Гормональная регуляция прогамной фазы оплодотворения у петунии

Тимофеева, Галина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гормональная регуляция прогамной фазы оплодотворения у петунии
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гормональная регуляция прогамной фазы оплодотворения у петунии"

Ha npas&x рукописи

ТИМОФЕЕВА Галина Владимировна

ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОГАМНОЙ ФАЗЫ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ У ПЕТУНИИ (PETUNIA HYBRIDA L)

03.00.12 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Институте физиологии растений им К А Тимирязева РАН в лаборатории природных и синтетических регуляторов роста, г Москва

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ доктор биологических наук

Ковалева Лидия Валентиновна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ доктор биологических наук профессор

доктор биологических наук

Ермаков Игорь Павлович Новикова Галина Викторовна

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

Санкт-Петербургский государственный университет Кафедра физиологии и биохимии растений

Защита состоится «12 »апреля 2005 г в 13 часов на заседании Диссертационного совета К 002 210 01 при Институте физиологии растений им К А Тимирязева РАН по адресу

127276, г. Москва, ул Ботаническая , 35 Факс (095)977-80-18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН

Автореферат разослан «5» марта 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В репродуктивном процессе растений ключевую роль играет прогамная фаза оплодотворения, которая состоит в доставке спермиев к семяпочке и включает в себя каскад событий, запускающих прорастание пыльцы на поверхности рыльца и рост пыльцевых трубок в тканях столбика и завязи. В настоящее время активно исследуются молекулярные механизмы восприятия и проведения соответствующих сигналов в системе пыльца-пестик, а также их физиологические ответные реакции (Кпох 1984; Taylor and Hepler 1997; Franklin-Tong 1999; Wheeler et al 2001; Lord and Russel 2002; Cheung and Wu 2003).

К настоящему времени накоплено достаточно много данных, указывающих на ключевую роль трансмембранного транспорта ионов в процессах прорастания пыльцевых зерен и роста пыльцевой трубки (Brewbaker and Kwack 1963; Feijo et al 1995; Messerli and Robinson 1997;Geitmann and Cresti 1998; Messerli et al 1999; Матвеева и др. 2002, 2004; Dutta and Robinson 2004;Iwano et al 2004. В целом эти процессы обеспечивают поляризованный или анизотропный рост растительных клеток растяжением. Прорастание пыльцевых зерен активируется после их гидратации и требует поступления в них из внешней среды ионов К+ и Са 2+. Перенос этих катионов через плазмалемму пыльцевых зерен сопряжен с активацией в ней Н+- АТФазы, протонного насоса, обеспечивающего генерацию на данной мембране движущей силы (в виде мембранного потенциала определенной величины) для трансмембранных потоков ионов К+ как осмотически активных агентов внутрь растущих пыльцевых трубок. Поступление ионов Са2+ в клетки, также требуемое для их роста растяжением, происходит через механочувствительные Са2+ -каналы в плазмалемме. Они открываются в ответ на механическое растяжение этой мембраны, обусловленное набуханием клеток из-за поступления в них воды по трансмембранному осмотическому градиенту, создаваемому в результате накопления в них ионов К+. Хотя в исследованиях, посвященных ионной регуляции прорастания мужского гаметофита, к настоящему времени достигнут значительный прогресс, информация о возможной роли фитогормонов в указанных выше процессах практически отсутствует. Имеющиеся сведения об участии фитогормонов в межклеточных взаимодействиях в системе пыльца-рыльце в прогамной фазе оплодотворения крайне ограничены (Barendse et al 1974; Stanley and Linskens 1974; Baker and Hasenstein 1997; Ковалева и др. 2000,2003,2004).

Цель и задачи работы. Цель настоящего исследования состояла в идентификации и характеристике факторов гормональной регуляции прогамной фазы оплодотворения у петунии. Их идентификация включала в себя исследование некоторых гормон-индуцируемых ответных реакций мужского гаметофита. Особое внимание было уделено изучению ключевых факторов биосинтеза этилена, предположительно участвующих в регуляции прорастания и роста мужского гаметофита в системе пыльца-пестик. В этой связи планировалось решить следующие задачи:

1. Выяснить, изменяется ли внутриклеточный (цитоплазматический) pH гидратированных пыльцевых зерен под действием экзогенных фитогормонов (ИУК, АБК, гиббереллинов и цитокининов).

2. Протестировать чувствительность мембранного потенциала плазмалеммы гидратированных пыльцевых зерен к действию экзогенных фитогормонов, а также ионов К+, которые могут выступать в роли основных потенциал-определяющих катионов в исследуемой системе.

3. Исследовать характер изменения факторов, инициирующих образование этилена в системе пыльца-пестик in vivo после самосовместимого и самонесовместимого опыления, для чего проследить динамику следующих процессов:

(а) изменений в тканях исследуемой системы уровня АЦК

как предшественника этилена в пути биосинтеза этого гормона;

(б) изменения в той же системе активностей ключевых ферментов, АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы, участвующих в синтезе этилена;

(в) образования этилена в тех же тканях.

Научная новизна. Проведенное исследование представляет собой одну из первых работ, направленных на решение проблемы, касающейся участия гормонов в межклеточных взаимодействиях в системе пыльца-пестик в прогамной фазе оплодотворения. Обнаружено, что экзогенные фитогормоны способны к транзиторной модуляции цитоплазматического pH гидратированных пыльцевых зерен. Впервые установлено, что в плазматической мембране клеток пыльцевого зерна функционируют верапамил/ нифедипин - ингибируемые Са 2+-проницаемые каналы, которые активируются при деполяризации этой мембраны и ответственны за поглощение клетками внеклеточного кальция и тем самым за генерацию в них кальциевого сигнала. Результаты работы свидетельствуют в пользу того, что этилен совместно с другими фитогормонами (ИУК, АБК, гиббереллинами и цитокининами) контролирует прорастание и рост мужского гаметофита в системе пыльца-пестик. Получены данные, свидетельствующие об участии АЦК,

предщественника в пути биосинтеза этилена, а также активностей двух ключевых этилен-образующих ферментов, АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы, в регуляции прорастания и последующего роста пыльцевых трубок. Научно-практическое значение. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения регуляторных механизмов опыления и оплодотворения у растений, а также в селекционной практике для получения гибридных семян. Материалы диссертации могут быть использованы в курсе лекций по физиологии и биохимии растений для студентов биологических и сельскохозяйственных ВУЗов. Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на Молодежной конференции (Киев, 2002); на V съезде общества физиологов России (Пенза, 2002); конференции "Физиология растений и экология на рубеже веков" (Ярославль, 2003); на XI съезде Русского ботанического общества (Новосибирск-Барнаул, 2003); VIII международной конференции ботаников С.-Петербург, 2004); Botanikertagung-2004 (Брауншвейг, Германия); Международной конференции «Проблема физиологии растений севера» (Петрозаводск, 2004); 14th FESPB Congress (Cracow, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ы страницах машинописного текста, включает 21 рисунок, список литературы включает; наименований.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследования. Объектом исследования служили растения петунии двух клонов (самосовместимого и самонесовместимого). Растения выращивали в оранжерее и вегетационном домике Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева в условиях почвенной культуры при естественном освещении. Самосовместимый и самонесовместимый клоны петунии размножали черенкованием соответствующих растений. Черенки выращивали в пробирках на агаризованной среде Мурасиге и Скуга. После укоренения черенки пересаживали в вазоны с почвой и выращивали в оранжерее. Для определения содержания АЦК и активности АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы свежесобранный материал (зрелую пыльцу, пестики, а также их части (рыльце, столбик и завязь)) замораживали в жидком азоте, а затем хранили при -70°С. Для определения цитоплазматического pH пыльцевых зерен и регистрации их мембранного потенциала использовали свежесобранную пыльцу.

Определение содержания АЦК проводили по методу Lizada и Yang (1979). Образцы (50 мг) на холоду гомогенизировали в присутствии 1,5 мл 0,2 М ТХУ. АЦК экстрагировали в течение 2 ч. Центрифугировали в течение 5 мин при 2300g. Затем в сосудик (15 мл) добавляли 1 мл

супернатанта, 0,6 мл дистиллированной воды и 0,2 мл 0,01 М сулемы. Сосудик герметично закрывали пробкой из самоуплотняющейся резины, через которую шприцем вводили 0,2 мл смеси из гипохлорида Na (5,25%) и насыщенного раствора NaOH (в соотношении 2:1), образующийся из АЦК этилен определяли на газовом хроматографе (Ракитин и Ракитин 1986).

Определение активности АЦК-оксидазы проводили по методу Liu et al (1999) с модификациями. Навеску замороженной ткани (50 мг) для экстракции АЦК-оксидазы гомогенизировали в присутствии 5% (w/w) поливинилпирролидона и 1,5 мл среды, содержащей 0,1 М трис-HCl (pH 7,5), 10% (v/v) глицерина, 2мМ DTT, ЗОмМ аскорбата натрия. Далее гомогенат фильтровали через стеклянный фильтр (GFC). Все операции проводили при 4°С. Экстракт, содержащий АЦК-оксидазу, инкубировали с 1мл реакционной смеси, содержащей 0,1 М трицина (pH 7,5), 10% (v/v) глицерина, 1мМ аскорбата натрия, О,1мМ FeSTO,,, 20мМ NaHCО3 и 1мМ АЦК при 30°С в течение 1 ч в герметичном сосуде. Для определения фонового содержания АЦК в растительном экстракте проводили реакцию: 0,5 мл растительного экстракта с 0,5 мл реакционной смеси (без АЦК). Затем определяли количество образовавшегося этилена (Ракитин и Ракитин 1986).

Определение АЦК-синтазной активности проводили по методу (Bui and O'Neill 1998) с модификациями. Навеску измельченной замороженной ткани (50 мг) гомогенизировали в 1,5 мл среды, содержащей 100 мМ Hepes-KOH (pH 8,5), 4 мМ DTT, 10 мкМ PLP, 20% (v/v) глицерина. Гомогенат фильтровали через GFC, полученный экстракт диализировали при 4°С в течение 3 ч против одной смены буфера: 10 мМ Hepes-KOH (pH 8,5), 10% (v/v) глицерина и ЮмкМ пиридоксаль-5'-фосфата (PLP). Активность АЦК-синтазы определяли, инкубируя 0,5 мл растительного экстракта с 0,5 мл буфера, содержащего 200 мкМ аденозилметионина (AdoMet), 10 мкМ PLP, 200 мМ Hepes-KOH (pH 8,5) в течение 60 мин при 30°С. Для определения фонового содержания АЦК в растительном экстракте после диализа проводили реакцию 0,5 мл растительного экстракта с 0,5 мл буфера (без AdoMet). Количество образовавшейся АЦК определяли по методу Lizada и Yang (1979).

Регистрация мембранного потенциала пыльцевых зерен. Мембранный потенциал гидратированных пыльцевых зерен регистрировали при помощи потенциал-чувствительного красителя diS-C3-(5), наблюдая за изменением флуоресценции образцов при 670 нм, возбуждая ее светом при 622 нм. Измерения проводили на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi-850 (Япония) в стандартных кюветах с длиной оптического пути 1 см без перемешивания их содержимого в ходе экспериментов. Основная среда инкубации пыльцевых зерен (2 мл) содержала 0,3 М сахарозу, 25 мМ MES-Трис (pH 6,9), 0,17 мкМ diS-C3-(5) и 100-200 мкг/мл общего клеточного белка. Свежесобранную пыльцу в этих экспериментах инкубировали в среде, содержащей 0,3 М сахарозу и 25 мМ MES-Трис, pH 6,9.

Определение цитоплазматического pH пыльцевых зерен.

Цитоплазматический pH пыльцевых зерен оценивали после их предварительной нагрузки pH-индикатором флуоресцеин диацетатом или бис-карбоксифлуоресцеин диацетатом. В цитозоле эти соединения способны превращаться соответственно во флуоресцеин и бис-карбоксифлуоресцеин, которые характеризуются выраженной pH-зависимостью флуоресценции их спектров. На основании измерений интенсивности флуоресценции образцов при 530 нм, возбуждаемой при 440 (F440) и 490 (F490) нм, рассчитывали величину F490/F440 как меру цитоплазматического pH (Трофимова, Молотковский, 1988). Пыльцевые зерна инкубировали в присутствии указанных соединений в течение 15 мин. Затем пыльцевые зерна отмывали. от среды, содержащей рН-индикатор, и помещали их в 1 мл среды (0,3 M сахарозу и 25 мМ MES-Трис, pH 6,9), использованной для измерения флуоресценции клеток, нагруженных тем или иным pH-индикатором. Измерения флуоресценции проводили на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi- 850 (Япония). В экспериментах, тестирующих эффекты экзогенных гормонов на цитоплазматический pH пыльцевых зерен, использовали водные растворы соответствующих гормонов: ИУК (5, 10 и 50 мкМ), АБК (5 и 10 мкМ), гиббереллина Аз (5 мкМ), 6-БАП (5 мкМ). Все эксперименты проводили в трех биологических и пяти аналитических повторностях.

Регистрация Са2+ -поглощающей способности пыльцевых зерен. О Са 2+-поглощающей способности пыльцевых зерен судили по изменению уровня кальция во внеклеточной среде, который регистрировали при помощи непроникающего через мембраны Са2+ - индикатора арсеназо III. Все измерения проводили на спектрофотометре Hitachi-557 в двухволновом (650-720нм) или двухлучевом режимах работы прибора. Основная среда инкубации пыльцевых зерен (1,95 мл) содержала 0,3 M сахарозу, 10 мМ MES- Трис (pH 6,4), 19 мкМ арсеназо III, 8% Ficoll и 100200 мкг/мл общего клеточного белка. Собранную пыльцу- до использования в экспериментах хранили в среде, содержащей 0,3 M сахарозу и 25 мМ MES-Трис, pH 6,9.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Прорастание пыльцевых зерен и рост пыльцевых трубок в значительной степени контролируются транспортом ионов К+, Са2+ и Н+ через их плазматическую мембрану (Brewbaker and Kwack 1963; Feijo et al 1995; Messerli and Robinson 1997; Geitmann and Cresti 1998; Messerli et al 1999; Dutta and Robinson 2004; Iwano et al 2004).

Согласно имеющимся в литературе данным (Gilroy and Jones 1992; Heimovaara-Dijkstra et al 1994; Brault et al 2004), трансдукция гормональных сигналов в растительных клетках может включать в себя транзиторный сдвиг в ту или иную сторону их цитоплазматическою pH и/или транзиторное увеличение уровня цитоплазматического свободного

Са2+. Последний эффект часто является результатом деполяризации плазматической мембраны или соответствующей модуляции чувствительности открывания в ней ионных, в том числе кальциевых, каналов к трансмембранному электрическому потенциалу (Беагпа1еу й а1 1997). Иначе говоря, сам процесс открывания Са2+-каналов в плазмалемме растительных клеток может быть чувствительным к действию фитогормонов, и эта чувствительность способна отражаться также в изменении степени поляризации данной клеточной мембраны.

В экспериментах, проведенных в настоящей работе, мы попытались выяснить, способны ли экзогенные фитогормоны оказывать влияние на электрохимическое поведение плазмалеммы гидратированных пыльцевых зерен, а также на поддержание их внутриклеточного ионного гомеостаза. Учитывая сказанное выше, в настоящей работе мы попытались выяснить, чувствительны ли к действию экзогенных фитогормонов цитоплазматический рН и мембранный потенциал пыльцевых зерен петунии, инкубируя их в буферной среде, и поэтому находящихся в полностью гидратированном состоянии.

Влияние экзогенных фитогормонов на цитоплазматический рН гидратированных пыльцевых зерен петунии

Проведенные нами эксперименты показали, что цитоплазматический рН пыльцевых зерен петунии (6.9) только в слабой степени зависел от рН инкубационной среды (рис.1).

7,19 1,0

5,0 (.$ 6,0 М 7,0 7,1 1,0

рН инкубационной среды

Рис.1. Зависимость величины цитоплазматического pH пыльцевых зерен от pH инкубационной среды

Использованные нами гормоны после внесения их в среду культивирования пыльцевых зерен по-разному влияли на их внутриклеточный рН (рис. 2). АБК вызывала закисление цитозоля (0,150,2 ед. рН) клеток пыльцы через 5 мин, а в последующие 15 мин мы

наблюдали постепенное обращение этого эффекта. Подобный эффект

6-БАП

5 10 15 20

0 5 10 15 20

Время, мин

Рис.2. Действие экзогенных гормонов на цитоплазматический рН пыльцевых зерен

• гормон —О— контроль

вызвал и 6-БАП (0,17-0,2 ед.рН). ИУК и ПС вызывали сходные между собой изменения (через 2-5 мин - закисление (0,3-0,4 ед.рН), затем -восстановление исходной величины pH и даже защелачивание (0,2 ед.рН)).

Обращает на себя внимание двухфазный характер кинетики изменения цитоплазматического pH пыльцевых зерен под действием экзогенных фитогормонов. Важно отметить, что первая, начальная фаза этого процесса развивалась достаточно быстро и отражала снижение данного параметра (0,1-0,3 ед.рН). Вторая, более медленная фаза, феноменологически представляет собой восстановление его исходного значения. Принимая во внимание отмеченные выше особенности кинетики сдвига цитоплазматического pH, можно высказать некоторые предположения относительно механизма наблюдаемого действия фитогормонов. Один из них мог бы основываться на активности Н+-АТФазы, то есть протонного насоса, локализованного в плазмалемме пыльцевых зерен. Известно, что Н+-АТФаза плазмалеммы растительных клеток активируется при закислении их цитозоля (Трофимова 1993). Поэтому не исключена возможность активации такого фермента в ответ на гормон- индуцируемое смещение pH цитоплазмы пыльцевых зерен. В принципе, рассматриваемые здесь процессы способны включаться в механизм запуска прорастания пыльцевых зерен и роста пыльцевых трубок. Это предположение основывается на важной роли Н+-АТФазы в поляризации плазмалеммы пыльцевых зерен и, тем самым, в энергизации трансмембранных потоков ионов К+ как основных неорганических осмолитов, транспортируемых внутрь клеток, растущих растяжением. Следует также отметить, что тенденция к защелачиванию цитоплазмы пыльцевых зерен, наблюдаемая в присутствии ИУК и ГК3. после завершения процесса восстановления исходного значения цитоплазматического pH, может указывать на реализацию одного из условий, необходимых для запуска ростового процесса. В частности, известно, что для роста требуется синтез белка, который активируется при защелачивании цитозоля. Применительно к пыльцевым зернам, об этом же свидетельствуют результаты, полученные в работе Матвеевой и др. (2002).

Таким образом, полученные данные о действии фитогормонов на гидратированные пыльцевые зерна петунии позволяют заключить, что транзиторное смещение их цитоплазматического pH в присутствии фитогормонов может говорить о физиологической значимости наблюдаемых эффектов, а именно, об их потенциальной роли в запуске ростового процесса.

Действие экзогенных фитогормонов и ионов К+ на мембранный потенциал плазмалеммы гидратированных пыльцевых зерен

Как уже выше отмечалось, действие фитогормонов в растительных клетках может быть опосредовано открыванием кальциевых каналов, функционирующих в плазмалемме и ответственных за поступление

внеклеточного кальция внутрь растительных клеток, то есть за генерацию в них кальциевого сигнала. С другой стороны, известно, что как в животных, так и в растительных клетках открывание Са2+-каналов запускается, как правило, деполяризацией их плазматической мембраны (Miedema et al 2001). Исходя из этих представлений, в дальнейших экспериментах мы решили выяснить, функционируют ли подобные Са2+-каналы в плазмалемме пыльцевых зерен петунии. В случае их функционирования и наличия на этой мембране трансмембранного электрохимического градиента ионов Са2+, направленного внутрь клеток, следует ожидать заметного снижения уровня данного катиона во внеклеточной среде из-за поглощения его клетками.

Эксперименты, проведенные нами с использованием арсеназо III -известного Са2+-индикатора, не проникающего через клеточные мембраны, показали, что такой эффект действительно наблюдается и инициируется при деполяризации плазмалеммы пыльцевых зерен (рис.3). Деполяризующим стимулом может быть добавление к суспензии пыльцевых зерен сантимолярных концентраций КС1 или миллимолярных концентраций сильно липофильного катиона тетрафенилфосфония (ТФФ+) (рис.3) . Как следует из рис.3, в К+-содержащей клеточной суспензии происходит такое изменение спектра поглощения арсеназо III, которое соответствует уменьшению концентрации комплекса этого красителя с ионами Са2+ во внеклеточной среде (рисЗА, кривая 2). Кинетика наблюдаемых спектральных изменений арсеназо III (рис.ЗБ, контроль) включает в себя как быструю, так и медленную фазы. Тот факт, что действие ТФФ+ имитирует влияние экзогенного К+ (рис.ЗА, кривая 3), дает основание предполагать, что наблюдаемые эффекты обусловлены деполяризацией плазматической мембраны пыльцевых зерен в присутствии обоих катионов.

Справедливость этого предположения была подтверждена результатами, полученными с использованием потенциал чувствительного красителя dis-C3-(5) (рис.4). Из приведенных на рис. 4 данных следует, что мембранный потенциал пыльцевых зерен быстро снижался в присутствии как КС1, так и ТФФ+.

Совокупность описанных выше наблюдений говорит в пользу активирующего действия деполяризации пыльцевых зерен на поглощение ими Са +. Данные о том, что амплитуда быстрой фазы спектрального ответа арсеназо III существенно снижалась в присутствии блокаторов кальциевых каналов клеточных мембран (нифедипина и верапамила (рис.ЗБ)) можно рассматривать как указание на участие Са2+-каналов в транспорте Са2+ через плазматическую мембрану пыльцевых зерен. Такая интерпретация, однако, справедлива только в том случае, если используемые нами блокаторы Са2+-каналов не оказывают ингибирующего влияния на активность К+-каналов, скорее всего ответственных за деполяризацию мембран пыльцевых зерен в К+-содержащей среде.

Рис.3. Поглощение Са2+ пыльцевыми зернами, вызываемое добавлением КС1 к клеточной суспензии, содержащей Са2+ - индикатор арсеназо III, и чувствительность этого процесса к блокаторам Са2+ -каналов.

(А) Изменение спектра поглощения арсеназо III, обусловленное снижением уровня Са2+ во внеклеточной среде и наблюдаемое через 10 минут после добавления к клеточной суспензии в контрольной кювете 100 мМ КС1 (кривая 2). Базовая линия (1) записана после предварительной компенсации разности поглощений содержимого контрольной и опытной кювет при действии спектрофотометра в режиме коррекции базовой линии. Для сравнения показан дифференциальный спектр поглощения арсеназо III, демонстрирующий действие на клетки пыльцы 15 мМ тетрафенилфосфоний хлорида (кривая 3). (Б) Кинетика К+- зависимых спектральных изменений арсеназо III. Стрелкой указано добавление 60 мМ KCI. Нифедипин (50 мкМ) и верапамил (20 мкМ) были добавлены к клеточной суспензии за 5 мин до запуска процесса поглощения кальция клетками.

KCl

верэпамил

А КС

} AF/F= 0,030 |

2 мин

+ нифедипин

контроль

AF/F= 0.061

2 мин

Рис. 4 Деполяризующее действие К+ и тетрафенилфосфония (ТФФ4) на клетки пыльцы и эффекты нифедипина и вераламила на К+-зависимую диссипацию мембранного потенциала, КС1 (100 мМ) и ТФФ+ (4мМ) добавлены к клеточной суспензии, когда снижение флуоресценции diS-Сз- (5), обусловленное распределением красителя между средой инкубации и клетками, достигло стационарного уровня. К+ -зависимая деполяризация клеток в присутствии нифедипина и верапамила прослежена при их концентрациях в инкубационной среде, соответственно равных 50 и 30 мкМ.

Возможность такого побочного действия нифедипина и верапамила была апробирована нами в экспериментах с (И8-С3-(5). Их результаты показали, что в присутствии данных соединений амплитуда К+-индуцируемого увеличения флуоресценции (И8-С3-(5) не только не снижалась, а даже в заметной степени возрастала (Рис. 4). Таким образом, действие блокаторов Са 2+-каналов приводило к гиперполяризации плазмалеммы пыльцевых зерен, причем этот эффект не связан с закрыванием в ней К+-каналов.

В отличие от экзогенных ионов калия, изменение поляризации плазмалеммы пыльцевых зерен носило совсем иной характер под влиянием экзогенных фитогормонов (рис. 5). В этом случае деполяризации мембран пыльцевых зерен не происходило. Напротив, некоторые из выбранных гормонов (АБК и 6-БАП) даже инициировали их быструю гиперполяризацию.

Рис. 5 Выявление наличия мебранного потенциала на плазматической мембране пыльцевых зерен с помощью флуоресцентного потенциал чувствительного красителя ШЗ- Сз - (5) и действие на него экзогенных фитогормонов. Стрелками указано добавление к суспензии пыльцевых зерен 5 мкМ АБК, 5 мкМ ГК, 5 мкМ ИУК, 5мкМ 6-БАП и 60 мМ КС1. Возрастание флуоресценции ШЗ- Сз -(5) в присутствии КС1 рассматривается как указание на наличие трансмембранной разности электрических потенциалов на плазмалемме пыльцевых зерен.

Судя по отсутствию изменений в поглощении внеклеточного Са +-индикатора арсеназо III, фитогормоны, в отличие от экзогенных ионов К+,

Г' 2 +

не вызывали транслокации ионов Са в том или ином направлении через плазмалемму пыльцевых зерен. Этот факт согласуется с отсутствием деполяризующего действия фитогормонов на величину их мембранного потенциала. Вместе с тем представленные здесь результаты не исключают генерации в пыльцевых зернах кальциевого сигнала, то есть транзиторного увеличения в них уровня свободного Са2+, под действием фитогормонов за счет выхода ионов Са2+ в цитозоль из внутриклеточных Са-депо. С генерацией такого сигнала, возможно, связан индуцируемый фитогормонами относительно быстрый сдвиг цитоплазматического pH гидратированных пыльцевых зерен. Высказанная в предыдущем разделе гипотеза о физиологической роли гормон индуцируемого сдвига цитоплазматического pH представляет собой одну из возможных интерпретаций характера участия фитогормонов в стимуляции ростового процесса.

Этилен как фактор гормональной регуляции прогамной фазы оплодотворения

Этилен участвует в регуляции репродуктивного процесса от закладки цветочных почек до созревания плодов. Индуцированное опылением образование и выделение этилена тканями пестика активно исследуется, с одной стороны, в связи с последующими процессами старения и опадения цветков (Whitehead et al 1984; Hoekstra and Wepes 1986; Peach et al 1987; Woltering 1990; Wang et al 1996; Clark et al 1997; Jones and Woodson 1997; Nakatsuka et al 1998 и др.), а с другой стороны, из-за возможного участия этого гормона в регуляции межклеточных взаимодействий в системе пыльца-пестик в прогамной фазе оплодотворения (Burg and Dijkman 1967; O'Neill et al 1993; Ковалева и др. 2000; Weterings et al 2002; Mol et al 2004). Предполагается, что сигнал опыления передается от опыленной поверхности рыльца к другим органам цветка (столбику, завязи, лепесткам венчика и т.д.). Накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что этилен и его предшественник АПК вовлечены в этот процесс.

Для изучения вопроса о роли этилена в процессе прорастания и роста мужского гаметофита петунии in vivo мы определили содержание предшественника этилена - АЦК (1-аминоциклопропан-карбоновой кислоты) и активности двух ключевых ферментов, вовлеченных в биосинтез этилена. А именно, АЦК-синтазы (катализирующей превращение аденозилметионина в АЦК) и АЦК-оксидазы (превращающей АЦК в этилен). Кроме того была определена продукция этилена этилена в системе пыльца-пестик петунии. Исследование проводили на двух клонах петунии, у которых при самоопылении пыльцевые трубки либо растут до завязи и осуществляют оплодотворение

(самосовместимый клон), либо останавливаются в тканях столбика вследствие гаметофитной самонесовместимости (самонесовместимый клон).

Активность АЦК-синтазы в системеп ыл ьца-пестик

Для выяснения вопроса о том, как связана активность АЦК-синтазы с процессом прорастания и роста пыльцевых трубок, мы определили ее активность в системе пыльца-пестик петунии двух клонов после самосовместимого и самонесовместимого опыления.

Рис.6. Активность АЦК- синтазы в пестиках петунии двух клонов после опыления

самосовместимыи клон самонесовместимый клон

Активность АЦК-синтазы присутствовала во всех частях пестика после обоих типов опыления, однако ее активность в рыльцах была существенно выше, чем в столбиках и завязях (рис.6). Для обоих типов опыления характерен волнообразный характер изменений активности АЦК-синтазы в рыльцах. Максимальный пик активности фермента в рыльцах наблюдали через 3 и 7 ч после самосовместимого опыления и через 2 и 5 ч после самонесовместимого опыления. Резкая разница между клонами в активности АЦК-синтазы выявлена в столбиках и завязях через 2 ч после опыления: после самосовместимого опыления активность АЦК-синтазы в столбиках в 4 раза (а в завязях - в 5 раз) выше активности АЦК-синтазы при самонесовместимом опылении.

Полученные результаты находятся в полном соответствии с литературными данными (WeteIings et al 2002) о том, что мРНК АЦК-синтазы, локализованные в периферийных зонах проводниковой ткани пестика табака, аккумулируются волнообразно в соответствии с фронтом прорастания пыльцевых трубок. Прорастание пыльцевых зерен и рост пыльцевых трубок в течение 4 ч сопровождались сходной активностью АЦК-синтазы в тканях рыльца (рис.6). Значительная разница между клонами выявлена в активностях АЦК-синтазы в тканях столбика и завязи через 2 ч после опыления: подъем активности фермента в случае самосовместимого опыления и его отсутствие в случае самонесовместимого опыления. Этот факт позволяет допустить, что прорастание и рост пыльцевых трубок включают активацию АЦК-синтазы в системе пыльца-пестик, специфичную как для самосовместимого, так и самонесовместимого опыления.

Содержание предшественника этилена АЦК в системе пыльца-пестик петунии

Опыление очень быстро запускает синтез АЦК в тканях рыльца (рис. 7). После самоопыления характер изменений содержания АЦК в рыльцах обоих клонов был идентичным. Однако при самосовместимом опылении концентрация АЦК превышала в 2,5 раза ее концентрацию при самонесовместимом опылении. Максимум в содержании АЦК наблюдали через 2 ч после опыления. Концентрации АЦК в тканях столбика и завязи у обоих клонов в течение 7 ч после опыления не менялись и были в 5 раз ниже концентраций АЦК в рыльцах.

Учитывая данные о высоком содержании АЦК в пыльце, можно предположить, что при попадании пыльцы на рыльце именно ее АЦК запускает автокаталитический биосинтез этилена в рыльце. Более активно идущий процесс автокатализа после самосовместимого опыления, возможно, обусловлен более высоким содержанием АЦК в пыльце самосовместимого клона (свыше 300 нмоль//» сырого веса). Последнее соображение получило подтверждение в последующих экспериментах при определении содержания АЦК в системе пыльца-пестик петунии двух

клонов после перекрестных опылений (рис.8). Более высокий уровень АЦК наблюдали в случае прорастания пыльцевых зерен петунии самосовместимого клона на рыльце самонесовместимого клона. В этом случае также обращает на себя внимание незначительный подъем в уровне АЦК и в тканях завязи в этот период. В целом, после перекрестных опылений, как и при самоопылении, высокий уровень АЦК наблюдали только в тканях рыльца. Пик в содержании АЦК имел место через 2-4 ч после опыления.

Сопоставление изменений в содержании АЦК в рыльцах петунии двух клонов при само- и перекрестных опылениях (рис.9) позволяет сделать следующее заключение. Уровень АЦК мужского гаметофита является существенным фактором, индуцирующим автокатализ биосинтеза этилена в системе пыльца-пестик. Прорастание пыльцевых зерен после самосовместимого опыления характеризовалось высоким содержанием АЦК в тканях рыльца (2,5 нмоль /рыльце), а самый низкий уровень АЦК (ниже 1 нмоль/рыльце) сопровождал прорастание пыльцевых зерен после самонесовместимого опыления, в то время как два варианта перекрестного опыления занимали промежуточное положение.

2.1 2,0 1.« 1,0 0,6 0,0

1 о.зо | 0 2! ! О 20 | 0.1» = 0,10 ^ 0,09 С 0,00

0,30 0,21 ' 0,20 0,1« 0,10 0,00 0,00

Рыльце

3 4 5 0 7 Столбик

0 1 г 3 4 в « 7 Время после опыления, ч Рис.8. Содержание АЦК в рыльцах, столбиках и завязях петунии самосовместимого и самонесовместимого клонов после перекрестных опылений

я рыльце СН клона X пыльцой СС клоне — — рыльце СС клона X пыльцой СН клона

0,1

0 1 2 3 4 5 0 Время после опыления, ч

Рис.8. Содержание АЦК в рыльцах петунии

сам осовм естим ого и самонесовместимого клонов лосле самоопыления и перекрестных опылений

—рыльце СС клона X пыльцой СС клона —— рыльце СН клонаХ пыльцой СН клона рыльце СС клона X пыльцой СН клона рыльце СН клона X пыльцой СС клона

На рис.10 представлена динамика содержания АЦК в системе пыльца-пестик петунии двух клонов во время прохождения прогамной фазы оплодотворения (1-7 ч после опыления) и оплодотворения (24 ч после опыления), которые характеризуются двумя пиками выделения этилена, составляющими начальную и конечную стадию синдрома постопыления. Процесс оплодотворения (у самосовместимого клона после самоопыления) сопровождается многократным повышением содержания АЦК в системе пыльца-пестик, включая ткани рыльца и завязи. Отсутствие оплодотворения у самонесовместимого клона (при самоопылении у которого пыльцевые трубки прекращают свой рост в проводниковых тканях столбика вследствие гаметофитной самонесовместимости) не вызывает каких-либо колебаний в содержании АЦК ни в тканях рыльца, ни в завязи. Высокая концентрация АЦК в рыльцах самосовместимого клона, возможно, связана с началом отделения и опадания столбика, которые в случае самонесовместимого опыления происходят позднее.

Активность АЦК-оксвдазы в системе пыльца-пестик

У петунии в процессах опыления и постопыления функционируют 4 гена АЦК-оксидазы, два из которых, АСОЗ и АСО4, экспрессируются в тканях развивающегося пестика (Tang et al 1993). В опытах по гибридизации in situ было установлено, что мРНК упомянутых выше АЦК-оксидаз локализованы в секреторных клетках рыльца (Tang et al 1993). Активность АЦК-оксидазы в рыльцах и завязях петунии двух клонов в процессе прорастания и роста пыльцевых трубок в тканях рыльца и столбика находится на постоянном близком по величине уровне, а в случае самонесовместимого опыления наблюдалась некоторая тенденция к ее повышению (рис.11). Возможно, запуск синтеза этилена осуществляет совместно с АЦК пыльцы АЦК-оксидаза рыльца.

Динамика выделения этилена тканямирыльца петунии двух клонов при само- и перекрестном опылении

Динамика выделения этилена тканями рыльца петунии двух клонов после само- и перекрестного опыления в течение 8 ч (вариант рыльце СС клона х пыльцой СН клона в течение 3 ч) после каждого из четырех видов опыления имело свою специфику (рис12). Максимально высокий уровень выделения этилена характерен для тканей рыльца самонесовместимого клона после самоопыления, в то время как прорастание пыльцевых зерен самосовместимого клона (после самоопыления) сопровождал самый низкий уровень этилена. Два варианта перекрестного опыления занимали промежуточное положение. Полученные нами результаты находятся в полном соответствии с литературными данными о том, что снятие самонесовместимости у лилии сопровождалось снижением уровня выделения этилена (Suzuki et al 2001).

012345678 Время после опыления, ч

Рис. 12. Выделение этилена тканями рыльца летун» самосовместимого и самонесовместимого клонов после самоопыления и перекрести опылений

» рыльце СС клоне х пыльцой СС клоне —с— рыльце СН клона х пыльцой СН клона т рыльце СС клона х пыльцой СН клона рыльце СН клона х пыльцой СС клона

Таким образом, прорастание и рост пыльцевых зерен петунии на воспринимающей поверхности рыльца после самосовместимого и самонесовместимого опыления характеризуются различными уровнями синтеза этилена (рис.П) и его предшественника АЦК (рис.9) в тканях рыльца. В случае самосовместимого опыления отмечено более высокое содержание АЦК, тогда как продукция этилена сохранялась на низком уровне. В случае самонесовместимого опыления более интенсивному синтезу этилена соответствовало менее |высокое содержание АЦК.

Заключение

В настоящей работе выявлен ряд факторов, участвующих в регуляции прогамной фазы оплодотворения, которая включает гидратацию пыльцы, ее прорастание в тканях рыльца и рост пыльцевых трубок в тканях столбика.

Установлено, что некоторые параметры ионного гомеостаза гидратированных пыльцевых зерен петунии обнаруживают чувствительность к экзогенным гормонам (ИУК, АБК, 6-БАП, ГКз). К их числу следует отнести цитоплазматический pH пыльцевых зерен, который временно снижался под действием всех испытанных нами фитогормонов. Вместе с тем мембранный потенциал на плазмалемме пыльцевых зерен оставался практически неизменным в присутствии ИУК или ГКз, только в слабой степени возрастал под действием АБК или 6-БАП, но достаточно быстро снижался после добавления к суспензии пыльцевых зерен сантимолярных концентраций ионов К+ или миллимолярных концентраций тетрафенилфосфония, известного сильно липофильного катиона. К+-зависимая деполяризация пыльцевых зерен вызывала быстрое поглощение ими ионов Са2+ из инкубационной среды, которое в заметной степени подавлялось в присутствии блокаторов Са2+ -каналов клеточных мембран, верапамила и нифедипина. Важно отметить, что данные, свидетельствующие о функционировании в плазмалемме пыльцевых зерен Са2+ -каналов, открываемых при ее деполяризации и блокируемых использованными ингибиторами, не исключают также возможной чувствительности активности таких каналов к действию фитогормонов. Сделано предположение о том, что в процессе гидратации пыльцевых зерен, который запускается в основном потоками К+, возможно, принимает участие АБК, так как ее эффекты включали гиперполяризацию мембранного потенциала пыльцевого зерна и закисление pH цитозоля, а эндогенное содержание АБК в прорастающих in vitro пыльцевых зернах, как показано ранее (Ковалева и др. 2003), падало через час до нуля.

Особое внимание в данной работе уделено процессу образования этилена (с участием АЦК-оксидазы) и предшествующего ему образования АЦК (с участием АЦК-синтазы) в системе пыльца-пестик петунии после самосовместимого и самонесовместимого опыления в прогамной фазе оплодотворения. Наблюдаемые нами изменения уровня АЦК, а также двух ключевых ферментов биосинтеза этилена, в системе пыльца-пестик дают основание полагать, что этилен контролирует прорастание и рост мужского гаметофита в спорофитных тканях пестика. Сопоставление уровня выделения этилена и содержания АЦК в системе пыльца-пестик после самосовместимого и самонесовместимого опыления позволяет заключить, что синтез этилена и АЦК в тканях рыльца сопровождает процессы гидратации и прорастания пыльцевых зерен на воспринимающей поверхности рыльца и, возможно, включается в запуск межклеточных взаимодействий в системе пыльца-пестик.

В процессе образования и выделении этилена тканями опыленного рыльца принимают участие оба партнера: мужской гаметофит и спорофитные ткани пестика, включая рыльце, столбик и завязь. Возможно, АЦК пыльцевого зерна совместно с АЦК-оксидазой рыльца запускают автокаталитический биосинтез этилена. Прорастание и рост пыльцевых трубок в тканях рыльца после самосовместимого опыления сопровождаются повышенным (по сравнению с самонесовместимым опылением) содержанием АЦК в тканях рыльца и повышенной активностью АЦК-синтазы в тканях столбика и завязи, в то время как после самонесовместимого опыления отмечено повышенное (по сравнению с самосовместимым опылением) выделение этилена.

Принимая во внимание полученные нами результаты и литературные данные (Ковалева и др.2000; 2003), можно заключить, что этилен совместно с другими гормонами (АБК, гиббереллинами, ИУК и цитокининами) участвует в регуляции прорастания и роста мужского гаметофита в спорофитных тканях пестика как после совместимого, так и несовместимого опыления и, возможно, инициирует межклеточные взаимодействия в системе пыльца-пестик. Мы полагаем, что после самосовместимого опыления этилен контролирует прорастание и рост пыльцевых трубок в тканях рыльца, столбика и завязи совместно с ИУК и гиббереллинами, в то время как после самонесовместимого опыления в подавлении роста пыльцевых трубок в тканях столбика наряду с этиленом участвуют АБК и цитокинины. С этой последней интерпретацией согласуется тот факт, что содержание этих фитогормонов резко возрастало в системе пыльца-пестик петунии после самонесовместимого опыления (Ковалева и др., 2003).

выводы

1) Обнаружено влияние экзогенных фитогормонов на цитоплазматический рН пыльцевых зерен петунии. Его величина временно снижается в присутствии фитогормонов, а последующее обращение этого эффекта приводит к достижению исходного (6.9) (АБК и 6-БАП) или более высокого значения рН (ИУК и ГКз)

2) Внеклеточные ионы К+ контролируют электрохимическое состояние плазмалеммы пыльцевых зерен. Добавление к их суспензии

(в бескалиевой среде) сантимолярных концентраций К+ инициирует быстрое поглощение ионов Са2+ из внеклеточной среды. Последнее опосредовано К+-индуцируемой деполяризацией плазматической мембраны и может рассматриваться как генерация в клетках пыльцы кальциевого сигнала.

3) Установлено, что в плазматической мембране пыльцевого зерна функционируют Са2+ каналы, которые активируются при ее деполяризации и блокируются в присутствии нифедипина или верапамила.

4) Экзогенные фитогормоны не вызывают транслокации Са + через плазматическую мембрану гидратированных пыльцевых зерен. Мембранный потенциал плазмалеммы несколько возрастает под действием АБК или 6-БАП и остается неизменным в присутствии ИУК и ГК3. Эти данные свидетельствуют о том, что действие гормонов связано не с деполяризацией плазмалеммы, а, вероятно, с транзиторным гормон- индуцируемым сдвигом цитоплазматического рН.

5) АЦК мужского гаметофита служит фактором активации АЦК-синтазы и запускает автокаталитический биосинтез этилена в системе пыльца-пестик.

6) АЦК-оксидаза конституитивно присутствует в активной форме во всех частях неопыленного и опыленного пестика.

7) Прорастание мужского гаметофита после самосовместимого опыления сопровождается возрастанием активности АЦК-синтазы в тканях рыльца, столбика и завязи, после самонесовместимого - только в тканях рыльца.

8) Содержание АЦК, а также активности АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы включаются в регуляцию процессов прорастания и роста мужского гаметофита в спорофитных тканях пестика, выступая в роли ключевых факторов, определяющих интенсивность синтеза этилена в прогамной фазе оплодотворения.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Тимофеева Г.В., Андреев И.М., Ковалева Л.В. Протопласты пыльцы петунии как модельная система для изучения трансдукции гормональных сигналов в системе пыльца-пестик // Современные направления в физиологии и генетике растений. Киев. 2002. С. 33.

2. Ковалева Л.В., Добровольская A.A., Родионова Г.Б., Тимофеева Г.В., Ракитин В.Ю. Этилен - фактор роста и развития мужского гаметофита // Тезисы докладов V съезда общества физиологов России. Москва. 2003. С. 400-401.

3. Л.В. Ковалева, Е.В. Захарова, Г.В. Тимофеева, Ю.В. Минкина, В.Ю. Ракитин. Гормональная регуляция роста мужского гаметофита в прогамной фазе оплодотворения у петунии (Petunia hybrida L.) IIXI съезд Русского ботанического общества. Новосибирск-Барнаул .

2003. Том.2. С. 147-149.

4. Захарова Е.В., Добровольская A.A., Минкина Ю.В., Тимофеева Г.В., Ковалева Л.В. Гормональные факторы роста мужского гаметофита in vitro и in vivo// Физиология растений и экология на рубеже веков. Ярославль. 2003. С. 203.

5. Kovaleva L.V., Dobrovolskaya A.A., Rodionova G.B., Timofeeva G.V., Zakharova E.V., Rakitin V.Yu. Ethylene is a factor of petunia male gametophyte growth and development // Botanikertagung 2004. Braunschweig. 2004. P. 27.

6. Тимофеева Г.В. Трансдукция гормональных сигналов в системе пыльца-пестик у петунии (Petunia hybrida L.) // Мат. VIII Межд. Конф. ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург. 2004. С. 139.

7. Г.В. Тимофеева, И.М. Андреев, Л.В. Ковалева. Включаются ли фитогормоны в генерацию кальциевого сигнала в пыльце петунии, запускаемую деполяризацией плазматической мембраны? // Межд. Конф. «Проблемы физиологии растений севера». Петрозаводск.

2004. С. 180.

8. Kovaleva L., Zakharova E., Timofeeva G., Rakitin V. Phytohormones and pollen-pistil interactions in Petunia hybrida L. // The 14th FESPB Congress Book of Abstracts. Cracow. 2004. С 167-168.

9. Андреев И.М., Тимофеева Г.В., Ковалева Л.В. Генерация кальциевого сигнала в пыльцевых зернах, запускаемая деполяризацией плазматической мембраны // ДАН 2005, Т.400. N 5. Принято в печать.

Ю.Ковалева Л.В., Захарова Е.В., Минкина Ю.В., Тимофеева Г.В., Андреев И.М. Прорастание и рост in vitro мужского гаметофита петунии чувствительны к действию экзогенных фитогормонов и сопровождаются изменением их эндогенного уровня. Физиология растений 2005 Т.52. N 4. Принято в печать.

Объем 1,5 п. д._Зак. 106_Тир. 100 экз.

Издательство МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

? ? "!Р 2С35

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тимофеева, Галина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ПРОРАСТАНИЕ И РОСТ МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА В

ПРОГАМНОЙ ФАЗЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Мужской гаметофит.

1.2. Адгезия пыльцевых зерен.

1.3. Гидратация пыльцевых зерен.

1.4. Прорастание мужского гаметофита.

1.5. Пыльцевая трубка

1.6. Рост пыльцевых трубок.

1.7. Факторы регуляции прорастания и роста мужского гаметофита:.

1.7.1. белки.

1.7.2. роль ионов Са2+, Н+, К+, СГ.

1.7.2.1. Са2+.

1.7.2.2. Н*.

1.7.2.3. К+и СГ.

1.7.3. фитогормоны.

1.8. Цель работы.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследования.

У 2.2. Вегетативное размножение клонов петунии.

2.3. Определение содержания АЦК.

2.4. Определение активности АЦК-оксидазы in vitro.

2.5. Определение активности АЦК-синтазы in vitro.

2.6. Регистрация мембранного потенциала пыльцевых зерен.

2.7. Оценка цитоплазматического рН пыльцевых зерен.

2.8. Регистрация Са2+ -поглощающей способности пыльцевых зерен.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ФИТОГОРМОНОВ НА

НЕКОТОРЫЕ ПАРАМЕТРЫ ИОННОГО ГОМЕОСТАЗА ГИДРАТИРОВАННЫХ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН ПЕТУНИИ.

3.1. Гормон-индуциру емые изменения цитоплазматического рН.

Ф-. 3.2. Действие экзогенных фитогормонов и ионов К+ на мембранный потенциал плазмалеммы.

3.2. Тестирование поведения экзогенных фитогормонов как факторов, обеспечивающих открывание Са 2+ каналов в плазмалемме пыльцевых зерен, ответственных за поглощение ими внеклеточного кальция. ф

ГЛАВА 4. ЭТИЛЕН - ФАКТОР ПРОРАСТАНИЯ И РОСТА

МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА В ПРОГАМНОЙ ФАЗЕ

ОПЛОДОТВОРЕНИЯ

4.1. Активность АЦК-синтазы в тканях пестика и его частях (рыльце, столбике и завязи) петунии двух клонов после самосовместимого и самонесовместимого опыления.

4.2. Динамика содержания АЦК в системе пыльца-пестик петунии двух клонов (самосовместимого и самонесовместимого) после опылений.

4.3. Активность АЦК-оксидазы в системе пыльца-пестик петунии после самоопыления.

4.4. Динамика выделения этилена тканями рыльца петунии двух клонов после самоопыления и перекрестного опыления.

ГЛАВА 5. ОСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гормональная регуляция прогамной фазы оплодотворения у петунии"

В репродуктивном процессе растений ключевую роль играет прогамная фаза оплодотворения, во время которой гаплоидный мужской гаметофит (пыльцевое зерно или пыльцевая трубка) взаимодействует с диплоидными спорофитными тканями пестика. Межклеточные взаимодействия в системе пыльца-пестик начинаются с попадания пыльцы на рыльце, продолжаются во время роста пыльцевых трубок по проводниковому тракту (межклеточное пространство проводниковых тканей или открытый канал столбика) и завершаются слиянием гамет в завязи. В этот сложный процесс вовлечено множество взаимодействий, включая клеточное узнавание, вне- и внутриклеточную сигнализацию и другие, пока неисследованные события. Изучение механизмов взаимодействия мужского гаметофита со спорофитными тканями пестика, которые в значительной степени определяют возможность последующего слияния гамет при совместимом опылении или ее невозможность при наличии генетически детерминированных барьеров оплодотворения, актуально для фундаментальных исследований фертильности и репродукции растений. Система пыльца-пестик представляет интерес в качестве модельной системы для изучения полярного роста, межклеточных взаимодействий и сигнальной трансдукции. К настоящему времени достигнут значительный прогресс в понимании многих процессов, вовлеченных в регуляцию роста пыльцевых трубок (Бритиков, 1957; Stanley & Linskens, 1974; Cresti & Went, 1976; Clarke & Gleeson, 1981; Knox, 1984; Ferrary et al, 1985; Zuberi & Dickinson, 1985; Bedinger, 1992; Cheung et al, 1993; Mascarenhas, 1993; Pierson et al, 1994; Derksen et al, 1995; Feijo et al, 1995; Cheung, 1996; Malho & Trewavas, 1996; Wolters-Arts et al, 1996; Luu et al, 1997; Taylor & Hepler, 1997; Franklin-Tong, 1999; Li et al, 1999; Pruitt, 1999; Nasrallah, 2000; Geitmann et al, 2000; Гусаковская и Блинцов, 2001; Graaf et al, 2001; Lord & Russel, 2002; Lord, 2003; Cheung et al, 2003). Однако молекулярная основа межклеточных взаимодействий в системе пыльца-пестик пока не изучена.

Данная работа представляет собой одну из первых работ, направленных на решение проблемы, касающейся участия гормонов в межклеточных взаимодействиях в прогамной фазе оплодотворения.

ГЛАВА 1. ПРОРАСТАНИЕ И РОСТ МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА В ПРОГАМНОЙ ФАЗЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) Опыление - одно из ключевых событий репродуктивного процесса растений. Пыльцевое зерно (мужской гаметофит), основная функция которого состоит в доставке двух мужских гамет к зародышевому мешку, попадает на воспринимающую поверхность рыльца пестика, где происходят его адгезия и гидратация, а затем прорастание и рост пыльцевой трубки в проводниковых тканях столбика и завязи.

1.1. Мужской гаметофит Пыльцевое зерно - изолированная клеточная система (зрелое пыльцевое зерно образовано двумя или тремя клетками) - формируется в процессе микроспорогенеза в процессе двух циклов клеточного деления. Мужские гаметы (спермии) или их предшественница -генеративная клетка - располагаются в толще цитоплазмы вегетативной клетки, которая по мере созревания пыльцы дегидратируется и заполняется запасными веществами. Ядро вегетативной клетки контролирует рост и метаболизм пыльцевой трубки (Нокс, 1990).

Структура и метаболизм рыльца, приспособленные к восприятию пыльцы, обеспечивают условия для ее адгезии, гидратации и прорастания, обеспечивая осмотический баланс и достаточное снабжение водой и питательными веществами (Кпох, 1984).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Тимофеева, Галина Владимировна

выводы

2) Внеклеточные ионы К+ контролируют электрохимическое состояние плазмалеммы пыльцевых зерен. Добавление к их суспензии (в бескалиевой среде) сантимолярных концентраций К+ инициирует быстрое поглощение ионов Са из внеклеточной среды. Последнее опосредовано К+-индуцируемой деполяризацией плазматической мембраны и может рассматриваться как генерация в клетках пыльцы кальциевого сигнала.

О-и

4) Экзогенные фитогормоны не вызывают транслокации Са через плазматическую мембрану гидратированных пыльцевых зерен. Мембранный потенциал плазмалеммы несколько возрастает под действием АБК или 6-БАП и остается неизменным в присутствии ИУК и ГКз. Эти данные свидетельствуют о том, что действие гормонов связано не с деполяризацией плазмалеммы, а, вероятно, с транзиторным гормон- индуцируемым сдвигом цитоплазматического рН.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что некоторые параметры ионного гомеостаза гидратированных пыльцевых зерен петунии обнаруживают чувствительность к экзогенным гормонам (ИУК, АБК, 6-БАП, ГКз). К их числу следует отнести цитоплазматический рН пыльцевых зерен, который временно снижался под действием всех испытанных нами фитогормонов. Вместе с тем мембранный потенциал на плазмалемме пыльцевых зерен оставался практически неизменным в присутствии ИУК или ГКз, только в слабой степени возрастал под действием АБК или 6-БАП, но достаточно быстро снижался после добавления к суспензии пыльцевых зерен сантимолярных концентраций ионов К+ или миллимолярных концентраций тетрафенилфосфония, известного сильно липофильного катиона. К+-зависимая деполяризация пыльцевых зерен вызывала быстрое поглощение ими ионов Са из инкубационной среды, которое в заметной степени подавлялось в присутствии блокаторов Са2+ -каналов клеточных мембран, верапамила и нифедипина. Важно отметить, что данные, свидетельствующие о функционировании в плазмалемме пыльцевых зерен Са2+ -каналов, открываемых при ее деполяризации и блокируемых использованными ингибиторами, не исключают также возможной чувствительности активности таких каналов к действию фитогормонов. Сделано предположение о том, что в процессе гидратации пыльцевых зерен, который запускается в основном потоками К+, возможно, принимает участие АБК, так как ее эффекты включали гиперполяризацию мембранного потенциала пыльцевого зерна и закисление рН цитозоля, а эндогенное содержание АБК в прорастающих in vitro пыльцевых зернах, как показано ранее (Kovaleva & Zakharova, 2003), падало через час до нуля.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тимофеева, Галина Владимировна, Москва

1. Андреюк Д.С., Матвеева Н.П., Тукеева М.И., Ермаков И.П. Динамика неорганических ионов в микроспоре и пыльцевых зернах табака в развитии мужского гаметофита // Онтогенез. 2000. 31: 114-119

2. Бритиков Е. А. Физиология опыления и оплодотворения у растений // М., «Знание». 1957.Серия VIII. V.33. 31 С.

3. Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. Возможные факторы индукции ранних этапов эмбриогенеза у покрытосеменных. // Физиол. растений. 2001. 48: 491-498.

4. Карпова JI.B. Физиологические особенности мужского гаметофита покрытосеменных растений на ранних этапах прорастания // Дисс. канд биол. Москва. 1985. 152 с.

5. Ковалева Л.И., Комарова Э.Н. Гаметофитная самонесовместимость у петунии: динамика углеводов в процессе роста пыльцевых трубок // Физиология растений. 1993. 40: 260-264.

6. Ковалева Л.В., Ракитин В.Ю., Добровольская A.A. Гаметофитно-спорофитные взаимодействия в системе пыльца-пестик. II. Выделение этилена и СОг при опылении // Физиол. растений. 2000. 47: 474-477.

7. Ковалева Л.В., Захарова Е.В., Скоробогатова И.В., Карсункина Н.П. Гаметофитно-спорофитные взаимодействия в системепыльца-пестик.З. Гормональный статус в прогамной фазе оплодотворения // Физиол. растений. 2002. 49: 549-552.

8. Ковалева Л.В., Захарова Е.В. Гаметофитно-спорофитные взаимодей- ствия в системе пыльца-пестик: 4. Гормональный статус и механизм самонесовместимости // Физиол. растений. 2004.51:402-406.

9. Матвеева Н.П., Войцех О.О., Андреюк Д.С., Ермаков И.П. Роль ГТ-АТФазы и альтернативной величины внутриклеточного рН на разных стадиях развития мужского гаметофита табака // Онтогенез. 2002. 33: 436-443.

10. Ю.Медведев С.С., Батов А.Ю., Мошков А.В., Маркова И.В. Роль ионных каналов в трансдукции ауксинового сигнала // Физиология растений. 1999. 46: 711-717. П.Нокс Р.Б. Пыльцевое зерно // Эмбриология растений Т.1. М.; Агропромиздат, 1990. С. 224-317.

11. Попова Л.Я. Некоторые вопросы селекции петунии гибридной // Интродукция и селекция цветочно-декоративных растений. "Наука". 1978.

12. Ракитин В. Ю., Ракитин Л. Ю. Определение газообмена и содержание этилена, двуокиси углерода и кислорода в тканях растений // Физиол. растений. 1986. 33: 403-413.

13. Трофимова М.С., Молотковский Ю.Г. рН цитозоля изолированныхпротопластов и его искусственное изменение // Физиол. Растений. 1988.35:629-640.

14. Трофимова М.С. Н^-АТФаза плазмалеммы как компонент рН-стата цитозоля изолированных протопластов // Физиол. растений 1993. 39 : 5-15.

15. Цингер Н. В., Петровская-Баранова Т. П. // Докл. АН СССР. 1961. 138: 436.

16. Чайлахян М.Х., Хрянин В.Н. Пол растений и его гормональная регуляция. М.: Наука, 1982. 176 с.

17. Ai Y.J., Singh A., Coleman C.E., Loerger T.R., Kheyr-Pour A., Kao TH. Self-incompatibility in Petunia inflata — isolation and characterization of cDNAs encoding 3 S-allele-associated proteins // Sex.Plant Reprod. 1990. 3: 323-331.

18. Allwod E.G., Anthony R.G., Smertenko A.P., Reichelt S., Drobak B.K., Doonan J.H., Weeds A.G., Hussey P.J. Regulation of the pollen-specific actin-depolymerizing factor LIADF1H Plant Cell. 2002. 14: 2915-2927.

19. Anderson M.A., McFadden G.I., Bernatzky R., Atkinson A., Oprin T., Dedman H., Tregear G., Farnley R., Clarke A.E. Sequence variability of three alleles of the self-incompatibility gene of Nicotiana alata // Plant Cell. 1989. 1:483-491.

20. Baker R.P., Hasenstein K.H. Hormonal changes after compatible and incompatible pollination in Theobroma cacao L.// Hort.Sci. 1997. 32: 1231-1234.

21. Bar-Shalom D., Mattsson O. Mode of hydration as an important factor in the germination of trinucleate pollen grains // Bot. Tiddskr. 1977. 71:245.

22. Barendse G.W.M., Pereira A.S.R., Berkers P.A., Driessen F.M., van Eyden-Emons A. & Linskens H.F. Growth hormones in pollen, styles and ovaries of Petunia hybrida and Lilium species // Acta. Bot. Neerl. 1970. 19:175-185.

23. Bedinger P. The remarkable biology of pollen // Plant Cell. 1992. 4:879-887.

24. Bednarska E. The effect of exogenous Ca ions on pollen grain germination and pollen tube growth- investigation with the use of Ca and verapamil, La3+and ruthenium red // Sex Plant Reprod. 1989. 2:5358.

25. Bednarska E. Calcium uptake from the stigma by germinating pollen in Petunia officinalis L. and Ruscus asculeatus L. // Sex Plant Reprod.1991. 4:36-38.

26. Bednarska E., Butowt R. Calcium in pollen-pistil interaction in Petunia hybrida Hort. II. Localization of Ca2+ ions and Ca2+-ATPase in unpollinated pistil. Folia Cytochem Cytobiol. 1995. 33:43-52.

27. Bergamini-Mulcahy G., Mulcahy D.L. The two phases of growth of Petunia hybrida (Hotr. Vilm-Andz.) pollen tubes through compatible styles//J Palynol. 1982. 18:61-64.

28. Bibikova T.N., Jacob T., Dahse I., Gilroy S. Local changes in apoplastic and cytoplasmic pH are associated with root hair development in Arabidopsis thaliana // Development. 1998. 125: 29252934.

29. Bui A.Q. & O'Neill S.D. Three 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase genes regulated by primary and secondary pollination signals in orchid flowers // Plant Physiol. 1998. 116:419-428.

30. Burg S.P. & Dijkman M.J. Ethylene and auxin participation in pollen induced fading of Vanda orchid blossoms 11 Plant physiol. 1967. 42:1648.

31. Bush D.R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants Annu Rev Plant Physiol. 1993. 44:513-542.

32. Capkova-Balatkova V., Hrabetova E., Tupy J. Effects of cycloheximide on pollen of Nicotiana tabacum in culture // Biochem Physiol Pflanz. 1980. 175:412

33. Chatfield S.P., Stimberg P., Forde B.G., Leyser O. The hormonal regulation of axillary bud growth in Arabidopsis// Plant J. 2000. 24: 159-169.

34. Chen C.-G., Mau S.-L., Clarke A.E. Nucleotide sequence and style-specific expression of a novel proline-rich protein gene from Nicotiana alata // Plant Mol Biol. 1993. 21:391 -395.

35. Chen C.Y., Wong E.L., Vidali L., Estavillio A., Hepler P.K., Wu H.M., Cheung A.Y. The regulation of actin organization by actin-depolymerizing factor in elongating pollen tubes // Plant Cell. 2002. 14: 2175-2190.

36. Cheung A.Y., May B., Kawata E.E., Gu Q., Wu H-M. Characterization of cDNAs for stylar transmitting tissue-specific proline-rich proteins in tobacco//Plant J. 1993.3: 151-160.

37. Cheung AY. Pollen-pistil interactions in compatible pollination // Proc Natl Acad Sci. 1995. 92: 3077-3080.

38. Cheung A.Y. Pollen-pistil interactions during pollen tube growth // Trends Plant Sci. 1996. 1:45-51.

39. Cheung A.Y., Wang H., Zhan X., Wu H. A transmitting tissue specific pollen tube growth-promoting glycoprotein. Proc. 15th Intern. Congress on Sexual Plant Reproduction. 1998. Wageningen.

40. Cheung A.Y., Chen C.Y., Wu H. M. Actin-depolymerizing factor mediates Rac/RopGTPase-regulated pollen tube growth // Plant cell. 2003. 15:237-249.

41. Chrispeels M.J., Crawford N.M. and Schroeder J.I. Proteins for transport of water and mineral nutrients across the membranes of plant cells//Plant Cell. 1999. 11:661-675.

42. Clark K.R., Okuley J.J., Collins P.D., Sims T.L. Sequence variability and developmental expression of S-alleles in self-compatible and pseudo self-compatible Petunia II Plant Cell. 1990. 2: 815-826.

43. Clarke A.E., Gleeson P., Harrison S., Knox R.B. Pollen-stigma interactions: identification and characterization of surface components with recognition potential // Proc Natl Acad Sci USA. 1979. V. 76. P. 3358.

44. Clarke A.E., Gleeson P.A. Molecular aspects of recognition and response in the pollen-stigma interaction: The phytochemistry of cell recognition and cell surface interactions // Res Adv Phytochem. 1981. V.15.P. 161

45. Clarke S.R., Staiger C.J., Gibbon B.C. and Franklin-Tong V.E. A potential signaling role for profilin in pollen of Papaver rhoeas //Plant1. Cell. 1998. 10:967-979.

46. Collet C.E., Harberd N.P., Leyser O. Hormonal interactions in the control of Arabidopsis hypocotyls elongation // Plant Physiolol. 2000. 124: 553-562.

47. Cresti M., Went J.L., van Pacini E., Willemse M.T.M. Ultrastructure of transmitting tissue of Lycopersicon peruvianum style: development and histochemistry // Planta. 1976. 132:305-312.

48. Cresti M., van Went J.L. Callóse deposition and plug formation in Petunia pollen tubes in situ // Planta. 1976. 133:35-40.

49. Cresti M., Keijzer C J., Tiezzi A., Ciampolini F., Focardi S. Stigma of Nicotiana: ultrastructural and biochemical studies // Am J Bot 1986. 73:1713-1722.

50. Derksen J., Rutten T., van Amstel T., Win A de, Doris F, Steer M. Regulation of pollen tube growth // Acta Bot Neerl. 1995. 44: 93-119.

51. Deshusses J, Gumber SC, Loewis FA. Sugar uptake in lily pollen: a proton symport H Plant Physiol. 1981. 67:793-796.

52. Dickinson H. Dry stigmas, water and self-incompatibility in Brassica//

53. Sex Plant Reprod. 1995. 8:1-10.

54. Doughty J., Hedderson F., McCubbin A., Dickinson H.G. Interaction between a coating-borne peptide of the Brassica pollen grain and stigmatic S (self-incompatibility) locus-specific glycoproteins // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. 90: 467-471.

55. Dutta R. & Robinson K.R. Identification and characterization of stretch-activated ion channels in pollen protoplasts // Plant physiol. 2004. 135:1398-1406.

56. Fan L.M., Wu W.H., Yang H.Y. Identification and characterization of the inward K+ channel in the plasma membrane of Brassica pollen protoplasts 11 Plant and Cell Physiology. 1999. 40: 859-865.

57. Fan L.M., Want Y.F., Wang H., Wu W.H. In vitro Arabidopsis pollen grain protoplasts // J. Exp. Botany. 2001. 52: 1603-1614.

58. Feijo J.A., Malho R., Obermeyer G. Ion dynamics and its possible role during in vitro pollen germination and tube growth // Protoplasma. 1995. 187: 155-167.

59. Feijo J.A., Hackett G., Kunkel J., Hepler P. Calcium and proton extracellular fluxes, growth oscilations and cytosolic pH in growing pollen tubes of Lilium. Proc. 15th Intern. Congress on Sexual Plant Reproduction. 1998. Wageningen.

60. Feijo J.A. The pollen tube oscillator: towards a molecular mechanism of tip growth? In: Cresti M., Cai G., Moscatelli A., eds. Fertilization inhigher plants. Heidelberg, Germany: Springer-Verlag Berlin. 1999. C. 317-336.

61. Feijo J.A., Sainhas J., Holdaway-Clarke T., Cordeiro M.S., Kunkel J.G., Hepler P.K. Cellular oscillations and the regulation of growth: the pollen tube paradigm.// Bioessays. 2001. 23 (1): 86-94.

62. Felle H.H. pH: signal and messenger in plant cells // Plant Biology. 2001.3:577-591.

63. Ferguson C., Teeri T.T., Siika-aho M., Read S.M., Bacic A. Location of cellulose and callose in pollen tubes and grains of Nicotiana tabacum // Planta. 1998. 206:452-460.

64. Ferrary T.E., Best V., More T.A., Comstock P., Muhammad A., Wallace D.H. Intercellular adhesions in the pollen-stigma system: pollen capture, grain binding and tube attachments // Amer J Bot. 1985. 72: 1466.

65. Franklin-Tong V.E., Hackett G. and Hepler P.K. Ratio imaging of Ca in the self-incompatibility response in pollen tubes of Papaver rhoeas // Plant J. 1997. 12:1375-1386.

66. Franklin-Tong V.E. Signaling and the modulation of pollen tube growth//Plant Cell. 1999. 11:727-738.

67. Fricker M.D., White N.S., Obermeyer G. pH gradients are not associated with tip growth in pollen tubes of Lilium longiflorum // J. Cell Biology. 1997. 110: 1729-1740.

68. Fu Y., Yang Z. Rop GTPase: a master switch of cell polarity development in plants // Elsevier Science Ltd. 2001. PII: S 1360-1385 (01).

69. Geitmann A., Li Y.Q., Cresti M. The role of the cytoskeleton and dictyosome activity in the pulsatory growth of Nicotiana tabacum and Petunia hybrida pollen tubes 11 Botanica Acta 1996. 109: 102-109.

70. Geitmann A., Cresti M Ca2+ channels control the rapid expansion in pulsating growth of Petunia hybrida pollen tubes // J Plant Physiol.1998. V. 152. P.439-447.

71. Geitmann A., Snowman B.N., Emons A.M.C. and Franklin-Tong V.E. Alterations in the cytoskeleton of pollen tubes are induced by the self-incom patibility reaction in Papaver rhoeas II Plant Cell. 2000. 11: 1239-1251.

72. Gibbon B.C., Ren H. and Staiger C.J. Characterization of maize {Zea mays) pollen profilin function in vitro and in live cells // Biochem J.1999. 327:2349-2353.

73. Gilroy S. & Jones R.L. Gibberellic acid and abscisic acid coordinately regulate cytoplasmic calcium and secretory activity in barley aleurone protoplasts // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89: 3591-3595.

74. GraafB.H.J., Derksen J.W.M., Mariani C. Pollen and pistil in the progamic phase // Sex Plant Reprod. 2001. 14:41-55.

75. Goring DR. & Rothstein S.J. The S-locus receptor kinase gene in selfincompatible Brassica napus line encodes a fuctional serine/threonine kinase//Plant Cell. 1992.4: 1273-1281.

76. Goszczynska D.M. & Reid M.S. Studies on the development of tight Rose buds // Acta Horticult. 1985.167:101 -108.

77. Guyon V.N., Astwood J.D., Garner E.C., Dunker A.K. and Taylor L.P. Isolation and characterization of cDNAs expressed in the early stages of flavonol-induced pollen germination in Petunia II Plant Physiol. 2000. 123:699-710.

78. Hamilton D.W., Hills A., Kohler B., Blatt M.R. Ca2+ channels at the plasma membrane of stomatal guard cells are activated by hyperpolarization and abscisic acid // Proc. Natt. Acad. Sci. USA. 2000. 97: 4967-4972.

79. Hansen H., Grossman K. Auxin-induced ethylene triggers abscisic acid biosynthesis and growth inhibition // Plant Physiol. 2000 124: 14371448.

80. Heimovaara-Dijkstra S., Heistek J.C., Wang M. Counteractive effects of ABA and GA3 on extracellular and intracellular pH and malate in barley aleurone II Plant Physiol. 1994. 106: 359-365.

81. Hepler P.K. Tip growth in pollen tubes: Calcium lies the way // Trends Plant Sci. 1997.2:79-80.

82. Herth W. Ionophore A 23187 stops tip growth, but not cytoplasmic streaming, in pollen tubes of Lilium longiflorum II Prothoplasma. 1978.96: 275.

83. Heslop-Harrison J. Tapetal origin of pollen coat substances in Lilium. II New Phytol 1968. 67:779-786.

84. Heslop-Harrison J. Hydrodinamics of the grass pollen grain // Am. J. Bot. 1979. 66: 737.

85. Heslop-Harrison J., Heslop-Harrison Y. The pollen-stigma interaction in the grasses. Pollen-tube penetration and the stigma response in Secale ¡1 Acta Bot. Neerl. 1981. 30:289.

86. Heslop-Harrison J. Pollen germination and pollen tube growth // Pollen: Cytology and Development. Jnter. Rev. Cyt. V.107. Eds K. L. Ciles, J. Prakash / N-Y: Academic Press. 1987.

87. Heslop-Harrison Y. & Heslop-Harrison J. Germination of the angiosperm pollen: evolution of the actin cytoskeleton and wall during hydration, activation and tube emergence // Annals of Botany. 1992. 69: 385-394.

88. Hille B. Ion channels of excitable membranes, 3rd Sunderland, MA, USA: Sinauer Press. 2001.

89. Hoekstra F.A., Bruinsma J. Protein synthesis of binucleate andtrinucleate pollen and its relationship to tube emergence and growth // Planta. 1979. 146:559-566.

90. Hoekstra F.A.& Weges R. Lack of control by early pistillate ethylene of the accelerated wilting of Petunia hybrida styles // Plant Physiol. 1986. 80:4-6.

91. Holdaway-Clarke T.L., Feijo J.A., Hackett G.R., Kunkel J.G. and Hepler P.K. Pollen tube growth and the intracellular cytosolic calcium gradient oscillate in phase while extracellular calcium influx is delayed //Plant Cell. 1997.9:1999-2010.

92. Hoopen R.T., Harbord R.M., Maes T., Nanninga N., Robbins T.P. The self-incompatibility (S) locus in Petunia hybrida is located on chromosome III in a region, syntenic for the Solanaceae // Plant J. 1998. 16:729-734

93. Huang JC, Lin SM, Wang CS. A pollen-specific and desiccation-associated transcript in Lilium longiflorum during development and stress // Plant Cell Physiol. 2000. 41 (4): 477-475.

94. Jaffe L.A., Weisenseel M.H., Jaffe L.F. Calcium accumulation within the growing tips of pollen tubes // J. Cell Biology. 1975. V.67. P. 488492.

95. Jones M.L. & Woodson W. R. Pollination-induced ethylene in carnation// Plant Physiol. 1997. 115:205-212.

96. Kandasamy M.K., Thorsness M.K., Rundle S.J., Goldberg M.L., Nasrallah J.B., Nasrallah M.E. Ablation of pappilar cell function in Brassica flowers results in the loss of stigma receptivity to pollination //Plant Cell. 1993.5:263-275.

97. Kende H. Ethylene biosynthesis // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Biol. 1993.44:283-307.

98. Kende H., Zeevaart J. The five "classical" plant hormones // Plant Cell.1997. 9: 1197-1210.

99. Kevin L.-C. Wang, Hai Li, Ecker J.R. Ethylene biosynthesis and signaling networks//Plant Cell. 2002. 14: S131-S151.

100. Kinoshita T., Nishimura M., Shimazaki K. Cytosolic concentration of Ca2+ regulates the plasma membrane H* -ATPase in guard cells of fava bean//Plant Cell. 1995. V.7. P. 1333-1342.

101. Knox R.B., Heslop-Harrison J. Cytological localization of enzymes in the wall of the pollen grain //Nature. 1969. 223:92-94.

102. Knox R.B., Heslop-Harrison J. Pollen-wall proteins: localization and enzymic activity // J Cell Sci. 1970. 6:1-27.

103. Knox R. B. Pollen-Pistil interactions / Encyclopedia of Plant Physiology. V.17. Springer-Verlag. 1984.

104. Konar R.N. & Linskens H.F. The morphology and anatomy of the stigma of Petunia hybrida // Planta. 1966. 71:356-371.

105. Kotake T., Li Y.Q., Takahashi M., Sakurai N. Characterization and function of wall-bound exo-beta-glucanases of Lilium longiflorum pollen tubes // Sex. Plant Reproduction. 2000. 13:1-9.

106. Kovaleva L & Zakharova E. Hormonal status of the pollen-pistil system at the progamic phase of fertilization after compatible and incompatible pollination in Petunia hybrida L II Sex Plant Reprod. 2003, 16:191-196.

107. Kranz E., Lorz H. Micromanipulation and in vitro fertilization with single pollen grain of maize I I Sex Plant Reprod. 1990. 3:160-169.

108. Kroh M., Labarca C., Loewus F. Use of pistil exudate for pollen wall biosynthesis in Lilium longiflorum //In: Heslop-Harrison J (ed). Pollen: development and physiology. Butterworths. 1971. London.

109. Kunz C., Chang A., Faure J.D., Clarke A.E., Polya G.M., Anderson M.A. Phosphorylation of style S-RNases by Ca2+ -dependent protein kinases from pollen tubes // Sex. Plant Reprod. 1996. 9: 25-34.

110. Kurkdjian A., Guern J. Intracellular pH: measurement and importance in cell activity // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1989 40: 271-303.

111. Labarca C. & Loewus F. The nutration role of pistil exudate in pollen tube wall formation in Lilium longiflorum. I. Utilization of injected stigmatic exudates//Plant Physiol. 1972. 50:7-14.

112. Labarca C.& Loewus F. The nutration role of pistil exudate in pollentube wall formation in Lilium longiflorum. II. Production and utilization of exudate from stigma and stylar canal // Plant Physiol. 1973. 52:8792.

113. Lane M.D. & Lawrence M.J. The population genetics of the self-incompatibility polymorphism in Papaver rhoeas. VII. The number of S-alleles in the species // Heredity. 1993. 71: 596-602.

114. Lenartowska M., Bednarska E., Butowt R. Ca in tje pistil of Petunia hybrida Hort. during growth of the pollen tube- cytochemical and radiographic studies// Acta Biol Cracov Ser Bot. 1997. 39:79-89.

115. Lenartowska M., Rodriguez-Garcia M.I., Bednarska E. Immunocytochemical localization of esterified and unesterified pectins in pollinated and pollinated styles of Petunia hybrida Hort. // Planta. 2001.213: 182-191.

116. Li Y., Moscatelli A., Cai G., Cresti M. Functional interactions among cytoskeleton, membranes, and cell wall in the pollen tube of flowering plants//Int RevCyt. 1997. 176:113-199.

117. Li H., Lin Y., Heath R. M., Zhu M.X. and Yang Z. Control of pollen tube tip growth by a Rop GTPasse-dependent pathway that leads to tip-localized calcium influx//Plant Cell. 1999. 11: 1731-1742.

118. Linskens H.F. Translocation phenomena in the Petunia flower after cross- and selfpollination // Fertilization in higher plants. Linskens H.F. (ed). Amsterdam: North-Holland. 1974. P.285-289.

119. Linskens H.F. Developmental biology of reproduction: current problems // Phytomorphology. 1981. 202-213.

120. Lind J.L., Bonig I., Clarke A.E., Anderson M.A. A style-specific 120-kDa glycoprotein enters pollen tubes of Nicotiana alata in vivo II Sex Plant Reproduction. 1996. 9:75-86.

121. Liu X., Shiomi S., Nakatsuka A., Kubo Y., Nakamura R., Inaba A. Characterization of ethylene biosynthesis associated with ripening in banana fruit//Plant Physiol. 1999. 121: 1257-1265.

122. Lizada M.C.C. & Yang S.F. A simple and sensitive assay for 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid // Anal. Biochem. 1979. 100:140-145.

123. Llop-Tous I., Barry C.S., Grierson D. Regulation of ethylene biosynthesis in response to pollination in tomato flowers.//Plant Physiol. 2000. 123 (3): 971-8.

124. Lord E.M. & Russell S.D. The mechanism of pollination and fertilization in plants // Annu Rev Cell Dev Biol. 2002. 18: 81-105.

125. Lord E.M. Adhesion molecules in lily pollination // Sex Plant Reproduction. 2003. 14:57-62.

126. Lush W.M. & Clarke A.E. Observations of pollen tube growth in Nicotiana alata and their implications for the mechanism of self-incompatibility II Sex Plant Reproduction. 1997. 10: 27-35.

127. Luu D-T., Heizmann P., Dumas C. Pollen-stigma adhesion in kale is notdependent on the self-incompatibility genotype // Plant Physiol. 1997. 115:1221-1230.

128. Luu D.-T., Marty-Mazars D., Trick M, Dumas C, Heizmann P. Pollenstigma adhesion in Brassica spp involves SLG and SLR1 glycoproteins //Plant Cell 1999.11:251-262.

129. Maathuis F.J., Ichida A.M., Sanders D., Schroeder J.I. Roles of higher plant K+channels//Plant Physiol. 1997. 114: 1141-1149.

130. MO.Makinen Y., Brewbaker J.L. Isoenzyme polymorphism in flowering plants. I. Diffusion of enzymes out of intact pollen grains // Physiol Plant. 1967. 20:477-482.

131. Hl.Malho R., Read N.D., Trewavas A.J., Pais M.S. Calcium channel activity during pollen tube growth and reorientation // Plant Cell. 1995. 7: 1173-1184.

132. Malho R. and Trewavas A.J. Localized apical increases of cytosolic free calcium control pollen tube orientation // Plant Cell. 1996. 8:19351949.

133. Malho R. Pollen tube guidance the long and wounding road // Sex Plant reproduction. 1998. 11:242-244.

134. MartinT.F.J. Phosphoinositide lipids as signaling molecules: Common themes for signal transduction, cytoskeletal regulation, and membrane trafficking // Annu Rev Cell & Develop Biology. 1998. 14: 231-264.

135. Martinis D.D. and Mariani C. Silencing sene exoression of theethylene-forming enzyme results in a reversible inhibition of ovule development in transgenic tobacco plants // Plant cell. 1999. 11:10611071.

136. De Martinis D., Cotti G., te Lintel Hekker S., Harren F.S., Mariani C. Ethylene response to pollen tube grouth in Nicotiana tabacum flowers// Planta. 2002.214: 806-812.

137. Mascarenhas J.P. The biochemistry of angiosperm pollen development // Bot Rev. 1975. 41:259-314.

138. Mascarenhas J.P. Gene activity during pollen development // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1990. 41:317-338.

139. Mascarenhas J.P. Molecular mechanism of pollen tube growth and differentiation//Plant Cell. 1993. 5:1303-1314.

140. Mattson O., Knox R. B., Heslop-Harrison J., Heslop-Harrison Y. Protein pellicle of stigmatic papillae as a probable recognition site in incompatibility reactions//Nature. 1974. 247:298.

141. McClure B.A., Haring V., Ebert P.R., Anderson M.A., Simpson R.J., Sakiyama F., Clarke A.E. Style self-incompatibility gene products of Nicotiana alata are ribonucleases // Nature. 1989. 342: 955-957.

142. Messerli M.A., Danuser G., Robinson K.R. Pulsative influxes of H*, K+ and Ca2+ lag growth pulses of Lilium longiflorum pollen tubes // J Cell Sci. 1999. 112(10) :1497-1509.

143. Messerli M.A., Creton R., Jaffe L.F., Robinson K.R. Periodic increasesin elongation rate precede increases in cytosolic Ca2+ during pollen tube growth // Developmental Biology. 2000. 222: 84-98.

144. Messerli M. and Robinson K.R. Tip localized Ca2+ pulses are coincident with peak pulsatile growth rates in pollen tubes of Lilium longiflorum //Cell Sci. 1997. 110:1269-1278.

145. Messerli M., Robinson K.R. Cytoplasmic acidification and current influx follow growth pulses of Lilium longiflorum pollen tubes // Plant J. 1998. 16(1):87-91.

146. Miedema h., Bothwell J.H.F., Brownlee C., Davies J.M. Calcium uptake by plant cells channels and pumps acting in concert // Trends in Plant Science. 2001. 6: 514-519.

147. Miki-Hirosige H., Nakamura S. Process of metabolism during pollentube-wall formation // J. Electron Microsc. 1982. 31.

148. Miller D.D., Callaham D.A., Gross D.J. and Hepler P.K. Free Ca2+ gradient in growing pollen tubes of Lilium //J. Cell Sci. 1992. 101:712.

149. Mol R., Filek M., Dumas C., Matthys-Rochon E. Cytoplasmic calcium in silk trichomes after pollen grain receptor and post-pollination changes of the electric potential in pistil tissues of maize // Plant Science. 2004. 166: 1461-1469.

150. Moutinho A., Trewavas A.J. and Malho R. Relocalization of a Ca -dependent protein kinase activity during pollen tube reorientation // Plant Cell. 1998. 10:1499-1509.

151. Mu J-H., Lee H-S., Kao T-h. Characterization of a pollen expressed receptor-like kinase gene of Petunia!I Plant Cell. 1994. 6: 709-721.

152. Muschietti J., Eyal Y. and McCormick S. Pollen tube localization implies a role in pollen-pistil interactions for the tomato receptor-like protein kinases LePRKl and LePRK2//Plant Cell. 1998. 10:319-330.

153. Nadeau J.A., Zhang X.S., Nair H., O'Neil S.D. Temporal andspatial regulation of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate oxidase in the pollination-induced senescence of orchid flowers// Plant Physiol. 1993. 103: 31-39.

154. NasraIIah J.B., Kao T-h, Goldberg M.L., Nasrallah M.E. A cDNA clone encoding an S-specific glycoprotein from Brassica oleracea //1. Nature. 1985.318:263-267.

155. Nasrallah J.B. Cell-cell signaling in the self-incompatibility response // Curr Opin Plant Biol. 2000. 3:368-373.

156. Nattancourt D. de. Incompatibility in angiosperms // Sex Plant Reprod. 1997. 10:185-199.

157. Obermeyer G., Kolb H.A. K + channels in the plasma membrane of lily pollen protoplasts//Botanica Acta. 1993. 106: 26-31.

158. Obermeyer G., Klaushofer H., Nagl M., Hofiberger M., Bentrup F.W. In vitro germination and growth of lily pollen tubes is affected by protein phosphatase inhibitors//Planta. 1998.207:303-312.

159. O'Neill S.D. Ovary and gametophyte development are coordinately regulated by auxin and ethylene following pollination // Plant Cell. 1993.5:403-418.

160. Park S.-Y., Jauh G.-Y., Mollet J.-C., Eckard J., Nothnagel E.A., Walling L.L., Lord E.M. A lipid transfer-like protein is necessary for lily pollen tube adhesion to an in vitro stylar matrix // Plant Cell. 2000,12: 151163.

161. Peach J.C., Latche A., Larrigaudicre C., Reid M.S. Control of early ethylene synthesis in pollinated petunia flowers // Plant Physiol. Biochem. 1987. 25:341-437.

162. Picton J.M., Steer M.W. Evidence for the role of Ca ions in tip extension in pollen tubes//Protoplasma. 1983. 115: 11-17.

163. Pierson E.S., Derksen J., Traas J.A. Organization of microfilaments and microtubulus in pollen tubes growth in vitro or in vivo in various angiosperms // Eur J Cell Biol. 1986. 41:14-18.

164. Pierson E.S. Rhodamine-phalloidin staining of F-actin in pollen after dimethyl sulphoxide permeabilization: comparison with the conventional preparation // Sex Plant Reproduction. 1988. 1:83-87.

165. Pierson E.S., Cresti M. Cytoskeleton and cytoplasmic organization of pollen and pollen tubes // Int Rev Cytol. 1992. 140:73.

166. Pierson E.S., Miller D.D., Callaham D.A., van Aken J., Hackett G., Hepler P.K. Tip-localized calcium entry fluctuates during pollen tube growth//Dev Biol. 1996. 174:160-173.

167. Preuss D., Lemieux B., Yen G., Davis R.W. A conditional sterile mutation eliminates surface components from Arabidopsis pollen and disrups cell signalling during fertilization 11 Genes Dev. 1993. 7:974985.

168. Pruitt RE. Molecular mechanisms of smart stigmas // Trends Plant Sci. 1997. 2:328-329.

169. Pruitt R.E. Complex sexual signals for the male gametophyte // Curr Opin.Plant Biol. 1999. 5: 419-422.

170. Rathore K.S., Cork R.J., Robinson K.R. A cytoplasmic gradient of Ca 2+ is correlated with the growth of lily pollen tubes // Develop. Biology. 1991. 148: 612-619.

171. Reddy A.S. Molecular motors and their functions in plants // Int Rev Cytol.2001.204: 97-178.

172. Rosen W.G. Pollen growth and fine structure. In: Heslop-Harrison J (ed) Pollen: development and physiology. Butterworths. 1971. London.

173. Rudd J.J., Franklin F., Lord J.M., Franklin-Tong V.E. Increased phosphorylation of a 26-kD pollen protein is induced by the self-incompatibility response in Papaver rhoeas. 1996. 8 (4): 713-724.

174. Rudd J.J. & Franklin-Tong V.E Unravelling response-specificity in Ca signaling pathways in plant cells// New Phytologist. 2001.151:7-33.

175. Schiott M., Romanowsky S.M., Baekgaard L., Jakobsen M.K., Palmgren M.G., Harper J.F. A plant plasma membrane Ca pump is required for normal tube growth and fertilization // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. 101 (25): 9502-9507.

176. Schumaker K.S. and Gizinski MJ. Cytokinin stimulates dihydropyridine-sensitive calcium uptake in moss protoplasts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. 90:10937-10941.

177. Silverman F.P., Assiamah A.A., Bush D.S. Membrane transport andcytokinin action in root hairs of Medicago sativa 11 Planta. 1998. 205: 23-31.

178. Shimmen T., Ridge R.W., Lambiris I., Plazinski J., Yokota E., Williamson R.E.Plant myosins // Protoplasma. 2000. 214: 1-10.

179. Singh A., Evensen K.B., Kao T.-h. Ethylene synthesis and floral senescence following compatible and incompatible pollination in petunia inflate // Plant Physiol. 1992. 99: 38-45.

180. Singh D.P., Jermakow A.M., Swain S.M. Gibberellins are required for seed development and pollen tube growth in Arabidopsisll Plant Cell. 2002. 14:3133-3147.

181. Snedden W.A., Fromm H. Calmodulin as a versatile calcium signal transducer in plants //New Phytologist. 2001. 151: 35-66.

182. Sondheimer E. and Linskens H.F. Control of in vitro germination and tube extension of Petunia hybrida pollen // Koninkl. Nederl. Akademie van wetenschappen Amsterdam. Reprinted from Proceedings. 1974. 77 (2): 116-124.

183. Sommer-Knudsen J., Clarke A.E., Bacic A. A galactose-rich, cell-wall glycoprotein from styles of Nicotiana alata //Plant J. 1996. 9:71-83.

184. Sommer-Knudsen J., Bacic A., Clarke A.E. Hydroxyproline-rich plant glycoproteins//Phytochemistry. 1998. 47:483-497.

185. Sze H., li X., Palmgren M.G. Energization of plant cell membranes by H+ -pumping ATPases. Regulation and biosynthesis// Plant Cell. 1999.11:677-690.

186. Stanley R. G., Linskens H. F. Pollen: Biology, biochemistry, management. Berlin, N-Y: Springer, 1974.

187. Steer M.W., Steer J.M. Pollen tube growth // New Phyytol. 1989. 111:323-358.

188. Stein J.C., Dixit R., Nasrallah M.E., Nasrallah J.B. SRK, the stigma-specific S locus receptor kinase of Brassica, is targeted to the plasma membrane in transgenic tobacco // Plant Cell. 1996. 8:429-445.

189. Suzuki H., Tsuruhara A., Tezuka T. Regulations of the C2H4-forming system and the H202-scavening system by heat treatment associated with self-incompatibility in lily// Sex Plant Reprod. 2001. 13:201-208.

190. Tang X., Gomes A.M.T.R., Bhatia A. And Woodson W.R. Pistil-specific and ethylene-regulated expression of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate oxidase genes in petunia flowers// Plant Cell. 1994. 6: 1227-1239.

191. Takasaki T., Hatakeyama K., Suzuki G., Watanabe M., Isogai A., Hinata K. The S receptop kinase derminase self-incompatibility in Brassica stigmas//Nature. 2000. 403: 913-916.

192. Taylor L., Hepler P. Pollen germination and tube growth // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. 48: 461-491.

193. Theologis A. One rotten apple spoils the whole bushel: The role of ethylene in fruit ripening// Cell. 1992. 70:181-184

194. Tova T., Staub J.K.E. and O'Neill S.D. Identification of a 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid synthase gene linked to the female (F) locus that enhances female sex expression in cucumber // Plant Physiol. 1997. 113:987-995.

195. Trewavas A. Le calcium, C'est la vie: calcium makes waves // Plant1. Physiol.1999.120 (l):l-6.

196. Vasil I.K. The histology and physiology of pollen germination and pollen tube growth on the stigma and in the style. In: Linskens HF (ed) Fertilization in higher plants. North-Holand. 1974. Amsterdam.

197. Vidali L., McKenna S.T., Hepler P.K. Actin polimerization is essential for pollen tube growth // Molecular Biology of the Cell. 2001. 12: 2534-2545.

198. WalkerJ.C. Receptor-like protein kinase genes of Arabidopsis thaliana //PlantJ. 1993. 3:451-456.

199. Weterings K., Pezzotti M., Cornelissen M., Mariani C. Dynamic 1-aminocyclopropane-l-carboxylate-synthase and oxidase transcript accumulation patterns during pollen tube growth in tobacco styles // Plant Physiol. 2002. 130: 1190-1200.

200. White P. J. Calcium channels in higher plants // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1465. P. 171-189.

201. Whitehead C.S., Halevy A.H., Reid M.S. Role of ethylene and ACC in pollination and wound-induced senescence of Petunia hybrida flowers // Physiol Plant. 1984. 61: 643-648.

202. Wilhelmi L.K., Preuss D. Blazing new trails: pollen tube guidance in flowering plants//Plant Physiol. 1999. 113:307-312.

203. Wilson C., Voronin V., Touraev A., Vicente O., Heberle-Bors E. A developmental^ regulated MAP kinase activated by hydration in tobacco pollen//Plant Cell. 1997. 9: 2093-2100.

204. Woltering E. J., Somhorst D., Van der Veer P. The role of ethylene in interorgan signaling during flower senescence // Plant Physiol. 1995. 109: 1219-1225.

205. Wo Iters-Arts M., Derksen J., Kooijman J.W., Mariani C. Stigma development in Nicotiana tabacum. Cell death in transgenic plants as a marker to follow cell fate at high resolution // Sex Plant Reprod. 1996. 9:243-2254.

206. Wolters-Arts N., Lush W.M. and Mariani C. Lipids are required for directional pollen tube growth //Nature. 1998. 392:818-821.

207. Wu H., Wang H., Cheung A.Y. A pollen tube growth stimulatory glycoprotein is deglycosylated by pollen tubes and displays a gradient in the flower// Cell. 1995. 82:393-403.

208. Wu H.M., Wong E., Ogdahl J., Cheung A.Y. A pollen tube growth-promoting arabinogalactan protein from Nicotiana alata is similar to the tobacco TTS protein // Plant J. 2000. 22:165-176.

209. Yang Z.H. Small GTPases: Versatile signaling switches in plants // Plant Cell. 2002. 14: S375-S388.

210. Yokota E. Identification and characterization of higher plant myosins responsible for cytoplasmic streaming // J. Plant Research. 2000. 113: 511-519.

211. Zheng Z.L., Yang Z. The Rop GTPase: an emerging signaling switch in plants // Plant Molecular Biology. 2000. 44: 1-9.

212. Zinkl G.M., Preuss D. Dissecting Arabidopsis pollen -stigma interactions reveals novel mechanisms that confer mating specificity // Annals of Botany. 2000. 3: 54-60.

213. Zonia L., Cordeiro S., Feijo JA. Ion dynamics and hydrodynamics in the regulation of pollen tube growth // Sex Plant Reproduction. 2001. 14:111-116.

214. Zonia L., Cordeiro S., Tupy J., Feijo JA et al. Oscillatory chloride efflux at the pollen tube apex has a role in growth and cell volume regulation and is targeted by inositol 3,4,5,6-tetrakisphosphate // Plant Cell. 2002. 14:2233-2249.

215. Zarembinski T.J., Theologis A. Ethylene biosynthesis and action: a case of conservation//Plant Mol.Biol. 1994. 26: 1579-1597.

216. Zuberi M.I., Dickinson H.G. Pollen-stigma interaction in Brassica. 3. Hydration of the pollen grains // J Cell. Sci. 1985. 76:321.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Тимофеева, Галина Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.12

Диссертация

Гормональная регуляция прогамной фазы оплодотворения у петунии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы