Крыницкая, А., И.Г. Минкевич, В К. Ерошин, Изучение физиологических характеристик роста дрожжей Candida valida BKM- Y-2327врежиме бистата. Прикладная биохимия и микробиология, 1987.23:366-373.

33. Минкевич, И.Г, А. Крыницкая,В.К. Ерошин,Бистат -методкультивирования, объединяющий свойствахемостата ирН-ауксостата. Микробиология, 1987.56:254-258.

34. Minkevich, I.G., F. Baumann, G. Rogge, B. Heinritz, Ratio of Heat Production to Oxygen Consumption During the Cell Cycle ofCandida maltosa EH 15 Grown on Ethanol. Acta Biotechnologica., 1988. 8: 435-444.

35. Минкевич, И.Г. О термодинамическом описании баланса вещества и энергии с помощью функций состояния. Журнал физической химии, 1988.62:1489-1494.

36. Minkevich, I.G., A.Y. Krynitskaya, V.K. Eroshin, Bistat - a Novel Method ofContinuous Cultivation. Biotechnology and Bioengineering, 1989.33:1157-1161.

37. Андреев, СВ., И.Г. Минкевич, В.К. Ерошип, Ингибированиероста дрожжей Candida valida этанолом. Прикладная биохимия и микробиология, 1991.27:738-747.

38. Емельянова, Е.В., И.Г. Минкевич, В.К. Ерошин, Характеристики роста дрожжей Candida vattda BKM-Y-2327на среде с глюкозой. Микробиология, 1992.61:422-430.

39. Минкевич, И.Г. Базовая модель микробной культуры какраспределенной системы. Биофизика, 1992.37:310-317.

40. Минкевич, И.Г., А. Абрамычев, Динамика возрастного распределения культуры микроорганизмов сучетом влияния концентрации субстрата. Биофизика, 1992.37:126-132.

41. Minkevich, I.G., A.Y. Abramychev, The Dynamics of Continuous Microbial Culture Described by Cell Age Distribution and Concentration ofOne Substrate. Bulletin of Mathematical Biology, 1994.56: 837-862.

42. Минкевич, И.Г. Материально-энергетический баланс живой клетки. Прикладная биохимия и микробиология, 1996.32:100-109.

43. Минкевич, И.Г., СВ. Андреев, В.К. Ерошин, Влияние органического и минерального субстратов на величину затрат клеток на поддержание. Микробиология, 1998.67:176181.

44. Minkevich, I.G., S.V. Andreyev, V.K. Eroshin, The Effect ofTwo Inhibiting Substrates on Growth Kinetics and Cell Maintenance of the Yeast Candida valida Process Biochemistry,

2000.36:209-217.

45. Минкевич, И.Г., А. Цыганков, Материально-энергетический балансроста фототроф-

ных пурпурных бактерий. Биофизика, 2002.47:663-672.

46. Minkevich, I.G., A.D. Satroutdinov, E.G. Dedyukhina, T.I. Chistyakova, V.K. Eroshin, Degradation ofEDTA by chemostat culture ofbacterial strain DSM9103. Process Biochemistry, 2003.38:1559-1564.

Основные публикации в трудах конференций

1. Minkevich I.G., Eroshin V,K. 1973. Theoretical Calculation ofMass Balance during the Cultivation of Microorganisms. In: Proceedings ofthe 1st Int. Symposium on Advances in Microbial Engineering. Marianske Lazne (Czechoslovakia). August 28-September 1,1972. Pp. 21-25.

2. Минкевич И.Г., Ерошин В.К. 1977.0 пропорциональности тепловыделения и поглощения кислорода культурами микроорганизмов. В сборнике: Седьмая Всесоюзная конференция по калориметрии. 31 января - 3 февраля 1977 г. П. ПКТБМ. Черноголовка. С. 429.

3. Erickson L.E., Minkevich I.G., Eroshin V.K. 1980. Utilization ofMass-Energy Balance Regularities in the Analysis of Continuous Culture Data. In: Proceedings ofthe 7th Symposium held in Prague. July 10-14,1978. Praha. Pp. 227-234.

4. Minkevich LG. 1980. Hierarchy of Rates during Transients in Continuous Cultures of Microorganisms. Там же (ссылка 3). Pp. 215-220.

5. Minkevich I.G., Utkina L.1.1980. Duration ofTransient during the Establishment of a Steady State in a Continuous Culture of Microorganisms. Там же (ссылка 3). Pp. 221-226.

6. Minkevich I.G. 1982. Acquisition and Transformation ofInformation during Microbial Culture Monitoring. In: Proc. of FEMS Symposium on Overproduction ofMicrobial Products (Hradec Kralove, CSSR. August 9-14,1981). Academic Press. Pp. 651-662.

7. Лысенко Л.Г., Кувшинников В.Д., Минкевич ИХ., Ерошин В.К. 1985. Автоматизация исследований в области культивирования микроорганизмов с использованием информационно-вычислительных комплексов. В сборнике: Материалы 1 международной школы по автоматизации научных исследований. Пущино. С. 134-137.

8. Minkevich I.G., Krynitskaya A.Yu., and Eroshin V.K. 1988 A Double Substrate Limitation Zone of Continuous Microbial Growth. In: Continuous Culture. FEMS Symposium No. 41. Academic Press. London, San Diego, New York, etc. Pp. 171-184.

9. Минкевич, ИХ.Динамика возрастного распределения клеточных популяций, in Математика. Компьютер. Образование. Г.. 2003, РХД: Москва-Ижевск. С. 211-223.

».1662

РНБ Русский фонд

2004-4 23961

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 14.01.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 3,0. Тираж 100 экз. Заказ 054. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Минкевич, Игорь Георгиевич

ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ

МЕТОДЫ И МАТЕМАТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ

ГЛАВА 2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ОПИСАНИЯ

МАТЕРИАЛЬНО-ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО БАЛАНСА РОСТА

КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

2.1. Введение

2.2. Элементный баланс роста клеточных популяций

2.3. Понятия Ф-базиса и редоксона

2.4. Термодинамика баланса вещества и энергии при прохождении химических реакций

2.5. Баланс и термодинамика химических реакций в Ф-базисе

2.6. Характеристики клеточной биомассы в Ф-базисе

2.7. Энергетика метаболизма в Ф-базисе

ГЛАВА 3. ТЕОРИЯ МАТЕРИАЛЬНО-ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО

БАЛАНСА КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ

3.1. Потоки редоксонов в метаболизме и их связь с переносчиками энергии. Парциальные обмены

3.2. Система уравнений материально-энергетического баланса

3.3. Эффективность роста биомассы и образования продуктов метаболизма

3.4. Модификации системы парциальных обменов

3.5. Верхний предел выхода биомассы и продуктов метаболизма

3.6. Энергетическая эффективность роста фотосинтезирующих бактерий

3.7. Ионный баланс роста клеточных культур. Обоснование бистата

Введение Диссертация по биологии, на тему "Материально-энергетический баланс и кинетика роста клеточных популяций"

Актуальность проблемы

Популяции микроорганизмов и клеток тканей представляют большой интерес для биофизических исследований. Многие свойства микробных клеток, в особенности эукариотических, аналогичны свойствам клеток высших организмов. Клеточная культура, выращиваемая в строго контролируемых условиях, с точки зрения ряда ее свойств является физической моделью отдельной клетки, поскольку межклеточные взаимодействия в ней намного слабее, чем в тканях. Такой объект может поддерживаться и изучаться в течение длительного времени при относительно небольших затратах на эксперимент. Физико-математические исследования клеточных популяций важны с точки зрения и фундаментальной науки, и приложений. Микроорганизмы занимают одно из важнейших мест в биосфере Земли. В последние десятилетия культуры микроорганизмов и клеток тканей широко используются в биотехнологии, как промышленной, так и (микроорганизмы) экологической. Несмотря на то, что такие исследования широко проводятся в течение десятков лет, ряд важных проблем в этой области остаются недостаточно разработанными. Сюда относятся интегральные закономерности клеточной энергетики, контролирующие распределение вещества и энергии в процессе роста популяции, а также кинетические закономерности роста, учитывающие ее гетерогенность по ключевым физиолого-биохимическим показателям. Вследствие сложности объекта основное внимание при его изучении уделялось подходам, основанным на представлении о микробной популяции как «точечном» объекте (описываемом сосредоточенной моделью) и, как правило, мало учитывавшим роль законов сохранения в динамике этого объекта. Следствием было смещение акцентов в сторону «точечной» кинетики в ущерб стехиометрии и биоэнергетике. Предпринятые нами исследования направлены на замещение пробелов знания в этой области.

Цель исследования

Основная цель нашей работы -развитие интегральных подходов в биоэнергетике и кинетике клеточных популяций, позволяющих выявить общие закономерности баланса вещества и энергии в метаболизме клеток, динамики роста популяций с учетом их гетерогенности, и применение этих подходов к исследованию культур микроорганизмов.

Эта общая задача состоит из следующих этапов.

1. Разработка теоретических основ анализа материально-энергетического баланса, а также ионного баланса клеточного метаболизма в целом, то есть полной совокупности биохимических реакций.

2. Применение этого подхода к теоретическому исследованию роста микробных культур и образования ими продуктов метаболизма.

5. Выявление новых аспектов «точечной» динамики клеточных популяций.

При разработке теории материально-энергетического баланса ставилась задача получить достаточно полный и работоспособный подход, обладающий концептуальной ясностью и дающий возможность максимально просто и эффективно получать реалистичные значения энергетических показателей процесса роста клеточных популяций. Нам представлялось важным разграничить роль трех факторов, определяющих биоэнергетику роста: 1) законы сохранения вещества и энергии, 2) вариабельность метаболических путей и 3) кинетика биохимических реакций.

Научное значение и новизна работы

В течение многих лет исследования субклеточных систем преобладают над исследованиями, относящимися к уровню целых клеток и их популяций. Объективная причина этого - сложность клетки, то есть большое количество ее составных частей, многоуровневость и разнообразие ее пространственной и функциональной организации. Субъективная причина, на наш взгляд, состоит в том, что основной акцент при изучении клеток и их популяций делается на ставшие традиционными подходы - ферментативную кинетику и обыкновенные дифференциальные уравнения.

Наша работа выходит за эти рамки. Мы предлагаем компактный подход, выделяющий своего рода прочный «скелет» в клеточном метаболизме, рамки, в пределах которых существует биологическое разнообразие клетки и сообщества клеток. Этот подход использует физико-химические свойства органических соединений как материала, из которого состоит клетка, свойства, которые обусловливают связь потоков вещества в метаболизме с передачей энергии и ее использованием в клетке. Он делает картину метаболических потоков и их связей легко понимаемой и пригодной для эффективного использования в конкретных расчетах. Этот подход дает возможность редукции количественных характеристик роста клеток и их популяций, то есть их сведения к характеристикам субклеточных систем.

Распределенная модель роста клеточной популяции, разработанная нами, отличается от имеющихся в литературе сбалансированностью уравнений, описывающих граничные условия, по количеству веществ-участников процесса роста и деления клеток. Впервые нами найдены и исследованы решения распределенной модели микробной популяции для случая, когда учитывается влияние среды на клетки. Нахождение таких решений выводит распределенные модели на уровень рабочего аппарата исследователя, занимающегося фундаментальными и прикладными задачами в области биотехнологии и экологии.

Нами разработан метод описания динамики точечных моделей с помощью изохрон в фазовом пространстве, дополняющий множество фазовых траекторий и дающий интегральное описание временных свойств переходных процессов. Разработан на основе теории ионного баланса и осуществлен экспериментально новый эффективный метод непрерывного культивирования - бистат, разработана и изучена математическая модель культуры, растущей в бистате.

В работе получены следующие новые результаты.

1) Впервые разработано общее понятие восстановленности для любого химического соединения, объединяющее старый (кислородный) и новый (электронный) подходы и предложена универсальная единица восстановленности - редоксон.

3) Впервые сформулирована полная система уравнений внутриклеточного материально-энергетического баланса, учитывающая одновременно движение редоксонов в метаболизме и баланс двух видов промежуточных переносчиков энергии - а) макроэргических связей и б) протонов как носителей высокого трансмембранного электрохимического потенциала.

7) Впервые дан изохронный портрет клеточной популяции.

Практическое значение работы

Разработанный нами метод материально-энергетического баланса является эффективным исследовательским инструментом для интегрального описания популяций клеток. Он может быть применен и для описания популяций многоклеточных организмов. Этот подход позволяет упростить рассмотрение динамики клеточных популяций, исключив из этого рассмотрения факторы, не влияющие на изучаемые характеристики. Например, если изменение метаболических путей не приводит к изменению затрат АТФ на конструктивный обмен, то такое изменение не должно учитываться при вычислении величины выхода биомассы из субстрата. Этот подход позволяет найти реалистичные оценки величин выходов биомассы или органических продуктов из субстрата на основе биохимической информации о метаболизме данного субстрата. Он является основой технологических расчетов режимов культивирования и особенно эффективен в случае высоких концентраций биомассы. Он позволяет также осуществлять мониторинг растущей популяции в режиме реального времени, что является источником качественно новой информации о процессе ее жизнедеятельности. Новый способ культивирования - бистат, разработанный нами на основе ионного и материально-энергетического балансов роста, обеспечивает устойчивое культивирование во всем диапазоне концентраций влияющего на рост субстрата S, в том числе при тех значениях S, которые неосуществимы известными методами (хемо-стат, турбидостат, рН-ауксостат). Разработанная нами базовая распределенная модель роста микробной популяции и найденные решения выявляют ряд новых свойств поведения клеточных популяций с учетом их физиологической гетерогенности, что также важно в приложениях к технологическим процессам. Наконец, изохронный портрет популяций и других динамических объектов позволяет определить время достижения стационарного состояния системы с заданной точностью.

Апробации работы

Результаты работы доложены и обсуждены в 22 сообщениях на 18 отечественных и зарубежных конференциях разных лет: 1st International Symposium on Advances in Microbial Engineering (Marianske Lazne, Czechoslovakia, 1972), III Всесоюзное совещание по управляемому биосинтезу и биофизике популяций (Красноярск, 1973), Всесоюзные конференции по лимитированию и ингибированию процессов роста и микробиологического синтеза (Пущино, 1976, 1980 - 2 сообщения), Седьмая Всесоюзная конференция по калориметрии (Черноголовка, 1977), Всесоюзные совещания по непрерывному культивированию микроорганизмов (Москва, 1978, Киев, 1981 - 2 сообщения), съезды Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980, Алма-Ата, 1985 - 2 сообщения), International Symposia on Continuous Cultivation of Microorganisms (Prague, 1978, Hradec Kralove, Czechoslovakia, 1987 - 5 сообщений), FEMS International Symposia (Hradec Kralove, Czechoslovakia, 1981, Пущино, 1983 - 2 сообщения), 1 Всесоюзное совещание по культивированию клеток животных и человека (Пущино, 1983), 1 международная школа по автоматизации научных исследований (Пущино, 1985), IV Всесоюзная конференция "Управляемое культивирование микроорганизмов" (Пущино, 1986 - 2 сообщения), Всесоюзная конференция «Биоконверсия-88» (Рига, 1988), 15th International Symposium on Yeasts (Riga, 1991), Международная конференция «Математика, компьютер, образование» (Пущино, 2003).

Публикации

Основные результаты работы изложены в 51 публикациях, из которых в рецензируемых изданиях 46 (20 в отечественных и 26 в зарубежных изданиях).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Минкевич, Игорь Георгиевич

выводы

1. Разработаны принципы теории материально-энергетического баланса живых клеток и клеточных популяций. Сформулировано понятие общей единицы восстановленности - редоксона. Разработан принцип деления метаболизма клеток на парциальные обмены - конструктивный, дыхательный, продуктный, поддержание клеток. Разработаны модификации основной схемы парциальных обменов, приложимые, в частности, к фотосинтези-рущим организмам. Введены интегральные энергетические характеристики парциальных обменов. Сформулирована система уравнений материально-энергетического баланса метаболизма, описывающая взаимосвязь парциальных обменов через переносчики энергии.

2. На основе теории материально-энергетического баланса: а) Найдены зависимости энергетических выходов биомассы и продуктов метаболизма от характеристик парциальных обменов и скорости роста. б) Получены максимальные значения выходов клеток и продуктов метаболизма при росте на различных источниках вещества и энергии. в) Получены значения зависящей и не зависящей от скорости роста популяции компонент скорости затрат энергии на поддержание клеток. г) Обоснована в общем виде и подтверждена экспериментально универсальная пропорциональная взаимосвязь между тепловыделением и потреблением кислорода популяцией микроорганизмов. д) Сформулирован принцип построения математических моделей роста клеточных популяций, основанный на сочетании 1) кинетических зависимостей метаболических потоков от факторов внешней среды и 2) соотношений материально-энергетического баланса между этими потоками.

3. Разработана общая теория ионного баланса популяции микроорганизмов и среды ее обитания как часть теории материально-энергетического баланса. На этой основе разработаны и экспериментально осуществлены: а) Новый метод непрерывного культивирования - бистат, имеющий преимущества перед ранее известными методами. б) Методические основы мониторинга роста микробных культур.

4. Экспериментальные исследования роста микробных популяций и интерпретация полученных данных в терминах теории материально-энергетического баланса показали, что кинетическая зависимость скорости роста от концентрации субстрата S связана с влиянием S не только на скорость потребления субстрата, но и на отдельные парциальные обмены, в том числе на процессы поддержания клеток. На этой основе разработана математическая модель, описывающая кинетику роста микробной культуры с высокой точностью.

6. Разработана базовая распределенная модель популяции микроорганизмов. Исследованы решения системы уравнений для распределения клеток по возрасту и концентрации субстрата, влияющего на скорость деления клеток. Выявлены динамические свойства решений этой системы, аналогичные свойствам сосредоточенной модели - временное масштабирование переходных процессов, существование неустойчивых стационарных решений со свойствами седла. Выявлены, с другой стороны, свойства этих решений, качественно отличающиеся от свойств сосредоточенной системы -колебательный характер переходных процессов, зависимость периода колебаний от концентрации субстрата в среде, окружающей клетки, возможность не только затухания возрастной синхронности, но и возникновения ее заново с последующим затуханием.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клеточные популяции (микроорганизмы, культуры клеток тканей) давно и широко исследуются как в аспекте особенностей их метаболизма, так и с точки зрения поведения целостного объекта. Эти два аспекта, глубоко и тесно связанные в самом объекте, оставались достаточно разобщенными в исследованиях, проводимых биофизиками, биохимиками и физиологами. Безусловно, это вызвано специфичностью экспериментальных методов, существенно различающихся при изучении функционирования, например, рибосом, митохондрий и других клеточных структур, а, с другой стороны, при работе с культурами микроорганизмов и клеток тканей. Существует необходимость «сборки» полученных результатов в виде компактной теории, описывающей интегральные закономерности преобразования вещества и энергии субстратов роста в вещество и энергию клеток.

В литературном обзоре нашей диссертации (Глава 1) описаны результаты многочисленных исследователей, работавших в самых различных областях (в том числе отстоявших друг от друга, на первый взгляд, достаточно далеко) и сделавших много для подготовки к разработке теории материально-энергетического баланса роста клеточных популяций. На этой основе нами осуществлена собственно разработка этой теории. В нашей работе различные подходы и направления вышеупомянутых исследований объединены друг с другом и с новыми элементами (Ф-базис, редоксон, парциальные обмены), что позволило создать новый подход к описанию процесса конверсии вещества и энергии в клеточном метаболизме.

Теория материально-энергетического баланса роста клеточных популяций (МЭБ) основана на разработанном нами понятии физиологического базиса (Ф-базиса) для представления состава молекул. В этой системе отсчета нами введена универсальная единица восстановленности - редоксон, которая является общей мерой для потоков по любым метаболическим путям: электрон-транспортные цепи, синтез макромолекул, низкомолекулярный метаболизм, транспорт органических соединений через мембраны. Редоксон характеризуется стандартной энтальпией и стандартной свободной энергией Гиб-бса, которые описывают его энергетический уровень в Ф-базисе. Любое химическое соединение, восстановленное относительно базисных веществ, обладает ненулевым числом редоксонов. В органических соединениях их энергетический уровень, средний на молекулу, имеет значения, близкие к универсальной величине, но не строго равные ей; отклонения имеют порядок нескольких процентов. Нами показано, что и существование этих отклонений, и их относительная малость играют фундаментальную роль в метаболизме. Малость отклонений лежит в основе того, что многие биохимические реакции обратимы или близки к обратимым. В то же время наличие этих отклонений делает возможным существование электрон-транспортных цепей.

Редоксон может рассматриваться как единица квантования метаболически доступной энергии, основанная на энергетических свойствах электронных оболочек атомов, ответственных за химические связи. Протоны, имеющие высокий трансмембранный потенциал (высокоэнергетические протоны, ВЭП), и макроэргические связи (МЭС) представляют собой также единицы квантования метаболически доступной энергии, меньшие по количеству переносимой энергии, чем редоксон. Все они являются материально-энергетическими единицами, поскольку имеют совершенно строгую связь с количеством вещества и приблизительно постоянный уровень энергии.

Теория материально-энергетического баланса роста клеточных популяций является компактной, поскольку она выделяет небольшое число факторов, влияющих на энергетическую эффективность преобразования вещества и энергии при росте. Это стехиометрические коэффициенты сопряжения потоков редоксонов и потоков ВЭП и МЭС, а также скорость кругооборота вещества в клетках. Выведенный нами закон сохранения редоксонов определяет жесткие рамки, в которых протекает метаболизм. Баланс ВЭП и МЭС определяет влияние особенностей метаболизма на биоэнергетику роста в целом.

Важную роль в теории материально-энергетического баланса играет введенное нами деление метаболизма на парциальные обмены. Это деление носит параллельный характер - существуют биохимические реакции, которые входят в два или более парциальных обмена. Это реакции метаболизации субстрата - источника вещества и энергии. Потоки через них делятся на части, соответствующие потокам редоксонов, выходящим из метаболизма -конструктивный обмен (заканчивается синтезом вещества биомассы клеток), дыхательный обмен (поставляет редоксоны в дыхательную цепь), продукт-ный обмен (заканчивается образованием внеклеточных органических продуктов). Такие парциальные обмены имеют вход и выход. Кроме того, существуют парциальные обмены циклического характера. Это, во-первых, поддержание клеток - кругооборот вещества, состоящий из распада и образования заново. Циклический характер имеет также фотосинтетический энергетический обмен. Учет разомкнутости или цикличности парциального обмена крайне важен для правильного составления его схемы.

Составление схемы парциального обмена связано с различным объемом необходимой для этого информации. Продуктный обмен, как правило, содержит относительно небольшое число реакций, которые хорошо известны, и поэтому составление его схемы - задача достаточно простая. Электрон-транспортные цепи содержат параллельные потоки с разной стехиометрией продукции ВЭП, что усложняет точное определение суммарного коэффициента образования высокоэнергетических протонов в расчете на один редоксон. Но эта задача в целом успешно решается исследователями. Наиболее трудно составить схемы конструктивного обмена и кругооборота вещества (поддержание клеток).

Конструктивный обмен был подробно «расписан» для роста дрожжей на глюкозе и этаноле и для роста бактерий на глюкозе (ссылки см. Главу 3). Нами показано, что стехиометрические коэффициенты для потребления АТР в конструктивном обмене, полученные этими исследователями, дают завышенные значения выхода биомассы. Возможны две причины этого - 1) отсутствие информации о каких-то затратах энергии, имеющих место в конструктивном обмене или 2) влияние затрат энергии на поддержание клеток, скорость которых пропорциональна скорости роста биомассы и потому является кажущимся вкладом в потребление энергии при синтезе макромолекул биомассы. Нами был разработан способ обойти эту трудность. Он заключается в том, что гетеротрофный рост на глюкозе принимается за стандартный процесс, а для роста на других источниках вещества и энергии вводятся поправки на количество израсходованных переносчиков энергии (МЭС, ВЭП) согласно различиям между метаболизмом на глюкозе и на данном субстрате. Этот подход показал свою работоспособность для хемогетеротрофного и фо-тотрофного роста, он перспективен для любого варианта получения вещества и энергии клетками.

Что касается поддержания клеток, то эта область выглядит сейчас наиболее сложной, так как кругооборот вещества весьма разнообразен в отношении вида входящих в него процессов, их локализации и возможной регуляции. Это отдельная область исследования, к которой, насколько мы можем заключить, нет до настоящего времени должного интереса и общего подхода. Однако известно, что независящая от скорости роста /и компонента затрат энергии на поддержание клеток невелика в оптимальных для роста условиях. Оценки величины /i-зависимой компоненты затрат на поддержание клеток были сделаны нами в данной работе и оказались неожиданно большими.

Теория МЭБ выявила глубокую связь между балансом и кинетикой роста клеточных популяций. Закон сохранения числа редоксонов устанавливает жесткие рамки, в пределах которых происходит перераспределение вещества и энергии при росте клеточных популяций. Отсюда нами выведены простые и универсальные связи между скоростями основных метаболических процессов: rs = ju + гр + го для хемогетеротрофного роста и rs = jn для роста фото-трофных бактерий с одной фотосистемой. Балансы высокоэнергетических протонов и макроэргических связей накладывают дополнительные связи на потоки вещества и энергии в метаболизме. Эти два баланса включают в себя непосредственные затраты ВЭП и МЭС на поддержание клеток, которые зависят от условий, в которых находятся клетки. Отсюда нами сделан вывод, что затраты энергии на клеточное поддержание лежат в основе важного механизма зависимости скорости роста популяции от концентраций субстратов, температуры и других факторов внешней среды. Этот подход позволил успешно описать рост дрожжей на этаноле с помощью математической модели.

Наряду с балансом редоксонов нами рассмотрен сопряженный с ним баланс ионов при росте клеточных популяций. Для этого была разработана обобщенная схема обозначений для молекул разных веществ с различной степенью ионизации и на ее основе найдена величина скорости подачи сре-ды-титранта при рН-статированном культивировании. Эта величина содержит важную информацию о скорости роста популяции клеток. Наши результаты позволили определить точный вклад баланса каждого вида иона, а также величины заряда клеток на скорость подачи титранта. Были выведены уравнения динамики рН-статированной культуры, которые послужили теоретической основой для разработки нами нового метода непрерывного культивирования - бистата.

Кинетические модели роста клеточных популяций интенсивно развивались в течение XX века. Ввиду сложности объекта исследования они использовали различные допущения и преднамеренные огрубления схем роста, лежащих в основе таких моделей. Сюда следует отнести упрощения зависимости сдельной скорости роста от концентрации субстрата или температуры, отсутствие учета балансовых связей, описание клеток простейшим способом - с помощью концентрации их общего числа или биомассы и т.д. Тем не менее, развитие моделей постепенно включало в них все больше деталей, касающихся характеристик популяции. Наиболее ярким примером этого можно считать разработку распределенных моделей. Они сочетают детальность описания объекта и отсутствие излишней сложности, которой обладают, например, стохастические модели. Последние адекватно описывают процессы с клетками, в которых случайность действительно играет важную роль, например, если число клеток мало и есть реальная вероятность для популяции не выжить. Когда число клеток велико, стохастические модели редуцируются в обычные детерминистические системы дифференциальных уравнений с обыкновенными или частными производными.

Наши исследования распределенных моделей построены таким образом, чтобы закрыть существенные «белые пятна» в этой области. Прежде всего это касается разработки корректной базовой модели, удовлетворяющей требованиям баланса роста. Основное уравнение «неразрывности» в моделях формулируется в литературе в единственно возможной форме и потому корректно. Сложности возникают с краевыми условиями. Автору пришлось иметь дискуссии с коллегами из Германии, которые записывали краевые условие (5.5.2) в ошибочном виде: вместо «(?,0) они ставили ——полагая, что приток должен всегда описываться производной. Это говорит о том, что проблемы с формулировкой распределенных моделей существуют. В нашей базовой распределенной модели краевые условия сформулированы корректно и в математическом, и в биологическом аспектах. Кроме того, эта модель, будучи детерминистической, описывает случайные вариации внутриклеточных веществ. Эти вариации в данной модели «сконцентрированы» во времени и приписаны к моментам деления клеток или начала образования почек. Учет такой случайности может оказаться важным, поскольку содержание многих веществ в клетках чрезвычайно мало.

Важным моментом в динамике клеточных популяций является масштабирование переходных процессов по величинам скоростей (существование быстрых и медленных компонент у этих процессов). Этот аспект динамики биологических объектов интенсивно исследовался для полиферментных систем, но почти не изучался на уровне клеточных популяций. В нашей работе исследование временного масштабирования выполнено и для сосредоточенной, и для распределенной модели. В обоих случаях показано существование линии медленного движения на плоскости «клетки-субстрат», которая существенно упрощает динамику популяции после того, как прошла быстрая стадия.

Нами разработан способ отражения временных характеристик динамического объекта на фазовой плоскости - изохронный портрет. Изохроны -линии равного времени, их множество определено динамическими свойствами системы и базовой линией на фазовой плоскости. В нашей работе эта линия ограничивает область в окрестности стационарной точки системы, такую, что после попадания в эту область можно считать, что стационарное состояние достигнуто с заданной точностью. Изохроны - упорядоченное множество меток времени на траекториях; упорядоченность происходит из использования общей базовой линии для всего множества изохрон. При изменении базовой линии меняется все множество изохрон.

В нашей работе впервые выполнено детальное исследование стационарной и нестационарной динамики популяции клеток, описываемой распределенной моделью с учетом взаимного влияния клеток и среды друг на друга. Это влияние в данной модели имеет место через концентрацию одного из субстратов. Такая модель - «распределенный» аналог сосредоточенной модели «биомасса-субстрат», исследовавшейся в ряде работ, в том числе и в нашей. Нам удалось показать ряд необычных свойств распределенной модели. Сюда относятся наличие колебаний, которых нет в аналогичной точечной модели, возобновление колебаний после их затухания, изменение периода колебаний вследствие влияния концентрации субстрата на клетки, инициация возрастной синхронности при переключении значения концентрации субстрата в подаваемой среде. С другой стороны, неустойчивое стационарное состояние, соответствующее седлу в сосредоточенной модели (случай субстратного ин-гибирования), описывается однозначно определенной точкой на плоскости «общая концентрация клеток N -концентрация субстрата S». Этой точке в распределенной модели соответствует стационарное возрастное распределение клеток. Но переходные процессы на плоскости {N,S} уже не описывается непересекающимися траекториями, которые в сосредоточенной модели однозначно определены начальными значениями (iV(0),5'(0)}. Распределенная система имеет бесконечное число степеней свободы, и «траектории» {N(t),S(t)} являются проекциями бесконечномерного множества на плоскость {N(t),S(t)}. Полученные нами «траектории» представляют собой спиралевидные самопересекающиеся кривые, которые в конечном счете приходят в точку на плоскости {N,S}, соответствующую тому или другому устойчивому стационарному состоянию.

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Минкевич, Игорь Георгиевич, Москва

1. Мишустин, Е.Н., В.Т. Емцев, Микробиология. 1978, Москва: Колос. 351.

2. Перт, С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. 1978, Москва: Мир. 331.

3. Стейниер, Р., Э. Эдельберг, Д. Ингрэм, Мир микробов. Vol. 1. 1979, Москва: Мир. 320.

4. Стейниер, Р., Э. Эдельберг, Д. Ингрэм, Мир микробов. Vol. 2. 1979, Москва: Мир. 334.

5. Стейниер, Р., Э. Эдельберг, Д. Ингрэм, Мир микробов. Vol. 3. 1979, Москва: Мир. 486.

6. Шлегель, Г. Общая микробиология. 1987, Москва: Мир. 566.

7. Гусев, М.В., JI.A. Минеева, Микробиология. 1992, Москва: Изд. МГУ. 448.

8. Lengeler, J.W., G. Drews, S. G., Biology of the Prokaryotes. 1999: Black-well Science Inc. 955.

9. Maier, R.M., I. Pepper, L„ C.P. Gerba, eds. Environmental Microbiology. 2000, Academic Press. 585.

10. Madigan, T.M., J. Martinko, J. Parker, Brock Biology of Microorganisms, 10/E. 10 ed. 2003: Prentice-Hall, Inc. 1104.

11. Чеботарев, JI.H., Г.В. Шабурова, Г.М. Лисюк, О динамике поглощения глюкозы дрожжами Saccharomyces carlsbergensis при действии света. Биологические науки, 1984(12): р. 81-83.

12. Чеботарев, Л.Н., И. А. Еремина, Метаболизм углеводов у гриба Aspergillus niger при действии света. Микробиология, 1988. 57(3): р. 385-388.

13. Беленикина, Н.С., М.Г. Страховская, Г. Фрайкин, Активирующее действие лазерного ультрафиолетового излучения на рост дрожжевых клеток. Биофизика, 1990. 35(4): р. 618-620.

14. Имшенецкий, А.А., Т.Ф. Кондратьева, Устойчивость полиплоидных культур Candida utilis к действию ультрафиолетовых лучей. Микробиология, 1987. 56(5): р. 879-881.

15. Полотебнова, М.В., Е.П. Феофолова, В.М. Терешина, Е.А. Широкова, Действие света на образование липидов и процесс спорообразования у мукорового гриба Cunninghamella japonica. Микробиология, 1988. 57(3): р. 379-384.

16. Поспелов, М.Е., В.Б. Туровецкий, Г. Фрайкин, О роли повреждения мембран в инактивации дрожжевых клеток видимым светом. Микробиология, 1987. 56(5): р. 882-885.

17. Федосеева, Г.Е., Т.И. Кару, Т.С. Ляпунова, Н.А. Помощникова, М.Н. Мейсель, Чувствительность различных дрожжевых культур к действию низкоинтенсивного красного света. Микробиология, 1987. 56(5): р. 792-796.1821

Информация о работе

Минкевич, Игорь Георгиевич
доктора физико-математических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.02

Диссертация

Материально-энергетический баланс и кинетика роста клеточных популяций - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы