Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биореакторы с мембранными устройствами газового питания для культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биореакторы с мембранными устройствами газового питания для культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

005535451

¿¿¿у?

ШАВАЛИЕВ МАРАТ ФАРИДОВИЧ

БИОРЕАКТОРЫ С МЕМБРАННЫМИ УСТРОЙСТВАМИ ГАЗОВОГО ПИТАНИЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ Басскаготусез сетех'тае

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

г 4 0КТ 2013

Казань-2013

005535451

Работа выполнена на кафедре химической кибернетики федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет» (ФГБОУ ВПО «КНИТУ»)

Научный руководитель:

кандидат технических наук, доцент, Мухачев Сергей Германович

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Бирюков Валентин Васильевич, доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой «Экологическая и промышленная биотехнология» ФГБОУ ВПО «Московский государственный машиностроительный университет (МАМИ)»

Шарифуллин Вилен Насибович, доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой «Инженерная кибернетика» ФГБОУ ВПО «Казанский государственный энергетический университет»

ФГБОУ ВПО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, г. Москва

Защита состоится 13 ноября 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.02 при ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» по адресу: 420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68 (зал заседаний Ученого совета, А-ЗЗО).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского национального исследовательского технологического университета.

Автореферат разослан « $ » 2013 :

Ученый секретарь диссертационного совета

Степанова Светлана Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Подготовка посевных материалов в асептических условиях является основой любого современного технологического процесса микробиологического синтеза. Отсутствие посторонней микрофлоры определяет качество получаемых продуктов. Другим важным условием развития теории и практики микробиологических производств является переход к непрерывным процессам. Этими обстоятельствами определяется актуальность выполненных исследований и конструкторских разработок в области биореакторов с мембранными устройствами подвода и стерилизации газового питания.

Работа выполнялась в лаборатории «Инженерные проблемы биотехнологии» Казанского государственного национального технологического университета (2006-2012г.г.). Отдельные экспериментальные работы выполнялись в рамках госбюджетной НИР 4.3947.2011 Минобразования и науки РФ (Первый этап: «Исследование гидродинамики потоков в аппаратах колонного типа с осевым и винтовым направлениями движения жидкости»), а также по гранту Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Разработка технологического регламента на выращивание чистой культуры дрожжей» (государственный контракт №8187р/7406 от 01.08.2010, исполнитель ООО «Биотехконсалтинг»).

Цель работы. Разработка и исследование альтернативных конструкций биореакторов с мембранными устройствами подвода и стерилизации газового питания, применимых для комплектации линий чистых культур факультативных анаэробов.

Задачи исследований

1. Анализ гидродинамики потока в биореакторах с мембранным устройством газового питания.

2. Определение массообменных характеристик биореакторов при различных режимах сульфитным методом и в процессе культивирования спиртовых дрожжей.

3. Определение рекомендуемых режимов эксплуатации биореактора для опытно-промышленного регламента непрерывного выращивания чистой культуры спиртовых дрожжей в строго асептических условиях.

4. Разработка исходных данных на проектирование биореактора промышленного масштаба.

Научная новизна

1. Предложены и защищены патентами РФ две конструкции биореакторов с мембранными устройствами подвода газового питания, обеспечивающие высокий уровень асептичносги процесса и отличающиеся поперечным и продольным относительно трубчатых мембран движением жидкостного потока.

2. Выявлено наличие струйного движения жидкости, предложена гидродинамическая модель потока на основе ячеечной модели и идентифицированы ее параметры.

3. Определен интервал соотношения скоростей подпитки субстратом и рециркуляции культуральной жидкости (1:10 - 1:25) для непрерывного выращивания инокулята спиртовых дрожжей (на примере ЗасИаготусез сеге\1з1ае У717).

4. На основе концепции парциальных обменов предложены альтернативные формулы расчета энергозатрат в процессе роста дрожжей и обеспеченности клеток кислородом в переходных условиях от аэробного роста к брожению.

5. В экспериментальных процессах непрерывного культивирования дрожжей показано, что при удельной поверхности трубчатых мембран 130 - 155 м2/м3 возможно получение активного инокулята с титром клеток дрожжей не ниже 350 млн.кл./мл при доле почкующихся клеток 45-55 %.

Практическая значимость работы

1. Разработанные колонные биореакторы с мембранными устройствами распределенного газового питания изготовлены в лабораторном варианте и использованы при комплектации установки для исследования процессов микробиологического синтеза, что подтверждено актом изготовителя (ООО «Биотехконсалтинг», г. Казань).

2. Разработана техническая документация в объеме рабочего проекта для организации серийного производства лабораторных биореакторов.

3. Комплекс оборудования с созданными биореакторами используется в учебном процессе и в исследованиях, проводимых в лаборатории «Инженерные проблемы биотехнологии» ФГБОУ ВПО «КНИТУ» (г. Казань).

4. Полученные результаты исследования роста дрожжей в переходных режимах использованы при разработке опытно-промышленного технологического регламента процесса выращивания чистой культуры спиртовых дрожжей (ОПР-СД-БТК-2011/1, срок действия до 30 июня 2014 г., ООО «Биотехконсалтинг»), включающего стадию выращивания дрожжей в биореакторе колонного типа с мембранным устройством подвода и стерилизации кислорода

5. Разработаны исходные данные на проектирование биореактора промышленного масштаба.

6. Предложенная конструкция биореактора отличается простотой масштабирования и отсутствием подвижных элементов, требующих расхода энергии.

Достоверность результатов исследований определяется:

1. Применением системы диспетчерского управления и сбора данных «MasterSCADA», обеспечивающей в режиме реального времени сбор информации с анализаторов и датчиков.

2. Применением современных методов анализа, приборов и анализаторов состава потоков жидкости и газа класса точности не хуже 2.

3. Ежесуточной калибровкой датчиков и анализаторов по стандартным газовым смесям и растворам первого класса точности.

4. Применением балансовых методов расчета на основе усредненных данных и дублирования основных экспериментов.

б. Применением статистических методов обработки результатов, проверкой на воспроизводимость и отсутствием противоречий с теми сведениями, которые ранее были известны.

Личный вклад актора. В диссертации обобщены результаты конструкторских разработок и экспериментальных работ, в которых автор принимал непосредственное участие. Личный вклад автора заключается: в проектировании лабораторных биореакторов, в том числе в разработке конструкторской документации и проведении технических и биотехнологических испытаний биореакторов двух конструкций; в разработке предложений по патентованию конструкций биореакторов; в комплексировании технических средств исследовательского комплекса, позволяющего исследовать режимы работы биореакторов; в разработке алгоритмов управления процессами и в проведении экспериментальных процессов получения инокулятов спиртовых дрожжей; в разработке ряда разделов опытно-промышленного регламента на выращивание инокулята спиртовых дрожжей в непрерывном режиме; в обсуждении и представлении результатов работы на конференциях, а также в подготовке их к публикации. Соавторы не возражают против использования результатов исследований в материалах диссертации.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались на VIII, XI и XII Международных конференциях молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2007, 2010, 2011 г.г.), Международной конференции «Международное сотрудничество и развитие биотехнологий в Кировской области» (Киров, 2008 г.), Второй всероссийской студенческой научно-технической конференции «Интенсификация тепло-массообменных процессов, промышленная безопасность и экология» (Казань, 2008 г.), Научно-практической конференции «Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию» (Казань, 2009 г.), XIII Международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Полимеры: Синтез исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений» - V Кирпичниховские чтения (Казань, 2009 г.), Республиканской школе студентов и аспирантов «Жить в XXI веке» (Казань 2009 г.), Международной конференции «Катализ для переработки возобновляемого сырья: топливо, энергия, химические продукты» (Новосибирск, 2010 г.), У-У1 Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2010-2011 г.г.), на ежегодных научно-технических конференциях ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» (2006-2013 г.г.).

Публикации. Материалы диссертационной работы изложены в 20 публикациях, в том числе в 6-ти статьях в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК, 3-х отчетах о НИОКР, 2-х описаниях патентов и 9-ти тезисах докладов на всероссийских и международных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, списка сокращений и условных обозначений, списка использованной литературы и двух приложений. Материал изложен на 144 страницах текста и содержит 47 таблиц и 48 рисунков. Список литературы включает 123 источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введения изложены общие сведения о решаемых в работе научно-технических задачах, обоснована необходимость и показана актуальность разработки новых конструкций биорсакторов непрерывного действия для линии выращивания чистых культур спиртовых дрожжей и исследования режимов наработки инокулятов.

В первой главе представлен обзор научных публикаций, посвященных принципам беспузырькового ввода кислорода в хультуральные жидкости с использованием мембранных устройств, методам расчета параметров процессов массопереноса кислорода в аппаратах с мембранными устройствами газового питания, методам расчета материальных балансов процессов микробного роста в переменных условиях культивирования.

Показано, что одной из наиболее актуальных и требующих решения проблем в области асептического выращивания инокулятов в непрерывных режимах, является совершенствование конструкции биореакторов. Вследствие отсутствия подвижного встроенного оборудования рабочая зона колонного биореактора может быть предельно заполнена мембранными элементами. Таким образом, удельная поверхность мембраны в 2 -3 раза превышает величину, достигаемую в известных аппаратах перемешивания, оснащенных мембранными устройствами подвода газового питания, например, модификации биореахгоров фирмы «Biotron» (Южная Корея) - Value Bio Reactor, фирмы «B.Braun» - лабораторный биореактор «Biostaí В», разработанных в 2006-2008 г.г. Рациональное размещение патрубков крепления трубчатых мембран позволило увеличить удельную поверхность мембран с 90 м2/м3 до 155 м2/м3. Рассмотрены два варианта конструкции мембранного блока, отличающиеся продольным (вдоль оси мембран) и поперечным движением жидкостного потока. Технические испытания этих конструкций показали, что величина сульфитного числа не зависит от направления потока относительно оси мембран в широком диапазоне скоростей движения жидкости, а определяется лишь величиной удельной поверхности и перепадом давления на мембране.

Для выполнения балансовых расчетов выбран метод парциальных обменов Минкевича-Ерошина с построением уравнений связи метаболических скоростей на основе стехиометрических инвариантов, записанных в дифференциальной форме.

Во второй главе представлено описание двух разработанных конструкций биореакторов колонного типа (рис. 1, табл. 1) и результаты их технических испытаний.

Первый биореактор (аппарат А) характеризуется осевым движением жидкостного потока сверху вниз или в обратном направлении вдоль оси аппарата и осей трубчатых мембран. Второй биореактор (аппарат Б) характеризуется винтовым движением потока перпендикулярно оси трубчатых мембран. Вид дифференциальной функции распределения времени пребывания потока в аппарате А (рис. 2) свидетельствует о возникновении струй вследствие трения жидхости о наружные и внутренние поверхности элементов конструкции аппарата. Одной из таких поверхностей служит внутренняя поверхность обечаек, а вторая образована встроенными пучками трубчатых мембран (аппарат А) или теплообменным устройством (аппарат Б).

Рисунок 1 - Общий вид аппаратов: тип А - с осевым движением потока, прототип аппарата для патента РФ № 2415913 тип Б - с винтовым движением потока, патент РФ, № 2446205

Таблица 1 - Основные характеристики биореакторов

Аппарат Геометрический объем, л Рабочий объем, л Удельная поверхность мембран, 2/3 м /м Максимальное абс. давление в полости мембран, МПа

А 1,406 1,169 155 0,35

Б 7,776 4,702 135 0,45

Рисунок 2 - Вид дифференциальной функции распределения времени пребывания частиц потока в аппарате А при различном вводе трассирующего вещества

Гидродинамические испытания показали, что при соответствующих скоростях потоков и конструктивных параметрах аппаратов, характеристики движения возникающих струй сближаются.

При моделировании гидродинамики потоков в исследуемых аппаратах необходимо учитывать особенности ввода и отвода жидкости: объемы и геометрию входных и выходных полостей, которые при использовании ячеечной модели представляются отдельными ячейками. Собственно гидродинамику струй также можно описать ячеечными моделями, эквивалентными однопараметрическим диффузионным моделям. Однако при описании всего процесса в целом необходимо учитывать условность разбиения потока на струи, т.е. учесть

диффузию вещества между контактирующими струями (рис. 3). Такой подход приводит к модели вида:

VI

Свх

Vra

Н V2

Vil Vи Г-'i,,

Vrl

Í21 I-2Í Vln

Ос

Vk

Рисунок 3 - Моделирование структуры потоков в биореакторе на основе ячеечной модели

Обозначим среднюю концентрацию трассера в объемах ячеек V¡¡ и Уц соответственно с» и C2¡, /' = (l, п ). Принимаем расход на выходе равным расходу на входе vt=vBX.

Введем величину yr. v\ = у ■ v„x. Тогда vi = v,x - V] = vBX-(l- у/). Эта величина пропорциональна сечению потока на входе в ячейку 11 и обратно пропорциональна гидравлическому сопротивлению, которое упрощенно можно представить средним количеством трубчатых мембран, расположенных в пределах ячейки данного ряда. Однако, численное значение у/ неизвестно и требуется его определение. Учитывая геометрию входной камеры и наличие байпаса, возникающего вследствие неравномерности перемешивания жидкости и ее частичного проскока в указанной камере, введем коэффициент байпассирования 1- Введем величину коэффициента эффективной диффузии в радиальном направлении (Z>,): vn = Dr { сц - си), i = (1, п). Таким образом, имеем четыре параметра, подлежащих идентификации: у/, п, (, Dr.

Для решения задачи идентификации запишем модель гидродинамики, соответствующую структуре потоков, представленных на рисунке 3, в виде следующей системы уравнений: de

У° di 6 V" С"

К-

di

-- G ■vr c0 - v, • с,, + Dr - (c2, - с,,);

V»-^P- = £ • v2 -c0 -v2 -c21 + Dr (c21 -cn);

dt dCv dt dc„

:V1 '«Vi -v, -C1( +D, -(c2l -c„) , i = (2, n);

~ = ^'Сьч -V, -с* -О, -(с» ~си) , / = (2, п); .. <1ск

Начальные условия: с„ (I = 0) = та /\\, с„ (/ = 0) = с» (/ = 0) = с, (Г = 0) = 0, где т„ - масса трассера, вводимая во входной поток.

Параметрическая идентификация модели гидродинамики потока в биореакторе выполнялась с использованием программного пакета Ма1ЬАВ. В качестве критерия

идентификации взята сумма квадратов отклонений экспериментальных и расчетных значений концентрации трассера (ЫаС1). При экспериментальных исследованиях концентрация трассера определялась кондуктометрическим методом (кондуктометр АТТ-5703). Результаты идентификации параметров модели гидродинамики для аппарата Б представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 3 - Оценка расхождения экспериментальных и расчетных значений Ск

Таблица 2 - Идентифицированные параметры гидродинамической модели

Всего ячеек 122

Доля 1 потока от общего расхода жидкости 0,52

Коэффициент эффективной диффузии 0,055

Коэффициент байпассирования 0,2

Показатель Эксперимент Расчет Отклонение,%

Дисперсия 0,1119 0,1154 3,08

Среднее время пребывания, сек 4117 4236 2,92

Исследование массообмена кислорода в биореакгорах на сульфитной модели показало нелинейную зависимость скорости массопереноса кислорода от перепада парциального давления кислорода на мембране (рис. 4). Отклонение от линейности связано с деформацией мембраны при подаче кислорода под давлением. При наружном диаметре трубчатой мембраны 4 мм и толщине стенки 1 мм предельное давление, при котором не достигается предел упругости полидиметилсилоксановой мембраны составляет 0,25 МПа и 0,35 МПа в

Зависимости сульфитного числа от изменения расхода рециркулируемого потока в диапазоне 330 - 1260 мл/час при испытании аппарата А не наблюдалось. Т.е. сульфит связывает кислород вблизи поверхности мембраны и гидродинамические условия потока при этом не влияют на интенсивность процесса массопереноса в модельных условиях. Аналогичная зависимость получена для аппарата Б. При этом транспорт кислорода через мембраны при атмосферном давлении в полости мембран составляет примерно 0,18 г/л-час.

В третье главе приведены результаты биотехнологических испытаний биореакторов с мембранным устройством кислородного питания. В качестве тестовой культуры были взяты спиртовые дрожжи ЗассИаготусе* сеге^ае У717, как представляющие практическую значимость и как культура, являющаяся факультативно анаэробной, т.е. способной переключать метаболизм при вариации соотношения кислородного и углеводного питания. Выбор питательной среды был осуществлен исходя из требования надежности расчета материального баланса. Поэтому использовались синтетические среды, основанные на соотношении компонентов минерального питания, близком к среде Ридер. Схема

случае наличия опорных элементов.

» 1 - — — --О.у- V и * —> / /— -

1 -С • .5 0 <3 « ,5 1 1 Л • — — 2 2 Д 3 «

Рисунок 4 - Зависимость скорости массопередачи кислорода от перепада парциального давления на мембране

технологической обвязки биореакторов при проведении биотехнологических испытаний представлена на рисунке 5.

Процесс выращивания инокулята в аппарате А осуществлялся в две стадии с рециркуляцией потока: 1) периодический процесс до завершения срабатывания глюкозы и 2) процесс с непрерывной подачей подпиточной среды. Концентрация глюкозы в «подушке» составляла 2 - 3 %, а в подпиточной среде 4 - 6 %. Динамика накопления биомассы и потребления глюкозы в периодическом процессе имеет классический вид. При этом удельная скорость роста меняется в пределах 0,25 - 0,12 ч"1. Поэтому, с целью исключения вымывания культуры, реализация непрерывных процессов была осуществлена при удельной скорости подачи подпиточной среды 0,06 - 0,1 ч'1. Данные экспериментальных замеров параметров процессов представлены в таблицах 4-5. Подача кислорода осуществлялась из периодически заполняемого ресивера В/ (рис. 5).

Р1 - Биореактор;

Н\-Нь - Перистальтические

насосы;

£|-£з — Емкости; Т\ - Термостат; У| -Измерительная ячейка; У2 - Ячейка для разделения газожндкостното потока; В\ - Ресивер;

/-; - Баллон с техническим кислородом.

Рисунок 5 - Технологическая схема установки выращивания инокулята

Динамика давления в ресивере показана на рисунке 6. Амплитуда колебания задается как один из параметров регулятора. В данном процессе она составляла ±0,002 МП а. Аналогично выглядит график колебания рН. С целью равномерного ввода титранта, последний вводился через три капилляра в три равноудаленные точки по высоте колонного биореактора. Амплитуда колебаний рН культуральной жидкости на выходе рециркуляционного контура составляла ± 0,025 ед. рН. На каждом интервале времени (Дт, рис. 6) в течение всего процесса осуществлялся расчет скорости массопередачи кислорода (табл. 4).

Объем кислорода в начальный 0) и конечный (¡+1) моменты времени для каждого интервала (Дт, рис. 6) рассчитывался по данным давления и температуры газа, исходя из постоянного объема газовой полости, образованной ресивером и

трубчатыми мембранами. Изменением объема мембранного блока при малой амплитуде колебания давления пренебрегали. Расход кислорода вычислялся исходя из мольного объема идеального газа и молекулярной массы кислорода.

Таблица 4 - Расчет расхода кислорода

Изб. давление Температура Время процесса Интервал времени Объем кислорода Подача кислорода Уо2

Вар "С час мин сек час нл г/час

Т| 1,0619 27,18 21 14 54,59 0,7455 1,0527 0,0717

1,0233 26,93 21 59 38,37 1,0153

Полученные таким образом для каждого интервала (Дт, рис 6) величины скоростей ввода кислорода усреднялись на отрезке времени Д1, в течение которого не менялись уставки регуляторов давления, рН, расход среды. Замеры пятикратно дублировались с шагом 1 час и усреднялись. Данные расчета по первому участку продолжительностью 5 часов приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Основные измеряемые параметры в процессе выращивании инокулята

№ п/п Оптич. плотн. РВ Поток на выходе Объем по ГСБ Температура газа на выходе Концентрация Огвык

ед.экст. % масс. г/ч л "С % объемн.

1 0,757 1,72 102,84 0,34 27,0 0,480

2 0,757 1,75 119,32 1,23 27,0 0,448

3 0,655 1,65 93,11 2,26 27,0 0,457

4 0,775 1,67 128,76 3,33 27,0 0,363

5 0,772 1,70 110,10 4,6 27,0 0,392

Средн. 0,7432 1,70 110,83 1'Г, =0,852 л/ч 27,0 0,428

Оптическая плотность культуральной жидкости измерялась при длине волны 590 нм. Расчет концентрации биомассы по данным измерения оптической плотности осуществлялся по эмпирической формуле: х = 8,36 (ОП - 0,08), полученной на основе определения концентрации отмытой сухой биомассы весовым методом. Здесь 0,08 - средняя оптическая плотность фильтрата культуральной жидкости.

Проток среды на входе в биореактор корректировался по данным тарировки насоса-дозатора в начале и в конце процесса. В промежуточных точках проток определялся на основании линейной интерполяции Например, для режима, данные которого представлены в

Рисунок 6 - Динамика давления кислорода в ресивере при выводе процесса на заданный режим

таблице 5, он был равен 0,115 л/ч или 0,1095 г/ч. Поток на выходе измерялся весовым методом и пересчитывался в объемный расход с учетом средней плотности культуральной жидкости. Часовой расход газа уо на выходе биореактора определялся по разности показаний газового барабанного счетчика (ГСБ РГ7000) и длительности интервала, и при последующих расчетах приводился к нормальным условиям (уо°)- По усредненным данным таблицы 5 рассчитывался унос кислорода с выходным газовым потоком: Яо1=32-Уо0Соаых/(100-22,4), г/ч.

При последующем расчете мольной скорости синтеза биомассы использовано понягае «биомоля», введенного В.Н.Ивановым и Е.И.Стабниквой, - условного моля в расчете на 1 атом углерода (для сахаромицетов — СН1,7з^о,и50о,454; Мх= 25,94). Моль субстрата также рассчитывался в расчете на 1 атом углерода.

Расчет мольных метаболических скоростей осуществлялся следующим образом: скорость роста биомассы Ях = .х-п/С^-Мх), исходя из средней концентрации биомассы в отбираемом потоке культуральной жидкости, объема жидкости в аппарате (незначительным изменением объема жидкости вследствие деформации трубчатых мембран пренебрегали), и массы биомоля 25,94 г/моль; скорость потребления субстрата Лб, по разности концентраций и расходов жидкостного потока на входе и выходе реактора и массе моля субстрата, приведенной к одному атому углерода, скорость потребления кислорода Дог = (Уо2 -По2)/(32 Уь) (перерасчет усредненного расхода в моль/час), скорость продуцирования углекислого газа на выходе, исходя из общего расхода газа и концентрации десорбировавшегося кислорода в выходном газовом потоке: Дсо2= [уо°-(1 - Оат/Ю0) -0,05Ко3]/(22,4-УО.

Полученные таким образом значения усредненных показателей для трех участков процесса представлены в таблице 6. Строка 1 данной таблицы построена на основании обработки данных, приведенных в таблице 5. Данные строк 1-2 таблицы 6 относятся к первым и вторым суткам ведения процесса, а данные строк 3 и 4 - к третьим суткам. Расчет выполнен для средней концентрации РВ на выходе из аппарата 1,0-1,02 % масс.

Таблица 6 - Показатели процесса при выводе на стационарный режим работы аппарата А

№ ufa D X РВ вх. Ях Rs Rq2 Rcca Продуктивность

г/л % масс. мыоль/л'ч ммоль/л"ч ммоль/л'Ч ммоль/л'ч гАСБ/лч

1 0,109 5,54 4,82 23,29 163,79 1,42 35,66 0,604

2 0,100 6,41 5,46 24,64 171,96 2,31 49,51 0,639

3 0,095 7,02 5,54 25.67 169,04 2,36 39,57 0,666

4 0,100 6,97 5,46 26,81 176,98 2,18 59,79 0,696

Стехиометрия процесса представлялась следующими парциальными обменами веществ, суммируемыми с весовыми коэффициентами у, 1-у, 1/ Fe:

Дыхание: (1/6) СН20+ (1/6)02 + ADF — (1/6) С02 + (1/6) Н20 + ATF. (у)

Брожение: 3 СН20 + ADF -» 2 СН3О0,5 + С02 + ATF. (1-у) Пластический обмен: 1,0668 СН20 + 0,185 NH3 + FE ATF -»

CHI,73NO.I,50O,454 + 0,0668 C02 + 0,4793 H20 + FE ADF, (1/FE)

где у - доля популяции, обеспеченная кислородом;

РЕ - суммарные энергозатраты, отнесенные на вновь синтезируемую биомассу, мольАТФ/мольАСБ.

Экспериментально определенные величины четырех метаболических скоростей позволяют построить три алгоритма расчета РЕ через расходные коэффициенты (табл. 7, продолжающая табл. 6): РЕ1=^5/х+17Уо/х-1,0668)/3; РЕ2=Ус/х+5Уо/х-0,0668; РЕз = [(ЯО+5)(У5/х-1,0668)+17'0,0668]/[3'(КО^5)-17].

Таблица 7 - Стехиометрические показатели процесса выращивания инокулята

№ У5/Х | Ус/х | Уо/х Ре, 1 РЕ2 1 Ри 1 рЕтдн У1 У2 Уз Успели.

моль/моль АСБ моль АТФ/моль АСБ - " - "

1 7,03 1,53 0,06 2,33 1,77 2,46 2,19 0,16 0,21 0,22 0,20

2 6,98 2,01 0,09 2,50 2,41 2,53 2,48 0,23 0,23 0,24 0,23

3 6,58 1,54 0,09 2,36 1,93 2,51 2,27 0,23 0,29 0,30 0,27

4 6,60 2,23 0,08 2,30 2,57 2,25 2,37 0,21 0,19 0,19 0,20

Поскольку технологические режимы близки по своим характеристикам и усредненные значения величины РЕ не коррелируют с величиной удельной скорости протока, данные определения величины РЕ могут быть усреднены по всем режимам: Рео6щ. = 2,33 моль АТФ/моль АСБ, средне-квадратичное отклонение ± 0,25 моль АТФ/моль АСБ.

Величину обеспеченности клеток кислородом (у) также определяли по альтернативным формулам:

у, = (6/17)[3-(Уз/х-1,0668УРе1], у2= (6/5)-[1-(Ус/х-0,0668У РЕ2],

__20,796_

У' ~ 4,267 • (Я0 + 5) - 0,267 • (17 + )

Учитывая коррекцию потока при переходе к режиму 4 (табл. 6, табл. 7) можно полагать наличие зависимости обеспеченности клеток кислородом от соотношения потоков

субстрата и кислорода.

Обоснованность полученных результатов подтверждается данными о реализуемости идентичного процесса при изменении рабочего объема аппарата. Результаты переходного процесса выращивания инокулята в аппарате Б рабочего объема 4,7 л представлены в таблицах 8- 11.

Таблица 8 - Общие исходные данные процесса культивирования дрожжей (переходный режим, 3 интервала)

>6 п/п Начало/Окончание временного интервала усреднения данных П. Ут V« РВ„ РВ„ Пиз

л л мм.рт.ст л/час % масс. % масс. л/час

1 8 ч 48 и 9ч 15м 4,7 1,09 756 0,278 8 0,011 0,136

2 10 ч 40 м 11 ч 13 м 4,7 1,09 756 0,304 8 0,011 0,036

3 39 ч 33 м 45 ч 36 м 4,7 1,09 752 0,361 15 0,34 0,008

Таблица 9 - Параметры переходного режима

Интервал О ОП X Т УОвых УОвих со2^

г/час час"1 СД.ЭКСТ. гАСБ/л "С Л/ч нл/ч %о5.

1 418,85 0,132 0,397 2,646 25,35 7,960 7,284 97,25

2 344,25 0,108 0,504 3,545 25,10 8,790 8,050 95,75

3 371,279 0,078 1,129 8,766 25,73 15,488 14,155 83,15

Таблица 10 - Метаболические скорости в переходном режиме выращивания инокулята спиртовых дрожжей

Интервал ввх Р Кх Ксог

% гАСБ/л-ч нл/л-ч ммоль/л'ч ммоль/л'ч ммоль/л'ч

1 3,583 0,349 7,284 13,470 157,246 67,285

2 4,770 0,394 8,050 14,821 172,085 73,217

3 14,851 0,680 14,155 26,203 375,105 111,789

Таблица 11 - Стехиометрические показатели переходного режима выращивания культуры спиртовых дрожжей

Интервал Уэ/х | Ус/х РЕ

моль/моль моль АТФ/моль АСБ

1 11,674 4,995 15,374

2 11,611 4,940 15,063

3 14,315 4,266 2,574

1.4

«

1

5 О.в

3 ¿0.6 о

0,4 0.2 0

лвОООО* о

00»00' И)МС11С>1Нс протока 1

_...........у ......_........

-ро"»^

ч- | Включение протока |

20.0 30,0

Время, час

Рисунок 9 - Динамика оптической плотности культуральной жидкости в переходном режиме

По мере приближения к стационару, общие затраты энергии быстро снижаются (табл. 11), а концентрация биомассы при удельной скорости протока 0,078 час"1 достигает к 40-му часу процесса 10 гАСБ/л (рис. 9). В стационарных режимах вне зависимости от объема аппарата и конструкции мембранного устройства газового питания различия

в энергетических параметрах не наблюдается (табл. 7 и табл. 11). При этом суммарный удельный расход энергии на цели поддержания жизнедеятельности и рост в расчете на единичное количество вновь синтезируемой биомассы зависит, в первую очередь от соотношения потоков субстрата и кислорода, поглощаемых биомассой.

Таким образом, стационарный процесс воспроизводим. Точность определения показателей достаточна для выполнения технологических расчетов. Величина обеспеченности кислородом при применении мембранных устройств исследуемых конструкций достаточна для получения инокулятов с концентрацией биомассы более, чем в

3 раза превышающей плотность инокулятов, выращиваемых в анаэробных условиях, реализуемых на предприятиях спиртовой промышленности (титры 350-450 млн.кл./мл и 100-120 млн.кл./мл соответственно). Плотность популяции и асептичность процессов контролировались путем микроскопирования с дискретностью 3 часа. Использован биологический микроскоп Альтами БИО-1. Например, для стационарного участка процесса выращивания дрожжей в аппаратах А и Б данные оптического микроскопирования с использованием камеры Горяева при увеличении 900х и двадцатикратном разбавлении культуральной жидкости представлены на рисунках 10а и 106 соответственно.

Рисунок 10 - Цифровая фотография популяции дрожжевых клеток в биореакторах: тип А - титр 375 млн.кл./мл (а); тип Б - титр 480 млн.кл./мл (б)

В четвертой главе представлено описание рекомендуемых режимов ведения процесса выращивания спиртовых дрожжей и обоснованы исходные данные на проектирование промышленного биореактора.

Исходя из средней величины удельной скорости роста в начальный период процесса 0,12 ч"1 и 0,1 ч"1 в период доращивания культуры, предложен режим работы трехсеющонного биореактора объемом около 200 л (табл. 8).

Общая продолжительность процесса составляет 6 суток. Это время рекомендовано исходя из практики асептических операций по стерилизации питательных сред в промышленных условиях.

Режим выращивания

инокулята может

корректироваться исходя из состава сырья, используемого для приготовления сред. Например, в предложенном технологическом регламенте выращивания дрожжей на гидролизатах соломы и отрубей продолжительность пускового процесса увеличивается на 20 - 25%.

При конструировании промышленного биореактора необходимо прежде всего обеспечить простоту его эксплуатации и величину удельной поверхности мембраны не менее 180 - 200 м2/м3. Увеличение поверхности мембран требует использования трубок с наружным диаметром не более 3 мм и толщиной стенки 0,6 - 0,7 мм. При этом будет

Таблица 8 - Режим работы трехсекционного биореактора

Технологический показатель Значение

Концентрация РВ в «подушке» 2,4 - 2,5 % масс

Объем исходной среды 175 - 185 л

Концентрация РВ после засева 2,3 - 2,4 % масс

Начальная концентрация биомассы 0,17-0,2 гАСБ/л

Период выращивания в периодическом режиме 28 - 29 ч

Выгрузка двух секций в дрожжегенератор 120 л

Распределение КЖ из третьей секции по всем трем секциям по 18-22 л

Долив подпиточной среды 118- 122 л

Концентрация РВ в подпиточной среде 15 % масс.

Расход подпиточной среды 5-15 л/час

Регулирование подачи подпиточной среды По датчику рОг

Общая длительность пускового периода 38-42ч

Расход подпиточной среды в непрерывном режиме 17- 19 л/ч

Продолжительность непрерывного режима Не более 4 суток

обеспечена возможность повышения избыточного давления кислорода до 0,4 МПа, а скорость массопереноса кислорода возрастет в 1,5 раза.

Технические характеристики проектируемого биореактора промышленного масштаба:

1. Объем секции биореактора - 65 л.

2. Диаметр секции - 200 мм.

3. Длина секции-2100 мм.

4. Количество секций - 3.

5. Способ крепления трубчатых мембран — навивка на равномерно устанавливаемые по окружности аппарата планки с пазами.

6. Число рядов планок, размещаемых на концентрических окружностях - 27.

7. Термостабилизация секций аппарата - за счет рубашек.

8. Термостабилизация ресиверов кислорода достигается за счет их установки внутри корпусов секций по центру вдоль вертикальных осей секций аппарата.

9. Расположение секций аппарата - вертикальное.

10. Блоки ввода распределенного кислородного питания - съемные (извлекаются вместе с крышками секций).

11. Основной конструкционный материал - сталь 12Х18Н10Т.

Конструкция такого аппарата является универсальной и позволяет устанавливать мембраны из любых материалов, в том числе нанопористых. Это расширяет возможности технологического использования биореакторов - обеспечивает распределенный ввод не только газообразных, но и жидких компонентов, что позволит снизить скорость рециркуляции жидкости и удельные энергозатраты.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ II ВЫВОДЫ

1. Разработана конструкторская документация, изготовлены и исследованы новые конструкции колонных биореакторов с мембранными устройствами стерилизации и беспузырькового подвода газового питания. Конструкции защищены патентами РФ.

2. Предельная скорость массопереноса кислорода на сульфитной модели составила 1,5 г/л-час, что достаточно для выращивания инокулята факультативно анаэробных микроорганизмов с титром не ниже 350 млн.кл./мл. Определены причины нелинейности зависимости скорости массопереноса кислорода от перепада давления на мембране.

3. Показано, что движение потока в исследованных биореакторах имеет струйный характер и разработана модель гидродинамики для сплошной жидкой фазы.

4. Предложен алгоритм управления газовым питанием биореактора.

5. На основе концепции парциальных обменов предложен алгоритм расчета стехиометрии микробного роста, позволяющий анализировать процесс в переходных условиях от аэробного роста к брожению. Предложены альтернативные формулы расчета обеспеченности клеток кислородом и энергозатрат в процессе роста дрожжей.

6. Обоснованы исходные данные на проектирование биореактора промышленного масштаба с учетом закономерностей движения потоков в колонном аппарате с мембранным

устройством газового шпания. Основным параметром, определяющим возможность масштабирования биореактора, является величина удельной поверхности мембраны.

7. Создан биотехнологический комплекс (технологическая линия), включающий биореакторы разработанных конструкций, используемый в образовательном процессе и

научных исследованиях.

Основное содержание диссертационной работы изложено в публикациях: а) в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Мухачев, С. Г. Биотехнологический комплекс учебной лаборатории энерго- и ресурсосбережения [Текст] / С. Г. Мухачев, В. М. Емельянов, М. Ф. Шавалиев, Р. Т. Елчуев, Р. Т. Валеева, Р. М. Нуртдинов, А. М. Буйлин // Вестник Казанского технологического

университета. - 2009. - №6. - С. 241-244.

2. Нуртдинов, Р. М. Разработка биотехнологического комплекса переработки растительного сырья и отходов сельскохозяйственного производства [Текст] / Р. М. Нуртдинов, С. Г. Мухачев, Р. Т. Валеева, В. М. Емельянов, М. Ф. Шавалиев, И. В. Шагивалеев, И. А. Якушев // Вестник Казанского технологического университета. - 2011. -№2.-С. 143-147.

3. Шавалиев, М. Ф. Применение инокулягора с мембранным устройством подвода газового питания для повышения асептики спиртовых производств [Текст] / М. Ф. Шавалиев, С. Г. Мухачев, Р. Т. Валеева, В. М. Емельянов // Вестник Казанского технологического

университета. — 2011. - №5. — С. 147-149.

4. Шавалиев, М. Ф. Оценка параметров процесса культивирования дрожжей в инокуляторе с мембранным устройством подвода газового питания [Текст] / М. Ф. Шавалиев, С. Г. Мухачев, Р. Т. Валеева, Д. С. Виноградов, В.М. Емельянов // Вестник Казанского технологического университета. - 2011. - №5. - С. 150-153.

5. Мухачев, С. Г. Техническое и методическое обеспечение образовательного процесса на базе лаборатории «Инженерные проблемы биотехнологии» [Текст] / С. Г. Мухачев, Р. Т. Валеева, М. Ф. Шавалиев // Вестник Казанского технологического

университета.-2012.-№11.-С. 135-136.

6. Шавалиев, М. Ф. Гидродинамика инокулягора со спиральным движением потока [Текст] / М. Ф. Шавалиев, Э. Д. Латыпов // Вестник Казанского технологического университета.-2012.-№18.-С. 64-65.

б) в научно-технических отчетах о НИР:

7. Разработка инокулятора вытеснения с мембранным устройством стерилизации кислорода [Текст]: отчет о НИР (заключ.): гос. контракт № 4236р/6589 от 26.06.2006 / ООО «Биотехпродукция» ; рук: В. М. Емельянов; исполн.: С. Г. Мухачев, В. В. Сигнов, Б. В. Кузнецов, М. Ф. Шавалиев, - Казань, 2007. - 50 с. - № ГР 01200610996.

8. Разработка технологического регламента на выращивание чистой культуры дрожжей [Текст] : отчет о НИР (заключ.) : гос. контракт №8187р/7406 от 01.08.2010 ; инв. № 4.4/2010 / ООО «Биотехпродукция»; рук: С. Г. Мухачев; исполн.: С. Г. Мухачев, Р. Т.

Валеева, М. Ф. Шавалиев, С. А. Понкратова, А. С. Понкратов. - Казань, 2011. - 68 с. - № ГР 01201061195.

9. Исследование непрерывного процесса получения биоэтанола 1-го и 2-го поколения в биореакторе вытеснения. Этап 1. Исследование гидродинамики потоков в аппаратах колонного типа с осевым и винтовым направлениями движения жидкости [Текст] : отчет о НИР (промежуточ.) : №35.12 / ФГБОУ ВПО «КНИТУ» ; рук: Емельянов В. М. ; исполн.: Мухачев С.Г., Шавалиев М.Ф., Латыпов Э.Д. - Казань, 2013. -27 с. - № ГР 01201252916.

В описаниях патентов:

10. Пат. 2415913 Российская Федерация, МПК С 12 М 1/04. Биореактор вытеснения с мембранным устройством подвода и стерилизации газового питания [Текст] / Емельянов В.М., Мухачев С.Г., Шавалиев М.Ф., Яруллин P.C., Якушев И.А., Аблаев А.Р., Владимирова И.С. ; заявитель и патентообладатель ООО «Биотехконсалтинг». - № 2009139720/13 ; заявл. 27.10.09; опубл. 10.04.2011, Бюл. № 10.-7 с.: ил.

11. Пат. 244620S Российская Федерация, МПК С12 М 1/04. Биореактор вытеснения с мембранным устройством подвода газового питания [Текст] / Мухачев С.Г., Емельянов В.М., Шавалиев М.Ф., Владимирова И.С., Аблаев А.Р., Нуруллина E.H. ; заявитель и патентообладатель ООО «Биотехконсалтинг». - 2010144464/10, заявл. 29.10.10 ; опубл. 27.03.12, Бюл. № 9. - 8 с.: ил.

б) в прочих публикациях по теме диссертационного исследования:

12. Кузнецов, Б.В. Разработка гибкого пилотного биотехнологического комплекса для центра высоких технологий / Б. В. Кузнецов, М. Ф. Шавалиев, С. Г. Мухачев, В. В. Ситнов / Пищевые технологии: докл. VIII Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием. - Казань: Отечество, 2007, - с. 233.

13. Мухачев, С.Г. Архитектура и основные технические решения лабораторных и опытно-промышленных комплексов для биотехнологических исследований / С. Г. Мухачев, Р. С. Яруллин, В. М. Емельянов, Ю. А. Сеченков, Б. В. Кузнецов, Р. Т. Елчуев, М. Ф. Шавалиев / Международное сотрудничество и развитие биотехнологий в Кировской области: сборник докладов международной конференции. - Киров. 2008. - с. 22-32.

14. Шавалиев, М. Ф. Лабораторный реактор вытеснения с мембранным устройством стерилизации кислорода / М. Ф. Шавалиев, С. Г. Мухачев / Интенсификация тепло -массообменных процессов, промышленная безопасность и экология: докл. II Всероссийской студенческой научно - технической конференции. - Казань: Бутлеровское наследие, 2008. -с. 45-48.

15. Мухачев, С. Г. Разработка биотехнологического комплекса для научно-учебной лаборатории энерго- и ресурсосбережения / С. Г. Мухачев, М. Ф. Шавалиев, Р. Т. Елчуев, Р. М. Нуртдинов, А. М. Буйлин, А. А. Степанова, Б. В. Кузнецов, Р. Т. Валеева / Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию: материалы науч. - практ. конф. - Казань: ТГГПУ. 2009. - с. 248-253.

16. Курбангалиев, Р. И. Варианты организации потоков в колонном биореакторе с устройством подвода газового питания на основе непористых полимерных мембран / Р. И.

Курбангалиев, М. Ф. Шавалиев, С. Г. Мухачев, Д. С. Виноградов // Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений - V Кирпичниковские чтения: тезисы докладов XIII Международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов. - Казань. 2009. - с. 346.

17. Шавалиев, М. Ф. Автоматизация инокулятора с мембранным устройством подвода кислорода / М. Ф. Шавалиев, Д. С. Виноградов, С. Г. Мухачев / Республиканская школа студентов и аспирантов "Жить в XXI веке": сб. материалов научно-исследовательских работ студентов и аспирантов. - Казань: Изд-во Казан, гос. технол. ун-та, 2009. - с. 276-277.

18. Шавалиев, М. Ф. Аппаратурное оснащение исследовательских работ в области совершенствования процессов комплексной переработки сельскохозяйственного сырья и отходов / М. Ф. Шавалиев, Д. С. Виноградов, Р. М. Нуртдинов, С. Г. Мухачев, В. М. Емельянов, Р. Т. Валеева / Биотехнология: экология крупных городов: материалы Московской международной научно-практической' конференции (Москва, 15-17 марта 2010 г.). - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. 2010. - с. 252253.

19. Шеремук, М. А. Мембранный инокулятор со спиральным каналом для аэробного культивирования дрожжей / М. А. Шеремук, М. Ф. Шавалиев, С. Г. Мухачев, А. М. Буйлин / Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы VI Московского международного конгресса, часть 1 (Москва, 21-25 марта 2011 г.). - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. 2011. - с. 373

20. Латыпов, Э. Д. Гидродинамика колонного инокулятора с мембранным устройством газового питания / Э. Д. Латыпов, М. Ф. Шавалиев // Пищевые технологии и биотехнологии: сборник тезисов докл. XII Международной конференции молодых ученых. - Казань: Издательство «Отечество». 2012. - с. 174-175.

_Заказ____Тираж__

ИЗДАТЕЛЬСТВО КАЗАНСКОГО НАЦИОНАЛЬНОГО

ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Офсетная лаборатория Казанского национального исследовательского технологического университета. 420015, Казань, К. Маркса, 68

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Шавалиев, Марат Фаридович, Казань

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАЗАНСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ШАВАЛИЕВ МАРАТ ФАРИДОВИЧ

БИОРЕАКТОРЫ С МЕМБРАННЫМИ УСТРОЙСТВАМИ ГАЗОВОГО ПИТАНИЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ 5ас с/г аго тусе^ сегеУ1*1ае

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

На правах рукописи

СМ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель: к.т.н. Мухачев С.Г.

Казань - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................4

1 МЕМБРАННЫЕ УСТРОЙСТВА ГАЗОВОГО ПИТАНИЯ И МЕТОДОЛОГИЯ РАСЧЕТА МАТЕРИАЛЬНО-ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО БАЛАНСА МИКРОБНОГО РОСТА.....................................................................9

1.1 Конструкции биореакторов с мембранным устройством газового питания..................................................................................................................9

1.2 Теоретические основы массопереноса кислорода через непористые мембраны.............................................................................................................11

1.3 Потребность микроорганизмов в кислороде. Сравнительная энергоэффективность аэробного роста и анаэробиоза...................................23

1.4 Теоретические основы расчета материального баланса микробного роста.....................................................................................................................28

1.5 Технологические риски в процессах выращивания чистых культур в аэробных условиях.............................................................................................34

1.6 Постановка задачи исследования...............................................................38

2 РАЗРАБОТКА И ТЕХНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ БИОРЕАКТОРОВ С МЕМБРАННЫМИ УСТРОЙСТВАМИ ГАЗОВОГО ПИТАНИЯ....................40

2.1 Колонные биореакторы с осевым и винтовым движением потока.........40

2.2 Технические испытания мембранного устройства...................................45

2.2.1 Оценка изменения деформации мембраны при многократной стерилизации...................................................................................................46

2.2.2 Оценка провисания трубчатых мембран при максимальном давлении...........................................................................................................49

2.2.3 Оценка рабочего объема аппаратов и удельной поверхности мембран............................................................................................................49

2.3 Исследование гидродинамики жидкостного потока................................53

2.3.1 Материалы и методы исследования гидродинамики.........................54

2.3.2 Исследование режима течения потока в биореакторе...........................57

2.3.3 Выбор типа и идентификация гидродинамической модели биореактора.....................................................................................................61

2.4 Оценка параметров массообмена кислорода в биореакторах с мембранными устройствами газового питания...............................................64

2.4.1 Материалы и методы выполнения исследований..............................64

2.4.2 Оценка массообменных характеристик биореакторов......................71

3 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ВЫРАЩИВАНИЯ СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ В БИОРЕАКТОРЕ С МЕМБРАННЫМ УСТРОЙСТВОМ ГАЗОВОГО ПИТАНИЯ........................................................................................79

3.1 Материалы и методы исследования процессов выращивания инокулята спиртовых дрожжей...........................................................................................79

3.1.1 Характеристика спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae.......79

3.1.2 Питательная среда.................................................................................80

3.1.3 Методы технохимического контроля..................................................81

3.1.4 Технологическая схема и управление процессом выращивания спиртовых дрожжей........................................................................................85

3.2 Режимы культивирования и микробиологический контроль процесса .93

3.4 Методика расчета стехиометрических параметров роста спиртовых дрожжей в стационарном режиме культивирования....................................103

3.5 Удельные затраты энергии и доля популяции, обеспеченная кислородом, в стационарном процессе выращивания инокулята спиртовых дрожжей.............................................................................................................106

4 РАЗРАБОТКА РЕКОМЕНДАЦИЙ ПО КОНСТРУКЦИИ ПРОМЫШЛЕННОГО БИОРЕАКТОРА КОЛОННОГО ТИПА.....................118

4.1 Проблема масштабирования биореактора...............................................118

4.2 Рекомендации по технологической обвязке инокулятора промышленного масштаба..............................................................................119

4.3 Разработка технического задания на промышленный образец инокулятора.......................................................................................................123

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................126

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ......................129

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ..........................................131

Приложение А

Приложение Б

ВВЕДЕНИЕ

Во всем мире все более интенсивно ведутся работы по созданию и совершенствованию технологий производства топлив из возобновляемого сырья. Проблема замены ископаемых топлив альтернативными источниками энергии актуальна и для Российской Федерации. Даже в нефтедобывающей Республике Татарстан, на территории которой за последние 60 лет XX века было извлечено 3 млрд.т нефти, оставшиеся ресурсы нефти оцениваются примерно в 1,7 млрд.т, которые при современном уровне добычи будут сработаны в среднем за 30 лет [1]. Запасы угля оцениваются в 3,4 млрд.т [1] и их должно по прогнозам хватить для производства химического сырья и энергии на 60-70 лет. Таким образом, в течение XXI века должна быть полностью изменена ресурсно-сырьевая база топливной промышленности.

Одним из перспективных процессов является производство биоэтанола, масштабы применения которого стремительно возрастают [2]. Совокупный среднегодовой темп роста (САвЯ) объемов производства биоэтанола в мире с 2002 г. по 2007 г. составил 19,0% [3]. Всего в 2008 г. в мире было произведено 65,61 млн. т биоэтанола. Бразилия и США являются лидерами в мировом промышленном производстве этанола, совместно они производят 70 процентов мирового объема этого продукта и используют почти 90 процентов этанола в качестве топлива. Также наращивается производство этанола в ЕС, Китае, Канаде, Таиланде, Колумбии, Индии, Австралии [4].

В настоящее время большая часть биоэтанола производится из кукурузы (США) и сахарного тростника (Бразилия). Однако, в ведущих странах мира ведутся работы по созданию технологий производства биоэтанола и других биоспиртов второго поколения из целлюлозосодержащего сырья [4].

Сырье для организации производства топливного спирта в начальный период энергетического перепрофилирования хозяйства должно соответствовать ряду требований [5]:

- возможность незамедлительного использования;

- возможность производства дополнительной продукции за счет фракционирования сырья и (или) переработки вторичных материалов основного производства, а также комплексирования производств и межотраслевой кооперации;

- наличие готовых технологий и научных заделов, гарантирующих высокое качество продукции и экономическую эффективность производства;

- возможность наращивания сырьевой базы.

Этим требованиям отвечают сахарная свекла, некондиционное зерно, отруби, технологическая щепа из мягколиственных пород, отходы лесопереработки, свекловичный жом, жмыхи и солома.

Общий объем возобновляемого органического сырья, которое может быть произведено и добыто на территории Республики Татарстан, может обеспечить производство топливного этанола в количестве до 500 ООО т в год [6].

Эффективное использование этого сырьевого потенциала будет определяться технологией его переработки, в том числе аппаратурным оформлением процессов.

Производство биоспиртов включает две стадии: наращивание биомассы дрожжей и собственно брожение. При этом в анаэробных условиях рост дрожжевых клеток не прекращается. Традиционное выращивание посевных материалов в спиртовых производствах РФ до сих пор осуществляется лишь в анаэробных условиях. При этом, вследствие низкой энергетической эффективности процесса брожения, рост биомассы замедлен и сопровождается повышенным удельным расходом субстрата. Поэтому в настоящее время все шире применяется аэробная дрожжегенерация. Она может осуществляться в традиционном режиме при аэрации культуральной жидкости воздухом или в интенсивных режимах с применением кислорода, переносчиков кислорода [7-10], перекиси водорода (последняя используется,

например, в процессе получения пищевого спирта по финской технологии на Буинском спиртзаводе, Республика Татарстан).

Анаэробное культивирование чистой культуры дрожжей осуществляют в несколько этапов путем их многократного пересева во все большие объемы сусла. Аэробное культивирование позволяет существенно ускорить процесс и реализуется, чаще всего, при аэрации воздухом. И в том, и в другом случае участок подготовки посевных дрожжей подвержен заражению посторонней микрофлорой [11], развитие которой снижает выход готовой продукции и ухудшает ее качество. Для подавления роста посторонней микрофлоры обычно вводят серную кислоту, понижающую рН до 3,0-3,5. Однако этот прием заметно подавляет и активность спиртовых дрожжей, вследствие чего падает продуктивность дрожжерастильных аппаратов.

Поэтому для снижения уровня инфицирования спиртового производства и повышения активности спиртовых дрожжей предлагаются варианты выращивания чистой культуры спиртовых дрожжей в стерильных условиях по интенсивной технологии, дающей высокую плотность дрожжевой популяции. Аэробная технология получения чистой культуры спиртовых дрожжей позволяет сохранять селективные свойства исходного промышленного штамма, препятствует постепенному вытеснению высокопродуктивной части популяции дрожжей малопродуктивной. Производимые в аэробных условиях дрожжи обладают высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот и трегалозы, что обеспечивает им высокую спиртотолерантность [7-10].

Реализация эффективных аэробных процессов культивирования дрожжей сопряжена с проблемой обеспечения асептических условий подвода кислорода. При глубинном культивировании аэробных микроорганизмов требуется непрерывная подача кислорода в ферментеры, осуществляемая путем продувания стерильного воздуха через культуральную жидкость. Воздух, подаваемый на аэрацию, должен быть очищен на 99,9% от примесей и микроорганизмов размером до 1 мкм. Наибольшее распространение

получил метод фильтрации воздуха через волокнистые (стекловата, базальтовое волокно, бумага, картон), пористые (полимеры, металлокерамика) или зернистые материалы, но и он не обеспечивает нужной степени очистки [12]. Известны способы асептического ввода кислорода через непористые мембраны [12, 13]. Новый подход к проблеме аэрации в процессе аэробного выращивания посевных материалов в спиртовом производстве заключается в подаче чистого кислорода или обогащенного кислородом воздуха в дрожжерастильный аппарат через непористые полимерные мембраны. При этом гарантированно обеспечивается стерильность газового потока, поскольку поток газа через мембрану дробится до уровня отдельных молекул, а частицы большего размера (бактерии, споры и даже вирусы) не проходят между волокнами полимера. В случае применения чистого кислорода происходит его практически полное потребление культурой, при этом существенно снижается пенообразование. Использование чистого кислорода становится экономически оправданным и за счет существенного увеличения движущей силы процесса массопередачи. Конечно, интенсивность массопередачи кислорода в мембранном реакторе не достигает значений, характерных для аппаратов с барботажными устройствами, но для целей получения посевного материала оказывается достаточной [12].

Задачей автора являлось изучение альтернативных вариантов конструкций биореакторов с мембранными устройствами подвода кислорода с целью выбора аппарата для линии чистой культуры спиртовых дрожжей, а также рассмотрение проблематики расчета стехиометрии процессов роста спиртовых дрожжей в переменных условиях ограниченного обеспечения популяции спиртовых дрожжей кислородом.

Теоретической основой построения стехиометрических соотношений, используемых в анализе процесса выращивания спиртовых дрожжей, являлись:

- концепции «парциального обмена» и «физиологического базиса» Ерошина и Минкевича [14-18].

- методика описания динамики процессов микробиологического синтеза на основе дифференциальной формы записи стехиометрических инвариантов Мухачева [19].

Результаты выполненной работы могут непосредственно использоваться при проектировании инокуляторов промышленного масштаба и линий чистых культур спиртовых дрожжей и других аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов. Масштабный переход от лабораторного биореактора к промышленному не представляет проблемы, поскольку в промышленной конструкции должны быть сохранены параметры применяемых мембран (диаметр, толщина) и их удельная поверхность. Таким образом, промышленные инокуляторы могут состоять из рабочих ячеек, параметры которых полностью отработаны на лабораторных моделях [20, 21].

Работа выполнена в лаборатории «Инженерные проблемы биотехнологии» Казанского национального исследовательского технологического университета. Отдельные результаты работы использованы при выполнении грантов Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере [22, 23].

Автор выражает глубокую признательность за научное руководство доценту Мухачеву С.Г. и особую благодарность доценту Валеевой Р.Т. за постоянную помощь в выполнении экспериментальных исследований.

1 МЕМБРАННЫЕ УСТРОЙСТВА ГАЗОВОГО ПИТАНИЯ И МЕТОДОЛОГИЯ РАСЧЕТА МАТЕРИАЛЬНО-ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО БАЛАНСА МИКРОБНОГО РОСТА

1.1 Конструкции биореакторов с мембранным устройством газового

питания

Традиционно название «мембранный реактор» относится к случаю отбора фильтрата культуральной жидкости, т.е. к так называемому «внутреннему рециклу биомассы». Этот прием позволяет вести процессы при низких концентрациях субстрата в исходных средах или в случаях, когда необходим повышенный проток среды, например, для уноса токсичных метаболитов. Чтобы не возникло неверного толкования, при описании разрабатываемых нами конструкций биореакторов, термин «мембранный реактор» не применялся. Рассматриваемые в настоящей работе конструкции аппаратов относятся по существу к реакторам с диффузионно-проницаемыми мембранами, предназначенными для транспортировки субстратов, в том числе компонентов газового питания [22, 24]. Бирюковым В.В. описана конструкция реактора с трубчатой мембраной, заполненной биокатализатором. При этом подчеркнуто то обстоятельство, что «массопередача кислорода за счет диффузии через стенку трубки недостаточна по сравнению с прямой массопередачей жидкость-газ с интенсивным перемешиванием» [24].

Тем не менее, фирма «B.Braun» осуществила разработку и выпуск лабораторных биореакторов с трубчатыми мембранами, селективными по отношению к транспорту кислорода [25]. При этом реактор был снабжен стандартной мешалкой, что, действительно, не позволяло разместить в рабочей зоне мембрану с величиной поверхности, необходимой для достижения скорости транспорта кислорода, достаточной для выращивания посевного материала аэробных культур средней плотности. Но даже и в этом случае аэробный процесс наращивания биомассы спиртовых дрожжей

оказался более предпочтительным по сравнению с анаэробной дрожжегенерацией [12]. Конструкции биореакторов фирмы «B.Braun» и ООО «Фермент», исследованные в ряде работ Александровской Ю.П., по принципу работы близки к «колонному мембранному биореактору» [24]. На рисунке 1.1 показан внешний вид крышки такого реактора с закрепленным на ней приводом многоярусной мешалки и «рулонным блоком» непористой мембраны из полидиметилсилоксана для беспузырькового ввода кислорода. Мембрана закреплена (навита) на несущем перфорированном цилиндре. Вследствие низкой удельной скорости диффузии кислорода через мембрану, в полость мембраны подается не воздух, а технический кислород под избыточным давлением до 0,25 МПа.

Рисунок 1.1— Мембранное аэрирующее устройство для исследовательского биореактора с

механическим перемешиванием

В работе Ю. П. Александровской так же исследовалась возможность повышения давления кислорода до 0,5 МПа, однако при изменении избыточного давления кислорода в полости мембраны от 0,225 до 0,25 МПа происходит скачкообразное, неравномерное по длине увеличение диаметра полимерной трубчатой мембраны, что объясняется достижением предела упругости [12]. Данный факт вносит некоторую неопределенность и

неконтролируемость в рабочие характеристики биореактора и поэтому в реальных условиях применения полимерных мембран желательно исключить неконтролируемую динамику свойств мембран под действием физических факторов.

1.2 Теоретические основы массопереноса кислорода через непористые

мембраны

Мембрана - это фаза или группа фаз, которые разделяют две различные фазы, отличаю�