Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лектины оболочки пыльцевого зерна Nicotiana tabacum L. и их роль в активации прорастания

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Лектины оболочки пыльцевого зерна Nicotiana tabacum L. и их роль в активации прорастания"

003484455

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правах рукописи

Лазарева Екатерина Алексеевна

Пектины оболочки пыльцевого зерна Ы'юоИапа 1аЬасит 1_. и их роль в активации прорастания

Специальность 03.00.12 — физиология и биохимия растений

2 6 НОЯ 20Со

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003484455

Работа выполнена на кафедре физиологии растений Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат биологических наук, доцент

Ермаков Игорь Павлович

Ковалёва Лидия Валентиновна Глазунова Клавдия Павловна

Ведущая организация: Главный Ботанический сад имени Н.В. Цицина

Российской Академии Наук

Защита состоится 11 декабря 2009 г. в 15.30 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, к. 12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

Факс: (495)939-43-09.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « }> 2009

года

Учёный секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук М.А. Гусаковская

Актуальность. В современных исследованиях механизмов регуляции развития растительных клеток большое внимание уделяют сигнальным системам, которые обеспечивают запуск морфогенетических программ внеклеточными лигандами (Hiscock, Allen, 2008). Поведение мужского гаметофита покрытосеменных растений, в том числе на этапе его перехода в активное физиологическое состояние в прогамную фазу оплодотворения, включает подобные механизмы. При этом важную роль играют белки и пептиды, которые диффундируют из пыльцевого зерна в окружающую среду. Они участвуют в процессах взаимодействия пыльцевых зёрен друг с другом и с клетками рыльца, но вместе с тем с помощью таких лигандов вегетативная клетка и пыльцевая трубка могут осуществлять мониторинг своего состояния и готовности к выполнению своих функций.

Особый класс белков, которые могут выступать в качестве внеклеточных лигандов, составляют лектины — белки, специфически и обратимо взаимодействующие с углеводными детерминантами без их модификации. Исследования последних лет, проведенные на клетках животных, показали, что лектины участвуют в контроле внутриклеточного транспорта и эндоцитоза, регулируют процессы адгезии (межклеточные и клетки к её матриксу), узнавания и миграции клеток, осуществляют позитивный и негативный контроль ростовых процессов и тем самым контролируют дифференциацию тканей и органов (Gabius et al., 2004). Быстрое накопление знаний в области исследования лектинов животных привело к формированию концепции "углеводного кода". Сформулирована новая парадигма поливалентных белок-углеводных взаимодействий с образованием супрамолекулярных ансамблей, осуществляющих трансдукцию сигналов (Garner, Baum, 2008).

Вопрос о роли лектинов в регуляции прорастания пыльцевого зерна до настоящего времени не решён, хотя уже давно обсуждается в литературе (Southworth, 1975; Dumas et al., 1984). Данные о влиянии экзогенных лектинов на прорастание немногочисленны и противоречивы. Вопрос об эндогенных лектинах пыльцевого зерна почти не изучен. Есть сведения о лектинах, прочно связанных с оболочкой (Carratu, Giannattasio, 1990; Ковалева и др., 1999). Однако с точки

зрения участия в запуске прорастания, наибольший интерес представляют подвижные белки внеклеточного матрикса, которые могли бы взаимодействовать с гликопротеинами плазмалеммы.

Цели и задачи исследования. Цель работы — выявить водорастворимые лектины оболочки и установить их роль в регуляции активации и прорастания пыльцевого зерна на примере ШсоНапа ¡аЬасит Ь. Для её достижения были поставлены следующие задачи.

• Изучение действия экзогенного лектина конканавалина А (Кон А) на активацию и прорастание пыльцы.

• Изучение роли водорастворимых компонентов оболочки (диффузатов) пыльцевого зерна табака в регуляции запуска его прорастания.

• Выявление лектинов в составе диффузатов оболочки методом гемагглютинации.

• Выделение лектинов из диффузатов оболочки пыльцевого зерна методом аффинной хроматографии.

• Изучение действия выделенных лектинов на запуск активации и прорастание пыльцевого зерна.

Научная новизна. Впервые обнаружено действие экзогенного лектина на величину мембранного потенциала и внутриклеточный рН растительной клетки. Установлена взаимосвязь между прорастанием пыльцевого зерна и гиперполяризацией плазмалеммы его вегетативной клетки.

Показано, что диффузаты оболочки пыльцевого зерна включают лектины, существенно влияющие на активацию и прорастание пыльцы. Эти эндогенные регуляторные лектины впервые выделены и охарактеризованы.

Практическая значимость работы. Представленная работа является фундаментальным исследованием сложной системы регуляции прорастания пыльцевого зерна. Полученные данные могут быть использованы для разработки подходов к оптимизации условий опыления у сельскохозяйственных растений

с целью повышения их продуктивности. Результаты работы могут быть использованы в курсах лекций по физиологии и эмбриологии растений.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на семинарах кафедры физиологии растений, доложены на международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2003, 2004, 2006); на V и VI съездах общества физиологов растений (Пенза, 2003; Сыктывкар, 2007); на IV международной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2005); на I международной школе для молодых учёных «Эмбриология и Биотехнология» (Санкт-Петербург, 2005); на XIX Международном конгрессе по половому размножению растений «From gametes to genes» (Будапешт, 2006); на II и III международных школах для молодых учёных «Эмбриология, Генетика и Биотехнология» (Уфа, 2007; Саратов, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего работгг(из них на иностранных языках). Работа изложена на ^ страницах, содержит в экспериментальной части 3 таблицы и 15 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы рассмотрена роль пептидов и белков оболочки пыльцевого зерна в его прорастании и во взаимодействии пыльцевых зёрен между собой и с клетками пестика. Обсуждены функции лектинов у растений. Проанализированы работы, посвященные изучению влияния лектинов на прорастание пыльцы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлись пыльцевые зёрна табака Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana SRI. Растения выращивали в климатической камере (25°С, 16-часовой световой день). Собранную пыльцу хранили при -20°С. Жизнеспособность пыльцевых зёрен контролировали, окрашивая их флуоресцеиндиацетатом.

Диффузаты (водорастворимые компоненты) оболочки пыльцевых зёрен получали, инкубируя пыльцевые зёрна, предварительно промытые гексаном, в среде прорастания (СП), которая включала 1,6 мМ Н3В03, 3 мМ Ca(N03)2, 0,8 мМ MgS04 и 1 мМ KN03 в 25 мМ Mes-Трис-буфере или 20 мМ Трис-НС1-буфере (рН 5,9). Продолжительность инкубации составляла 15 мин при 0°С. После чего отделяли диффузаты от клеток центрифугированием и последующей фильтрацией через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Контрольные измерения активности цитозольного фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (спектрофотометрия при X = 340 нм) подтвердили отсутствие белков цитозоля в составе диффузатов.

Метод гемагглютинации с эритроцитами кролика использовали для выявления лектиновой активности. Реакцию агглютинации проводили в иммунологических плашках с U-образными лунками. Пектиновую активность определяли визуально по степени агглютинации. Для установления углеводной специфичности лектинов диффузатов пробы предварительно инкубировали с тестируемым углеводом, после чего к пробе добавляли эритроциты.

Выделение лектинов из диффузатов проводили на колонках методом аффинной хроматографии на двух сорбентах: сефадексе G-200 и а,0-метил-маннопиранозиде, иммобилизованном на агарозе (ММП-Агароза). Элюцию белков, связавшихся с сефадексом, проводили при рН 2,0 (30 мМ НС1). Белки, связавшиеся с ММП-Агарозой, элюировали 0,5 M ММП. Концентрацию белка во фракциях и диффузатах определяли флуориметрически с использованием красителя на белок NanoOrange или метода дот-блот с окрашиванием белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране, кумасси R-350.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (ДЦС-ПААГ) проводили в соответствии с методом Лэммли (Laemmli, 1970). Полученные гели окрашивали 0,4% раствором AgN03. Анализ гелей проводили с использованием программы OneDscan.

Пыльцевые зёрна культивировали в жидкой СП, которая была дополнена 10% сахарозой. Для выявления действия диффузатов и выделенных лектинов оболочки на активацию и прорастание пыльцы в качестве тест-культуры использовали суспензии с низкой концентрацией клеток (770 кл./мл). Такие культуры характеризуются низким прорастанием и способны реагировать на действие ростовых факторов стимуляцией прорастания (Chen et al., 2000). В качестве контроля использовали культуру с высокой их концентрацией (105 кл./мл). Действие конканавалина А на пыльцу изучали в культуре с концентрацией 105 кл./мл. Число проросших пыльцевых зёрен оценивали через 1 ч после гидратации.

Величину внутриклеточного рН и мембранный потенциал вегетативной клетки пыльцевого зерна определяли методами количественной флуоресцентной микроскопии. Пыльцевые зёрна окрашивали потенциал-зависимым анионным красителем DiBAC4(3) (бис-(1,3-дибутилбарбитуровой кислоты) триметин оксонол) в течение 10 мин. Расчёт абсолютного значения мембранного потенциала (Е) проводили по формуле Е = (RT/F) • ln(I/I0), где I - интенсивность флуоресценции пыльцевого зерна в исследуемой пробе; ¡о - интенсивность флуоресценции клеток, полностью деполяризованных посредством фиксации (по Emri et al., 1998 с модификациями). Для определения величины внутриклеточного рН использовали краситель-индикатор рН BCECF-AM (ацетоксиметилового эфира 2',7'-бмс-(2-карбоксиэтил)-5(и-б)-карбокси-флуоресцеин). Оценивали отношение (R) интенсивностей рН-зависимой (^-возб = 494 нм) к рН-независимой (квт5 = 445 нм) флуоресценции окрашенных пыльцевых зёрен. Калибровочную кривую, связывающую величину R и рН, строили, используя раствор BCECF в буфере с диапазоном значений рН от 6,0 до 7,6 (Матвеева и др., 2003).

Цитологический анализ проводили с использованием моторизованного микроскопа Axioplan2 imaging МОТ, оснащенного цифровой камерой AxioCam HRc. Получение и анализ изображений осуществляли с помощью пакета программ AxioVision 4.5. Часть данных получена на микроскопе Leitz-Orthoplan, снабжённом блоком PLOEMOPAK.

Статистическая обработка данных. Все опыты проводили не менее чем в пяти повторностях. Достоверность различий рассчитывали с помощью /-критерия Стьюдента (р < 0,01 или р < 0,05). На рисунках представлены средние значения и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Действие Кон А на прорастание и активацию пыльцевого зерна

Пыльцевые зёрна инкубировали с экзогенным лектином Кон А в течение 10 мин, после чего их отмывали и культивировали в среде без Кон А. Такое кратковременное воздействие Кон А на начальном этапе активации стимулировало прорастание пыльцевых зёрен (Рис. 1). С увеличением концентрации Кон А его эффект постепенно возрастал. Данный эффект был обусловлен специфическим связыванием лектина с углеводными детерминантами, поскольку конкурентный сахар 0,1 М а,0-метил-маннопиранозид (ММП) подавлял действие Кон А (100 мкг/мл) на прорастание на 90 %.

Кон А, мкг/мл

Рис. 1. Влияние Кон А на прорастание пыльцевых зёрен табака.

Таким образом, стимулирующее действие Кон А на прорастание реализуется, по-видимому, на начальном этапе активации. Этот вывод был подтверждён при изучении действия Кон А на такие показатели активации пыльцевого зерна, как гиперполяризация плазмалеммы и увеличение внутриклеточного рН, которые, наряду с интенсификацией дыхания, реорганизацией внутриклеточных структур, активацией ферментных систем и транспортных процессов, определяют функциональную активацию клетки при выходе из состояния покоя (Матвеева и др. 2003; Брейгина и др., 2009).

а -15

Контроль Кон А Кон А+ММП

ю 2

1 10 100 1000 Кон А, мкг/мл

Рис. 2. Влияние Кон А на величину мембранного потенциала вегетативной клетки пыльцевого зерна:

(а) гиперполяризация плазмалеммы вегетативной клетки пыльцевого зерна в зависимости от концентрации Кон А;

(б) подавление эффекта Кон А (100 мкг/мл) в присутствии ММП (0,1 М).

Пыльцевые зёрна культивировали в присутствии Кон А в течение 10 мин, одновременно окрашивая их потенциал-зависимым флуоресцентным красителем 01ВАС4(3). Полученные препараты микроскопировали. Показано, что Кон А вызывает гиперполяризацию плазмалеммы (Рис. 2 а).

С увеличением концентрации Кон А происходило постепенное снижение мембранного потенциала вплоть до -32 мВ при концентрации Кон А 1 мг/мл, что в 2 раза превышает значение в контроле (-16 мВ). Изменения мембранного потенциала в зависимости от концентрации Кон А (Рис. 2 а) зеркально отражали влияние этого лектина на прорастание (Рис. 1): коэффициент корреляции между величиной мембранного потенциала и числом проросших пыльцевых зёрен г = -0,96 (р<0,01).

Эффект Кон А был специфичным, поскольку присутствие в среде инкубации 0,1 М ММП полностью снимало его влияние на мембранный потенциал (Рис. 2 б).

Аналогичным образом нами было изучено влияние кратковременного воздействия Кон А (5 мин) на величину внутриклеточного рН вегетативной клетки пыльцевого зерна, которую оценивали с помощью красителя индикатора рН

ВСЕСР-АМ. Кон А (100 мкг/мл) вызывал возрастание этой величины на 0,3 ед. по сравнению с контролем (Рис. 3). ММП (0,1 М) и в этом случае полностью подавлял действие Кон А.

7.4

X

f

{

{

6.6

Контроль Кон А Кон А+ММП

Рис. 3. Влияние Кон А (100 мкг/мл) на величину внутриклеточного рН вегетативной клетки пыльцевого зерна и подавление эффекта Кон А в присутствии ММП (0,1 М).

Таким образом, проведённые эксперименты показали, что экзогенный глюкозо/маннозо-специфичный лектин Кон А стимулирует активацию и прорастание пыльцевого зерна табака. Эти результаты хорошо соотносятся с данными о том, что Кон А вызывает активацию клеток животных, наиболее ранними проявлениями которой являются гиперполяризация плазмалеммы (Tatham, Delves, 1984) и увеличение внутриклеточного рН (Hesketh et al., 1985). Рассмотренные результаты демонстрируют участие в запуске прорастания пыльцы гликоконъюгатов плазмалеммы, с которыми могут взаимодействовать лектины — экзогенный Кон А или гипотетические эндогенные лектины оболочки. Выявление этих лектинов стало целью нашей дальнейшей работы.

2. Действие диффузатов оболочки на активацию и прорастание пыльцевого

Анализ действия диффузатов на тест-культуры с низкой концентрацией пыльцевых зёрен выявил их влияние на прорастание (Рис. 4, 5). В первой серии опытов диффузаты присутствовали в среде на протяжении всего периода инкубации (1 ч) (Рис. 4). При этом был обнаружен выраженный оптимум количества диффузатов в среде (26 мкг белка/мл), при котором они эффективно

зерна

стимулировали прорастание. В дальнейшем мы использовали диффузаты в концентрации от 20 до 30 мкг белка/мл. Высокие концентрации диффузатов в среде (100 мкг белка/мл) практически полностью подавляли прорастание.

Таким образом, в составе диффузатов из оболочек пыльцы присутствуют физиологически активные вещества. Предположив, что их действие на прорастание реализуется на начальном этапе активации пыльцевого зерна, мы использовали ранее разработанные в модельных экспериментах с Кон А подходы для проверки этой гипотезы.

О 25 50 75 100 Диффузаты, мкг белка/мл

Рис. 4. Влияние диффузатов оболочек на прорастание пыльцевых зёрен. Длительное воздействие диффузатами (1 ч).

10 кл./мл 770 КЛ./МЛ

770 кл./мл + диффузаты

Рис. 5. Действие диффузатов оболочки на прорастание пыльцевых зёрен. Кратковременное воздействие диффузатами (10 мин).

Пыльцевые зёрна культивировали с диффузатами (21 мкг белка/мл) в течение 10 мин, после чего их переносили в среду без диффузатов. Из результатов, представленных на рисунке 5, видно, что такое воздействие на тест-культуру приводило к двукратному увеличению числа проросших пыльцевых зёрен, тем самым достигался уровень прорастания в контроле с высокой концентрацией клеток. Таким образом, и кратковременное (Рис. 5), и длительное (Рис. 4) воздействие диффузатами стимулировало прорастание пыльцевых зёрен в равной мере. Из этого следует, что стимулирующий эффект

диффузатов на прорастание определяется их действием на ранние стадии активации.

Ранее на пыльце петунии уже наблюдали стимулирующий эффект диффузатов на прорастание пыльцы (КлгЬу, УэбП, 1979). Полученные нами данные подтверждают эти данные и уточняют время действия диффузатов — это ранний этап активации пыльцевого зерна. Вместе с тем, мы можем исключить из рассмотрения белки трифины, поскольку в наших опытах трифина была удалена до начала эксперимента.

Концентрация диффузатов, мкг белка/мл

О 1 10 100 1000

Рис. 6. Влияние диффузатов оболочки на величину мембранного потенциала вегетативной клетки пыльцевого зерна.

Для выявления действия диффузатов на величину мембранного потенциала плазмалеммы вегетативной клетки их добавляли в тест-культуру пыльцевых зёрен одновременно с потенциал-зависимым красителем 01ВАС4(3). После 10 мин инкубации обнаруживалась гиперполяризация плазмалеммы, степень которой росла с увеличением концентрации диффузатов, достигая -63 мВ при концентрации диффузатов 240 мкг белка/мл (Рис. 6). Стоит отметить, что диффузаты в концентрации более 100 мкг белка/мл практически полностью подавляли прорастание пыльцы (Рис. 4). Для того, чтобы ответить на вопрос, связано ли это с нарушением ионного гомеостаза, действием ингибиторов прорастания, присутствующих в составе диффузатов, или иными причинами, необходимы дополнительные исследования.

Таким образом, нами впервые получены данные, свидетельствующие о наличии в оболочке пыльцевого зерна регуляторных факторов, стимулирующих его активацию. Данные о действии диффузатов на величину мембранного потенциала плазмалеммы вегетативной клетки позволяют предполагать, что они могут напрямую или опосредованно модулировать работу её ион-транспортных белков.

Изменения мембранного потенциала строго контролируются клеткой и определяются активностью ион-транспортных систем плазмалеммы. Экзогенные лектины, в частности Кон А, способны влиять на ионные потоки и вызывать гиперполяризацию плазмалеммы клеток животных (Mahaut-Smith et al., 1991; Lai et al., 2003; Wang et al., 2006). В основе обусловленной действием Кон А и диффузатами гиперполяризации, возможно, лежат сходные механизмы регуляции, основанные на лектин-углеводных взаимодействиях. Обнаруженное в данной работе сходство эффектов Кон А и диффузатов позволяет предположить наличие в составе диффузатов лектинов, сходных с Кон А по углеводной специфичности и действию на прорастание пыльцы.

3. Выявление лектинов в диффузатах

Для выявления лектиновой активности диффузатов использовали общепринятый метод гемагглютинации, в основе которого лежит способность поливалентных лектинов взаимодействовать с гликанами на поверхности эритроцитов млекопитающих, в результате чего происходит их «склеивание». Оседая на дно U-образной лунки, такие сшитые лектинами клетки формируют диффузное пятно, тогда как в отсутствие лектина клетки собираются в компактную точечную структуру.

Использование этого метода позволило выявить присутствие лектинов в диффузатах (Табл. 1). Эффект постепенно снижался по мере разведения пробы и полностью исчезал при концентрации 50 мкг белка/мл. Способность диффузатов агглютинировать эритроциты позволяет предполагать наличие в их составе поливалентных лектинов (моновалентные лектины не способны к агглютинации) (Gabius et al., 2004).

Агглютинирующую активность, наряду с лектинами, проявляют таннины (в пыльце не обнаружены), некоторые фенолы, липиды и некоторые ионы двухвалентных металлов (ОаЬшБ е1 а1., 2004). Для того чтобы выявить возможный вклад в гемагглютинацию низкомолекулярных веществ, диффузаты фракционировали методом ультрафильтрации с порогом разделения 10 кДа. Было обнаружено, что низкомолекулярная компонента диффузатов не способна к агглютинации.

Табл. 1. Выявление лектиновой активности пыльцевых диффузатов в тесте гемагглютинации и обнаружение в их числе гликопротеинов, образующих комплекс с экзогенным лектином Кон А, неактивный в этом тесте.

Анализируемая проба Концентрация белка в серии двукратных разведений диффузатов, мкг/мл

800 400 200 100 50 0

Диффузаты +++ +++ ++ + - -

Диффузаты + Кон А (5 мкг/мл) +++ +++ ++ - + +++

+++ — максимальная лектиновая активность,--отсутствие агглютинации

Попытка выявить углеводную специфичность изучаемых лектинов, подобрав сахарид, способный подавить вызванную ими агглютинацию эритроцитов, не дала положительного результата. Мы исследовали действие ММП, глюкозы, арабинозы, галактозы, рамнозы, сахарозы, лактозы, раффинозы, взятых в концентрации 0,1 М, смеси двух Сахаров (глюкоза и ММП), а также водорастворимого декстрана (50 мг/мл). Однако ни один из указанных углеводов не подавлял лектиновую активность диффузатов.

Отрицательные результаты определения углеводной специфичности можно объяснить присутствием в диффузатах нескольких лектинов с различной специфичностью или же тем, что эти лектины специфичны к сложным гликанам. Ранее были обнаружены прочно связанные с оболочками пыльцевого зерна лектины, которые существенно различались по углеводной специфичности. Некоторые из них специфически взаимодействовали с гликопротеинами (муцином, тиреоглобулином и фетуином) и не проявляли сродства к моно-и дисахаридам (Саггай, ^аппаКазю, 1990). Другие лектины были специфичны

14

к D-глюкозе и некоторым другим простым сахарам (Ковалева и др., 1999). Углеводную специфичность лектина, секретируемого пыльцевой трубкой табака, при тестировании моно- и дисахаридов установить не удалось (Ильченко, 1988).

Для последующей идентификации выявленных лектинов, а также для дальнейшей работы с ними важно знать, являются ли они гликопротеинами. Ответ на этот вопрос был получен в результате изучения взаимодействия диффузатов с Кон А, который прочно связывается гликанами гликопротеинов (Hirabayashi, Kasai, 2002). С этой целью к диффузатам добавляли Кон А и оценивали лектиновую активность полученной смеси (Табл. 1). В диапазоне концентраций диффузатов в пробах от 800 до 200 мкг белка/мл добавление Кон А не влияло на агглютинацию. Однако при разведении диффузатов до концентрации 100 мкг/мл агглютинирующая активность смеси снижалась. Это означает, что все лектины диффузатов связались с Кон А с образованием комплекса, неспособного агглютинировать эритроциты. При дальнейшем разведении пробы, как и следовало ожидать, проявлялась агглютинирующая способность Кон А. Полученные данные свидетельствуют о том, что выявленные в составе диффузатов лектины являются гликопротеинами, в состав которых входят остатки глюкозы и/или маннозы.

Эксперименты с очисткой диффузатов от гликопротеинов на колонке с Кон А, иммобилизованном на сефарозе 4В (Кон А-сефароза), подтвердили этот вывод. В результате связывания с Кон А диффузаты (200 мкг белка/мл), прошедшие через колонку, полностью теряли способность агглютинировать эритроциты (Рис. 7).

Рис. 7. Исследование агглютинирующей активности диффузатов, прошедших через колонку с Кон А-сефарозой. Отрицательный контроль на аутоагглютинацию -раствор 150 мМ NaCI (рН 7.0). Положительный контроль - Кон А (5 мкг/мл).

Контроли:

отрицательный

Диффузаты

положительный -»-

Üjjljll ' ^^

Диффузаты после колонки с Кон А-сефарозой

Таким образом, в результате анализа легковымываемых белков оболочки пыльцевого зерна обнаружены эндогенные поливалентные лектины, являющиеся гликопротеинами.

4. Выделение водорастворимых лектинов оболочки пыльцевого зерна методом аффинной хроматографии и анализ их действия на активацию и прорастание

Метод аффинной хроматографии позволяет осуществить быстрое выделение лектинов на углевод-презентирующих носителях, в том числе из неочищенного материала. В качестве аффинных сорбентов были выбраны сефадекс G-200 (декстран с низкой степенью сшивки) и ММП-Агароза (ММП, иммобилизованный на агарозе). Эти сорбенты часто применяют для выделения глюкозо/маннозо-специфичных лектинов (Bezerra et al., 2006; Nagano et al., 2008).

Выделение лектинов на сефадексе G-200 и их анализ

В ходе процедуры выделения лектинов диффузаты наносили на колонку, после чего колонку промывали и элюировали связавшиеся белки. Предварительные эксперименты показали непригодность D-глюкозы (0,2 и 0,5 М) для элюции. Возможно, искомые лектины проявляют специфичность к более крупным олигосахаридным фрагментам в составе сефадекса. Декстран — высокомолекулярный гомополимер D-глюкозы с разнообразным количеством боковых цепей, присоединенных через а-1,2, а-1,3 или а-1,4 связи, что усложняет поиск конкурентного сахарида. В таких случаях для элюции нередко используют растворы с низкими значениями рН (Gabius et al., 2004). В настоящей работы белки, связавшиеся с сефадексом, элюировали 30 мМ НС1 (рН 2,0).

Характерная кривая выделения лектинов представлена на рисунке 8 а. Лектины элюировались в виде одного пика. Их массовая доля составляла 4-5 % от общего количества белка, нанесённого на колонку. Таким образом, в оболочках 1 мг негидратированных пыльцевых зёрен содержится как минимум 0,02 мкг водорастворимых лектинов, проявляющих сродство к декстрану.

Электрофоретический анализ фракции выделенных лектинов в 11 % ДДС-ПААГ (Рис. 8 б) показал наличие в её составе пяти белков с молекулярными

массами 64, 58, 51, 50 и 35 кДа. Разнообразие белкового состава нефракционированных диффузатов иллюстрирует дорожка 1 на том же рисунке. Сопоставление этих двух белковых проб позволяет говорить о достаточно высокой избирательности очистки белков на сефадексе.

10 20 N фракции

Рис. 8. Очистка пектинов, присутствующих в диффузатах оболочки пыльцевого зерна, с помощью сефадекса 6-200:

(а) выход белковых фракций при аффинной хроматографии диффузатов;

(б) электрофоретический анализ фракции выделенных пектинов; дорожка 1 - диффузаты; дорожка 2 - выделенные лектины (фракция № 27); справа указаны рассчитанные молекулярные массы пектинов (кДа); слева - положение белков-маркёров (кДа).

Анализ этой фракции показал, что очищенные на сефадексе белки при условии высокого их разведения агглютинируют эритроциты (Табл. 2). Возможно, это связано с тем, что в составе фракции элюируются лектины гликопротеиновой природы, способные к самоингибированию при высоких концентрациях. Эти данные свидетельствуют о том, что в результате очистки на сефадексе получены поливалентные лектины.

Табл. 2. Выявление лектиновой активности декстран-специфичных белков.

Анализируемая проба Концентрация лектинов, мкг/мл

2 1 0,5 0,25 0,13

Декстран-специфичные лектины - - - ++ -

+++ — максимальная пектиновая активность,--отсутствие агглютинации

С использованием тест-культуры с низкой концентрацией клеток установлено, что белки, очищенные на сефадексе, способны стимулировать прорастание (Рис. 9 а) и влиять на величину мембранного потенциала вегетативной клетки (Рис. 9 б). Гиперполяризация плазмалеммы возрастала с увеличением концентрации белка в пробе.

Рис. 9. Действие декстран-специфичных пектинов на прорастание (а) и величину мембранного потенциала вегетативной клетки пыльцевого зерна (б).

Выделение лектинов на колонке с ММП-Агарозой и анализ их действия на прорастание

В результате специфической элюции белков, связавшихся с ММП-Агарозой, с помощью 0,5 М ММП, была получена фракция лектинов, вышедших с колонки в виде одного пика (№ 32) (Рис. 10 а). Массовая доля этих маннозо-специфичных

18

лектинов по отношению ко всему внесенному на колонку белку составляла около 0,5 %.

Электрофоретический анализ данной лектиновой фракции в градиентном 8-25 % ДДС-ПААГ показал наличие в её составе 3 белков (Рис. 10 6, дорожка 2), молекулярные массы которых составляли 58, 69 и 74 кДа. Сравнивая белковый состав фракции, выделенной на сефадексе (Рис. 8), и фракции маннозо-специфичных лектинов (Рис. 10), следует отметить белок 58 кДа, возможно, общий для этих фракций, т.е. проявляющий сродство и к маннозе, и к декстрану.

Рис. 10. Фракционирование диффузатов оболочки пыльцевого зерна методом

аффинной хроматографии на колонке с ММП-Агарозой (а) и электрофоретический

анализ маннозо-специфичных лектинов (б).

Дорожка 1 — диффузаты; дорожка 2 — фракция лектинов (N2 32).

Справа указаны рассчитанные молекулярные массы лектинов (кДа).

Слева — положение белков-маркёров (кДа).

Влияние маннозо-специфичных лектинов на прорастание пыльцевого зерна

Маннозо-специфичные лектины стимулировали прорастание пыльцы (Рис. 11 а). Как и нефракционированные диффузаты, они оказывали двухфазное действие на этот процесс. Однако концентрация белка, оптимальная для стимулирования прорастания, для диффузатов была в 100 раз больше, чем для

маннозо-специфичных лектинов (26 и 0,2 мкг белка/мл, соответственно) (Рис. 4 и 11 а). Эти лектины выступали как эффективный стимулирующий агент, увеличивая прорастание до 49 %, что сопоставимо с уровнем прорастания в культуре с высокой концентрацией клеток (62 %).

а б

0.5 1 1.5 2

Концентрация белка, мкг/мл

контроль лектин

лектан + ММП

Рис. 11. Влияние маннозо-специфичных лектинов на прорастание пыльцевых зёрен в тест-культуре (а) и подавление эффекта лектинов в присутствии ММП (0,3 М) (б).

В экспериментах с предварительной инкубацией маннозо-специфичных лектинов (0,2 мкг/мл) в присутствии 0,3 М ММП было обнаружено блокирование их стимулирующего действия на прорастание пыльцы (Рис. 11 б). Это позволяет сделать вывод о том, что способность выделенных маннозо-специфичных лектинов стимулировать прорастание определяется их специфическим взаимодействием с соответствующими углеводными детерминантами, локализованными предположительно на поверхности плазмалеммы.

Механизм действия обнаруженных лектинов на активацию и прорастание пыльцы нуждается в дальнейшем изучении. Можно предположить, что взаимодействие подвижных лектинов оболочки пыльцевого зерна с плазмалеммой его вегетативной клетки модулирует работу ион-транспортирующих белков плазмалеммы или запускает сигнальные каскады, подобно тому, как это происходит в клетках животных (Hsu et al., 2009; Garner, Baum, 2008).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Более 100 лет прошло с момента открытия в семенах бобовых белков, способных агглютинировать эритроциты (Sharon, Lis, 2004). В настоящее время, в основном, благодаря исследованиям лектинов животных, представления об их функциональной значимости существенно расширились. Стала очевидной их роль в распознавании углеводных сигналов как эндогенной, так и экзогенной природы (Gabius et al., 2008). Однако роль белок-углеводных взаимодействий в физиологических процессах у растений по-прежнему остается мало изученной (De Hoff, 2009).

В настоящей работе установлено участие эндогенных лектинов в регуляции ключевого этапа жизни мужского гаметофита — его прорастания. Участие белок-углеводных взаимодействий в данном процессе ранее было показано с помощью экзогенных лектинов (Southworth, 1975; Knox et al., 1976). Эти представления были дополнены в настоящей работе. Установлено, что лектин Кон А специфически взаимодействует с углеводными детерминантами плазмалеммы вегетативной клетки пыльцевого зерна и вызывает её гиперполяризацию и увеличение внутриклеточного pH. Вследствие этого возрастает эффективность прорастания пыльцы.

Нами впервые обнаружены эндогенные лектины, диффундирующие из оболочки пыльцевого зерна в процессе его гидратации. Эти лектины сходны с Кон А по углеводной специфичности и аналогичным образом действуют на мембранный потенциал вегетативной клетки и прорастание пыльцы. Показано, что эти эффекты обусловлены специфическим взаимодействием лектинов с углеводными детерминантами, по-видимому, теми же, с которыми взаимодействует Кон А.

В данной работе впервые представлены результаты, свидетельствующие об участии лектинов в реализации популяционного эффекта, который оказывает существенное влияние на прорастание пыльцы в условиях in vivo и in vitro. Известно, что этот эффект играет важную роль и в поведении культур соматических клеток растений (Vasil, 2008). В этой связи заслуживает рассмотрения вопрос об универсальности механизмов регуляции ростовых процессов, использующих лектины.

выводы

1. Исследовано стимулирующее действие экзогенного лектина конканавалина А на активацию и прорастание пыльцы табака in vitro. Методами флуоресцентной микроскопии установлено, что на начальном этапе активации пыльцевого зерна этот лектин вызывает увеличение внутриклеточного рН и гиперполяризацию плазмалеммы его вегетативной клетки. Выявлена взаимосвязь между действием конканавалина А на величину мембранного потенциала этой клетки и эффективностью прорастания пыльцевых зёрен. Все указанные эффекты конканавалина А полностью блокировал конкурентный сахар метил-a-D-маннопиранозид, что свидетельствует о специфическом взаимодействии данного лектина с углеводными детерминантами, предположительно гликоконъюгатами плазмалеммы.

2. Исследовано действие веществ оболочки пыльцевого зерна, легковымываемых в водной среде, на суспензионные культуры пыльцевых зёрен, в которых эффективность прорастания существенно снижена вследствие уменьшения концентрации клеток в суспензии. Установлено, что легковымываемые вещества оболочки восстанавливают способность пыльцы к прорастанию. Эффект этих диффузатов проявлялся также в гиперполяризации плазмалеммы вегетативной клетки пыльцевого зерна на начальном этапе его активации. В результате очистки на сефадексе выделена смесь белков 64, 58, 51, 50 и 35 кДа, аналогичным образом действующая на активацию и прорастание пыльцы, а методом гемагглютинации подтверждено присутствие в указанной смеси белков лектинов.

3. Методом аффинной хроматографии выделены в виде единичного пика маннозо-специфичные лектины, легковымываемые из оболочки пыльцевого зерна. По данным электрофоретического анализа, молекулярные массы этих белков составляли 58, 69 и 74 кДа. Эта фракция стимулировала прорастание в культурах с низкой концентрацией клеток. Показано, что данный эффект обусловлен специфическим взаимодействием лектинов с углеводными детерминантами.

4. Полученные результаты впервые выявили участие углеводных детерминант плазмалеммы вегетативной клетки пыльцевого зерна и эндогенных лектинов его оболочки в регуляции ростовой функции. Эти лектины диффундируют в окружающую среду в процессе гидратации пыльцевых зёрен и могут опосредовать их взаимодействия между собой и с клетками рыльца.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации соискателей учёной степени кандидата наук

1. Матвеева Н.П., Андреюк Д.С., Лазарева Е.А., Ермаков И.П. Влияние конканавалина А на величину мембранного потенциала и внутриклеточный pH в процессе активации пыльцевого зерна табака in vitro II Физиология растений. 2004. Т. 51. № 4. стр. 549-554.

2. Матвеева Н.П., Лазарева Е.А., Клюшник Т.П., Зозуля С.А.,Ермаков И.П. Выявление лектинов оболочки пыльцевого зерна Nicotiana tabacum L, стимулирующих прорастание in vitro II Физиология растений. 2007. Т. 54. № 5. стр. 699-706.

II. Прочие публикации

3. Лазарева Е.А. Флуориметрическое изучение изменений мембранного потенциала на начальном этапе прорастания пыльцевого зерна табака // Материалы X междунар. конф студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2003», 15-18 апреля 2003 г., Москва, стр. 27-28.

4. Лазарева Е.А. Измерение величины мембранного потенциала вегетативной клетки пыльцевого зерна // V Съезд общества физиологов растений России, Тезисы докладов Междунар. конф. «Физиология растений - основа фитобиотехологии», Пенза, 15-21 сентября 2003 г., стр. 121.

5. Лазарева Е.А. Роль внеклеточных лектинов в регуляции прорастания пыльцевого зерна табака // Тезисы докладов XI междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2004», 12-15 апреля 2004 г., Москва, стр. 83.

6. Лазарева Е.А., Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Лектины оболочек пыльцевого зерна табака // Материалы IV междунар. научной конф. «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» г. Минск, 26-28 октября 2005 г., стр. 132133.

7. Лазарева Е.А. Водорастворимые лектины оболочек пыльцевого зерна табака // Программа и тезисы I Междунар. Школы для Молодых Ученых «Эмбриология и Биотехнология» 4-9 декабря 2005 г., Санкт-Петербург, стр. 44.

8. Лазарева Е.А. Краснолобова С.А. Выявление стимулирующих прорастание лектинов в оболочке пыльцевого зерна табака // Тезисы докладов XIII междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», 12-15 апреля 2006 г., Москва, стр. 134--135.

9. Lazareva Е.А., Matveyeva N.P., Yermakov I.P. Pollen wall lectins contribute to germination in vitro // XlXth International Congress on Sexual Plant Reproduction «From gametes to genes» organized by the Agricultural Research Institute of the Hungarian Academy of Sciences under the auspices of the International Association of Sexual Plant Reproduction Research (IASPRR), July 11-15, 2006, Budapest, Hungary, P. 172-173.

10. Лазарева E.A., Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Участие лектинов оболочки пыльцевого зерна в запуске прорастания // VI Съезд общества физиологов растений России, Тезисы докладов Междунар. конф. «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», 18-24 июня 2007 г., г. Сыктывкар, часть первая, стр. 315-316.

11. Лазарева Е.А., Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Лектины оболочек пыльцевого зерна табака и их роль в регуляции прорастания // Тезисы докладов II Междунар. Школы молодых учёных «Эмбирология, генетика и биотехнология» Уфа, 3-7 декабря, 2007 г., стр. 80-82.

12. Лазарева Е.А., Филимонова М.В. Роль лектинов оболочки в активации и прорастании пыльцевого зерна табака // Тезисы докладов III Междунар. школы молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология», г. Саратов, 29 июня-3 июля 2009 г., стр. 66-68.

Заказ №55-аЛ 1/09 Подписано в печать 10.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 I' )/ www.cfr.rn; е-таИ:'т/о@с/г.т

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лазарева, Екатерина Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Межклеточные взаимодействия в регуляции прорастания пыльцы

1.1. Взаимодействия пыльцевых зерен между собой.

1.2. Химические сигналы, контролирующие прорастание пыльцы при совместимом опылении.

1.3. Отторжение или принятие пыльцы в реакции самонесовместимости.

2. Подвижные белки оболочки пыльцевого зерна.

3. Пектины оболочки пыльцевого зерна и действие экзогенных лектинов на его прорастание.

4. Роль лектинов в жизнедеятельности растительной клетки.

4.1. Распространение и локализация лектинов у растений.

4.2. Физиологическая роль лектинов.

4.3. Белки, содержащие углевод-связывающие домены.

4.4. Пектины растений как инструмент исследования.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Действие конканавалина А на активацию и прорастание пыльцевого зерна.

2. Действие диффузатов оболочки на активацию и прорастание пыльцевого зерна.

3. Выявление лектинов в диффузатах.

4. Выделение водорастворимых лектинов оболочки пыльцевого зерна методом аффинной хроматографии и анализ их действия на активацию и прорастание.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Лектины оболочки пыльцевого зерна Nicotiana tabacum L. и их роль в активации прорастания"

Актуальность темы.

В современных исследованиях механизмов регуляции развития растительных клеток большое внимание уделяют сигнальным системам, которые обеспечивают запуск морфогенетических программ внеклеточными лигандами (Hiscock, Allen, 2008). Поведение мужского гаметофита покрытосеменных растений, в том числе на этапе его перехода в активное физиологическое состояние в прогамную фазу оплодотворения, включает подобные механизмы. При этом важную роль играют белки и пептиды, которые диффундируют из пыльцевого зерна в окружающую среду. Они участвуют в процессах взаимодействия пыльцевых зёрен друг с другом и с клетками рыльца, но вместе с тем с помощью таких лигандов вегетативная клетка и пыльцевая трубка могут осуществлять мониторинг своего состояния и готовности к выполнению своих функций.

Особый класс белков, которые могут выступать в качестве внеклеточных лигандов, составляют лектины — белки, специфически и обратимо взаимодействующие с углеводными детерминантами без их модификации. Исследования последних лет, проведенные на клетках животных, показали, что лектины участвуют в контроле внутриклеточного транспорта и эндоцитоза, регулируют процессы адгезии (межклеточные и клетки к её матриксу), узнавания и миграции клеток, осуществляют позитивный и негативный контроль ростовых процессов и тем самым контролируют дифференциацию тканей и органов (Gabius et al., 2004). Быстрое накопление знаний в области исследования лектинов животных привело к формированию концепции "углеводного кода". Сформулирована новая парадигма поливалентных белок-углеводных взаимодействий с образованием супрамолекулярных ансамблей, осуществляющих трансдукцию сигналов (Garner, Baum, 2008).

Вопрос о роли лектинов в регуляции прорастания пыльцевого зерна до настоящего времени не решён, хотя уже давно обсуждается в литературе (Southworth, 1975; Dumas et al., 1984). Данные о влиянии экзогенных лектинов на прорастание немногочисленны и противоречивы. Вопрос об эндогенных лектинах пыльцевого зерна почти не изучен. Есть сведения о лектинах, прочно связанных с оболочкой (Carratu, Giannattasio, 1990; Ковалева и др., 1999). Однако с точки зрения участия в запуске прорастания, наибольший интерес представляют подвижные белки внеклеточного матрикса, которые могли бы взаимодействовать с гликопротеинами плазмалеммы.

Цели и задачи исследования. Цель работы - выявить водорастворимые лектины оболочки и установить их роль в регуляции активации и прорастания пыльцевого зерна, на примере Nicotiana tabacum L. Для ее достижения были поставлены следующие задачи.

• Изучение действия экзогенного лектина конканавалина А (Кон А) на активацию и прорастание пыльцы.

• Изучение роли водорастворимых компонентов оболочки (диффузатов) пыльцевого зерна табака в регуляции запуска его прорастания.

• Выявление лектинов в составе диффузатов оболочки методом гемагглютинации.

• Выделение лектинов из диффузатов оболочки пыльцевого зерна методом аффинной хроматографии.

• Изучение действия выделенных лектинов на запуск активации и прорастание пыльцевого зерна.

Научная новизна. Впервые обнаружено действие экзогенного лектина на величину мембранного потенциала и внутриклеточный рН растительной клетки. Установлена взаимосвязь между прорастанием пыльцевого зерна и гиперполяризацией плазм ал еммы его вегетативной клетки.

Показано, что диффузаты оболочки пыльцевого зерна включают лектины, существенно влияющие на активацию и прорастание пыльцы. Эти эндогенные регуляторные лектины впервые выделены и охарактеризованы.

Практическая значимость работы. Представленная работа является фундаментальным исследованием сложной системы регуляции прорастания пыльцевого зерна. Полученные данные могут быть использованы для разработки подходов к оптимизации условий опыления у сельскохозяйственных растений с целью повышения их продуктивности. Результаты работы могут быть использованы в курсах лекций по физиологии и эмбриологии растений.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на семинарах кафедры физиологии растений, доложены на международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2003, 2004, 2006); на V и VI съездах общества физиологов растений (Пенза, 2003; Сыктывкар, 2007); на IV международной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2005); на I международной школе для молодых ученых «Эмбриология и Биотехнология» (Санкт-Петербург, 2005); на XIX Международном конгрессе по половому размножению растений «From gametes to genes» (Будапешт, 2006); на II и III международных школах для молодых ученых «Эмбриология, Генетика и Биотехнология» (Уфа, 2007; Саратов, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Лазарева, Екатерина Алексеевна

выводы

1. Исследовано стимулирующее действие экзогенного лектина конканавалина А на активацию и прорастание пыльцы табака in vitro. Методами флуоресцентной микроскопии установлено, что на начальном этапе активации пыльцевого зерна этот лектин вызывает увеличение внутриклеточного рН и гиперполяризацию плазмалеммы его вегетативной клетки. Выявлена взаимосвязь между действием конканавалина А на величину мембранного потенциала этой клетки и эффективностью прорастания пыльцевых зерен. Все указанные эффекты конканавалина А полностью блокировал конкурентный сахар метил-а-О-маннопиранозид, что свидетельствует о специфическом взаимодействии данного лектина с углеводными детерминантами, предположительно гликоконъюгатами плазмалеммы.

2. Исследовано действие веществ оболочки пыльцевого зерна, легковымываемых в водной среде, на суспензионные культуры пыльцевых зерен, в которых эффективность прорастания существенно снижена, вследствие уменьшения концентрации клеток в суспензии. Установлено, что легковымываемые вещества оболочки восстанавливают способность пыльцы к прорастанию. Эффект этих диффузатов проявлялся также в гиперполяризации плазмалеммы вегетативной клетки пыльцевого зерна на начальном этапе его активации. В результате очистки на сефадексе выделена смесь белков 64, 58, 51, 50 и 35 кДа, аналогичным образом действующая на активацию и прорастание пыльцы, а методом гемагглютинации подтверждено присутствие в указанной смеси белков лектинов.

3. Методом аффинной хроматографии выделены в виде единичного пика маннозо-специфичные лектины, легковымываемые из оболочки пыльцевого зерна. По данным электрофоретического анализа, молекулярные массы этих белков составляли 58, 69 и 74 кДа. Эта фракция стимулировала прорастание в культурах с низкой концентрацией клеток. Показано, что данный эффект обусловлен специфическим взаимодействием лектинов с углеводными детерминантами.

4. Полученные результаты впервые выявили участие углеводных детерминант плазмалеммы вегетативной клетки пыльцевого зерна и эндогенных лектинов его оболочки в регуляции ростовой функции. Эти лектины диффундируют в окружающую среду в процессе гидратации пыльцевых зерен и могут опосредовать их взаимодействия между собой и с клетками рыльца.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Более 100 лет прошло с момента открытия в семенах бобовых белков, способных агглютинировать эритроциты (Sharon, Lis, 2004). В настоящее время, в основном благодаря исследованиям лектинов животных, представления об их функциональной значимости существенно расширились. Стала очевидной их роль в распознавании углеводных сигналов как эндогенной, так и экзогенной природы (Gabius et al., 2008). Однако роль белок-углеводных взаимодействий в физиологических процессах у растений по-прежнему остается мало изученной (De Hoff et al., 2009).

В настоящей работе установлено участие эндогенных лектинов в регуляции ключевого этапа жизни мужского гаметофита — его прорастания. Участие белок-углеводных взаимодействий в данном процессе ранее было показано с помощью экзогенных лектинов (Southworth, 1975; Knox et al., 1976). Эти представления были дополнены в настоящей работе. Установлено, что лектин Кон А специфически взаимодействует с углеводными детерминантами плазмалеммы вегетативной клетки пыльцевого зерна и вызывает её гиперполяризацию и увеличение внутриклеточного рН. Вследствие этого возрастает эффективность прорастания пыльцы.

Нами впервые обнаружены эндогенные лектины, диффундирующие из оболочки пыльцевого зерна в процессе его гидратации. Эти лектины сходны с Кон А по углеводной специфичности и аналогичным образом действуют на мембранный потенциал вегетативной клетки и прорастание пыльцы. Показано, что эти эффекты обусловлены специфическим взаимодействием лектинов с углеводными детерминантами, по-видимому, теми же, с которыми взаимодействует Кон А.

В данной работе впервые представлены результаты, свидетельствующие об участии лектинов в реализации популяционного эффекта, который оказывает существенное влияние на прорастание пыльцы в условиях in vivo и in vitro. Известно, что этот эффект играет важную роль и в поведении культур соматических клеток растений (Vasil, 2008). В этой связи заслуживает рассмотрения вопрос об универсальности механизмов регуляции ростовых процессов, использующих лектины.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лазарева, Екатерина Алексеевна, Москва

1. Брейгина М.А., Смирнова А.В., Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Изменения мембранного потенциала в процессе прорастания пыльцевого зерна и роста пыльцевой трубки // Цитология. 2009. Т. 51. С. 815-822.

2. Гараева JI. Д., Поздеева С. А., Тимофеева О. А., Хохлова JI. П. Лектины клеточной стенки при закаливании к холоду озимой пшеницы // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 845-850.

3. Горшкова Т.А. Растительная клеточная стенка как динамическая система // Москва: Наука. 2007. 429 с.

4. Ермаков И.П., Матвеева Н.П., Дубинина Н.П. Связывание конканавалина А микроспорой петунии // Вестн. Моск. Ун-та. 1990. Т. 16. С. 25-29.

5. Ильченко К.В. Некоторые свойства лектина пыльцы двух видов табака и секреция лектина в процессе роста пыльцевых трубок // Фиозиология растений. 1988. Т. 35. С. 534-541.

6. Ковалева Л. В., Захарова Е. В., Минкина Ю. В. Ауксин и флавоноиды в прогамной фазе оплодотворения у петунии // Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 449-454.

7. Ковалева Л.В., Комарова Э.Н., Выскребенцева Э.И. Спорофитно-гаметофитные взаимодействия в системе пыльца-пестик. 1. Лектины клеточных стенок // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 98-101.

8. Козлов Ю. В. Рибосом-инактивирующие лектины растений // Молекулярная биология. 2006. Т. 40. С. 711-723.

9. Курек Д.В., Лопатин С.А., Варламов В.П. Перспективы использования хитинсвязывающих доменов для выделения и очистки рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45. С. 5-13.

10. Матвеева Н.П., Андреюк Д.С., Войцех О.О., Ермаков И.П. Регуляторные изменения внутриклеточного рН и выход из пыльцевых зерен СГ на начальном этапе прорастания in vitro II Физиология растений. 2003. Т. 50. С. 360-365.

11. Матвеева Н.П., Войцех О.О., Андреюк Д.С., Ермаков И.П. (2002) Роль Н+-АТФазы и альтернативной оксидазы в регуляции величины внутриклеточного рН на разных стадиях развития мужского гаметофита табака // Онтогенез. Т. 33. С. 436-443.

12. Подцубная-Арнольди В.А. Цитоэмбриология покрытосеменных растений // Москва: Наука. 1976. 486 с.

13. Шакирова Ф.М., Безрукова М.В. Современные представления о предполагаемых функциях лектинов растений // Журнал общей биологии. 2007. Т. 68. С. 109-125.

14. Abreu I., Oliveira М. Immunolocalisation of arabinogalactan proteins and pectins in Actinidia deliciosa pollen // Protoplasma. 2004. V. 224. P. 123-128.

15. Ambrosi M., Cameron N.R., Davis B.G. Lectins: tools for the molecular understanding of the glycocode // Org Biomol Chem. 2005. V. 3. P. 1593-1608.

16. Barre A., Herve C., Lescure В., Rouge P. Lectin Receptor Kinases in Plants // Plant Sciences. 2002. Y. 21. P. 379-399.

17. Barrett S.C.H. Mating strategies in flowering plants: the outcrossing-selfing paradigm and beyond // Phil. Trans. R. Soc. Lond. 2003. V. 358. P. 991-1004.

18. Becker J.D., Boavida L.C., Carneiro J., HauryM., Feijo J.A.Transcriptional Profiling of Arabidopsis Tissues Reveals the Unique Characteristic of the Pollen Transcriptom // Plant Physiology. 2003. V. 133. P. 713-725.

19. Benito Moreno R.M., Macke F., Alwen A., Herberle-Bors E. In-Situ seed production with in-vitro-matured, isolated pollen // Planta. 1988. V. 176. P. 517522.

20. Benvenuto E., Orders R.J., Tavazza R., Ancora G., Biocca S., Cattaneo A., Galeffi P. 'Phytoantibodies': a general vector for the expression of immunoglobulin domains in transgenic plants // Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. P. 865-874.

21. Bertin R.I., Sullivan M. Pollen Interference and Cryptic Self-Fertility in Campsis radicans // Am J Bot. 1988. V. 75. P. 1140-1147.

22. Bezerra W.M., Carvalho C.P.S., Moreira R.A., Grangeiro T.B. Establishment of a heterologous system for the expression of Canavalia brasiliensis lectin: a model for the study of protein splicing // Genet. Mol. Res. 2006. V. 5. P. 216-223.

23. Blum H., Beier H., Gross H.J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels // Electrophoresis. 1987. V. 8. P. 93-99.

24. Boraston A.B., Bolam D.N., Gilbert H.J., Davies G.J. Carbohydrate-binding modules: fine-tuning polysaccharide recognition // Biochemical Society. 2004. V. 382. P. 769-781.

25. Bosch M., Franklin-Tong V.E. Self-incompatibility in Papaver. signalling to trigger PCD in incompatible pollen // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 481-490.

26. Bots M., Feron R., Uehlein N. Weterings K., Kaldenhoff R., Mariani T. PIP 1 and PIP2 aquaporins are differentially expressed during tobacco anther and stigma development//J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 113-121.

27. Bouwmeester K., Govers F. Arabidopsis L-type lectin receptor kinases: phylogeny, classification, and expression profiles // J. Exp. Bot. 2009. V. 60. P. 4383-4396.

28. Brewbaker J.L., and Kwack B.H. The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube growth // Am. J. Bot. 1963. V. 50. P. 747-858.

29. Brewbaker J.L., Majumder S.K. Cultural Studies of the Pollen Population Effect and the Self-Incompatibility Inhibition // Am. J. Bot. 1961. V. 48. P. 457-464.

30. Brill L.M., Evans C.J., Hirsch A.M. Expression of MsLECl- and MsLEC2-antisense genes in alfalfa plant lines causes severe embryogenic, developmental and reproductive abnormalities // Plant J. 2001. V. 25. P. 453-61.

31. Brink R.A. The Physiology of Pollen. IV. Chemotropism; Effects on Growth of Grouping Grains; Formation and Function of Callose Plugs; Summary and Conclusions // Am. J. Bot. 1924. V. 11. P. 417-436.

32. Brownlee C. Role of the extracellular matrix in cell-cell signalling: paracrine paradigms // Curr. Opin. Plant Biol. 2002. V. 5. P. 396-401.

33. Brummell D.A., Harpster M.H. Cell wall metabolism in fruit softening and quality and its manipulation in transgenic plants // Plant Mol. Biol. 2001. V. 47. P. 311-340.

34. Burbulis I.E., Iacobucci M., Shirley B.W. A null mutation in the first enzyme of flavonoid biosynthesis does not affect male fertility in Arabidopsis // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1013-1025.

35. Buzas E.I., Gyorgy В., Pasztoi M., Jelinek I., Falus A., Gabius H.J. Carbohydrate recognition systems in autoimmunity // Autoimmunity. 2006. V. 39. P. 691-704.

36. Cadot P., Nelles L., Srahna M., Dilissen E., Ceuppens J.L. Cloning and expression of the cyclophilin Bet v 7, and analysis of immunological cross-reactivity among the cyclophilin A family. // Mol. Immunol. 2006. V. 43 P. 226235.

37. Carratu G., Giannattasio M. Lectin Activity in Pollen from Plants Representative of Thirty Orders of Spermatophyta // Sex. Plant Reprod. 1990. V. 3. P. 35-40.

38. Chen Y.-F., Matsubayashi Y., Sakagami Y. Peptide Growth Factor Phytosulfokine-a Contributes to the Pollen Population Effect // Planta. 2000. V. 211. P. 752-755.

39. Chivasa S., Ndimba B.K., Simon W.J., Robertson D., Yu X.L., Knox J.P., Bolwell P., Slabas A.R. Proteomic analysis of the Arabidopsis thaliana cell wall //Electrophoresis. 2002. V. 23. P. 1754-1765.

40. Cruzan M.B. Pollen-Pollen and Pollen-Style Interactions During Pollen Tube Growth in Erythronium grandiflorum (Liliaceae) // Am. J. Bot. 1990. V. 77. P. 116-122.

41. Cruzan M.B. Pollen-tube distributions in Nicotiana glauca\ evidence for density dependent growth // Amer. J. Bot. 1986. V. 73. P. 902-907.

42. Dai S., Li L., Chen Т., Chong K., Xue Y., Wang T. Proteomic Analyses of Oryza sativa Mature Pollen Reveal Novel Proteins Associated Potentially with Pollen Germination and Tube Growth // Proteomics. 2006. V. 6. P. 2504-2529. .

43. De Hoff P. L., Brill L.M., Hirsch A.M. Plant lectins: the ties that bind in root symbiosis and plant defense // Mol. Genet. Genomics. 2009. V. 282. P. 1-15.

44. Dearnaley J.D.W., Daggard G.A. Expression of polygalacturonase enzyme in germinating pollen of Brassica napus // Sex. Plant Reprod. 2001. V.13. P. 265271.

45. Desrochers A.EM., Rieseberg L.H. Mentor Effects in Wild Species of Helianthus (Asteraceae) //Am. J. Bot. 1998. V. 85. P. 770-775.

46. Dickinson H. No Stigma Attached to Male Rejection // Science. 1999. V. 286 P. 1690-1691.

47. Dickinson H.G.F, Elleman C.J, Doughty J. Pollen coatings chimaeric genetics and new functions. // Sex. Plant Reprod. 2000. V. 12. P. 302-309.

48. Dong J, Kim S.T, Lord E.M. Plantacyanin plays a role in reproduction in Arabidopsis II Plant Physiol. 2005. V. 138. P. 778-789.

49. Dumas C, Knox R.B, Gaude T. Pollen-Pistil Recognition: New Concepts from Electron Microscopy and Cytochemistry // Int. Rev. Cylol. 1984. V. 90. P. 239272.

50. Edlund A.F, Swanson R, Preuss D. Pollen and stigma Structure and Function: The Role of Diversity in Pollination // The Plant Cell. 2004. V. 16. P. 84-97

51. Emri M, Balkay L, Krasznai Z, Tron L, Marian T. Wide Applicability of a Flow Cytometric Assay to Measure Absolute Membrane Potentials on the Millivolt Scale//Eur. Biophys. Journ. 1998. V. 28. P. 78-83.

52. Esteban R, Dopico B, Mun F.J, Romo S, Labrador E. A seedling specific vegetative lectin gene is related to development in Cicer arietinum II Physiol Plant. 2002. V. 114. P. 619-626.

53. Feijo J.A, Malho R, Obermeyer G. Ion dynamics and its possible role during in vitro pollen germination and tube growth // Protoplasma. 1995. V. 187. P. 155167.

54. Ferris P.J, Waffenschmidt S, Umen J.G, Lin H, Lee J.H, Ishida K, Kubo T, Lau J, Goodenough U.W. Plus and minus sexual agglutinins from Chlamydomonas reinhardtii II Plant Cell. 2005. V. 17. P. 597-615.

55. Gabius H.-J. Glycans: bioactive signals decoded by lectins // Biochem. Soc. Trans. 2008. V. 36. P. 1491-1496.

56. Gabius H.-J, Andre S, Kaltner H, Siebert H.-C. The Sugar Code: Functional Lectinomics // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1572. P. 165-177.

57. Gabius H.-J, Siebert H.-C, Andry S, Jimynez-Barbero J, Rudiger H. Chemical Biology of the Sugar Code // ChemBioChem. 2004. V. 5. P. 740-764.

58. Ganeshaiah K.N, Shaanker R.U, Shivashankar G. Stigmatic inhibition of pollen grain germination its implication for frequency distribution of seed number in pods of Leucaena Ieucocephala (Lam) de Wit // Oecologia. 1986. V. 70. P. 568572.

59. Garner O.B., Baum L.G. Galectin-glycan lattices regulate cell-surface glycoprotein organization and signaling // Biochem. Soc. Trans. 2008. V. 36. P. 1472-1477.

60. Geitmann A., Palanivelu R. Fertilization Requires Communication: Signal Generation and Perception During Pollen Tube Guidance // Floriculture and Ornamental Biotechnology. 2007. V. 1. P. 77-89.

61. Geitmann A., Steer M. The Architecture and Properties of the Pollen Tube Cell Wall // Plant Cell Monogr. The Pollen Tube / Eds Malho R.: Springer-Verlag. 2006. P. 177-200.

62. Geurts R., Bisseling T. Rhizobium nod factor perception and signaling // Plant Cell. 2002. V. 14 P. S239-S249.

63. Goldraij A., Kondo K., Lee C.B., Hancock C.N., Sivaguru M., Vazquez-Santana S., Kim S., Phillips Т.Е., Cruz-Garcia F., McClure B. Compartmentalization of S-RNase and HT-B degradation in self-incompatible Nicotiana II Nature. 2006. V. 439. P. 805-810.

64. Graaf B.H.J., Derksen J.W.M., Mariani C. Pollen and pistil in progamic phase // Sex. Plant Reprod. 2001. V. 14. P. 41-55.

65. Gray J.E., Casson S., Hunt L. Intercellular peptide signals regulate plant meristematic cell fate decisions // Sci. Signal. 2008. V. 1. P. 53.

66. Haerizadeh F., Wong C.E., Bhalla P.L., Gresshoff P.M., Singh M.B. Genomic expression profiling of mature soybean (Glycine max) pollen // BMC Plant Biology. 2009. V. 9. A. 25.

67. Hanai H., Matsuno Т., Yamamoto M., Matsubayashi Y., Kobayashi Т., Kamada H., Sakagami Y. A secreted peptide growth factor, phytosulfokine, acting as a stimulatory factor of carrot somatic embryo formation // Plant Cell Physiol. 2000. V.41.P. 27-32.

68. Helsper J.P.F.G., Pierson E.S. The Effect of Lectins on Germinating Pollen of Lilium longiflorum. II. Effect of Concanavalin A on Phospholipid Turnover and on Biosynthesis of Pectic Polysaccharides // Acta Bot. Neerl. 1986. V. 35. P. 257263.

69. Hesketh T.R., Moore J.P., Morris J.D., Taylor M.V., Rogers J., Smith G.A., Metcalfe J.C. A Common Sequence of Calcium and pH Signals in the Mitogenic Stimulation ofEukaryotic Cells //Nature. 1985. V. 313. P. 481-484.

70. Heslop-Harrison J. Incompatibility and the Pollen-Stigma Interaction // Annu. Rev. Plant Physiol. 1975. V. 26. P. 403-425.

71. Heslop-Harrison J., Heslop-Harrison Y., Shivanna K.R. The Eevaluation of Pollen Quality, and a Further Appraisal of the Fluorochromatic (FCR) Test Procedure // Theor. Appl. Gen. 1984. V. 67. P. 367-375.

72. Hirabayashi J. Lectin-based structural glycomics: glycoproteomics and glycan profiling // Glycoconj. J. 2004. V. 21. P. 35-40.

73. Hirabayashi J., Kasai K.-I. Separation technologies for glycomics // J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2002. V. 771. P. 67-87.

74. Hiscock S.J., Allen A.M. Diverse cell signalling pathways regulate pollen-stigma interactions: the search for consensus // New Phytol. 2008. V. 179. P. 286-317.

75. Hiscock S.J., Mclnnis S.M. Pollen recognition and rejection during the sporophytic self-incompatibility response: Brassica and beyond // Trends Plant Sci. 2003. V.8.P. 606-613.

76. Hsieh K., Huang A.H. Tapetosomes in Brassica tapetum accumulate endoplasmic reticulum-derived flavonoids and alkanes for delivery to the pollen surface // Plant Cell. 2007. V. 19. P. 582-596.

77. Hsu D.K., Chen H.Y., Liu F.T. Galectin-3 regulates T-cell functions // Immunol Rev. 2009. V. 230. P. 114-127.

78. Humphrey T.V., Bonetta D.T., Goring D.R. Sentinels at the wall: cell wall receptors and sensors // New Phytologist. 2007. V. 176. P. 7-21.

79. Igasaki Т., Akashi N., Ujino-Ihara Т., Matsubayashi Y., Sakagami Y., Shinohara K. Phytosulfokine stimulates somatic embryogenesis in Cryptomeria japonica II Plant Cell Physiol. 2003. V. 44. P. 1412-1416.

80. Ikeda S., Nasrallah J.B., Dixit R., Preiss S. Nasrallah M.E. An aquaporin-like gene required for the Brassica self-incompatibility response // Science. 1997. V. 276. P. 1564-1566.

81. Jamet E., Albenne C., Boudart G., Irshad M., Canut H., Pont-Lezica R. Recent advances in plant cell wall proteomics // Proteomics. 2008. V. 8. P. 893-908.

82. Jamet E., Canut H., Boudart G., Pont-Lezica R.F. Cell wall proteins: a new insight through proteomics // Trends Plant Sci. 2006. V. 11. N. 1. P. 33-9.

83. Jennings D.L., Topham P.B. Some Consequences of Raspberry Pollen Dilution for its Germination and for Fruit Development // New Phytol. 1971. V. 70. P. 371-380.

84. Kanchan S., Chandra J. Pollen Allelopathy-A New Phenomenon // New Phytol. 1980. V. 84. P. 739-746.

85. Ke-Feng F., Ting-Ting Y., Meng-Xiang S. Mosaicism in the Organization of Con A Binding Sites on the Membrane Surface of Female Cells of Nicotiana tabacum II New Phytol. 2005. V. 167. P. 743-749.

86. Kerhoas C., Knox R.B., Dumas C. Specificity of the Callose Response in Stigmas of Brassica II Ann Bot. 1983. V. 52. P. 597-602.

87. Khalikova E., Susi P., Korpela T. Microbial Dextran-Hydrolyzing Enzymes: Fundamentals and Applications // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2005. V. 69. P. 306325.

88. Kim B.J., Gibson D.M., Shuler M.L. Effect of the plant peptide regulator, phytosulfokine-a, on the growth and Taxol production from Taxus sp. suspension cultures // Biotechnol. Bioeng. 2006. V. 95. P. 8-14.

89. Kim S., Mollet J.-C., Dong J., Zhang K., Park S.-Y., Lord E.M. Chemocyanin, a small basic protein from the lily stigma, induces pollen tube chemotropism // PNAS. 2003. V. 100. P. 16125-16130.

90. Kim S.-H., Kim G.Ii. Cell-cell recognition during fertilization in the red alga, Aglaothamnion oosumiense (Ceramiaceae, Rhodophyta) // Hydrobiologia. 1999. V. 398/399. P. 81-89.

91. Kirby E.G., Vasil I.K. Effect of Pollen Diffusates on Germination of Eluted Pollen Samples of Petunia hybrida In Vitro И Ann. Bot. 1979. V. 44. P. 361-367.

92. Klemawesch S.J., Burcley C.E. The Lectin Reactivity and Lectin-Like Activity of Allergenic Pollen Extracts // J. Allergy Clin. Immunol. 1984. V. 73. P. 619-627.

93. Knox R. В., Heslop-Harrison J. Pollen-Wall Proteins: Localization and Enzymic Activity // J. Cell Sci. 1970. V. 6. P. 1-27.

94. Knox R.B., Clarke A., Harrison S., Smith P., Marchaloni J.J. Cell recognition in plants: Determinants of the stigma surface and their pollen interactions // Proc. Natl. Acad. Sci. 1976. V. 73. P. 2788-2792.

95. Kulkarni G.V., Lee W., Seth A., McCulloch C.A. Role of Mitochondrial Membrane Potential in Concanavalin A-Induced Apoptosis in Human Fibroblasts //Exp. Cell Res. 1998. V. 245. P. 170-178.

96. Kutschmar A., Rzewuski G., Stuhrwohldt N., G. T.S Beemster; Inze D.; Sauter M. PSK-a promotes root growth in Arabidopsis II New Phytol. 2009. V. 181. P. 820-831.

97. Lacoux J., Gutierrez L., Dantin F., Beaudoin В., Roger D., Laine E. Antisense transgenesis of tobacco with a flax pectin methylesterase affects pollen ornamentation // Protoplasma. 2003. V. 222. P. 205-209.

98. Lai Z.-F., Chen Y.-Z., Nishi K. Modulation of intracellular СГ homeostasis by lectin-stimulation in Jurkat T lymphocytes // Europ. J. Pharmacol. 2003. V. 482. P. 1-8.

99. Lamport D.T., Kieliszewski M.J., Showalter A.M. Salt stress upregulates periplasmic arabinogalactan proteins: using salt stress to analyse AGP function // New Phytol. 2006. V. 169. P. 479-492.

100. Lankinen A., Skogsmyr I. Pollen competitive ability: the effect of proportion in two-donor crosses // Evolut. Ecol. Res. 2002. V. 4. P. 687-700.

101. Lannoo N., Peumans W.J., Van Damme E.J.M. Do F-box proteins with a C-terminal domain homologous with the tobacco lectin play a role in protein degradation in plants? // Biochem. Soc. Trans. 2008. V. 36. P. 843-847.

102. Lannoo N., Van Damme E.J.M. Nucleocytoplasmic plant lectins // Biochim. Biophys. Acta. 2009. Epub. ahead of print.

103. Lerouge P., Cabanes-Macheteau M., Rayon C., Fischette-Lain'e A.-C., Gomord V., Faye L. N-Glycoprotein biosynthesis in plants: recent developments and future trends // Plant Mol. Biol. 1998. V. 38. P. 31-48.

104. Lorbiecke R., Steffens M., Tomm J.M., Scholten S., von Wiegen P., Kranz E., Wienand U., Sauter M. Phytosulphokine gene regulation during maize (Zea mays L.) reproduction // J. Exp. Bot. 2005. V. 56 P. 1805-1819.

105. Marin-Rodriguez M.C., Orchard J., Seymour G.B. Pectate lyases, cell wall degradation and fruit softening // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. P. 2115-2119.

106. Marshall D.L., Folsom M.W., Hatfield C., Bennett T. Does Interference Competition Among Pollen Grains Occur in Wild Radish? // Evolution. 1996. V. 50. P.1842-1848.

107. Marton M.L., Cordts S., Broadhvest J., Dresselhaus T. Micropylar Pollen Tube Guidance by Egg Apparatus of Maize // Science. 2005. V. 307. P. 573-576.

108. Matsubayashi Y., Ogawa M., Kihara H., Niwa M., Sakagami Y. Disruption and overexpression of Arabidopsis phytosulfokine receptor gene affects cellular longevity and potential for growth // Plant Physiol. 2006. V. 142. P. 45-53.

109. Matsubayashi Y., Ogawa M., Morita A., Sakagami Y. An LRR receptor kinase involved in perception of a peptide plant hormone, phytosulfokine // Science. 2002. V. 296. P. 1470-1472.

110. Matsubayashi Y., Sakagami Y. Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 7623-7627.

111. Matsubayashi Y., Takagi L., Omura N., Morita A., Sakagami Y. The endogenous sulfated pentapeptide phytosulfokine-a stimulates tracheary element differentiation of isolated mesophyll cells of zinnia // Plant Physiol. 1999. V. 120. P.1043-1048.

112. McClure B. Darwin's foundation for investigating self-incompatibility and the progress toward a physiological model for S-RNase-based SI // J. Exp. Bot. 2009. V. 60. P. 1069-1081.

113. Mo Y., Nagel C., Taylor L.P. Biochemical complementation of chalcone synthase mutants defines a role for flavonols in functional pollen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 7213-7217.

114. Moreira R.A., Monteiro A.C.O., Horta A.C.G., Oliveira J.T.A., Cavada B.S. Isolation and characterization of Dioclea altissima var. megacarpa seed lectin // Phytochemistry. 1997. V. 46. P. 139-144.

115. Mraz P. Mentor effects in the genus Hieraclum S. STR. fCompositae, LactuceaeJ II Folia Geobotanica 2003. V. 38. P. 345-350.

116. Murase K., Shiba H., Iwano M., Che F.S., Watanabe M., Isogai A., Takayama S. A membrane-anchored protein kinase involved in Brassica self-incompatibility signaling// Science. 2004. V. 303. P. 1516-1519.

117. Murphy S.D., Aarssen L.W. Allelopathic Pollen Extract from Phleumpratense L. (Poaceae) Reduces Germination, In vitro, of Pollen of Sympatric Species 11 Int. J. Plant Sci. 1995. V. 156. P. 425-434.

118. Nitsch J.P. Deux Especes Photoperiodiques de Jours Courts: Plumbago indica L. et P. zeylanica L. // Bull. Soc. Bot. France. 1965. V. 112. P. 517-522.

119. Obermeyer G., Blatt M.R. Electrical properties of intact pollen grains of Lilium longifloram: characteristics of the non-germinating pollen grain // J. Exp. Bot. 1995. V. 46. P. 803-813.

120. Palanivelu R., Brass L., Edlund A., Preuss D. Pollen Tube Growth and Guidance Is Regulated by POP2, an Arabidopsis Gene that Controls GABA Levels // Cell. 2003. V. 114. P. 47-59.

121. Palanivelu R., Preuss D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro II BMC Plant Biology. 2006. V. 6. P. 1-9.

122. Parre E, Geitmann A. (a) More than a leak sealant. The mechanical properties of callose in pollen tubes // Plant Physiol. 2005 V. 137. P. 274-286.

123. Parre E, Geitmann A. (6) Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense // Planta. 2005. V. 220. P. 582592.

124. Pasonen H. L, Kapyla M. Pollen-pollen interactions in Betala pendula in vitro II New Phytol. 1998. V. 138. P. 481-487.

125. Pearce G, Moura D.S, Stratmann J, Ryan RALF C.A, a 5-kDa ubiquitous polypeptide in plants, arrests root growth and development // PNAS. 2001. V. 98. P. 12843-12847.

126. Pereira L.G, Coimbra S, Oliveira H, Monteiro L, Sottomayor M. Expression of arabinogalactan protein genes in pollen tubes of Arabidopsis thaliana II Planta. 2006. V. 223. P. 374-380.

127. Peumans W.J, Van Damme J.M. Lectins as Plant Defense Proteins // Plant Physiol. 1995. V. 109. P. 347-352.

128. Prado A.M., Porterfield D.M, Feijo J.A. Nitric oxide is involved in growth regulation and re-orientation of pollen tubes // Development. 2004. V. 131. P. 2707-2714.

129. Raftery M.J, Saldanha R.G, Geczy C.L, Kumar R.K. Mass Spectrometric Analysis of Electrophoretically Separated Allergens and Proteases in Grass Pollen Diffusates // Respir. Res. 2003. V. 4. P. 10.

130. Rea A.C, Nasrallah J.B. Self-incompatibility systems: barriers to self-fertilization in flowering plants // Int. J. Dev. Biol. 2008. V. 52. P. 627-636.

131. Roy S, Jauh G.Y, Hepler P.K, Lord E.M. Effects of Yariv phenylglycoside on cell wall assembly in the lily pollen tube II Planta. 1998. V. 204. P. 450-458.

132. Rudiger H., Gabius H.-J. Plant Lectins: Occurrence, Biochemistry, Functions and Applications // Glycoconjugate J. 2001. V. 18. P. 589-613.

133. Rudiger H. Isolation of Plant Lectins // Lectins and Glycobiology / Eds Gabius H.-J., Gabius S. Berlin: Springer-Verlag, 1993. P. 31-47.

134. Sampedro J., Cosgrove D.J. The expansin superfamily // Genome Biology. 2005. V. 6. A. 242.

135. Sanchez A.M., Bosch M., Bots M., Nieuwland J., Feron R., Mariani C. Pistil factors controlling pollination // Plant Cell. 2004. V. 16. P. S98-S106.

136. Scheer J.M., Pearce G., Ryan C.A. LeRALF, a plant peptide that regulates root growth and development, specifically binds to 25 and 120 kDa cell surface membrane proteins of Lycopersicon peruvianum II Planta. 2005. V. 221. P. 667674.

137. Schultz C.J., Rumsewicz M.P., Johnson K.L., Jones B.J., Gaspar Y.M., Bacic A. Using Genomic Resources to Guide Research Directions. The Arabinogalactan Protein Gene Family as a Test Case // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 1448-1463.

138. Sharma N., Bajaj M., Shivanna K.R. Overcoming Self-incompatibility through the Use of Lectins and Sugars in Petunia and Eruca II Ann. Bot. 1985. V. 55. P. 139-141.

139. Sharma N., Shivanna. K.R Lectin-like components of pollen and complementary saccharide moiety of the pistil are involved in self-incompatibility recognition // Current Science. 1983. V. 52. P. 913-916.

140. Sharon N. Lectins: past, present and future // Biochem. Soc. Trans. 2008. V. 36. P.1457-1460.

141. Sharon N., Lis H. History of Lectins: From Hemagglutinins to Biological Recognition Molecules // Glycobiology. 2004. V. 14. P. 53R-62R.

142. Shoseyov O., Shani Z., Levy I. Carbohydrate Binding Modules: Biochemical Properties and Novel Applications // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. V. 70. P. 283-295.

143. Skogsmyr I., Lankinen A. Sexual selection: an evolutionary force in plants? // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 2002. V. 77. P. 537-562.

144. Snow A.A., Spira T.P. Differential Pollen-Tube Growth Rates and Nonrandom Fertilization in Hibiscus moscheutos (Malvaceae) // Am. J. Bot. 1991. V. 78. P. 1419-1426.

145. Southworth D. Lectins Stimulate Pollen Germination // Nature. 1975. V. 258. P. 600-602.

146. Suen D.F., Wu S.S.H., Chang H.C., Dhugga K.S., Huang A.H.C. Cell Wall Reactive Proteins in the Coat and Wall of Maize Pollen // J. Biol. Chemistry. 2003. V. 278. P. 43672-43681.

147. Takayama S., Isogai A. Self-incompatibility in plants // Annu. Rev. Plant Biol. 2005. V. 56. P. 467-489.

148. Tang W., Kelley D., Ezcurra I., Cotter R., and McCormick S. LeSTIGl, an extracellular binding partner for the pollen receptor kinases LePRKl and LePRK2, promotes pollen tube growth in vitro // Plant J. 2004. V. 39. P. 343-353.

149. Tatham P.E., Delves P.J. Flow Cytometric Detection of Membrane Potential Changes in Murine Lymphocytes Induced by Concanavalin A // Biochem. J. 1984. V. 221. P. 137-146.

150. Taylor L.P, Grotewold E. Flavonoids as developmental regulators // Curr. Opin. Plant Biol. 2005. V. 8. P. 317-323.

151. Taylor M.E., Drickamer K. Paradigms for glycan-binding receptors in cell adhesion // Curr. Opin. Cell Biol. 2007. V. 19. P. 572-577.

152. Trainotti L., Spinello R., Piovan A., Spolaore S., Casadoro G. B-Galactosidases with a lectin-like domain are expressed in strawberry 11 J. Exp. Bot. 2001. V. 52. P.1635-1645.

153. Tumosa C.S. A Lectin in Pollen of Marihuana, Cannabis sativa L. // Experientia. 1984. V. 40. P. 718-719.

154. Updegraff E.P., Zhao F., Prcuss D. The extracellular lipase EXL4 is required for efficient hydration of Arabidopsis pollen II Sex. Plant Reprod. 2009. V. 22. P. 197-204.

155. Valdivia E.R., Wu Y., Li L.-C., Cosgrove D.J., Stephenson A.G.A Group-1 Grass Pollen Allergen Influences the Outcome of Pollen Competition in Maize // PLoS One. 2007. V. 17. el54.

156. Van Damme E.J.M., Barre A., Rouge P., Peumans W.J. Cytoplasmic/nuclear plant lectins: a new story // Trends Plant Sci. 2004. V. 9. P. 484-489.

157. Walko R.M., Furtula V., Nothnagel E. A. Analysis of Labeling of Plant Protoplast Surface by Fluorophore-Conjugated Lectins // Protoplasma. 1987. V. 141. P. 33-46.

158. Wan J., Patel A., Mathieu M., Kim S.-Y., Xu D., Stacey G. A lectin receptor-like kinase is required for pollen development in Arabidopsis II Plant Mol. Biol. 2008. V. 67. P. 469-482.

159. Wang G., Qian Y., Qiu Q., Lan X., He H., Guan Y. Interaction between Cl-channels and CRAC-related Ca2+ signaling during T lymphocyte activation and proliferation // Acta Pharmacologica Sinica. 2006. V. 27. P. 437-446.

160. Winsor J.A., Peretz S., Stephenson A.G. Pollen competition in a natural population of Cucurbita foetidissima (Cucurbitaceae) // Am. J. Bot. 2000. V. 87. P. 527-532.

161. Wu A.M., Lisowska E., M. Duk, Yang Z. Lectins as tools in glycoconjugate research // Glycoconj. J. 2008. V. 27.

162. Wu H.M., Wong E., Ogdahl J., Cheung A.Y. A pollen tube growth-promoting arabinogalactan protein from nicotiana alata is similar to the tobacco TTS protein. // Plant J. 2000. V. 22. P. 165-76.

163. Ylstra В., Touraev A., Benito Moreno R.M., Stoger E., van Tunen J. A., Vicente O., Mol J.N.M., Heberle-Bors E. Flavonols Stimulate Development, Germination, and Tube Growth of Tobacco Pollen // Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 902-907.

164. Yokota E., Ohmori Т., Muto S., Shimmen T. 21-kDa Polypeptide, a Low-Molecular-Weight Cyclophilin, Is Released from Pollen of Higher Plants into the Extracellular Medium In Vitro И Planta. 2004. V. 218. P. 1008-1018.

165. Zhang Y., Zhao Z., Xue Y. Roles of proteolysis in plant self-incompatibility // Annu. Rev. Plant Biol. 2009. V. 60. P. 21-42.

166. В работе использованы следующие сокращения:1. Кон А конканавалин А;

167. ММП a.D-метил-маннопиранозид;

168. ДДС додецилсульфат натрия.

169. Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты № 02-04-49246, 05-04-49370-а, 08-04-00746-а).