Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках E.coli

Летута, Ульяна Григорьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках E.coli
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках E.coli"

На правах рукописи

005048857

ЛЕТУТА УЛЬЯНА ГРИГОРЬЕВНА

Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках Е.соїі

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

з 1 ЯНВ 2013

Саратов 2012

005048857

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет» в Научно-образовательном центре биохимической физики наносистем.

Научный руководитель: Берлинский Виталий Львович

доктор физико-математических наук, заведующий кафедрой физики конденсированного состояния ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет»

Официальные оппоненты: Проскуряков Иван Игоревич

доктор физико-математических наук,

зав. лабораторией молекулярной спектроскопии

Института фундаментальных проблем биологии РАН

Щеголев Сергей Юрьевич

доктор химических наук, профессор, директор Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики РАН

Защита состоится « » _ 2013 года в /£.'30часов

на заседании диссертационного совета (Д.212.243.05) при Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, корпус 3, физический факультет СГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке им. В. А. Артисевич Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

Автореферат разослан " /¿> " 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета „у

доктор физико-математических наук, профессор Дербов

Общая характеристика работы Актуальность работы. Большинство химических элементов имеют стабильные изотопы, отличающиеся и массой, и магнитными характеристиками атомных ядер. Некоторые изотопы, например, 'Н, ,3С, 15N, 25Mg, 31Р, характеризуются наличием ядерных спинов и ядерных магнитных моментов и называются магнитными. Все бесспиновые изотопы немагнитны.

Различия атомных масс и магнитных свойств изотопов являются причиной масс-зависимых и магнитно-изотопных эффектов, соответственно. Известно множество масс-зависимых изотопных эффектов, проявляющихся как изменение скорости протекания химических реакций (Griffiths, 1998). Магнитно-изотопные эффекты в химии характерны только для радикальных реакций (Бучаченко, 1978). Они обусловлены, главным образом, влиянием ядерного магнитного момента на спиновую эволюцию радикальных пар (РП), судьба которых (внутриклеточная рекомбинация или внеклеточные реакции) определяется действием спиновых запретов и правил отбора.

Вплоть до открытия магнитно-изотопных эффектов в биохимии (Бучаченко, 2008) — в реакциях ферментативного фосфорилирования, - возможное влияние магнитных изотопов на живые организмы не предполагалось. Это было обусловлено несколькими причинами, главная из которых - отсутствие в живых организмах радикальных реакций с участием радикальных пар. Существуют свободно-радикальные биохимические реакции, подобные цепным неразветвленным радикальным реакциям (Тогауа, 2003). Но магнитные и спиновые эффекты в таких реакциях невозможны из-за отсутствия радикальных пар.

Открытие магнитного изотопного эффекта в реакциях ферментативного фосфорилирования для магнитного изотопа магния 25Mg2+ (Бучаченко и др., 2004), а также для 67Zn2+ (Бучаченко и др., 2010) и 43Са2+ (Бучаченко и др., 2011), показало, что скорость ферментативных реакций зависит от наличия ядерного магнитного момента у иона металла, находящегося в активном сайте фосфорилирующего энзима. До последнего времени все обнаруженные магнитно-изотопные эффекты ферментативного фосфорилирования наблюдались in vitro — на выделенных митохондриях и чистых ферментах, обогащенных изотопами. Однако открытым остаётся вопрос, лежащий в основе новой фундаментальной научной проблемы, -

влияют ли магнитные моменты атомных ядер на внутриклеточные процессы in vivo, на функционирование целого организма?

Основная цель работы: Установить влияние магнитного 25Mg и немагнитных 24Mg, 26Mg изотопов магния на жизнедеятельность целого организма на примере прокариотических бактериальных клеток Escherichia coli и теоретически обосновать возможность проявления магнитно-изотопных эффектов в живых организмах.

Задачи:

- получить магнитно-полевые зависимости констант скоростей ферментативных ион-радикальных реакций для Ag-механизма и механизма сверхтонкого взаимодействия ядерного спина и спина электрона, индуцирующих синглет-триплетную конверсию;

- оценить возможность использования магнитнополевых зависимостей этих констант для изучения механизма ферментативных реакций, для оценки констант скоростей элементарных актов ферментативных реакций и для определения химических и магнитных характеристик интермедиатов;

- получить экспериментальные зависимости роста бактериальных клеток E.coli в присутствии магнитного 25Mg и немагнитных 24Mg, 26Mg изотопов магния в питательной среде;

- экспериментально оценить влияние магнитного изотопа магния 25Mg на основные показатели роста и развития бактерий по сравнению с немагнитными изотопами 24Mg, 26Mg: константу скорости роста, колониеобразующую способность, константу скорости отмирания бактериальной культуры;

- исследовать влияние внутриклеточного обогащения изотопами магния на жизнеспособность клеточной культуры и её биохимический состав.

Положения, выносимые на защиту;

1. Спинзависимые ион-радикальные ферментативные реакции могут быть «первичным магниторецептором» в живых организмах, не требующим существования специального органа. Продукты этих реакций «превращают» эффекты ядерного спина и магнитного поля в «биохимический отклик» живых организмов.

2. Внешнее постоянное магнитное поле увеличивает величину эффекта магнитных изотопов химических элементов за счёт сверхтонкого взаимодействия 4

в слабых полях. Такие эффекты могут проявляться только в ферментативных реакциях, идущих с переносом одного или нескольких электронов, то есть с образованием ион-радикальных пар.

3. Константа скорости роста и колониеобразующая способность бактерий E.coli увеличиваются в присутствии магнитного изотопа магния 25Mg по сравнению с немагнитными изотопами.

4. Клетки E.coli, обогащенные магнитным изотопом магния 25Mg, при пересеве на новую питательную среду оказываются более жизнеспособными по сравнению с бактериями, обогащенными немагнитными изотопами 24,26Mg.

5. От типа изотопа магния - магнитный/немагнитный - зависит внутриклеточный элементный состав микроорганизмов Е. coli.

Научная новизна работы. В теоретической части работы рассмотрены два механизма синглет-триплетной конверсии ион-радикальных пар, образующихся в активном сайте ферментов во время реакции: Ag-механизм, обусловленный разностью g-факторов ион-радикалов, и СТВ-механизм, обусловленный сверхтонкими взаимодействиями неспаренных электронных спинов с ядерными спинами. Показано, что спинзависимые ион-радикальные ферментативные реакции в различных участках тел могут быть "первичным магниторецептором" в живых организмах, не требующим создания специального органа. Продукты этих реакций "превращают" эффекты ядерного спина и магнитного поля в "биохимический отклик" живых организмов. Получены зависимости скоростей ферментативных реакций от величины констант сверхтонких взаимодействий, от напряженности магнитного поля и от констант скоростей элементарных актов ферментативных реакций.

В ходе решения поставленной научной проблемы были получены экспериментальные результаты, доказывающие магнитно-изотопные эффекты магния 25Mg in vivo в клетках Ecoli: на константы скоростей роста и отмирания, на колониеоб-разующую способность и внутриклеточный элементный состав бактериальных клеток. Впервые экспериментально надежно и однозначно доказано, что магнитный изотоп 25Mg, находясь в составе живых клеток, влияет на их рост, развитие и жизнедеятельность, а его биологические эффекты отличаются от эффектов немагнитных изотопов 24,26Mg.

Научно-практическая значимость. Полученные экспериментальные данные и проведенные теоретические расчёты влияния магнитных полей на живые организмы открывает широкие горизонты для исследования действия многих жизненно важных элементов, имеющих природные стабильные магнитные изотопы, на внутриклеточные процессы. Подобные исследования станут фундаментом для новых научных направлений в рамках биофизики, физико-химической молекулярной и клеточной биологии - спиновой биохимии и спиновой микробиологии.

В ходе выполнения работ разработана методика приготовления питательных сред и культивирования микроорганизмов в присутствии изотопов магния, позволяющая выращивать бактерии с высоким внутриклеточным содержанием изотопов и имеющая большую практическую значимость для дальнейших исследований магнитно-изотопных эффектов. Получены патенты на способ повышения жизнеспособности клеток E.coli и способ изотопного обогащения.

Личный вклад соискателя. Автор участвовал в постановке задач, в получении всех теоретических результатов, самостоятельно проводил все эксперименты и обрабатывал результаты, участвовал в апробации работы.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на следующих международных и российских конференциях: The 12th ¡International symposium on spin and magnetic field effects in chemistry and related phenomena (Нидерланды, Нордвик, 10-15 мая 2011); 2, 3, 4th International conference on Magneto-science 2007 (Япония, Хиросима), 2009 (Нидерланды, Наймеген), 2011 (Китай, Шанхай&Сиань); IV, V Российско-Японский семинар «Магнитные явления в физикохимии молекулярных систем» (Оренбург, 2009-2010 гг.); 15-я, 16-ая, 18-ая Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (г. Москва, 20082012 гг.); 20, 21, 22, 23-й Международный симпозиум «Современная химическая физика» (г.Туапсе, 2008-2011 гг.). Работа выполнена в соответствии с грантами РФФИ № 09-03-09432, 10-03-01203, 10-04-96083, 11-03-09581 и в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на2009-2013 годы, ГК№ 02.740.11.0703, П207, 14.740.11.1193.

Публикации. Основные результаты работы опубликованы в 3 статьях и 16 тезисах докладов международных и всероссийских конференций.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, включая литературный обзор, оригинальные теоретические и экспериментальные результаты, выводов, списка цитируемой литературы. В конце каждой главы приведены основные результаты и выводы. Работа изложена на 106 страницах и содержит 46 рисунков.

Содержание работы

Во Введении обоснована актуальность работы, приведена структура диссертации, поставлена цель исследования и сформулированы основные задачи.

В Главе 1 дан обзор биологических функций магния, участвующего более чем в 300 ферментативных процессах. Представлены литературные данные о роли магния для жизнедеятельности всех живых организмов и функциональной значимости ионов магния для прокариотических микроорганизмов - бактерий. Описаны магнитно-изотопные эффекты в Са- и /п-зависимых ферментативных реакциях. Приведены литературные данные, обосновывающие ион-радикальный механизм ферментативного фосфорилирования с участием ядерных спинов магнитных изотопов. Описаны уже существующие применения магнитно-изотопных эффектов магния в медицинской практике, например, для лечения гипоксии миокарда.

В Главе 2 представлены результаты квантово-механических теоретических расчётов. Рассмотрены и СТВ-механизмы спиновой конверсии ион-

радикальной пары (ИРП), образующейся в активном сайте ферментов.

Для анализа влияния магнитного поля на ферментативные реакции использовалась идеализированная кинетическая схема такой реакции.

Здесь А и В - исходные диамаг-

ГД+ пот

1 ' 1 нитные частицы, которые в результате переноса электрона превращаются в синглетную ион-радикальную пару

[А' \ В' "]5 с константой скорости кх. Для синглетной ион-радикальной пары [А"+, В'"]5 возможны три канала эволюции:

1) обратный перенос электрона на акцептор с константой скорости к.\,

2) дальнейший перенос электрона или трансформация субстратов, приводящие к образованию продуктов с константой скорости к\

рГОсЬкЯв г д . + ,15

• 3) спиновая эволюция, переводящая синглетную ИРП в триплетное состояние [А'+, В"']т с частотой ш5т, определяемой магнитными взаимодействиями неспаренных электронных спинов.

Аналогично системе кинетических уравнений, используемых в обычной химической кинетике, была построена система уравнений для спиновых матриц

плотности р, характеризующих частицы на разных стадиях реакции. '¿рлв

- = -к,рлв +к_,Тг{Р,р' Р,)

(1)

i (2) dt P (3)

Здесь рлв - спиновая матрица плотности для исходных реагентов А и В всинглетном состоянии, а уравнение (1) описывает, соответственно, превращение исходных частиц, находящихся в активном сайте фермента; р1 - матрица плотности для ион-радикальных пар в синглетном и триплетном состоянии, а уравнение (2) описывает превращение ион-радикальных пар; рр - матрица плотности для продуктов реакции, и уравнение (3) описывает образование продуктов реакции; Ps- оператор проектирования в синглетное состояние, H - спиновый гамильтониан ион-радикальной пары.

Для расчёта магнитнополевых зависимостей констант скоростей ферментативных реакций впервые использовано квазистационарное приближение, что позволило считать скорость образования продуктов ферментативной реакции приближенно равной скорости расходования исходных реагентов. Поэтому вместо расчёта суммарной константы кр скорости образования продуктов рассчитывалась константа скорости исчезновения исходных частиц А или В. Таким образом, для расчёта констант скорости образования продуктов нам достаточно одного матричного элемента pis = Psp'Ps -

Показано, что для квазистационарного приближения (при t > (£,)"') количество синглетных ион-радикальных пар описывается выражением

pi(0 = (p/jsse"v , (4)

где - амплитуда количества ион-радикальных пар в синглетном состоянии -

находилась как решение системы алгебраических уравнений, получаемых из уравнения (2),

+Рст'Р*}-крст' + А,|ад = 0. (5)

При подстановке решения (4) в уравнение (1) получается

(б)

Уравнение (6) устанавливает связь константы скорости кр ферментативной реакции с константами элементарных процессов переноса электрона или разделения зарядов и с относительной «концентрацией» ион-радикальных состояний (Р'»,).«• Даже малые изменения количества синглетных ИРП способны оказать сильное влияние на константу кр и на скорость образования продуктов. Можно считать, что отношение констант к_л /к играет роль «биохимического усилителя», способного существенно увеличить эффект даже малых изменений количества ИРП, вызываемых действием магнитного поля.

Использование квазистационарного приближения позволило получить выражение для магнитнополевой зависимости константы скорости магниточувстви-тельного ферментативного процесса для Д§-механизма спиновой конверсии ИРП

кр(До)) _ к^1к{2 + к_,1к + {К(01к)г) к, ~ (2 + к^/к)(1 + к^/А + (Асо/к)2)

На рис.1 показана магнитнополевая зависимость константы скорости магни-точувствителыюго ферментативного процесса. Каждая из кривых на графике соответствует разным значениям отношения констант к_л / к . Верхняя кривая соответствует наименьшему значению отношения, нижняя - наибольшему. Здесь снова проявляется действие отношения констант скоростей обратной реакции и образования продуктов как «биохимического усилителя».

Рис. 1 Магнитнополевая зависимость к, '

Кривая 1 соответствует значению отношения кл!к = 0.1, кривая 2 - кл/к = 0.5, кривая 3 - k.i!k = 1

ла зависимость —-- имеет монотонный характер и возрастает при уве-

личении напряженности магнитного поля. При стремлении магнитного поля к бес-

м к

kJAœ)

конечности отношение -достигает предельного значения

кх ~ 2 + к_,/к (8) При определенных значениях констант к_, / к данная зависимость выходит на насыщение, и дальнейшее увеличение поля не будет влиять на скорость образования продуктов.

Экспериментальные магнитнополевые зависимости удобнее относить к значениям величин, наблюдаемым в нулевом магнитном поле. В данном случае это

эквивалентно нормированию функции (7) на величину М21 = _А_ При такой

к + к,

нормировке магнитнополевая зависимость принимает вид:

= ] +_к^АюУ/к'_

МО) (2 + к^/к)(1 + к_,/к + (А(0/к)2) (9)

Замечательная особенность этого выражения в том, что оно не зависит от константы скорости прямого переноса электрона кх. Несколько графиков магнит-нополевых зависимостей, нормированных таким образом, представлены на рисунке 2. Относительные изменения увеличиваются с ростом отношения констант к_,/к. Снова наблюдается эффективность влияния магнитного поля на организмы с большими значениями отношения *_,/*• В клетках константа скорости к опреде-

ляется не только свойствами фермента, но и зависит от многих других факторов, в том числе, от скорости сопряженных реакций, температуры и т.д. Неблагоприятные внешние условия способны уменьшать константу скорости к и увеличивать отношение ¡к. Но в таком случае, согласно уравнению (6), будет возрастать эффективность влияния спин-зависимых стадий на протекание ферментативных реакций. Следовательно, влияния внешнего магнитного поля и ядерного спина должны ярче проявляться в живых организмах, находящихся в неоптимальных внешних условиях. Если же изменение условий интенсифицируют ферментативные процессы, то соответствующее увеличение константы скорости к будет проявляться как ослабление эффектов внешнего магнитного поля.

Рис. 2 Магиитнополевая зависимость, нормированная на значение в нулевом магнитном поле. Кривая 1 соответствует значению отношения /(.¡/к = 0.1, кривая 2-к\/к=0.5, кривая 3 -к.\!к= I.

При анализе характерных точек, например, точки перегиба, получено, что уменьшение константы скорости к сдвигает магнитнополевую зависимость в сторону слабых магнитных полей. Очевидно, что в магнитных полях Н » Н,/2 скорости магниточувствительных ион-радикальных ферментативных процессов будут слабо зависеть от изменений сильного магнитного поля.

Для механизма сверхтонкого взаимодействия ядерного спина с электронным спином гамильтониан имеет вид:

Я = glp Н5] + Н522 + аУг1 = + + "V, (10)

где а - константа сверхтонкого взаимодействия соответствующего ядерного спина.

Для СТВ-механизма спиновой конверсии ИРП решение системы (1)-(3) с применением квазистационарного приближения принимает вид

М0»-! і *.*-,

иг а2 + 6)2

кг+а/2 + (Ог

(И)

.А2 4 [к2 +а2 +ш2\а2 +сл2) к* + (а(0 / 2)2 + к2 (а)2 +а2) Для построения магнитно-полевой зависимости констант скоростей ферментативного процесса были введены следующие обозначения

к к. к , а а а а а

Тогда

, ДіМ-, і

К 8д2 V2 +1

1 1 д2 +у2 + 1/2

.М2 4(Д2+У2 + ІХУ2 + І) Д4+(У/2)2+Д2(У2 + 1)

(12)

• (13)

к, "

График получаемой магнитно-полевой зависимости представлен на рисунке 3.

к Лео)

Г\

Рис. 3 Магнитнополевая зависимость

Кривая соответствует следующим значениям

Магнитнополевая зависимость г как видно из рисунка 3, быстро воз-

растает при у«1, то есть для малых значений величины со или слабых магнитных полей. Далее следует максимальное значение и медленный спад до определенного значения. То есть, при со —>оо данная зависимость выходит на насыщение и выражение (13) принимает вид:

М°°)=1 к,к_,ік2+а2 к, ~ 2к2 4к2+а2

(14)

Очевидно, что характер магнитнополевой зависимости константы скорости ферментативной реакции будет зависеть от соотношения констант прямого и обратного переноса электрона к1 и к.г и участвующего в процессе ядерного спина, то есть константы сверхтонкого взаимодействия. Для описания характера магнитно-полевой зависимости преобразуем выражение (13) следующим образом: J__1 + 8/12 2ц2(\-2Ц2)_ 1

к, )к1к.1 8р2+у2 + 1 1 + 4/і2 1 + 4ц2 д2+у2+Зд2/(1 + 4д2)

(15)

В полученном выражении первое и третье слагаемые представляют собой кривые Лоренца - обычную и «перевёрнутую» (рисунок 4 а) и б) соответственно). Второе слагаемое представляет некую поправку, так как не зависит от магнитного поля.

а) ____________б)

13! -1 \

1М 0 1 ? / " /

115 1.10 \ 3 \ \\ •0 2 ■0 > /

И5 ч. ■0 4 1

Рис. 4 Кривые Лоренца, описывающие слагаемые магнитнополевой зависимости констант скорости ферментативной реакции (15).

Кривая 1 соответствует значению ц=0.1; кривая 2 - ц=0.5; кривая 3 - ц=1

Максимальное значение кривых определяется соотношением константы сверхтонкого взаимодействия ядра и константы скорости самой реакции к/а. При к~ а и к> а магнитно-полевая зависимость принимает вид прямой. Для таких условий наблюдение магнитно-полевых эффектов в ферментативных реакциях становится невозможным. Для значений к < а магнитно-полевые эффекты в ферментативных реакциях могут быть обнаружены в слабых магнитных полях, где магнит-нополевая зависимость принимает вид, приведенный на рисунке 3.

Суммарное действие внешнего магнитного поля на конкретный живой организм будет зависеть: от внутриклеточного природного магнитно-изотопного содержания химических элементов; от степени участия таких изотопов в физико-химических стадиях ферментативных процессов; от условий протекания ферментативной реакции, прямым или косвенным образом влияющих на её константу скорости.

В Главе 3 описаны полученные магнитно-изотопные эффекты магния in vivo в клетках E.coli, свидетельствующие о влиянии ядерного спина магнитного изотопа 25Mg на внутриклеточные ферментативные процессы.

Материалы и методы

В качестве объекта исследований использовалась культура клеток Escherichia coli - музейный штамм K12TG1. Бактерии E.coli выращивались в минимальных синтетических питательных средах М9, содержащих на 1л дистиллированной воды: NH4CI - 2 г, 24,25'26MgS04 - 260 мг, глюкоза - 10 г, Na2HP04 - 12 г, КН2Р04 -6 г, NaCl - 1 г. Питательные среды различались только изотопной формой содержащегося в сульфате магния - немагнитные 24Mg, 26Mg, магнитный 25Mg и природный изотоп Mg магния. При приготовлении синтетической питательной среды М9 строго контролировался pH = 6.85 ± 0.15. Для приготовления сульфатов магния использовались изотопно-чистые оксиды 24MgO, 25MgO и 26MgO производства ФГУП «Электрохимприбор» с рекордно высоким изотопным обогащением 99.8, 98.8 и 97.7 атомных процентов, соответственно.

Музейный штамм Escherichia coli предварительно инкубировался в Lb-бульоне (Sigma Aldrich Со.) в течение 16 часов при температуре 37 °С. После клетки E.coli пересевались в среды М9 с 24Mg, 25Mg, 26Mg, соответственно. В качестве контроля использовалась питательная среда с природным содержанием изотопов Mg, то есть смесь изотопов в их природном соотношении. В одной из экспериментальных серий раствор с подобным соотношением изотопов был приготовлен искусственно из сульфатов изотопов магния для дополнительного контроля чистоты эксперимента.

При культивировании бактериальных клеток поддерживалась постоянная аэрация путём помещения сред с культурой бактерий на шейкер ST-3 ELMI. Скорость вращения платформы - 200 об/мин. Ростовые кривые (зависимости оптической плотности суспензий, характеризующей рост бактериальной культуры, от времени культивирования) получались турбидиметрическим методом с помощью измерения оптической плотности суспензий каждый час на спектрофлуори-метре «SOLAR 2203» на следующих длинах волн: 450, 492, 540 и 620 нм. Все исходные среды М9 исследовались масс-спектральными (Х-7, Thermo Elemental, США) и атомно-эмиссионными (ICAP-61, Thermo Jarrell Ash, США) методами ана-14

лиза на содержание следующих элементов: П, Ве, В, N8, М§, А1, Б!, Р, й, К, Са, Эс, Т1, V, Сг, Мп, Ре, Со, №, Си, 7п, О а. ве, Аэ, 8с: Вг, Г<Ь, 8 г У, 2г. Мо, ЫЬ, К и, Ш1, Сё, 1п, Эп, вЬ, Те, С5, Ва, Ра, Се, Рг, Ш, 8т, Ей, Ос). ТЬ, 1)у, Но, Ег, Тш, УЬ, Ри, НР, Та, \У, Яе, (Х 1г, Р1, Аи, Иё, Т1, РЬ, Вй ТЬ и и (ИПТМ РАН). Результаты исследований приведены на рисунке 5(а, б). Достоверных различий в содержании основных и примесных элементов в питательной среде не обнаружено. Это означает, что проявление обнаруженных биологических эффектов изотопов магния не связано с влиянием примесных элементов на жизнедеятельность бактерий. Наблюдаемые различия связаны, в первую очередь, с изменением хода метаболических процессов в бактериальных клетках в зависимости от типа - магнитный/немагнитный - изотопа магния.

I 1 М9 с !*Ыд

Рис. 5 Относительное содержание элементов питательных сред М9.

с(тМ§) - концентрация элементов в средах М9, где ш - обозначает атомную массу изотопа (24,25 или 26), добавляемого в соответствующую питательную среду. С(24М§) - концентрация элементов в питательной среде М9, содержащей изотоп магния

Для исследования влияния изотопов магния на стационарную фазу роста и на фазу отмирания бактериальной культуры применялся метод измерения коло-ниеобразующих единиц (КОЕ) с применением серийных разведений. Подсчёт КОЕ производился после 16 часов инкубации бактерий на ЬЬ-агаре при 37° С.

После 20 часов культивирования в магний-изотопных средах М9 клетки Е.соН были пересеяны (в эквивалентных количествах) на аналогичную среду М9, но совершенно не содержащую искусственно добавляемого магния, т.е. концентрация ионов магния составляла 0 моль/л (состав среды ЫН4С1 - 2 г. глюкоза -

10 г, Na2HP04 - 12 г, КН2Р04 - 6 г, NaCl - 1 г). Колониеобразующая способность измерялась через 24, 48, 72 часа после начала культивирования. Данный эксперимент уникален, так как на его результаты не могли повлиять различия в содержания примесных элементов в М9 - так как среда, в которой росла культура, одинакова для всех клеток. Этот простой эксперимент позволил определить, какой из изотопов магния наиболее эффективен для роста бактерий уже в качестве внутриклеточного элемента.

Все экспериментальные данные статистически обрабатывались с помощью прикладного программного пакета Origin 8.0 с применением критерия Стьюдента.

В результате проведения 10 независимых экспериментальных серий, 4 из которых были «double blind» (в каждой серии было минимум 2 повтора для каждого изотопа), были получены ростовые кривые для клеток E.coli (рисунок 6), отражающие различное влияние изотопов магния (магнитных и немагнитных) на рост микроорганизмов. Адаптационная фаза роста бактерий E.coli на средах с немагнитными изотопами магния 24,26Mg длилась не менее часа, как видно на экспериментальных ростовых кривых. Оптическая плотность культуры клеток E.coli, растущих на среде с магнитным изотопом магния 25Mg, уже на первом часу увеличилась вдвое, что свидетельствует об увеличении количества бактериальных клеток - микроорганизмы при пересеве на среду с 25Mg не нуждаются в длительной адаптации к новым условиям. Это означает, что магнитный изотоп магния оказывается более эффективным на начальном этапе роста бактериальной культуры по сравнению с немагнитными изотопами.

Рис. 6 Ростовые кривые клеток Е. coli, выращенных на питательных средах М9 с изотопами магния. 24Mg, 25Mg и 26Mg - пит. среда М9 с соответствующим изотопом магния; *Mg- с природным магнием;

Mg - с магнием, полученным

из смеси изотопов в их природном соотношении. Регистрация оптической плотности производилась

на длине волны 492 нм.

С помощью линейной и экспоненциальной аппроксимации ростовых кривых были определены характерные параметры - продолжительность адаптационной фазы (рисунок 7) и константа скорости роста бактериальной культуры (рисунок 8).

Рис. 7 Относительные значения продолжительности адаптационной фазы роста как функция изотопии магния. I, - продолжительность адаптационной фазы для клеток, выращенных на среде с ¡-м изотопом (24М^, 25М%, 26М$, *М§);

- продолжительность адаптационной фазы для клеток, выращенных на среде с природным магнием *М§.

Рис. 8 Относительные значения констант скорости роста для клеток как функция изотопии магния.

- константа скорости роста для клеток, выращенных на среде с 1-м изотопом (24М§, 251^, 2б1У^, или - константа ско-

рости роста для клеток, выращенных на среде с природным магнием *М§. Константы найдены с помощью экспоненциальной (1) и линейной (2) аппроксимации.

Как видно из графика (рис. 8), независимо от способа аппроксимации константа скорости роста для бактерий, растущих на средах с 25М§, оказывается достоверно выше на 10-15 % по сравнению с клетками, потребляющих в качестве питательного субстрата немагнитные изотопы магния. Качественно полученные экспериментальные зависимости совпадают с данными по влиянию магнитного изотопа магния на скорость ферментативного фосфорилирования (Бучаченко, 2004). Бактериальная культура при пересеве в среду М9 попадает в совершенно новые для неё условия, что является своеобразным стрессовым фактором. Во время короткой адаптации и начала экспоненциальной фазы функциональные системы перестраи-

—1-1-1--

25Мц

ваются для инициации активного деления. Именно на этом этапе скорость синтеза АТФ играет решающую роль - запуск большинства процессов, связанных с ростом и делением клетки, требует расхода энергии. То есть, полученный магнитно-изотопный эффект изотопа магния определяется, в том числе, и скоростью накопления бактериями достаточного количества макроэргических молекул АТФ, необходимого для активной жизни.

Другим важным микробиологическим показателем, характеризующим рост бактериальной культуры, является колониеобразующая способность (КОЕ). При подсчёте КОЕ на стационарной фазе роста и фазе отмирания бактерий были получены результаты, представленные на рисунке 9. Данные экспериментальные зависимости подтверждают полученную кинетику роста микроорганизмов -на среде с магнитным изотопом 25М§ колониеобразующая способность клеток Е.соП выше в 1,5-2 раза в различных экспериментальных сериях по сравнению с немагнитными изотопами 24^26Mg вплоть до третьего дня культивирования (рисунок 9). Присутствие 25Мё в питательной среде в виде трофического субстрата увеличивает жизнеспособность клеточной культуры. Её определяет накопленный клетками магний за цикл роста до стационарной фазы - после пересева таких клеток на новую питательную среду именно содержащийся в них магний становится основным источником двухвалентных ионов, необходимых для активации жизнеобеспечивающей деятельности многих ферментов.

Рис. 9 КОЕ клеток Е.соП на начальной фазе отмирания,

выращенных на питательных средах М9 с изотопами маг-

Т, дн

Рис. 10 Относительные значения констант скоростей отмирания клеток Е.соИ, как функция изотопии магния.

^ - константа скорости отмирания для клеток, выращенных на среде с ¡-м изотопом (24М& 25\^ или 26К^); к24м8 - константа скорости отмирания для клеток, выращенных на среде с изотопом магния 24Мё.

1.40 1.3S

1,00 0,95 0.90 0,65 0,80-

"Mg

Константа скорости отмирания бактериальной культуры, культивируемой на питательной среде с магнитным изотопом магния 25Mg, оказывается выше по сравнению с немагнитными изотопами 24,26Mg (рисунок 10). Это означает, что изменение хода метаболических процессов на стадии роста влечёт за собой неизбежные изменения и на стадии отмирания культуры. Константа скорости определялась как показатель убывающей экспоненциальной функции при аппроксимации кривых отмирания.

Необходимо отметить, что практически во всех экспериментах не наблюдалось достоверных различий между немагнитными изотопами магния 24Mg и 26Mg. Это говорит именно о магнитной природе обнаруженных эффектов изотопа 25Mg, не связанных с различием атомных масс изотопов.

После 20 часов культивирования на магний-изотопных средах бактерии были обогащены по соответствующему изотопу магния до 99,5 % по сравнению с исходной бактериальной культурой, выращенной на питательном бульоне Lb, как видно из данных таблицы 1.

Таблица 1 - Соотношение изотопов магния (%) в клетках E.coli после цикла культивирования на изотопных средах М9*

Изотоп Исходная культура Клетки, выращенные на среде М9 с 24Mg Клетки, выращенные на среде М9 с 25Mg Клетки, выращенные на среде М9 c26Mg

24Mg 87,8 99,5 6,6 10,0

25Mg 5,9 0,23 92,5 1,6

26Mg 6,3 0,23 0,87 88,4

* Погрешность определения от 1.2 % отн. для 95 % до 15 % для 0.5%

Цикл культивирования бактерий на питательных средах, содержащих изотопы магния в качестве питательного субстрата, приводит к практически полному замещению внутриклеточного магния на конкретный изотоп. Поэтому пересев таких изотопно-обогащенных клеток на питательную среду с нулевой концентрацией ионов магния покажет, насколько каждый из изотопов эффективен в качестве внутриклеточного элемента.

Измерение колониеобразующей способности при проведении такого эксперимента показало, что бактерии, обогащенные магнитным изотопом магния формировали большее количество жизнеспособных колоний по сравнению с немагнитными изотопами магния 24'26Mg в течение трёх дней (рисунок 11). С вероятностью, соответствующей степени обогащения бактерий изотопом магния (таблица 1), внутриклеточные системы, в том числе ферментативные, будут использовать именно конкретный изотоп. То есть все процессы, идущие в клетках, обогащенных по магнитному изотопу магния 25Мд, с вероятностью 92,5 % будут использовать именно его в качестве активного элемента. Увеличение колониеобразующей способности бактерий, содержащих свидетельствует о более эффективной работе ферментативных систем, использующих магний.

8»

200

Рис. 11 КОЕ клеток Е.соИ, обогащенных изотопами магния 2*М&, природным маг-

нием которые культивировались на питательной среде М9 с концентрацией ионов магния О ммоль/л

После цикла культивирования на питательных средах М9 с магнитным и немагнитными 2i^2('ЬЛg изотопами магния, клетки Е.соИ многократно исследовались с помощью масс-спектральных методов. Впервые была обнаружена зависимость между содержащимся в среде изотопом магния и внутриклеточным элемент-

ным составом зрелых микроорганизмов. На рисунках 12-14 приведены полученные экспериментальные данные.

у 1д1сае Р|,с- 12 Относительное содержание макроэлементов Ыа, К, Са в

клетках Е.соИ, после цикла культивирования на средах М9 с изотопами магния.

Рис. 13 Относительное содержание макроэлементов В, Р, Б в клетках Е.соИ, после цикла культивирования на средах М9 с изотопами магния.

■ м3

!4М=

-О- Мп -А-га

Рис. 14 Относительное содержание макроэлементов Мп, 7<п в клетках Е.соИ, после цикла культивирования на средах М9 с изотопами магния.

"*МВ

На рисунках 12-14 использовались следующие обозначения: С, — содержание элемента в клетках, выращенных на среде с ¡-м изотопом (24Р^, 25М§, 26М§); С.Мг -содержание элемента в исходной клеточной культуре, выращенной на питательной среде с природным соотношением изотопов магния.

Полученные зависимости элементного состава от присутствия изотопов магния в питательной среде представляют особый интерес. Отсутствие описаний подобных эффектов в литературе не позволяет сделать достоверные выводы о механизме подобного влияния. Очевидно, что роль магнитных изотопов в клетках не сводится к ускорению отдельных ферментативных процессов. Магнитно-изотопное обогащение клеток и изменение биологических процессов включает процессы внутриклеточной регуляции, что приводит к удалению одних химических элементов и накоплению других.

Основные результаты н выводы

1. Показано, что спинзавнсимые ион-радикальные ферментативные реакции могут быть "первичным магниторецептором" в живых организмах без создания специального органа. Продукты этих реакций "превращают" эффекты ядерного спина и магнитного поля в "биохимический отклик" живых организмов.

2. Получены зависимости скоростей ферментативных реакций от величины констант сверхтонких взаимодействий, от напряженности магнитного поля и от констант скоростей элементарных актов ферментативных реакций для двух механизмов спиновой конверсии: Ag-механизма, обусловленного разностью g-факторов ион-радикалов, и СТВ-механизма, обусловленного сверхтонкими взаимодействиями неспаренных электронных спинов с ядерными спинами.

3. Внешнее постоянное магнитное поле должно увеличивать величину эффекта магнитных изотопов химических элементов за счёт сверхтонкого взаимодействия в области слабых полей.

4. Получены надежные экспериментальные данные, доказывающие влияние магнитных моментов ядер изотопов магния на биологические процессы в клетках Escherichia coli. Константа скорости роста и колониеобразующая способность бактерий выше в присутствии магнитного изотопа магния 25Mg по сравнению с немагнитными изотопами.

5. Получены экспериментальные данные о влиянии внутриклеточного обогащения изотопами магния на жизнеспособность клеточной культуры и её биохимический состав. Бактерии, обогащенные магнитным изотопом магния 25Mg, при пересеве на новую питательную среду оказываются более жизнеспособными по сравнению с бактериями, обогащенными немагнитными изотопами 24,26Mg.

6. Однозначно доказано магнитное происхождение обнаруженных магнитно-изотопных эффектов: все они обусловлены различиями магнитных свойств ядер изотопов магния, а не различиями их масс.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах

1. Шевченко УХ., Берлинский В.Л. Ферментативные процессы как механизм биологической магниторецепции // Хим. физика.— 2011.— Т. 30, №6.— С. 78-83.

2. Кольтовер В.К., Шевченко УХ., Авдеева Л.В., Ройба Е.А., Берлинский В.Л., Кудряшова Е.А. Магнитно-изотопный эффект магния в живой клетке // Доклады Академии наук. — 2012. — Т. 442, № 2. — С. 272-274.

3. Шевченко У.Г., Авдеева Е.И., Берлинский В.Л. Биологические эффекты магнитного изотопа магния 25Mg в клетках Ecoli П Хим. физика. — 2012. — Т. 31, №7, —С. 1-8.

4. Shevchenko U.G., Berdinskiy V.L. Enzymatic phosphorylation as example of magnetosensitive spindependent process // ICMS2007, Hiroshima, Japan, 11-15 Nov. 2007. — P. 133.

5. Shevchenko U.G., Berdinskiy V.L. Enzymatic phosphorylation as example of magnetosensitive spindependent process // 15-я Междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2008", Москва, 8-11 апр. 2008 г. — С. 704.

6. Shevchenko U.G., Koltover V.K., Deryabin D.G., Berdinsky V.L. Magnesium isotope effect on enzymatic phosphorylation and growth of E. coli cells // IV Российско-Японский семинар "Магнитные явления в физикохимии молекулярных систем", г. Оренбург, 2009 г. — С. 21.

7. Шевченко У.Г., Кольтовер В.К., Дерябин Д.Г., Берлинский В.Л. Влияние изотопов магния на рост и развитие клеток Е. coli //21-й Междунар. симпозиум "Современная химическая физика", г. Туапсе, 2009 г. — С. 167.

8. Shevchenko U.G., Koltover V.K., Deryabin D.G., Berdinsky V.L. Magnesium isotope effect on enzymatic phosphorylation and growth of E. coli cells // 3d International Conference on Magneto science, Netherlands, Nijmegen, 2009.— P. 123.

9. Shevchenko U.G., RoybaE.A., TarasovaN.V. The Mg2+ and Zn2+ concentration effects on E. coli growth // V Российско-Японский семинар "Магнитные явления в физикохимии молекулярных систем", г. Оренбург, 2010 г. — С. 79.

10. Royba Е.А., Shevchenko U.G., Koltover V.K., Berdinskiy V.L. Magnetic

magnesium isotope effect on antibiotic resistance // V Российско-Японский семинар 24

"Магнитные явления в физикохимии молекулярных систем", г. Оренбург, 2010 г. —С. 76.

11. Шевченко У.Г., Ройба Е.А., Иванова М.Л. Влияние концентраций ионов металлов Mg2+ и Zn2+ на фазы роста Е. coli II 22-й Междунар. симпозиум "Современная химическая физика", г. Туапсе, 2010 г. — С. 284.

12. Ройба Е.А., Шевченко У.Г., Кольтовер В.К., Берлинский B.J1. Магнитные изотопные эффекты магния in vivo II 22-й Междунар. симпозиум "Современная химическая физика", г. Туапсе, 2010 г. — С. 247-248.

13. Ройба Е.А., Шевченко У.Г. Escherichia coli — тест-организм для исследования магнитно-изотопных эффектов в биологии II Материалы Междунар. науч. форума "Ломоносов-2011", г. Москва, 2011 г.

14. Авдеева Е.И., Шевченко У.Г., Ройба Е.А. Влияние магнитного и немагнитных изотопов на жизнедеятельность клеток Escherichia coli II Материалы Междунар. науч. форума "Ломоносов-2011", г. Москва, 2011 г.

15. Shevchenko U.G. Spin-depended enzymatic processes as the origin of biological magnetoreception // The 12th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena "Spin Chemistry Meeting 2011", Noord-wijk, Netherlands, 2011. — P. 110.

16. Royba E.A., Shevchenko U.G., Brudastov Yu.A. Escherichia coli — test-organism for studying of biological magnetic isotope effects // The 12th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena "Spin Chemistry Meeting 2011", Noordwijk, Netherlands, 2011. — P. 108.

17. Авдеева Е.И., Шевченко У.Г., Карандашев B.K. Влияние изотопов магния и постоянного магнитного поля на элементный состав бактерий Е. coli II 23-й Междунар. симпозиум "Современная химическая физика", г. Туапсе, 2011 г.

18. Шевченко У.Г. Биологические магнитно-полевые и магнитно-изотопные эффекты магния // Сб. тезисов XXIII симпозиума "Современная химическая физика". —2011. — С. 143.

19. Shevchenko U., Berdinskiy V., Avdeeva Е. Biological magnesium magnetic isotope and magnetic field effects on E. coli cells // Proc. of The 4th International conference on Magneto-science. — 2011. — P. 50.

Летута Ульяна Григорьевна

Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках Е.соИ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ЛР № 063109 от 04.02.1999 г. Подписано в печать 4 декабря 2012 г. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Формат 60x84/16. Усл.-печ. л. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ № 7236/2.

Отпечатано с готового оригинал макета 05.12.2012 г. ООО Агентство «Пресса» г. Оренбург, ул. Комсомольская, 45, тел.: (3532) 30-61-83 e-mail: presal999@mail.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Летута, Ульяна Григорьевна

Введение.

Глава 1 Магний в живых организмах.

1.1 Биологические функции магния.

§2+-зависимый метаболизм бактерий.

1.3 Синтез и гидролиз АТФ с участием ионов Mg2+.

1.4 Особенности метаболизма бактерий E.coli в присутствии ионов магния.

1.5 Магнитно-изотопные эффекты в биохимии.

1.5.1 МИЭ магния в процессах ферментативного фосфорилирования в митохондриях.

1.5.2 Фосфорилирование креатинкиназой в присутствии магнитного изотопа магния.

1.5.3 МИЭ магния для АТФ-синтазы.

1.5.4 МИЭ магния для глицерофосфаткиназы.

1.5.5 МИЭ магния для пируваткиназы.

1.5.6 МИЭ в биохимии для других изотопов непереходных металлов: 43Са и 67Zn.

1.6 Магнитно-полевые эффекты изотопов магния.

1.7 Применение магнитно-изотопных эффектов магния в медицине.

Глава 2 Спин-зависимые ферментативные реакции как механизм биологической магниточувствительности.

2.1 Внутриклеточные ферментативные реакции с переносом электрона как «первичный рецептор» магнитных полей.

2.2 Кинетическая схема ферментативной реакции с образованием ион-радикальной пары.

2.3 Применение квазистационарного приближения для нахождения магнитнополевых зависимостей констант скоростей ферментативной реакции. «Биохимический усилитель» ферментативной реакции.

2.4 Магнитнополевые зависимости констант скоростей ферментативной реакции Ag-механизм спиновой конверсии.

2.5 Магнитнополевые зависимости констант скоростей ферментативной реакции для СТВ-механизма спиновой конверсии.

2.6 Резюме.

Глава 3 Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках Escherichia coli.

3.1 Материала и методы.

3.2 Влияние изотопов магния на скорость роста и продолжительность адаптационной фазы клеток E.coli.

3.3 Влияние изотопов магния на колониеобразующую способность клеток E.coli.

3.4 Влияние внутриклеточного обогащения изотопами магния на рост бактерий E.coli.

3.5 Влияние изотопов магния на внутриклеточный элементный состав бактерий E.coli.

3.6 Резюме.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках E.coli"

Большинство химических элементов имеют стабильные изотопы, отличающиеся и массой, и магнитными характеристиками атомных ядер. Некоторые изотопы, например, 'Н, 13С, 15Н 25Мё, 31Р, характеризуются наличием ядерных магнитных моментов, или ядерных спинов, и называются магнитными. Все остальные бесспиновые изотопы немагнитны.

Различия атомных масс и магнитных свойств изотопов являются причиной масс-зависимых и магнитно-изотопных эффектов, соответственно. Известно множество масс-зависимых изотопных эффектов, проявляющихся как изменение скорости протекания химических реакций [1-2]. Магнитно-изотопные же эффекты в химии характерны только для радикальных реакций [3]. Они обусловлены, главным образом, влиянием ядерного магнитного момента на спиновую эволюцию радикальных пар (РП), судьба которых (внутриклеточная рекомбинация или внеклеточные реакции) определяется действием спиновых запретов и правил отбора.

Вплоть до открытия магнитно-изотопных эффектов в биохимии [4-8] - в реакциях ферментативного фосфорилирования, - возможное влияние магнитных изотопов на живые организмы не предполагалось. Это было обусловлено несколькими причинами, главная из которых - отсутствие в живых организмах радикальных реакций с участием радикальных пар. Существуют свободно-радикальные биохимические реакции, подобные цепным неразветвленным радикальным реакциям [9-11]. Но магнитные и спиновые эффекты в таких реакциях невозможны из-за отсутствия радикальных пар.

Открытие магнитного изотопного эффекта на синтез аденозитрифосфорной кислоты (АТФ) для магнитного изотопа магния 25Мё2+

67 43 2+

4-6], а также для Ъп [7] и 4Ха^ [8], показало, что скорость ферментативных реакций зависит от наличия ядерного магнитного момента у иона металла, находящегося в активном сайте фосфорилирующего энзима. Производство

АТФ для ферментов АТФ-синтетазы, креатинфосфаткиназы, пируваткиназы и глицерофосфаткиназы было в 2-4 раза выше в случае, когда в активном сайте присутствовал магнитный изотоп магния, цинка или кальция. Различий в скорости синтеза АТФ для немагнитных изотопов не наблюдалось, что исключает масс-зависимую природу наблюдаемых эффектов. Обнаруженные магнитно-изотопные эффекты в ферментативных реакциях привели к возникновению новой научной проблемы - влияния магнитных моментов атомных ядер на внутриклеточные процессы и, как следствие, на функционирование целого организма.

Первым был открыт магнитно-изотопный эффект, обусловленный различием магнитных свойств атомных ядер изотопов магния. Среди трёх стабильных изотопов магния 25М^, 2бМ§ (природное содержание, лг соответственно, 78.7, 10.1 и 11.2%) только ядро М^; имеет спин 1=5/2 и является магнитным, остальные два изотопа - немагнитны (см. таблицу 1).

Для объяснения действия магнитного момента ядра изотопа 25М£ на скорость синтеза АТФ был предложен ион-радикальный механизм ферментативной реакции [12]. Его суть заключается в образовании синглетной ион-радикальной пары в активном сайте фермента, содержащем три участника реакции - ион магния , аденозиндифосфорную кислоту (АДФ) и молекулу, являющуюся носителем третьей фосфатной группы (например, для креатинкиназы это креатин). Эта ион-радикальная пара образуется путём переноса электрона с концевой фосфатной группы АДФ на магний. Таким образом, становится возможным присоединение третьей фосфатной группы к АДФ, т.е. синтез АТФ. Однако на скорость этой реакции влияет обратный перенос электрона, регенерирующий исходные реагенты; этот процесс возможен только в синглетном состоянии пары. Именно здесь становится важным наличие спина ядра у магнитного изотопа иона магния: в результате

25 сверхтонкого взаимодействия ядерный спин изотопа переводит синглетную ион-радикальную пару в триплетное состояние, из которого обратный перенос электрона запрещён по спину и, следовательно, возможна только прямая ферментативная реакция синтеза АТФ. Повышение вероятности прямой реакции, в конечном итоге, приводит к увеличению выхода АТФ по сравнению со случаем, когда в активном сайте фермента находятся немагнитные изотопы.

Обнаруженные магнитно-изотопные эффекты ферментативного фосфорилирования наблюдались in vifro - на выделенных митохондриях и чистых ферментах, обогащенных изотопами. Однако открытым остаётся вопрос, формулирующий новую фундаментальную научную проблему, -влияют ли магнитные моменты атомных ядер на внутриклеточные процессы in vivo, на функционирование целого организма.

О ^

Цель данной работы - установить влияние магнитного Mg и немагнитных 24Mg, 26Mg изотопов магния на жизнедеятельность целого организма на примере прокариотических бактериальных клеток Escherichia coli и теоретически обосновать возможность проявления магнитно-изотопных эффектов в живых организмах.

В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

- получить магнитно-полевые зависимости констант скоростей ферментативных ион-радикальных реакций для Ag-механизма и механизма сверхтонкого взаимодействия (СТВ) ядерного спина и спина электрона, индуцирующих синглет-триплетную конверсию;

- экспериментально оценить влияние магнитного изотопа магния

Mg на основные показатели роста и развития бактерий по сравнению с немагнитными изотопами 24Mg, 26Mg: константу скорости роста, колониеобразующую способность, константу скорости отмирания бактериальной культуры;

Положения, выносимые на защиту:

2. Внешнее постоянное магнитное поле увеличивает величину эффекта магнитных изотопов химических элементов за счёт сверхтонкого взаимодействия в слабых полях. Такие эффекты могут проявляться только в ферментативных реакциях, идущих с переносом одного или нескольких электронов, то есть с образованием ион-радикальных пар.

3. Константа скорости роста и колониеобразующая способность бактерий E.coli увеличиваются в присутствии магнитного изотопа магния Mg по сравнению с немагнитными изотопами. лг

4. Клетки E.coli, обогащенные магнитным изотопом магния Mg, при пересеве на новую питательную среду оказываются более жизнеспособными по сравнению с бактериями, обогащенными немагнитными изотопами 24'26Mg.

Научная новизна работы.

В теоретической части работы рассмотрены два механизма синглет-триплетной конверсии ион-радикальных пар, образующихся в активном сайте ферментов во время реакции: Ag-механизм, обусловленный разностью g-факторов ион-радикалов, и СТВ-механизм, обусловленный сверхтонкими взаимодействиями неспаренных электронных спинов с ядерными спинами. Показано, что спинзависимые ион-радикальные ферментативные реакции в различных участках тел могут быть «первичным магниторецептором» в живых организмах без создания специального органа. Продукты этих реакций «превращают» эффекты ядерного спина и магнитного поля в «биохимический отклик» живых организмов. Получены зависимости скоростей ферментативных реакций от величины констант сверхтонких взаимодействий, от напряженности магнитного поля и от констант скоростей элементарных актов ферментативных реакций.

В ходе решения поставленной научной проблемы были получены экспериментальные результаты, доказывающие магнитно-изотопные эффекты магния Mg in vivo в клетках E.coli - на константы скоростей роста и отмирания, на колониеобразующую способность и внутриклеточный элементный состав бактериальных клеток. Впервые экспериментально надежно и однозначно доказано, что магнитный изотоп 25Mg, находясь в составе живых клеток, влияет на их рост, развитие и жизнедеятельность, а его биологические эффекты отличаются от эффектов немагнитных изотопов 24,26Mg.

Научно-практическая значимость.

Полученные экспериментальные данные и проведенные теоретические расчёты влияния магнитных полей на живые организмы открывает широкие горизонты для исследования действия многих жизненно важных элементов, имеющих природные стабильные магнитные изотопы, на внутриклеточные процессы. Подобные исследования станут фундаментом для новых научных направлений в рамках биофизики, физико-химической молекулярной и клеточной биологии - спиновой биохимии и спиновой микробиологии.

В ходе выполнения работ разработана методика приготовления питательных сред и культивирования микроорганизмов в присутствии изотопов магния, позволяющих выращивать бактерии с высоким внутриклеточным содержанием изотопов и имеющая большую практическую значимость для дальнейших исследований магнитно-изотопных эффектов. Получен патент на способ повышения жизнеспособности клеток Е.соИ.

В первой главе диссертации дан обзор биологических функций магния. Представлены литературные данные о роли магния для жизнедеятельности всех живых организмов и функциональной значимости ионов магния для прокариотических микроорганизмов - бактерий. Описаны обнаруженные группой российских учёных магнитно-изотопные эффекты в ферментативных реакциях для ионов магния, кальция и цинка. Приведены литературные данные, обосновывающие ион-радикальный механизм ферментативного фосфорилирования с участием ядерных спинов магнитных изотопов. Описаны уже существующие применения магнитно-изотопных эффектов магния в медицинской практике лечения гипоксии миокарда.

Во второй главе рассмотрены два механизма спиновой конверсии ион-радикальной пары, образующейся в активном сайте ферментов: Д^- механизм, обусловленный разностью зеемановских взаимодействий электронных спинов с внешним магнитным полем, и СТВ-механизм, обусловленный влиянием ядерного спина магнитного изотопа. Приведены теоретические расчёты констант скоростей ферментативных реакций с использованием метода спиновых матриц плотности для обоих механизмов. Впервые использовано и описано квазистационарное приближение применительно к биохимическим ферментативным реакциям. Показано, что соотношение констант скоростей ферментативных процессов, а также значение константы сверхтонкого взаимодействия влияет на проявление магнитно-изотопных и магнитно-полевых эффектов в живых организмах. Приведены полученные аналитические магнитно-полевые зависимости констант скоростей ферментативных реакций, идущих по ион-радикальному механизму, для зеемановского взаимодействия электронных спинов и сверхтонкого взаимодействия ядерного спина со спином электрона. Обоснована возможность существования нового универсального механизма биологической магниточувствительности, обусловленной влиянием магнитных моментов ядерных спинов изотопов химических элементов на элементарные стадии внутриклеточных ферментативных реакций.

В третьей главе описаны впервые полученные магнитно-изотопные эффекты магния in vivo в клетках E.coli. Приведены экспериментальные ростовые кривые, отражающие влияние магнитного изотопа магния на скорость роста бактериальных клеток по сравнению с немагнитными изотопами. Описаны экспериментальные исследования проявления магнитно-изотопных эффектов магния на колониеобразующую способность, отмирание бактерий и внутриклеточных биохимический состав. Обоснована магнитная природа всех обнаруженных эффектов в клетках E.coli и их достоверность. Представлены уникальные экспериментальные данные зависимости внутриклеточного обогащения бактерий изотопами магния и жизнеспособности бактериальной культуры, дополнительно свидетельствующие о чувствительности живых организмов к наличию магнитного момента у ядер изотопов химических элементов.

В конце диссертации перечислены основные результаты и выводы, и приведён список литературы.

Работа выполнена в соответствии с грантами РФФИ № 09-03-09432, 1003-01203, 10-04-96083, 11-03-09581 и в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, ГК № 02.740.11.0703, П207, 14.740.11.1193.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Летута, Ульяна Григорьевна

Заключение

1. Показано, что спинзависимые ион-радикальные ферментативные реакции могут быть «первичным магниторецептором» в живых организмах без создания специального органа. Продукты этих реакций «превращают» эффекты ядерного спина и магнитного поля в «биохимический отклик» живых организмов.

Mg, при пересеве на новую питательную среду оказываются более жизнеспособными по сравнению с бактериями, обогащенными немагнитными

24,26» к изотопами ' Mg.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Летута, Ульяна Григорьевна, Оренбург

1. Griffiths, Н. Stable isotopes. Integration of biological, ecological and geochemical processes / H. Griffiths. Oxford, UK: Bios scientific publishers, 1998.

2. Melander, L. Reaction rates of isotopic compounds / L. Melander, Jr.W. Saunders.-N.Y.: Wiley, 1980.

3. Бучаченко, A.JI. Магнитные и спиновые эффекты в химических реакциях / А.Л. Бучаченко, Р.З. Сагдеев, К.М. Салихов. Новосибирск: Наука, 1978.

4. Buchachenko, A.L. / A.L. Buchachenko, D.A. Kouznetsov, S.E. Arkhangelsky et al. // Doklady Biochem. Biophys. 2004. - Vol. 396. - P. 197.

5. Buchachenko, A. L. Magnetic isotope effect of magnesium in phosphoglycerate kinase phosphorylation / A. L. Buchachenko, D.A. Kouznetsov, S.E. Arkhangelsky, M.A. Orlova, A.A. Markaryan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2005.-Vol. 102.-P. 10793-10796.

6. Buchachenko, A.L. Magnetic isotope effects in chemistry and biochemistry / A.L. Buchachenko. New York: Nova Science Publishers, Inc., 2009. - 105 p.

7. Buchachenko, A.L. A specific role of 43Ca in the enzymatic ATP synthesis / A.L. Buchachenko, D.A. Kouznetsov, N.N. Breslavskaya, // Am. J. Biotechnol. Mol. Sci. 2011. - Vol. 1(1).-P. 30.

8. Banerjee, R. Radical carbon skeleton rearrangements: catalysis by coenzyme В12-dependent mutases/ R. Banerjee //Chem Rev. 2003. - Vol. 103. -P. 2083.

9. Toraya, Т. Radical catalysis in coenzyme B12-dependent isomerization (eliminating) reactions / T. Toraya // Chem Rev. 2003. - Vol. 103. - P. 2095.

10. Fontecave, M. Biological radical sulfur insertion reactions / M. Fontecave, S. Ollagnier-de-Choudens, E. Mulliez // Chem Rev. 2003. - Vol. 103. -P. 2149.

11. Бучаченко, А. Л. Новые механизмы биологических эффектов электромагнитных полей / А.Л. Бучаченко, Д.А. Кузнецов, В.Л. Берлинский // Биофизика. 2006. - № 51 (3). - С.545.

12. Ленинджер, А. Биохимия / А. Ленинджер. М.: Мир, 1976. - 631 с.

13. Алешин, С.В. Вещества жизни: кальций, магний и витамин D / С.В. Алешин. -М.: Орто.ру, 2004. 132 с.

14. Чистяков, Ю. В. Химия элементов в биологических системах / Ю. В. Чистяков. Иркутск: Изд-во ИГХТУ, 2004.

15. Jaouen Ed. G. Bioorganometallics. Biomolecules, Labeling, Medicine. -Wiley-VCH: Weinheim, 2006.

16. Благой, Ю.П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами / Ю.П. Благой. М.: Наука, 1998.

17. Schmuck, С. Highlights in Bioorganic Chemistry: Methods and Applications / C. Schmuck, H. Wennemers. Wiley: VCH, 2004.

18. Andreini, C. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles / C. Andreini et al. // Biol. Inorg. Chem. 2008. - Vol.13. -P.1205-1218

19. Seo, J. W. Magnesium Metabolism / J. W. Seo, T. J. Park, // Electrolyte & Blood Pressure. 2008. - Vol. 6. - P. 86-95.

20. Cowan, J. A. The Biological chemistry of magnesium; VCH publishers / J. A. Cowan. Inc.: New York, 1995.

21. Webb, M. The utilization of the magnesium by certain Gram-positive and Gram-negative bacteria / M. Webb // J. Gen. Microbiol. 1966. - Vol. 43. - P. 401-409.

22. Hmiel, S.P. Magnesium transport in Salmonella typhimuriam: characterization of magnesium influx and cloning of a transport gene / S.P. Hmiel, M.D. Snavely, C.G. Miller, M.E. Maguire // J. Bacteriol. 1986. - Vol. 168. - P. 1444-1450.

23. Silver, S. Active transport of magnesium in Escherichia coli / Silver S., // Proc. Natl. Acad. Sei. 1969. - Vol. 62. - P. 764-771.

24. Smith, R.L. Membrane topology of a P-type ATPase: the MgtB Mg2+ transport protein of Salmonella typhimurium / R.L. Smith, M.E. Maguire // Miner Electrolyte Metab. 1993. - Vol. 19. V.266-216.

25. Smith, R.L. Microbial magnesium transport: unusual transporters searching for identity / R.L. Smith, M.E. Maguire // Molecular Microbiology. 1998. -Vol. 28(2).-217-226.

26. Lusk, J.E. Magnesium and the growth of Escherichia coli / J.E. Lusk, E.P. Kennedy // Journal of Biological Chemistry. 1968. - Vol. 243. - P. 2618-2624.

27. Gunter, T. Phospholipids of Escherichia coli in Magnesium Deficiency / T. Gunter, L. Richter, J. Schmalbeck. Berlin: Freie Universität Berlin, 1974.

28. Мойса, JI. H. Математическое моделирование кривых роста штамма Escherichia coli — продуцента рекомбинантного белка 3-галактозидазы / Л. Н. Мойса, В. А. Чиляков // Мол. Биотехнологии. 2004. - Т. 20 (6). - С. 546-558.

29. Sosunov, V. Unified two-metal mechanism of DNA synthesis and degradation by DNA polymerase / V. Sosunov, E. Sosunova, A. Mustaev, I. Bass, V. Nikiforov, A. Goldfarb // EMBO. 2003 - Vol. 22. - P.2234^14.

30. Westover, K.D. Structural basis of transcription: nucleotide selection by rotation in the RNA polymerase II active center / K.D. Westover, D.A. Bushnell, R.D. Kornberg // Cell. 2004. - Vol. 119. - P.481 -^89.

31. Yamell, W. Mechanism of intrinsic transcription termination and antitermination / W. Yarnell, J. Roberts // Science. 1999. - Vol. 284. - P. 611-615.

32. Wang, D. Structural basis of transcription: role of the trigger loop in substrate specificity and catalysis / D.Wang, D.A. Bushnell, K.D. Westover, C.D. Kaplan, R.D. Kornberg // Cell. 2006. - Vol. 127. - P. 941-954.

33. Nudler, E. /E. Nudler //Rev. Biochem. 2009.-Vol. 78.-P. 335-361.

34. Epshtein, V. / V. Epshtein, C. Cardinale, A. Ruckenstein, S. Borukhov, E. Nudler // Mol. Cell. 2007. - Vol. 28. - P. 991-1001.

35. Steitz, T.A. / T.A. Steitz // Harvey Lect. 1997-1998. - Vol. 93. - P. 75-93.

36. Основы биохимии / А. Уайт, Ф. Хендлер, Р. Смит и др. М.: Мир, 1981.-520 с.

37. Рэкер, Э. Биоэнергетические механизмы / Э. Рэкер. М.: Мир, 1967. -221 с.

38. Албертс, Б. Молекулярная биология клетки: В 2-х т. Т.1 - 2-е изд. / Б. Албертс, Д. Брей, Дж. Льюис и др. - М.: Мир, 1994. - 405 с.

39. Николе, Д.Д. Биоэнергетика: Введение в хемиосмотическую теорию / Д.Д. Николе. М.: Мир, 1985. - 3 51 с.

40. Noji, Н. Direct observation of the rotation of FrATPase / H. Noji, R. Yasuda, M. Yoshida, Kinosita K. // Nature. 1997. - Vol. 386. - P. 299-302.

41. Тихонов, A.H. Трансформация энергии в хлоропластах -энергопреобразующих органеллах растительной клетки / А.Н. Тихонов // СОЖ. -1996.-№ 6.-С. 24-32.

42. Тихонов, А.Н. Молекулярные преобразователи энергии в живой клетке / А.Н. Тихонов // СОЖ. 1997. - № 7. - С. 10-17.

43. Тихонов, А.Н. Молекулярные моторы / А.Н. Тихонов // СОЖ. -1999.-№6.-С. 8-16.

44. Abrahams, J.P. Structure at 2,8А Resolution of FrATPase from Bovine Heart Mitochondria / J.P. Abrahams, A.G.W. Leslie, R. Luter, J.E. Walker // Nature. 1994.-Vol. 370.-P. 621-628.

45. Виноградов, А.Д. Преобразование энергии в митохондриях / А.Д. Виноградов // СОЖ. 1999. - № 9. - С. 11-19.

46. Goldberg, A. Magnesium binding by Escherichia coli ribosomes / A. Goldberg // J. Mol. Biol. 1966. - Vol. 16. - P. 663.

47. Richardson, С. С. / С. C. Richardson, C. L. Shildkraut, Ii. V. Aposhian, A. Kornberg // Biol. Chem. 1964. - Vol. 239. - P. 222.

48. Chamberlin, M. Deoxyriboucleic acid-directed synthesis of ribonucleic acid by an enzyme from Escherichia coli / M. Chamberlin, P. Berg // Proc. Nat. Acad. S. 1962. - Vol. 48. - P. 81.

49. Lusk, J. E. Magnesium and the growth of Escherichia coli / J. E. Lusk, R. J. P. Williams, E.P. Kennedy // The Journal Of Biological Chemistry 1968. -Vol. 243(10).-P. 2618.

50. Mccarthy, B. J. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli / В. J. Mccarthy // Biochim. Biophys. Acta. 1962. -Vol. 55.-P. 880-888.

51. Marchesi, S. L. Magnesium starvation of Aerobacter aerogenes / S. L. Marchesi, D. Kennell // Biochimica et biophysica acra. 1967. - Vol. 55. - P. 880888.

52. Kennell, D. Magnesium starvation of Aerobacter aerogenes. II. Rates of nucleic acid synthesis and methods for their measurement / D. Kennell, A. Kotoulas, //Journal of Bacteriology 1967. - Vol. 83. - P. 345-356.

53. Gunther, Т. / Т. Gunther, P. Mariss // Zeitschrift fur Naturforschung -1968.-Vol. 23 b.-P. 334-338.

54. Natori, S. The turnover of ribosomal RNA of Escherichia coli in a magnesium-deficient stage / S. Natori, R. Nozawa, D. Muzuno // Biochim. Biophys. Acta 1966. - Vol. 114 - P. 246.

55. Бучаченко, A.JI. Магнитные и спиновые эффекты в химических реакциях / А.Л. Бучаченко, Р.З. Сагдеев, K.M. Салихов. Новосибирск: Наука, 1978.-337 с.

56. Merli, A. / A. Merli, A. Szilagyi, B. Flachner, G. Rossi, M. Vas // Biochemistry.-2002.-Vol. 41. P. 111 - 118.

57. Бучаченко, A.JI. Магнитный изотопный эффект и обогащение изотопов в фотохимических реакциях / А.Л. Бучаченко, В.Ф. Тарасов, В.И. Мальцев //Ж. физ. химии. 1981. - № 55. - С. 1649-1660.

58. Tarasov, V.F. Radio induced 12С/ ,3С magnetic isotope effect / V.F. Tarasov, E.G. Bagryanskaya, Y.A. Grishin, R.Z. Sagdeev, A.L. Buchachenko // Mendeleev Commun. 1991. - № 1. - C. 85 - 93.

59. Бучаченко, А.Л. Второе поколение магнитных эффектов в химических реакциях / А.Л. Бучаченко // Усп. химии. 1993. - Т. 62. - С. 1139 -1145.

60. Бучаченко, А.Л. Спиновый катализ новый тип катализа в химии / А.Л. Бучаченко, В.Л. Берлинский // Усп. Химии. 2004. - Т. 73. - С 1123 - 1131.

61. Зельдович, Я.Б. Магнитно-спиновые эффекты в химии и молекулярной физике / Я.Б. Зельдович, А.Л. Бучаченко, Е.Л. Франкевич,// УФН. 1988. - Т. 155(1). - С. 3-44.

62. Buchachenko, A.L. On the magnetic field and isotope effects in enzymatic phosphorylation / A.L. Buchachenko, N. Lukzen, B. Pedersen // Chem. Phys. Letters. 2007. - Vol. 434. - P. 139-143.

63. Buchachenko, A.L. Dependence of mitochondrial ATP synthesis on the nuclear magnetic moment of magnesium ions / A.L. Buchachenko, D.A. Kuznetsov, S.E. Arkhangelsky, M.A. Orlova, A.A. Markaryan // Cell Biochem. Biophys 2005. -V. 43. - P.243-252.

64. Kouznetsov, D.A. / D.A. Kouznetsov, S.E. Arkhangelsky, A. Berdieva, P. Khasidov, M.A. Orlova // Isotopes Environ. Health Stud. 2004. - Vol. 40 - P. 221.

65. Бучаченко, A.JT. / A.JI. Бучаченко, Д.А. Кузнецов, С.Е. Архангельский, М.А. Орлова, А.А. Маркарян, А.Г. Бердиева, П.З. Хасидов // Докл. РАН. 2004. - Т.396. - С. 828.

66. Buchachenko, A.L. Magnesium isotope effects in enzymatic phosphorylation / A.L. Buchachenko, D.A. Kouznetsov, N. N. Breslavskaya, M.A. Orlova // J. Phys. Chem. B. 2008. - Vol. 112. - P. 2548-2556.

67. Buchachenko, A.L. Spin biochemistry: intramitochondrial phosphorylation is a magnesium nuclear spin controlled process / A.L. Buchachenko, D.A. Kouznetsov, S.E. Arkhangelsky, M.A. Orlova, A. Markaryan // Mitochondrion. -2005.-№5(1).-P. 67-89.

68. Buchachenko, A. L. Magnetic field affects enzymatic ATP synthesis / A. L. Buchachenko, D. A. Kuznetsov // J. Am. Chem. Soc. 2008. - Vol. 130. - P. 12868-12869.25

69. Buchachenko, A.L. The porphyrin-fullerene nanoparticles: Mg magnetic isotope effect / A.L. Buchachenko, D.A. Kuznetsov // European J. of Medicinal Chemistry. 2008. - Vol. 36. - P. 833-844.

70. Амиршахи, Н. / Н. Амиршахи, Р.Н. Аляутдин, С. Саркар, С.М. Резаят, М.А. Орлова, И.П. Трушков, A.JI. Бучаченко, Д.А. Кузнецов // Российские нанотехнологии, 3 2008. - № 9/10. - С 967-975.

71. Wiltschko, W. The magnetite-based receptors in the beak of birds and their role in avian navigation / W. Wiltschko, R. Wiltschko // J. Comp. Physiol. A. -2005.-Vol. 191.-P. 675.

72. Rodgersa, C.T. Chemical magnetoreception in birds: The radical pair mechanism / C.T. Rodgersa, P. J. Hore // PNAS. 2009. - Vol. 106(2). - P. 353.

73. Blakemore, R. Magnetotactic bacteria / R. Blakemore // Science. -1975.-Vol. 190(4212).-P. 377.

74. Schüler, D. (Ed.) Magnetoreception and magnetosomes in bacteria / D. Schüler. Berlin: Springer, 2007. -Vol. 3. 319 p.

75. Lohmann, K. J. Animal behaviour: Magnetic-field perception / K. J. Lohmann // Nature. 2010. - Vol. 464. - P. 1140.

76. Johnsen, S. Magnetoreception / S. Johnsen, К. J. Lohmann // Nature Reviews. Neuroscience. 2005. - Vol. 6. - P. 703.

77. Johnsen, S. Magnetoreception in animals / S. Johnsen, К. J. Lohmann // Physics Today. 2008. - Vol. 10. - P. 29.

78. Steiner, U.E. Magnetic field effects in chemical kinetics and related phenomena / U.E. Steiner, Т. Ulrich // Chem Rev. 1989. - Vol. 89. - P. 51.

79. Banerjee, R. Introduction: Radical Enzymology / R. Banerjee // Chem Rev. 2003. - Vol. 103. - P. 2083.

80. Fontecave, M. Biological radical sulfur insertion reactions / M. Fontecave, S. Ollagnier-de-Choudens, E. Mulliez // Chem Rev. 2003. - Vol. 103. -P. 2149.

81. Richter, O.-M. H. Cytochrome c-oxidase structure, function, and physiology of a redox-driven molecular machine / O.-M. H. Richter, В. Ludwig // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. - 2003. - Vol. 147. - P. 47.

82. Бучаченко, A. JI. Стабильные радикалы / А. Л. Бучаченко, А. М. Вассерман М.-Наука, 1973.

83. Serres, М. Genomics and Metabolism in Escherichia coli / M. Serres, M. Riley // Prokaryotes 2006. - Vol. 1. - P. 261-274.

84. Методы общей бактериологии: В 3-х т. Т.1. / Под ред. Герхардта А.-М.: Мир.- 1983, 536 с.

85. Варфоломеев, С.Д. Биокинетика / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. -М.: Гранд, 1999. С. 546.

86. Практикум по микробиологии / Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Изд. 2-е, перераб. и доп. - М.: Колос. - 1979, 216 с.

Информация о работе

Летута, Ульяна Григорьевна
кандидата физико-математических наук
Оренбург, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках E.coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы