Фитогормоны и флавонолы в регуляции прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок петунии (Petunia hybrida L.)

Минкина, Юлия Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фитогормоны и флавонолы в регуляции прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок петунии (Petunia hybrida L.)
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Фитогормоны и флавонолы в регуляции прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок петунии (Petunia hybrida L.)"

На правах рукописи

UUJU58671

МИНКИНА ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА

ФИТОГОРМОНЫ И ФЛАВОНОЛЫ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОРАСТАНИЯ ПЫЛЬЦЫ И РОСТА ПЫЛЬЦЕВЫХ ТРУБОК ПЕТУНИИ (,PETUNIA HYBRIDA L.)

03.00.12 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003058671

Работа выполнена в лаборатории природных и синтетических регуляторов роста Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук

Ковалева Лидия Валентиновна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических паук, профессор

каидидаг биологических наук

Ермаков Игорь Павлович Скоробогаюва Ирина Витальевна

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ- Главный ботанический сад им Н В Цивдша РАН

Защита состоится "22" мая 2007 г в 14 часов на заседании

Диссертационного совета К 002 210 01 при Институте физиологии растений им К А Тимирязева РАН по адресу 127276, г Москва, ул Ботаническая, 35 Факс (495) 977-80-18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН

Автореферат разослан "20" апреля 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

М И Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Независимо оттого, прорастает ли пыльцевое зерно in vivo - на воспринимающей поверхности рыльца пестика или т vitro - на среде культивирования, в нем происходит реорганизация цитоппазмы и элементов цитоскелета для обеспечения выхода пыльцевой трубки Эти изменения происходят в течение нескольких минут после гидратации и включают поляризацию актинового цитоскелета (Tiwari and Polito, 1988), переориентацию вегетативного ядра (I,alarme and Twell, 2002), концентрацию митоходрий и полисахаридов в кончике пыльцевой трубки (Mazina et al, 2002) В процессе гидратации пыльцевое зерно из неполярной клетки превращается в высоко поляризованную клегку (Edlund et al, 2004) Механизм, лежащий в основе процесса поляризации не ясен, несмотря на то, что в последние деся1ь лет процессы, вовлеченные в регуляцию роста пыльцевой трубки, постоянно привлекали внимание исследователей (Mascarenhas, 1993, Pierson et al, 1994, Feijo et al, 1995, Uepler, 1997, Wolters-Arts et al 1998, Messcrh, Robinson, 1998, Frankhn-Tong, 1999, Матвеева, Ермаков, 1999. Geitmann et al, 2000, Gu et al, 2005, Yoon et al, 2006) Сигнал поляризации в конечном счете активизирует ROP1, GTP-связанный белок, вовлеченный в динамику F-актина и установление градиентов кальция в кончике пыльцевой трубки (Gu et al, 2003) Остаются невыясненными молекулярные и регуляторные механизмы прорастания и роста пыльцевой трубки, в том числе идентификация внешних и внутренних сигналов, которые регулируют ROP1-сигнальный комплекс и характеристика молекулярной связи между сигналами и ROP1 GTPase

В качестве кандидатов на участие в этом процессе рассматриваются ионы (Геуо et al, 1995), липиды (Lush et al, 1998, Wolters-Arts et al, 1998), и фитогормоны (Ковалева и др , 2000, 2002, Kovaleva et al, 2003, Ковалева и др , 2004, 2005) Данная работа является продолжением начатых ранее исследований и направлена на изучение факторов гормональной регуляции прорастания и роста пыльцевых трубок Цель и задачи работы. Цель настоящего исследования состояла в изучении роли фитогормонов и флавоночов в регуляции прорастания и роста мужского гаметофита петунии {Petunia hybrida L ) двух клонов (самосовместимого и самонесовместимого) Для достижения этой цели в работе были поставлены следующие задачи

1 Разработать оптимальную среду для культивирования мужского гаметофита

2 Определить эндогенное содержание фитогормонов и флавонолов в прорастающем in vitro мужском гаметофитс

3 Изучить действие экзогенных фитогормонов, их ингибиторов, а также флавонолов (кверцетина и кемферола) на прорастание и рост мужского гаметофита (in vitro и in vivo)

4 Исследовать динамику изменений цитоплазматического рН в прорастающих in vitro пыльцевых зернах и пыльцевых трубках под действием экзогенных

фитогормонов

5 Проверить гипотезу о возможном участии флавонолов в качестве эндо1енных риуляторов транспорта ИУК в процессах развития, прорастания и роста мужского гамеюфита Для этого мы исследовали динамику содержания ИУК, а также суммы растворимых фепопьных соединений и флавонотов в системах

(а) m vivo пыльник-мужской гаметофит,

(б) in vitro прорастающий мужской гаметофит,

(в) пыльца-пестик

Научная новизна. Впервые установлено участие многокомпонентного комплекса фитогормонов (ИУК, АБК, гиббереллина Аз) и фчавонолов (кверцетина и кемферола) в регуляции in vitro ирорастания и роста мужского гаметофита петунии Максимальный стимуляторньш эффект фитогормоны и флавонолы оказали в концентрации 10"|2М Прорастание пыльцы стимулировали в большей степени гиббереллин А3 и АБК, в меньшей - ИУК и флавонолы Наибольший стимуляторный эффект на рост пыльцевых трубок оказал гиббереллин A3 6-БАП ингибировал прорастание и рост мужского гаметофита Флуридон (ингибитор синтеза АБК) и паклобутразол (ингибитор синтеза гиббереллинов) в разной степени снижали интенсивность прорастания пыльцы и рос г пыльцевых трубок, в то время как 2,4-хлорфенокси-2-метилпропионовая кислота (ингибитор транспорта ИУК) полностью их ингибировала Впервые получены данные в пользу гипотезы о том, что флавонолы могут быть эндогенными регуляторами транспорта ИУК в прогамной фазе оплодотворения Впервые обнаружено, что экзогенные фитогормоны способны включаться в регуляцию внутриклеточного pli (pHJ прорастающего m vitro мужского гаметофита В ходе прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок в присутствии ИУК наблюдался монотонный рост pllc, а в присутствии 6-БАП снижение рНс

Научно-практическое значение. Полученные результаты могут быть рекомендованы к использованию в селекционной практике и для дальнейшею изучения регуляторных механизмов и сигнальных систем в процессах опыления и оплодотворения у растений Материалы диссертации могут быть использованы в курсе лекций по физиологии и биохимии растений для студентов биологических и сельскохозяйственных ВУЗов

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II Международной конференции "Регуляторы роста, развития и продуктивности растений" (Минск, 2001), на XVII Международном конгрессе "Sexual Plant Reproduction" (Lublin, Poland, 2002), на VIII Международной конференции 'The Biology of Plants Cell in vitro and Biotechnology" (Саратов, 2003), на V сьезде общества физиологов России (Пенза, 2003), на конференции "Физиология растений и экология на рубеже веков" (Ярославль, 2003), на XI съезде Русского ботанического общества

(Новосибирск-Барнаул, 2003), на VIII международной конференции ботаников (С -Петербург, 2004), на Международной конференции "Проблемы физиологии растений Севера" (Петрозаводск, 2004), на VI симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004), на Международной конференции "Plant tissue culture from theory to practice" (Salaspils, Latvia, 2004), на Международной конференции "Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения бноразнообразия" (Вологда, 2005) Публикации По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том чисте 3 статьи

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на/^/страницах машинописного текста, включает 38 рисунков и 18 таблиц, список литературы состоит mjSg наименований, из них иностранном языке

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объект исследования Объектом исследования были растения петунии двух клонов (самосовместимого и самонесовместимого) Клоны размножали черенкованием соответствующих растений Черенки выращивали в пробирках на агаризованной среде Мурасиге и Скуга (по методике Murashige and Skoog, 1962) После укоренения черенки пересаживали в вазоны с почвой и выращивали в оранжерее Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН в условиях почвенной культуры при естественном освещении

Культивирование мужского гаметофита in vitro. Исследования проводили на зрелой свежееобрашюн пыльце 2 мг пыльцы смешивали с 2 мл среды культивирования с помощью стеклянной палочки, создавая тонкии слой суспензии во флаконах (15мл), герметично закрытых резиновыми пробками Прорастание пыльцевых зерен и рост пыльцевых трубок исследовали при их культивировании в течение 6 часов в термостатируемых условиях при 25-26°С Прорастание пыльцевых зерен и длину пыльцевых трубок оценивали с помощью микроскопа с окуляр-микрометром при 150-кратном увеличении В каждом варианте опыта оценивали длину 100 проросших пыльцевых трубок

Методика изучения эффектов экзогенных фитогормонов и флавонолов на т vitro прорастание и рост мужского гаметофита В экспериментах по тестированию действия экзогенных фитогормонов (ИУК, гиббереллина Аз, АБК), синтетического цитокинина 6-БАП и флавонолов (кверцетина и кемферола) на прорастание и рост мужскою i аметофита in vitro указанные соединения в концентрациях (10"|2-10'3М) вносили в среду культивирования пыльцевых трубок перед началом опыта одновременно с навеской пыльцы На графиках приведены средние арифметические значения и их стандартные отклонения из 3-5 независимых опытов, каждый из которых проведен в 2-кратной биологическом повторности (п=6-10) Достоверность

различий между вариантами оценивали по 1-критерию Стыодеша при уровне значимости Р < 0 05

Определение содержания фитогормонов Опредетепие содержания ИУК и цигокининов (суммы зеатина, зеатинрибозида и дигидрозеатина) проводити методом ВЭЖХ (Скоробогатова, Захарова и др , 1999)

Оценка изменений внутриклеточного pH (рНс) в прорастающем ш vitro мужском гаметофите под действием фитогормонов. рНс пыльцевых зерен оценивали после их предварительной нагрузки флуоресцеин диацетатом или 2\Т-бчс(2-карбоксиэтил)-5('6)-карбоксифлуоресцеина ацетоксимстиловым эфиром IIa основании измерений интенсивное гей флуоресценции образцов при 530 нм, возбуждаемой при 440 (F440) и 490 (F490) нм, рассчитывали величину отношения F49O/F440 как меру рНс (Трофимова и Молотковский, 1988, Fricker et al, 1997) Процесс прорастания пыльцевых зерен инициировали при 25-26°С, помещая их на 1, 2 и 4 часа в водную среду, содержащую 0 4 M сахарозу и 1 б мМ Н3ВО3 После этого пыльцевые зерна помещали на 15 мин в среду загрузки, содержащую 0 3 M сахарозу, 0 25 мМ Mes-Трис pH (6 9) и 5 мкМ рН-индикатор, отмывали от красителя и помещали в 1 мл буферной среды того же состава Измерения флуоресценции проводили на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi (Япония) В экспериментах использовали водные растворы соответствующих гормонов (АБК, ИУК, гиббереллина А3) и синтетического цитокшшна б-БАП в концентрации 5мкМ Всс эксперименты проводили в трех биологических и пяти аналитических повторностях Определение суммы фенольных соединений и флавонолов Свежесобранную пыльцу (10 мг) проращивали в течение 6 часов при 25-26°С на среде, содержащей 0 4M сахарозы и 1 6мМ борной кислоты, затем промывали дистиллированной водой и фиксировали 70% этанолом (1 час, перемешивая на качалке) Навеску (50-150мг) пестиков (а также рылец столбиков и завязей) растирали в ступке и подвергали экстракции 70% этанолом (1 час, перемешивая на качалке) Полученный этанольный экстракт отфильтровывали и спектрофотометричееким методом определяли в нем содержание с\ммы фенольных соединений с реактивом Фолина-Дениса (поглощение при 725 нм) (Запрометов, 1971) Содержание флавонолов определяли с 0 5%-ьым водным раствором хлористого алюминия (поглощение при 415 нм) (Gage and Wendel, 1950) Калибровочные кривые в обоих случаях строили по рутину IIa графиках представлены средние арифметические из 3-5 определений и их стандартные отклонения Разница между средними величинами опыта и контроля достоверна при 5% уровне значимости (Р<0 05)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оптимизация среды для культивирования мужского гаметофита петунии

При выборе среды для культивирования мужского гаметофига петунии мы основывались на лтературных данных о том, что необходимыми факторами прорастания и росла пыльцевых трубок покрытосеменных являются углеводы и бор (последний является компонентом клеточных стенок) (Steer and Steer, 1989, Pierson et al, 1996, Iioldaway-Clarke et al, 1997, 2003, Ylstra et al, 1998, Feijo et al, 1999, Li et a!, 2002) Как следует из рис 1, при 6-часовом культивировании мужского гаметофита на 0 4M сахарозе прорастание пыльцевых зерен составляло 35%, а длина пыльцевых трубок - 45 цм, в то время как на 1 6мМ Н3ВО3 интенсивность прорастания составляла 30%, а длина пыльцевых трубок достигала 120цм При совместном внесении в среду культивирования сахарозы и Н3ВО3 интенсивность прорастания пыльцы возрастала до 60%, а длина пыльцевых трубок достигала 205 5цм (рис 1) Таким образом, сахароза стимулировала только прорастание пыльцевых зерен, а Н3ВО3 - прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок На основе полученных данных была разработана среда А для культивирования мужского гаметофита петунии, содержащая 0 4M сахарозу и 1 6мМ Н3ВО3 (pH 6 83) Кроме среды А, мы использовали среду Б (модифицированную среду Brewbacker and Kvvack), которая включала 0 4M сахарозу, 1 6мМ Н3ВО3, 1 ЗмМ Ca(N03)2, 0 9 мМ KN03, 0 8 мМ MgS04 (pH 6 79)

На рис 2 представлена динамика прорастания и роста пыльцевых трубок двух клонов петунии на трех средах культивирования На воде прорастало 10-25% пыльцевых зерен обоих клонов, а длина пыльцевых трубок достигала 10-25цм На среде А интенсивность прорастания пыльцы самосовместимого клона достигала 62%, самонесовместимого клона - 48%, в то время как максимальная длина пыльцевых трубок самосовместимого клона составляла 205 5цм, а самонесовмесгимого - 250цм На среде Б шггенсивность прорастания пыльцы самосовместимого клона достигала 72%, а самонесовместимого - 60%, максимальная длина пыльцевых трубок самосовмесгимого клона составляла 274цм, а самонесовместимого клона - 370рм Следовательно, между двумя клонами петунии были выявлены существенные различия как по степени прорастания, так и по длине пыльцевых трубок Наибольшую степень прорастания проявили пытьцевые зерна самосовместимого клона, в то время как пыльцевые трубки самопесовместимого клона характеризовались максимальной длиной

Сахароза

н3во3

Сахароза + Н3Б03

70 •

0.5 1 2 4 6

2 250 А

| 200

О. >-

3 в

(И

150 ■

л с

с: в

х £

100 ■

5С

О -

»№||

0.5 1 2 4 6

250

200

150

100

0.5 1 2 4 6

250 200 150 100 50

-оД

Контроль (вода)

0.3М

С.4М

0.6М

0 5 12 4 6 Продолжительность культивирования,ч Контроль(вода)

1.6 мМ 1,бхЮ"3М

Среда А 0.4М сахароза + 1,6мМ Н,ВО,

Рис.1. Влияние сахарозы и борной кислоты на прорастание и рост пыльцевых трубок петунии самосовместимого клона

Самосовместимый клон

Самонесовместимый клон

Л111

05 1 1.5 2

0.5 1 1.5 2 4

0.5 1 1.5 2

400 350 300 250 200 150 100 50 О

0.5 1 1.5 2 4 6

Продолжительность культивирования ч "в Вода

I-1 Среда А {0.4 М сахароза, 1.6 мМ Н3В03)

нм Среда Б (0.4 М сахароза, 1.6 мМ Н,80,

1.3 мМ Са(М03)3, 0,9мМ КМО,, 0.8мМ МдБО,)

Рис.2. Прорастание и рост пыльцевых трубок петунии двух клонов на трех средах культивирования

Гормональная регуляция in vitro прорастания и роста мужского гаметофита

петунии

Ранее было показано участие фитогормонов в регуляции межклеточных взаимодействий в системе пыльца-пестик петунии после самосовместимого и самонесовместимого опыления (Kovaleva & Zakharova, 2003) В данной работе исследование гормональной регуляции прорастания и роста мужского гаметофита проводились на in vitro прорастающих пыльцевых зернах петунии двух клонов (самосовместимого и самонесовместимого)

Эффекты экзогенных фитогормонов на т vitro прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок петунии двух клонов При культивировании пыльцы на дистиллированной воде (рис 3) наблюдали 2-х кратное повышение интенсивное ги ее прорастания при внесении фитогормонов (гиббереллина А3, ЛБК, ИУК) в концентрации 10"12М (см рис 6,7,8)

При внесении в среду А (0 4М сахароза и 1 6М Н3ВО3) гиббереллина А3 и ЛБК (в меньшей степени - ИУК) в 2 раза возрастала не только интенсивное гь прорастания пыльцы, но заметно стимулировался и рост пыльцевых трубок (рис 4) Максимальный (в 2 5 раза) стимуляторный эффект на рост оказал гибберечлин A3 длина пыльцевых трубок достигала 450цм, менее значительный эффект оказала АБК, еще меньше - ИУК (рис 4)

На среде Б (0 4М сахароза, 1 6М Н3ВО3, 1 ЗмМ Ca(N03)2, 0 9мМ KN03, 0 8мМ MgSO/i) фитогормоны незначительно стимулировали прорастание пыльцы (рис 5)

Таким образом, использование трех сред культивирования позволило точнее выявить эффекты исследуемых фитогормонов на прорастание и рост пыльцевых трубок Наибольшую эффективность фитоюрмоны проявили на среде А, на которой и была проведена основная часть исследования

А) Самосовместимый клон

Гиббсреллин A3

Гиббереллин А3, при внесении его в среду кульгивирования А в концентрациях от 10"|2М до 10 3М, стимулировал как прорастание пыльцы, так и рост пыльцевых трубок (рис 6) Максимальный эффект гиббереллин А3 проявил в концентрации 10 12М Через 6 ч культивирования интенсивность прорастания достигала 90%, а длина пыльцевых трубок - 450рм (рис 6) Если принять за 100% интенсивность прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок петунии на среде без гормона, то эффект гиббереллина A3 можно выразить в % к ко!ггролю (табл 1 и 2) 2-3-кратную стимуляцию гиббереллином А3 прорастания пыльцы наблюдали в первые два часа культивирования, а 2-3 кратную стимуляцию роста пыльцевых трубок в течение 6 часов (рис 6, габл 1 и 2) При внесении в среду культивирования паклобутразола (ингибитора синтеза гиббереллинов) прорастание пыльцы не происходило

Гиббереллин А^

АБК

ИУК

100

л 80 с;

К 60 X

X •

В 40 га а. о

го

100

100 80 60 40

0.5 1 1.5 2 4

0 5 1 1.5 2 4

5 100

I 80

>< 60 3 ш ф

1 40 ■ с;

« 20

га х

I 0

|Ш|1

100

ЭО

го

100

О I-

0.51 1.52 4 б 0 5 1 1.5 2 4 6 0.5 1 1.5 2 4 5

Продолжительность культивированиям

Контроль (вода) ==> Гормон

Рис.3. Влияние экзогенных фитогормонов (10 12М) на прорастание и рост пыльцевых трубок петунии самосовместимого клона

Гибберелпин А^

АБК

ИУК

0.5 1 1.5 2 4

0 5 1 1.5 2 4

0 5 1 1 5 2 4

0 5 1 1.52 4 6 0.5 1 1 5 2 4 6 0 5 1 1.5 2 4 6

Продолжительность культивирования,ч

Контроль (среда А) ■ ■ Гормон

Рис.4. Влияние экзогенных фитогормонов (10"12М) на прорастание и рост пыльцевых трубок петунии самосовместимого клона

Гиббереллин А3

100 100

АБК

И УК

0 5 1 1.5 2 4

0.5 1 1.5 2 4

500 400

Л! 300 200 100

500 ! 400 300 200 100

шипи

0.5 1 1.52 А 6 0.5 1 1 5 2 4 6 0.5 1 1.52 4 6

Продолжительность культивирования.ч

Контроль (среда Б) <==• Гормон

Рис.5. Влияние экзогенных фитогормонов {10"12М) на прорастание и рост пыпьцевых трубок петунии самосовместимого клона

Таблица 1. Стимуляция прорастания пыльцы петунии самосовместимого клона

при внесении гиббереллина А3 в среду культивирования А (в % от контроля)

Время 1012М ю"10м 108М ю'м м-4м 10"3М

0.5ч 278 235 227 219 200 163

Хч 207 194 186 165 156 142

2ч 190 178 178 151 133 133

4ч 169 154 151 131 124 121

Таблица. 2. Стимуляция роста пыльцевых трубок петунии самосовместимого клона при внесении гиббереллина Аз в среду культивирования А (в % от контроля)

Время 1012М 10-1иМ 10ЧМ 10"6М 104М ю'м

0.5ч 299 228 228 197 157 118

1ч 313 296 288 283 244 210

2ч 292 266 240 160 139 132

4ч 219 168 157 133 132 124

6ч 219 178 173 135 118 100

Полученные нами результаты и данные на мутантах арабидопсиса (БпщЬ й а!, 2002) позволили сделать вывод, что гиббереллины регулируют растяжение пыльцевых трубок

АБК

АБК, также как и гиббереллин Аз, в концентрации значительЕЮ

стимулировала интенсивность прорастания пыльцы (до 90%), и в меньшей степени -рост пыльцевых трубок (их длина достигала ЗООцм) (рис 7) Максимальный 2-Зх-кратный эффект на прорастание и рост пыльцевых трубок АБК проявляла в концентрации 10 12М в первый час культивирования (табл 3 и 4) Таблица 3. Стимуляция прорастания пыльцы петунии самосовместимого клона

при внесении АБК в среду культивирования (в % от контроля)

Время 10"12М 10,иМ Ю^М 10'6М 10'4М кг*м

0.5ч 327 291 198 168 151 112

1ч 208 198 173 157 116 111

2ч 182 169 146 138 121 102

4ч 165 153 147 133 121 101

Таблица 4. Стимуляция роста пыльцевых трубок петунии самосовместимого

клона при внесении АБК в среду культивирования (в % от контроля)

Время 10"ПМ 10-,иМ 10"8М 10"6М Ю^М 103М

0.5ч 259 165 157 118 118 94

1ч 249 208 209 205 127 94

2ч 186 174 164 162 153 112

4ч 158 152 144 139 137 121

6ч 141 129 122 120 112 97

Контроль (К) - 0.4М сахароза + 1,6мМ H-jBO.,

Рис.6. Влияние гиббереллина A3 {10 1еМ-Ю"3М) на in vitro прорастание пыльцы (А) и рост пыльцевых трубок (Б) петунии самосовместимого клона на среде А

л я л с

jj с

X «

& «

о.

о о.

с *

too 80 60 40 20 О

S350

5 300

О- 250

2 200

S 150

| 100

¡5 50 с

W о

К 10'16М 101гМ Ю',0М 10"м 10JM 10JM

Б.

5 К 1(»"М 1042М Ю'"м 10""м 10"®М 10JM 10JM

Контроль (К) - СИМ сахароза + 1.6мМ Н3ВО=

Рис.7. Влияние АБК (1016М-10"3М) на

in vitro прорастание пыльцы (А) и рост пыльцевых трубок (Б) петунии самосовместимого клона на среде А

Максимальный Зх-кратиый эффект на интенсивность прорастания пыльцы АЬК проявляла в концентрации 10 ПМ в первые полчаса культивирования Внесение в среду культивирования флуридона (ингибитора синтеза АБК) тормозило прорастание пыльцы На основе полученных данных выдвинули гипотезу о том, что АБК участвует в поддержании внутриклеточного осмотического потенциала мужского гамет офита

ИУК

ИУК в меньшей степени, чем гиббсреллин А3 и АЬК, стимулировала прорастание пыльцы (до 80%), а длина пыльцевых трубок достшала ЗООцм (рис 8) В концентрации - 10"|2М ИУК стимулировала прорастание пыльцы в 1 5 раза (табл 5), а рост пыльцевых трубок - в 2 - 2 5 раза (табл 6)

Ингибитор транспорта ИУК (2,4-хлорфенокси-2-метилпропиоповая кислота) полностью ингибировал прорастание пыльцы В присутствии ингибитора транспорта ИУК, при внесении в среду культивирования пыльцы АБК и гиббереллина А3 прорастания пыльцы также не наблюдали Полученные данные свидетельствуют о том, что в основе прорастания и роста мужскою гаметофиш лежит полярный транспорт ИУК

Таблица 5 Стимуляция прорастания пыльцы петунии самосовместимого клона при внесении ИУК в среду культивирования А (в % от контроля)

Время 1012М 101иМ 10 8М 1 оЛм кг'м 10"'м

0 5ч 151 136 127 121 101 0

1ч 162 110 87 82 74 0

2 ч 128 113 94 90 86 0

4ч 149 130 97 92 83 0

Таблица 6. Стимуляция роста пыльцевых трубок петунии самосовмсстимого клона при внесении ИУК в среду культивирования А (в % от контроля)

Время 10"12М 10-1иМ 10"8М Ю^М нг'м 10"3М

0 5ч 252 252 238 239 220 0

1ч 204 179 166 156 155 0

2ч 144 129 123 121 112 0

6ч 141 105 100 97 95 0

6-БАП

В отличие от фитогормонов (гиббереллина А3, АБК и ИУК) синтетический цитокинин 6-БАП в концентрациях (10'|2М-10 3М) ингибировал прорастание и рост пыльцевых трубок (рис 9)

Таким образом, использованные в опытах фитогормоны АБК, гиббереллин А3 и ИУК стимулировали в разной степени прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок петунии самосовмсстимого клона, в то время как синтетический цитокинин 6-БАП их ингибировал Максимальный эффект на прорастание пыльцы в концентрации Ю',2М проявили гиббереллин А3 и АБК, а на рост пыльцевых трубок - гиббередлин А3

- 100 л

К 10'"м Ю',!М 101°М 10"elVI 10"6М 10"м 1СР'м

Б.

к ю "м ю',2м ю'им ю 'м ю 6м 1о"м ю 'м

Контроль (К) - 0,4м сахароза + 1,6мМ Н3В03

Рис.8. Влияние ИУК (10"16М-10"3М) на

in vitro прорастание пыльцы (А) и рост пыльцевых трубок (Б) петунии самосовместимого клона на среде А

л =г л с; -о с к

X р

га Q.

а с

100 90 80 70 60 50 40 30 го ю о

j 250

f 200 О.

* 150 Л т 0) 100 Г Л

Е 50 £ с

га 0 х

К 10 М 10 ТЙ 10"М Ю'М 1(TM10JM

Б.

К Ю^М 10""м 10"!М 104М '0 "м 10 'м

Контроль (К) - 0.4М сахароза + 1 6мМ Н3ВО.,

Рис.9. Влияние 6-БАП (10 12М-10"3М) на in vitro прорастание пыльцы (А) и рост пыльцевых трубок (Б) петунии самосовместимого клона на среде А

Б) Самонесовместимый клон

Экзогенные фитогормоны (гиббереллин Л3, АБК и ИУК) стимулировали прорастание пыльцы петунии самонесовместимого клона в меньшей степени, чем самосовместимою, но гиббереллин A3 вызвал максимальный эффект на рост пыльцевых трубок (их дайна составляла 600цм) Также как и в случае самосовместимого клона, синтетический цитокинин 6-БАП в концентрациях от 10' '2М до 10"3М ингибировал прорастание и рост пыльцевых трубок (100% ингибирование прорастания пыльцы происходило при внесении в среду культивирования 6-БАП в концентрации 10"3М)

В прорастающих in vitio мужских гаметофитах пегунии двух клонов выявлены резкие различия в содержании цитокининов, в охличие от гиббереллина, АБК и ИУК, содержание которых незначительно различались между клонами Если прорастание и рост пыльцевых трубок самосовместимого клона проходило при приблизительно постоянном уровне цитокининов (40 ш/г сырой массы), то рост пыльцевых трубок самонесовместимого клона в течение 2-6 часов сопровождался постепенным подъемом уровня цитокининов и достигал 255 нг/г сырой массы Ранее Захаровой было установлено 5-кратное повышение содержания цитокининов в опыленных пестиках самонесовместимого клона петунии (Kovaleva & Zakharova, 2003) Все вышеизложенное позволило связать повышенный уровень цитокининов в in vitro прорастающей пыльце самонесовместимого клона с функционированием механизма гаметофитной самонесовместимости, характерным для этого клона петунии

Эффекты экзогенных флавонолов на прорастание пыльцы и рост пыльцевых

трубок

Кемферол в концентрации (10"12М) в разной степени стимулировал прорастание т vitro пыльцевых зерен петунии на трех средах культивирования (рис 10) На среде А кемферол стимулировал интенсивность прорастания пыльцы до 80%, а длина пыльцевых трубок достигала 240рм

Кверцетин, также как и кемферол, стимулировал прорастание и рост пыльцевых трубок на среде А (данные не представлены)

Таким образом, оба использованных нами экзогенных флавонола (кверцетин и кемферол) стимулировали прорастание и рост пыльцевых трубок петунии

Флавонолы как эндогенные регуляторы транспорта ИУК в процессах развития, прорастания и роста мужского гаметофита

Согласно литературным данным (Ihimann, 1965, Rubery and Jacobs, 1988, Murphy et al, 2000, Mathesius, 2001) совместная локализация флавонолов и ИУК в различных органах растений может свидетельствовать об участии фтавонолов в регуляции транспорта ИУК Регуляция транспорта ауксинов эндогенными флавонолами т vivo установлена с использованием флавонол-дефицитных мутантов

0 5 1 1.5 2 4

0.5 1 1.5 2 4

300 250 200 150 100 50 0

300

т 250

**|1

200 150 100 50 1 0

0.5 1 1.5 2 4 6" 0.5 1 1.52 4 6 0.5 1 1.52 4 6

Продолжительность культивирования.ч

Вода (контроль) Вода + кемферол

Среда А (контроль) Среда А + кемферол

Среда Б + (контроль) Среда 6 + кемферол

Рис.10, Влияние экзогенного кемферола (10"12М) на in vitro прорастание и рост пыльцевых трубок петунии самосовместимого клона

арабидопсиса (Gupta et al, 2002) Локализация мембраносвязанных агликонов флавоиолов совпадала с локализацией ауксина (Gupta et al, 2002)

Целью этого этапа исследования и стала проверка гипотезы о том, могут ли быть флавонолы эндогенными регуляторами транспорта ИУК в процессе формирования, прорастания и роста мужского гаметофита Для этого мы провели сравнение динамики содержания ИУК и флавонолов в спорофитных тканях пыльника, в тесном взаимодействии с которыми происходит развитие мужского гаметофита и в прорастающей т vitro зрелой пыльце петунии двух клонов (самосовместимого и самонесовместичого) (рис 11)

Формирование пыльцевых зерен обоих клонов сопровождалось постепенным увеличением содержания ИУК и флавонолов в развивающихся пыльниках Зрелая пыльца содержала 60-70 нг ИУК/г сырой массы и 20 мг флавонолов/г сырой массы В прорастающих in vitro мужских гаметофигах обоих клонов отмечено повышение уровня ИУК в течение двух часов культивирования, в то время как повышение содержания флавонолов наблюдали в течение первого часа прорастания Прорастающий мужской гаметофит самосовместимого клона (по сравнению с самонесовместимым) характеризовался более высоким уровнем ИУК и флавонолов Очевидно, выявленные нами корреляции в содержании ИУК и флавонолов являются существенным фактором формирования фертильности мужского гаметофита, но не связаны с формированием механизма самонесовместимости

Сравнительный анализ кинетики изменений в содержании флавонолов и ИУК в прорастающей in vitro пыльце (рис 11), а также в системе пыльца-пестик in vivo и ее отдельных частях (данные не представлены) свидетельствует о том, что прорастание мужского гаметофита как in vitro, так и т vivo сопровождается повышением содержания ИУК, что в свою очередь коррелирует с повышением содержания флавонолов

Влияние экзогенных фитогормонов па внутриклеточный рН (рНс) прорастающего in vitro мужского гаметофита петунии

Переход мужского гаметофита в состояние физиологического покоя сопряжен с резким снижением рНс, а выход из этого состояния при инициации прорастания - с возрастанием рНс (Матвеева и др 2002, 2003) Участие рНс в регуляции процессов прорастания пыльцевого зерна непосредственно подтверждено экспериментами in vitro с искусственным изменением рНс Установлена взаимосвязь этой величины с интенсивностью энергетического метаболизма

Влияние экзогенных фитогормонов на рНс непрорастающих пыльцевых зерен петунии было обнаружено ранее (Ковалева и др 2005) Целью следующего этапа нашей работы составило изучение чувствительности рНс т vitro прорастающего мужского гаметофита петунии к воздействию экзогенных фитогормонов (ИУК, АБК, гиббереллина А3) и синтетического цитокинина 6-БАП (рис 12)

Ьй л>

> и

S <и ш

111 л

i 2

it о

3 3

а. л

0) и

о ^ и X

Пыльники из бутонов Зрелая 2-3 см 5 см пыльца

0 2 6 Время культи в про вания.ч

Самосовместимый клон Самонесовместимый клон

5 ° в о>

О) ш

<и о

о ъ О £

Р 20

1Э

Пыльники из бутонов Зрелая 1,5см 2см Зсм 4.5см 5см пыльца

О 0.5 1 2 4 6 Время культивирования^

Самосовместимый клон Самонесовместимый клон

Рис.11. Динамика содержания ИУК и флавонолов в процессе развития и прорастания мужского гаметофита петунии двух клонов

7.5

о 7-0 X

о. 6.5 6.0

5,5

1 час

о-0^0

7,5 7,0 6,5 6,0 5.5

ИУК 2 часа

7,5 7,0 6:5 6,0 5,5

4 часа

• ♦ » »

7,5

О 7,0 X

6,5 6,0 5,5

АБК

СХГ^

7,5 7,0 6,5 6,0 5,5

7,5 7,0 6,5 6,0 5.5

7,5

о 7,0 X

а 6,5 6,0

5,5

СКЮфО

Гиббереллин А,

7,5 7,0 6,5 6,0 5,5

7,5 7.0

О. 6.5 5,5

6-БАП

0 5 10 15 20

7,5 7,0

6 R

6,0

5,5

Q» • • »

О 5 10 1520

Время:мин

# ■ Контроль —О— Гормон

Рис.12. Действие экзогенных фитогормонов на внутриклеточный рН (рНс) in vitro прорастающего мужского гаметофита

Перенос пыльцы, предварительно культивированной на среде без гормонов в течение 1, 2 или 4 часов, на среду, содержащую ИУК, приводило к монотонному росту рНс мужского гаметофита как в ходе прорастания пыльцы, так и рос;а пыльцевых тр)бок Под действием экзогенной ИУК рПс возрастал в первые 5 минут на 0 5 ед В последующие 15 мину! этот эффект сохранялся (рис 12)

АБК в первые 5 минут повышала (на 0 4-0 5 ед ) рНс прораставших в течение 1 часа пыльцевых зерен на среде без гормонов (рис 12)

Гиббереллин А3 вызывал защелачивание рНс пыльцевых зерен, прораставших в течение 4 часов на среде без гормонов, в первые 5 минут - на 0 2 ед , в последующие 5 минут - на 0 4 ед (рис 12)

В 01личис от ИУК, АБК и гиббереллина Аз, 6-БАП (ингибирующий poci мужского 1аметофита) в первые 5 минут снижал (на 0 17 сд) рНс прораставших в течение 1 часа пыльцевых зерен на среде без юрмонов, а в прораставших в течение 4 часов - па 0 3 ед (рис 12)

Таким образом, в ходе экспериментов установлено, что фитогормоны способны включаться в регуляцию рНс мужского гаметофита Следует отметить, что щелочной сдвиг рПс при действии ИУК и АБК развивался в первые 5-10 минут В отличие от АЬК и гиббереллина Аз действие ИУК на рНс прорастающего т vitro мужского гаметофита не обращалось со временем и выражалось в монотонном защелачивании цнтозоля Монотонное изменение рНс наблюдали и в присутствии 6-БАП, но в отличие от ИУК, это изменение носило качественно иной характер, а именно, снижение рНс, которое усиливалось со временем роста пыльцевых трубок Эти наблюдения дают основание полагать, что регуляция рНс мужского гаметофита, возможно, является гормон - зависимым процессом

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гормональный статус зрелого мужского гаметофита обеспечивает инициацию его прорастания как иг vitro, так и in vivo Прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок сопровождаются повышением уровня ИУК, АБК, гиббереллинов, цитокинипов, а также флавонолов Полученные в данной работе результаты указывают на то, что в основе in vitro прорастания и роста мужского гаметофита лежит полярный транспорт ИУК, а флавонолы, возможно, блокируют отток ауксина из прорастающего мужского гаметофита, тем самым, повышая ei о внутриклеточную концентрацию, что в свою очередь способствует полярному росту пыльцевых трубок Гиббереллины участвуют в регуляции растяжения пыльцевых трубок Полагаем, что АБК участвует в поддержании внутриклеточного осмотического потенциала мужского гаметофита

выводы

X) In vitro прорастание и рост мужского гаметофита петунии самосовместимого и самонесовместимого клонов сопровождались повышением содержания фитогормонов (ИУК, гиббереллинов, цитокининов) и флавонолов

2) Мужской гаметофит самосовместимого клона характеризовался

более высоким уровнем содержания ИУК и флавонолов, обеспечивающим его высокий уровень фертлльности

3) Мужской гаметофит самонесовместимого клона характеризовался более высоким уровнем содержания цитокининов Синтетический цитокинин 6-БАП ингибировал прорастание и рост мужского гаметофит обоих клонов Полученные данные указывают на участие цитокининов в регуляции механизма гаметофитной самонесовместимости

4) Экзогенные фитоюрмоны (ИУК, АБК, гиббереллин Аз) и флавонолы (кемферол и кверцетин) стимулировали прорастание и рост мужского гаметофита обоих клонов Максимальный стимуляторный эффект наблюдачи в концентрации 10 12 М для всех испытанных веществ

5) Экзогенные гиббереллин A3 и АБК стимулировали прорастание пыльцы в большей степени, чем ИУК и флавонолы

6) Гиббереллин А3 наиболее эффективно по сравнению с другими испытанными соединениями стимулировал рост пыльцевых трубок

7) Ингибитор транспорта ИУК (2,4-хлорфенокси-2 метилпропионовая кислота) почностью подавлял, а ингибиторы синтеза АБК (флуридон) и гиббереллинов (паклобутразол) тормозили прорастание и рост мужского гаметофита

8) В присутствии ингибитора транспорта ИУК экзогенные АБК, гиббереллин А3 и флавонолы не активировали прорастание пыльцы Полученные результаты свидетельствуют о том, что в основе in vitro прорастания и роста мужского гаметофита лежит полярный транспорт ИУК

9) Перенос пыльцы, предварительно культивированной на среде без гормонов в течение 1-4 часов, на среду, содержащую ИУК, приводило к монотонному росту цитоплазматического рН (рНс) мужского гаметофита как в ходе прорастания пыльцы, так и роста пыльцевых трубок Напротив, присутствие в среде 6- БАП (ингибирующего рост мужского гаметофита) вызывало снижение рНс

10) Зависимость гормон-индуцнрованных изменений цитоплазматического

рНс от физиологического состояния мужского гаметофита предполагает, что эти изменения участвуют в регуляции прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Захарова Е В , Минкина Ю.В , Ковалева Л В и др Гормоны и рост пыльцевых трубок петунии в культуре in vitro II II Международная Конференция "Регуляторы роста, развития и продуктивности растсичй" Минск 2001 С 74-75

2 Ковалева Л В , Захарова Е В , Минкина Ю В Фитогормональная регуляция роста мужского гаметофита в системе пыльца-пестик // Доклады академии наук 2002

Т 385 №4 С 552-555

3 Zakharova Е , Mmkina Yu, Kovaleva L V Hormonal regulation of petunia male gametophyte growth in vitro // XVII International Congress on Sexual Plant Reproduction Lublin, Poland 2002 P 185

4 Ковалева JI В , Захарова Е В , Добровольская А А , Минкина Ю.В Рост пыльцевых трубок петунии в культуре m vitro II VIII Международная конференция ' Биология клеток растений in vitto и био]ехиология" Саратов 2003 С 154-155

5 Захарова Е В , Ковалева Л В., Минкина Ю В , Скоробогагова И В , Карсунккна II П Гормональный статус системы пыльца-пестик петунии при совместимом и несовместимом опылении//Пенза (ВОФР) 2003 С 392-393

6 Л В Ковалева, Е В Захарова, Г В Тимофеева, Ю В Минкинд, В Ю Раки тин Гормональная регуляция роста мужского гаметофита в прогамной фазе оплодотворения у петунии (Petunia hybrida L ) // "Ботанические исследования в Азиатском России" Новосибирск-Барнаул Том 2 XI съезд Русского ботанического общества 2003 С 147-149

7 Захарова F В , Добровольская А А , Минкина Ю.В, Тимофеева Г В ,

Ковалева Л В Гормональные факторы роста мужского гаметофита m vitro и in vivo II "Биология клеток растений m vitro и биотехнология Физиология растении и экология на рубеже веков" Ярославль 2003 С 203

8 Л В Ковалева, Е В Захарова, А А Добровольская, Ю В Минкина, В Ю Ракитин Факторы роста и развития мужского гаметофита // "Проблемы физиологии растений Севера" Петрозаводск (ОФР) 2004 С 91

9 Ковалева Л В , Минкина Ю.В., Отениченко H А , Загоскина H В Фенолыше соединения в развивающихся пыльниках и прорастающей in vitro пыльце у петунии самосовместимого и самонесовместимою клопов // VI симпозиум по феиольиым соединениям Москва 2004 С 44

10 Минкина Ю.В. Гормональная регуляция роста мужского гаметофита петунии в культуре in vitro II VIII Молодежная конференция ботаников Санкт-Петербург 2004 С 148

11 Kovaleva L , Minkina Yu , Zakharova E Control of Petunia hybrida L male gametophyte growth in vitro II "Plant Tissue culture from theory to practice" Salaspils, Latvia 2004 P 56

12 Л В Ковалева, ГО В Минкина, II В Авдеева, II А Олениченко, II В Загоскина Участие фенольных соединении в межклеточных взаимодействиях в системе пыльца-пестик петунии И "Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия" Вологда 2005 С 61

13 Ковалева Л В , Захарова Е В , Минкина Ю.В., Тимофеева Г В , Андреев И M Прорастание и рост in vitro мужского гаметофита петунии чувствительны к действию экзогенных гормонов и сопровождаются изменением эндогенного уровня фитогормонов // Физиология растений 2005 1 52 №4 С 584-590

14 Л В Ковалева, ЕВ Захарова, Ю.В. Минкина Ауксин и флавоноиды в прогамной фазе оплодотворения у петунии // Физиология растений 2007 Т 54 №3 С 449-454

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Минкина, Юлия Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ПРОРАСТАНИЕ И РОСТ МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА ПОКРЫТОСЕМЕННЫХ (обзор литературы) 1.1.Зрелое пыльцевое зерно.6

1.2. Межклеточные взаимодействия в системе пыльца-рыльце. 10

1.2.1. Адгезия пыльцевых зерен.11

1.2.2. Гидратация пыльцевых зерен.12

1.2.3. Прорастание пыльцевых зерен.15

1.3. Организация пыльцевой трубки.17

1.4. Рост пыльцевых трубок.19

1.5. Факторы прорастания и роста мужского гаметофита в культуре in vitro.28

1.5.1. Углеводы.29

1.5.2. Бор.30

1.5.3. Кальций.32

1.5.4. Флавонолы.34

1.5.5. Фитогормоны.36

1.5.5.1. Жасмоновая кислота.38

1.5.5.2. Салициловая кислота.39

1.5.5.3. Гиббереллины.40

1.5.5.4. АБК.

1.5.5.5. Цитокинины.42

1.5.5.6. Этилен и ИУК.

1.6. Цель исследования.43

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Характеристика объекта исследования.45

2.2. Вегетативное размножение клонов петунии.

2.3. Культивирование пыльцевых трубок in vitro.

2.4. Методика изучения эффектов экзогенных фитогормонов и флавонолов in vitro на прорастание и рост пыльцевых трубок.

2.5. Методика изучения эффектов экзогенных фитогормонов и флавонолов in vivo на прорастание и рост пыльцевых трубок.

2.6. Определение содержания ИУК и цитокининов методом

ВЭЖХ.47

2.7. Оценка изменений цитоплазматического рН (рНс) в прорастающем in vitro мужском гаметофите под действием фитогормонов.49

2.8. Определение содержания суммы растворимых фенольных соединений и флавонолов.

ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ СРЕДЫ ДЛЯ ПРОРАСТАНИЯ И РОСТА МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА ПЕТУНИИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

3.1. Сахароза.51

3.2. Бор.

3.3. Кальций.

3.4. Среда культивирования А.53

3.5. Среда культивирования Б.57

3.6. Использование агар-агара.60

ГЛАВА 4. ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОРАСТАНИЯ И РОСТА МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА ПЕТУНИИ 4.1. Эффекты экзогенных фитогормонов и их ингибиторов на in vitro прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок петунии самосовместимого клона.62

4.1.1. Гиббереллин А3.63

4.1.2. АБК.65

4.1.3. ИУК.70

4.2. Эффекты экзогенных фитогормонов и их ингибиторов на in vitro прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок петунии самонесовместимого клона.

4.3. Синтетический цитокинин 6-БАП.78

4.4. Влияние экзогенных фитогормонов на рост пыльцевых трубок in vivo.80

4.5. Влияние экзогенных фитогормонов на изменение внутриклеточного рН (рНс) прорастающего in vitro мужского гаметофита петунии.81

4.5.1. ИУК.

4.5.2. АБК.

4.5.3. Гиббереллин Аз.

4.5.4. 6-БАП.

4.6. Обсуждение.88

ГЛАВА 5. ФЛАВОНОЛЫ В РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ, ПРОРАСТАНИЯ И РОСТА МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА ПЕТУНИИ IN VITRO И IN VIVO

5.1. Динамика содержания суммы растворимых фенольных соединений и флавонолов в системе пыльник-мужской гаметофит.90

5.2. Динамика содержания суммы растворимых фенольных соединений и флавонолов в прорастающем in vitro мужском гаметофите.92

5.3. Динамика содержания и локализация растворимых фенольных соединений и флавонолов в системе пыльца-пестик.94

5.4. Влияние экзогенных флавонолов на прорастание и рост in vitro мужского гаметофита.102

5.4.1. Кверцетин.102

5.4.2. Кемферол.106

5.5. Влияние экзогенных флавонолов на прорастание и рост in vivo мужского гаметофита.109

5.6. Возможность участия флавонолов в качестве эндогенных регуляторов транспорта ИУК в процессах развития, прорастания и роста мужского гаметофита.111

5.7. Обсуждение.114

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фитогормоны и флавонолы в регуляции прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок петунии (Petunia hybrida L.)"

Независимо от того, прорастает ли пыльцевое зерно in vivo - на воспринимающей поверхности рыльца пестика или in vitro - на среде культивирования, в нем происходит реорганизация цитоплазмы и элементов цитоскелета для обеспечения выхода пыльцевой трубки. Эти изменения происходят в течение нескольких минут после гидратации и включают поляризацию актинового цитоскелета (Tiwari and Polito., 1988), переориентацию вегетативного ядра (Lalanne and Twell., 2002), концентрацию митоходрий и полисахаридов в кончике пыльцевой трубки (Mazina et al., 2002). В процессе гидратации пыльцевое зерно из неполярной клетки превращается в высоко поляризованную клетку (Edlund et al., 2004). Механизм, лежащий в основе процесса поляризации не ясен, несмотря на то, что в последние десять лет процессы, вовлеченные в регуляцию роста пыльцевой трубки, постоянно привлекали внимание исследователей (Mascarenhas, 1993; Pierson et al., 1994; Nasrallah, 1994; Feijo et al., 1995; Hepler, 1997; Wolters-Arts et al., 1998; Messerli, Robinson, 1998; Franklin-Tong, 1999; Матвеева, Ермаков, 1999; Geitmann et al., 2000; Nasrallah, 2000; Gu et al., 2005; Yoon et al., 2006). Сигнал поляризации в конечном счете активизирует ROP1, GTP-связанный белок, вовлеченный в динамику F-актина и установление градиентов кальция в кончике пыльцевой трубки (Gu et al., 2003). Остаются невыясненными молекулярные и регуляторные механизмы прорастания и роста пыльцевой трубки, в том числе идентификация внешних и внутренних сигналов, которые регулируют ROP1-сигнальный комплекс и характеристика молекулярной связи между сигналами и ROP1 GTPase.

В качестве кандидатов на участие в этом процессе рассматриваются ионы (Feijo et al., 1995), липиды (Lush et al., 1998; Wolters-Arts et al., 1998) и фитогормоны (Ковалева и др., 2000; 2002; Kovaleva & Zakharova, 2003; Ковалева и др., 2004; 2005). Данная работа является продолжением начатых ранее исследований и направлена на изучение факторов гормональной регуляции прорастания и роста пыльцевых трубок.

ГЛАВА 1. ПРОРАСТАНИЕ И РОСТ МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА ПОКРЫТОСЕМЕННЫХ (обзор литературы)

Основная функция мужского гаметофита (пыльцевого зерна или пыльцевой трубки) состоит в доставке мужских гамет к зародышевому мешку, где и осуществляется двойное оплодотворение. Последовательность событий, происходящих после опыления и приводящих к успешному оплодотворению, включает: попадание пыльцевого зерна на поверхность рыльца, адгезию, его гидратацию и прорастание, проникновение пыльцевой трубки в ткани рыльца, рост пыльцевой трубки в проводниковых тканях столбика, проникновение пыльцевой трубки в зародышевый мешок и, наконец, слияние гамет в процессе двойного оплодотворения (Knox, 1984; Heslop-Harrison, 1987; Mascarenhas, 1993; Rüssel, 1993; Батыгина, 1994; Hepler et al., 1997; Nasrallah, 2000; Lord and Russell, 2002; Lord, 2003). Гаплоидный мужской гаметофит осуществляет свою функцию благодаря комплексу приспособлений, связанных с процессами рассеивания пыльцы, взаимодействия пыльцевых зерен с поверхностью рыльца, а также питания и роста пыльцевых трубок в спорофитных тканях пестика. Несмотря на то, что в последние тридцать лет механизмы межклеточных взаимодействий в системе пыльца-пестик интенсивно исследуются, их молекулярная основа не установлена до сих пор.

1.1. Зрелое пыльцевое зерно

Формирование мужского гаметофита растений происходит при тесном взаимодействии с окружающими спорофитными тканями пыльника (Mascarenhas, 1989; 1990; McCormic, 1991, 1993). В тканях пыльника осуществляется микроспорогенез, представляющий собой процесс формирования микроспор путем мейотического деления микроспороцитов, а затем в период микрогаметогенеза происходит образование и созревание пыльцевых зерен.

В структурном отношении пыльцевое зерно представляет собой одну из простейших клеточных систем, покрытую сложноорганизованной оболочкой, внешний слой которой представлен спорополлениновой экзиной, а внутренний - полисахаридной интиной (Heslop-Harrison, 1987; Bedinger, 1992). Оболочка выполняет различные функции в процессах рассеивания, адгезии, гидратации и прорастания пыльцевых зерен.

Двухклеточные пыльцевые зерна покрытосеменных растений состоят из вегетативной клетки, отвечающей за рост и метаболизм растущей пыльцевой трубки, и генеративной, при делении которой образуются два спермия.

Вегетативная клетка - крупная, содержит ядро с диффузным хроматином, которое окружает содержащая многочисленные поры ядерная оболочка, тесно связанная с цитоплазматической эндомембранной системой. Цитоплазма вегетативной клетки богата митохондриями, пластидами, элементами аппарата Гольджи и рибосомами (Нокс, 1990).

Генеративная клетка содержит ядро, окруженное небольшим количеством вакуолизированной цитоплазмы, содержащей эндоплазматический ретикулум, диктиосомы, митохондрии, рибосомы и микротрубочки (Ciampolini et al., 1982; Wagner et al., 1990). Деление генеративной клетки приводит к образованию пары спермиев. У многих видов этот процесс происходит в пыльцевой трубке уже после начала ее прорастания на рыльце. Набор органелл, характерный для цитоплазмы спермия, включает митохондрии, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, рибосомы, небольшие вакуоли, пластиды с редуцированной системой внутренних пластинок, микротрубочки и многочисленные микрофиламенты (Ciampolini et al., 1982). Эти характеристики, а также сниженная плотность ядерных пор позволили предположить, что ядра генеративной клетки и спермиев менее транскрипционно активны, чем ядро вегетативной клетки (Wagner et al., 1990), и различаются по своей функциональной активности (Tanaka, 1993).

Было высказано предположение, что различную степень конденсации хроматина в вегетативном и генеративном ядрах контролируют локализованные в цитоплазме регуляторные молекулы, которые неравным образом распределяются между дочерними клетками в результате митоза (Eady et al., 1995; Tanaka, 1997).

Генеративное ядро, в отличие от вегетативного, практически неактивно в отношении синтеза рРНК (Testilliano et al., 1995). В ряде исследований установлена тесная взаимосвязь генеративной клетки и спермиев с ядром вегетативной клетки, которая сохранялась и во время роста пыльцевой трубки. Наличие большого количества ядерных пор на той стороне вегетативного ядра, которая обращена к генеративной клетке, подтверждает взаимосвязь между вегетативным ядром и генеративной клеткой (Shi et al., 1991). Специфичные транскрипты или белки могут транспортироваться из вегетативной в генеративную клетку. Обнаружены мРНК, которые экспрессируются в вегетативной клетке, но не исключена их экспрессия и в генеративной клетке (Hanson et al., 1989). Twell в 1992 году показал, что промотор специфического гена пыльцы, lat52, управляет экспрессией специфичных генов вегетативной клетки (Twell, 1992). Наиболее изучены поздние гены, специфичные для вегетативной клетки, их используют в качестве молекулярных маркеров дифференциации мужского гаметофита (Twell, 1994). В работах ряда авторов (Eady et al., 1995; Chen and McCormick, 1996) было показано, что экспрессия таких генов, регулирующих прорастание пыльцевого зерна и образование пыльцевой трубки, осуществляется без участия генеративной клетки. В генеративной клетке у арабидопсиса были обнаружены Rop GTPases. Rop включаются в механизм, контролирующий актин-зависимый рост кончика пыльцевой трубки. Предполагают, что Rop GTPases играют важную роль в модуляции акто-миозиновой системы, которая включается в движение генеративной клетки (Lin et al., 1996).

Наиболее характерным процессом, сопровождающим созревание пыльцевого зерна, является запасание углеводов, которое может начинаться еще на стадии его дифференциации. Резервные вещества, необходимые для прорастания пыльцы, накапливаются в вегетативной клетке в форме крахмала, везикулярных полисахаридов, цитоплазматической каллозы и свободных сахарозы, глюкозы и фруктозы (Тиру et al., 1992; Матвеева, Ермаков, 1999). В зрелой пыльце находятся запасные питательные вещества (зерна крахмала и липидные капли). Цитоплазматические полисахариды и сахароза служат не только источником энергии, но и выполняют функции протекторов (Pacini, 1996). Проведенный недавно Добровольской анализ развивающихся пыльников петунии выявил различия в динамике различных форм Сахаров в процессе развития мужского гаметофита. Важно отметить, что содержание Сахаров было значительно выше в период созревания пыльцевых зерен по сравнению с ранними этапами развития (Добровольская, 2006).

Кроме запасных питательных веществ, в зрелом пыльцевом зерне содержатся и физиологически активные соединения, которые используются во время роста пыльцевой трубки.

Пыльца растений богата ферментами, такими как амилаза, инвертаза, каталаза, протеаза, липаза, кутиназа, цитаза, пектиназа, рибонуклеаза, карбоксилаза, редуктаза, фосфатаза, дегидраза, пероксидаза, цитохромоксидаза и др. (Knox and Heslop-Harrison, 1970; Голубинский, 1974). Фосфатаза, рибонуклеаза, кутиназа, амилаза, протеаза и инвертаза локализованы в интине пыльцевого зерна или пыльцевой трубке (Knox and Heslop-Harrison, 1970; Singh and Knox, 1984).

Подавляющее количество мРНК и белки, которые требуются для прорастания и начала роста пыльцевой трубки, синтезируются в пыльцевом зерне в процессе его развития (Mascarenhas, 1989, 1993). Зрелая пыльца содержит белки, синтезированные на протяжении всего периода созревания, а также пресинтетические мРНК, которые транслируются во время прорастания. Некоторые транскрипты накапливаются по мере развития пыльцевого зерна, но начинают транслироваться только после его прорастания. К их числу относятся, в частности, мРНК гликопротеинов 66 и 69 kDa (Storchova et al., 1994; Capkova et al., 1997). В пыльце некоторых видов растений, таких как Lilium longiflorum L., Tradescantia virginiana L., Nicotiana tabacum L., Cryptomeria japónica L. был обнаружен полипептид 21 kDa, который присутствует в цитоплазме, в вегетативном ядре и генеративной клетке (Yokota et al., 2004). Его выделение из пыльцы в среду культивирования зависит от присутствия EGTA и MgCb, а

2+ также от концентрации Са и рН. При низком значении рН и высокой концентрации MgCl2 происходило ингибирование прорастания пыльцевых зерен (Yokota et al., 2004).

Из пыльцы петунии {Petunia inflatá) были выделены гены, кодирующие рецептор-подобную киназу PRK1 (Lee et al., 1996). Показано, что домен этой киназы содержит лейцин-богатые последовательности, характерные для белковых взаимодействий. Для выяснения роли киназы PRK1 были исследованы трансгенные растения, у которых промотор гена lat52 был соединен с с-ДНК, антисмысловой домену PRK1. Было установлено, что микроспоры трансгенных растений нормально развивались лишь до митоза. Далее лишь половина из них вступала в митоз, образуя нормальные пыльцевые зерна. Другая половина, теряя ядро, погибала, что указывает на важную роль киназы PRK1 в трансдукции сигналов, регулирующих развитие пыльцевых зерен (Lee et al., 1996).

К настоящему времени идентифицирован ряд специфических для пыльцы генов, экспрессия которых приурочена к определенным стадиям развития микроспоры и пыльцевого зерна (Mascarenhas 1990; 1993; McCormick, 1993; Twell, 1994; Taylor and Hepler, 1997). Свыше 20 000 генов экспрессируется во время развития мужского гаметофита и только 10 % из которых, как полагают, являются специфическими для мужского гаметофита (Willing and Mascarenhas, 1984; Willing et al., 1988). Многие из этих генов транскрибируются после митоза I, а некоторые - во время прорастания и раннего роста пыльцевой трубки в системе пыльца-пестик (Mascarenhas, 1993).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Минкина, Юлия Викторовна

выводы

1 )In vitro прорастание и рост мужского гаметофита петунии самосовместимого и самонесовместимого клонов сопровождались повышением содержания фитогормонов (ИУК, гиббереллинов, цитокининов) и флавонолов.

2) Мужской гаметофит самосовместимого клона характеризовался более высоким уровнем содержания ИУК и флавонолов, обеспечивающим его высокий уровень фертильности.

3) Мужской гаметофит самонесовместимого клона характеризовался более высоким уровнем содержания цитокининов. Синтетический цитокинин 6-БАП ингибировал прорастание и рост мужского гаметофита обоих клонов. Полученные данные указывают на участие цитокининов в регуляции механизма гаметофитной самонесовместимости.

4) Экзогенные фитогормоны (ИУК, АБК, гиббереллин А3) и флавонолы кемферол и кверцетин) стимулировали прорастание и рост мужского гаметофита обоих клонов. Максимальный стимуляторный эффект

12 наблюдали в концентрации для всех испытанных веществ.

5) Экзогенные гиббереллин А3 и АБК стимулировали прорастание пыльцы в большей степени, чем ИУК и флавонолы.

6) Гиббереллин А3 наиболее эффективно по сравнению с другими испытанными соединениями стимулировал рост пыльцевых трубок.

7) Ингибитор транспорта ИУК (2,4-хлорфенокси-2 метилпропионовая кислота) полностью подавлял, а ингибиторы синтеза АБК (флуридон) и гиббереллинов (паклобутразол) тормозили прорастание и рост мужского гаметофита.

8) В присутствии ингибитора транспорта ИУК экзогенные АБК, гиббереллин А3 и флавонолы не активировали прорастание пыльцы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в основе in vitro прорастания и роста мужского гаметофита лежит полярный транспорт ИУК.

9) Перенос пыльцы, предварительно культивированной на среде без гормонов в течение 1-4 часов, на среду, содержащую ИУК, приводило к монотонному росту цитоплазматического рН (рНс) мужского гаметофита, как в ходе прорастания пыльцы, так и роста пыльцевых трубок. Напротив, присутствие в среде 6- БАП (ингибирующего рост мужского гаметофита) вызывало снижение рНс.

10) Зависимость гормон-индуцированных изменений цитоплазматического рНс от физиологического состояния мужского гаметофита предполагает, что эти изменения участвуют в регуляции прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Петуния {Petunia hybrida L.) неоднократно использовалась в качестве объекта исследования при изучении физиологических и молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий в системе пыльца-пестик (Barendse et al., 1970; Stanley et al., 1974; Cresti et al., 1979; Lee et al., 1996; Ковалева и др. 2000, 2002; Kovaleva et al., 2003; Ковалева и др. 2004; 2005). Этому способствовало функционирование механизма гаметофитной самонесовместимости, связаного с функционированием S-гена, который контролирует рост пыльцевых трубок в тканях рыльца и столбика в прогамной фазе оплодотворения. Несовместимые пыльцевые трубки прорастают на поверхности рыльца, входят в ткани столбика, но спустя 8-10 часов их рост тормозится, тогда как совместимые пыльцевые трубки продолжают расти и через 24 часа достигают завязи. Поскольку до сих пор синтез S-белка в мужском гаметофите остается гипотетическим, а молекулярные основы взаимодействий в системе пыльца-пестик не установлены, поиск факторов, участвующих в этих взаимодействиях, является актуальной проблемой.

Данная работа является продолжением начатых ранее исследований (Ковалева и др., 2000; 2002; Kovaleva et al., 2003; Ковалева и др., 2004; 2005) и направлена на изучение факторов регуляции прорастания и роста мужского гаметофита. Поскольку возможности изучения регуляторных механизмов этого процесса in vivo сильно ограничены из-за сложности системы пыльца-пестик, мы использовали более простую модельную систему - культивируемые in vitro пыльцевые трубки.

Поскольку пыльцевые трубки могут прорастать в культуре in vitro, можно полагать, что инициация прорастания пыльцевой трубки является автономным процессом. В последнее время широко используют изолированные микроспоры табака для формирования пыльцевых зерен в культуре in vitro. Установлено, что в среде, содержащей ткани пыльника или завязи, с большей частотой происходят эмбриогенез, каллусообразование и регенерация гаплоидных растений (Матвеева и др. 1998).

Подбор среды культивирования для пыльцы петунии проводили, исходя из литературных данных. Так, известно, что необходимыми факторами in vitro прорастания и роста пыльцевых трубок являются Са2+, 1-Г и В(ОН)4" (Steer and Steer, 1989; Messerli and Robinson, 1997; Holdaway-Clarke, 2003). Ca2+ связывает соседние пектиновые цепи, тем самым укрепляя клеточную стенку. В(ОН)4~ связывает мономеры рамногалактуронана II (RG-II), усиливая жесткость стенки. Ионы РГ являются свободными агентами и в стенке пыльцевой трубки могут действовать через фермент пектинметилэстеразу (PME) или стимулировать гидролиз пектина, способствуя пластичности стенки (Moustacas ni et al., 1986, Li et al., 2002). Полагают, что Ca и бор связываются с клеточной стенкой в оптимальных концентрациях, достаточно высоких для того, чтобы обеспечить поддержание достаточной жесткости стенки, но в то же время достаточно низкими для того, чтобы позволить стенкам быстро осуществлять периоды быстрого роста (Holdaway-Clarke, 2003). Как показали наши эксперименты, оптимальная среда для культивирования пыльцы петунии содержала бор, как основной компонент.

Пыльцевые зерна содержат большую часть классических фитогормонов (Stanley & Linskens, 1974; Singh, Sawhney, 1992). Анализ гормонального статуса прорастающего in vitro мужского гаметофита петунии и эффектов экзогенных фитогормонов подтвердил положение об автономности начального процесса прорастания пыльцевой трубки и указал на участие в нем гормональной системы пыльцевого зерна. Прорастание пыльцевых зерен петунии самосовместимого и самонесовместимого клонов сопровождалось синтезом ИУК, гиббреллинов и цитокининов. Наличие синтеза гормонов в прорастающем мужском гаметофите, как нам представляется, весьма существенно для межклеточных взаимодействий в системе пыльца-пестик (Ковалева и др., 2005). Хотя полученные данные свидетельствуют об участии фитогормонов в процессе прорастания пыльцевого зерна, однако вопросы, касающиеся механизма их действия и возможности их функционирования как сигнальных молекул в системе пыльца-пестик, остаются пока открытыми.

Можно высказать некоторые предположения о том, каким образом фитогормоны контролируют процессы прорастания и роста мужского гаметофита, если принять во внимание как наши собственные, так и литературные данные.

К настоящему времени установлено, что с помощью фитогормонов осуществляется координация взаимодействия клеток, тканей и органов в растении, регуляция функций и обеспечение целостности организма, запуск физиологических и морфогенетических программ (Theologis, 1992). Накоплено достаточно много данных, демонстрирующих способность фитогормонов модулировать транскрипцию и трансляцию некоторых генов в растениях (Walker et al., 1998; Robertson, 1998; D'Agostino &, Kieber, 1999; Weijers & Jürgens, 2004; Кулаева & Прокопцева, 2004; Nemhauser et al., 2006), гораздо меньше известно о самых начальных стадиях трансдукции гормональных сигналов, связанных с их восприятием и проведением к геному (Brault et al., 2004; Zhang et al., 2005; Zalejski et al., 2005, 2006). Исследования, проведенные в настоящей работе, следует рассматривать как один из первых этапов в изучении механизма действия фитогормонов в регуляции прорастания и роста мужского гаметофита.

Сообщения, имеющиеся в литературе в настоящее время, показывают, что выявление роли и/или требования фитогормонов в тех или иных процессах в растениях может основываться на использовании в исследованиях такого рода двух основных методических подходов. В одном из них исследования проводятся на мутантных растительных объектах, дефектных в биосинтезе того или иного фитогормона (Cheng et al., 2004), в то время как основу другого, более традиционного подхода составляет изучение действия экзогенных соединений данного типа (Levchenko et al., 2005).

Для выявления участия гормонов в регуляции роста мужского гаметофита Sondheimer и Linskens использовали в своих исследованиях обработку экзогенными фитогормонами прорастающей in vitro пыльцы Petunia hybrida. При этом ИУК, гиббереллин Аз и зеатин в концентрациях Ю'МО^М ингибировали, а АБК в тех же концентрациях незначительно стимулировала прорастание пыльцы (Sondheimer and Linskens, 1974). В проведенных нами опытах установлено, что экзогенные фитогормоны ИУК, АБК, гиббереллин А3 стимулировали прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок петунии, причем максимальный эффект эти фитогормоны проявили в концентрации Синтетический цитокинин 6-БАП ингибировал прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок в разной степени в зависимости от его концентрации (100% ингибирование прорастания пыльцы наблюдали при использовании 6-БАП в концентрации 10"3М).

Относительно роли фитогормонов в изучаемом нами процессе можно высказать ряд предположений.

АБК, как мы полагаем, возможно, участвует в гидратации пыльцевых зерен, при этом и сама гидратация может быть АБК-зависимым процессом. Известно, что АБК может включаться в процессы гидратации, контролируя процессы транспорта ионов как осмотически активных веществ через мембраны растительных клеток, причем ее действие сопровождается генерацией "кальциевого сигнала" (Dearnaley et al, 1997). Показано, что такой же сигнал генерируется и при гидратации пыльцевых зерен (Huang et al, 2000). Известно, что АБК является антагонистом гиббереллинов, ингибирует аккумуляцию антоцианинов и транскрипцию chs генов петунии (Weiss et al., 1995).

Из данных, полученных как на прорастающих in vitro пыльцевых трубках (рис.8), так и на системе пыльца-пестик петунии in vivo (Ковалева и др., 2002, Kovaleva & Zakharova, 2003), следует, что гиббереллины контролируют процесс растяжения пыльцевой трубки. Убедительные результаты, демонстрирующие необходимость гиббереллинов для роста пыльцевых трубок, получены на дефицитных по гиббереллину мутантах Arabidopsis (Singh et al, 2002). Роль гиббереллина в процессе прорастания и роста пыльцевых трубок in vivo и in vitro была показана в ряде работ (Bhandal and Malik, 1979; Viti et al., 1990; Setia et al., 1994). Для подтверждения роли гиббереллина в процессе роста пыльцевых трубок были проведены опыты с добавлением в среду культивирования in vitro пыльцевых трубок Arabidopsis ингибитора синтеза гиббереллина - униконазола. После добавления в среду культивирования гиббереллина эффект униконазола был подавлен, то есть пыльцевые трубки продолжали свой рост (Singh et al., 2002). Гиббереллины стимулируют аккумуляцию антоцианинов и индуцируют экспрессию chs и chi генов (Weiss et al., 1992). Кинетика индукции chs и необходимость de novo синтеза белков для аккумуляции chs мРНК предполагает, что гиббереллины косвенно индуцируют гены антоцианинового биосинтеза, которые экспрессируются во время развития венчика (Kroon et al., 1994).

Известно, что ауксины включаются в различные процессы развития растений, такие как увеличение размера клеток, дифференциация тканей, инициация корней, гравитропизм, фототропизм и апикальное доминирование. При добавлении к изолированным колеоптилям ауксина, он способен индуцировать их элонгацию. Этот ответ начинается в течение 10 минут и приводит к 5-10 кратному увеличению скорости роста (Evans, 1985). Идентифицировано много генов, необходимых для ответа на ауксин у дикого типа. Мутации axrl приводят к редукции ответа на ауксин (Lincoln et al., 1990; Leyser et al., 1993), а мутации ахгЗ приводят к увеличению ауксинового ответа (Leyser et al., 1996; Rouse et al., 1998). Обработка растений ауксином ингибировала биосинтез цитокинина (Nordstrom et al., 2004). Экзогенный ауксин стимулировал продукцию этилена (Morgan and Hall, 1962) через индукцию генов, кодирующих ферменты, которые лимитируют скорость биосинтеза этилена (Abel et al., 1996). Этилен ингибировал латеральный (Burg and Burg, 1966) и базипетальный (Suttle, 1988) транспорт ауксина. Ауксин вызывал увеличение продукции гиббереллина (Ross et al., 2000). АБК снижала уровень свободной ИУК, повышая связанные формы ИУК (Dunlap and Robacker, 1990).

Относительно роли ауксинов и цитокининов в регуляции роста мужского гаметофита следует отметить, что их баланс в системе пыльца-петик контролирует рост пыльцевых трубок в тканях столбика in vivo (Ковалева, Захарова, 2004). На основе данных о метаболических перестройках в тканях пестика петунии в процесс роста пыльцевых трубок (Linskens, 1974, Ковалева, Комарова, 1993) логично допустить, что ауксины совместно с цитокининами контролируют рост мужского гаметофита, влияя на поступление питательных веществ к растущим пыльцевым трубкам и/или на организацию их цитоскелета. Как полагаем, в основе прорастания и роста мужского гаметофита лежит полярный транспорт ИУК.

Ингибирование роста пыльцевых трубок в тканях столбика петунии самонесовместимого клона при самоопылении сопровождалось многократным увеличением уровня цитокининов в системе пыльца-пестик (Ковалева, Захарова, 2004). Вероятно, в этой связи следует рассматривать и полученные здесь данные об ингибиторном эффекте 6-БАП на рост пыльцевых трубок. Гормональный баланс мужского гаметофита во время последующего роста in vitro резко различался у двух клонов петунии: рост пыльцевых трубок самонесовместимого клона характеризовался пятикратным повышением уровня цитокининов. Использованный в опытах синтетический цитокинин (6-БАП) тормозил как прорастание, так и рост пыльцевых трубок петунии обоих клонов. Полагаем, что повышение уровня содержания цитокининов в прорастающей in vitro пыльце самонесовместимого клона петунии может быть связано с экспрессией S-гена самонесовместимости и синтезом неидентифицированного фактора самонесовместимости в мужском гаметофите.

Интересные данные о включении ауксина и цитокининов в индуцируемые дефицитом бора изменения в апексах гороха получены в самое последнее время (Wang et al, 2006). Показано, что при дефиците бора замедляется рост апекса растений. У бор-дефицитных растений уровень ауксина и цитокининов, которые регулируют апикальное доминирование, был снижен. Добавление бора к стеблевому апексу таких растений восстанавливало эндогенный уровень Z/ZR и ИУК в них и стимулировало транспорт ауксина из стеблевого апекса.

Достаточно выраженные изменения рНс пыльцевых зерен и пыльцевых трубок под действием экзогенных фитогормонов, наблюдаемые в проведенных нами экспериментах, говорят в пользу того, что эти изменения могут оказывать заметное влияние на те эффекторные метаболические системы мужского гаметофита, которые участвуют в реализации его ответной реакции на фитогормон. Вместе с тем особое внимание обращает на себя тот факт, что характер действия на пыльцевые зерна ИУК и АБК существенно зависит от их физиологического состояния. Качественно иное изменение рНс прорастающих пыльцевых зерен, вызываемое этими соединениями, а именно его возрастание, дает основание полагать, что активация ростовых процессов в мужском гаметофите сопровождается появлением в нем новых мишеней действия фитогормонов или переходом их в другое состояние, отличное от того, свойственного стадии покоя. Кроме того, отсутствие здесь, в отличие от соответствующих изменений рНс покоящихся пыльцевых зерен (Тимофеева, 2005), фазы обращения сдвига рНс может быть связано с необходимостью увеличения рНс, требуемого, как известно, для активации синтеза белка в ходе прорастания пыльцы (Матвеева и др., 2003).

Чувствительность гормон-индуцированного щелочного сдвига рНс пыльцевых зерен к ванадату (Тимофеева, 2005), вероятно, говорит о том, он обусловлен стимуляцией протонного насоса (Н+-АТФазы) на плазмалемме пыльцевых клеток. Возможно, что этот эффект лежит в основе стимуляции фитогормонами процесса прорастания пыльцевых зерен. С другой стороны, тот факт, что в контроле, то есть в отсутствие фитогормонов, ванадат не влиял на данный параметр, означает, что в этих условиях регуляция рНс клеток пыльцевого зерна, вероятно, осуществляется благодаря активности других компонентов рН-статирующей системы (Бпскег е1 а1., 1997; ОЬегтеуег е1 а1., 1992). Вместе с тем ванадат-индуцируемое закисление покоящихся пыльцевых зерен, наблюдаемое в контроле в сходных экспериментальных условиях, может свидетельствовать об участии НГ-АТФазы плазмалеммы в регуляции рНс. Выявленное различие в чувствительности к ванадату исходного (контрольного) значения рНс клеток покоящихся и прорастающих пыльцевых зерен петунии может быть связано с существенно различной обогащенностью их плазмалеммы Н+-АТФазой, которая преобладает в пыльцевых зернах первого типа (ОЬегтеуег е1 а1., 1992). При этом, несмотря на относительно низкое содержание Н^АТФазы в плазмалемме прорастающих пыльцевых зерен, стимуляция ее активности фитогормонами выявляется, как мы предполагаем, в щелочном сдвиге их рНс. В то же время, в контроле подавление действия Н4-АТФазы ванадатом может не проявляться в сдвиге рНс по причине ее исходно низкой активности, вероятно исключающей в данных условиях поведение этого фермента как активного компонента рНс - стата пыльцевого зерна (ОЬегтеуег е1 а1., 1992). Не исключено также, что регуляция рНс прорастающих пыльцевых зерен носит иной характер, который обусловлен необходимостью активации ростовых процессов.

В целом полученные в работе результаты позволяют заключить, что внутриклеточный рНс клеток пыльцевого зерна петунии чувствителен к действию на них ряда классических фитогормонов, причем характер их влияния на рНс существенным образом зависит как от их природы, так и от физиологического состояния этих растительных объектов.

На основании этих результатов предполагается, что физиологическое действие фитогормонов в данной системе включает в себя модуляцию рНс, то есть временное нарушение гомеостатической регуляции рНс цитозоля клеток пыльцевого зерна, которое может играть сигнальную роль в инициации дальнейших клеточных ответных реакций, запускаемых фитогормонами. Полученные данные позволяют заключить, что гормон-индуцированный щелочной сдвиг рНс пыльцевых зерен опосредован активностью Н^-АТФазы на их плазматической мембране и что действие этого протонного насоса включается в регуляцию рНс клеток пыльцевого зерна, находящегося как на стадии гидратации, так и прорастания.

Фенольные соединения, образование которых свойственно практически всем растительным клеткам и тканям являются одними из наиболее распространенных в растениях представителей вторичного метаболизма (Koes et al., 1994; Запрометов, 1993; 1996). Флавоноиды входят в состав пигментов (халконы и антоцианы), компонентов окраски (флавононы, флавоны и флавонолы), включаются в защитные механизмы от различных стрессов (например, от УФ радиации), в межклеточные взаимодействия в системе растение - патоген (Минаева, 1978; Tunen and van Mol, 1990; Koes et al., 1994). Представлению о флавонолах как о возможных факторах репродуктивного развития способствовали многочисленные данные о наличии этих веществ в цветках различных растений, а также об изменении их количества и состава в процессе цветения. Стенли и Линскенс в 1974 году (Stanley and Linskens, 1974) предположили, что флавонолы, совместно с белками, диффундируют из пыльцы в первые минуты ее прорастания, что в свою очередь стимулирует сдвиги в метаболизме рыльца и всего гинецея. В. Г. Минаева провела серию опытов по выявлению характера воздействия флавонолов володушки на прорастание и рост пыльцевых трубок (Минаева, 1978). Действие флавонолов оказалось положительным на оба эти процесса, что позволило предположить использование этих соединений на построение оболочки пыльцевого зерна.

Исследования на трансгенных растениях табака, кукурузы и петунии (Wiermann et al, 1983; Ylstra, 1992, 1994; Mo et al., 1992; Taylor and Jorgensen, 1992; van der Meer et al., 1992; Pollak et al., 1993, 1995; Vogt et al., 1994) позволили поставить вопрос о сигнальной роли флавонолов при прорастании пыльцы. У петунии впервые был получен трансгенный мутант white anther (wha), у которого блокирован биосинтез кемферола в пыльниках в результате мутации гена chsA, контролирующего активность халконсинтазы - фермента начального этапа биосинтеза флавонолов (Napoli et al., 1999). У этих растений либо пыльца не прорастала, либо не образовывались пыльцевые трубки (Taylor and Jorgensen, 1992). Однако пыльца мутантных растений прорастала при добавлении кемферола во время опыления, а также при скрещивании мутанта с диким типом (с флавонол-продуцируемым рыльцем). Было показано, что только один тип флавонолов, а именно агликоны флавонолов, способны восстанавливать прорастание флавонол-дефицитной пыльцы (Mo et al., 1992). Фертильность полностью восстанавливалась при добавлении наномолярных концентраций кемферола на рыльце при опылении (Mo et al., 1992). HPLC анализ выявил кемферол в зрелом пыльнике и в экстрактах рыльца петунии дикого типа, тогда как экстракт из рылец растений трансгенной петунии терял способность продуцировать кемферол (Mo et al., 1992).

Предположение о том, что флавонолы необходимы для прорастания пыльцы, было высказано на основе наблюдений за трансгенными растениями петунии, содержащими chs ген мужской стерильности (van der Meer et al., 1992). Флавонолы присутствуют в диффузате зрелой пыльцы табака и оказывают сильный стимуляторный эффект на in vitro развитие, прорастание и рост пыльцевых трубок (Ylstra et al., 1992; 1995). Экстракты из незрелых рылец дикого типа не были способны восстанавливать фертильность CMF пыльцы, тогда как экстракты из зрелых рылец способны восстанавливать прорастание и рост пыльцевых трубок (Ylstra et al., 1992).

Chs и агликоны флавонолов, необходимые для прорастания пыльцы петунии, накапливались во время развития рылец и пыльников у дикого типа, что в свою очередь коррелировало со способностью рылец восстанавливать фертильность флавонол-дефицитной CMF пыльцы.

В данной работе на двух клонах петунии (самосовместимом и самонесовместимом) проведен сравнительный анализ содержания флавонолов в развивающихся пыльниках, в in vitro прорастающем мужском гаметофите и системе пыльца-пестик после самосовместимого и самонесовместимого опыления. Развитие мужского гаметофита сопровождается накоплением флавонолов в тканях развивающегося пыльника. Максимальный уровень флавонолов содержится в зрелой пыльце, во время ее прорастания уровень флавонолов повышался, в то время как рост пыльцевых трубок in vitro происходит при их постоянном уровне. В спорофитных тканях пестика флавонолы главным образом локализованы в тканях рыльца.

Интермедиаты и конечные продукты флавоноидного пути аккумулируются в тех же самых клетках и в мутантных растениях, и в растениях дикого типа, что возможно, свидетельствует о том, что флавонолы накапливаются в тех же самых клетках, в которых они синтезируются (Galweiler et al, 1998).

Ядерная локализация кемферола и кверцетина предполагает, что они могут функционировать в качестве антиоксидантов или регуляторных факторов транскрипции (Grandmasion and Ibrahim 1996, Shirley, 1999, Sheahan and Cheong 1998).

Согласно высказанной в 60-х годах прошлого века идее, флавонолы могут контролировать рост и развитие растений, влияя на транспорт ауксинов (Thimann, 1965; Rubery and Jacobs, 1988). Rubery (Rubery, 1990) предположил, что кверцетин и другие флавоноиды связываются, как природные лиганды, с фитотропином или рецептором NPA (N-l naphthylphthalamic acid). Это мнение подтверждается данными Vesper и Kuss (Vesper and Kuss, 1990), которые обнаружили в присутствии NPA сильную стимуляцию ауксином роста колеоптилей кукурузы.

В последние годы появляется все больше данных в пользу представлений о том, что ингибирование транспорта ауксина, так же как и сам его транспорт, является существенным фактором, влияющим на распределение фитогормона, обеспечивающее устойчивое состояние растения (Brown, 2001). Регуляция транспорта ауксинов эндогенными флавонолами in vivo установлена с помощью флавонол-дефицитных мутантов арабидопсиса (Gupta et al., 2002). Локализация мембраносвязанных агликонов флавонолов совпадала с локализацией ауксина (Gupta et al., 2002).

Рассматривают ряд причин, по которым флавонолы могут выступать кандидатами в роли эндогенных регуляторов транспорта ауксина (Stafford, 1990, Murphy et al., 2000, Peer et al., 2001). Во-первых, широкое распространение флавонолов в растениях. Во-вторых, тесная связь между структурой и функцией (разнообразие модификаций, приводящих к образованию многообразия соединений с разнообразными функциями). Втретьих, чувствительность к внешним факторам (свет, поранение, симбиотические бактерии) и регуляция синтеза ферментов, контролирующих биосинтез флавонолов (прежде всего халкон-синтазы). В четвертых, локализация в тканях, в которые транспортируется ауксин (Murphy et al, 2000, Peer et al, 2001), а также в плазмалемме (Peer et al, 2001), где локализован ингибитор транспорта ауксина (Brown et al., 2001).

Во взрослых растениях флавонолы, как и ауксины, аккумулируются в растущих или развивающихся тканях. Локализация флавонолов совпадает с аккумуляцией ауксина в корнях и проростках, и может влиять на процесс развития, через контроль за распределением ауксина в этих тканях (Ulmasov et al., 1997, Sabatini et al., 1999) и экспрессией PIN гена (Galweiler et al., 1998). Область аккумуляции флавонолов также наблюдается в зоне перехода между органами, включая переход корень-стебель и переход от меристематической зоны к зоне растяжения в корне. Возможно, роль этой аккумуляции заключается в том, чтобы модулировать поток ауксина между этими различными органами (Ulmasov et al., 1997, Sabatini et al., 1999).

Полученные нами данные на двух клонах петунии о локализации ИУК и флавонолов в системе in vitro (прорастающая пыльца) и двух системах in vivo (пыльник-мужской гаметофит и пыльца-пестик) позволяют сделать ряд предположений о роли флавонолов в процессах роста и развития мужского гаметофита. Процесс формирования мужского гаметофита и его прорастание как in vitro, так и in vivo на воспринимающей поверхности рыльца, сопровождались повышением содержания ИУК и флавонолов. Обращает на себя внимание, что прорастающий мужской гаметофит самосовместимого клона (по сравнению с самонесовместимым) характеризовался более высоким уровнем ИУК и флавонолов. Очевидно, выявленные нами корреляции в содержании ИУК и флавонолов являются существенным фактором формирования фертильности мужского гаметофита. Можно предположить, что в исследуемой нами системе флавонолы блокируют отток ауксина из прорастающего мужского гаметофита, тем самым, повышая его внутриклеточную концентрацию, что в свою очередь способствует полярному росту пыльцевых трубок.

В последние годы накапливаются данные о флавонолах как сигнальных молекулах, участвующих в различных процессах роста и развития растений (Marigo and Boudet, 1977; Jacobs and Rubery, 1988; Vesper and Kuss, 1990; Ylstra et al., 1996; Peer et al., 2001; Kim et al., 2005). В пыльце петунии выявлен специфический фермент-флавонол-З-О-галактозилтранс-фераза (F3GalTase). Этот фермент экспрессируется исключительно в мужском гаметофите и контролирует образование гликозилированных флавонолов (флавонол-З-О-галактозидов). F3GalTase пыльцы петунии, катализируя образование флавонол-З-О-галактозидов, использует только УДФ-галактозу и флавонолов (в отличие от гликозилтрансфераз спорофитных тканей) (Xu et al., 1997). Было показано, что в пыльце петунии после обработки кемферолом возрастала транскрипция генов, кодирующих регуляторные или сигнальные белки (Derksen et al., 1999).

Локализация ферментов биосинтеза флавонолов (халконсинтазы и халконизомеразы) как в ядре, так и в цитоплазме позволила авторам предположить участие флавонолов в регуляции генной транскрипции (Peer et al., 2001). Полагают, что флавонолы, возможно, включаются в ингибирование сигнальных каскадов фосфорилирования или специфических киназ. Согласно данным Benjamins (Benjamins et al., 2003), PID киназа участвует в полярном транспорте ауксина и взаимодействует с Са2+-связывающими белками. Анализ PIN белков и транспорта ауксина у флавоноид-дефицитных мутантов предполагает, что PID - медиируемая киназная активность может модулироваться эндогенными флавонолами (Peer et al., 2004). У арабидопсиса накопление флавонолов отмечено в областях, где экспрессируются белки AtPTENl (специфический для пыльцы белок), PID и RCN1 (специфичный для корней белок) (Gupta et al., 2002; Benjamins et al., 2003).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Минкина, Юлия Викторовна, Москва

1. Батыгина Т. Б., Круглова Н. Н. (1994) Движение ядра и клеток в развивающемся пыльцевом зерне. Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 1: Генеративные органы цветка, под ред. Т. Б. Батыгиной. СПб.: Мир и семья. 120-121.

2. Бритиков Е. А. (1957) Физиология опыления и оплодотворения у растений. М.: Знание. Серия VIII1. 33.

3. Бутенко Р. Г. (1989) Биотехнология растений: культура клеток. М.: ВО Агропромиздат. 59.

4. Голубинский И. Н. (1974). Биология прорастания пыльцы. Киев: Наукова Думка. 12-18.

5. Гусаковская М. А., Блинцов А. Н., Ермаков И. П. (1998) О гормональной регуляции эмбриогенеза in vivo у растений. ДАН. 363. 260-262.

6. Гусаковская М. А., Блинцов А. Н. (2001) Возможные факторы индукции ранних этапов эмбриогенеза у покрытосеменных. Физиология растений. 48 (4): 491-498.

7. Добровольская А. А. (2006) Спорофитная регуляция развития мужского гаметофита петунии {Petunia hybrida L.): Дисс. канд. биол. наук, Москва. 86-92.

8. Запрометов М. Н. (1971) Фенольные соединения и методы их исследования. Биохимические методы в физиологии растений, под ред. Павлиновой О. А. М.: Наука. 185-197.

9. Запрометов М. Н. (1993) Фенольные соединения. Распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука. 272.

10. Запрометов М. Н. (1996) Фенольные соединения и их роль в жизни растения. М.: Наука. 45.

11. Ковалева Л. В., Комарова Э. Н. (1993) Гаметофитная самонесовместимость у петунии: динамика углеводов в процессе роста пыльцевых трубок. Физиология растений. 40: 260-264.

12. Ковалева Л. В., Ракитин В. Ю., Добровольская А. А. (2000) Этилен -регулятор роста пыльцевых трубок в спорофитных тканях пестика у петунии самосовместимого и самонесовместимого клонов. ДАН.370 (6): 832-833.

13. Ковалева JI. В., Ракитин В. Ю., Добровольская А. А. (2000) Гаметофитно-спорофитные взаимодействия в системе пыльца-пестик. II. Выделение этилена и С02 при опылении. Физиология растений. 47: 544-547.

14. Ковалева Л. В., Захарова Е. В., Минкина Ю. В. (2002) Фитогормональная регуляция роста мужского гаметофита в системе пыльца-пестик. ДАН. 385 (4): 552-555.

15. Ковалева JI. В., Захарова Е. В. (2004) Гаметофитно-спорофитные взаимодействия в системе пыльца-пестик. 4. Гормональный статус и механизм самонесовместимости. Физиология растений. 51 (3): 446-451.

16. Кулаева О. Н., Прокопцева О. С. (2004) Новейшие достижения в изучении механизма действия фитогормонов. Биохимия. 69: 293-310.

17. Матвеева Н. П., Старостенко Н. В., Тукеева М. П., Андреюк Д. С., Блинцов А. Н., Ермаков И. П. (1998) Изменение пути развития изолированных микроспор табака под влиянием внеклеточнеых факторов, выделяемых in vitro. Физиология растений. 45 (5): 730-734.

18. Матвеева Н. П., Ермаков И. П. (1999) Физиология развития мужского гаметофита покрытосеменных растений (современные направления исследований). Журнал общей биологии. 60 (3): 277-293.

19. Матвеева Н. П., Войцех О. О., Андреюк Д. С., Ермаков И. П. (2002) Роль Н+-АТФазы и альтернативной величины внутриклеточного рН на разных стадиях развития мужского гаметофита табака. Онтогенез. 33 (6): 436-443.

20. Матвеева Н. П., Андреюк Д. С., Войцех О. О., Ермаков И. П. (2003) Регуляторные изменения внутриклеточного рН и выход из пыльцевых зерен СГ на начальном этапе прорастания in vitro. Физиология растений. 50 (3): 318-323.

21. Минаева В. Г. (1978) Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическоеиспользование. Новосибирск: Наука. 106-120.

22. Нокс Р. Б. (1990) Пыльцевое зерно. Эмбриология растений. Т. 1. М.: Агропромиздат. 224-317.

23. Попова JI. Я. (1977) Петуния гибридная и ее культура. Интродукция и приемы культуры цветочно-декоративных растений. М.: Наука.

24. Попова JI. Я. (1978) Некоторые вопросы селекции петунии гибридной. Интродукция и селекция цветочно-декоративных растений. М.: Наука.

25. Скоробогатова И. В., Захарова Е. В., Карсункина Н. П., Курапов П. Б., Соркина Г. Л., Кислин Е. Н. (1999) Изменение содержания фитогормонов в проростках ячменя в онтогенезе и при внесении регуляторов, стимулирующих рост. Агрохимия. 8: 49 -53.

26. Тимофеева Г. В. (2005) Гормональная регуляция прогамной фазы оплодотворения у петунии {Petunia hybrida L.): Дисс. канд. биол. наук, Москва. 52-60.

27. Трофимова М. С., Молотковский Ю. Г. (1988) рН цитозоля изолированных протопластов и его искусственное изменение. Физиология растений.35: 629-640.

28. Цингер Н. В., Петровская-Баранова Т. П. (1961) Оболочка пыльцевого зерна-живая физиологически активная структура. ДАН СССР. 138: 436.

29. Чайлахян М. X., Хрянин В. Н. (1982) Пол растений и его гормональная регуляция. М.: Наука. 176.

30. Abel S., Theologis А. (1996) Early genes and auxin action. Plant Physiol. Ill (1): 9-17.

31. Barendse G. W. M., Pereira A. S. R., Berkers P. A., Driessen F. M., van Eyden-Emons A. and Linskens H. F. (1970) Growth hormons in pollen, styles and ovaries of Petunia hybrida and Lilium species. Acta. Bot. Neerl. 19: 175-186.

32. Bar-Shalom D., Mattsson O. (1977) Mode of hydration as an important factor in the germination of trinucleate pollen grains. Bot. Tiddskr. 71: 245.

33. Basker R. P., Hasenstein К. H. (1997) Hormonal changes after compatible and incompatible pollination in Theobroma cacao L. Hort. Science. 32: 1231-1234.

34. Bedinger P. (1992) The remarcable biology of pollen. Plant Cell. 4: 879-887.л <

35. Bednarska E. (1989) The effect of exogenous Ca ions on pollen graingermination and pollen tube growth. Sex. Plant Reprod. 2: 53-58.

36. Bednarska E. (1991) Calcium uptake from the stigma by germinating pollen in Primula officinalis L. and Ruscus aculeatus L. Sex. Plant Reprod. 4: 36-38.

37. Bednarska E., Butowt R. (1995) Calcium in pollen pistil interaction in Petunia hybrida. Hort. II. Localization of Ca2+ ions and Ca2+-ATPase in unpollinated pistil. Folia Cytochem. Cytobiol. 33: 43-52.

38. Bednarska E., Butowt R. (1995) Calcium in pollen pistil interaction in Petunia hybrida. Hort. III. Localization of Ca2+-ATPase in pollinated pistil. Cytochem. Cytobiol. 33: 125-132.

39. Benderdour M., Bui-Van T., Dicko A., Belleville F. (1998) In vivo and in vitro effects of boron and boronated compounds. J. Trace Elem. Med. Biol. 12(1): 2-7.

40. Benjamins R., Ampudia C. S. G., Hooykaas P. J. J, Offringa R. (2003) PINOLD-mediated signalling involves calcium-binding proteins. Plant Physiol.132: 1623-1630.

41. Bergamini-Mulcahy G., Mulcahy D. L. (1982) The two phases of growth of Petunia hybrida (Hotr. Vilm-Andz.) pollen tubes through compatible styles. J. Palynol. 18:61-64.

42. Bergamini-Mulcahy G., Mulcahy D. L. (1983) A comparison of pollen tube growth in bi- and tri-nucleate pollen. In: Mulcahy D. L., Ottaviano E. (eds). Pollen: biology and implications for plant breeding. Elsevier Biomedical. Amsterdam.

43. Bergamini-Mulcahy G., Mulcahy D. L. (1988) The effects of suplemented media on the growth in vitro of bi- and tri-nucleate pollen. Plant Sci. 55: 213-216.

44. Blevins D. G., Lukaszewski K. M. (1998) Boron in plant structure and function Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 481-500.

45. Bots M., Vergeldt F., Wolters-Arts M., Weterinds K., Henk van As. and Mariani C. (2005) Aquaporins of the PIP2 class are required for efficient anther dehiscence in tobacco. Plant Phisiol. 137: 1049-1056.

46. Brewbaker J. L., Kwack B. H. (1964) The calcium ion and substances influencing pollen growth. In: Linskens H. F. (ed.) Pollen physiology and fertilization. Amsterdam: Elsevier North Holland. 145-151.

47. Brown D. E., Rashotte A. M., Murphy A. S., Normanly J., Tague B. W., Peer W. A., Taiz L. and Muday G. K. (2001) Flavonoids act as negative regulators of auxin transport in vivo in Arabidopsis. Plant Physiol. 126 (2): 524-535.

48. Brown P. H., Bellaloui N., Wimmer M. A., Bassil E. S., Ruis J., Hu H., Pfeffer H., Dannel F., Romheld V. (2002) Boron in plant biology. Plant Biol. 4: 205-223.

49. Brugliera F., Holton T. A., Stevenson T. W., Farcy E., Lu C. Y., Cornish E. C. (1994) Isolation and characterization of a cDNA clone corresponding to the Rt locus of Petunia hybrida. Plant J. 5 (1): 81-92.

50. Burg S. P., Burg E. A. (1966) The interaction between auxin and ethylene its rolein plant growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 55: 262-269.

51. Bush D. R. (1993) Proton-coupled sugar, and amino acid transporters in plants Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 44: 513-542.

52. Bui A. Q., and O'Neill S. D. (1998) Three 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase genes regulated by primary and secondary pollination signals in orchid flowers. Plant Physiol. 116: 419-428.

53. Cai G., Moscaletti A., Cresti M. (1997) Cytoskeletal organization and pollen tube growth. Trends Plant Sci. 2: 86-91.

54. Capkova-Balatkova V., Hrabetova E., Tupy J. (1980) Effects of cycloheximide on pollen of Nicotiana tabacum in culture. Biochem. Physiol. Plant. 175: 412.

55. Capkova V., Fidlerova A, van Amstel T, Croes A. F., Mata C., Schrauwen J. A., Wullems G. J., Tupy J. (1997) Role of N-glycosylation of 66 and 69 kDa glycoproteins in wall formation during pollen tube growth in vitro. Eur. J. Cell Biol. 72 (3): 282-285.

56. Ciampolini, F., Cresti M. and Kapil R. N. (1982) Germination of cherry pollen grains in vitro-an ultrastructural study. Phytomorphology. 32 (4): 364-373.

57. Chen C. G., Mau S. L., Clarke A. E. (1993) Nucleotide sequense and style-specific expression of a novel proline-rich protein gene from Nicotiana alata. Plant Mol. Biol. 21: 391-395.

58. Chen Y. C. S., McCormick S. (1996) Sidecar pollen, an Arabidopsis thaliana male gametophytic mutant with aberrant cell divisions during pollen development. Development. 122: 3243-3253.

59. Cheng H., Qin L., Lee S., Fu X., Richards D. E., Cao D., Luo D., Harberd N. P., Peng J. (2004) Gibberellin regulates Arabidopsis floral development via suppression of DELLA Protein Function. Development. 131: 1055-1064.

60. Cheung A. Y., May B., Kawata E. E., Gu Q., Wu H. (1993) Characterization of cDNAs for stylar transmitting tissue-specific proline-rich proteins in tobacco. Plant J. 3: 151-160.

61. Cheung A. Y., Wang H., Wu H. (1995) A floral TTS-specific glycoprotein attracts pollen tubes and stimulates their growth. Cell. 82: 383-393.

62. Cheung A. Y. (1995) Pollen-pistil interactions in compatible pollination. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3077-3080.

63. Cheung A. Y. (1996) Pollen-pistil interactions during pollen-tube growth. Trends Plant Sci. 1:45-51.

64. Cheung A. Y., Wang H., Zhan X., Wu H. (1998) A transmitting tissue specificth •pollen tube growth-promoting glycoprotein. Proc. 15 International Congress on Sex. Plant Reprod. Wageningen.

65. Cheung A. Y. and Wu H. M. (1999) Arabinogalactan proteins in plant sexual reproduction. Protoplasma. 208: 87-98.

66. Chrispeels M. J., Crawford N. M., Schroeder J. I. (1999) Proteins for transport of water and mineral nutrients across the membranes of plant cells. Plant Cell. 11:661-675.

67. Clarke A. E., Gleeson P., Harrison S., Knox R. B. (1979) Pollen-stigma interactions: identification and characterization of surface components with recognition potential. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 3358.

68. Clarke A. E., Gleeson P. A. (1981) Molecular aspects of recognition and response in the pollen-stigma interaction. The phytochemistry of cell recognition and cell surface interactions. Rec. Adv. Phytochem. 15: 161.

69. Clarke S. R., Staiger C. J., Gibbon B. C. and Franklin-Tong V. E. (1998) A potential signaling role for profilin in pollen of Papaver rhoeas. Plant Cell. 10: 967-979.

70. Cole R. A., Synek L., Zarsky V. and Fowler J. E. (2005) SEC8, a subunit of theputative Arabidopsis exocyst complex, facilitates pollen germination and "icompetitive pollen tube growth. Plant Physiol. 138: 2005-2018.

71. Cosgrove D. J. (1997) Relaxion in a high-stress environment: the molecular bases of extensible cell walls and cell enlargement. Plant Cell. 9: 1031-1041.

72. Creelman R. A. and Mullet J. E. (1995) Jasmonic acid distribution and action in plants: regulation during development and response to biotic and abiotic stress. Proc. Natl. Sci. USA. 92: 4114-4119.

73. Creelman R. A., Mullet J. E. (1997) Biosynthesis and action of jasmonates in plants. Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 355-381.

74. Cresti M., van Went J. L. (1976) Callóse deposition and plug formation in Petunia pollen tubes in situ. Planta. 133: 35-40.

75. Cresti M., Pacini E., Ciampolini F., Sarfatti G. (1977) Germination and early tube development in vitro of Lycopersicum peruvianum pollen: ultrastructural features. Planta. 136: 239-247.

76. Cresti M., Tiezzi, A. (1990) Germination and pollen tube formation. In: Microspores: Evolution and ontogeny. Blackmore S. and Knox R. B. (eds.) London: Academic Press. 239.

77. D'Agostino I. B., Kieber J. J. (1999) Molecular mechanisms of cytokinin action. Curr. Opin. Plant Biol. 2: 359-364.

78. Dell B., Huang L. (1997) Physiological response of plants to low boron. Plant1. Soil. 193: 103-120.

79. Derksen J., Rutten T., van Amstel T., de Win A., Doris F., Steer M. (1995) Regulation of pollen tube growth. Acta. Bot. Neerl. 44: 93-119.

80. Derksen J., van Wezel R., Knuiman B., Ylstra B., van Tunen A. J. (1999) Pollen tubes of flavonol-deficient petunia show striking alterations in wall structure leading to tube disruption. Planta. 207: 575-581.

81. Derksen J., Knuiman B., Hoedemaekers K., Guyon A., Bonhomme S. and Pierson E. S. (2002) Growth and cellular organization of Arabidopsis pollen tubes in vitro. Sex. Plant Reprod. 15 (3): 133-139.

82. Dickinson H. G., Lawson J. (1975) The growth of the pollen tube wall in Oenthera organensis. J. Cell Sci. 18: 519.

83. Dixit R., Rizzo C., Nasrallah M. and Nasrallah J. (2001) The Brassica MIP-MOD gene encodes a functional water channel that is expressed in the stigma epidermis. Plant Mol. Biol. 45: 51-62.

84. Doares S. H., Narvaez-Vasquez J., Conconi A., and Ryan C. A. (1995 (a)) Salicylic acid inhibits synthesis of proteinase inhibitors in tomato leaves induced by systemin andjasmonic acid. Plant Physiol. 108: 1741-1746.

85. Doughty J., Hedderson F., McCubbin A., Dickinson H. G. (1993) Interaction between a coating-borne peptide of the Brassica pollen grain and stigmatic S (self-incompatibility) locus-specific glycoproteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:467-471.

86. Dunlap J. R., Robacker K. M. (1990) Abscisic acid alters the metabolism of indole-3-acetic acid in senescing flowers of Cucumis melo L. Plant Physiol. 94: 870-874.

87. Eady C., Lindsey K., Twell D. (1995) The significance of microspore division and division symmetry for vegetative cell-specific transcription and generative cell differentiation. Plant Cell. 7(1): 65-74.

88. Elleman C. J., Dickinson H. G. (1999) Commonalities between pollen/stigma and host/pathogen interactions: calcium accumulation during stigmatic penetration by Brassica oleracea pollen tubes. Sex. Plant Reprod. 12: 194-202.

89. Estruch J., Kadwell S., Merlin E., Crossland L. (1994) Cloning and characterization of a maize pollen-specific calcium-dependent calmodulin-independent protein kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 8837-8841.

90. Evans M. L. (1985) The action of auxin on plant cell elongation. Crit. Rev. Plant. Sci. 2: 317-365.

91. Feijo J. A., Malho R., Obermeyer G. (1995) Ion dynamic and its possible role during in vitro pollen germination and tube growth. Protoplasma. 187: 155-167.

92. Feijo J. A., Hackett G. R., Kunkel J. G., Hepler P. K. (1998) Calcium and proton extracellular fluxes, growth oscilations and cytosolic pH in growing pollen tubes of Lilium. Proc. 15th International Congress on Sex. Plant Reprod. Wageningen.

93. Feijo J. A., Sainhas J., Hackett G. R., Kunkel J. G. and Hepler P. K. (1999) Growing pollen tubes possess a constitutive alkaline band in the clear zone and a growth-dependent acidic tip. J. Cell Biol. 144 (3): 483-496.

94. Feijo J. A., Sainhas J., Holdaway-Clarke T., Cordeiro M. S., Kunkel J. G., Hepler P. K. (2001) Cellular oscillations and the regulation of growth: the pollen tube paradigm. Bioassays. 23 (1): 86-94.

95. Ferrary T. E., Best V., More T. A., Comstock P., Muhammad A., Wallace D. H. (1985) Intercellular adhesions in the pollen-stigma system: pollen capture, grain binding and tube attachments. Amer. J. Bot. 72 (9): 1466.

96. Franklin-Tong V. E., Hackett G. and Hepler P. K. (1997) Ratioimaging of Ca2+in the self-incompatibility response in pollen tubes of Papaver rhoeas. Plant J.12: 1375-1386.

97. Franklin-Tong V. E. (1999) Signaling and the modulation of pollen tube growth. Plant Cell. 11 (4): 727-738.

98. Fricker M. D., White N. S., Obermeyer G. (1997) pH gradients are not associated with tip growth in pollen tubes of Lilium longiflorum. J. Cell Sci. 110:1729-1740.

99. Fridborg I., Kuusk S., Moritz T., Sundberg E. (1999) The Arabidopsis dwarf mutant shi exhibits reduced gibberellin responses conferred by overexpression of a new putative zinc finger protein. Plant Cell. 11 (6): 1019-1032.

100. Fu Y., Wu G., Yang Z. (2001) Rop GTPase-dependent dynamics of tip-localized F-actin controls tip growth in pollen tubes. J. Cell Biol.152 (5): 1019-1032.

101. Gage T. B., Wendei S. H. (1950) Quantitative determination of certain flavonol 3-glycosides. Anal. Chem. 22: 708-711.

102. Galweiler L., Guan C., Muller A., Wisman E., Mendgen K., Yephremov A., Palme K. (1998) Regulation of polar auxin transport by AtPINl in Arabidopsis vascular tissue. Sci. 282: 2226-2230.

103. Geitmann A., Snowman B. N., Emons A. M. C. and Franklin-Tong V. E. (2000) Alterations in the actin cytoskeleton of pollen tubes are induced by the self-incompatibility reaction in Papaver rhoeas. Plant Cell. 11: 1239-1251.

104. Golovkin M. and Anireddy S., Reddy N. (2003) A calmodulin-binding protein from Arabidopsis has an essential role in pollen germination. PNAS. 100(18): 10558-10563.

105. Graber M. L., DiLillo D. C., Friedman B. L., Pastoriza-Munoz E. (1986) Characteristics of fuoroprobes for masuring itracellular pH. Anal. Biochem. 156:202-212.

106. Grandmaison J., Ibrahim R. K. (1996) Evidence for nuclear protein binding of flavonol sulfate esters in Flaveria chloraefolia. J. Plant Physiol. 147: 653-660.

107. Gupta R., Ting J. T. L., Sokolov L. N., Johnson S. A., Luan S. (2002) A tumor suppressor homolog, AtPTENl, is essential for pollen development in Arabidopsis. Plant Cell. 14: 2495-2507.

108. Hanson D. D., Hamilton D. A., Travils J. L., Bashe D. M., Mascarenhas J. P. (1989) Characterization of a pollen-specific cDNA from Zea mays and its expression. Plant Cell. 1: 173-179.

109. Hearn M. J., Franklin F. C. H., Ride J. P. (1996) Identification of a membrane glycoprotein in pollen of Papaver rhoeas which binds stigmatic self-incompatibility (S) proteins. Plant J. 9 (4): 467-475.

110. Hedden P. and Phillips A. L. (2000) Manipulation of hormone biosynthetic genes in transgenic plants. Curr. Opin. Biotechnol. 11: 130-137.

111. Hepler P. K. (1997) Tip growth in pollen tubes: Calcium lieds the way. Trends Plant Sci. 2: 79-80.

112. Hepler P. K., Vidali L., Cheung A. Y. (2001) Polarized cell growth in higher plants. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17: 159-187.

113. Herth W. (1978) Ionophore A 23187 stops tip growth, but not cytoplasmic streaming in pollen tubes of Lilium longiflorum. Prothoplasma. 96: 275.

114. Heslop-Harrison J., Mackenzie A. (1967) Autoradiography of (2-14C) thymidine derivative during meiosis and microsporogenesis in Lilium anthers. J. Cell Sci. 2: 387.

115. Heslop-Harrison J. (1979) An interpretation of the hydrodynamics of pollen. Am. J. Bot. 66: 737-743.

116. Heslop-Harrison J. (1983) Self-incompatibility: phenomenology and physiology. Proc. Roy. Soc. London. Ser. B. Biol. Sci. 218: 371-395.

117. Heslop-Harrison J. (1987) Pollen germination and pollen tube growth. Pollen: Cytology and Development. Int. revilew of Cytology. 107. (eds.) K. L. Ciles. J. Prakash. N. Y: Academic Press. 1.

118. Heslop-Harrison Y. and Heslop-Harrison J. (1992) Germination of the angiosperm pollen: evolution of the actin cytoskeletion and wall during hydration, activation and tube emergence. Ann. Bot. 69: 385-394.

119. Heslop-Harrison J. and Heslop-Harrison Y. (1996) Microtubules and the positioning of the vegetative nucleus and generative cell in the angiosperm pollen tube: a quantitative study. Proc. Roy. Soc. Lond. Ser. B.263 (1375): 1299-1304.

120. Hiscock S. J., Doughty J., Dickinson H. G. (1995) Synthesis andphosphorylation of pollen proteins during the pollen-stigma interaction in self-compatible Brassica napus L. and self-incompatible Brassica oleracea L. Sex. Plant Reprod. 8:345-353.

121. Hoekstra F. A., Bruinsma J. (1979) Protein synthesis of binucleate and trinucleate pollen and its relationship to tube emergence and growth. Planta.146: 559-566.

122. Holdaway-Clarke T. L, Feijo J. A., Hackett G. R., Kunkel J. G., Hepler P. K. (1997) Pollen tube growth and the intracellular cytosolic calcium gradient oscillate in phase while extracellular calcium influx is delayed. Plant Cell.9: 1999-2010.

123. Holdaway-Clarke T. L, Weddle N. M., Kim S., Robi A., Parris C., Kunkel J. C., Hepler P. K. (2003) Effect of extracellular calcium, pH and borate on growth oscillations in Lilium formosanum pollen tubes. J. Exp. Bot. 54 (380): 65-72.

124. Holdaway-Clarke T. L., Hepler P. K. (2003) Control of pollen tube crowth: role of ion gradients and fluxes. New Phytol. 159: 539-563.

125. Hooley R. (1994) Gibberellins: perception, transduction and responses. Plant. Mol. Biol. 26: 1529-1555.

126. Houline G., Boutry M. (1994) Identification of an Arabidopsis thaliana gene encoding a plasma membrane K^-ATPase whose expression is restricted to anther tissues. Plant J. 5: 311-317.

127. Huang J. C., Lin S. M., Wang C. S. (2000) A pollen-specific and desiccation-associated transcript in Lilium longiflorum during development and stress. Plant Cell Physiol. 41: 477-485.

128. Ishii T., Matsunaga T., Pellerin P., O'Neill M. A., Darvill A., Albersheim P. (1999) The plant cell wall polysaccharide rhamnogalacturonan II self-assembles into a covalently cross-linked dimer. J. Biol. Chem. 274: 13098-13104.

129. Iwano M., Entani T., Shiba H., Takayama S. and Isogai A. (2004) Calciumcrystals in the anther of Petunia: the existence and biological significance in the pollination process. Plant Cell Physiol. 45: 40-47.

130. Izhaki A., Swain S. M., Tseng T. S., Borochov A., Olszewski N. E., Weiss D. (2001) The role of SPY and its TPR domain in the regulation of gibberellin action throughout the life cycle of Petunia hybrida plants. Plant J.28 (2): 181-190.

131. Izhaki A., Borochov A., Zamski E., Weiss D. (2002) Gibberellin regulates post-microsporogenesis processes in petunia anthers. Physiol. Plant.115 (3): 442-447.

132. Jacobs M., Rubery P. H. (1988) Naturally occuring auxin transport regulators. Science. 241:346-349.

133. Jansen M. A. K., Sessa G., Malkin S., Fluhr R. (1992) P£PC-mediated carbon fixation in transmitting tract cells reflects style-pollen tube interactions. Plant J. 2: 507-515.

134. Kevin L. C., Wang H. L., Ecker J. R. (2002) Ethylene biosynthesis and signaling networks. Plant Cell. 14: 131-151.

135. Kim A. R, Cho J. Y., Zou Y„ Choi J. S., Ching H. Y. (2005) Flavonoids differentially modulate nitric oxide production pathways in lipopolysaccharide-activated RAW264.7 Cells. Arch. Pharm. Res. 28: 297-304.

136. Knox R. B., Heslop-Harrison J. (1970) Pollen-wall proteins: localization and enzymic activity. J. Cell Sci. 6: 1-27.

137. Knox R. B. (1984) Pollen-pistil interactions. In H. F Linskens, J. Heslop-Harrison (eds.) Encyclopedia of Plant Physiology New Series. Springer-Verlag. Heiderberg. Germany. 17: 508-608.

138. Koes R. E., Spelt C. E., van den Elzen P. J. M., Mol J. N. M. (1989b) Cloning and molecular characterization of the chalcone synthase multigene family of Petunia hybrida. Gene 81: 245-257

139. Koes E., Quattrocchio F., Mol J. N. M. (1994) The flavonoid biosynthetic pathway in plants: function and evolution. Bio Essays. 16: 123-131.

140. Kost B., Lemichez E., Spielhofer P., Hong Y., Tolias K., Carpenter C., Chua N. (1999) Rac homologues and compartmentalized phosphatidilinositol 4,5-bisphospate act in common pathway to regulate polar pollen tube growth. J. Cell1. Biol. 145:317-330.

141. Kovaleva L., Zakharova E. (2003) Hormonal control of pollen-pistil interactions at the progamic phase of fertilization after compatible and incompatible pollination in petunia (Petunia hybrida L.). Sex. Plant Reprod. 16: 191-196.

142. Kroon J., Souer E., de Graaf A., Xue Y., Mol J., Koes R. (1994) Cloning and structural analysis of the anthocyanin pigmentation locus Rt of Petunia hybrida: characterization of insertion sequences in two mutant alleles. Plant J. 5: 69-80.

143. Kunz C., Chang A., Faure J. D., Clarke A. E., Polya G. M., Anderson M. A. (1996) Phosporylation of stile S-RNases by Ca -dependent protein kinases from pollen tubes. Sex. Plant Reprod. 9: 25-34.

144. Labarca C., Loewus F. (1972) The nutration role of pistil exudate in pollen tube wall formation in Lilium longiflorum. I. Utilization of ingected stigmatic exudate. Plant Physiol. 50: 7-14.

145. Labarca C., Loewus F. (1973) The nutration role of pistil exudate in pollen tube wall formation in Lilium longiflorum. II. Production and utilization of exudate from stigma and style canal. Plant Physiol. 52: 87-92.

146. Laudert D., Weiler E. W. (1998) Allene oxide synthase: a major control point in Arabidopsis thaliana octadecanoid signaling. Plant J. 15 (5): 675-684.

147. Lee H. S., Karunanandaa B., McCubbin A., Gilroy S., Kao T. (1996) PRK1, a receptor-like kinase of Petunia inflata, is essential for postmeiotic development of pollen. Plant J. 9 (5): 613 624.

148. Lefebvre B., Arango M., Oufattole M., Crouzet J., Purnelle B., Boutry M. (2005) Identification of a Nicotiana plumbaginifolia plasma membrane H(+)-ATPase gene expressed in the pollen tube. Plant Mol. Biol. 58 (6): 775-787.

149. Lenartowska M., Bednarska E., Butowt R. (1997) Ca2+ in the pistil of Petunia hybrida Hort. During growth of the pollen tube cytochemical and radiographic studies. Acta. Biol. Cracov Ser. Bot. 39: 79-89.

150. Lenartowska M., Rodriguez-Garcia M. I., Bednarska E. (2001) Immunocytochemical localization of esterified and unesterfied pectins in unpollinated and pollinated styles of Petunia hybrida Hort. Planta. 213:182-191.

151. Levchenko V., Konrad K. R., Dietrich P., Roelfsema M. R. G., Hedrich R. (2005) Cytosolic abscisic acid activates guard cell anion channels withoutpreceding Ca2+ signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 4203-4208.

152. Leyser H. M. 0., Lincoln C. A., Timpte C., Lammer D., Turner J., Estelle M. (1993) Arabidopsis auxin resistance gene AXR1 encodes a protein related to ubiquitin activating enzyme El. Nature. 364: 161-164

153. Leyser H. M. 0., Pickett F. B., Dharmasiri S., Estelle M. (1996) Mutations in the AXR3 gene of Arabidopsis result in altered auxin response including ectopic expression from the SAUR-AC1 promoter. Plant J. 10: 403-413.

154. Li Y. Q., Faleri C., Geitmann A., Zhang H. Q., Cresti M. (1995) Immunogold localization of arabinogalactan proteins, unesterified and esterified pectins in pollen tubes oiNicotiana tabacum L. Protoplasma. 189 (1-2): 26-36.

155. Li Y., Moscatelli A., Cai G., Cresti M. (1997) Functional interactions among cytoskeleton, membranes and cell wall in the pollen tube of flowering plants. Int. Rev. Cyt. 176: 113-199.

156. Li H., Lin Y., Heath R. M., Zhu M .X. and Yang Z. (1999) Control of pollen tube tip growth by a Rop GTPasse-dependent pathway that leads to tip-localized calcium influx. Plant Cell. 11: 1731-1742.

157. Li Y. Q., Mareck A., Faleri C., Moscatelli A., Liu Q., Fresti M. (2002) Detection and localization of pectin methylesterase isoforms in pollen tubes of Nicotiana tabacum L. Planta. 214: 734-740. 145.

158. Lin Y., Wang Y., Zhu J-K., Yang Z. (1996) Localization of a Rho-GTPase implies a role in tip growth and movement of the generative cell in pollen tubes. Plant Cell. 8: 293-303.

159. Lincoln C., Britton J. H., Estelle M. (1990) Growth and development of the axrl mutants of Arabidopsis. The Plant Cell. 2: 1071-1080.

160. Lind J. L., Bacic A., Clarke A. E. and Anderson M. A. (1994) A style-specific hydroxyproline-rich glycoprotein with properties of both extensions and arabinogalactan proteins. Plant J. 6: 491-502.

161. Lind J. L., Bonig I., Clarke A. E., Anderson M. A. (1996) A style-specific 120-kDa glycoprotein enters pollen tubes oiNicotiana alata in vivo. Sex. Plant Reprod. 9 (2): 75-86.

162. Linskens H. F., Heinen W. (1962) Cutinase-Nachweis in pollen. Z. Bot. 50: 338-347.

163. Linskens H. F. and Kroh M. (1970) Regulation of pollen tube growth. Acad. Press INC., New York. 89-113.

164. Linskens H. F. (1974) Translocation phenomena in the petunia flower after cross-and self-pollination. Fertilization in higher plants (ed) Linskens H. F Amsterdam: North-Holland. 285-289.

165. Lopez I., Anthony R. G., Maciver S., Jiang C. J., Khan S., Weeds A. G. And Hussey P. J. (1996) Pollen specific expression of maize genes encoding actin depolymerizing factor-like proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 7415-7420.

166. Lord E. M. (2001) Adhesion molecules in lily pollination. Sex. Plant Reprod. 14: 57-62.

167. Lord E. M. and Mollet J. C. (2002) Plant cell adhesion: A bioassay facilitates discovery of the first pectin biosyntetic gene. Biol. Chem. 99 (25): 15843-15845.

168. Lord E. M. and Russell R. D. (2002) The mechanisms of pollination and fertilization in plants. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18: 81-105.

169. Lord E. M. (2003) Adhesion and guidance in compatible pollination. J. Exp. Bot. 54: 47-54.

170. Lovegrove A. and Hooley R. (2000) Gibberellin and abscisic acid signaling in aleurone. Trends Plant Sci. 5: 102-110.

171. Lush W. M., Grieser F., Wolters-Arts M. (1998) Directional guidance of Nicotiana alata pollen tubes in vitro and on the stigma. Plant Physiol. 118 (3): 733-741.

172. Luu D. T., Marty-Mazars D., Trick M., Dumas C., Heizmann P. (1999) Pollenstigma adhesion in Brassica (spp). involves SLG and SLR1 glycoproteins. Plant Cell. 11:251-262.

173. Ma L., Xu X., Cui S. and Sun D. (1999) The presence of a heterotrimeric G protein and its role in signal transduction of extracellular calmodulin in pollen germination and tube growth. Plant Cell. 11 (7): 1351-1363.

174. Makinen Y., Brewbaker J. L. (1967) Isoenzyme polymorphism in flowering plants. Diffusion of enzymes out of intact pollen grains. Physiol. Plant.20: 477-482.

175. Malho R. and Trewavas A. J. (1996) Localized apical increase of cytosolic free calcium control pollen tube orientation. Plant Cell. 8: 1935-1949.

176. Malho R. (1998) Pollen tube guidance the long and winding road. Sex. Plant Reprod. 11:242-244.

177. Mao J. Q., Chen Y. Y., Miao Y. (1992) Ca ion localization in the path of pollen tube growth within the gynoecium of Brassica napus. Acta. Bot. Sin.34: 233-236.

178. Mascarenhas J. P. and Lafountain J. (1972) Protoplasmic streaming, cytochalasin B and growth of the pollen tube. Tissue Cell. 4: 11-14.

179. Mascarenhas J. P. (1975) The biochemistry of angiosperm pollen development. Bot Rev. 41: 259-314.

180. Mascarenhas J. P. (1989) The male gametophyte of flowering plants. Plant Cell. 1:657-664.

181. Mascarenhas J. P. (1990) Gene activity during pollen development. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Biol. 41: 317-338.

182. Mascarenhas J. P. (1993) Molecular mechanism of pollen tube growth and differentiation. Plant Cell. 5: 1303-1314.

183. Mathesius U. (2001) Flavonoids induced in cells undergoing nodule organogenesis white clover are regulators of auxin breakdown by peroxidase. J. Exp. Bot. 52:419-426.

184. Matoh R., Takasaki M., Takabe K., Kobayashi M. (1998) Immunocytochemistry of rhamnogalacturonan II in cell walls of higher plants. Plant Cell Physiol. 39:483-491.

185. Mattson O., Knox R. B., Heslop-Harrison J., Heslop-Harrison Y. (1974) Protein pellicle of stigmatic papillae as a probable recognition site in incompatibilityreactions. Nature. 247: 298.

186. Maucher H., Hamberg M., Grimm R., Ganal M. and Wasternack C. (2000) Molecular cloning of allene oxide cyclase: The enzyme establishing the stereochemistry of octadecanoids and jasmonates. J. Biol. Chem.275: 19132-19138.

187. McConn M. and Browse J. (1996) The critical requirement for linolenic acid is pollen development, not photosynthesis, in an Arabidopsis mutant. Plant Cell. 8:403-416.

188. McCormick S. (1991) Molecular analysis of male gametogenesis in plants. Trends Genet. 7: 298-303.

189. Messerli M. and Robinson K. R. (1997) Tip localized Ca pulses are coincident with peak pulsatile growth rates in pollen tubes of Lilium longiflorum. Cell Sci. 110: 1269-1278.

190. Messerli M. and Robinson K. R. (1998) Cytoplasmic acidification and current influx follow growth pulses of Lilium longiflorum pollen tubes. Plant J. 16(1): 87-91.

191. Miller D. D„ Callaham D. A., Gross D. J. and Hepler P. K. (1992) Free Ca2+ gradient in growing pollen tubes of Lilium. J. Cell Sci. 101:7-12.

192. Miller K. D., Strommer J., Taylor L. P. (2002) Conservation in divergent solanaceous species of the unique gene structure and enzyme activity of a gametophytically-expressed flavonol 3-O-galactosyltransferase. Plant Mol. Biol. 48 (3): 233-242.

193. Mo Y., Nagel C., Taylor L. P. (1992) Biochemical complementation of chalconesynthase mutants defines a role for flavonols in functional pollen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 7213-7217.

194. Mol R., Filek M., Dumas C., Matthys-Rochon E. (2004) Cytoplasmic calcium in silk trihomes after pollen grain receptor and post-pollination changes of the electric potential in pistil tissues of maise. Plant Science. 166: 1461-1469.

195. Mollet J. C., Park S. Y., Nothnagel E. A., Lord E. M. (2000) A lily stylar pectin is necessary for pollen tube adhesion to an in vitro stylar matrix. Plant Cell. 12(9): 1737-1750.

196. Morgan P. W., Hall W.C. (1962) Effect of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on the production of ethylene by cotton and grain sorghum. Physiol. Plantarum. 15:420-427.

197. Moscatelli A., Cai G., Liu G. Q., Tiezzi A., Cresti M. (1996) Dynein-related polypeptides in pollen and pollen tubes. Sex. Plant Reprod. 9 (6): 312-317.

198. Moutinho A., Trewavas A. J. and Malho R. (1998) Relocalization of a Ca2+-dependent protein kinase activity during pollen tube reorientation. Plant Cell. 10: 1499-1509.

199. Murashige T., Skoog E. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

200. Murphy A., Peer W., Taiz L. (2000) Regulation of auxin transport by aminopeptidases and endogenous flavonoids. Planta. 211: 315-324.

201. Muschietti J., Eyal Y. and McCormick S. (1998) Pollen tube localization implies a role in pollen-pistil interactions for the tomato receptor-like protein kinases LePRKl and LePRK2. Plant Cell. 10: 319-330.

202. Napoli C. A., Fahy D., Wang Huai-Yu., Taylor L. P. (1999) white anther: A petunia mutant that abolishes pollen flavonol accumulation, induces male sterility and is complemented by a chalcone synthase transgene. Plant Physiol. 120 (2): 615-622.

203. Nasrallah J. B., Stein J. C., Kandasamy M. K., Nasrallah M. E. (1994) Signalling the arrest of pollen tube developments in self-incompatible plants. Sci. 266: 1505-1508.

204. Nasrallah J. B. (2000) Cell-cell signaling in the self-incompatibility response. Curr. Opin. Plant Biol. 3: 368-373.

205. Nemhauser J. L., Hong F., Chory J. (2006) Different plant hormones regulate similar processes through largely nonoverlapping transcriptional responses. Cell. 126: 467-475.

206. Obermeyer G., Lutzelschwab M., Heumann H.-G., Weisenseel M. H. (1992) Immunolocalization of H+-ATPase in the plasma membrane of pollen grains and pollen tubes of Lilium longiflorum. Protoplasma. 171: 55-63.

207. Obermeyer G., Kriechbaumer P., Strasser D., Maschessnig A., Bentrup F. W. (1996) Boric acid stimulates the plasma membrane H^-ATPase of ungerminated lily pollen grains. Physiol. Plant. 98 (2): 281-290.

208. Obermeyer G., Klaushofer H., Nagl M., Hoftberger M., Bentrup F. W. (1998) In vitro germination and growth of lily pollen tubes is affected by protein phosphotase inhibitors. Planta. 207: 303-312.

209. O'Neill S. D., Nadeau J. A., Zhang X. S., Bui A. Q. and Halevy A. H. (1993) Interorgan regulation of ethylene biosynthetic genes by pollination. Plant Cell. 5:419-432.

210. Biol. Chem. 271 (37): 22923-22930.

211. Pacini E. (1996) Types and meaning of pollen carbohydrate reserves. Sex. Plant Reprod. 9: 362-366.

212. Palanivelu R. and Preuss D. (2000) Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends Cell Biol. 10 (12): 517-524.

213. Palanivelu R., Brass L., Edlund A. F. and Preuss D. (2003) Pollen tube growth and guidance is regulated by POP2, an Arabidopsis gene that controls GAB A levels. Cell. 114: 47-59.

214. Paoletti E. (1992) Effects of acidity and detergent on in vitro pollen germination and tube growth in forest tree species. Tree Physiol. 10 (4): 357-366.

215. Park S. Y., Jauh G. Y., Mollet J. C., Eckard J., Nothnagel E. A., Walling L. L., Lord E. M. (2000) A lipid transfer-like protein is necessary for lily pollen tube adhesion to an in vitro stylar matrix. Plant Cell. 12(1): 151-163.

216. Peer W. A., Murphy A. S., Brown D. E., Tague B. W., Muday G. K., Taiz L. (2001) Flavonoid accumulation patterns of transparent testa mutants of Arabidopsis. Plant Physiol. 126: 536-548.

217. Picton J. M., Steer M. W. (1983) Membrane recycling and the control of secretory activity in pollen tubes. J. Cell Sci. 63: 303-310.

218. Pierson E. S., Cresti M. (1996) Cytoskeleton and cytoplasmic organization of pollen and pollen tubes. Dev. Biol. 174: 160-173.

219. Pollak P. E., Vogt T., Mo Y-Y., Taylor L. P. (1993) Chalcone synthase and flavonol accumulation in stigmas and anthers of Petunia hybrida. Plant Physiol. 102:925-932.

220. Pollak P. E., Hansen K., Astwood J. D., Taylor L. P. (1995) Conditional malefertility in maize. Sex. Plant Reprod. 8: 231-241.

221. Pressey R., Reger B. J. (1989) Polygalacturonase in pollen from corn and other grasses. Plant Sci. 59: 57-62.

222. Pruitt R. E. (1997) Molecular mechanisms of smart stigmas. Trends Plant Sci. 2: 328-329.

223. Pruitt, R. E. (1999) Complex sexual signals for the male gametophyte. Curr. Opin. Plant Biol. 2 (5): 419-422.

224. Raskin I., Turner I. M. and Melander W. R. (1989) Regulation of heat production in the inflorescences of an Arum lily by endogenous salicylic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86. 2214-2218.

225. Rathore K. S., Cork R. J., Robinson K. R. (1991) A cytoplasmic gradient of Ca2+ is correlated with the growth of lily pollen tubes. Dev. Biol. 148: 612-619.

226. Reddy A. S. (2001) Calcium: silver bullet in signaling. Plant Sci. 160 (3): 381-404.

227. Reid J. B. (1994) Plant hormone mutants. Plant Growth Regul. 12: 207-226.

228. Reiss H. D., Herth W. (1978) Visualization of the Ca-gradient in growing pollen tubes of Lilium longiflorum with chlorotetracycline fluorescence. Protoplasma. 97: 373.

229. Ren H., Gibbon B. C., Ashworth S. L., Sherman D. M., Yuan M. and Staiger C. J. (1997) Actin purified from maize pollen functions in living plant cells. Plant Cell. 9: 1445-1457.

230. Robbertse P. J., Lock J. J., Stoffberg E., Coetzer L. A. (1990) Effect of boron on directionality of pollen tube growth in Petunia and Agapanthus. South. Afr. J. Bot. 56 (4): 487-492.

231. Robertson M., Swain S. M., Chandler P. M., Olszewski N. E. (1998) Identification of a negative regulator of gibberellin action, HvSPY, in Barley. Plant Cell. 10:995-1007.

232. Rosen W. G. (1975) Pollen-pistil interactions. The biology of the male gametophyte. (eds.) Duckett J. G., Racey P. A. Biol. J. Linn Soc. L: Academic Press. 7(1): 153.

233. Ross J. J., O'Neill D. P., Smith J. J, Kerckhoffs L. H. J., Elliott R. C. (2000) Evidence that auxin promotes gibberellin Aj biosynthesis in pea. Plant J.21:547-552.

234. Rouse D., Mackay P., Stirnberg P., Estelle M., Leyser O. (1998) Changes in auxin response from mutations in anAUX/IAA gene. Science. 279: 1371-1373.

235. Rubery P., Jacobs M. (1990) Auxin transport and its regulation by flavonoids. In Pharis R., Rood S. (eds), Plant Growth Substances 1988. Springer-Verlag, Berlin: 428-440.

236. Russell S. D. (1993) The egg cell: development and role in fertilization and early embryogenesis. Plant Cell. 5: 1349-1359.

237. Sabatini S., Beis D., Wolkenfelt H., Murfett J., Guilfoyle T., Malamy J., Benfey P., Leyser O., Bechtold N., Weisbeek P., Scheres B. (1999) An auxin-dependent distal organizer of pattern and polarity in the Arabidopsis root. Cell. 99: 463-472.

238. Sanders P. M., Lee P. Y., Biesgen C., Boone J. D., Beals T. P., Weiler E. W. and Goldberg R. B. (2000) The Arabidopsis delayed dehiscence 1 gene encodes an enzyme in the jasmonic acid synthesis pathway. Plant Cell. 12: 1041-1062.

239. Schaller F. (2001) Enzymes of the biosynthesis of octadecanoid-derived signaling molecules. J. Exp. Bot. 52: 11-23.

240. Setia N., Setia R. C. and Chabra N. (1994) Interactive effects of growth hormones and calcium antagonists on germination and tube elongation of groundnut pollen. Plant Cell. Incompatibility. Newsletter. 26: 70-80.

241. Silverstone A. L., Mak P. Y., Martinez E. C., Sun T. P. (1997) The new RGA locus encodes a negative regulator of gibberellin response in Arabidopsis thaliana. Genetics. 146 (3): 1087-1099.

242. Sheahan J. J., Cheong H. (1998) The colorless flavonoids of Arabidopsis thaliana (Brassicaceae): II. Flavonoid 3'hydroxylation and lipid peroxidation. Am J. Bot. 85:476-480.

243. Shirley B. W. (1999) Evidence for enzyme complexes in the phenylpropanoid and flavonoid pathways. Physiol. Plant. 107: 142-149.

244. Singh M. B., Knox R. B. (1984) Invertases of Lilium pollen. Characterization and activity during in vitro germination. Plant Physiol. 74: 510-515.

245. Singh S., Sawhney V. K. (1992) Plant hormones in Brassica napus and Lycopersicon esculetum pollen. Phytochemistry. 31: 4051-4053.

246. Singh D. P., Jermakow A. M., Swain S. M. (2002) Gibberellins are required for seed development and pollen tube growth in Arabidopsis. Plant Cell.14 (12): 3133-3147.

247. Snedden W. A., Fromm H. (2001) Calmodulin as a versatile calcium signal transducer in plants. New Phytologist. 151: 35-66.

248. Sommer-Knudsen J., Clarke A. E., Bacic A. (1996) A galactose-rich, cell-wall glycoprotein from styles of Nicotiana alata. Plant J. 9: 71-83.

249. Sommer-Knudsen J., Clarke A. E., Bacic A. (1997) Proline and hydroxyproline-rich gene products in the sexual tissues of flowers. Sex. Plant Reprod. 10:253-260.

250. Sommer-Knudsen J., Bacic A., Clarke A. E. (1998) Hydroxyproline-rich plant glycoproteins. Phytochemistry. 47: 483-497.

251. Sondheimer E. and Linskens H. F. (1974) Control of in vitro germination and tube extension of Petunia hybrida pollen. Koninkl. Nederl. Akademie van wetenschappen Amsterdam. Reprinted from Proceedings. 77 (2): 116-124.

252. Stadler R., Truernit E., Gahrtz M. and Sauer N. (1999) The AtSUCl sucrose carrier may present the osmotic driving force for anther dehiscence and pollen tube growth in Arabodopsis. Plant J. 19: 269-278.

253. Stafford H. (1990) Flavonoid metabolism. CRC Press, Boca Raton. FL.

254. Stanley R. G., Linskens H. F. (1974) Pollen-biology biochemistry, management. Springer-Verlag Berlin New York Heidelberg. 230-242.

255. Steer M. W., Steer J. M. (1989) Pollen tube tip growth. New Phytol. 111:323-358.

256. Stintzi A. and Browse J. (2000) The Arabidopsis male-sterile mutant, opr3, lacks the 12-oxophytodienoic acid reductase required for jasmonate synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 10625-10630.

257. Storchova H., Capkova V., Tupy J. (1994) A Nicotiana tabacum mRNA encoding a 69-kDa glycoprotein occurring abundantly in pollen tubes istranscribed but not translated during pollen development in the anthers. Planta. 192 (3): 441-445.

258. Suttle J. C. (1988) Effect of ethylene treatment on polar IAA transport, net IAA uptake and specific binding of N-l-naphthylphthalamic acid in tissues and microsomes isolated from etiolated pea epicotyls. Plant Physiol. 88: 795-799.

259. Swain S. M. and Olszewski N. E. (1996) Genetic analysis of gibberellin signal transduction. Plant Physiol. 112: 11-17.

260. Tanaka I. and Wakabayashi T. (1992) Organization of the actin and microtubule cytoskeleton preceding pollen germination. An analysis using cultured pollen protoplasts of Lilium longiflorum. Planta. 186: 473-482.

261. Tanaka I. (1993) Development of male gametes in flowering plants. J. Plant Res. 106:55-63.

262. Tanaka I. (1997) Differentiation of generative and vegetative cells in angiosperm pollen. Sex. Plant Reprod. 10 (1): 1-7.

263. Tang X., Gomes A. M. T. R., Bhatia A., Woodson W. R. (1994) Pistil-specific and ethylene-regulated expression of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate oxidase genes in petunia flowers. Plant Cell. 6: 1227-1239.

264. Taylor L. P., Jorgensen R. (1992) Conditional male fertility in chalcone synthase-deficientpefaw'a. J. Heredity. 83: 11-17.

265. Taylor L. P. (1995) Flavonols: effects on fertility and fecundity. Crop. Sci. 35: 1521-1526.

266. Taylor L., Hepler P. (1997) Pollen germination and tube growth. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 461-491.

267. Taylor L. P., Strenge D., Miller K. D. (1998) The role of glycosylation in flavonol-induced pollen germination. Adv. Exp. Med. Biol. 439: 35-44.

268. Taylor L. P., Miller K. D. (2002) The use of a photoactivatable kaempferol analogue to probe the role of flavonol 3-O-galactosyltransferase in pollen germination. Adv. Exp. Med. Biol. 505: 41-50.

269. Testilliano P. S., Gonzales-Melendi P., Ahmadian P., Fadon B., Risueno M. C. (1995) The immunolocalization of nuclear antigens during the pollen developmental program and the induction of pollen embryogenesis. Exp. Cell Res. 221(1): 41-54.

270. Theologis A. (1992) One rotten apple spoils the whole bushel: The role of ethylene in fruit ripening. Cell. 70: 181-184.

271. Tirlapur U. K., Faleri C., Cresti M. (1996) Immunoelectron microscopy of myosin associated with generative cells in pollen tubes of Nicotiana tabacum L. Sex. Plant Reprod. 9 (4): 233-237.

272. Thimann K. (1965) Toward an endocrinology of higher plants. Rec. Progr. Horm. Res. 21: 579-596.

273. Tova T., Staub J. K. E., O'Neill S. D. (1999) Identification of a 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid synthase gene linked to the female (F) locus that enhances female sex expression in cucumber. Plant Physiol. 113:987-995.

274. Trewavas A. (1999) Le calcium, C'est la vie: calcium makes waves. Plant Physiol. 120(1): 1-6.

275. Tsukamoto T., Ando T., Kokubun H„ Watanabe H., Tanaka R. (1998) Differentiation in the status of self-incompatibility among all natural taxa of Petunia {Solanaceae). Acta Phytotax. Geobot. 49: 115-133.

276. Twell D. (1992) Use of a nuclear-targeted B-glucoronidase fusion protein to demonstrate vegetative cell-specific gene expression in developing pollen. Plant1. J. 2: 887-892.

277. Tupy J., Rihova L., Capkova V., Zarsky V. (1992) Differentiation and maturation of tobacco pollen in situ and in suspension culture. Angiosperm pollen and ovules. N. Y. etc.: Springer-Verlag. 309-314.

278. Turnen J. G., Ellis C. and Devoto A. (2002) The jasmonate signal pathway. Plant Cell. 14: 153-164.

279. Ulmasov T., Murfett J., Hagen G., Guilfoyle T. J. (1997) Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9: 1963-1971.

280. Vasil I. K. (1974) The histology and physiology of pollen germination and pollen tube growth on the stigma and in the style. In H. F. Linskens (ed.) Fertilization in higher plants. North. Holland. Amsterdam. 105-118.

281. Vesper M. J., Kuss C. L. (1990) Physiological evidence that the primary site of auxin action in maise coleoptiles is an intracellular site. Planta. 182: 486-491.

282. Vidali L., Hepler P. K. (1997) Characterization and localization of profilin in pollen grains and tubes of Lilium longiflorum. Cell Motil Cytoskeleton.36 (4): 323-338.

283. Vidali L., Sylvester T. McKenna and Peter K. Hepler. (2001) Actinpolymerization is essential for pollen tube growth. Mol. Biol. Cell. 12:2534-2545.

284. Viti R., Bartolini S. and Vitagliono C. (1990) Growth regulation on pollen germination in olive. Acta Hortic. 286: 227-230.

285. Vogt T., Pollak P., Tarlyn N., Taylor L. P. (1994) Pollination- or wound-induced kaempferol accumulation in petunia stigmas enhances seed production. Plant Cell. 6: 11-23.

286. Vogt T., Wollenweber E., Taylor L. P. (1995) The structural requirements of flavonol that induce pollen germination of conditionally male fertile Petunia. Phytochemistry. 38: 589-592.

287. Vogt T., Taylor L. P. (1995) Flavonol 3-O-glycosyltransferases associated with petunia pollen produce gametophyte-specific flavonol diglycosides. Plant Physiol. 108 (3): 903-911.

288. Voronin V., Touraev A., Kieft A., Andre A. M., van Lammeren E., HeberleBors E., Wilson C. (2001) Temporal and tissue-specific expression of the tobacco ntf4 MAP kinase. Plant Mol. Biol. 45: 679-689.

289. Xu P., Vogt T., Taylor L. P. (1997) Uptake and metabolism of flavonols during in vitro germination of Petunia hybrida (L.) pollen. Planta. 202: 257-265.

290. Wagner V. T., Cresti M., Salvatici P., Tiezzi A. (1990) Changes in volume, surface area and frequency of nuclear pores of the vegetative nucleus of tobacco pollen in fresh, hydrated and activated conditions. Planta. 181: 304-309.

291. Walker L., Estelle M. (1998) Molecular mechanisms of auxin action. Curr. Opin. Plant Biol. 1:434-439.

292. Wang G., Romheld V., Li C., Bangerth F. (2006) Invelopment of auxin and CKs in boron deficiency induced changes in apical dominance of pea plants (Pisum sativum L.) Plant Physiol. 163 (6): 591-600.

293. Weijers D., Jurgens G. (2004) Funneling auxin action: Specificity in signal transduction. Curr. Opin. Plant Biol. 7: 687-693.

294. Weiss D., Halevy A. H. (1989) Stamens and gibberellin in the regulation of corolla pigmentation and growth in Petunia hybrida. Planta. 179: 89-96.

295. Weiss D., Blokland R., Kooter J. M., Mol J. N. M., van Tunen A. J. (1992) Gibberellic acid regulates chalcone synthase gene transcription in the corolla of Petunia hybrida. Plant Physiol. 98: 191-197.

296. Wehling P., Hackauf B., Wicker G (1994) Phosporylation of pollen proteins in relation to self-incompatibility in rye (Secale cereale 1.). Sex. Plant Reprod.7: 67-75.

297. Wheeler M. A., McComb J. A. (2002) Pollen in vitro viability germination and pollen storage in Eucalyptus marginata. XVIIth Internation Congress of Sex Plant Reprod. Maria Curie-Sklodowska University Press. Lublin. 176.

298. Wiermann R., Vieth K. (1983) Outer pollen wall an important accumulation site for flavonoids. Protoplasma. 118: 230-233.

299. Wiermann R., Gubatz S. (1992) Pollen wall and sporopollenin. Int. Rev. Cytol. 140: 35-72.

300. Wilhelmi L. K., Preuss D. (1999) Blazing new trails: pollen tube guidance in flowering plants. Plant Physiol. 113: 307-312.

301. Willing R. P. and Mascarenhas J. P. (1984) Analysis of the complexity and diversity of mRNAs from pollen and shoots Tradescancia. Plant Physiol. 75:865-868.

302. Willing R. R, Bashe D. and Mascarenhas J. R (1988) Analysis of guantity and diversity of messenger RNAs from pollen and shoots of Zea mays. Theor. Appl. Genet. 75:751-753.

303. Wilson C., Voronin V., Touraev A., Vicente O., Heberle-Bors E. (1997) A developmentally regulated MAP kinase activated by hydration in tobacco pollen. Plant Cell. 9: 2093-2100.

304. Wilson C., Heberle-Bors E. (2000) MAP kinases in pollen. Probl. Cell Differ. 27:39-51.

305. Wolters-Arts N., Lush W. M and Mariani C. (1998) Lipids are required for directional pollen tube growth. Nature. 392: 818-821.

306. Wu H., Wang H., Cheung A. Y. (1995) A pollen tube growth stimulatory glycoprotein is deglycosylated by pollen tubes and displays a gradient in the flower. Cell. 82: 393-403.

307. Wu H., Wong E., Ogdahl J., Cheung A. Y. (2000) A pollen tube growth-promoting arabinogalactan protein from Nicotiana alata is simular to the tobacco TTS protein. Plant J. 22: 165-176.

308. Yang Z. H. (2002) Small GTPases: versatile signaling switches in plants. Plant Cell. 14: 375-388.

309. Yang T. and Poovaiah B. W. (2002) Hydrogen peroxide homeostasis: Activation of plant catalase by calcium/calmodulin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.99 (6): 4097-4102.

310. Yamaguchi S., Smith M. W., Brown R. G., Kamiya Y. and Sun T. P. (1998) Phytochrome regulation and differential expression of gibberellin 3(3-hydroxylase genes in germinating Arabidopsis seeds. Plant Cell. 10: 2115-2126.

311. Ylstra B., A. Touraev, R. M. B. Moreno, E. Stoger, van Tunen A. J., Vicente O., J. N. M. Mol. and E. Heberle-Bors. (1992) Flavonols stimulate development, germination, and tube growth of tobacco pollen. Plant Physiol. 100: 902-907.

312. Ylstra B., Busscher J., Franclin J., Hollman P. C. H., Mol. J. N. M. van Tunen J. (1994) Flavonols and fertilization in Petunia hybrida: localization and mode of action during pollen tube growth. Plant. J. 6: 201-212.

313. Ylstra B., A. Touraev, A. O. Brinkmann, E. Heberle-Bors and A. J. van Tunen. (1995) Steroid hormones, stimulate, germination, and growth of in vitro maturedtobacco pollen. Plant Physiol. 107(2): 639-643.

314. Ylstra B., Muskens M., van Tunen A. J. (1996) Flavonols are not essential for fertilization in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 32 (6): 1155-1158.

315. Ylstra D. G. J. Busscher and A. J. van Tunen. (1998) Hexose transport in growing Petunia pollen tubes and characterization of a pollen-specific, putative monosaccharide transporter. Plant Physiol. 118: 297-304.

316. Yokota E. (2000) Identification and characterization of higher plant myosins responsible for cytoplasmic streaming. J. Plant Research. 113:511-519.

317. Yokota E., Ohmori T., Muto S., Shimmen T. (2004) 21-kDa polypeptide, a low-molecular-weight cyclophilin, is released from pollen of higher plants into the extracellular medium in vitro. Planta. 218 (6): 1008-1018.

318. Yu X. Y., Nasrallah J., Valenta R. and Parthasarathy M. V. (1998) Molecular cloning and mRNA localization of tomato pollen profilin. Plant Mol. Biol. 36: 699-707.

319. Yu F. L., Zhao J., Liang S. P., Yang H. Y. (1999) Ultracytochemical localization of calcium in the gynoecium and embryo sac of rice. Acta. Bot. Sin.41: 125-129.

320. Zalejski C., Zhang Z., Quettier A. L., Maldiney R., Bonnet M., Brault M.,

321. Demandre C., Rona J.-P., Sotta B., Jeannette E. (2005) Diacylglycerol pyrophosphate is a second messenger of abscisic acid signaling in Arabidopsis thaliana suspension cells. Plant J. 42: 145-152.

322. Zenkteler M. (1990) In vitro fertilization and wide hybridization in higher plants. Critical. Rev. Plant Sciences. 9: 319. 267-279.

323. Zerback R., Bokel M., Geiger H. and Hess D. (1989) A kaempferol 3-glucosylgalactoside and further flavonoids from pollen of Petunia hybrida. Phytochemistry. 28 (3): 897-899.

324. К Ю"12Ю"10 10"® 10* 10410'3,М80 70 60 50 40 30 20 10 0

325. К 10'12 Ю'10 108 10"6 10ц 10'3, М60055023. 500аг О 450ю400о.1.X 3501а ш 300ш л 250л 200с;л 150сго X 100с; 501. С

Информация о работе

Минкина, Юлия Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.12

Диссертация

Фитогормоны и флавонолы в регуляции прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок петунии (Petunia hybrida L.) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы