Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гаметофитно-спорофитные взаимодействия в системе пыльца-пестик

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гаметофитно-спорофитные взаимодействия в системе пыльца-пестик"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ГБ Ой • .

КОВАЛЕВА Лидия Валентиновна

3 .. - •

ГАМЕТОФИТНО-СПОРОФИТНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В СИСТЕМЕ ПЫЛЬЦА — ПЕСТИК

0.3.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1994

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамеш: Иттг"П!туте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН Р. Г Бутенко, доктор биологических наук, профессор Т. Б. Баты-гина, доктор биологических наук, профессор И. П. Ермаков

Ведущая организация — Главный Ботанический сад РАН

Защита состоится <-?£ , > ------ 1994 г

в «10 » часов на заседании специализированного совет; Д.002.45.01 по защите диссертаций на соискание ученой сте пени доктора биологических наук при Институте физиологш растений им. К. А. Тимирязева РАН (127276, Москва, Бота ннческая ул., 35).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инсти

тута" 19

Автореферат разослан < ^ > апреля 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

Н. В. Загоскин;

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ А.итЕ_альпдсть_прор-яеми. Совокупность органов цветка, структура которых формировалась и ходе длительной энолюцпи покрытосеменных растений, определяет специфичны! для каждого вида тин репродуктивной стратегии, включающей Формирование гамет, оплодотворение и разлитие зиготы в зародыш.

В последние десятилетия получено большое колпчеотю ДШЛГЫХ ПО морфологии, физиологии И ОИОХИМИИ IVJMeTO-iWOI'fllfitin Шоддуопзя - Арнольди, IУ 64, Сравнительная эмбриология цветковых, т.т. 1-b, 19d1- !990. Ргшникова, Хведмштч. 1ч:.;', Резникова, 1904, Pol] on de'.vj ojwion t, 198'/', Кш.'-агогтаг., 1989, 1990, 1993, J.mbryol оеУ of fin^iпнроппз, 1У'Ю, ha;u.f;l, 1990,1993, Angtosporm pollen, and ovuloa, 1ч92. Ермаков. 191<<\ McCormLck, 1991, 1993). Они внесли существенный вклад n понимание сложного строения мужского гаметофита, содержащего всю генетическую информацию для развития гаплоидного растения и в изучение тонкой структуры зародышевого мешка и ого элементов; кроме того они вскрыли некоторые особенности взаимодействий развивающихся гаметофитов и материнских структур спорофита. Необходимость оптимизации-репродуктивного процесса ставит перед исследователями задачу изучить участие в этих процессах таких фушщиональных блоков, как инициация белок - синтезирующей системы, системы рецепторов, внутриклеточных систем транспорта и координации.

Включение гаметофитов во внутреннюю среду спорофита сопрововдар-гся формированием ряда адаптационных структурно -функциональных особенностей. В частности, коэволюция взаимодействий мужского гаметофита (пыльцевого зерна или пыльцевой трубки) со спорофитом привела к выработке специфических систем, обеспечивающих выполнение его основной биологической функции (вектора для доставки мужских гамет), биохимические механизмы которых остаются пока неизученными.

В настоящее время возросло внимапи е исследователей к процессам, протекающим непосредственно после опыления, и актуальной задачей представляется изучение механизмов взаимодействия в системе пыльца - пестик. Эта цепь сооытий включает взаимодействия мужского гаметофита со спорофитными тканями рыльца, столоика, плаценты и семяпочки. Они определяют в значительной степени возможность

• : v \i - .} ..... •

сзаишнссшшляцш' vouor при совместимом 'опылении или ее невозможность ирн наличии генетически детерминированных барьеров оплодотворения. Изучение . механизмов взаимодействуя •инльци и пестика при самоопшимшии и межвидовой гиорпдизпции имеет как теоретическое значение (межклеточные гоаимодоИстмш как «ощеоиологическая проблема), так и практическое (ooi.um и качество урожая) (Френкель и Галун, 19&_\ Раиншсовэ, Кп..х, 1ЗД, do Nuttane.ourt, 1 ч'ГГ, 1(д*4, Raul, 19Ud, Daring et а), Mauel а), Г/Л , Haara II all and Maura 11 ah, П>(Х5).

1)|юС>лсма межвидовой несовместимости тесно евмзана с решением задач отдаленном гноридизации растении и с центральной нрыш.'шн ан'им|,ионнип оотапппи происхокдением видом.

Is данной раооте сделана попытка провести на нескольких Nf 'M.cjii.iiijx системах е использованием методов физиологии, (ч-,.)Ш,ти и иммунохимии комплексное исследование взаимодействий мук.'.коьо г.чмтчфт» i: тг.аиими спорофита для разраеюткн U!|.(,(H КОНЦеПЦИИ r;im(!T.K(.«tho СНорофИГНиХ ЮОИМООТИОШеИИИ п;оциисах риц-олуктивммго морфогенеза и половой репродукция.

Цель и задачи. исследования. основной целью раооты являлось и...учение физиологическом и окохммпчкскоп н[)ироди механизмов, лежащих в основе различных генетически детермнш^ноеанних серверов онл'»дотворенпн и поиск Факторов, участвующих ■ в системах, ооеспечпва.'кцих рост иди ингиенгрование мужского г.-.метофита в епмрифитных тканях пестика.

Дли этого ми решали следующие задачи: 1.Изучить Оедкопую специфичность

рещюдуктшших органов, в н^юцессе развития цветков, ^.Оцепить изменении в метаооднзме спороФитных тканей пестика в процессе росту совместимых пыльцевых труоок (петунии, виноград, лук»), З.ораншт. (шо/.ишч.«смш осооенности различных генетически детерминированных механизмов ингиОировапии мужского гмиггсфита в тканях спорофита при: cauoHccou.ieci'HMocTii гаметофи того типа (петуния), мужской стерильности (петунии), оессемянности 0-пноград).

4.1'азраоотать модельную систему дли изучении . . месткомов межвидовой несовместимости.

. pmVT!'. /■.- s.>,-,:пio ■ нар-умений

оплодотворпгял (cauoi ; ■• y,!-, чк;п;;,' .ini'rvrгь, игжкая стерильность) ¡Wtf-ivrrp, ,1 II pawn 1С.|щ.ЛПШИ

как реаулм...* • тру* .-у:-,чч рогу.-••»..ur кит--".«¡йотинй

мужского rO':.i'i:.;-:ffa <>> «и« к*.. .........;•>».' 0г»ч"::-..ч.чыюсть

предложение] о и .•(.•..хьрт с':» пгшг> и и.тл«'. >• тся в

ФИЗИРЛ0ГИЧ?-.СКС-*.? №1 ! :'.rv ; •,:.Г.ИГ('Я ii . ГШПМ -ДСЙСТВИЙ

репродуктивных элсимгт» i ntx>«oc совместимого и несовместимого отшшш (ьрн с.оьюопилоцт .. и межвидовой гибридизации) с позиции их кгеямементарности.

Впервые на нескольких экспериментальных системах методами физиологии, биохимии и иммунохимия просодоно комплексное поучение биохимической дифференциации мужского гаметофита и спорофитннх тканей пестика и выявлены ее осооенности в процессе морфогенеза и ил взаимодействия.

Впервые покапано, что комплементарные взаимодействия мужского гаметофита с тканями столбика характеризуйся отрицательным энергетическим оолансом' и высоким уровнем лпктшюпой активности.

Установлено, что механизмы ингиоиропшшя {.».ста и развития мужского гамитофита при функционировании генетически детерминированных барьеров' самооплодотворения формируются при участии геномов мужского гаметофита и спорофита и сопронадвдзются С1гнтезами мРНК и белков в тканях пестика.

Обнаружено, что механизм гаметофитной самопоеовместимости формируется в процессе развития цветков и начинает функционировать накануне их раскрытия. В спорофлтгшх тканях пестика петунии впервые выявлены факторы механизма ингиоированпя мужского гаметофита : М-антиген и изезим рибонуклеазы (продукты ' гена несовместимости).

Функционирование -механизма гаметофитной самсшеоовмг-стимооти сопровождается повышенной активностью риоопуклеазы, глютаматдегидрогеназы и перокоидазн в тканях пестика.

Продемонстрировано, что формирование механизма мужской стерильности сопровождается . повышенным уровнем

лерокепдазион активности icaic в пыльце, так и а пестике.

выдвинута ги ги ¡теза о том, что оелковые компоненты спел i мы вз^имодеиствия пыльца - пестик являются составной

частью общей, системы узнавания растения, включающей как факторы активные в процессе опыления и оплодотворения и определяющие репродуктивную стратегию вида , так и факторы функционирующие на различных этапах онтогенеза при патогенезе и определяющие выживаемость вида.

На основе полученных данных о направленности метаболизма в системе пыльца-пестик в процессах дифференциации гаметофитов, совместимого опыления и функционирования механизмов ингибирования мужского гаметофита сформулировано представление о многоуровневой системе регуляции гаметофитно - спорофитных взаимодействий в процессах репродуктивного морфогенеза и опыления по типу локтин - рецептор, антиген - антитело и фермент - субстрат.

5йШТическдя_оначимость_работы. Изучение закономерностей опыления - как одного из важнейших этапов в жизни растения, непосредственно предшествующего оплодотворению и завязыванию семян, вносит вклад в повышение урожайности с/х культур.

Механизмы половой несовместимости представляют несомненный • интерес для практиков селекционеров, поскольку у ряда культур она является препятствием при выведен™ новых сортов, а для получения гомозиготного потомства необходимы

экспериментальные способы преодоления самонесовыестишсти. В целом, половая несовместимость влияет па урожай многих хозяйственно - ценных растений, в частности таких видов, как рожь, капуста, табак, клевер, люцерна, гречиха, .яблоня, вишня, и рнд других.

Установленные в данной работе закономерности формирования барьеров самооплодотворения могут ■ служить теоретической основой для раэрабсЗтки разданных селекционных программ.' Они могут быть использованы в научных исследованиях при изучение конкретных физиологических механизмов несовместимости у различных видов растений, а также в селекционной практике при разработке методов получения гибридных семян с использованием несовместимости или мужской стерильности.

Лврооащщ_ра0оть1. Материалы диссертации доложены на следующих конференциях: Всесоюзный симпозиум, «освященный 75-летию открытия ак. Наваштшм двойного оплодотворения у покрытосеменных, Москва, 1чуз; Х11 Меэдународнии Ботанический Конгресс, Ленинград, 197ÍH V11 Всесоюзный симпозиум но эмбриологии растений, Киев, 1978? Всесоюзное совещание "Цито-эмориологические и генетико- биохимические основы опыления и оплодотворения", Киев, 1982; VII Меадулародны/t симпозиум но оплодотворению и эмбриогенезу у покрытосеменных, Братислава, 1982? VIII Всесоюзный симпозиум по эмбриологии растений, Ташкент, 1982* Всесоюзный симпозиум "Развитие мужской генеративной сферы", Симферополь, 198с!> Всесоюзный симпозиум "Морфо-фупкционэлыше аспекты развития женских генеративных структур семенных растении", Телави, 19J-1J-Всесоюзное совещание по проблемам опыления и оплодотворения у растений, Ленинград, 1985)1X Всесоюзный симпозиум но эмбриологии растений, Кишинев, 1986; VI Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1987» IX Мевдународный Симпозиум по половому воспроизведению у высших растений, Реймс, 1986} X Международный Симпозиум но половому воспроизведению у высших растений, Сиена, 1988* 11 Международный Симпозиум по лектинам, Тарту, 1989J XII Международный Симпозиум по лектинам, Калифорния, 1990> XI Мевдународный симпозиум-по репродукции растений, Ленинград, 19911 Мевдународный Симпозиум" Пыльца и семяпочки покрытосеменных", Комо (Италия), 1991v XII Международный Симпозиум по половому воспроизведению у растений, Огайо, 1992i 2-ой съезд Всесоюзного общества физиологов растений, Минск, 1990;- 3-ий съезд Всероссийского общества физиологов растений, С.-Петербург, 1993;- Семинар лаборатории роста и развития Института физиологии растений РАН, 1991.

Работа проведена в Лаборатории роста и развития Института физиологии, растений РАЙ, возглавлявшейся до 1991 года академиком М.Х.Чайлахяном, с 1991 г. - к.б.н.- Н.П.Аксеновой. В экспериментах принимали участие Н.А.Мусатова, Н.К.Смирнова, Н.А.Юрьева, „ Э.Н.Комарова, Г.Н.Лотова, Е.В.Копеина, Л.М.Карецкая'и др. коллеги. Всем им автор выражает, глубокую благодарность.

публикации. Материалы диссертации опубликованы в 53 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссергация изложенэ на ¿¡Ю стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов, общего заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 116 рисунками и 17 таблицами. Список литературы включает &1Г наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты_исследования

В качестве объектов исследования использовали репродуктивные органы (пыльцу, пестики, семяпочки) растений из семейства Solanaceae: пзтуяии (Petunia hybrida) трех клонов (самонесовместимого, стерильного, фертильиого) и сэльпиглоссиса (Salplglossls sp.), а также винограда (Vltis vlnllera) двух сортов :семенного Кара Джанджал и бессемянного Кишмиш черный и пяти видов лука : Alliura cepa, A. vavllovil, A. schoenoprasum, A.odorum, к. nutans (сем. Liliaceae).

Все растения (кроме винограда) выращивали в оранжерее Института физиологии растений им Тимирязева в условиях почвенной культуры при естественном освещении. Сбор и обработку соцветий винограда проводили на экспериментальной • базе НПО им. Шредера (Самарканд).

^етрды_исследдвания

Экстракцию и гидролиз нуклеиновых кислот 0,5 N КОН проводили по Шмидту -Тангаузеру в модификации Вольгина и Партье (1964). Содержание нуклеиновых .кислот определяли по поглощению их гидролизатов в УФ по Спирину (1968),

Разделение белков полиакриламидном геле (ПААГ) проводили с использованием ДЦС-Na (Остерман, 1981).

Риоонуклеазную активность определяли по Вандендришу и Стоксу в модификации Татарской (1964) при pH 6,0. Диск-электрофорез в JlAATe проводили по Дэвису (Маурер, 1971). В качестве субстрата использовали дрожжевую РНК (Wilson, 1969). .

Активность глютаматдегидрогеназк определяли по методу Нарциссова (1970), модифицированному Миляевой применительно к растительным тканям.

Белковую фракцию, обладающую пероксидазной активностью, выделяли по методике (Lee, 1973, Síilnshi, Noguchl, 1975). В полученном экстракте Оелкм осаждали сульфатом аммония в интервале 10-00% от полного насыщения. Пероксидазную активность определяли по окислению гваякола (Lee, 1973).

Изоферментный анализ пероксидаз и эстераз проводили по методике Чаяновой и Хавкина (1990), обеспечивающей разделение анодных и катодных изоформ в одной системе в 11ААГ при pll 7.3-.7.6. Зоны пероксидазной активности обнаруживали Оензидиновым методом, зоны эстеразной активности - с помощью раствора 1- и 2-нафтилацетата и прочного синего 33 в Грис-малеатном буфере, рН 5.0-5.6.

Антигены получали путем экстракции лиофилизированной ткани физиологическим раствором (0,14 М NaCl). Содержание белка л пыльце и пестиках определяли по методу ЛюОошинского и Зальта (lubochlnsky, Zalta, 1963) и Брэдфорд (Bradford, 1976).

Антисыворотки получали от кроликов, иммунизированных гомогенатами тканей репродуктивных органов. Иммунизация осуществлялась по общепринятой методике (Володарский, 1971) с полным адъювантом Фрейдда и антибиотиками. Глобулиновые фракции из антисывброток выделяли спиртовым осаждением по Кону в модификации Гусева (Зильбер, Абелев, 1962). Сыворотки узкой специфичности получали истощением глобулиновой фракции антисывороток гетерологичйши антигенами (Гусев, 1966).

ИммунодкффузионныЯ анализ проводили методами двойной иммунодиффузии в агаре по Ухтерлони и иммуноэлектрофсреза по Грабарю и Уильямсу (Остерман, 1983).

Свободные лектины извлекали калий - фосфатным буфером, связанные - 0,05% Тритоном. Лектиновую активность определяли по минимальному количеству белка, которое вызывало гемагглютинацию трипсиниэированных эритроцитов кролика.

Материал для сканирующей микроскопии фиксировали глютаральдегидом в фосфатном буфере и 0s0}, дегидрировали (серия спиртов) и после высушивания проводила напыление Au/Pd. фотографировали с помощью Т EMS KAN - 1UUCX при 4U квт.

Статистическую обработку данных проводили методом парных сравнений на компьютере типа "IBM PC". Опыты ставили в 3-6 биологических повторностях. В работе приводятся средние значения и стандартные отклонения.

- 10

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ KOMiUlEMEHTAPHOCTb

МУЖСКОЙ И КИСКОЙ рвтщуктившх СИСТЕМ Й основе изучения биохимической специфичности взаимодействий мужского гаметофита с женскими спорофитными тканями пестика в процессе опыления к оплодотворения лежат представления Е.А.Бритикова о комплемонтарности мужской и женской репродуктивных систем растений (Бритиков, 1954, 1%Т). Детальный анализ физполого-биохимических различий между половыми элементами цветков многих видов растений различных систематических групп привел Бритикова к выводу о том, что в процессе половой дифференциации формируются две комплементарные системы, обладающие физиологической, полярностью : пыльца и пыльцевые трубки, с одной стороны, и проводниковые ткани пестиков, с другой стороны, имеют четко выраженные различия по pli клеточного сока, изоэлектрической точке белков и окислительно- восстановительному потенциалу.

Компоненты клеточных стенок.как факторы взаимодействия

в системе пыльца - пестик Межклеточные взаимодействия, регулируемые внеклеточным матриксом, являются основой развития растительного организма (Steovos, Sussex, 19В9, Showalter, 1993"). ' Растительный внеклеточный матрикс представляет собой динамическую структуру, обладающую многими функциями (Roberts, 1989, Varner, Lin, 1969). Во время цветения усиливается экспрессия генов белков внеклеточного мэтрикса (Neale et al, 1990, Lord, Sanders, 1992). Полагают, что белки клеточных- стенок либо . прямо включаются в структурные изменении, связанные с переходом апекса от вегетативного состояния в репродуктивное,, лиоо. осуществляют специфические: структурные и функциональные процессы в. клеточных стенках.- Логично предположить, что и взаимодействия мужского' гаметофита с тканями пестика также регулируются внеклеточным матриксом.

Внеклеточинй диффузат пыльцевых 'зерен • составляют компоненты их стенок: белки,' -углеводы, .липиды и пигменты (Stanley, Linskens, 1944, Clarke et al, 1975, Knox, 1984). При химическом анализе экссудата пестиков выявлены углеводы

(свободные сахара и полисахариды), белки, свободные аминокислоты, лгогиды и фенолыше соедипешя (Knox, 1964» Baldwin et al, 1992, de Goldman et al, 1992, Chen and Clarke, 1992, Doughty et- 91-, 1993)= По всей ВИДИМОСТИ ОСНОВНЫМ источником информационных молекул в этих взаимодействиях являются различные типы белковых молекул (схема 1). Схема 1. Факторы взаимодействия в системе пыльца - пестик

ПЫЛЬЦА

Факторы

тканей тапетума (экзина ПЗ)

Факторы мужского гаметофита (интина ПЗ)

Факторы мужского гаметофита (ВМ ПТ)

Факторы мужского гаметофита (ПТ) и мужских гамет

Уровни

взаимодействия

Проникновение ПТ в ткани рыльца

Рост ПТ в тканях столбика

Доставка гамет в ЗМ и слияние гамет

ПЕСТИК

Прорастание пыльцы Белки ВМ на поверхности папилл

рыльца рыльца

ВМ

диффузата рыльца

ВМ проводниковой ткани или

канальной жидкости

Факторы женского гаметофита (ЗМ) и женских гамет

ВМ - внеклеточный мэтрикс, ПТ - пыльцевая трубка,

ПЗ - пыльцевое зерно, ЗМ - зародышевой мешок

Сложная организация оболочки пыльцевого зерна является результатом экспрессии генов микроспоры и клеток тапетума, а также генов родительского растения, контролирующих образование спорофитных детерминант цитоплазмы микропоры. В процессе взаимного распознавания партнеров при прорастании пыльцы решающую роль играют белки экзины, синтезируемые в тапетуме (спорофитного происхождения) и белки интины (продукты гаплоидного поколения): они секретируются микроспорой или вегетативной клеткой мужского гаметофита.

Поиск компонентов межклеточных взаимодействий в системе пыльца - пестик мы проводили, исследуя антигенную, лектиновую и ферментативную специфичность репродуктивных органов растений на нескольких модельных системах.

Исследования антигенной специфичности репродуктивной системы стимулировали данные, что пыльца содержит Оелки -аллергены, локализованные в окзине и интине пыльцевых зерен (Кпох е! а1, 1970).

Антигенная специфичность репродуктивных органов Антигошшй состав растительных тканей изучен нами на разных стадиях репродуктивного морфогенеза : при переходе растоний к цветению и дифференциации пола, в процессах развития цветка, опыления и оплодотворения (Ковалева и др., 1979, 1980, 1981, 1984, 1907^.

Изучение антигенной специфичности вегетативных и генеративных тканей растений привело нас к заключению, что экспрессия "репродуктивных" антигенов происходит в стеблевых апексах на ранней стадии цветения, до появления морфологических признаков.

Проведенный анализ выявил иммупохимическую специфичность репродуктивных элементов всех исследованных растений и позволил классифицировать антигены по степени их специфичности ; 1) специфические для пыльцы, 2) специфические для пестика, 3) общие для пыльцы и пестика. Специфические антигены пыльцы и пестика различаются по серологической, специфичности и электрофоретической подвижности (рис.1).

Антигены: 1 -пыльцы, 2-пестика,

I

■ 1

Антисыворотки : й.- 1-.узкоспецифическзя АС против АГ пыльцы (истощение АГ пестиков), о - -узкоспецифическая АС против АГ пестиков (истощение АГ пыльцы)

¿-2-АС против пестиков

ь.

Рис.1 Антигенная специфичность мужского гаметофита (а) и спорофитных тканей пестика (б) петунии (из:Ковалева, 19Ш)

- 1,4 -

Представленные результаты по выявлению специфических для пыльцы и пестиков антигенов подтверждают комплементарность мужских и женских элементов репродуктивной системы растений. По-видимому, выявленные антигены (или часть из них) принимают участие во взаимодействиях мужских и женских элементов при прорастании пыльцы и росте пыльцевых трубок в тканях столбика. Это предположение подтверждается данными, что: 1) репродуктивные органы имеют гораздо более богатый (гго сравнению с вегетативными органами) антигенный состав, 2) антигены входят в состав диффузатов пыльцы и экссудатов пестика и легко диффундируют при контакте с благоприятной средой, 3) мужской гаметофит обладает более богатым антигенным спектром по сравнению со спорофитиыми тканями пестика, 4) большая часть антигенов пестика локализована в рыльце, 5) специфические антигены мужского гаметофнта и женских спорофитных тканей пестика появляются на поздних стадиях развития цветка.

Лектиновая специфичность репродуктивных органов

Лектияовяя активность белков обусловлена способностью связывать глюканы углеводсодержащих полимеров, локализованных ва поверхности клетки. Благодаря этой специфичности они могут выступать в роли молекул узнавания внутри клетки и между ними. Предполагают, что они играют фундаментальную биологическую роль, так как найдены в различных органах и тканях растений (ЕИгег,.1986). Большая часть изученных лектиков является секреторными белками и аккумулируется в вакуолях, клеточной стенке или в межклеточном пространстве. Вакуолдрные лектины обнаружены и в отдельных клеточных слоях зародыша в семенах злаков (С11г1зр8в1, На1кйе1, 1991).

Предполагается участие лектинов в регуляции клеточного роста путем нековалентного взаимодействия с клеточкой стенкой,'" в регуляции активности ряда ферментов, в том числе обуславливающих работу ионных насосов, в формировании, поддержании или использовании пула предшественников запасных веществ, во взаимодействиях с полисахаридами, гликопротеинами во время синтеза и внутриклеточного транспорта последних.

Мы провели иммунохимический анализ репродуктивных органов

петунии с помощью узкоспецифической антисыворотки против лектина конканавалина А (Кон А), а также гетерологичных полиспецифических сывороток против антигенов репродуктивных органов петунии (рис.2 а, б).

а - центральная лунка:. АС против Кон А, периферииные - АГ пыльцы, б - центральная лунка : АС против пестиков, периферийные - АГ Кон А

Рис.2. Лектиновая активность в репродуктивных органах петунии (из : Ковалева, 1991)

Результаты показали, что во всех проанализированных тканях (вегетативных и репродуктивных апексах, пыльце, неошленных и опыленных пестиках петунии трех клонов: стерильного, фертильпого, самонесовместимого) присутствует лектин, гомологичный Кон А. •

Биологические функции Кон А не установлены. Он проявляет ряд свойств, которые ооеспечили ему широкое использование в научных исследованиях, в первую очередь способность специфически связывать . углеводные остатки маннозы, глюкозы и глюкоэамчна и осаэдать полисахариды и гликоконъюгвты, содержащие эти мопосахара.. Активность лектина, гомологичного конканавалину А, обнаружена наш в женских и мужских органах петунии, в процессе роста как совместимых, так и несовместимых пыльцевых трубок. Мы полагаем, что функции выявленного в репродуктивных органах петунии лектина связаны с отложением или использованием запасных веществ как при развитии цветка, так и при взаимодействии половых элементов в процессе опыления.

Экстракты из репродуктивных органов петунии,и всех видов лука проявили агглютинирующую активность относительно трипсинизировашшх эритроцитов кролика (табл. 1, 3, Ь, 7,

' . <1 .у ,:ч

- -

рис. 7). Эти дашше получены совместно с Э.Н. Комаровой.

На репродуктивных органах лука ALliuro сера показано, что мевду пыльцой и пестиками имеются различия как по активности и содержанию лектинов, так и по их углеводной специфичности (таблица 1).

Таблица 1.

Лектиновая активность в репродуктивных органах Allium сера Т

Активность МСЛ, Углеводная Содержанке МСЛ, мкг/мл белка специфичность мкг/г сырого МСЛ (+) веса

ПЫЛЬЦА 0,125 Глюкоза 2782

рибоза фукоза сахароза глюкопираноза 2-дезоксиглшоза ацетилглюкозоамин меллиоиоза 1 фруктоза

ПЕСТИКИ 1,43 Фруктоза 3533

ксилоза арабитол

Следовательно, мембрансвязанная фракция лектинов в репродуктивных 1 органах Allium сера характеризуется количественными и качественными особенностями, коррелирующими с представлениями о комплементарных взаимодействиях мужского гаметофита с тканями ' пестика.

Взаимодействия в системе пыльца - пестик при совместимом опылении Многоступенчатый процесс взаимодействия в системе пыльца - пестгас состоит из ряда последовательных событий : Падгезии пыльцевых зерен, 2)гидратации пыльцевых зерен, 3)прорастания пыльцевых зерен на поверхности рылец, -Проста пыльцевых трубок в тканях рыльца и столбика. Как видно из данных, представленных на рис.3,4,5, процесс опыления вносит изменения в энергетический баланс репродуктивных органов.

Время нахождения ' Время после Время после

во влажной каморе . опыления опыления

Рис.3. Рис.4. Рис.5.

Рис.3. Интенсивность дыхания пыльцы и неошленных пестиков

1 - пестики, 'I - пыльца <

Рие.4. Влияние опыления на дыхание :

1 - дыхание опыленных пестиков,

2 - суммарное дыхашш совместно присутствующих в

сосудике, но несоприкасающихся пыльцы и пестиков Рис.5. Дыхание поело опылении (Л) и число пыльцевых трубок,

внедрившихся в иеетик CD):

1 - дыхание опыдеиннх пестиков, . :

2 - суммарное дыхание совместно присутствующих в

сосудике, но несоприкасающихся пыльцы и-пестиков ■

3 - число пыльцевых труоок, внедрившихся в пестик

(оценивали по шестиоальной шкале) . , ,

Интегральным показателем уровня энергетического оомена является энергетический оаланс, составляемый из количества освобожденной при "дыхании энергии, и количества теплоты,, одновременно выделяемой в окружащую среду (Жолкевич, 19ТЗ).

Микрокалоршлотрическое и газометрическое- исследование энергетического оаланса репродуктивных органов рш -в условиях влажной камеры сосудиков Bapoft)ra (Бритиков и др., 19Т4)»

показало, что у неопылешгых пестиков потребление кислорода и тепловыделение на протяжении 7 ч держалось на одном уровне, а энергетический баланс был положительный (рис.3).

Газообмен и тепловыделение изолированной пыльцы, в отличие от пестиков, претерпевали изменения: наоухаиио сопровождалось бурной теплопродукцией (физико- химический термогенез, обусловленный теплотой адсорбции воды на сухом веществе), а прорастание - активацией потребления кислорода. Энергетический баланс на пачальпых этапах прорастания был отрицательным, через 4-5 ч - становился положительным.

Дыхание и тепловыделение после опыления (сбрасывание пыльцы на пестики проводили примерно через час после заключения- их во влажную камеру) возрастали (рис. 4,5^ опыленные пестики потребляли кислород в больших количествах, чем в суше взятые по отдельности в , тех же соотношениях пыльца и пестики. В табл.2 представлены результаты одного из опытов по определению энергетического баланса пестиков в процессе опыления.

Таблица 2. Энергетический баланс, обусловленный опылением

Время после • опыления, мин дЕ кал У дО час X г лО, % от дЬ

20 1.14 4.75 420

60 1.14 ^ 4.16 363

150 0.51 2.18 ' 427

дЕ - количество энергии, освобожденной при дыхании

опыленных пестиков, дО - вызванная опылением дополнительная теплоотдача

Таким образом, • если у пеопыленных пестиков дыхание и теплоотдача мало менялись на протяжении всего периода наблюдений, а энергетический баланс был положительным (количество освобожденной при дыхании энергии превышало количество выделяемой теплоты), то взаимодействующие с пыльцой пестики дышали и выделяли тепло интенсивнее, чем взятые по отдельности в тех же соотношениях пыльца и пестики

суммарно, при этом энергетический баланс стлновился отрицательным, что связано с усиленным гидролизом белков' и ' углеводов (Stanley, Llnskens, 1974).

Рост мужского гаметофита в тканях пестика обусловлен растяжением оболочки, предшественником которой является- слой шшшы пыльцевого зерна, содержащий микрофиориллы целлюлозы и пектиновые компоненты. На начальном этапе пыльцевые трубки формируют ооолочку за счет эндогенных углеводов и жиров,, а затем начинают использовать компоненты пестика (главным ооразом моносахариды и аминокислоты), разрушая с помощью своих ферментов белки, полисахариды, жирные кислоты (Knox, 1984, Crostl et al, 1986). Апикальный рост' пыльцевой трубки обеспечивают везикулы, формирующиеся в диктиосомах и переносящие предшественников полисахаридов к растущей нлазмалемме. Синтез глюканов стенки пыльцевой трубки (целлюлозы и каллозы) происходит на наружной стороне нлазмалеммы, в качестве суострата глкжаисмитаэы используют УДФ-глюкозу (Miki- II iros 1 go, Nakamura, 1982).

К мужскому гаметофиту, как и в случае других растущих тканей и органов высших растений, транспортируется из увядающих органов цветка (венчика, тычинок) ассимилированный углерод в основном в форме сахарозы (Llnskens, 1974, Nichols, Но, 1975). Динамика содержания растворимых углеводов в тканях столбика и завязи различна (рис,6).

Рис.6.

Содержание сахарозы и глюкозы в столбиках (а) и завязях (б) петунии в процессе опыления: - совместимого (1)

несовместимого (2) (из: Ковалева, Комарова, 19УЗ)

мкг/мг 60

Время после опыления, ч

Рост совместимых пыльцевых трубок сопровождается синтезом tie novo мРШС (Mascarenhas, 1975, !990, 1993), повышением ферментативной активности (Roggen, 1966, Ковалева ядр., 1975), синтезом de novo белка с антигенной активностью (Ковалева и др., 1975), изменением лектиновой специфичности (табл.3).

Таблица 3. Лектииовая активность в процессе опыления у Allium сора (из:Комарова, Ковалева, 1990)

Неопыленные пестики

Опыленные пестики (?. ч)

Активность МСЛ, мкг/мл белка

1.5

0.25

Содержание лектинов, мкг/г сырого веса

3533

9050

Углеводная специфичность .

Фруктоза ■

ксилоза

араоитол

Ксилоза арабитол меллибиоэа галактоза

В первые два часа после опыления содержание лектинов п пестиках возрастает, а углеводная специфичность меняется. Мы полагаем, что выявленные нами изменения лектиновой специфичности тканей пестика могут быть связаны с конформационными изменениями струкутры лектинов, но не исключен и биосинтез лектинов в процессе роста пыльцевых трубок. В пользу такого предположения, свидетельствуют' данные о динамике лектиновой активности в столбике и завдзи петунии в ходе роста совместимых пыльцевых трубок (рис. 7).

Рис.7.

1.5 1

0.» 0.4

О. J

o.i

V>sw*a*.m /мл f«лхи

лектиновая активность в. столбиках и завязях петунии в процессе совместимого

опыления (из:Ковалева, Комарова, 1993)

1 * е часы лослв оНылёпи?.

—imс<(Л«ц

- 20 - ■ • Резкий подъем .пектиновой активности выявлен в столОиквх в первые 2- 4 ч после опыления, когда пыльцевые трубки внедряются в ткани рыльца. В завязях незначительный ник лектиновой активности обнаружен через 2 ч'после опыления. Мы полагаем, что выявленные корреляции связаны с участием .пектинов в механизме межклеточного взаимодействия мужского гаметофита со спорофитными тканями пестика.

Заключение

Антигенная специфичность репродуктивных органов обусловлена экспрессией генов в процессе дифференциации апикальной стеблевой меристемы при переходе к цветению и характеризуется оощнми для мужской и женской систем антигенами, синтезирующимися на' ранних • стадиях репродуктивного морфогенеза, и антигенами, специфическими для мужского гаметофита и спорофиуных тканей пестика, которые появляются на поздних стадиях развития репродуктивных органов. Лектиновая специфичность репродуктивных органов находит отражение в активности, содержании и углеводной специфичности лектинов мужского гаметофита и спорофитних тканей пестика. -

Взаимодействия мужского гаметофита , со спорофитными тканями пестика сопровождаются повышением уровня дыхания и тепловыделения, отрицательный энергетический баланс на первых этапах связан с активирующимися в тканях пестика гидролитическими процессами. При этом динамика содержания. растворимых Сахаров (сахарозы, глюкозы и фруктозы) различна в тканях столбика и завязи. Рост совместимых пыльцевых трубок сопровождается синтезом de novo антигена и высоким уровнем . лектиновой активности в проводниковых тканях пестика.

Полученные нами результаты соответствуют представлениям о комплементарности мужских и , женских. , элементов репродуктивной системы растений, выдвинутыми Бритиковым (19Ь7) и позволяют предполагать участие оелков, проявляющих антигенную и лектиновую специфичность во взаимодействиях, в системе пыльца - пестик на этапах адгезии, гидратации и прорастания пыльцевых зерен на поверхности рыльца, а также и роста пыльцевых трубок в тканях пестика." '

II. ГЕНЕТИЧЕСКИ ДЕТ'Е]'МИНИРОВАННЫЕ БАРЬЕРЫ САМООПЛОДОТВОРЕНИЯ В СИСТЕМЕ ШЛЪЦА - ПЕСТИК '

Механизм опыления включает в сеоя не только способ доставки функционально действенной пыльцы от структуры, в которой она . образуется, к поверхности восприимчивой семяпочки, но и физиологические барьеры. препятствующие самооплодотворению (схема 2).

Схема 2.

Барьеры самооплодотворения в системе пыльца - пестик

Системы взаимодействия

Барьеры оплодотворения

пыльца : рыльце

адгезия гидратация прорастаиие ПЗ

пыльцевая трубка: столбик

"■ОТТОРЖЕНИЕ ПЗ

(X) Мужская стерильность • Гетероморфная несовместимость Спорофитпая несовместимость

рост ПТ в .тканях столбика

пыльцевая трубка: зародышевой мешок

ПТ входит в ЗМ, доставляя .спермии

01Т0ШИИЕ ПТ

^ОТТОРЖЕНИЕ

ПТ .

(X) Гаметофитная несовместимость

(X) Женская стерильность (бессемянпость)

(X)- исследованы в данной работе

Несовместимость половых элементов при опылении и оплодотворении у растении выражается в неспособности пыльцевых труоок проникать на всю длину столбика и осуществлять оплодотворение, хотя и пыльца и пестик Функционально активны. Половая несовместность проявляется как при самоопылении, так и при межвидовых и внутривидовых скрещиваниях. Ь основе самонесовместимости лежат генетически детермини|)ованные процессы, препятствующие инбридингу- Этой гцюоломе посвящены многочисленные обзоры (East, 1929, M.out, )938, Batoraan, 1954, Lowis, 1954, 1975, Pandey, 1960, Cruwo, 1964, Lundqvist, 1965, 1975, Суриков, 1972, 1991, M as tens, 1975, Nottancourt, 1984, Duiuas, Oaudo, 1987).

Гетеромо;'<фнлл самонесовместилюсть включает дихогамию (явление разновременной закладки и развития мужских и женских гаметофитов) и геторостилию (рэзностолочатость), основаш!ую на морфологическом неоднородности цветков в пределах вида.

Гомоморфная .самонесовмостимость характерна для видов, популяции которых однородны в отношении- признаков цветков. Специфичность реакции несовместимости гомоморфного типа, а также ее индукция, энергетический баланс и ее связь с общим обмином веществ обусловлена генетическими факторами несовместимости (Ltn.skon.'j, 1965). Ген несовместимости (S -ген) в результате мутаций образует серию множественных' аллелей, которые содержатся в мужской и женской системах. Попадание пыльцы с определенным комплексом аллелей на рыльце с тем же составом аллелей вызывает реакцию .несовместимости , (Low is, 1954).

В семействах Compositae, Sturculiaceae, Cruciferao, Kubiaceao, ' Irldaceae обнаружен спорофитный тип сс1монесовмостимости : реакция пыльцевых зерен определяется генотипом диплоидных тканей спорофита, продуцирующего, микроспоры, и протекает в, форме подавления прораста!Шя пыльцевых зерен на рыльце (bowls, 1954, Bateraan, 1954).

Гнметофитный тип самонесовместимости (в этом, случае реакция пыльцы зависит от генотипа гаметофита и . протекает в форме подавления роста пыльцевых трубок в тканях столбика) встречается в семействах Rosacoae, Leguminosae,. Onagraceae, Solanaceae, Scrophularlaceau (bateman, 1954)'.

- 23 - '

1.САМОНЕСОВМЕСТИМОСТЬ ГАМЕТОФИТНОГО ТИПА У ПЕТУНИИ

На рис.5 дана динамика завязывания семян у петунии самонесовместимого клона при опылении пестиков, находящихся в бутонах за 5, 4, 3, 2 суток до раскрытия (пыльцу Орали открытых цветков того же или чужого растения). Семена

завязались только раскрытия бутонов.

в' цветках,

§

■г ■

а

5 £

самоопыленных ■ за , сутки

из не до

й А Л 2 1

. I з Росервте

Рис.8. Динамика завязывания семян у петунии самонесовместимого клона при опылении в бутонах ¡из: Ковалева и др.,1975Л

Следовательно, пестики • петунии задолго до раскрытия , бутонов способны к восприятию пыльцы, при этом совместимой оказывается не только чужая, но и. своя пыльца.' Мм предположили, что формирование механизма самонесовместимости происходит в процессе развития цветков и . заканчивается накануне их раскрытия.

Последующий анализ содержания нуклеиновых кислот и белка выявил значительные различия между пестиками двух клонов (самонесовместимого и фертильного) накануне раскрытия бутонов: более высокий уровень общего содержания РНК выявлен в пестиках самонесовместимого клона (рис.9). Соотношение ЙП£ ?ДНК в процессе развития пестиков самонесовместимого клона росло, а в пестиках совместимого клона - падало. В процессе опыления имела место обратная корреляция в содержании РНК: при совместимом опылении уровень РНК возрастал, а несовместимом опылении - снижался. нт ^¡г

Рис.9. Ч

Содержание РНК в пестиках

петунии двух клонов ¡в мг за г сухой массы)

-,— совместимый клон -— самонесовместимый клон Iиз:Ковалева и др., 1975б\

до рос*.рйти9 цЬепжоб после владения

при

О помощью иигиоиторов белкового и нуклеинового синтеза нам удалось преодолеть самонесовместимостъ у петунии (Ковалева и др., 1УГ5 в). В опытах использовали ингибиторы нуклеинового и белкового синтеза : митомицин 0 (ингибитор синтеза' ДНК), актиноьмцин Д и оливомицин (ингибиторы 'Синтеза РНК), циклогексимид и хлорамфеникол (ингибиторы -. синтеза белка) в концентрациях 5 - 500 мкг /мл. Ингибиторы вводили в оутоны за 2-3 суток до раскрытия цветков, т.е. в период Формирования механизма самонесовместимости. Хотя при этом мы воздействовали одновременно на все органы цветка, методика позволяла учитывать воздействие иниоиторов отдельно на пыльцу и на пестики. Критерием снятия самонесовместимости было завязывание семян при самоопылении цветков, подвергнутых воздействию инпибито{юв в бутонах (таолица 4).

Таолица 4. Сиятио самонисовместимости у петунии ири воздействии ингибиторов оелково-нуклеинового обмена

Ингибитор Обработке подвергались

пыльца и пестик пестик пыльца

Оливомицин 21(18) ~Т95~ " 21 (10) —1ВТ ' 20(16) . -?5Т- "

Актшюмйций Д 5(2) 19(9) 8(0)

92 - 16 0

Циклогексимид 15(2) 15(2) 15(0)

50 61 0

Хлорамфеникол . 5(2) .5(2) 5(0)

10 13 0

Вода (контроль) 15(0) 15(0) 15(0)

х - в числителе число цветков, оораооташшх ингибитором, " в скобках - число цветков с завязавшимися семенами, ' в знаменателе - сроднее число семян в одном цветке *

Снятие самонесовместимости мы наблюдали при обработке бутонов ингибиторами и нуклеинового и белкового обмена. Наиболее эффективным ингибитором оказался оливомицин: в некоторых опытах до 801? обработанных цветков завязывали семена. Кроме того, снятие самонесовместимости происходило при обработке . оливомищшом как пестиков, так и пыльцы. Актиномицин Л и ингибиторы синтеза белка снимали самонесовместимость только при обработке пестиков.

■ Стимулирование роста несовместима пыльцевых трубок у лилии было обнаружено при введении актиномицинэ в канал столбиков зэ 6-12 ч до опыления ( АгЛег, 1)ге1аш, 1970). В наших 'опытах введение ингибиторов нуклеинового синтеза приводило к снятию самояесовместимости я завязыванию семян. На основании этих данных сделан ■ вывод о необходимости синтеза мРНК во время формирования механизма самонесовместимости как в спорофитных тканях пестика, так и в мужском гаметофите.

При использовании ингибиторов белкового синтеза также наблюдали снятие самояесовместимости. Более эффективным оказался циклогексимид (семена завязались в '¿6% обработанных цветков), причем результативной была только обработка пестиков. Следовательно, в исследуемый леряод развития репродуктивных органов синтез специфических белков, связанных с процессом формирования ■ сэмонесовместимости, происходит, очевидно, только в пестиках.

Ингиоиторный анализ показал, что механизм самонесовместимости, будучи детерминированным ДНК,

формируется в процессе развития цветков и начинает функциош1ровать накануне их раскрытия. В этом процессе принимают участие геномы мужского гаметофита и пестика. Белковые синтезы в исследуемый период проходят, очевидно, только в тканях пестика. Следовательно, экспрессия гена несовместимости идет неоднозначно в'микро - и макроспорангии..

Иммунохимический анализ репродуктивных органов петунии подтвердил наши предположения, поскольку антигенные спектры пыльцы двух клонов оказались идентичными, а в антигенном спектре пестиков самонесовместимого клона .выявлен специфический антиген, отсутствующий в пестиках совместимого клона (рис.10).

Цент.лунка-узкоспецифичсская ЛС к пестикам самонесовм^стимого 1Ü1DHO (истощение ЛГ пестиков фертильиого клона),

—1- АГ столбиков из оутонов за 1 сутки до / ' . , ' раскрытия,

/ . 2- АГ столбиков из раскрытых цветков,

*:.:••/ /Й' „ -----„ ------ ...---------- ^ , —

-I

^ ' J, до раскрытия.

у i 3- АГ столбиков из бутонов за 3-4 суток Ч • 4_ др супчиков, 5-АГ пыльников,

Рис.Ю. Выявление S -антигена в пестиках петунии (из: Ковалева, 19Ü4)

Результаты иммучохимического анализа, проведенного с помощью узноспоцифической сыворотки против пестиков самонесовместимого клона (истощение антигенами пестиков фертильного клона) показали, что . специфический антиген локализован только в одной части пестика - в столоике (лунки ■ 1-2) и. появляется только накануне раскрытия бутонов. .

Полученные ■данные дали основание связать • синтез выявленного антигена с активностью 5 - гена несовместимости в . спорофитн.ых тканях пестика. К настоящему времени S -антигены выявлены в пестиках ряда растений' Brassica campes tris. (Hinata and Nishio, 1978), B.oieracea (Furrary et ai, 1981), Prunus avium (Raíí et ai , 1981), Nicotiana aiata (Anderson ot al, 1986). Следует отметить, что исследованные растения проявляют различные типы несовместимости : у двух: видов Brassica несовместимость* снорофитного типа, т.е. яри взаимодействии пыльцевых зерен с поверхностью рыльца, а у петунии и табака, а также у Prunus avium - реакция несовместимости гаметОфитпого типа. Все выявленные антигены гликопротенны с молекулярной массой 37-57 кД, содержание-углеводов в них составляет около 20% (лектиновыи тест выявил глюкозу, маннозу, галактозу, фукоэу, араокнозу) (Knox, 1984).'

Дальнейшие наши .исследования показали^ что формирование механизма самонесовместимости у петунии сопровождается ■ повышенным уровнем активности различных ферментов: . глютаматдегидрогеназы - одного из ключевых. ' 'ферментов, аминокислотного метаболизма, риоонуклеазы - фермента нуклеинового метаболизма и нероксидазы - нолифункционалыюго

фермента, принимающего участие в разнообразных процессах морфогенеза (рис.10,11,13). Очевидно, этот процесс затрагивает многие пути метаболизма в репродуктивной системе.

л А«"елка _______ _ „

- т... I :

КЗ! Сф49Стияшй КЛЫ4 ^^

Рис.10. Активность глютаматдегидрогенэзы в пестиках петунии

двух'клонов (из : Ковалева, 1984 б ) Как показал электрофорез в [1ААГе (рис. 11), высокая активис>сть ркоонук^еазы обусловлена синтезом изозимэ РНКазы, который появляется накануне раскрытия бутонов и функционирует в пестиках в первые часы после опыления. При снятии самонесовместимости оллвомиципом изозим не выявлялся.

к

11 ю l t

г

о

hvfi PHK-t+/*r Î&-MA

fiSSf

w

¡11^1

S. Г

a

¡■V£f

И23 1

IЯ Cil i 1Ш :

Ш!

Рис.11 Активвость и изозимный спектр РНКазы в пестиках . петунии двух клонов (из:Ковалева и др., 1975)

Как показали наши данные, в процессе роста несовместимых пыльцевых труб<5к (т.е. при функционировании механизма самонесовместимости) • уровень ферментативной активности РНКазы, глютаматдегидрогеназы и пероксидазы оставался высоким. . ■ .

- -

Лектшювая активность в тканях пестика при несовместимом опылении резко снижалась в первые 2 часа (рис.12), причем это падение обусловлено снижением лектиновой активности в проводниковых тканях столбила, в то время как в тканях завязи она колебалась незначительно как и

_____1__

Рис.12. Лекпшовая .активность в : столбиках и завязях петунии в процессе роста несовместимых пыльцевых трубок Сопоставление всех полученных нами данных позволило выдвинуть концепцию о двухфазности взаимодействия мужского гаметофита со спорофитными тканями пестика при самоопылении: 1-"узнавание", II-отторжение несовместимых пыльцевых трубок.

Молекулярные механизмы межклеточного узнавания в системе пыльца - пестик не идентифицированы, однако участие дектинов в них постулируется.. Б пользу последнего говорят и данные о снятии самонесовместимости у петунии при обработке рыльца конканзвалином А, который, возможно, связывает углеводные детерминанты макромолекул, ' . (возможно, гликонротеинов), принимающих участие в механизме узнавания.

Механизм отторжения несовместимых пыльцевых трубок при гаметофитной самонесовместимости формируется в процессе репродуктивного морфогенеза, начинает функционировать накануне раскрытия цветков, сопровождается синтезом de novo niPtiK и белков (S -антиген, изозим РНКазы) и повышенной ферментативной активностью рибонуклеазы, пероксидазы и глютаматдегидрогеназы в проводниковых тканях столбика.

- 29 -

2. Мужская стерильность у петунии

Мужская стерильность может проявляться в различных формах, включая недоразвитие пыльников, их уродства, абортивность пыльцы на различных стадиях мшсроспорогенеза и нераскрытие пыльников (функциональная мужская стерильность) вплоть до случаев поллого удаления от рыльца (позиционная мужская стерильность) (Френкель, Галун,1977).

Исследования линий с цитонлазматической мужской стерильностью (ЦМО) показали, что аоортишюсть пыльцы обусловлена изменениями в тканях . тапетума (1л;зег, ЬеггЛоп, 1972), состояние которой коррелирует с фазами дифференциации снорогенной ткани. Неидентифицировашшй фактор, нарушающий гармонию в отношениях между двумя тканями, десинхронизирует развитие пыльцы, что приводит к ее дегенерации.

У стерильных клонов петунии нарушаются трофические процессы, необходимые для развития жизнеспособной пыльцы из микроспоры вследствие преждевременной активации фе{>мента к'аллазы, синтезируемой в тапетуме и разрушающей каллозную оболочку микроспор, что приводит к дегенерации материнских клеток микроспор в профазе мейоза (Singh, 1975). Фертилмше линии петунии отличаются от линий с мужской стерильностью по ультраструктуре пыльников, активности цитохромоксидазы в пыльниках (Bino et al,'1985), содержанию аденилатa (Bino et ai, 1986) и полиаминов (Geräts et al, 1988), причем выявленные различия возрастают после аберраций в тальниках, что указывает на связь с причинойвызывающей (ДОС.

Известно, что митохондрии содержат цитоплозматический фактор, связанный с ЦМС, кроме того у линий с ЦМО выявлены специфические изменения как в ДНК, так и белках (Hanson, Conde, 1986, Kaul, 1988). На соматических гибридах фертильных и стерильных линий, полученных путем слияния протопластов фертильных линий и ЦМС линий и содержащих рекомоинантную митохондриальную ДНК, показано с помощью методов рестрикциониого анализа наличие специфического участка ДНК, связанного с фенотипом ЦМС (не гомологичны у петунии и кукурузы). Идентификация структуры ЦМО-связанной ооласти митохондриальной ДНК" (S-pcí локуса) у петунии (Nivk.on, Hanson, 1989) позволила авторам выдвинуть гипотезу

- an - • '

относительно молекулярного механизма ЦМС, допускающую интегрирование pet' полипептидов в мембрану митохондрий путем включения в электронный транспорт или другие митохондриальные Функции, приводящее к нарушению, например, ферментных комплексов (Connett, Hanson, 1990).'{Ia основе более низкого уровня цианид резистентного дыхания в клетках стерильной петунии (по сравнению с фертильной) они предположили участие альтернативного пути дыхания в митохондриях стерильных пыльниках петунии.

Недавно получены данные (Раере et al, 1990), что мужская, стерильность у табака регулируется ядерными генами путем контроля за синтезом In organello рада митохопдриэлышх белков. Авторы полагают, что гены могут действовать на уровне и транскрипции, и трансляции белков. '

С выше изложенными представлениями согласуются наши результаты определения активности пероксидазы в репродуктивных органах петунии трех клонов : фертильного, самонесовмсстимого и стерильного (рис.13).

& г.5

г

1,0

по анп /иг ftMa.

___iliiivtt lli

ИЗ ^VfMiMtMMf СЦксссшсст^им LJiJ

с

Рис.13. Активность пероксидазы в пыльце и неопылешшх пестиках петунии трех клонов : фертильного, самонесовместимого и стерильного.

- 31 -

Минимальный уровень активности пероксидазы характерен для репродуктивных органов петунии фергильного клопа. У самонесовместимого клона выявлена слабак активность пероксидззы в мужском гаметофите, но в спорофитных тканях пестика активность фермента максимальна. Ьыше показано, что формирование механизма сомонесовмсстимости у петунии в процессе развития цветков сопровождается повышенной активностью глютаматдегидрогепазы, риоонуклеазы и пе(хжсила'лы в сиорофитных тканях пестика, которая сохраняется и в процессе роста несовместимых пыльцевых труоок. Формирование стерильного мужского гаметофитэ сопровождается повышением активности пероксидазы но только в тканях пыльника, но и в тканях пестика. Судя по результатам здектроферетического разделения изозимов пероксидазы в нейтральной оуфернои системе, мужской гаметофит петунии тр(;х клоном характеризуется оолее бедным спектром изозимов нерэкеидазы по сравнению со спорофитными тканями пестика. Изозчмныи спектр мужского гаметофитэ стерильного клона резко отличается от спектров всех исследованных органов петунии трех клонов.

Как показал иммунохимический анализ, стерильный мужской гаметофит характеризуется отсутствием оолыпеи части антигенов, присутствующих в пыльце фертильного клона. Кр:ме того, выявляемые в пыльце стерильного клона 1-з антигена являются общими для репродуктивных органов петунии т.е. в стерильном мужском гаметофите не происходит синтез специфических для мужских репродуктивных органов белков. В

клона) антиген. Таким образом, формирование стерильного мужского гаметофитэ сопровождается изменениями антигенной и ферментативной специфичности сиорофитных тканей пестика.

- зг -

3, БЕССЕМЯННОСГЬ У ВИНОГРАДА ■У оолигатно бессемянных сортов винограда бессемянность * выражается в возникновении нарушений на разных стадиях ре^юдукции. У парте.чокарпических сортов развитие женского . гамотофпта прекращается на самых ранних' стадиях развития, ноатому мелкие ягоды (для их образования не • требуются процессы опыления и оплодотворения), характеризуются полным отсутствием семян (группа Коринок)."К' стеиоспермакарпической группе сортов относятся бессемянные сорта, у которых для образования ягод процессы опыления и оплодотворения обязательны, но затем происходит аоортирование зародыша -и Формируются рудимелтариые семена (группа Кишмишей).

Исследование репродуктивной сферы Кишмишей (Pearson, 1932, Stout, 1936, Иванова-Наройская, 1938, Волосовцев, 1967) показало, что до процесса . опыления никаких нарушений в женской сфере не происходит, а нарушения, приводящие -к Оесеемяшюсти, возникают либо на этапе оплодотворения (в нрогамной фазе или во время гамогенеза), либо на ранних стадиях развития зародыша. .

Изучение процесса оплодотворения у винограда Кишмиш черный, проведенное Смирновой и Миляевой (1982), показало, что пыльцевые труоки могут длительное время находиться в зародышевом мошке, постепенно темнея и отмирая. Образования зародыша не наблюдали, хотя клетки яйцевого аппарата довольно длительное время выглядели жизнеспособными. Различия в ходе развития семяпочек у двух сортов наблюдали через 10 дней после опыления. Если у семенного сорта происходило Формирование слоя склеренхимных клеток в наружном, интегументе, развитие ядер' эндосперма и зародыша, то у оессешшюго сорта наблюдалось торможение развития семяпочки, отсутствие склеренхиыного слоя в наружном ' интегументе, прекращение делений ядер эндосперма, дегенерация семяпочки.

Для выявления функциональных . нарушений, приводящих к оесеемяшюсти, мы совместно со Смирновой и Миляевой изучили особенности метаболизма в развивающихся завязях и семяпочках семенного (Кара Джанджал) и бессемянного (Кишмиш черный) винограда до появления морфологических различий меэду ниш : I зтап-бутонизация (в бутонах завершается формирование женского гаметофита, мужской гаметофит уже сформирован).

II' этап - цветение (к началу раскрыт«" цветков семяпочки содержат сформироваюше зародышевые метки). Этот этап включает опыление (прорастание пыльцевых зерен на рыльце и рост пыльцевых трубок в тканях столбика), и оплодотворение (вхождение пыльцевых трубок в семяпочку и взаимодействие мужской и женской гамет).

III этап - постоплодотворение - характеризуется одинаковым развитием завязей и семяпочек у семенного и бессемянного сортов, состоянием "покоя" зиготы.

IV этап--- появление различий в развитии семяпочек: у семенного сорта начинается эмбриогенез, развитие ядер эндосперма, формирование покровов семени, у бессемянного -начало дегенерации семяпочки I отслоение интегументоБ, остановка . делений . ядер эндоспермаЧ.

На I этапо развития 1бутонизации\ мы не выявили различий между развивающимися завязями и изолированными из них семяпочками винограда двух сортов по уровшо содержа н ия аминокислот и беЛка, а также по их антигенным спектрам.

На II этапе I опыление и оплодотворение\ в белковом метаболизме семяпочек выявлены различия : в семяпочках у бессемянного сорта активность глютаматдогидрогеназы - в 3 раза выше, чем в семяпочках у семенного сорта , тогда как в завязях у обоих сортов (освобожденных от семяпочек) она

Рис.14.Активность глютаматдегидрогеназы а завязях и семяпочках винограда Кара Джанджал |КД\и бессемянного Кишмиш черный !КЧ\ наА-ех стадиях развития

Повышение активности ГДГ в семяпочках у оессемянного сорта в период взаимодействия мужского гаметофита со енорофитлыми тканями пестика мы рассматриваем как индикатор повышенной метаболической активности в связи с формированием механизма оессемянности.

На III - IV этапах характер динамики активности ГДГ в развивающихся завязях меняется: у бессемянного сорта активность ГДГ снижалась, что указывает на затухание их метаболической активности, а в завязях у семенного сорта наблюдали постепенное повышение активности ГДГ, что связано с активацией метаболических процессов в развивающемся семени. Прямое доказательство усиления метаболической активности в семяпочках у семенного сорта получено с помощью иммунохимичоского анализа: в них выявлен антиген, отсутствующий в семяпочках у бессемянного сорта. ■

Обработка развивающихся завязей Кишмиша черного на II этапе развития ингибиторами белкового и нуклеинового обмена (оливомицивом, актиномицином Д, хлорамфениколом и циглогексимидом) привела к образованию твердых семян, значительно отличающихся от обычных рудиментов семян у этого сорта (табл.Ь). Цитоэмбриологические . исследования, проведенные Смирновой, показали, что в этих "семенах" на IV этапе развития происходят процессы, сходные • с процессом нормального развития семени у семенного сорта (начало формирования покровов семени, образование проэмбрио и многочисленных ядер эндосперма).

Таким образом, семяпочки у бессемянного сорта винограда на стадии опыления и оплодотворения функционально активны' и способны к оплодотворению. Повышение активности ГДГ в них на этане цветения и образование "семян" после воздействия ингибиторов ■ белкового и нуклеинового обмена позволили предположить, что бессемянность у винограда Кишмиш черный обусловлена генетически детерминированным механизмом, реализующемся в процеесе взаимодействия мужского гаметофита с тканями зародышевого мешка, что сопровождается синтезами de do novo мРНК и цитоплазматических белков.

Таблица 5 Влияние оливомшугаа на образование семчн у винограда Кишмиш черный

Срок Концентрация, Число oöpaöo- Число Число семян обработки мкг/л ташшх ягод семян на 10U ягод (Х)

1 этап - б утони з а ц и я

10 дней до 100 75 0 0

опыления 250 75 0 0

500 'Г 5 0 0

1-2 дня до 100 225 ' 0 0

опыления 250 225 0 0

500 225 0 и

II этап -цвет е н и е

Опыление 100 174 50 2«. а

250 164 22 13.4

500 214 51 24.0

Оплодотво- 100 214 67 31 .3

рение 250 200 51 25.5

500 249 65 34.1

Вода (контроль) 500 3 >1%

Выявленные различия в метаболизме семяпочек у двух сортов на III этапе, несмотря на кажущуюся неактивность зигот, свидетельствуют о начале развития'семени у семенного сорта и функционировании механизма бессемянности у бессемянного.

Заключение

В основе взаимодействия мужского гаметофита с пестиком лежит способность к узнаванию и отбору спо>соо-лцх. к i оплодотворению гамет. Способность к узнаванию и отторжению позволяет реализовать две . основные функции полового размножения: 1)изоляцию и стабильность вида и 2) допустимую степень ' вариабельности внутри вида. У покрытосеменных растений механизм узнавания функционирует в снорофитнии ткани пестика, что, по мнению Шивашш (Shivanna, 1у7у), и ооеспечшю прогресс в их размножении.

Выдвинутая ними концепция о двухфазности взаимодействия |ужокого гаметофита со спорофитными тканями пестика при ..амооиклотш включает на втором этапе .механизм ингибирования чужского гаметофита.

Ми проанализировали три случая генетически .(етермшшровашюго торможения роста и .развития ' мужского гумстофита: мужскую стерильность, самонесовместимость гамитоФитного типа и бессемянность.

Механизм самонесовместимости ' гаметофнтного типа Формируется в ходе репродуктивного морфогенеза и 'начинает Функционировать за сутки до раскрывания бутонов. В Формировании механизма самонесовместимости принимают участие геномы мужского гаметофита и спорофитных тканей пестика. Для запуска механизма самонесовместимости необходим синтез tie novo цитоплазматических и митохондриальных белков только в пестиках, формирование самонесовместимости в пестиках петунии сопрововдаетсн ■ высоким содержанием РНК, повышенной Ферментативной активностью [ГДГ,' пероксидазы и РНКазы) и синтезом do novo S - антигена и изозима РНКазы.

Стерильность мужского гаметофита у петунии, связанная с активностью спорофитных тканей тапетума, сопровождается полним отсутствием специфических антигенов (выявленных в фортилыгой пыльце) и кроме того - изменениями антигенной и ферментативной специфичности спорофитных тканей пестика.

Бессемяшюсть у винограда Кишмиш черный обусловлена Функционированием генетически детерминированного механизма, формирование которого происходит -в процессе взаимодействия мужского гаметофита с тканями зародышевого . мешка и сопровождается синтезом de novo мРНК и' цитоплазматических белков в тканях семяпочки.

Следовательно, все три типа изученных нами барьера самооплодотворения включают на этапе формирования механизма ингйОиропшшя мужского гаметофита синтезы de novo mPHK и белков, обладающих антигенной 'и ферментативной специфичностью, в спорофитных тканях,' а ва этане • функционирования -- дегенерацию мужского гаметофита на разных студнях репродуктивного морфогенеза и оплодотворения.

IIL РЕПРОДУКТИВНЫЕ ОРГАНЫ ЛУКОВ - МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В СИСТЕМЕ !ШЫМ - ПЕСТИК.

ПРИ МЕЖВИДОВОЙ НЕСОВМЕСТИМОСТИ

Межвидовая несовместимость выработана в щх^цееге дивергентной эволюции, как один из механизмов межвидовой изоляции, в противоположность меиозу, ооеснечивамн.ему широкий спектр рекомоинаций, и оплодотворению, благодари которому поддерживается генетическое разнообразие. в популяциях. Межвидовая несовместимость ont,опочивает сохранение единства и воспроизведения, поддерживает оптимальную гетерозиготность особей и их гомеоетаз. значение изучения межвидовой несовместимости возрастает в связи с необходимостью решения ряда вопросов современной биологии -выяснение природы патологических изменений митоза, меиоза, . взаимодейтвия ядра и цитоплазмы, раскрытия закономерностей наследования при отдаленной гибридизации (Банникова, 1'.<Н6).

Межвидовая несовместимость может проявляться на ;imvw из уровней взаимодействия мужского гаметофитэ со спорофитними тканями пестика и выражаться в непрорастании пыльцевых зерен, ингибировании роста пыльцевых труоок, неслиянии гамет и неспособности формирования полноценных семян. Поэтому она является барьером дли . отдаленной гибридизации, одного из методов интро'грессии в культурные растения ' генов повышенной

УРОЖЗЙНОСТИ И УСТОЙЧИВОСТИ, ПРИСУЩИХ ДИКИМ ВИДП!(!.

Исходя из того, что морфологические картины подавления роста мужского гаметофитэ при отдаленной гибридизации я принудительном самоопылении подббцы, часть исследователей придерживается гипотезы об универсальности механизма несовместимости, которая предполагает существование специфических механизмов подавления, контролируемых ъ комплексом (Lewis, Crowe, 1958). Другие авторы (Heslop-Harrison, 1975, Nettancourt, 1977) полагают, что механизмы подавления при инбридинге и отдаленной гибридизации контролируются разными генами.

Павди (Pandey, 1968) предполагает существовании первичной и вторичной специфичности '5 - .комплекса, регулируемых отдельными,, но близко связанными генетическими элементами, причем первичная специфичность контролирует

- зн -

межвидовую «(¡совместимость, вторичная - внутривидовую. Согласно Хогенбуму (Ilogenboom, 1975), межвидовая,

несовместимость резко отличается от самонесовместимости и включает Оарьер илконгрузнтности - отсутствие скоординированности процессов взаимодействия в системе пыльца - пестик. Имеющихся экспериментальных данных недостаточно, чтобы вынести окончательное решение, поэтому целесообразна разработка модельной системы, на которой можно оыло бы исследовать различные типы барьеров оплодотворения.

Объектами поиска в этом направлении служили репродуктивные органы лука пяти видов {Allium сера, A.vavliovli, A.schoenoprasum, A.otiorum, A.nutans), два последних - дикие плосколиственные виды, устойчивые к пероноспорозу. Изучение репродуктивных оргавоз лука с помощью сканирующей электронной микроскопия показало, что поверхность рылец у всех видов лука покрыта папиллами, форма, размер и локализация которых меняется в зависимости от вида (Kovaleva, Komarova, 1988). В белковых гидролизатах из репродуктивных органов луков выявлены значительные различия в содержании отдельных аминокислот (рис.15). Максимальное содержание связанных аминокислот выявлено в репродуктивных органах диких, устойчивых к пероноспорозу, видов A.odorura и A nutans.' К|юме того, репродуктивные органы луков (и пыльца, и пестики) характеризуются более высоким содержанием аминокислот по сравнению с вегетативными органами (листьями и стрелками).

Учитывая полученные нами данные об участии Оелков, ооллдамцих антигенной, лектиновой и ферментативной специфичностью,в механизме взаимодействия мужского гаметофита со епо[юфитними тканями пестика при самоопылении, мы провели аналогичный анализ репродуктивных органов луков, чтобы оценить возможность участия этих типов белковой'специфичности в межвидовой несовместимости.

Данные олект(юфоретического разделения белков репродуктивных органов луков представлены на рис.16.

В зоне низкомолекулярных компонентов локализована большая часть белков, общих для мужской и женской репродуктивной сферы. Напротив, среди высокомолекулярных Фракций, очевидно, находятся белки, специфические либо для мужского гаметофита, либо для тканей пестика.

«г/ 100 иг ty ieca

/ \ ! \ N

f .« '.'vV ' 4 -

--i .. v\ ^ * . \ ,< ... v . •

2 >4 5 с 7 $ 9 10 M и !4 15

QN Urt0KUCA0r?»1

4

io; t'

ЦТ/ 10O МГ bt-CO .

t

Г Л

\\

//Л

o:—

~T 3

5 6 i в » to и ia 13 д^жцислот*

«г / Iос иг trt« t«!co

ft

б 7 S 3 1 10 il 11 1+ IS

амипонислотч

• П «i ftvtn ' П»

Рис.15. Содержание аминокислот : А- в пыльце, Б- в пестиках пяти видов лука (Alliiwi сера- -— , A.vavilovil - -A.schoenoprasum - <•- , A.odorum , A.nutans - , В

-в репродуктивных (пыльце и пестиках) и вегетативных (листьях и стрелках) органах Allium nutans: 1-

аспарагиновая к-та, 2-треонин, 3-серин, 4- глутаминовая к-та, 5-пролин, 6-глицин, 7-аланин, 8-валии, 9-иэолейцин, 10-лейцин, 11- тирозин, 12-фенилалашш, 13-лизин, 14 - гистидин, 15-аргашш

...........- 40

* . , er

t"r * i t"V fi ?

. -(3 Рис.16.

Белковые спектры репродуктивных органов луков 4-ех видов . в ПААГ -СДС

- 50

ео.

о'фо'уо'ч о*?

J.vut. О« tdor. .Л^лч' Л. cepc*.

Антнгенную структуру репродуктивных органов луков изучали с использованием нативных и узкоспецифических антисывороток против пыльцы или против пестиков лука всех изученных видов. Проведенный анализ выявил многокомпонентность антигенной структуры пыльцы и пестиков. При этом оылн выявлены различия как внутривидовые (между пыльцой и пестиками), так и между видами. Органоспецифические антигены, т.е. антигены пестиков, которые обнаруживаются в пестиках всех изученных видов лука, и антигены пыльцевых зерен, характерные для пыльцы всех видов лука, выявлены с помощью узкоспецифических антисывороток, полученных путем истощения гетерологичными антигенами.

Антигенная структура мужского гаметофита A.nutans характеризуется антигеном, взаимодействующим с антигенами пестиков всех иследовашшх видов лука по типу антиген - антиген непосредственно при диффузии в агаре (без использования антисывороток) (рис.17). Для ответа на вопрос о

Функции этих антигенов необходимы данные об их природе.

___________

f J г^ъгщ ш^т^щ

<>г •• ■у ■ ■

* ' i

» . .!< ' о дг. rs-й ' .fa ---j

Реакции преципитации между антигенами пыльцы и пестиков A.nutani в агаре. Л - в центральных лунках - А Г пыльцы A. nutans; я периферических лунках: в - лунки 1-6 - А Г пестиков а. пи tans в разбавлении до I :Э2; б - лунхи 1-2 - КХ пестиков A.nutans, лунки 3-4 -АГ пестиков A.odorum; лунки J-2 - АГ пестиков A.vavitovii, лунки 3-4 - АГ пестиков А.ссра; г - лунки 1-2 - АГ пестиков A.nutans, лунка 3 - АГ пестиков петунии, лунка 4 -АГ пыльцы петунии.

Pnc.iY. Сиицифичсские антигены в репродуктивных органах лука Allium nutans

- 41 -

В репродуктивных органах всех видов лука выявлены свободная и связанная фракции лектинов (таблицы 1, 3. ь), при этом экстракты из тканей пестиков проявляли большую агглютинирующую активность относительно трипсинизированннх эритроцитов кролика но сравнению с мужским гаметофитом. Агглютинирующая активность мембрансвязашшх лектинов в псстиках всех видов (кроме А. о<1отга) выше активности свободных лектинов. Максимальная лектиновая активность выявлена в пестиках диких сортов лука, особенно Л.оИогшк

Содержание лектинов в репродуктивных органах у розных видов лука варьирует в значительных пределах. Наиболее высокое содержание лектинов выявлено в репродуктивных органах диких видов лука А.ойогит и А.пиШпз, однако и между ними имеются существенные различия: в пыльце А.пи1апд доминируют связанные лектины, а в пыльце А.ойогит - свободные;.

Таблица 6.

Лектиновая активность в репродуктивных органах луков

Виды меморансвязанная растворимая

лука фракции фракция

•А Б А Б

П H Л h Ц A

Allium сера 0.005 • 317 0 001 367

A.vavilovil 0.08 2061 0 001 169

A.odorura 0.04 1917 0 04 1054 U

A.nutans 0.2 . • 6047 i i 0 025 1360

t ПЕСТ HO

Allium сера 0.5 1360 0 .8 25192

A.vavilovil 0.02 175 0 .01 392

A.odorura 0.3 2779 4 .0 171140

A. nutans 0.1 1468 0 .01 416

1

А---- , мкг/ мл белка

агглютинирующая активность Б - содержание лектинов, мкг/ г сырого веса

- л? -

Далее была измерена активность пероксидазы полифуикционального фермента, участвующего в процессах роп[ху1укт)н)ногоь морфогенеза, включая механизмы мужской стерильности и самонесовместимости. Пероксидазнзя активность в пыльце трех видов лука (Allium vavilovll, A.odorum, A.nutans) (рис. 16) находится на одинаковом уровне. Уровень пероксидазной активности в пестиках A.vavilovll превышает ее уровень в пыльце в 4 раза, у A.odorum - в 5 раз, у A.nutans -в 10 раз. Следовательно, ткани пестиков характеризуются более высоким у[ювнем пероксидазной активности. Максимальный уровень пероксидазы выявлен в пестиках лука A.nutans.

1

1

С.Ь

Ш1-

.jfcbL^L.

-ь

.ml;

■ь

jdm

ЖМ fZ73 0ЯЫЛ4*** щемили

J-1}«:.Hi. Пероксидазная активность в репродуктивных органах

луков: 1- Allium vavilovll, 2- A.odorum, 3- A.nutans Заключение

Иммунохимический и биохимический анализы репродуктивных органов луков показали, что различия между ними находят отражение в антигенной, лектиновой и ферментативной специфичности. Дикие устойчивые к пероноспороэу виды A.odorum и A.nutans характеризуются более высокой белковой специфичностью. Этим можно объяснить неудачи селекционеров при получении" жизнеспособных семян при гибридизации А сера• с этими видами, тогда как вполне возможна гибридизация с А.schoenoprasuin и A,vavilovll, у которых не выявлены столь резкие различия в белковой специфичности с А.сера. Мы предположили, что белковая специфичность репродуктивных органов является составной частью общей системы узнавания, включающей не только факторы, активные в процессе опыления и оплодотворения, но и факторы, активные при патогенезе и Функционирующие на разных этапах онтогенеза растения.

^ ПО dvn /ыг бекла

- -Обсуждение

О ПрОЦСССВ ПОЛОВОГО p;.33MHO)P.i)4HH НиКрЫТОССМеННЫХ

растений, пслюч</мдего меиочи'1..,ское деление кл<ггок, »"»jmw»' дифференциацию и синг.чмию, происходит гетер чередование гэметофитно- спорофитных поколении. Рамыпне и дифференциация гаметофитов (пыльцевого зерна и зародышевого мошка) происходит под влиянием тканей сгюр;фита. в данной работе получены доказательства оиохимическои

комплементарности формирующихся в процессе нодевон дифференциации мужской и женской репродуктивных систем и участия Оелковых компонентов спорофитных тканей в регуляции роста и развития мужского гэметофита.

Оплодотворение у высших растений характеризуется процессом опыления и последующим ростом пыльцевой трубки, обеспечивающей доставку мужских гамет к яйцеклетке и устраняющей необходимость водной среды, в котором происходит слияние .полопик клеток у низших растении. Для осуществления более прогрессивного но сравнению с самоопылением перекрестного опыления, которое обеспечивает. свободное перекомбинирование наследственных факторов, у многих видов н процессе эволюции выработались различные приспособления, включая различные типы самонесовмесгимости: гетер ¡мор^нуи (дихогамия и гетеростилия) и гомоморфную (спорофитная и гаметофятная) (Суриков, 1 ).

В последние годы интенсивно ведутся исследования

взаимодействий в системе пыльца - портик в направлении ноиск-ч

i

и идентификации продуктов гена несовместимости, которые, как полагают, синтезируются и в' мужском гаметофпте, и н спорофитных тканях пестика и регулируют их взаимодействия в процессе оплодотворения (Lewis, 19с6). Как показали наши исследования, экспрессия продуктов 5 - гена в микро- и макроспорангии проходит неоднозначно, а генетический контроль за реакцией несовместимости осуществляется, вероятно, на полигонном уровне. .

Наши результаты, полученные на нескольких модельных системах при изучении белковой специфичности репродуктивных органов растений в процессе совместимого опыления, а тшш; при наличии-различных генетически детерминированных барьера оплодотворения (самонесовместимости гаметофитного типа.

мужасои стерильности и бессемяшюсти) позволили сфо{Ж!ули{Х)Зс)ть представление о многоуровневой системе регуляции гаметсфитно- спорофитных взаимодействий как в процессе репродуктивного морфогенеза, так и и опыления .

Коэволюция мужского гаметофита со спорофитом привела к выработке ряда специфических механизмов, в том числе механизма узнавания, s также к созданию систем, обеспечивающих либо прорастание пыльцы и рост совместимых пыльцевых трубок в тканях столбика, либо - отторжение несовместимых пыльцевых трубок в процессе оплодотворения.

Механизмы узнавания в системе пыльца - пестик, которые должны включать генерацию и передачу сигналов, остаются пока полностью неизученными. Полученные нами данные о лектиновой, антигенной и ферментативной специфичности мужского гаметофита и тканей пестика различных видов растений позволили высказать гипотезу о том, что компоненты белковой специфичности репродуктивных органов входят в общую систему узнавания растения, включающую факторы, активные в процессе опыления и оплодотворения, а также факторы, активные при патогенезе и функционирующие на разных этапах онтогенеза растения и тем самым обеспечивающие репродуктивную стратегию и выживаемость вида. Реакция узнавания при самоопылении и пере-крестной гибридизации, возможно, осуществляется по типу лектин -- рецептор, хотя к настоящему времени не получено прямых доказательств участия лектинов ни в регуляции клеточного роста путем нековалентных взаимодействий с клеточной стенкой, ни в регуляции активности ферментов.

Рост совместимых пыльцевых труббк обеспечивается комплементарными взаимодействиями в системе пыльца - пестик, возможно, но типу лектин- рецептор, антиген - антитело и фермент - субстрат. Полученные нами результаты согласуются с полученными ранее данными об интенсификации метаболизма ь тканях по»,тика в процессе {юста пыльцевых трубок. Впервые установлено, что рост совместимых . пыльцевых труоок сопровождается высоким уровнем лектиновой активности к синтезом белка (le novo в тканях столбика.

Выдвинутая нами концепция о двухфазном взаимодействии • в система пыльца - постиг, включает на второй фазе механизм Ш!гион[>овапия мужского- гаметофита на различных этапах его

- АЪ -

развития. Во всех трех изученных нами случаях генетически детерминированных барьеров (гаметофитная самонесовместимость, мужская стерильность и бессемянность) на этапе формирования механизма ингибирования мужского гаметофита установлены синтезы do novo mPHK и белков в спорсфитных тканях пестика, а на этапе функционирования этого механизма - дегенерация мужского гаметофита на разных стадиях его развития (от дифференциации до оплодотворения).

Как показали наши данные, одним из компонентов механизма ингибирования мужского гаметофита является взаимодействие по типу фермент - субстрат. Мы полагаем, что механизм ингибирования мужского гаметофита обусловлен активацией или инактивацией одного или нескольких ферментов и, как следствие, нарушением комплементарных взаимодействий в системе пыльца - пестик. В этой связи существенны данные не только о рибонуклеазе (цитотоксичный механизм разрушения РНК несовместимого мужского гаметофита), но и о высокой активности пероксидазы при функционировании механизмов ингибирования мужского гаметофита.

У петунии генетический анализ выявил 5 пероксидазныг. локусов, расположенных в различных хромосомах Uiondrlkn, 1991), что указывает на множественность ее Функций. Как показали наши исследования, повышенная активность этого фермента в спорофитных тканях пестика сопровождает

в ингибирования мужского оксидаза играет роль в

формирование биохимических механизме! гаметофита тканями спорофита. Перс формировании и лигнификации клеточной стенки, участвуя в катаболизме ауксина и биосинтезе этшгена, а возможно, связана с изменениями общего гормонального статуса и редокс системами в плэзмалемме. Не исключено, что ионы кальция индуцируют связывание некоторых изопероксидаз с глоточными структурами ( К1Шег, 1985) и такое Са -регулируемое связывание, возможно, зависит от механизма углеводного Узнавания.

- !d -

и IJ If 0 л U

1. (¡первые на нескольких модельных системах методам» фтиодоши, оиохимни и иммунохимии .проведено комплексное изучение белковой специфичности мужского гамет! )фита и епорофнтних тканей пестика и выявлены оееги пнее.ти их биохимической дифференциации.

<■. h основе половой дифференциации и межклеточных взаимодействий в системе пыльца - пестик лежит принцип вомалемеатарноети белковых компонентов мужского гаметофита и oiiopu.liHi'biJX тканей, проявляющийся, в частности, в их антивеннои, лектиновой и Ферментативной специфичности.

,5. Выдвинута концепция о том, что оелковые компоненты по.жмоденвтвш! системы: пыльца - пестик являются составной частью иОщеп системы узиаванин растения, которая регулирует репродуктивную стратегию и выживаемость вида.

■1 Л'.заимодейотвия в системе пыльца - пестик при совместимом опылении осуществляются по типу лектшв-рецептор, антиген - антитело, фермент - суострат и сопровождаются повышенным уровнем белкового метаболизма, .включая синтез белка do novo и высокий уровень лектиновой активности в проводниковых тканях столоика.

i-.l енетически детерминированные барьеры оплодотворения (мужская стерильность, гаметофитная самонесовместимость, бесоеилпность) обусловлены функционированием в тканях спорофита видоспецифичных биохимических механизмов

шит.ощювания /отторжения мужского гаметофита, представляющих способы регуляции репродуктивной стратегии вида.

6.Формирование механизмов ингибирования / отторжения мужского гаметофита сопровождается синтезами de novo мРНК и белков, проявляющих антигенную и ферментативную специфичность, в спорофитных тканях репродуктивной системы в процессе половой, дифференциации и , репродуктивного морфогенеза. ' '

7.Функционирование механизма отторжения мужского гаметофита происходит на ферментно- субстратном уровне и приводит к нарушению комплементарных взаимодействий в системе пыльца - пестик и как следствие - к гибели мужско го гаметофита.

8. Механизм ингиоирования мужского гаметофита при

наличии барьера самонесовмсстимости гаметофитього типа у петунии осуществляется' на уровне PIÍIÍ мужского гаметофита и рибонуклеэзы опороЗдатвых тканей пестика. Специфический »twhm РНКазы является продуктом гена несовместимости (5 ■ гена) и синтезируется в проводниковых тканях столбика накануне раскрывания цветков.

9.Получены данные в пользу гипотезы об универсальности механизма несовместимости при самоопылении и межвидовой гибридизации, включающего реакцию узнавания и механизм отторжения мужского гаметофита на одном но этапов оплодотворения (от прорастания на поверхности рыльца до слияния гамет в зародышевом мешке).

10.Для изучения механизмов отторжения мужского гаметофита при межвидовой гибридизации разработана модельная система, включающая четыре вида лука (AJliimi сира, A.vavllovli, A.odorum, A.nutans) с различной степенью устойчивости к патогенам, репродуктивные органы которых различаются по антигенной, лектиновой и ферментативной специфичности. Установлена белковая специфичность толерантных к экзогенному заражению видов лука, характеризующихся резкой несовместимостью.при межвидовой гибридизации.

11.Выдвинуто представление о многоуровневой спорофитной регуляции гаметофитно- спорофитных взаимодействии в процессе репродуктивного морфогенеза и оплодотворения.

список раоот, опубликованных по материалам диссертации

1. Ьрнтикпц >:.A. .Жолкопич В.Н..Борисова Т.д., Мусатова H.A., Ковалева Л. В. I.liir.f ^калориметрическое и гагзометрическое исследование опыления у ржи // Физиология растений. - 1974 -L2I, с.

2. i.риги ico г. i-;.A., Жолкевич В.Н., Мусатова H.A., Ковалева Л.В./ :Miopri.'TH4t!i;kiin баланс пестиков ржи при опылении //Половой процесс н .ччориогенез растении: Мат. Всес. симн. - М, 1973.-0.27-26.

п. it) вале на ,'l.li.. Мусатова H.A., Вритиков В. А./ Изучение процесса i}»'í|*.ih/<4hií»u: самонесовместш.юсти у потунии с помощью ингибиторов оелмчюго и iiytuieinionoro обмена // ДАН СССР.- 1975- í.222.Tt>.~ il.M7íi М7и.

■I. Ковалева л.В.. Мусатова H.A. .критиков В.А.Иммунологическое изучение совместимого и несовместимого опыления у петунии //'¡■изиол. растений. -197;>.-Т.22 я.4.-0.bó9-6Y3. !'. Ковалева ;i,Р., Мусатова H.A. Рнбонуююазная активность в генеративных органах петунии в связи с формированием механизма cal ^Несовместимости //ДЛИ COUP.- 197 ,5.-Т.223 ТЗ-С.762-765.

0. Kiivaieva 1,. .Musatova N. A. Immunological study oí compatible and incunpat.fble pollination oí Petunia hybrida // Abstr.XIl Int I :o i; in i en 1 Congress -1975 -) .en i n^rad-, i'. 298.

7. Mu:.a tova N.A, KovaJova I,. Overcoming of the incompatibility iiuriru: pollination oí Petunia hybrida by inhibitors oí nucleic and protein metabolism // Abstr. XII Botanical Congress-\Ч(:> 1.onii¡í;rad,-P..Í04.

H. Koval-s'a 1,., Mi isa tova N.A. Hibonuclease activity in the »ieiioraUve organs of Putunla in relation to the formation oí the mechan ism of solf-inoompatlbility // Nucleic Acids Abstracts -1971) -rJ-6 P. 154.

■к Ковалева Л.В. Несовместимость в прогамной фазе оплодотворения у петунии: Автореф.дпсс.канд. биол. наук / ИФР АН ССОР. М., 1ч77. -.-'¡¡с.

к;. Kovalova 1,., Chaüaehyan M.Kh. Overcoming solí-

iru oüipai ibí 1 i ty by inhibitors of nucleic acid and protein

met.abol ш» //l'hytoiiiorphoiogy, 1978,N4, P.445-449.

li. Милпева З.Л., Ковалева Л.В.', Чайлахян М.Х. Изменения в

t'ieiih.iMiA спектрах стеблевых апексов рудбекии при переходе от

ы:гч1 .тинного состояния в репродуктивное // ДАН СССР -1979-Т1,

1, 0.209-272.

I,'. Ковалева Л.В., Хрянин В.Н., Чайлахян М.Х. О специфичности оелкчь при [¡{»явлении пола у растений конопли //ДАН СССР.-IvíUi. - i. 2,'.2, З.-С. 1275-1277.

Ks. Ковалева Л.В., Миляева Э.Л., Чайлахян М.Х. Выявление специфических белков в стеблевых апексах короткоднев'ной периллы iv¡ i.jeiii-'ii iitm переходе от вегетативного состояния к репродуктивному /V )(ЛЧ СССР. -1 981 --T.260.T6-0.1Ы 3-1516. 14. Миляева а. Л., Ковалева Л.В., Чайлахян М.Х. Образование специфических оелков в стеблевых апексах растений при переходе к цвеченим // Физиол.растений.-1982.-Т.29.в.2. С.253-260. 1г.. Ковалева Л.В. Иммунохимичсское выявле!ше белков, обязанных с явлением несовместимости при самоопылении у петунии '•'Цитоамориол; и генетико-биохим. основы опыления и i<плод'.'Творения, - Киев:Наук, думка, 1982,-С. 170-172. It.. Смирнова U.K., Миляева Э.Л., Ковалева Л.В. Влияние . инпмпторпп оелкового и нуклеинового обмена на половую несовместимость у оессемянного сорта винограда Кишмиш черный // ЦиТ" амориол. н генетико-биохим.основы опыления и o¡u:0;¡.,n>o¡,emiH,~ Киев: Наук.думка, 1982',-С. 189-192.

17. Kovaleva I., Immunological sp«e 11 ic f t.y of р|мп! g* n«• it»i. lv.> organs during the progamic phasy oi ierti 1 ir.ni, fori // Гсч-ч-.ч<1я»у-yt Г Int.Cytoombn'ol. iiymp. .Ilfiekova dol Inn, 1l-.nit ir.iiivri, 1983, P. 23,l>~239.

10. Ковалева Л.В. Белки несовместимости к генеративных органах растении //Развитие мужской генеративной сф'грч растеши;: Тез.дом. Всесоюз. сими.- Симферополь. 1\«>3, ооо7. 19. Ковалева Л.В. Локализации белков несовместим-юти в генеративных органах растошш //Проблемы raMtrromie:!«, оплодотворения и пмориогонвэа: Материалы Hcuw.».wh.ih> эмбриологии растений.- Ташкент:Фан, 19(5.5.-С.Yo 'П. ?0. Ковалева Л.В. Белковый фактор несовместимости в ц. «я игл г. петунии //ДЛИ СССР. -1. - Т. '<■'(? -0.101Y UV:n, ? 1. Ковалева Л.В. Активность гдютаматдегидроген.чои и ц.чгг.ч.-чх петунии // Морфо-функциональные аспекты развития неких геноратишшзх структур семенных растении :M-m;jwu«» г> .с чо. гимн. Телави, 193-1.-С.

22. Миднсва ЭЛ., Ковалева Л.В., Гукасян И.А., Чаил.>хлн И.х. Питофизиологические основы перехода'растений от тчимии..»'.. состояния в репродуктивное // Гормональная регуляция ¡.щ-'С'-незя растений,М., Наука., 1904.- С. 107--2U1.

¿3. Kovalova Г,., MiJyova Е. Spyclf 1с prototiu? in :>>••.!. ajov.--, of Jludlwiolda and Per 111 a // Abstr. lnti;iri.oyriip. "iMani imi »hi regulators". 1УН4, p. 39.

?4. Ковалева Л.В. Иммунохимическио основи цггс;'И.гст>;>' -тп гц и самоопылении и скрещивания // (.-о. научных трудов ло щ >и

оотапике, генетике и селекции, Л.ВИР. - 19ви Т.у*. - с.!--.» :..*.. 2i>. Kovaleva L. .Ml Jayova К. i>pec.i.nc prutofn.'i in .sit i.> unio ;; during traa1; Шоп to J' I owe r1 гц?//М о I ogj a • p I ai 11 a n i;n !" v., •».

F.39S P.39Б■.

?6. Ковалева Л.В. Специфические антигены мужски/, и >е|;екн< элементов цветка петунии // Физиол.растении. ГШ. !.• ,!. в.о, С. 94Л -918.

27. Ковалева Л.В. Иммунохимическая специфичность реп;-,яушил элементов и механизм узнавания в системе пыльца - ш-елис ,/ Молекулярный механизмы генетических процессов: 1ез. дысл.У! Исес. снмп.-19иг.-М.,0.120.

Hi. Kovalova L. The receptive suriaee oi All luw :,pp. r.i V Annalos sclentil'iquus. - I9W.- 1Щ, p. Ill-llo. ?9. Kovaleva L. Pollen - pistil interactions: protein .••pvinj ■V Abstracts XI Int.syrap. on soxual reproduction, l"o<i, iiena, P.YO. I

30. Kovaleva L., Komarova E. The receptive surface ot Allium nigrnau ( m0rph0l0{.*lcal and l miuurioo Mimical uspeeisj '/ Piiytomorplio.loiiy. - iw.- У.Зв, N4; P.271-27). Я. Komarova F., Kovaleva L. lectins in ivpi-oduet iw ere:,!,:. i,j UjJum spp. // Abstr. 11 Int. bootin Meet ing. l,;oo i;i;■ l■ i, tJ, 32. Ковалева Л.В., Кома(ова Э.Н. ропридуктикш)1 <>pj ¡.¡¡и is.-m

юдоль для изучения межклеточных юайм»дий»^гвия в пич •!.'«• ¡ш.чыы гсетик // Тезисы Бсес.оов. ЬОФр,- 1990 Мини*. С. (о, . 53. Kovalova L., Komarova Е. lectins and pollen -pioi.i! :nteraeUons // AbaU'. of IntorJec -12. ll.'90. Oaliii.mia, l .oD.

И. Kovaiuva i. pistu juctlns in Potunia hytirida t.r •ompatiblo and Incompati'nlo clone's /'/Abstr. Ниетп. о,op. on tngiospem pot Leu and ovules,- 1991- Oomo, I'.oi. s:.i. Ковалева Л.Н. М^жклиточнио втаишлеиствия в cmrr« ч. ичльц.» -юстшс в прогаилой фазе онлодоч'воренил /V Успехи оевн-м ниоя июлогии.- 1991 .-Т.11 I .В.74.12-794.

- 60 -

on. Ковалева J!.n. Иммунохимическое выявление лектиновой • истинности в репродуктивных органах петунии // ДАН СССР.- 1991. -г■.320.Tti,c.223- 226.

37. Ковалева Л. is.. Коп пина К.В. Антигенная специфичность рептдуктивних элементов лука АШш nutans // ДАН СССР.-1991.-т.ззп. тб,-с./27-;?ш.

за. Kovaieva I,, Protein specificity and ligand - receptor interaction:; during progame phase // bmbrlology and seed reproduction. 1'roc. Int. bymp. -1992- St-Peterburg, P.282- 283. 39. Кыктн'а li., Kovaieva L. The changes oi lectin activity in onion sexual organs during pollination // bmbriology and seed roprinluetion. Proc. Int.Syinp.- 1992- St.-Peterburg, P.272-273. -10. Kovaleva L., :>ergeeva L., Zaltsman 0. Peroxidase activity in (.lie маю arid fernalu elements о I fertile and sterile Petunia plant:; //Ab-ur.Xil Int.Congress on sexual plant reproduction.-1992 Col win bus, i'.?.i>

■II. Kovaleva ],. Camotophytic incompatibility in Petunia hybrida molecular aspects of male gametophyte and iemale sporophyte interactions // In Angiosporm pollen and ovules,-1992.- Springer Verlag, flew York Inc., P.101-103.

-12. Ковалева Л.Н. Регуляторные механизмы роста пыльцевых трубок // Успехи современной биологии.- 1992.- Т. 112. в.З.-С. 373 382.

■13. Ковалева Л.В., Комарова Е.Н. Гаметофитноя несовместимость у петунии: динамика углеводов в процессе тоста пыльцевых трубок // Физиол.растений.-1993.-Т.40, Т2, С.260-264.