Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Масштабирование процессов глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторах

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Масштабирование процессов глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторах"

На правах рукописи

КАРПОВ АНТОН АЛЕКСАНДРОВИЧ

МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОРЕАКТОРАХ

03.00.23 - биотехнологии АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

У

На правах рукописи

КАРПОВ АНТОН АЛЕКСАНДРОВИЧ

МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОРЕАКТОРАХ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Евгений Александрович Рубан

Научный консультант:

Доктор ветеринарных наук, профессор,

академик РАСХН, лауреат Государственной премии РФ Анатолий Яковлевич Самуйленко Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Игорь Владимирович Тихонов

Доктор ветеринарных наук, профессор,

заслуженный вет. врач РФ Николай Васильевич Мельник

Ведущее учреждение:

Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я Р.Коваленко

Защита состоится «0С7» октября 2004 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбинат.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан сентября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Отсутствие научно обоснованных критериев масштабирования предопределяет многоступенчатость опытно -технологических работ, существенно замедляет внедрение полученных в полупроизводственных условиях технологических результатов и требует проведения дорогостоящих и длительных экспериментов непосредственно на крупномасштабном оборудовании.

Сложность определения условий масштабного перехода, с одной стороны, и важность изучения этих условий - с другой, приводят к необходимости применения системного подхода, суть которого в данном случае состоит в том, что вся информация, получаемая на лабораторных, опытных и промышленных установках, последовательно накапливается и обогащается в процессе разработки полной математической модели биореактора. Построенная таким образом математическая модель позволяет наиболее достоверно осуществлять масштабный переход и решать задачи оптимального проектирования биореакторов.

Эффективная работа биореактора во многом определяет технико-экономические показатели всего производства. При этом существует тесная взаимосвязь вопросов аппаратурного и технологического оформления процессов биосинтеза, в частности, рассмотрение вопросов гидродинамики и массопередачи являются определяющими при реализации процессов в крупно-тоннажных аппаратах.

Теория масштабирования процессов культивирования отражена в работах Л.М.Батунера (1966), В.В.Бирюкова (1985), Е.С.Былинкиной (1973), У.Э.Виестура (1987), В.В.Кафарова (1974, 1976, 1979), Е.А.Рубана (1995, 2003), А.Я.Самуйленко (2003), Л.А.Самохвалова (1968), К.Г Федосеева (1977), S.Aiba, J.E. Beiley, D.F. Ollis (1989), A.E.Humphry, N.F.Mills (1965), N.Blakebroygh (1981), RXFox (1978), Y.Miura (1976), Z.Seichert (1977), T.B.Young (1979), O.Levenspiel (1972).

При масштабировании необходимо знание физических, биологических, биофизических данных, определяющих течение биосинтеза, и с помощью определенных условий аэрации, перемешивания поддерживать оптимальные для биосинтеза параметры по жизненно важным для микроорганизма факторам.

Воспроизводимость процессов биосинтеза в биореакторах различного объема значительно облегчается, если предварительно исследовано влияние на биосинтез следующих основных факторов, определяющих эффективность условий аэрации и перемешивания, условий массообмена в системах газ -жидкость и жидкость - микроорганизм.

Однако следует также учитывать, что масштабный переход в настоящее время не может осуществляться только на основе постоянства каких-либо гидродинамических критериев, так как в процессе биосинтеза меняются реологические свойства культуральных жидкостей, что требует изменения условий аэрации и перемешивания, т. е. управления ими. Именно поэтому необходим весь объем исследовательских работ по изучению всего комплекса проблем культивирования в биореакторах без чего в дальнейшем невозможен обоснованный масштабный перенос процессов культивирования от лабораторных биореакторов в промышленные объемы.

Цель и задачи исследования. Цель работы - масштабирование биореакторов для глубинного культивирования микроорганизмов, т.е. нахождение критериев, при которых возможен непосредственный перенос опытных данных, полученных в лабораторных установках в биореакторы промышленного масштаба.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- классификация биореакторов и их выбор;

- изучение гидродинамики биореакторов;

- анализ массообмена в биореакторах;

- анализ основных критерий масштабирования биореакторов для глубинного культивирования микроорганизмов;

- выбор и экспериментальная проверка критериев масштабирования биореакторов.

Научная новизна. Определены основные критерии масштабирования биореакторов с механическим перемешиванием и аэрацией для глубинного культивирования микроорганизмов с моделированием оптимальных гидродинамических и массообменных характеристик. Показана адекватность выбранных критериев масштабирования полученным экспериментальным данным на лабораторных и промышленных биореакторах.

Практическая значимость работы. На основании модели биореактора с механическим перемешиванием и аэрацией выбраны критерии и разработана методика его масштабирования при переносе данных, полученных на лабораторных установках в промышленные биореакторы.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты доложены и обсуждены на: научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования ФГУП «Щелковский биокомбинат» (Щелково, сентябрь 2004 г.); Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, октябрь 2004г.).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. Теоретическое обоснование и экспериментальная проверка выбранных методов моделирования и масштабирования процесса глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией с использованием современных методов анализа.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 157 наименование, в том числе 82 зарубежных. Материалы диссертации иллюстрированы 7 таблицами и 31 рисунком.

2. Собственные исследования

Работа выполнена в отделе информатики и технологического обеспечения Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП) РАСХН и ФГУП «Щелковский биокомбинат» по разделу 06.01. Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса «Разработать блочно-модульную линию производства противобактерийных препаратов с использованием современных методов исследований, оборудования и с учетом требований GMP

2.1. Материалы и методы

При проведении исследований по масштабированию использовались биореакторы с перемешивающим устройством и аэрацией емкостью 10, 100 и 300 л типа АК-10-1, AHKVM-2M, фирм «Электролюкс» (Швеция) и Мару-биши (Япония). Сравнительный анализ конструктивных особенностей биоре-акюров емкостью от 1,2 до 750 л фирм <<№&» (США), «Галенкамп» (Англия) и «Браун» (ФРГ) проводился по данным каталожных изданий.

Экспериментальная оценка характеристик дисперсной жидкой фазы осуществлялась микроскопированием проб из биореактора.

Оценка интенсивности перемешивания по уровню микроперемешивания проведена с помощью анализа структуры потоков с учетом, что каждый злемент потока может находиться в активной зоне различное время.

Изучение структуры потоков производилось введением в биореактор различных индикаторов в виде ступенчатого, импульсного или синусоидального возмущения. В качестве индикаторов использовались растворы кислоты или щелочи.

Максимальную теоретическую эффективность биореактора по массо-обменным характеристикам можно предварительно оценить сульфитным методом, основанном на окислении кислородом сульфита натрия в сульфат.

Более сложным, но соответственно и более реальным с учетом свойств культуральной жидкости является динамический метод, когда концентрация растворенного кислорода определяются после резкого прекращения подачи аэрирующего газа и при подаче его вновь.

При предварительных лабораторных исследованиях гидродинамики, массообмена и критериев масштабирования использовались бактерии Escherichia coli, которые культивировались в лабораторных биореакторах на глюкозной питательной среде с добавлением минеральных солей в безопасных для экспериментатора условиях.

Схема установки на основе биореактора АК-10-1, емкостью 10 л, приведена на рис. I.

Рис.1. Схема опытной лабораторной установки: 1- биореактор Ак-10-1; 2 - турбинная шестилопастная мешалка; 3 -отражательные перегородки (4шт); 4,5 - привод перемешивающего устройства; 6 - барботер (аэратор) со сменным стаканом доя нанесения возмущения; 7 - датчик рН типа Ингольд; 8 - датчик рСЬ; 9 - датчик рСОг; Ю- переключатель зон измерения; 11,12 - блоки измерения и записи температуры, рН, рС>2, рСОг-

Для промышленной проверки критериев масштабирования биореакторов с механическим перемешиванием и аэрацией использованы результаты культивирования в биореакторах различной емкости микроорганизмов Егу-81ре1оШпх йтаораШае вакцинного штамма ВР-2 возбудителя рожи свиней. Культивирование проводилось по традиционной технологии на производственной питательной среде на основе перевара Хоттингера и печеночного экстракта.

, tjnmtm HtifX

Концентрация микроорганизмов определялась по оптической плотности на фотокалориметре ФЭК-56.

Для определения длительности фаз роста и максимальной удельной скорости роста бактерий рожи использовали графический метод.

Контроль температуры осуществлялся термометрическими датчиками; рН и окислительно-восстановительного потенциала (еН) - потенциометриче-ски; парциального давления кислорода (рОг)) и углекислого газа (рСОг) -диффузионным методом; глюкозы - ферментным; концентрации микроорганизмов - оптически; давления - манометрически.

Для анализа гидродинамических и массообменных показателей использовали динамическое программирование, цепи Маркова, линейное и нелинейное программирование, а при масштабировании биореакторов - геометрическое программирование с использованием персональных ЭВМ.

2.2. Теоретический анализ

В качестве основополагающего постулата принято, что сксрость биохимических реакций при культивировании определяется концентрациями физиологически важных веществ у поверхности микробных клеток, зависящими, в свою очередь, от аппаратурного оформления, технологического режима культивирования и некоторых специфичных технологических показателей. К последним относятся: количество и качество посевного материала и условия его выращивания, состав среды, условия стерилизации и пенога-шения, отвода тепла и др.

В настоящей работе внимание сосредоточено на одном из ключевых факторов масштабирования - изучение влияния гидродинамических и массо-обменных условий на процесс глубинного культивирования, остальные же факторы на всех этапах исследования приняты постоянными или учитывались при проведении параллельных опытов.

Исходными предпосылками при составлении модели процесса явились следующие:

- при культивировании микроорганизмов в среде, наряду с отдельными микробами, образуются их скопления, имеющие сферическую форму диаметром от 10 до 100 мк и более;

- биореактор должен обеспечивать турбулентное перемешивание по жидкой фазе > 10^), т. е. при таком режиме должны отсутствовать макро-градиент концентрации питательных веществ и метаболитов и зоны застоя по рабочему объему биореактора; в одинаковых макрообъемах культураль-ной жидкости, в которых объем выборки по числу микроколоний статистически достаточно велик, в сравниваемых биореакторах имеется примерно равное число микроорганизмов;

- суммарный метаболизм всех микроорганизмов, находящихся в равных объемах культуральной жидкости, будет одинаковым в масштабируемых процессах, если в среднем концентрации физиологически важных веществ у их поверхности из разных биореакторов различного объема будут равны.

2.3. Характеристики биореакторов, использованных для масштабирования

В таблице 1 приведены характеристики биореакторов при работе по масштабированию.

Таблица 1

Характеристики биореакторов

Примечание: Данные получены из каталожных изданий.

Условные обозначения: V - объем биореактора; п - скорость вращения мешалки; С, - расход газа на аэрацию; Д - диаметр биореактора; Н - высота биореактора; <1м - диаметр мешалки; 1 - длина лопасти мешалки; Ь - ширит лопасти мешалки; п, - количество ярусов мешалок; п0 - количество отбойников; с - ширина отбойника; N - мощность привода мешалки.

На рис. 2 схематично приведены основные геометрические соотношения серийного биореактора, а в таблице 3, их оптимальные значения.

Рис. 2. Основные геометрические соотношения для биореактора с аэрацией и механическим перемешиванием:

Д - диаметр биореактора; H - высота биореактора; Но - уровень жидкости в биоре ам ope; dw - диаметр мешалки; 1 - длина лопасти мешалки; b - ширина лопасти мешалки; h„ - расстояние нижнего яруса мешалки от дна биореактора; h) - расстояние между ярусами мешалок; с - ширина отражательной перегородки (отбойника).

Таблица 2

Оптимальные геометрические соотношения

для промышленных биореакторов

' Геометрические соотношения Для микроорганизмов

Отношение высоты биореактора к диаметру H/D 2,5-3,0

Отношение диаметра мешалки к диаметру биореак-гора DM D 0,3-0,5

1 Oiношение ширины лопасти к диаметру мешалки, i Ldvi 0,25-0,3

Отношение шины лопасти к диаметру мешалки, 1/dM 0,4-0,5

количество лопастей, п„ 4-6

Количество отбойников, п0 4

' Oi ношение ширины отбойника к диаметру мешалки С Dm 0,1-0,12

Количество ярусов мешалок, п, 1-3

! Расстояние нижнего яруса мешалки от дна, h0 1 - 1,5 dM

Расстояние между ярусами мешалок h,- k«

2.4. Гидродинамика биореакторов с механическим перемешиванием и аэрацией

Гидродинамические условия в реакторах с механическим перемешиванием, как правило, характеризуются окружной скоростью мешалки, критерием Рейнольдса, удельного расхода мощности на перемешивание и времени перемешивания (длительности). Сохранение постоянства этих показателей в различных аппаратах предполагает сохранение аналогичного гидродинамического режима.

Раштон ввел понятие числа мощности на затрачиваемое при механическом перемешивании жидкостей в биореакторе и выразил его через следующее соотношение N. =—гЩ— = внешняя сила/внутренняя сила р п ¿т'р

Экспериментальные данные о зависимости модифицированного критерия Рейнольдса от для плосколопастной (пл=6) турбинной мешалки приведены на рис.3.

Рис.3. Зависимость числа мощности (Ир) от модифицированного критерия Рейнольдса (Ле*) для шестилопастной турбинной мешалки при приведенных геометрических соотношениях.

Эспериментальные соотношения между Рг и другими переменными приведены на рис.4.

0.* V

Л'сЧО

2 А б ю !Г

Рис.4. Затраты мощности на перемешивание в системе газ-жидкость для плосколопастной (П,=6) турбинной мешалки: <1»,/д=0,33; С/Д=0,1: Н/Д=3.

Отношения затрачиваемой мощности на перемешивание в системе газ-жидкость для турбинной шестилопастной мешалки и в зависимости от интенсивности аэрации изменяется от 0,5 до 1.

Для расчетов потребляемой мощности при отклонении геометрических соотношений аппарата от «стандартных» в формулу расчета мощности вводится эмпирический корректирующий фактор.

где Б - диаметр аппарата; Нж - высота столба жидкости.

2.5. Структура потоков и время перемешивания в биореакторах

Под временем перемешивания (выравнивания) концентраций в трехфазной системе (жидкость-газ-микроорганизм) принимается время, необходимое для достижения определенного уровня гомогенности в рабочем объеме биореактора после импульсного введения индикатора в рабочую зону биореактора. Это время будет зависеть от конструктивных соотношений биореактора и перемешивающего устройства скорости вращения мешалки и структуры потоков, создаваемой при перемешивании.

Изучение циркуляции жидкости в биореакторах с мешалками показало, что существуют зоны с ярко выраженными радиальными и осевыми потоками. На рис.5 показана упрощенная модель рециркуляционных потоков, возникающих при перемешивании турбинной плосколопастной мешалкой.

Рис.5. Циркуляция жидкости в аппарате с турбинной мешалкой и отражательной перегородкой:

О - центр вращения, I - зона циркуляции, II-IV - зоны перемешивания

На рис.6 приведена упрощенная схема распределения скоростей потоков по зонам, причем в зонах I и II затухание скорости происходит быстрее, чем в зонах III и IV.

Рис.6. Распределение скоростей потоков в аппарате с турбинной мешалкой: О - центр вращения, z и х - оси; V*, V, - скорости вращения потока вдоль осей в аппарате.

Целью работы явилось установление связи между наличием рециркуляционных зон, продолжительностью перемешивания и основными режим-

ными параметрами процесса - геометрическими размерами и числом оборотов мешалки.

Время перемешивания тпер по зонам определялось измерением установившегося значения рН перемешиваемой жидкости в данной зоне после нанесения импульса возмущения (твозм~1 сек.) 1 н.раствором кислоты (НгЗО,») или щелочи ((№ОН) в зону мешалки (зона I) непосредственно по диаграмме (рис.7). При всех измерениях количество подаваемой щелочи или кислоты оставалось строго постоянным (10 мл).

Рис 7. Прохождение сигнала (импульса возмущения) в зонах (И) - (IV) Скорость движения диаграммы 12 мм/мин.

1 -момент нанесения импульса, рНн = 9,0; 2 - установившееся значение, рНк=5,6; с - скорость разгона звена; До - возмущающее воздействие; х,х - начальное значение рН исследуемой жидкости (единицырН); х„Ых - конечное значение рН после нанесения воз-м> тения (единицырН); туст - время установления (сек); тмп - время запаздывания (сек); - время перемешивания (сек.)

Согласно нашим экспериментальным данным, полученным при записи показаний выходного сигнала на диаграмме получено, что юр 6 *7Туст

у шиую времени Т можно представить в виде значения 7' = ——

где Ур - объем аппарата; - количество жидкости, захватываемой мешалкой:

где к - постоянный коэффициент для турбинной мешалки, равный 0,4; п - число оборотов мешалки; <1м -диаметр мешалки.

Тогда для условий полного перемешивания имеем

Зависимости времени перемешивания от диаметра и числа оборотов мешалки и критерия Рейнольда приведены на рисунках 8 и 9.

Рис.8. График зависимости времени перемешивания от диаметра и числа оборотов турбинной шестилопастной мешалки.

Диаметр мешалки <!„ (мм): 1а, 16 — 50; 2а, 26 - 72; За, 36 - 89; 4а, 46 - 125; 5а, 56 -150. п - скорость вращения мешалки (об./мин), хПер - время перемешивания (мин). Данные: а - экспериментальные, б - расчетные.

¿700 ■

й Л1

Рис.9. График зависимости произведения птпср от критерия Яе для турбинной шес-тилопастной мешалки.

Диаметр мешалки ёш (мм): 1-50,2-72,3-89,4-125, Режим: I - переходной, II - турбулентный

В результате исследований режимов работы биореактора застойных зон в пределах исследованных параметров не обнаружено.

2.6. Объемный коэффициент массопереноса (Ки)

Процессы аэробного культивирования микроорганизмов лимитируются скоростью растворения кислорода, вследствие чего для практиче ;ких целей необходимо значение потребности культуры в кислороде и скорости его растворения (скорость массопередачи), которая может быть выражена в общем виде следующей зависимостью

где Ср - равновесная концентрация кислорода в среде; С - рабочая концентрация кислорода в культуральной среде; Ку - объемный коэффициент массопередачи по кислороду; Кб - удельная скорость потребления кислорода единичным микроорганизмом; X - концентрация биомассы в единице объема среды.

На рис. 10 показана зависимость интенсивности дыхания т времени полного перемешивания, т.е. времени, которое необходимо для выравнивания концентраций в рабочем объеме аппарата после изменения какого-либо параметра (расход воздуха, рН, температура и т.д.).

л>; I

\

1

з

Рис.10. Зависимость интенсивности дыхания от времени полного перемешивания для E.coli.

1 - 1 час. культивирования; 2-4 часа культивирования.

Рис.11. Интенсивность дыхания Е.соИ в процессе культивирования.

1 - расход воздуха 0,25 л/л-мин, скорость перемешивания 200 об/мин;

2 - расход воздуха 1,0 л/л -мин, скорость перемешивания 200 об/мин;

3 - расход воздуха 1,5 л/л -мин, скорость перемешивания 200 об/мин;

4 - расход воздуха 0,25 л/л-мин, скорость перемешивания 600 об/мин;

5 - расход воздуха 1,0 л/л-мин, скорость перемешивания 600 об/мин;

6 - расход воздуха 1,5 л/лмин, скорость перемешивания 600 об/мин.

На рис.11 приведены данные по изменению интенсивности дыхания в процессе культивирования при различных режимах аэрации и перемешивания. Как видно из представленных результатов, максимальное дыхание микроорганизмов в процессе культивирования Е.соИ отмечалось между 3 и 5 часами.

На рис.12 представлены данные одного из опытов по исследовании. Зависимости интенсивности дыхания от скорости вращения мешалки и значений времени полного перемешивания (тП1:р). Лимитирующий предел по влиянию этих параметров на интенсивность дыхания лежит соответственно в интервале 600-650 об/мин, что соответствует времени полного перемешивания 2-2,7 мин. Так же проведены эксперименты, целью которых было выяснить, как происходит изменение дыхания при различных режимах перемешивания.

Рис.12. Зависимость дыхания от интенсивности перемешивания для 4-х часов культивирования Е.еоИ.

Таким образом, зная оптимальную величину коэффициента массопере-

ч

дачи по кислороду, рассчитанному с учетом поддержания оптимальной концентрации растворенного можно определить необходимую интенсивность перемешивания для обеспечения требуемых условий массопередачи газ-жидкость по двум газообразным компонентам.

2.7. Примеры масштабирования процессов культивирования микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией

В разделе приведены результаты исследований по масштабированию процессов культивирования культуры Escherichie coli (модельная кульгура) и Erysipelothiie rhusiopathiae шт. ВР-2 (промышленная культура), используемая при производстве противорожистой вакцины.

2.7.1. Масштабирование процесса кул ьтивирования E. coli.

Культивирование E.coli на простой глюкозной среде в бчореакторе АНКУМ-2 емкостью 10 л, снабженном одной плосколопасной (шесть лопастей) турбинной мешалкой и четырьмя отбойниками со следующими геометрическими характеристиками и технологическими параметрами культивирования.

Технические характеристики

Рабочий объем биореактора 0,7 V (Ур) - 7 л.; диаметр биореактора Б - 0,2 м.; высота биореактора Н - 0,4 м.; высота жидкости в биореакторе Но -0,3 м.; диаметр мешалки - 0,08 м.; скорость вращения мешалки п - от 50 до 1200 об/мин.; расход воздуха на аэрацию 0„ - от 0,1 до 12 л/ми !.; расстояние мешалки от дна биореактора Ьо- 0,08 м.; ширина отбойников - с - 0,02 м.; мощность двигателя перемешивающего устройства Ид,, - 0,5 квт.

Технологические параметры Вязкость культуральной жидкости - 0,01 кг/(м-сек); плотность куль-туральной жидкости рж- 1200 кг/м3; удельный расход воздуха на аэрацию

-^--0,5об/обмин. - или О - 3,5 л/мин.; удельная скорость роста Ц„,-2,1 час"';;

лимитирующий уровень концентрации субстрата (глюкозы) - Б <'0-12 мкМ; лимитирующий уровень парциального давления растворенного в культу-ральной среде кислорода рОг > 10±3% нас; оптическая концентрация хопт -40 ± 5 млрд/мл.; время культивирования Тц, - 4± 0,5 часа.; сульфитное число

биореактора 5С>Л - 150 мМОг/(л.ч); коэффициент массопередачи по кислороду

Для определения реального коэффициента массопередачи по кислороду использовался динамический метод. Графическое изображение данного метода приведено на рис. 13 и 14.

Дм**, пршЬотнт( с}.

Рис. 13. Измерение концентрации рОг во времени при динамическом методе оценки коэффициента массопередачи.

првизкпычие еЗ.

Рис. 14 Оценка коэффициента массопередачи О2 динамическим методом.

Измерения выполнялись через короткие интервалы времени соответствующим переходным состоянием периодического культивирования. При этом материальный баланс по растворенному кислороду будет равен:

где С* - концентрация кислорода на входе в биореактор; Сь - рабочая концентрация растворенного кислорода;

г - удельное потребление кислорода на единицу концентрации микроорганизмов М мольОг/млрд мл.час;

х„„г - оптическая концентрация микроорганизмов, млрд/мл.

При культивировании Е.соЦ в биореакторе емкостью 10 л получены экспериментальные результаты, представленные на рис. 14., 15, 16 и 17.

Хтт

¡0

Рис 14. Кривая роста Е.соИ.

Рис. 15. Зависимость удельной скорости роста E.coli концентрации глюкозы.

Рис 16. Зависимость удельной скорости роста ЕаэИ от парциального давления кислорода в культуральной жидкости.

Рис. 17.. Зависимость накопления Exoli от сульфитного числа, мМОг/(лч)

Для поддержания гомогенности в рабочем объеме биореактора необходимо поддержание турбулентного режима перемешивания, т.е. Яеч> 104.

Так как Яем = п ^ Р > то подставляя заданные и известные геометрические соотношения 6J ореактора,

получим: 104= 1Ю 2 , откуда п = 786 об/мин.

Окружная скорость мешалки покр = jt.n.dM=3,14-786 0,08=180 м/мин. Расход мощности, расходуемой на перемешивание

где Np - число мощности для шестилопастной трубинной мешалки согласно рис. 3

равно б.

к, 6-1,2-10'-13,1'-0,085

N„ =-:-:-» 5,4 /сек » 53вт

9,81

Удельный расход мощности = 1,5квт!м3

Мощность, затрачиваемая на перемешивание, как показано ранее, при аэрации снижается до 50%.

Для достижения перемешивания близкого к идеальному необходимо шестикратное обновление поверхности контакта фаз перемешиваемого объема культуральной жидкости.

Время полного перемешивания равно

6Л 6-06007

г.,„ =--—г =-г * 0,7мин » 42сек

"' 0,16л-¿и 0,16-786-0,08'

Требуется определить условия масштабирования (переноса) технологии культивирования E.coli в биореактор MD-100 (Япония) емкостью 100 л со следующими характеристиками: рабочий объем биореактора Vp - 70 л; диаметр биореактора D - 0,6 м; высота биореактора - Н - 1 м; высота жидкости Нж - 0,7м; диаметр шестиполостной турбинной мешалки dM - и,24 м; скорость вращения мешалки от 50 до 1000 об/мин; расход воздуха на аэрацию G от 1 до 200 л/мин.

В биореакторе емкостью 100 л должно выполняться условие сохранения окружной скорости мешалки jind - const

Следовательно, тш|ём|=лп2йм2 Так как у биореактора емкостью 100 л

ём = 0,24 м, тогда 786 0,08=П2 ' 0,24

786-0,08

П- =-;

0,24

2в0о61 мин

откуда

Значение равно:

4,33-0,24М,2-10^ 4 4 Кеч- МО"2 ;

Расход мощности на перемешивание

6-1,2-10 4,33 -0,24 9,81

= 42,7кг ■ и / сек « 420вт

Удельный расход мощности

К, 0,07

Число аэрации при расходе воздуха 0,5 об/об.мин = 35 л/мин

К'а ■■

■5 14 1

0,5. ^-0,6'-0,7^-

^- = 2,ЗМ0-2

4,33-0,24' Время полного перемешивания

6>0>07 П-7

г,. „ =-г ~ 0,1 мин ~ А2сек

п 0,16-260.0,24

Коэффициент массопередачи по кислороду Ки- 112 мМ02/(л.ч.ат.)

Относительная концентрация на 4 часа культивирования - 42±5 млрд/мл. Следовательно, масштабирование технологии культивирования из биореактора емкостью 10 л в 100-литровый осуществлено с точностью не превышающей 5% по времени культивирования и оптической плотности культуры.

2.7.2 Масштабирование культивирования Erysipelotria rhusiopathiae mm BP-2.

Культивирование бактерии рожи свиней из шт.ВР-2 проводилось по традиционной технологии на питательной среде на основе перевара Хоттин-гера и печеночного экстракта на лабораторном реакторе АК-10-1 (РФ) емко-

стью 10 л, снабженного одной плосколопастной (шестилопастной) трубин-ной мешалкой и четырьмя отбойниками с возможностью масшт бирования (переноса) технологических показателей в промышленный биореактор емкостью 300 л («Электролюкс», Швеция). Масштабирование проводилось по ранее рассмотренной методике для E.coli.

Технические и технологические характеристики и значения критериев масштабирования приведены в виде таблиц.

Таблица 3

Технические характеристики биореакторов АК-10-1 и биореактора фирмы «Электролюкс»

Таблица 4

Технологические показатели культивирования бактерий рожи ыт.ВР-2

> Биореакюр ! и, кг/(м сек) Р кг/м1 Пул 1/час ^ГЛЮКОЗЫ % ки мМОг/л.ч.ат. рОа %нас. 1кул ЬТ часы ^опт млрд/мл

1 АК-10-1 0,01 1200 0,71 0,1 420±5% 40-50 22±1 7±1

1 «Электролюкс» 0,01 1200 0,7 0,1 415±5% 40-50 2Ш 7,35± 1

Критерии масштабирования

Таблица 5

I Ьиореактор п об/мин покр м/мин N0 КВТ Н/Ур квт/м3 1-пер МИН №

ЛК-10-1 600 1,1-Ю4 180,5 0,05 7,1 0,6 2,4-10'2

1 «Электролюкс» 100 3,18-10" 180,5 1,68 6,0 0,7 2,6102

Следовательно, масштабирование процессов культивирования E.coli и бактерий рожи из лабораторных биореакторов (Юл) в промышленные (100 и 300л) осуществлена с максимальной ошибкой, не превышающей 5% с использованием набора гидродинамических и массообменных критериев масштабирования.

3. Выводы

3.1. Проведен анализ классификации и выбор биореакторов с механическим перемешиванием и аэрацией для культивирования микроорганизмов.

3.2. Изучена гидродинамика биореактора, включающая структуру потоков с использованием методов нанесения импульсного возмущения по рН в рабочий объем.

3.3. Изучены оптимальные массообменные характеристики биореакторов с использованием сульфитного метода и реальные при культивировании Е.соН и бактерий рожи шт. ВР-2 с использованием динамического метода. Реальное значение объемного критерия массообмена (Ки) значил о ниже оптимального.

3.4. Изучена кинетика культивирования микроорганизмов в биореакторе.

3.5. Проведен анализ и выбраны критерии масштабирования, включающие окружную скорость мешалки, степень турбулизации, удельный расход мощности на перемешивание, время полного перемешивания и число аэрации.

3.6. Проведена проверка методики масштабирования процессов культивирования Е.соН (модель) и бактерий рожи свиней шт. ВР-2. П сказана эффективность предложенной методики масштабирования с использованием системного анализа. Максимальна ошибка во время культивирования и оптической плотности не превышала 5%.

4.Практические предложения

4.1. Разработана «Методика анализа гидродинамических и массооб-менных характеристик биореактора с механическим перемешиванием и аэрацией» Утверждена директором ВНИТИБП 16 сентября 2004 г.

4.2. Разработана «Методика масштабирования процессов культивирования аэробных микроорганизмов в биореакторах с механическ 1М перемешиванием и аэрацией». Утверждена директором ВНИТИБП 16 сентября 2004 г.

Список работ, Опубликованных по теме диссертации

1. Карпов А.А., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я. Масштабирование биореакторов с механическим перемешиванием и аэрацией. // Доклад на научно-практической конференции посвященной 80-летию «Щелковского биокомбината». - Щелково, сентябрь 2004. с. 190-192.

2. Карпов А.А., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я. Масштабирование процессов культивирования микроорганизмов. // Доклад на научно-практической конференции посвященной 80-летию «Щелковского биокомбината». — Щелково, сентябрь 2004. с. 186-188.

3. Карпов А.А., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я. Технические и технологические характеристики биореакторов с механическим перемешиванием и аэрацией для культивирования микроорганизмов. // Доклад на Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». - Щелково, октябрь 2004. с. 65-71.

4. Карпов А.А., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я. Гидродинамика биореакторов. // Доклад на Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических прег аратов». — Щелково, октябрь 2004. с. 60-65.

5. Карпов А.А., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я. Структура потоков и время перемешивания в биореакторах. // Доклад на Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». - Щелково, октябрь 2004. с. 71-79.

Отпечатано в ООО "Мещера" зак. 069 тир. 100

»177 17

РНБ Русский фонд

2005-4 14837

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карпов, Антон Александрович

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Общие предпосылки.

1.2. Классификация и выбор биореакторов.

1.2.1. Гомогенность культуральной среды в биореакторе.

1.2.2. Механическое перемешивание в биореакторах.

1.2.3. Аэрация.

1.3. Гидродинамика биореакторов.

1.3.1. Физико-химические особенности культуральной среды.

1.3.2. Модели структуры потоков в биореакторах.

1.4. Массообмен в биореакторах с механическим перемешиванием 25 и аэрацией.

1.5. Критерии масштабирования биореакторов с механическим перемешиванием и аэрацией.

2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы.

2.2. Теоретический анализ.

2.3. Результаты исследований.

2.3.1. Характеристики биореакторов использованных для масшта- 47 бирования

2.3.2. Гидродинамика биореакторов с механическим перемешива- 49 нием и аэрацией.

2.3.3. Структура потоков и время перемешивания в биореакторах

2.3.4. Объемный коэффициент массопереноса (KLa).

2.3.5. Примеры масштабирования процессов культивирования микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией.

2.3.5.1. Масштабирование процесса культивирования E.coli.

2.3.5.2. Масштабирование культивирования Erysipelotrix rhu-siopathiae шт. ВР-2.

3. Обсуждение результатов исследований.

4. Выводы.

5. Практические предложения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Масштабирование процессов глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторах"

Актуальность проблемы. Отсутствие научно обоснованных критериев масштабирования предопределяет многоступенчатость опытно-технологических работ, существенно замедляет внедрение полученных в полупроизводственных условиях технологических результатов и требует проведения дорогостоящих и длительных экспериментов непосредственно на крупномасштабном оборудовании.

Сложность определения условий масштабного перехода, с одной стороны, и важность изучения этих условий — с другой, приводят к необходимости применения системного подхода, суть которого в данном случае состоит в том, что вся информация, получаемая на лабораторных, опытных и промышленных установках, последовательно накапливается и обогащается в процессе разработки полной математической модели биореактора. Построенная таким образом математическая модель позволяет наиболее достоверно осуществлять масштабный переход и решать задачи оптимального проектирования биороеакторов.

Непосредственный перенос опытных данных, полученных для данной системы глубинного культивирования с одного биореактора на другой (масштабирование), осуществляется в три этапа:

- выбор лучшего штамма посевного материала и среды пс основным биотехнологическим показателям;

- сравнительная оценка ростовых свойств питательной среды и штамма в лабораторной посуде (пробирка, колба и т.д.);

- оценка гидродинамических параметров процесса культивирования и их оптимизация в условиях использования лабораторной пилотной установки (от 1 до 10 л), снабженной системами автоматического контроля и управления;

- перенос полученного оптимального режима культивирования в промышленные объемы (собственно масштабирование).

Эффективная работа биореактора во многом определяет технико-экономические показатели всего производства. При этом существует тесная взаимосвязь вопросов аппаратурного и технологического оформления процессов биосинтеза, в частности, рассмотрение вопросов гидродинамики и массопередачи являются определяющими при реализации процессов в крупнотоннажных аппаратах.

Наиболее перспективным в настоящее время следует признать применение для целей масштабирования сочетания двух и более критериев.

Так как в процессах биосинтеза скорость роста микроорганизмов и накопление целевого продукта могут лимитироваться гидродинамическим режимом работы биореактора и условиями массообмена, естественно предположить, что для возможности получения в биореакторах различных емкостей одинаковых показателей следует учитывать влияние большинства факторов, которые могут воздействовать на процессы жизнедеятельности, с учетом меняющихся по ходу биосинтеза реологических свойств системы. При культивировании микроорганизмов в производственных условиях обычно можно говорить о следующих основных параметрах -температура, рН, парциальное давление растворенного кислорода (рОг), растворенного углекислого газа (рССЬ) и окислительно-восстановительного потенциала (еН), достаточно полно характеризующих потребности микроорганизмов, по которым можно контролировать и управлять процессом в биореакторах различной емкости. При переходе к аппаратам больших емкостей неизбежно меняется гидродинамическая обстановка и масштабировать ее один к одному npai гически не представляется возможным. Следовательно, необходимо знание физических, биологических, биофизических данных, определяющих течение биосинтеза, и с помощью определенных условий аэрации, перемешивания, массообмена поддерживать оптимальные для биосинтеза параметры по жизненно важным для микроорганизма факторам.

Воспроизводимость процессов биосинтеза в биореакторах различного объема значительно облегчается, если предварительно исследовано влияние на биосинтез следующих основных факторов, определяющих эффективность условий аэрации и перемешивания, условий массообмена в системах газ -жидкость и жидкость - микроорганизм.

Однако следует также учитывать, что масштабный переход в настоящее время не может осуществляться только на основе постоянства каких-либо гидродинамических критериев, так как в процессе биосинтеза меняются реологические свойства культуральных жидкостей, что требует изменения условий аэрации и перемешивания, т. е. управления ими. Именно поэтому необходим весь объем исследовательских работ по изучению всего комплекса проблем культивирования в биореакторах без чего в дальнейшем невозможен обоснованный масштабный перенос процессов культиви ювания от лабораторных биореакторов в промышленные объемы.

Цель и задачи исследования. Цель работы — масштабирование биореакторов для глубинного культивирования микроорганизмов, т.е. нахождение критериев, при которых возможен непосредственный перенос опытных данных, полученных в лабораторных установках в биореакторы промышленного масштаба.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- классификация биореакторов и их выбор;

- изучение гидродинамики биореакторов;

- анализ массообмена в биореакторах;

- анализ основных критерий масштабирования биореакторов для глубинного культивирования микроорганизмов;

- выбор и экспериментальная проверка критериев масштабирования биореакторов.

Научная новизна. Определены основные критерии масштабирования биореакторов с механическим перемешиванием и аэрацией для глубинного культивирования микроорганизмов с моделированием оптимальных гидродинамических и массо-и теплообменных характеристик. Показана адекватность выбранных критериев масштабирования полученным экспериментальным данным на лабораторных и промышленных биореакторах.

Практическая значимость работы. На основании модели биореактора с механическим перемешиванием и аэрацией выбраны критерии и разработана методика его масштабирования при переносе данных, полученных на лабораторных установках в промышленные биореакторы.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты доложены и обсуждены на: научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования ФГУП «Щелковский биокомбинат» (Щелково, сентябрь 2004 г.); конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, октябрь 2004 г.).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. Теоретическое обоснование и экспериментальная проверка выбранных методов моделирования и масштабирования процесса глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией с использованием современных методов анализа.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литер туры, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 157 наименование, в том числе 82 зарубежных. Материалы диссертации иллюстрированы 7 таблицами и 31 рисунком.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Карпов, Антон Александрович

4. Выводы

4.1. Проведен анализ классификации и выбор биореакторов с механическим перемешиванием и аэрацией для культивирования микроорганизмов.

4.2. Изучена гидродинамика биореактора, включающая структуру потоков с использованием методов нанесения импульсного возмущения по рН в рабочий объем.

4.3. Изучены оптимальные массообменные характеристики биореакторов с использованием сульфитного метода и реальные при культивировании E.coli и бактерий рожи, шт. ВР-2, с использованием динамического метода. Реальное значение объемного критерия массообмена (KLa) значимо ниже оптимального.

4.4. Изучена кинетика культивирования микроорганизмов в биореакторе.

4.5. Проведен анализ и выбраны критерии масштабирования, включающие окружную скорость мешалки, степень турбулизации, удельный расход мощности на перемешивание, время полного перемешивания и число аэрации.

4.6. Проведена проверка методики масштабирования процессов культивирования E.coli (модель) и бактерий рожи свиней, шт. ВР-2. Показана эффективность предложенной методики масштабирования с использованием системного анализа. Максимальна ошибка во время культивирования и оптической плотности не превышала 5%.

5. Практические предложения

5.1. Разработана «Методика анализа гидродинамических и массооб-менных характеристик биореактора с механическим перемешиванием и аэрацией». Утверждена директором ВНИТИБП 16 сентября 2004 г.

5.2. Разработана «Методика масштабирования процессов культивирования аэробных микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией». Утверждена директором ВНИТИБП 16 сентября 2004 г.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпов, Антон Александрович, Щёлково

1. Андреева Е.А., Работнова И.Л. Влияние окислительно-восстановительного потенциала на рост аэробных микроорганизмов //Микробиология.- 1978.- Т. XL1., № 4.- G.637-643.

2. Атикинсон Б. Биохимические реакторы. М.: Пищевая промышленность, 1979. - 280с.

3. Батунер Л.М. Процессы и аппараты органического синтеза и биохимической технологии.- М.-Л., 1966.- 485с.

4. Бейли Дж, Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: Мир, 1989.-Т. 1.-692с.

5. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: Мир, 1989.-Т.2.-590с.

6. Бекер М.Е. Введение в биотехнологию.- М.: Пищева? пром-сть, 1978.- 247с.

7. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза.- М.: Наука, 1985. 292с.

8. Бирюков В.В. Автоматический контроль и управление в процессах биосинтеза антибиотиков. Обзор. — М.: Обзорная информация ЦБНТИмед-пром, серия химико-фармацевтическая промышленность, 1974. Вып. 9. -108с.

9. Богданов В.М., Рогожин Н.С., Авакян Б.Г., Абдулаев У.Л., Шевченко Ю.Н. Актуальные проблемы ветеринарной науки и практики: Тез. юкл.науч.-практ.конф. — Самарканд, 1987. С. 6-7.

10. Былинкина Е.С. Проблема масштабного перехода в микробиологических процессах //Микробиологическая промышленность. 1973. - № 10.- С. 49-55.

11. Виестур У.Э., Кристапсонс М.Ж., Былинкина Е.С. Культивирование микроорганизмов. М.: Пищевая промышленность, 1980. - 232с.

12. Виестур У.Э. Аэрация и перемешивание в процессах культивирования микроорганизмов. Обзор М.: ОНТИТЭИмикробиопром. - 1972. - 67с.

13. Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич А.В. Биотехнология (биологические агенты, технология, аппаратура). Рига: Зинатне, 1987. — 264с.

14. Виестур У.Э., Швинка Ю.Э., Рикманис М.А. Биоэнергетические и аппаратурные аспекты создания энергосберегающих систем ферментации //Биотехнология.- 1988. Т. 4, № 2. - С. 235-243.

15. Виестур У.Э., Долгицер Н.С. Способы культивирование микроорганизмов и аппараты.- М.: 1972. — 81с.

16. Виестур У.Э., Кузнецов A.M., Савенков. Системы ферментации. — Рига: Зинатне.1986. 174с.

17. Винаров А.Ю., Кафаров В.В., Гордеев Л.С. Перемешивание на микро- и макроуровнях в процессах ферментации. Обзор — М.: ОНТИТЭИмикробиопром. 1974. - 70с.

18. Винаров А.Ю., Кафаров В.В., Гордеев Л.С. и др. Ферментеры колонного типа для микробиологических процессов.- М.: 1976. — 48с.

19. Ворошилова Л.А. Исследование технологических условий, обеспечивающих воспроизводимость процессов ферментации в различных аппаратах. Автореф. дисс. канд.техн.наук. М., 1977. — 127с.

20. Ворошилова Л.А., Бирюков В.В. Былинкина Е.С. Масштабный переход в процессах ферментации по сочетанию массообменных характеристик аппаратов //Микробиологическая промышленность.- 1976.- № 2. С.3-8.

21. Данквертс П.В. Газо-жидкостные реакции. М.: Химия, 1973. —296с.

22. Дрю С. Жидкая культура. Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1983.-441с.

23. Дубинина Г.П. Управление культивированием патогенных микроорганизмов //Микробиология.- 1982. -№12. С. 40-44.

24. Егоров Н.С., Олескин А.В., Самуилов В.Д. Биотехнология 1. Проблемы и перспективы. — М.: Высшая школа, 1987. 159с.

25. Зайцева Г.И., Чудинова А.Д. Исследования по культивированию вакцинного штамма рожи свиней ВР-2 в ферментерах //Экспресс-информация. Всесоюзный научно-исследовательский институт биологической промышленности. 1978. -№ 5.- С. 99-101.

26. Иерусалимский Н.Д. Теоретические и промышленные аспекты микробиологического синтеза //Вестник АН СССР.- 1965. -№ 4. С. 42-50.

27. Калунянц К.А., Голгер Л.И., Балашов В.Е. Оборудование микробиологических производств. — М.: Агропромиздат, 1987. 398с.

28. Кафаров В.В. Основы массопередачи. М.: Высшая школа, 1972.496с.

29. Кафаров В.В., Винаров А.Ю., Гордеев Л.С. Моделирование биохимических реакторов. М.: Лесная промышленность, 1979. - 342с.

30. Кафаров В.В., Перов В.Л. Мешалкин В.П. Принципы математического моделирования химико-технологических систем. М.: Химия, 1974. -344с.

31. Кафаров В.В. Методы кибернетики в химии и химической технологии. М.: Химия. - 1971, - 302с.

32. Кафаров В.В., Дорохов И.Н. Системный анализ процессов химической технологии.- М.: Химия, 1976.- 489с.

33. Кафаров В.В., Клипинцер В.А., Дудоров А.А. Стохастическая модель не идеального смесителя //ТОХТ.- 1968. -№ 12. — С.793-801.

34. Каркмасова М.А., Баснакьян И.А., Мельникова С.А. Фазовое культивирование микроорганизмов //Микробиология.- 1985.- № 2. С. 105-109.

35. Ландау Л.Д., Лившиц Е.М. Механика сплошных сред.- М.: Наука, 1953.-789с.

36. Лацис Л.Я., Селга С.Э., Завелис Я.Э., Ясович М.Я., Базилевич Я.А. Регулятор скорости вращения мешалки пилотных и промышленных ферментеров //В кн. Ферментационная аппаратура. -Рига. 1980. — С.72-77.

37. Левич В.Г. Физико-химическая гидродинамика. М.: Физматиздат, 1960.-280с.

38. Лимитирование и ингибирование микробиологических процессов. /Под ред. В.К.Ерошина. -Пущино. 1980. - 177с.

39. Лимитирование и ингибирование процессов роста и микробиологического синтеза. /Под ред. И.Л.Работновой, И.Г.Минкевича. -Пущино. -1976.-208с.

40. Лисенков А.Н., Чумаков М.П., Миронова Л.Л. Системный подход к статистическому анализу и оптимизации процессов биотехнологического производства вакцин //Биотехнология.- 1990.- № 6. — С. 77-82.

41. Марцулевич Н.А., Поротодьяконов И.О., Романков П.П. Масштабный переход при моделировании массообменных процессов в аппаратах с идеальным перемешиванием диспергированной фазы //ТОХТ. -1984. -T.XVIII, № 1. С. 3-7.

42. Масштабный переход в химической технологии. /Под ред. А.М.Розена. М.: Химия, 1980. - 319с.

43. Матвеев В.Е., Вадимов В.М., Воробьев А.А. Научные основы получения чистых культур микроорганизмов в технологии вакцин. М.: Медицина, 1980.-225с.

44. Матвеев В.Е. Микробиологическая технология: новое научное направление биотехнологии //Биотехнология.- 1985.- № 1. — С. 6-14.

45. Мельник Н.В. Разработка, усовершенствование и оптимизация промышленных технологий производства диагностикумов и противобакте-рийных вакцин //Дис. доктора ветеринарных наук. Щелково.- 1997.- 280с.

46. Мельникова В.А. Ингибирование и стимуляция жизнедеятельности микроорганизмов в процессах культивирования //Микробиология.- 1983.-№10.-С. 3-8.

47. Микробиологический синтез. Процессы, аппараты и автоматизированные системы управления в микробиологических производствах и биотехнологических системах. Сб.научн.тр. /ВНИИбиотехн. -М.: 1978.-180с.

48. Мутафаров С.Б., Минкевич И.Г., Ерошин В.К. рН-ауксостат: теория и практика. Пущино: 1985. - 41с.

49. Николаев А.Н., Воинов Н.А., Емельянов В.М. Интенсификация процессов микробного синтеза в пленочных аппаратах //Биотехнология. -2000.-№6. -С. 75-79.

50. Николаев П.И. Аппаратурное оформление промышленных процессов микробиологического синтеза //Журнал всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева. -1972. -Т. 17, №5. -С. 504-569.

51. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. -М.: Мир, 1978.-331с.

52. Петрова Т.А., Степанова Н.В. Интермедиальные модели роста микроорганизмов //Микробиология. -1990. -Т.59, №1. — С. 43-51.

53. Работнова И.Л. Пути управления биосинтезами у микроорганизмов: Тез.докл. III Всесоюзного совещания по управляемому биосинтезу и биофизике популяций. -Красноярск. 1973.-С. 242-244.

54. Работнова И.Л. Физиология микроорганизмов и управляемое культивирование //Успехи микробиологии. -1990. -№24. С. 88-97.

55. Разработка колонного ферментера / ИЛ.Струманис, У.Э.Виестур, М.Е. Бекер, А.К. Кинс.// Микробные биомассы и их метаболиты. -Рига: 1972.-С. 117-121.

56. Рубан Е.А. Оптимизация и масштабирование процессов глубинного культивирования микроорганизмов и клеток животных с использованием методов системного анализа. Автореф. дисс. доктора биол.наук.- М.: 1995. -47с.

57. Рубан Е.А., Раевский А.А. Автоматизация процессов биосинтеза: Тезисы XXI Всемирного ветеринарного конгресса. — М.: 1980. — С. 180.

58. Рубан Е.А., Батуров В.И., Гуславский А.И., Гайденко В.П. Комплексные технологические линии для производства биопрепаратов: Тезисы IV Всесоюзной конференции по комплексной автоматизации и механизации химфармпромышленности. Белгород: 1981.-С. 121-122.

59. Рубан Е.А. Методы системного анализа процесса культивирования: Тезисы докладов II Всесоюзной конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов». — М.: 1981.-С. 202-202.

60. Рубан Е.А., Емельянов Н.И., Письменный В.В., Мельниченко В.М. АСУ ТП культивирования клеток животных и микроорганизмов: '"руды конференции «Управляемое культивирование микроорганизмов». -Пущино: 1986.-С. 40-41.

61. Рубан Е.А., Абрамов А.Б., Соловьев Б.В., Назаркина К.И., Письменный В.В. Опыт использования АСУ ТП при культивировании клеток животных. Сборник научных трудов «Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов». М.: 1989. - С. 33-38.

62. Рубан Е.А., Кафаров В.В. Определение времени перемешивания в аппаратах с мешалкой //Журнал прикладной химии. -1968. №2. - С.301-308.

63. Рубан Е.А. Исследование условий перемешивания в ферментерах при биосинтезе антибиотиков. Автореф. дисс. канд. технических наук.- JL: 1969.-19с.

64. Рубан Е.А., Кафаров В.В. Модель структуры потоков многофазных систем: Тезисы Всесоюзной конференции по биоинженерии «Инженерные проблемы микробиологического синтеза».- М.: 1968. С.246-252.

65. Рубан Е.А., Кафаров В.В. Анализ процесса перемешивания в ферментерах при биосинтезе антибиотиков: Тезисы Всесоюзной конференции по биоинженерии «Инженерные проблемы микробиологического синтеза». -М.: -1968. -С.13-17.

66. Рубан Е.А., Былинкина Е.С. Расчет мощности на перемешивание в ферментерах //Хим.фарм.журнал. -1968. -№3 -С.41-44.

67. Рубан Е.А., Кафаров В.В., Былинкина Е.С., Ворошилова JI.A. Аэрация и перемешивание в процессе биосинтеза антибиотиков //Проблемы антибиотиков. -1962. -№2-3. С. 10-26.

68. Рубан Е.А., Кафаров В.В., Ворошилова JI.A. Аэрация и перемешивание в процессе биосинтеза антибиотиков //Доклад на симпозиуме стран СЭВ. -М.: 1968. -С.10-16.

69. Рубан Е.А., Кафаров В.В.,Былинкина Е.С. Исследование перемешивания в аппаратах для биосинтеза антибиотиков //Хим.фарм.журнал. — 1969.-№6. -С.33-38.

70. Рубан Е.А., Былинкина Е.С., Якушин М.В. Исследование интенсивности дыхания культуры продуцента стрептомицина в модельных экспериментах //Хим.фарм.журнал. -1969. №1. -С.57-61.

71. Рубан Е.А., Былинкина Е.С., Якушин М.В. Исследование газообмена на модельных растворах //Хим.фарм.журнал. -1969. -№1. -С.62-65.

72. Рубан Е.А. Анализ условий гидродинамики на биосинтез антибиотиков. Сборник докладов конференции молодых специалистов Москворецкого района. -М.: 1970. -С.7-9.

73. Рубан Е.А., Былинкина Е.С., Никитина Т.С. Изучение влияния перемешивания на документацию антибиотиков с использование.^, изотопов. Материалы 1 конгресса «Успехи в биоинженерии». -Марианск-Лазна, ЧССР.-1972 -С.92-95.

74. Рубан Е.А., Былинкина Е.С., Никитина Т.С., Торбочкина Л.И., Са-зыкин Ю.О. Анализ и расчет гидродинамического режима работы ферментера //Хим.фарм.журнал. -1972. -№ 10. -С.20-22.

75. Рубан Е.А., Гайденко В.П., Веселов И.Я., Грачева И.М., Уваров И.П. Влияние аэрации и перемешивания на культивирование в ферментерах различной емкости //Микробиологическая промышленность. -1974. -№4. -С. 42-44.

76. Рубан Е.А., Никаноров Б.А., Гайденко В.П. Обеспечение оптимальных гидродинамических условий в промышленных ферментерах. //Экспресс-информация «Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности».-М.:-1976.-№5 -С.8-11.

77. Рубан Е.А. Анализ процессов массообмена при культивировании микроорганизмов //Экспресс-информация «Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности» М.: -1984. -№5.-С. 12-17.

78. Рубан Е.А., Самуйленко А.Я., Еремец В.И. Оборудовшие фирм США для биотехнологии //Вестник РАСХН. 2001№3. - С.29-31.

79. Рубан Е.А., Былинкина Е.С. К вопросу о масштабировании перемешивания при ферментации //Проблемы антибиотиков. -1967. -№3. -С.7-26.

80. Самохвалов JI.A. Масштабирование процесса брожения . помощью теории подобия: Тезисы доклада на 6-м съезде Всесоюзного микробиологического общества «На главных путях научно-технического прогресса». Рига: 1980.-Т.4. -С. 129.

81. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов. М.: Изд-во РАСХН.- 2(Ю0. -Т.1. -375с.

82. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов. -М: Изд-во РАСХН.- 2000. -Т.2. -340с.

83. Телишевская Л.Я., Трусова Л.И. Значение углеводов для роста Listeria monocytogenes и Erysipelothrix insidiosa. Труды института Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветпрепаратов. — 1974. -Т. 20.-С. 251-254.

84. Технология микробного синтеза. /Под ред. Дунце Н.Э. Рига: Зи-натре. -1978. -193с.

85. Уонг Д., Кооней Ч., Демайн А., Дуннеп Р., Хемпри А., Лолли М. Герметизация и технология ферментов. —М.: Пищевая промышленность.-1983. -336с.

86. Уэбб' Ф.Ч. Биохимическая технология и микробиологический синтез. -М.: Медицина.- 1969. -630с.

87. Федосеев К.Г. Физические основы и аппаратура микробного синтеза биологически активных соединений. М.: Медицина.- 1977. - 303с.

88. Шилов А.Г., Штоффер Л.Д., Былинкина Е.С. Расчет мощности, потребляемой одно- и многоярусными турбинными мешалками. В кн.: Микробиологические препараты. — Рига: - 1976. - С. 205-212.

89. Шишов В.П., Никаноров Б.А., Передереев Н.И., Сощик Г.Г., Филиппова Г.И. Питательная среда для выращивания бактерий рожи. Авторское свидетельство, заявлено 03.06.74., опубликовано 30.12.75. Бюлл. № 48. С. 2.

90. Штербачек 3., Тауск П. Перемешивание в химической промышленности.-М.: ГХИ- 1963.-416с.

91. Aiba S., Humphrey А.Е., Mills N.F. Biochemical Engineering. N.J. Academic Press, 1965. - 287p.

92. Aiba S., Okabe M.A. A complementary approach to Scale up Sumula-tion and Optimization of microbial Processes /In book advanas in Biochemical Engineering, Berlin, N.Y. Spring verlag, 1977, -Vol.6 - P. 111 -130.

93. Anderson G.B., Behboodi E., Pacheco T.V. Cultured inner cell masses from in vitro derived livine blastocysts // Theriogendogy. 1992. -Vol.37, №177. -P.l 12-132.

94. Andrew S.P. Gas-liguid mass transfer in microbiological reactors //Trans.Inst.Chem.Eng.-1982.-Vol.60.№ 1. -P.3-13.

95. Bajpai R.K., Reuss M., Conpling of mixing and microbial Kinetics for evaluating the performance of bioreactors //CanJ.Chem.Eng. — 1982.- Vol.60, №3. -P.3 84-392.

96. Blakebrough N., Moresi M. Scale-up whey fermentation in * pilot-plant fermenter. //Eur. J. Appl. Microbiol. And Biotechnol. -1981.-Vol. 12, № 3. P. 173-178.

97. Brown D.E. Scaling up microbial processes. //Chemtechn. -1983.-Vol. 13, №3,-p. 164-169.

98. Bylinkina E.S., Ruban E.A., Nikitina T.S. Studies of Agitation intensity in antibiotic fermentation broths using isotopic tracers. — In: Adv. in Microbial• Engineering. 1973. - N 4. - P. 331 -342.

99. Castalda F.J., Maline J.F. Velocity-dependent reaction rates in asimple reactor. //J.Water Pollut. Contr.Fed. 1982.-Vol.54, №3, Part.l -P.261-269.

100. Cavin C.S., Cavin E.D., Legowski J.J. A study of the efficacy of computer simulated laboratory experiments //J.Chem. Educ. -1978. -Vol.55, №9 -P.602-604.

101. Ciacolo L.L.,Hameyr K. Method and apparatus for automated meoser-ment of tntrgy oxyden. Пат США № 4073692. -1978.

102. Cooper C.M., Fernstrom G.A., Miller S.A. Performance of agitated gas-liguil contactors. //Ing.Eng. Chem. -1944. №3. -P.504-548.

103. Coto S., Kuwajima Т., Okabe M., Okamato R., Takamatsu A., Application of tower type fermenter with two — fluid to biomass production from methanoc //J.Fermnt.Technol. -1979. -Vol.57, №4 P. 341-344.

104. Dawes E.A. Quantative problems in biochemistry E&S. Livingstone. Edinburgh and London.- 1960 - P. 99-154.

105. Duric N. Self-aspirating bioreactor SA: Тезисы симпозиума стран СЭВ по биотехнологии. Братислава. -1983. -С. 157.

106. Eckenfelder W.W. Process design of aeration system for biological waste treatment//Chem.Eng.Progress. -1956. -P.286-312.

107. Feigner P. A new technique of heterogenous enzyme-linked immunosorbent assay, stick-ELISA. I. Description of the technique //Zbl. Bact. I., Abt. Orig. A.-1978. -P. 112-117.

108. Fireoved R.L. Mutharasen R. Meoserment of gas-phase oxyden concentrations with oxyden electrode //Biotechn. and Bioeng. -1982. №9. -P.2109-2113.

109. Fox R.I. The applicability of publiched Scale-up Criteria t) comercial fermentation processes //1st. Eur. Congr. Biotechnol. Interlaken, Part 1. Frankfurt -1978.-P. 80-83.

110. Herbert D. The chemical composition of microorganisms as asfunction of freir envioronment // Symp. Soc. Microbiol, II.- 1961.- P. 394-416.

111. Higbie R. The rate of absorption of pure gas into a still liquid during short periods of exposure // Trons. Am.l ust.Chem.Engers. -1935. -P.365-391.

112. Heijnen J.J., Roels J.A. A macroscopic model describing yield and maintenance relationships in aerobic fermentation processes // Biotechn.and Bio-eng. -1981.-Vol. 23,№4.-P.739-763.

113. Ishikawa Y., Shoda M., Maruyama H. Design and performance of a new microcalorimetric system for aerobic cultivatijn of microorganisms //Biotechn. and Bioeng. -1981. -Vol.23, №11. -P.2629-2640.

114. Levenspiel O., Chemical Reaction Engineering, 2d ed., John Wiley and Sons, Ins., New Jork.- 1972. -480 p.

115. Linek V., Vacek ,V. Meagurment of fermentor aeration capacity by a fast-response oxyden electrode in medium aid dispersions //Biotechn. and Bioeng. -1979. -Vol. 21, №5. -P.907-908.

116. Lutterback A., Koll R.A., Brem G. In vitro-maturation of lovine oocytes in coculture with granulose cells and their subseguent fertilization and development //Zuchthygienc. 1987.- Vol. 22, № 4. -P. 145-150.

117. Luttmann R., Thoma M., Bocholz H., Scheiding W., Schugerl K. Growth simulation of Hansenula polymorpha. 1 Extension of oxyden cell mass balance model //Eur. J.Appl. Microbol. And Biotechnol.-1981. Vo'.13, №2. -P.90-95.

118. Margaritis A., Shappard J.D. Mixing timeand oxyden transfor characteristics of a double draft tube airlift fermenter //Biotech.and Bioeng. -1981.1. Vol.23, №9.-P.2117-2135.

119. Marqaritis A., Zajic J.E., Mixing, mass transfer, and Scale-up of polysaccharide fermentation //Biotechnol. and Bioeng. -1978.-Vol. 20, № 7. — P. 9391001.

120. Muller H., Muller F. Verfahren and Vorrichtung zum Begasen von Flussigkeiten. Пат.Швейцарии, № 634231. -1983.

121. Nagata S., Mixing : Principles and Applications.-Wiley, New Jork. -1975. -P.385-401.

122. Nesterov B.F., Vershov D.S.,Siborov E.A. Control of the multicompo-nent gaseus medium in laboratory fermentation apparatus. //In.Sth. Irt. Ferment. Sym /Berlin.-1976. -P.26-41.

123. Newcomb R., Rawson L.E.A. Investigation of physiological factors affecting non-surgical transfer //Theriogenology 1980.- Vol. 13. -P. 41-49.

124. Nienow A.W., Hilly M.D. Power drawn by multiple impellers in sparged agitated vessels //Biotechn. and Bioeng. -1979. -Vol. 21, №12. -P.2341-2345.

125. Oosterhuis N.M.G., Kossen N.W.F. Scale-up of bioreactors //Riv. Boil., -1983. -Vol.76, № 2. P. 335-346.

126. Palaeht K. MaBstalsiibertragung fur Fest-Fliissing Drehschei-benextraktoren bei Einsat zur Extraktion von Biomassen //Abh. Akad. Wiss. DDR Abt. Math, Naturwiss, Techn. 1982.- № 2. - P. 265-292.

127. Prokop A., Ludvik M. Droplet Size frequency distribution of dispersed hydrocarbon phase in fermentation Process //Microb.Engineering. 1973.- №1.-P.349-362.

128. Qnicker G., Schumpe A., Koking В., Deckwer W. Comparison of measured and calcylation oxyden solubilities in fermentation media //Biotech, and Bioeng. -1981. -Vol.23, №3. -P.635-650.

129. Ruston J.H. The use pilot plant mixing date //Chem.Eng. Progress. -1951.- №47. — P.485-500.

130. Richards J.W. Studies in aeration and agitation //Progress in Industrial microbiology.-1962. №3.-P. 143-162.

131. Robertson D.C., McCullough W.G. Glucose catabolism of Ery-sipelothrrix rhysiopatiae // Bacteriology. 1968. -Vol. 95, № 6. - P. 2112-2116.

132. Roels J., Berg J., Voneken R. The Rheology of Mycelial Broths // Biotechnology and Bioengineering. 1974. -№ 2. - P. 181-208.

133. Schumpe A., Deckwer W.D. Estimation of 02, C02 solubilities in fermentation media //Biotechn. and Bioeng. -1979.- Vol. 21, №6. -P.1075-1078.

134. Seichert L., Fenci Z., Musilkova M., Ujcova E., Machnon V., Maca K. The Scale-up of Submerged fermentation processes in filamentous microorganisms //Folia microbial. -1977.- Vol.22, № 6.- P.474-490.

135. Sitting W. Experimental lay-out of loop fermenters for large Scale bio-mass production //In. Congr. Pure and Appl. Chem. Plenary and InvL. Lect. 27th Congr. Pure Helsinki. 1979, Oxford. -1980. -P.339-349.

136. Stopped-flow //Nature. -1982. Vol. 300, №58. - P.793-812.

137. Sukovaty J. Zpucob a zarizeni na provdusnoval substratupri fermen-tace. Патент ЧССР № 163559. 1976.

138. Taguchi H. The Nature of Fermentation Fluids // In book: Advances in Biochemical Engineering, Berlin — N.Y., Springer Verlag. -1971. P. 1-29.

139. Todt., Lucke J., Schiigerl K., Renken A. Gas holdup and longitudinal dispersion in different types of multiphase reactors and their possible application for microbial processes //Chem. Eng. Sci. -1977.-Vol. 32, № 4. P. 365-375.

140. Vanderveer J.W., Malick E.A. Fermentation apparatus and method. Патент США №4224414. -1980.

141. Varder F., Lilly M.D. The measurement of oxedan transfer coefficients Vinfermentors by fruguency respome techniques //Biotech, and Bioeng. -1982. -Vol.4, №7.-P.1711-1719.

142. Vortube J., Sobotka M., Prokop A. Evaluation of aeration capacity from cultivation data files: application to Large-scale fermentation //Biotechn. and Bioeng. -1978.-Vol.20, №6. -P. 913-916.

143. Wang D.I., Cooney C.L., Deman A.Z., Dunnill P., Humphrey A.E., Lilly M.D. Fermentation and Enzyme technology N.Y.: John W. and Sons — 1979.-336p.

144. Wang W.L., Jing H.S., Lu K.H., Gorden J., Polge C. The affect of gas phase on the in vitro development of bovine embryos derived from in vitro maturation and fertilization of ovarian oocytes //Theriogenology 1992.- ' ^ol. 37. -P. 320-340.

145. Willadsen S.M., Godke R.A. A. simple procedure for the production о findentical sheep twins //The veterinary Record. 1984. -Vol. 114. -P. 240-243.

146. Wolf K.H. Beitrag zur MaBstahsubertragung Kontinuerlicher quasi-zweiphasiger fermentativer Prozesse in einem nuhrstufigen Kuhrreaktor //Abh. Akad. Wiss DDR. Abt. Math. Naturwiss. Techn. -1980.- № 3. P. 145-153.

147. Wolf K.H. Methoden de MaBstabsubertragug-ihre Moglichkeiten und Grenzen bei fermentativer Prozeassen //Abh. Akad. Wiss DDR. Abt. Math. Naturwiss, Techn. -1981. -№ 3. P. 459-469.

148. Young T.B. Fermentation Scale-up: txperience with a total environmental approach //Ann. N.Y. Acad. Sci. 1979. -№326. - P. 165-181.