Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗА ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ: СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ И РЕГУЛЯЦИЯ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗА ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ: СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ И РЕГУЛЯЦИЯ"

А-1в §00

рворонгаский ордена лешна государственный ушверсктет ' ■ шдо ленинского кшсшсша v _

. На правах рукописи

ПШЙРУ де К. Мигель Антало А, ;

УДК 577.152.1:582.5

. НАЛАТДЕГКДРОП!НАЭА ВЫСШ РАСТЕШИ: _ СВОЙСТВА, ФУНКЦИЙ И КГУЛЯЦИЯ ; • -

03.00,04 - Виохтаия 03.00.12 - Фиэкология раотенуд

Авюрефераг ■ диссертации на соискание ученой степени кандидате биологических наук

Вороне* -1ГЭ1

V Работа выполнена в лаборатории кафедры физиологии' и биохимии растения Воронежского ордена Ленина государствен«ого университета имени Ленинского комсомола.

ДоучныИ руководитель; доктор биологических наук, пр«4,е®сор

. А.А.Эемляцухин. Официальные оппоненты; ^докто^611^0г^вски* ^а^ Шатилов 9.Р.

кандидат, биологических наук Е рш'ова а\н

Ведущая органгоедам; Институт физиологии растений АН СССР

Защита состоится " Д* "_/Яа % 1991г. в 15 часов'

на заседании специализированного сгоета К 063.43.05. по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук при Воронежском государственном университет« (394693 Воронеж,Университетская пл.,1,госуниверситет,биологс-почвен-ный факультет). '

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Воронежского государственного университета;

*

Автореферат разослан "^У " Аы^л/.Я 1991 года

Ученый секретарь специализированного--" ]

Совета ' --Д.^) ^ <) (, Г.Е.Роробаш .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

\

Актуальность проб пени. В настоящее время исследование регу-•ляции'Метаболических процессов организма является одних из приоритетных на правде дав развитой биохимических и физиологических <наук. Оно имеет не только фундаментальное.но и большое прикпад-vjMoe значение. Так как исследование метаболизма, с точки зрения i6no регуляции позволит не только лучше кштролировать продуктге-•ность и урожайность растения,но и разработать более эффективные способы выведения и селекции новых сортов организмов. Кроме того, применение современных методов биотехнологии и генной инженерии в дшнсП области позволит произвести разумное вмешательство в процессы жизнедеятельности организмов, с целью получать ценные биологические препараты, необходимые для медицины, промышленности или сельского хозяйства.

Достижение этих возможностей требует глубокого и детального знания механизмов регуляции метаболизма,которое невозможно без исследовануш саморегулирования обменных процессов на уровне отдельных энзуматическюс систем,"

В этом отношении, многие аспекты регуляции жетаболиэма у-высших растении иэученн недостаточно. Это относится в том чi-C- * ле, к исследованию механизмов регуляции к сшртаения функциональных блоков у.х метаболизма.

Известно, что в сопряжении ваинешвс метаболических путей растительной клетки,существенную (центральную) роль мграет палат ( taño», Kuetin ,1984), который ассиметршно распределяется в ее компаргментах, При этом, в регуляции потока данного метаболита внутри кгатки могут участвовать несколько энзимов, в том числе два типа магатдегидрогеназы СМДГÍ: оксиредук- . тазноп и декарбоксилирующей, Однако, лишь оксирелуктаэная МДГ (НАД4-; К.Э. 1.1.1.37), в силу своего универсального распространения в природе и в тканях организма, своей мультифункциональ-hoctv. и субклетс^ноя локализации способнаучаствовать со всея полнотса в регуляции и осуществлен*:« функций палата. Т.о., изучение характерно тук у, механизмов регуляции оке пред уктазчеп. малатдегидрогеназноа системы имеет существенное значение для понукания протекангя процессов метаболизма в растительной клетке.

В течение последних лет немалое внимание было обращемок исследовании фтико-химических и регулятортых свойств МДГ •

центральнай . ' .

науч- .ая библиотека t осн. сел^скохоэ, академии ии. К. А. Тимирязева

- я -

(НАД*"), Однако,, главный упор исследователей бил направлен на НДГ животного и бактериального происхождения, В ходе этих исследования, в основном изучалась МДГ, локализованная в мито- ' хондриях и в цитоплазме эунариотических организмов. Вместе с тем в: их клетках, и прежде всего у растения МДГ, представлена множественными молекулярными формами,км ею идам и раз личную локализация и генетический контроль 13емлянухш V. др,, 1986;Струнников , 1906). В результате исследования лишь суммарной активности или недостаточно идентифицированных молекулярных форм МДГ, сведения об отдельных изоэнэимах из клеток высших расте-'киЯвесша ограничены и несистекатизировоны. Малочислекы данные о свойствах и регуляции активности МДГ из глиоксисш, пероксисом,хлоропластов и клеточных стенок растем'ш. Отсутствует сравнительное исследование характеристик изоэнзимов '. налатдегидрогеназноя системы клеток одного организма. Проблематичным для многих га след о ев тепе Я остается вопрос о физиологическом значении к ой участии изоэнэтов МДГ в регуляции метаболических процессов растительной клетки. Отсутствуют све-' дения об активном центре и об аминокислотнш составе изоэнзи-мов МДГ (НАД4*) из растения. Практически не опубликованы данные об изменениях изоэнзкмного спектра МДГ в зависимости от этапов онтогенеза у. от физиологического состояния растения. Отсутствуют донные о механизмах регуляции данных изменений иэоэнэутм-ноге спектра МДГ. Недостаточно исследовано влияние внешние факторов и молекуляртые механизмы их действия на активность лзоэнзимов МДГ. Все эти аспекты и вопросы необходимо исследовать для более полного понимания физиологической и бмш.мичес-коЯ роли малатдегндрогеназнол системы в регуляции метаболических процессов растительной клетки. .

Цель и задачи исследования. Цель настоящей роботы - исследовать свойстве и механизмы регуляции активности изоэнзимсв НАД^-ЙДГ, а также распространение,тканевую и субклеточную ло-калюацию ее молекулярных форм в клетках разных растения.Исходя из цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменения активности и изоэнзимкого спектра МДГ в органах розных сортов и ведов растений, в онтогенезе.

2. Исследовать тканевую и субклеточную локализацию иаоэн-зкыов МДГ.

3. Разработать эффективные методы получения гомогенных

препаратов МДГ из разных растении. .

•4. Исследовать к сравнить физико-химические. "и кинетические свойства разных даоэнзиюв МДГ клетки, ,, •

5. Прогости идентуфикацию коногшных груш НАД^-МДГ и представить гипотетическую модель активного,центра растительного , энзима. • . ■ ■

\ 6. КсследоватЬ влияние экэогеннтсизндогшнюс, сигналов и соединения на активность к иэоэнэимний спектр МДГ. .

7. Смоделировать действие механизмов генетического контроля и биосинтеза №ДГ в растительной клетке.

8. представить схему,механизмов регуляции активности мацат-дегидрогеназнсй системы в растительной клетке. •

Научная новизна работы. £ результата проведенных исследований изучено распространение, динамика активности в онтогенезе, ' тканевая и субклеточная локализация иаоэнэммов МДГ (НАД*") в некоторых еццах растений. Исследована тканевая к вкдовая специфичности изоэнзу,иного спектра МДГ. Впервые ползчены данные о дифференциальной активаиш а онтогенезе изоэнзимов МДГ из эндосперма к л ещев инн, [{сказана: зависимость изоэнэимного спектра МЛ Г других растений от этапа онтогенеза и от физвологичеспо-го состояния организма. Впервые получены гоиогенннв препарату -изоэнзиисв МДГ из нитохондрии.тлноксисом и этиогшастов эндосперма кяешввищ. Получена такие гомогенная МДГ из цитоплазмы литка кукуруза. Дана сравнительная характеристика этих изоэнзи-мсв МДГ. Куте» исследовании аминокислотного состава и физико-химкческих свойств показано, ^ то' но тку лярныв Форш МДГ эвд ос -пер!а представляют собой истииние г.зознзиму. Впервые иденти£и-тровены аминокйслотнне остатки,входящие в охтьмныЯ центр КДГ' кукурузы и клещевины. [Iредлонена гипотетическая схема активного центра к каталитического механизма МДГ растительного лроисхоаденкя, &ссл<?д оэаца регуляцу.я активности изознзйиов КДГ. Впоррые установлено действие мехшизма субстратной индукции в генетической регуляции кзоэнакмов ИДГ внсшх растеьуЯ. Установлено регул я торное влияние аде таловых ну клеот вдов,углекислоты г других соединений на активность изознз^мов МДГ, ПредлЬженв гупотетическоя модель иасвнгзмов, контролирующих на уровне гаознотмов НАД^-МДГ, энергетшеские и би о синтетические процессы в растительной кл^гге, Ц учен о участие митохондрий ль ног о гедо-ка в реруляцис биосинтеза, сргане^яь^ого иэоэмяима ИД".

Практическая ценность работы. В ходе диссергзцконной работы были получены данные,которые дают возмокносТг лучше понять . механизмы,регулирующие на уровне изоэнзимов НАД'~-"Д| метаболизм растения. Полученные данные при исскедовании тяпневоя и вадо-воя специфичноотей нэоэнзимного спектра НДГ и обнаруженная корреляция между'ним и продуктивностью (содержание» п'/ра в семенах), растения могут быть использованы в области генетики и селекции растений. .

Разработанные схемы счистки могут быть мсгтольэовош для получения гомогенных препаратов энзима кэ других источников, С их псмошыо мо*Гно получить высокоактивные препарата, МДГ, которые •могут широко примениться в производственных и па"5ореторшх . .условиях. Найдены оптимальные условия храненга НАД-МДГ в присутствии эффективных стабилизаторов,которые позволяют сохранять активность энзима в течение 10 месяцев без существенных потерь. Разработанные схемы выделения и хранения характеризуется целым . # рядок преимуществ (дшевн'зка,простота,эффективность хранения по отношдаио к другим методам) .¿Хватова, 1955, тят1уя ,1985). Полученные препараты могут быть использованы в лабораториях для ре гэ не рации НАД* или КАДН при исследовании других энзимати-ческих систем или при моделировании им надмолекулярных . структур клетки. Кроме того гомогенные препараты НДГ могут / Сьть испольаозена в пищевоя промышленности для исследования

■ качества продуктов и в медицине для биохимических анализов.'

■ Кроме того, полученные в ходе диссертационной работы данные , имеют фундаментальное теоретическое значение и могут быть .использованы прт чтении специальных курсор по физиологии и биохимии растений. ■

Апробация работы; Материалы диссертации докладывались и обсуждались не У1 Всесоюзной межуниверситетской конференции по &ОЛОГИ.И клетки,Тбилиси,1987г,; на отчетных научних конференциях Вороыексхого1 государственного университета 1986- 1990гг. на 19-ол кснферйкции молодея ученых Московского университета, Москва, 1063; на 19 Колдун а род ном конгрессе фодореш.и европейских биохкмических'общоств,Рим,1939; на 1У Всссосзпся конференции молодых ученых по физиологии растительной кяетег.Мккек,. 1990, на. 7 международном конгрессе федерации европейских / Обществ физиологов растоткП,УЯЭА,Швеция, 19--Ю: на 20 международном конгрессе федерто'.м европейских Сисх» мичеськх обсчета/

Будапешт,199G; на 2 съезде Всесоюзного общества физиологов растений,Минск,1990; на межреспубликанской научно-технической конференции по.проблемам азотистого метаболщма,Волгоград, 19Э0.. , . -

Публикации. Со материалам диссертации опубликовано' 9 работ. Структура дюссертац™. Диссертация состоит иэ введения, обзора литературы 1иэ & глав и 7 пунктов), экспериментальной части (из 4 глав yi 16 пунктов), заклсчощ'я, выводов, списка. литературы и. приложения. Материала кзяожени на Л^У страницах машинописного текста,включая список лкгерогура, _ таблиц рисунков и схем. Список литература, насчитывает* 233 источника, кэ историк 59 на русском нанке. В приложении приводится: . таблиц, ¿се> рисунков, к у ifiít,

. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

. f Материалы и методы исследования ч -

Объектисследования, Б качестве основных объектов исследований использовали проростки: клежевши ( Molnaa commnle )*, кукурузы i Zea maye ) , COpTQ Боронвискай 76* СОИ ^ Й1уо1лв mij L.. ), сорта Амурская 310. Некоторые-исследования.предо-лсли на проростках других сортов кукурузы и.сои, а токжа на Других видах растений. Описание этих видов приводятся в работе по ходу изложения экспериментальных данных. Выбор растения мотивировался целым рядом причин,в том числе различиями в типе основного обмене,концентрацией й уровнем удельной активности энэша. Растения в^ршциежлк гидропонным способом в темноте или на свету при 25 °С. При исследовании индуцированного синтеза 34ДГ, растения .еырацивапи также гидропонным способом в присутствии рознвх концентраций органических куй л от (малатв.+умарата, Цитрата), .

■ Мчтоди исследования. Выделение и исследование МДГ проводи-* ■ W. кз разных органов растений,используя Фракционирование суль-йатон в кк они я и лй ду,^ ije ренциёпьное разделение срганелльных ■ ^рэкщЪ.у.оннообсеннуо хроматосра^ис на ДЗАЗ-целяглозе,г©ль-?ильтр'«шю на ce,ta дек с ох и упьтра^ильтрпцию под дсвл^нием ereociep« азот«.

Активность КДГ'определяли сгектрофотометрическк по методике.

- s -

. Очоа ( echo». ,1955). Qftnvtt ¿елок определяли по методу Г сур v. С Uwty ,1951) и спектрофогоыетрическк по методике Калькэра (Землянухнн,1985). Разделение клеточшх органелл преведгш: с помещью метода дифференциального «енгрг^угиреввкил у, учъгра-лвк-трифугирования в градиенте плотное та сахарозы в течете 3-1 массе при 100000 на /льтрапентрифуге УЦПЗ-47, ротор РКЗ-С^. Электрофорети-гескиа'исследования осуществляли методом дмк-элек-трофореза а б "-но« полиакрилвмуднем теле по методу Дэвисе t: teTia, oiTiet.in _ . , 1959).' Для специфического проявления ИДГ в геле использовали тетразолкевыЯ метод (Геаль и др. ,1982) в уо-

стадий Когаиедова (1976). У.сспедовану.е субъединкчного строе' нйя проводили с помошш электрофореза е додецилсульфатом натрия ' ( 1лвн»1/ ■ ,1970).-Молекулярнуо массу ИДГ определяли гель-фильт-

■ ршдией на сефедексе с-150ЧЛетерквн,1ЭТ1).

Для идентификации аминокислотных остатков,входящих в активный центр НАД-МДГ,использовали спешфуческие реагента: дкэтил-пкрокарбонаг, п-хлормеркур^иЛкзоат.фтандксн^крвдоксвльфосфат, фениг.кетикс^льфокилфторид. А^иношслотныК состав' изоэнзимов КЕТ опредечяли путем* кислотного гмролиза (6Н НС1) в присутствш 0,02 $ -меркалтоэтанола и 0,25 % феноле на аминокислотном анализатора AAA 831 (ЧСФР) (Еербрел,1989). '

* В опытах по юследоввну.п: тлутровамн or о синтеза МДГ к моделированию синтеза*"белка в кигохондриях эндосперма использовали радиоактивные амучокислоты ^С-иевцина, и 14С-гл>тнв tnpo-

■ гзводственнсэ объединение "Гзотоп"). Редиоактувность измеряли на низкофоновои установке УНФ-15СО.•

Все опыты проводили не менее, чем в трех биологических и двух аналитических повторноетях. В таблицах и на рисунках показаны данные типичных опытов,со средними арифметическими знэче-, нкяыи. Кэлогенные дшнье обрабатывались с Г7смо:кьс пр строки кру-емых микрокалькуляторов и 3SX ( рмсоок ,$РГ).

РЕЗУЛЬТАТЫ .КОКЕДОЗйЖа'-

1. Распространение МДГ в разных органах растения

В настоящее время известно,что КДГ присутствует » растительных клетках в вида множественных молекулярных <fofw.которые отломаются между собой по субклеточно!* локализации % образует

систему (малатдегидрогеназную систему) взаимосвязанных белков. Обнаружение множественннх молегупаршх ИДГ .лекал уз оашных в раз »умни компартментах клетки высших растений,осложняет изучение регуляции этого энзима' . По этой причине нами бвяа составлена задача исследовать чушесгв^сщие внутри клетки соотношений между отдельными изознзимами ХДГ, и механизмы регут -аячкк ее изознзкмного спектра в онтогенезе в зависимости от фкэио логического состояния растений. МДГ была обнаружена в органах всех исследованных растения С10 видов, З сортот , 6 генетически чистых линия и 1 мутантЛ Чянэко, активность МДГ в . клетках зависит как от вида, сорта или пиний 'растения,тек .и та от органа и типа метаболита. Наибольшая концентрация МДГ обнаруживается в клетках масличных ра;тении. Эта а а ко но мерное ть остается в силе для сортов и линий кукурузы и сои,которые отличаются между собой по содеряанкс жира в их семенах-. Среди всех исследованных видов растении наибольшая активность МДГ наблюдается в эндосперме клещевины (155 Ед^г,сырой массы) у. в иит*е кукурузы (137 Ед/г.о.м.). 1*ри прорастании максимум активности КДГ наблюдается в запасающих тканях исследованных растений, через 3-5 дней посла начала опыта. В листьях и корнях проростков максимальная активность энзима наблюдается на 2-3 день прорастания. ' '

СИ

Гне.1

и 2

зи

1_1 5

1—1 б

ЭЛектро^ор^Гр•'-¿Г и» вчпяыЛГ'ЩИГ Тканей разных р-^типий.

1 -ЭиДослгрм юл-щеенич. 2'.Щиг0л кукурурн. 3.Семядоли пслссдпечники. 4.Семядоли сои. б.Ссглядоли клугц-рн. б.Семядоли г ирохч.

Отличия в активности МДГ в органах разных видов рас тэт-Я имеют не только количественную,но и качественную основу. Элек-трофореткческие исследования позволили нам установить тканевую и видовую специфичность изоэнэимного спектра МДГ. При этом, спектры МДГ отличаются как по числу и электроф еретической под» викности иэознэимов,так и по соотношениям меящу ними. Наибольшее число молекулярмнх-форм МДГ обнаруживается в эндосперме клетевинв и в щитке кукурузы,в электрофорегракмех которых про-, являются по б белков (рис.1). Исследование субклеточной локализации НЛД-ЙДГ показало, что основная-доля активности энзима в органах этих'растения локализована в цитоплазме (.таблица 1а,б). Однако,в эндосперме клецевкнн активность МДГ, локализованная в оргакельных фракциях вше,чем в щитке кукурузы. Кроме того била изучена субклетснная локализация МДГ в листьях кукуруза и сои. Отличия в распределении МДГ в субклеточных фракциях органов разных растений связаны с особенностями их метаболизме. Зл?к£роферетический анализ субкиетадиых фракций этих растений показал специфичную локализацию иэоэнзииов МДГ. В цитоплазме эндосперма клещевины локализованы две молекулярные форта МДГ, а в остальных компартментах по одной. В отличие от этого в цитоплазме щитка кукурузы локализуется однв.в в митохондриях -две молекулярные формы МДГ.

Ксследование иэоэнэгмного спектра МДГ в онтогенезе показало, что он имеет динамичный характер и зависит от возраста и физиологического состояния растения. Установлена дифференциальная активация изо энзимов МДГ в ходе онтогенеза. Показано, что в течет« первых £4 часов происходит активация глиоксисомальноя МДГ за счет модификации уже существующих ее предшественников. Одновременно уменьшается экспрессия цитоплазматических молекулярных форм МДГ. Сходные явления были обнаружены при исследовании запасаюявх тквнеЯ кукурузы и клевера. Обнаружена также перестройка изоэнэкхного спектра МДГ листьев кукурузы, клешевины и сои при переходе из этиолкрованного в фотосинтезирую-дее состояние. .

Т.о. .и.эоэнэимчый спектр ЕДГ представляет собой диноккчос-. коо равновесие молекулярных форм энзима,которое постоянно регулируется организмом в зависимости от метаболических потребностей и условий развития.

Теблю»1.а ' \

. ' Субклеточная локализация малатдегадрогена эй эндосперма клещввшш

^Субклеточная фрэкцуя '.Общая активность, Ед. :Удельная. .'активность, :Ед/мг белка X ^ Выход,%

Ц«Т030ЛЬ 25,7 + 1,0 2,4 + 0,5 ' 45,6

Над осадочная • ■

жидкость градиента 15,4 + 2,3 , 1,6 +0,3 27,3

йитохондрии 9,9 + 1,5 1,9 + 0,5 17.5 .

Этиопласти 1,6 + 0,3 ,1,0 + 0,3 . 2,3

Глиоксисома ' 3,9 + 0,5 2,6 +0,6 6,9

" Таблица 1,6

Оубклетотная локализация ыалатдегидрогедаэы щитка кукурузы

Субклетснная • фракция Обшая : актижость, : Ед. Удельная : V активность, * : Ед/иг белка : Выход, $

Цитозоль 60,3 + 2.3 1,8 + 0,4 77,6

Надое а,"®чная >

жидкость градиента 17,3 + 1,6 2,1+ 0,0 22,4

Митохондрии 6,7 + 0,6 3,2 + 0;5 15,6

Этиспласты 0,6 + 0,2 0,5 + 0,1 1.0

Глиоксисомн 1,1 + 0,3 2,4 + 0,6 1,5

2. Очи.стка ~и физико-химические характеристика ^ДГ уз высших растений

I

С псмощью разработанной нами схемы очистки были получены гомогенные препараты МДГ »та цитопяадан из шитка кукурузы (стегнэнь-очистки - 540 раз; 1305,1 Ед на мг белка), митохондрии 1373,4 раза; 597,5 Ед на мг белка), глиоксисси (909,3 раза;

1355,0 Ед на мг белка) и этиоплчетов (40,2 раза; 3 Ед на мг белка) эндосперма кляцэвины.-Результата очистки ми то хонд рольного и глиокскссмапьксго изоэнеу.мов МДГ из -"чоспэрма клоташ-ш преде тавленн а таблица* £ v 3. Все энзим (дав ^шара ш по • 'дакнвм электро^ор^тачвеких юелвдозэшгй (¡или гоиогятчми.

Таблта ^

Очисгкп митсхондриальноК налаглвм-дрогшаэы из эпдосперна

клещевины

Стадия ■ Ойьом ил Акт«- : кость : обяэл, Ед. ; Ее л ок обт.й, МГ Удельная ак-: .тив- -:нссть, Ьд/мг белка Степень счистки ВыходД

Растительный ■ 25,00 378,904- 239,20t- 1,00 1С0,00

экстракт ■ 6,i(f 10.00 0,10

Фракция митохонд- 2,40 155,70+ 80,30+- 1,904- 1,го 41,10

рий и глиоксисон 4,20~ з.го" 0,10-

Гея ь- фильтрация 11,40 133,00f 3S,7£Jf- 3.604- г,40 36,90

на се|адексе с-2а ■ 3,80~ 2,i>0"* и,10-

Ш на ЛЭАО- 27,00 117,10* 4,054- ,30,10+ 18,80 30,90

ПЧЛЛПЛОЗО 6 ,90~ 1,10 6,00

Ультра^и льт рациП 3,00 о ,82+ .105,904. 66,20^ 22,90

под девпением 2, го"* 0,01 2,30

Гель-Зильтрация 6,20 23, ' 0,04+ 507,50 373,40 20,70

"на св(5'Одбксоа-150 - 1,30" 0,00~ 82,60*

Подучите отделимых то$ори мл-мдг » грмогонном-сктъгикй позволило исследовать их х о - xv m ич в с кие к кинетические . хорзктврусткхи. Определение молекулярной массн ияоформ КДГ из эндоспора клещевины голь-фильтрациеи на се^адексе с-150 и электрофорезом в присутствии додецклсулы1ата натрия лежзэало, что донные бэлки тест разную мол окулярную структуру, Глкскси-сомвльная в этиспяасткая МЛГ представляют собой,соответственно, димер и тотромер с иэологичоскоя структурой-и массой 65,0 (33,0) и 115 (3Ü) к Да. ^итохендриальнал f.'," Г; икеот гетерслсги-чвеку» структуру и молекулярную массу, равную 8Ь,0 (42,0 и

Таблица Э.

Очистка глиоксисомельнои малатдегидрогеназы из эндосперма клещевины

Стадия Объем, Актив- 1=6 Л(Ж, Удель- :Сте~ Ьыход,

ии ность обииП, нал ак-'нань *

■ * общая, Ед мг тив- ^част- л .

ность, :ки Ьл/мг :

белка .:

Растительная 101,50 1140,504- 767,111». 1,494- 1,00 100,00

эк от ракт — 8,20~ 7,10" ' о.оГ

фракция митохонд- 2,60 £13,004- 90,90»- ■ 2,70+ 1,80 21,30

рий и глиоксисом _ 6,10~ 4,20 0,06~

Гель-фильтрация 14,00 162,00». 44,50»- Э.6&* 2,50 13,да

ца свдалекее с-25 4,30 3,10" 0,15"

ИСК на ДЭАЭ- 19,5, 112,80»- 35,97+ 24,80 "10,00

целлюлозэ 2, Ю~ 7,40~

Ультрафильтрация ■1,8" 52,104- 0,45+ 115,834- 77,80 4,6

пед давлением 1,30~ 0,02~ 2,28™

Гель-фильтрация 4,0 27,10»- 0,02+ 1355,01- 909,30 2,4

на сефадексе с-150 . 0,90"* 0,00" 45,00

35,0) кДа? Цитоплазматическая МДГ из шитва кукурузы такие" представляет собой иэологический димер с молекулярной массой,равной 30,0 (36,0) кДа,

, Кэучена температурная зависимость активности очищенных изо-форм МДГ для реакция окисления калота » восстановления оксало-ацетата. Рассчитаны температурной коэффициент ( ч10 ), энергия актилаиии (Еакт ), энтальпия ( Л|Г ), свободная энергия ( дс^ ) и энтропия ( ), характеризующие зевке им ость скорости ре-

акции от температуры в переход энзим-с^бстратнсго комплекса в активированное состояние^ Зти дшные указывают на различную белковую природу изофора-КДГ из эндосперма клаяевинн. Показано, что изоформы НДГ обладают различной термостабильностью при осуществлении прямой и обратной реакция. Кроме того, ус те яовп в но, что пареметри переходного знай м-субстратн ого комплекса для этих реакций отличаются между собой. Полученные отрицательные эначо-

ния энтропии для окисления палата свидетельствуют о том, что переход в активированное состояние сопровождается ж онфори анионными изменениями,ведущими к упорядочению комплекса. Все взофор-иы НДГ катализируют восстановление оксапоацетат а в зависимости ■ от температуры среды в двух конформационных состояниях, одно из которых обладает низкой активность» и существует при невысоких температурах среды. Другое с высокой активностью существует в среде при температурах,превышающих 15-25 °С в зависгкости от • изофори МДГ. ' •

Исследование зависимости активности изофорты МДГ от хокцент--рации ионов водорода в раствбре показало, что рН оптимума изо- . форм МДГ лежит в пределах от 8,0 до 5,5 при восстановлении оксалоацетата, 9,0-10,0 при окислении палата. .*

Проведенные нами исследования кинетики реакция МДГ позволяют предполагать, что они осуществляют биохимические превращения по последовательному упорядоченному каталитическому механизму. При" этом их кинетика реакций подчиняется уравнении Ккхаэлиса- ' Яентен. Кэоформы МДГ обладают более высоким, сродством в оксало-ецетату и НАЕЙ( чем к манату и НАД*", Это определяется более слабым взаимодействием энэта с мал атом и НАД4, и необходимостью ' осуществления больших конформационных сдвигов в ее молекулах при окислении субстрата ^Блшенфелд,1986). Показано,что изофор-. мы МДГ обладзцх различной степенью чувствительности к высоким концентрациям субстратов. Т.о., изсформы МДГ,обеспечивание энергетические функции Смитохондриаяьный и глиоксиссмальный белки) ингибируются при относительно высоких концентрациях НАДН и оксалоацетата, Этиспластная к Цитоплазматическая КДГ ' менее подвержены ингибитор«оку влиянию этих субстратов.

Эти исследования и анализ аминокислотного состава белга из эндосперма клещевины показывают, что данные изофорны представ-яягт собой истинные изознзкмн МДГ. Данные,полученные при исследовании аминокислотного состава изоэнэимов МДГ из эндосперма клещевины представлены в таблице 4. Ун и показывают , что иэоэн-эшы НДР из клещевина имеют близкий аминокислотный состав, но отличаются по содержанию лизина, треонина, серпна, глутаминовоа кислоты,цистеина и лейцина. Аминокислотный состав этих Селксв сильно отлтаается от состава ¡чДГ из бактериальных источников.

Химическая блокировка функциональных груш МДГ специфическими реагентами показала, что в каталитичосксй механизм дейст- .

с Таблица 4

• Аминокислотные) состав изоэнэимов НДГ клещевины, бактерий и растений

Аминсгиелоте

Яязин 68 57' 41 46 ' 54 ' 38 34

Гксгкдш • 15 "16 .4 10 12 6 10

Аргинин 11 8 18 24. 24 18 20

Ас парафиновая

кислота , 16 , 25 • 24 65 79 46 48

Асперагин - - 22 ' - - г

Треонин 25. 16 36 24 , 20 44 'ЭО '

Серкн 29 68 ■ 4 24 34. 46 42 40

Глутакиновая

кислота 60 68 38 68 58 52 ' 58

Глутамин .- - 30 ■ - ■ - -

Пролин 25 25 26 . 20 '28 " 24 26

Глицин 55 71 72 43 58 56 52

Алании ад 41 68. 46 48 . 42 50

Цистевн' 26 И е - . 0 6 6

В алии 6 16 68 . 54 52 ' 42 44

Метионин - - 8. 10 14 10 6

КзолеЯцин 21 1» 34 40 52 26 22

Леяцин ' 44 33. 66 48 40 40 . 44

.Тирозин 9 7 8 18 22 12 12 '

Фенилаланин И 7 20 18 26 14 20

Триптофан - - 4 б 4 10

вил энзима, видимо, вовлечены остатки гистидина, а рг к нина и -лизина. Остатки цистеина и серина в активном центре иитоплаэма-тическои и глиоксисомальноя НДГ не были обнаружены при блокировке с помощь» соответствуших реагентов. Расчет количества модифицированных остатков показал, что около двух оо'татков тистиди-на и аргинина и один остаток лизина необходимы для проявления

Число остатков на димер

клеще зины митохондрии -.'клеше-: :вины : :глиок-: : с не омы: сМа оо11 1оЬвв ДОНОса 1<1а-г!ив ТЬггяо-р1»®«а рМ1ия :шпина- :та * # ИАДФ+, кукурузы

малатдепуфогенаэнои активности.

На схема 1 показана гипотетическая модель активного венгре и каталитического превращения палата МДГ, Остотки аргинина в активном цектре-МДГ, по-видим см у, образуют субстратно-связаваю-fflv.tt участок. Карбоксильные группы малата взаимодействует с гуа-ниджовами группами аргинина. Поскольку перевод энзима изена-в холок онформацию сопровождался значительным скиягекием с гея он и модификации лизина,по-видимому, этот остаток локализован 8 не- . посредственной близости от ксэнзима и,возможно,учаотвует в поддержании необходимой ориентации НАД4" при формировании энзим-субстратного комплекса. Возникающее перераспределение злоктрон-нои плотности никоткнамидного колыга способствует переносу гвд-ркд-иона иН-гругшы малата на А-плоскости 4 положения кольца НАД4". Остаток гистидмна,по-видимому .участвует в атаке и перенос атома водорода Ш-групгты малата,на НАД4". Водород от СК-группы малата может-либо обмениваться в виде протона с окружптеЯ средой, либо переносится на шедаэольиую группу второго остатка гистидина, Безусловно структура активного, центра НДГ рас титл ь-Vtort происхождения дается ошь в первом приближении, тем не менее она согласуется с вмеигомися экспериментальном и тггер&тур-Ними данными для энзима бактериальных и «квотных источников. Так как в лете рагу ре бооб'це отсутствует сведения об активном центре-раститвльноО-НДГ,предполагаемая нами, схема может служить рабочей гипотезой для развития исследований по элементарному акту катализа энзша из этих исгочкисов,

3, Регуляция активности мадатдэгидрогеназн у внсшу.х

растений „ .

Одной из центральных, проблем в изучений метаболизма растений является выяснение молекулярных механизмов регуляции его функциональных блоков {катаболизма,анаболизма) на энзим этическом уровне. С недея Точки зрения,, калатдегидрогеназная сгсггл'а ваа-ших растения может играть важную роль в атом процесса;тех как она состоит из балков,ьшолнлшмх либо катабопическ^е.лкбо анаболические функции внутри клетки. Эти белки объединится внутри клетки обдам и ассиметричио распределенными субстратами* и коэн-ашом (НА^/КАДН). При нсследованки активности ЯАЙ-ВД в онтогенезе растения Свло показано, что ее молекулярные форш надо-

У//УТ////Л

Схема X. Гилстетгческая модель активного центра и формирования энзим-оуоетратного комплекса ВАЛ-;«* из эндоспеома клзщев::ни. стрелками показано смоление электроннол плотности пр[: вэанкодалствии субстрата с функциональным:! группами активного цвстра.

дятел внутри клеток в вида динамического равновесия,состояние которого зависит от метаболических потребностей организма,' от процессов роста и т.д. Ог.ьты по исследованию ахтивности и изо-энзимного спектра МДГ в органах разнчх сортов и чистых линий кукуруза и сов показали, что состояние этого равновесия зависит также от генетической основы и от метаболической специализации растений. У кукурузы,например,активность МДГ вые о в органах линий,которые содержат высокую концентрацию жира в их семенах. При этом,возрастание активности энзима обеспечивается за счет уменьшения общего числа белков мадатдегмдрогемазнок системы и дальнейшей специализации, клеточного метаболизма. Исследования влияния разных концентраций органических кислот питательного раствора на малатдегидрогеназиую систему высших растений свидетельствует о налички в клетках механизмов индуцированного синтеза энзима ((->«0.2). Изменения в.актюнссти и изоэнзимнем спектр МДГ под влиянием маяата показывают,что низко- и высокомасличные л;*нии сортов кукурузы,по-видимому,несут практически одинаковую генетическую информацию,но часть ген ома,ответственного за синтез молекулярных фор* энзима,репрессируется' в клетках при специализации метаболизма. .

1 ■ ■

1 ■ I

■

■ в ■

■ ■ ■

1 ш i

1 Н I

Рис.Я Э я etcrpof ope грамма ТЛДГ из щитка проростков ^у,-куруэ'ы сорта Воронежская ?б( виращони«г п рэвинх питательных средах.

■ 1. ■ HjjO. а, 0,25$ маната . 3. «адэта.

4, 0,5л маяат'т,- SÜmkII акгиномицин^Д., .

. 5. мздата, 50мкМ циклогексимид.

Экспрессия мситез 'эти* нолэиулярных форм МДГ происходит лишь 5 очень специфичных условиях раз»ития.например,на начальнах этапах разлития или под пяиянием экзогенного индуктора. В качестве индуктора НДГ, но^ет выступать малат.под его влиянием происходит синтез d» novo 5 дополнительных молекулярных форм ■ . энзима. 'В таблице 5 причт деки результаты очистки МДГ из о р гене л Ьн ОД фракции щитков индуцированних проростков кукурузы.выроненных в присутствий 1 С^олапина. Эти данные свидетельствует о вклинении радиоактивно .1 метки в молекулах изо энзимов ЛдГ иэ индуцированных мела том растзни;».. Механизм индукции Ч£Г палат ом, «по-В1;ди^!0му. действует по принципу близкому к модели К в к оба и Моно С J»tob,Monod(1961).

.Кроме того, был исследован молекулярный механизм влияния" углекислоты'на активность IUT. Инкубация т>а стену;! в атмосфере C0¿ способна вызывать качественные и количественные изменения в активности и изоэнэимном спектра !$ДГ в органах разных растений. Изучение влияния СО^ на активность очикенннх г лк оке и с о чз л ь к о :л и о ти о ti ласт но Я МДГ показало, что кислота вызывает конку рентну о синергетичёекуп активации молекул энзима. Возможно,даиинЛ механизм действия углекислоты леи it на основе повышения каталитической эффективности молекул i-Ш1 поп возникновении различных стрессовых ситуация. Ьто явлчние играет волну» роль в компенсации деструктивного воздействия внешних стрессовых факторов на метаболизм организмов чХочачк'а.Сомеро Í&S6).

Соотношение адениловых нуклеотпдов ,kl.i кТё ) внутри

хонпаргиентов клетки играет особо важную роль в регуляции клеточного метаболизма. нами было обнаружено«что аденкловые иуклео-ткды явлввтсп элективными конкурентными ингибиторами МДГ.Показано,что изоэнзимы ВДГ обладают разной чувствительностью к влия-няэ адениловых иуклаотиров. Физиологические концентрации АТР вызывают эффективное мнгибирозание митохоадриальноП и гяиоксисо- -бальной удг, В соответствии с концепцией Атдинсовэ "клеточного ' заряда энергии" с повышением уровня АТ? усиливается биосинтетические процессы. При уменьшении уровня АТР,наоборот,возрастает скорость энергетических.процессов при сопутствующем, снижения темпов различных биосинтезов. Т.о..специфичность чувствительности язо'энзимов МДГ к концентрациям и соотношениям ИАДН,НА4+,АТ5, АДФ дает возможность осуществлять грубую регуляцию различных метэболичеоких.проиесссв.путси воздействия на ее активность^ В литературе ииертся даяние,свидетельствующие о »ом,что в высших растениях стадия превращения малаге играет важную роль в регуляции оо'щей скорости 1;Т;С (, За«™ в* »1, 1977) ,9 ЭДГ определяет функциональное состоянии ыультиэнзинного комплекса (иоогв «г ш,' 1304). Кроме того,было исследовано влияние некоторых органических кислот и ионов одно- и двухвалентных металлов на активность изоэнзимов КДГ. Показано,что мвг+ и не входят в активный . центр и не явлнмтся специфичными к»£актораии ВДГ. изучено возможное участив иитохондриаяьного геноиа в регуляции биосинтеза изоэнзима МДГ из этого.компацкакта. Полученные предварительные результеты указывают на возможный мимхоадриэльный биоситей тянелой субьединицы этого белка.

Т.о. »проведанные исследования 11ДГ высгих растений позволили нам установить,что энзим в клетках регулируется с помощью механизмов, действующих га нескольких функциональных уровнях. Ка схема 2 представлена гипотетическая модель регуляции синтеза и активности растительной НАД+-МДГ.

Из рисунка следует,что НАД+-ВДГ представлена в растительной клетке множественными молекулярными формами,активность которых контролируется с, помоиью механизмов,действующих на нескольким уровнях оргзя.чзации айвой иатеряя. йэбиеательная регудкция активности изоэизинов ЩГ,л1кап«зоьэг.них в разных коипартиентах, позволяет клетка контролировать интенсивности отдельных метаболических процессов и подчинять- их протекание потрвблоогяи организма, Обнаруженное илсаниз.чы регуляции активности НАД+-адГ давт

.. ' ' -Табшта 5

Очистка изоэвзимовЦДГ из шиоиндриавьно-шоксисонэльаоЕ фракции шипа яндудароаеивяг

проростков кукурузы ■ . • ■ .

Оп«

Аг:тиввость:?эдаозкгивность Удельная Сдельная о0язз,3д. -¡включение :рздиовкти»т екгяэ- . :иапу1ъс/мид • :ность : лость ! -

:6ввха х

Растительный экстракт .

Йпдукпия Сусерпэонт

Вырадаванаэ Фракция китохонд-

за 0,5 £ . риЯ и гзкоксисси ■

палате Внсалигэние

сульфатов аилоняя

Гель-фильтрация .

-25

КОХ на ДЭД8- -целлюлозе

ЩГ X . а

1ИГЯ

адг и

22,0 238,3+7,3 243,5>+ИЛ 95220,0+1300,0 359,6+?,3 1,0+0,0

20,0 95,5+10,6 140,7+3,6' 67828,0^1560,0 707,3+57,2 1,5+0,1

1,2 100,9+7,1 113,2+1,1 2*869,0+9064, 218,7+10,1 1,1±0,Г'

1,2 37,211,3 75,5+1,7 6118,0+701,0 164,5+13,1 2,0*0,1

11,0 23,$т3,2 61,8+1,6 - 5551,0+356,1 249,9+16,2.2,6+0,3

5,5 0,9+0,3 3,5+0,6 2,4 ' 1,1+0,1 14,8+0,18,4 0,4+0,1 5,5+0,5 5,0' 0,2+0,0 3,9+0,4 •

510,0^50,1 566,6+100. 4,0+0,5 106,0+10,7 26,4+1,2 13,5+0,9.

134,0+6,0 670,0+30,0 19,5^2,0 ■

е.

'У * ■ » г Ч Н,М1

ь*/] Г«-щ _ I

1 'нним млт^ 1 £Й1 (»1

■ ,

1 } ., . • , п^гкцн

ч i!

1|Ч*« I

»«п.м.щтГт [,

1)1 . "«Г-

сдох

К2

П «имккети „„„„,

I 1 • та™«

I. ^""»'Л"""": N -И .»уд^у. ; ¡™

___ ___,

Ф I

* Ч ЯШИН,

¡Л/т

1Г4Ц||йАА1МЙ|Г

3

*1К>"'* ГЧИКСнЦШ |

УЛОВШа, ОБОЗНАЧЕНИЯ: активация; тср-гс ¡гекие: го£кояшке;Д.С.Л,-длкна светового дшг.Э.Я,-элехтрапсигчесхий потенвдал;ФС1-фотосистема 1* ФД-ферроредсксш;ТД-ткорелоксин;отЕс-огислЕтеш;

-коны одного и двухзалевтнах кеталлов;К.К.-каталитическая ш мтввадкя'.ЭШ-эле г тронно-транспортная цепь;8ЬдГ-культ«энэкнныя I осплекс белков ЦТЬ ивгадаяьтон);ДХМЙ-дкхлориетилмочевкна; ,

н е зв.КСаВОаЦ0ТаТ ,мал~малат* ® ~$0С$0гли1еРин0вая кисяотаД.А.-дЦ^ренцу.альная активация в онтсг&-

.возможность заключать,что втот.внэим играет важную роль в регуляции метаболизма ив сопряжении его функциональных блоков внутри клетки, С на nett точки эрения,иадатдегидрогенвэная система растительной клетки представляет собой вторичную сигнеяыгую 'систему клетка,передающую путем регуляции скорости потока метаболитов между еа коилв рт и он там н,информацню об з л е кт ро хии кч е ском и энергетическом потенциале и о метаболических потребностях организма. * , ■

■ ВЫВОДЫ

1. Получены гомогенные препараты лзофори МДГ (НАД1") из двух ВИДОВ растений: клещевины (Ricinus communis ) И кукурузы ( Z«» «уа)> Впервые выделена МДГ из глиоксясом,митохондрий и эгио-пластов эндосперма клещевины. Из иитка,кукурузы 'получена ■цило-плазмагическая МДГ. Разработан способ длительного хранения (8 месяцепрепаратов МДГ, в среде,содержащей 25 £ глицерина или tu tэхарозы,

2. Установлено,что функциональные единицы МДГ (НАД+) являют. ся молекулярными формами с дшерной или тетрамерной структурой.

Дамеры имеют иолекулярные массы от 65 до 85 «Да. Утиопластная МДГ представляет собой теграмер (IIS кДэ). ЦДГ из цитоплазмы (кудурузы) .глиоксисом'и этноплаотов (клещевины) имеют изологи-ч«скую структуру и состоят из идентичных субъединиц о иолепуляркой массой от 30 до 36 кДа. МитохонДриальнэя МДГ является гете-рологичосним динаром,состоящим из двух веиденгичных суСъединиц (42 и 35 кДа).

3. На основании исследованяИ аминокислотного состава,¿изияо-химических и кинетических характеристик установлено,что выделенные иаоформи МДГ являются истинными изоэнвиаэчи.т.е. гснзтпчэски детерминированными.белками. Изоэнзимы МДГ из эндосперма клепя вины различаются по целому ряду cboüctb.

Изучен активный центр и предложена схема мехоннэпа каталитического превращения для растительных ВДГ. В его состав входят два остатка аргинина и гисгидпнэ и по одному радикалу лизина и цистешш. Последняя аминокислота присутствует в активном центра митохондриальных белков. Пара гиотидин-лизин играет вохлу» роль в атаке и переносе гидрид-ионов водорода из молекул малата в А-стороне 4 пололенин никотин-анидного кольца.

5. Активность ЩГ обнаружена.в органах всех исследованных

растений. Установлена, что в онтогенезе растений динамика активности энзима имеет обще и специфичные черты, ваьисяище от ткаяоП, <от характера метаболизма на данной этапа развития,от физиологического состояния,а также от видовой принадлежности организма. Сильное возрастание ективнооти МДГ наблюдается через 3-5 дней после прорастания семян.

- S. В органах разншс видов растений обнаружены множественные молекулярные формы !*ДГ,имеющие различную субклеточную локализацию. Изоэнзимы МДГ локализуются в разных коыпартиентах клерки (цитоплазме,иитохондркпх,глноксисо11а)с,пероксисоиах,хлоропласта* (или этиопдасгах)). Характер распределения активности МДГ между . ними зависит от типа тканей и от вида растений.'Установлено,что наибольшая доля активности МДГ локализуется в цитоплазме (45-80 f>) и в митохондриях (10-30 %) растений.

7. Показано,что отличия в динамике активности МДГ разных видов растений имеют качественную основу, ЙзоэнзимянА споктр МДГ растений обладает видовой и тканевой специфичностью. Установлено, что характер иэознзшшого спектра УДГ в органах растений зависит от типе метаболизма,от физиологического состояния и от возраста организма. Обнаружена такяе зависимость кзоэнзимного спектра ЫДГ от продуктивности (содержания жиров или белков в семенах) и от генетической основы растений.

8. Экзогенный малат способен вызывать индуцированный синтез изоэнзкков адг в органах высших ростен^й.

9. Кегсубация растений в условиях анаэробиоза способна вызывать возрастание активности и изменения изоэнзимного спектра МДГ в их органах. Установлено,^то возрастание активности ад,при гипоксии происходит,главным образом,за.счет повышения каталитической эффективности некоторых ее изоэнэимов.

10. Показано, что в растительных клетках активность ЦДГ регулируется с помощью различных факторов (соединения). Важный вклад в регуляцию активности изоэнзимов ЗДГ вносят концентрации и отно-ыен;:н сопряга*иу»х агентов (ДТР/АДР;ИАД*"/Н,АДИ) в комяартментах клетки. Обнаружено,что некоторое органические кислоты (^умерат и малонат) к двух и одновалентные ионы метзлдэ (к*,м»*.с»г^,ваг+.к?г+

и т.д.) могут принимать участие н регуляции активности изо--лаэкмов ^ДГ. Отиочено.что Кзг+ И ипг+ не нвлпщтся абсолютно специ-^ячнцик ко|бкторзми МДГ, •

. Материалы диссертации опубликовани е работах: - *

*,1, Землянухин A.A. ,ЕприШ1ев А.Т.,ЛинеИр/ К.Л. Очистка', маяатдегидрогенааы /э щитка кукурузы //Труды У1 всесоюзной конференции ^fO. "Биологии кле тки".-Тбилиси.-1987 .-v.321-323.

2. Pinheln) {ter Carvalho M,A., Zemlytmukhln Л.Л., Eprinttxnv A. T. Ttuev- ' ïsiUr. of Maldte detgrdmeorneo aqUtity in plant cell //Abu tracte

tin« oC>Eas.-aaœe.-1-Je?.-Tli,12T. . '

3. Еприншв A.T. ,*'инеяру M, A,, Зубков S.Д. Субклетотяая локализация малетдегидрогенаэы:у bucevk растений //Тезисы д-ок-ладоз 1У ВсессозноВ'конф,мол.ученых по $изтопогни растителнвои .

' клетки,-«инск".-1990.-2.49.

• 4, Землянухин А,А,.Епринуэв А.Т.,Попова Т.Н./Мшейргу H.A. Ферментативная регуляция метаболизма ди и трм:арг5оиоа/х кислот в растительной к латке //Тезв сн. дог ладоз П съезда Всесоюзного общества физиологов, растения. Аквдомия иаук СССР.-кинск.-1990.-С.Зэ. ' . .

... 5, Епркнцев'АЛЧ^инеару *.А.,Землянухин A.A. ¿е(№еитвтив-ная! регуляция образования ata велеао-уксуекоя кислоты в различная хОмпаргсгентах растительной клетей //Тезисы докладов мет.рос.конф. по проблемам азотистого метаболизма.-Волгоград. 1SÖU,-сек.¡¿.-с*49.

б, SJ;l>.4ibtton of Kalkt« âchydregermeo eynthenle. in hl «ha г plant9,/ Finhslro de Carralho H.A., Zmlyan-ukhin A.A.* Erri.nt.se y i,T., StJcachivlU И.С, //Abstraeta 7th CoAffrt&J of FSSTP^-Pitraiflegla PieintAr».«t. -

S.-tert 2.-A 58—: .J31. '

Pinhilro Carv»lho K.A., Fprlnteev A .T., Ze*lyanukhi« A.A. Phjei-cal ani] ehcreleal jiropertles of №l*ta dchydroeenae* lao«rtt]rm*n fton caetor beaa «Ыоормт» //Aiystraote ?Oth Meeting of ГСЗЗ.-Budar»nt.-1990,- »140.

. 0. üvxaKpy и,А. .Землянухин A.A. ,Ьцриицев А.Т. ^чистка и свойства цитоплазматическоя мелатдегвдрогенозн из щитка кукурузы // Биологические науки.-1Э90.-Т.324, ' ? 12,-3.33-101,

9'. Землянухин A.A. ,Итог.ру H.A. ,Епрхнцев A,?. Uincuta и изоферментный спектр малатдегидрогенаэы 'Аетвуз.сб."Регуляция ' ферментативная активности у растений."-Горький.-19!?0.-С.9% ' .

аказ 156 от 6.04.91 г.» тирах 100 экз. Оормат GOxDO 1/16./ Объеы X п.д. Офсетная лаборатория В1У,