Ионные механизмы регуляции развития и прорастания мужского гаметофита табака Nicotiana tabacum L.

Андреюк, Денис Сергеевич

Автореферат диссертации по теме "Ионные механизмы регуляции развития и прорастания мужского гаметофита табака Nicotiana tabacum L."

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Ни правах рукописи

РГ5 ОМ

АНДРЕКЖ Денис Сергеевич

ИОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ

РАЗВИТИЯ И ПРОРАСТАНИЯ МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА ТАБАКА МсоНапа шЬасит Ь.

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва- 2000

Работа выполнена на кафедре физиологии растений Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Ермаков И.П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Ковалева Л.В.

кандидат биологических наук, Тимофеев К.Н.

Ведущая организация: кафедра физиологии и биохимии растений Санкт-Петербургского государственного университета

Защита диссертации состоится " 15 " ноября 2000 г. в 16:00 часов на заседании Диссертационного Совета К.053.05.14 при Биологическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. A.M. Горького Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан " 9 " октября 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук, доцент / Полесская О.Г.

¡ШЬ Ud tt'O

р ¡г л а D

Актуальность проблемы.

Свободные неорганические ионы участвуют в реализации многих жизненно важных процессов: контролируют активность ферментов, играют центральную роль в генерации и трансдукции сигналов, осморегуляцни и регуляции транспорта веществ через клеточные мембраны. К числу наиболее "универсальных" в этом отношении ионов, действующих в любых клетках, следует отнести ионы калия, хлорид, а также протоны (Marshner, 1995). В жизни растительной клетки протоны играют особую роль, поскольку они служат для энергизации плазматических мембран (Sze et al., 1999). Наряду с перечисленными ионами регуляторные функции в клетках растений выполняет нитрат (Scheible et al., 1997).

Вопросы, связанные с изучением роли указанных ионов в регуляции роста и метаболизма у растений, изучены достаточно полно на вегетативных тканях и органах (Marshner, 1995). У покрытосеменных растений, с этой точки зрения, наиболее исследован корень (Walker et al., 1998). Такой важный для решения фундаментальных проблем физиологии растений объект, каким является мужской гаметофит, оставался вне поля зрения исследователей, хотя и было известно, что его онтогенез у покрытосеменных сопровождается резкими изменениями интенсивности биосинтетических и ростовых процессов (Резникова, 1984). Это следует объяснять отсутствием до последнего времени адекватных методических подходов к изучению механизмов ионной регуляции на столь специфичном объекте.

Основываясь на данных исследования процессов вегетативного роста, допустимо предположить, что ионные механизмы играют важную роль в регуляции метаболизма и роста мужского гаметофита. Для проверки этого предположения представлялось необходимым с использованием комплекса современных методов установить, в какой мере и каким конкретно образом неорганические ионы участвуют в регуляции критических этапов онтогенеза мужского гаметофита. Это, во-первых, совокупность процессов, предшествующих и подготавливающих формирование мужского гаметофита (рост, вакуолизация и поляризация микроспоры); во-вторых, дифференциация пыльцевого зерна и его взаимодействие с тканями пыльника; и, наконец, его активация на начальном этапе прорастания.

Цели и задачи работы.

Целью настоящей работы являлось установление роли ионов калия, хлорида, нитрата и величины внутриклеточного рН в регуляции онтогенеза мужского гаметофита покрытосеменных растений на примере Nicotiana tabacum L.

Для достижения этой цели были исследованы стадии развития и прорастания мужского гаметофита, резко различающиеся между собой направленностью доминирующих физиологических функций. При этом решались следующие конкретные задачи:

• изучить динамику внутриклеточных концентраций ионов калия, хлорида и нитрата, а также величины внутриклеточного рН с целью выявления взаимосвязи этих показателей с функциональной активностью мужского гаметофита;

• провести анализ элементного состава локулярной жидкости пыльника и установить роль внеклеточных ионов в контроле развития мужского гаметофита;

• выявить на клеточном уровне основные физиологические механизмы, определяющие величину внутриклеточного рН в процессе развития и прорастания мужского гаметофита.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное изучение вклада ионных механизмов в регуляцию онтогенеза мужского гаметофита покрытосеменных растений. Выявлена динамика содержания неорганических ионов во внутриклеточной и внеклеточной средах в процессе дифференциации и прорастания мужского гаметофита, и установлена взаимосвязь изменений ионного состава этих сред с инициацией реорганизации метаболизма пыльцевого зерна при его переходе в состояние покоя и последующем выходе из этого состояния.

Впервые показано, что величина внутриклеточного рН определяет скорость активации и прорастания пыльцевого зерна. Тем самым установлена роль величины внутриклеточного рН в контроле функциональной активности мужского гаметофита.

Впервые изучен ряд механизмов, контролирующих величину внутриклеточного рН в онтогенезе мужского гаметофита: Н+-АТФаза плазматической мембраны, альтернативная оксидаза и хлоридные каналы.

Практическая ценность работы.

В работе вскрыты существенные элементы системы контроля развития и прорастания мужского гаметофита, что важно для формирования представлений о механизмах регуляции полового размножения высших растснки. Полученные результаты могут быть использованы при обсуждении центральных проблем физиологии и эмбриологии растений в соответствующих курсах лекций, читаемых студентам биологических специальностей.

Аппробация работы.

Материалы диссертации были доложены на Международных конференциях студентов и аспирантов "Ломоносов" (Москва, 1999, 2000), Международной конференции по анатомии и морфологии растений (С.-Петербург, 1997), 3-м ежегодном симпозиуме ОФР РАН "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997), VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997), П(Х) съезде Русского ботанического общества "Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков" (С.-Петербург, 1998), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнатизация" (Пущино, 1998), 4-м Съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999), VII Молодежной конференции ботаников (С.-Петербург, 2000), конференции молодых ученых " Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), 12-м конгрессе FESSP (Будапешт, 2000). По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация включает следующие разделы: Введение, гл.1. Обзор литературы, гл.2. Материалы и методы, гл.З. Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы и список литературы. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 16 рисунков. Список литературы включает 155 наименований.

Материалы и методы.

Растения табака Nicotiana tabacum L. выращивали из семян в климатической камере (25°С, 16ч световой день). Идентификацию стадий онтогенеза мужского гаметофита проводили в соответствии с классификацией Kyo, Harada (1986) с использованием общепринятых цитохимических методов. Исследовали следующие стадии: М.1 -ранняя микроспора по выходе из тетрады, эта стадия взята в качестве точки отсчета на рис. 1, 2 (t = 0 сут), М.2 - вакуолизированная микроспора (t = 1 сут), М.З - премитозная микроспора (t = 1,5 сут), П3.1 - среднее 2-ядерное пыльцевое зерно (t = 3 сут), П3.2 и ПЗ.З - поздние 2-ядерные пыльцевые зерна (t = 3,5 сут и t = 4 сут, соответственно), П3.4 - зрелое, частично обезвоженное пыльцевое зерно, П3.5 и П3.6 -соответственно, начальный и заключительный периоды активации зрелого пыльцевого зерна.

Интенсивность ростовых и метаболических процессов. Биомассу микроспор, пыльцевых зерен и пыльников определяли общепринятыми методами. Для измерения клеточного и вакуолярного объемов использовали компьютерную морфометрию. Скорость поглощения кислорода регистрировали методом полярографии с использованием электрода Кларка. Содержание в клетках АТФ определяли биолюминометрическим методом.

Анализ элементного состава локулярного содержгшого проводили посредством рентгеноспектрагтьного микроанализа (РМА) в межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биологического факультета МГУ. Для получения пригодных для анализа проб локулярной жидкости готовили отпечатки поперечных срезов пыльника, мгновенно их замораживали (t = -159,6°С) и высушивали при низкой температуре.

Динамику внутриклеточной концентрации ионов калия, хлорида и нитрата выявляли, анализируя потенциометрическим методом с использованием ионселективных электродов водные экстракты из микроспор и пыльцевых зерен.

Динамику величины внутриклеточного рН регистрировали посредством двух методов: 1) микрофлуориметрии, возбуждая флуоресценцию окрашенных пыльцевых зерен при двух длинах волн; величину рН определяли после построения соответствующей калибровочной кривой, измеряя отношение интенсивностей рН-зависимой (Х.возб = 489 нм) и рН-независимой (^¡озб = 436 нм) флуоресценции; 2) кюветной флуориметрии с регистрацией интенсивности рН-зависимой флуоресценции. В качестве индикатора рН в обоих случаях использовали флуоресцеиндиацетат (ФДА).

Статистическую обработку данных проводили, используя программу MS EXCEL. На рисунках и в таблицах представлены средние арифметические величины ± ошибки средних.

Результаты и обсуждение

Для решения основной задачи настоящей работы - установления роли неорганических ионов и величины внутриклеточного рН в регуляции онтогенеза мужского гаметофита - прежде всего, представлялось необходимым выявить стадии онтогенеза изучаемого объекта, существенно различающиеся по интенсивности ростовых и метаболических процессов с тем, чтобы сопоставить прохождение этих стадий с соответствующими изменениями ионных концентраций.

Интенсивность ростовых процессов оценивали, измеряя биомассу (массу сухого вещества) и объем микроспоры и пыльцевого зерна, а метаболическую активность - определяя скорость поглощения пыльцевыми зернами кислорода и содержание в них АТФ.

Установлено, что в период развития микроспоры и пыльцевого зерна интенсивность ростовых процессов достигает максимума в интервале П3.1 - П3.2, когда биомасса пыльцевого зерна возрастает в 1,4 раза, а его объем - в 2,2 раза. В последующие же 0,5 сут (П3.2 -ПЗ.З) ростовые процессы практически полностью останавливаются.

Можно было предположить, что столь резкое снижение ростовой активности пыльцевого зерна сопровождается соответствующим снижением интенсивности метаболических процессов. Это предположение было подтверждено благодаря изучению скорости поглощения кислорода и внутриклеточного содержания АТФ на стадиях П3.1 и ПЗ.З. Действительно, было установлено, что на стадии ПЗ.З скорость поглощения кислорода была в 2 раза, а содержание АТФ - почти в 36 раз ниже, чем на стадии П3.1 (табл.1).

Таким образом, по интенсивности ростовых процессов и энергетического метаболизма стадию П3.1 можно охарактеризовать как функционально активную, а ПЗ.З - как стадию относительного физиологического покоя. Такая оценка указанных стадий хорошо согласуется с данными ряда авторов об изменении скорости синтеза РНК и белка в процессе дифференциации мужского гаметофита табака: именно на средней 2-ядерной стадии (П3.1) скорости этих процессов достигают максимальных значений, после чего они резко снижаются (Тиру etal., 1992).

Аналогичный подход к изучению прорастания пыльцевого зерна in vitro позволил установить, что скорость поглощения кислорода резко возрастает уже на начальном этапе активации (П3.5, табл. 1). В конце активации (П3.6) скорость поглощения кислорода была на порядок выше, чем в состоянии покоя (ПЗ.З, П3.4), а содержание в клетках АТФ возрастает почти в 60 раз. Данные изучения дыхания 2-клеточной пыльцы различных видов растений указывают на то, что увеличение скорости поглощения кислорода на начальном этапе прорастания пыльцевого зерна связано с активацией цитохромного пути дыхания (Hoekstra, Bruinsma, 1980).

Таким образом, в онтогенезе мужского гаметофита выявлены стадии, существенно различающиеся по интенсивности ростовых и метаболических процессов. Наиболее значимые изменения функциональной активности мужского гаметофита происходят, во-первых, при переходе из состояния с максимальной функциональной активностью (П3.1) в состояние физиологического покоя (ПЗ.З) и, во-вторых, при выходе из состояния покоя во время активации зрелого пыльцевого зерна, предшествующей его прорастанию (П3.5 и П3.6). Именно эти стадии были в центре внимания в настоящей работе.

Таблица 1. Скорость поглощения пыльцевыми зернами кислорода (Уол), содержание в них АТФ и величина внутриклеточного рН на разных стадиях онтогенеза мужского гаметофита

Стадия . онтогенеза Voi, 10'18моль.час''.мкм"'' Содержание АТФ, 10"l4r.MK.vi"J рН

М.З 0,2 ± 0,02 7,4 + 0,10

П3.1 0,2 ±0,06 36 ±8,8 7,1 +0,08

П3.2 7,3 ± 0,23

пз.з 0,1 ±0,02 1 ±0,5 6,8 ± 0,02

Г13.4 0,1 ±0,02 8 ±4,0

П3.5 0,6 ±0,15 7,2 ±0,13

П3.6 1,0 ±0,19 59 ± 1,0 7,6 + 0,11

Таблица 2. Элементный состав локулярной жидкости на разных стадиях развития микроспоры и пыльцевого зерна. Представлены высоты пиков в спектрах РМА, соответствующие перечисленным элементам и выраженные в имп/сек.

Элемент Стадия развития

М.1 М.2 П3.2

К* 4,0 ± 1,1 4,1 ± 1,4 9,3 ±0,8

Cl* 0,4 ±0,2 0,3 ±0,1 1,2 ±0,1

Са* 0,4 ± 0,2 0,6 ± 0,4 2,9 ± 1,2

С 4,9 ±1,3 2,9 ± 0,4 4,3 ±0,6

N 2,0 ±0,5 2,6 ±0,5 2,6 ±0,3

О 7,2 ± 1,9 7,5 ± 1,3 9,2 ± 1,6

* - различия между стадиями по содержанию элемента достоверны при Р>0.95

Изучение ионных механизмов развития и прорастания мужского гаметофита было начато с определения величины внутриклеточного рН на разных стадиях этого процесса, поскольку рН, как известно, является ключевым параметром, контролирующим активность ростовых н метаболических процессов в живых клетках (Kurkdjian, Guern. 1989).

С этой целью посредством микрофлуориметрического метода измеряли рН цитоплазмы вегетативной клетки. Установлено, что как развитие, так и прорастание пыльцевого зерна сопровождаются существенными изменениями величины внутриклеточного рН (табл. 1). Эта величина снижается с рН 7.1 (П3.1) до рН 6.8 (ПЗ.З) при переходе в состояние покоя в конце фазы дифференциации пыльцевого зерна и возрастает с рН 7.2 (П3.5) до рН 7.6 (П3.6) на протяжении активации, предшествующей прорастанию.

Сопоставление величины рН с интенсивностью ростовых и метаболических процессов на различных стадиях онтогенеза мужского гаметофита выявило наличие четкой взаимосвязи между ними (табл. 1): высокой функциональной активности пыльцевого зерна соответствует и высокий уровень внутриклеточного рН (П3.1, П3.6), в то время как состояние относительного физиологического покоя достигается при минимуме рН (ПЗ.З). Аналогичная закономерность установлена для разнообразных животных систем, в жизненном цикле которых имеется фаза физиологического покоя (Альберте и др., 1994; Roos, Boron, 1981).

Поскольку развитие мужского гаметофита в значительной мере контролируется спорофитом посредством изменения состава локулярной жидкости (Бхандари, 1990), представлялось целесообразным изучить также содержание главных неорганических ионов в этой жидкости на разных стадиях развития микроспоры и пыльцевого зерна.

С этой целью посредством РМА определяли содержание в локулярной жидкости К, Cl, Са, а также С, N и О. Из данных, приведенных в табл.2, видно, что пики С, N и О остаются практически неизменными по высоте на всех трех изученных стадиях - M.I, М.2 и П3.2, - что позволяет исключить возможность вариации в толщине отпечатка пыльника. В этих условиях изменение высоты пика, в первом приближении, отражает изменение содержания соответствующего элемента в исследуемом объекте (Hodson, 1995).

Можно видеть, что содержание в локулярной жидкости капия, хлора и кальция оставаюсь неизменным при переходе от стадии М.1 к М.2 (табл. 2). Однако, содержание каждого из этих ионов резко возрастает на стадии П3.2, возможно, вследствии их выброса в локулу из дегенерирующих тканей пыльника - тапетума и связника (Koitunow et al., 1990).

Вместе с тем, накопление калия и хлорида в локулярной жидкости предшествует резкому снижению величины внутриклеточного рН,

характерному для перехода пыльцевого зерна в состояние покоя (табл. 1). Это позволило предположить, что концентрация внеклеточных ионов контролирует величину внутриклеточного pH в процессе развития мужского гаметофита.

Для проверки этого предположения изучали влияние ионного состава внеклеточной среды на изменение величины внутриклеточного pH в процессе развития мужского гаметофита in vitro. Пыльцевые зерна, изолированные на стадии П3.1, культивировали на протяжении 1 сут в стандартной культуральной среде (Benito Moreno et al., 1988) или в среде, дополненной 50 мМ KCl.

Установлено, что процесс развития пыльцевого зерна in vitro сопровождается существенными изменениями величины внутриклеточного pH, направленность которых зависит от концентрации ионов калия и хлорида во внеклеточной среде. В стандартной среде pH возрастает с 7,1 ±0,1 (П3.1, исходное значение) до 7,4 ± 0,1, в то время как в среде, содержащей KCl, pH снижается до 6,8 ± 0,1, достигая уровня, характерного для стадии ПЗ.З in vivo (табл.1).

Таким образом, проведение экспериментов in vitro подтвердило предположение о регуляторной роли внеклеточных локулярных неорганических ионов.

В задачи следующего раздела работы входило изучение динамики внутриклеточных концентраций ионов калия, хлорида и нитрата в процессе развития микроспоры и пыльцевого зерна. С этой целью, используя ионселективные электроды, измеряли содержание ионов в водных экстрактах из микроспор и пыльцевых зерен, мембраны которых были предварительно повреждены замораживанием-оттаиванием. На основе этих данных рассчитывали концентрацию ионов в единице объема (мМ) микроспоры или вегетативной клетки пыльцевого зерна.

Показано, что в интервале М.1 - ПЗ.З внутриклеточные концентрации ионов калия, хлорида и нитрата претерпевают существенные изменения (рис. 1). Периоду интенсивного роста микроспоры и пыльцевого зерна (М.2 - П3.1; 1-3 сут) соответствуют относительно высокие концентрации внутриклеточного калия (80 - 100 мМ) и достаточно низкие концентрации хлорида (около 30 мМ). Завершение ростовых процессов и снижение метаболической активности пыльцевого зерна (П3.2 - ПЗ.З; 3,5-4 сут) сопровождается резким уменьшением внутриклеточной концентрации калия (до 40 мМ) и возрастанием концентрации внутриклеточного хлорида (до 50 мМ). На стадии ПЗ.З (4 сут) содержание тех и других ионов во внутриклеточной среде достигает уровня, соответствующего ингибированию процесса трансляции (Wyn Jones, Pollard, 1983).

1 2 3

время, сут

1 2 3

время, сут

Рис. 1. Внутриклеточные концентрации ионов калия, хлорида и нитрата в процессе развития микроспоры и пыльцевого зерна (интервал МЛ - ПЗ.З).

К\ СГ, мМ

120

80

40

СГ

К*

рн о \

........

7,5 7

6,5 6

5,5

рн

12 3 4

время, сут

Рис. 2. Изменение величины внутриклеточного рН и концентрации ионов калия и хлорида на заключительном этапе дифференциации пыльцевого зерна

о

Концентрация нитрата на протяжении роста микроспоры (М.1 -М.З; 0-1,5 сут) снижается с 20 до 6 мМ и далее поддерживается неизменной, оставаясь на протяжении всего изучаемого интервала более высокой, чем в целом пыльнике. Этот факт косвенным образом свидетельствует об участии нитрата в регуляции биохимических процессов в пыльцевом зерне.

Рис. 2 суммирует изменения внутриклеточных концентраций ионов калия и хлорида, а также величины внутриклеточного рН при переходе мужского гаметофита в состояние физиологического покоя. Из рисунка видно, что резкое снижение величины рН, характерное для этого перехода, совпадает по времени с возрастанием концентрации в пыльцевом зерне хлорида, и оба эти события непосредственно следуют за снижением концентрации внутриклеточного калия.

Таким образом, в результате проведенной работы получены количественные оценки концентрации калия, хлорида и нитрата в процессе развития микроспоры и пыльцевого зерна и установлена взаимосвязь этих величин с интенсивностью ростовых процессов, метаболической активностью, а также с величиной внутриклеточного рН.

В связи с выявлением корреляции между функциональной активностью мужского гаметофита и ионным составом как внутри- так и внеклеточной сред, представлялось необходимым напрямую продемонстрировать определяющее влияние концентрации ионов калия, хлорида или взаимосвязанной с ними величины внутриклеточного рН на функциональное состояние мужского гаметофита. При выполнении этого раздела работы мы ограничились изучением влияния величины внутриклеточного рН на скорость поглощения кислорода и на прорастание зрелого пыльцевого зерна в условиях in vitro.

С этой целью анализировали скорость поглощения кислорода зрелыми пыльцевыми зернами и эффективность их прорастания при сдвиге внутриклеточного рН в кислую или щелочную сторону, что достигалось посредством использования, соответственно, пропионовой кислоты (Kurkdjian, Guern, 1989) или конканавалина А (Кон A, Hesketh et al., 1985).

Рис. 3 отражает динамику интенсивности рН-зависимой флуоресценции после добавления реагента, изменяющего внутриклеточный рН. Из рисунка видно, что Кон А вызывает постепенное возрастание измеряемой величины в соответствии с тем, что наблюдали ранее на клетках животных (Hesketh et al.,' 1985). Реакция пыльцевых зерен на проиионоиую кислоту имеет двухфазный характер: кривая резко снижается, а затем постепенно возрастает с тенденцией выхода на плато. Аналогичная динамика внутриклеточного рН характерна для различных растительных объектов, испытавших

время, мин

Рис.3. Изменение интенсивности рН-зависимой флуоресценции (1рц) при закислении цитозоля пропионовой кислотой (ПК) или его защелачивании, вызванном конканавалином А (Кон А). Стрелкой указан момент внесения реагента в суспензию пыльцевых зерен.

□ контроль П закисление

□ защелачивание

Уо,

прорастание

Рис. 4. Относительные величины скорости поглощения кислорода (Уот) пыльцевыми зернами и эффективности их прорастания в условиях контролируемого изменения величины внутриклеточного рН. За единицу приняты соответствующие величины в контроле.

действие слабых липофильных кислот (Сиегп е! а1., 1986; Трофимова, Молотковский, 1993).

Сдвиг внутриклеточного рН существенно изменяет как скорость поглощения кислорода в период активации пыльцевого зерна, так и эффективность процесса прорастания (рис.4). Закисление цитозоля почти полностью ингибирует оба процесса, в то время как защелачивание приводит к 30 % возрастанию скорости поглощения кислорода и на 70 % увеличивает число проросших пыльцевых зерен.

Таким образом, было подтверждено предположение о том, что величина внутриклеточного рН представляет собой параметр, контролирующий скорость поглощения кислорода пыльцевыми зернами и скорость их прорастания. Тем самым на примере ионов водорода наглядно продемонстрирована регуляторная роль внутриклеточных неорганических ионов в изменении функциональной активности мужского гаметофита на критическом этапе его онтогенеза.

Изложенные выше данные в своей совокупности свидетельствуют о скоординированном изменении концентрации неорганических ионов (включая протоны) во вне- и внутриклеточных средах мужского гаметофита в процессе его онтогенеза и о регуляторной роли этих ионов в реорганизации метаболизма на определенных этапах этого процесса. В этой связи возникла необходимость установления конкретных механизмов, контролирующих величину внутриклеточного рН. К числу таких механизмов можно было отнести Н+-АТФазу плазматической мембраны, альтернативную оксидазу и хлоридные каналы. Предстояло, таким образом, определить вклад каждого из этих механизмов в регуляцию изучаемых нами процессов развития и прорастания мужского гаметофита.

Для решения этой задачи исследовали влияние специфических ингибиторов перечисленных механизмов на изменение величины внутриклеточного рН. В качестве ингибитора Н+-АТФазы плазматической мембраны использовали ортованадат (600 мкМ), альтернативной оксидазы - бензгидроксамовую кислоту (БГК, 5 мМ), хлоридных каналов - этакриновую кислоту (1 мМ). Вклад указанных механизмов в регуляцию рН в пыльцевых зернах оценивали по изменению интенсивности рН-зависимой флуоресценции в ответ на добавление соответствующего ингибитора (рис. 5, табл. 3).

Установлено, что все перечисленные выше механизмы участвуют в регуляции рН в пыльцевом зерне на трех выбранных для изучения стадиях - П3.1, ПЗ.З и П3.5, существенно различающихся по функциональной активности.

Ipil

0,6 !

0,4

4 6

время, мин

10

Рис. 5. Влияние ингибиторов Н+-АТФазы (ортованадат), апьтернативной оксидазы (БГК) и хлоридных каналов (этакриновая кислота) на интенсивность рН-зависимой флуоресценции (1рН) на стадии ПЗ.З. Стрелкой указан момент добавления ингибиторов в суспензию пыльцевых зерен.

Обозначения: 1 - контроль; 2 - добавлен ортованадат, 3 - добавлена БГК, 4 - добавлены ортованадат и БГК, 5 - добавлена этакриновая кислота.

Таблица 3. Подавление рН-зависимой флуоресценции (%) на разных стадиях онтогенеза мужского гаметофита посредством ингибирования механизмов, контролирующих внутриклеточный рН

Стадия Добавляемый ингибитор

онтогенеза ортованадат БГК ортованадат + БГК этакриновая кислота

П3.1 5 ±2,0 9 ± 6 35 ±3,0* 33 ± 5,1 *

ПЗ.З 6 ±3,0 15 ±2,0* 30 ± 2,0* 43 ± 1,1*

П3.5 0 8 ±6,0 33 ±4,0* 31 ± 2,6*

* - достоверное отличие от соответствующей величины в контроле (Р>0,95)

Вклад I-Г-АТФазы в регуляцию рН на всех этих стадиях выявляется лишь при одновременном блокировании альтернативной оксидазы. Аналогичным образом, регуляторная роль альтернативной оксидазы на стадиях П3.1 и П3.5 обнаруживается лишь при условии одновременного ингибирования Н+-АТФазы. Лишь на стадии Г13.3 роль альтернативной оксидазы в регуляции внутриклеточного рН становится более значимой и выявляется без дополнительного ингибирования других механизмов. На всех трех изучаемых стадиях вклад хлоридных каналов в регуляцию рН сопоставим с совокупным вкладом двух других механизмов - Н+-АТФазы и альтернативной оксидазы.

Таким образом, в мужском гаметофите активно функционирует, по меньшей мере, три механизма, влияющих на внутриклеточный рН, а следовательно и находящиеся под его контролем метаболические и ростовые процессы - это АТФазы р-типа (прежде всего, Н+-АТФаза плазматической мембраны), альтернативная оксидаза и хлоридные каналы.

Заключение

В настоящей работе исследовали участие неорганических ионов и величины внутриклеточного рН в регуляции критических стадий онтогенеза мужского гаметофита табака, начиная от стадии ранней микроспоры и заканчивая стадией инициации прорастания зрелого пыльцевого зерна.

Установлено, что развитие мужского гаметофита сопровождается существенными изменениями интенсивности ростовых процессов (оцениваемых по изменению биомассы и объема гаметофита), а также интенсивности энергетического метаболизма (скорости поглощения кислорода, содержанию в клетках АТФ). Наиболее значимые изменения соответствуют, во-первых, переходу мужского гаметофита из состояния активного метаболизма в состояние физиологического покоя в конце фазы дифференциации пыльцевого зерна и, во-вторых, выходу из этого состояния на начальном этапе прорастания зрелого пыльцевого зерна. Таким образом, стало очевидно, что именно эти периоды - переход в состояние покоя и выход из него - представляют наибольший интерес для выявления участия ионных механизмов в регуляции онтогенеза мужского гаметофита. Поэтому на них и было сосредоточено наше внимание.

Изучение методом РМА динамики элементного состава локулярной жидкости, в окружении которой развивается мужской гаметофит, выявило накопление в ней ионов калия и хлорида к концу фазы дифференциации пыльцевого зерна, что можно связать с подготовкой перехода гаметофита в состояние покоя. В этот же период,

как показало исследование, проведенное с использованием ионселективных электродов, ионный состав внутриклеточной среды гаметофита также существенно изменяется: концентрация калия снижается, а хлорида - возрастает, т.е. в цитозоле создаются ионные условия, способствующие, как известно, ингибированию синтеза белка (Wyn Jones, Pollard, 1983).

Вопрос о возможной роли нитрата в регуляции развития мужского гаметофита нуждается в дальнейшем изучении. Его концентрация поддерживается на постоянном уровне, исключая период роста и вакуолизации микроспоры, подготавливающий и детерминирующий формирование мужского гаметофита. На протяжении этого периода внутриклеточная концентрация нитрата постепенно снижается. Косвенным свидетельством участия этого иона в регуляции биохимических процессов может служить тот факт, что на всех изученных стадиях концентрация нитрата в гаметофите была выше, чем в целом пыльнике.

Таким образом, в результате проведенного исследования не только впервые выявлена динамика содержания неорганических ионов во внутриклеточной и внеклеточной средах в процессе развития микроспоры и пыльцевого зерна, но и установлена взаимосвязь изменений ионного состава этих сред с инициацией реорганизации метаболизма пыльцевого зерна, обусловленной его переходом в состояние физиологического покоя.

Наряду с изменениями ионного состава, развитие и прорастание мужского гаметофита сопровождается изменениями величины внутриклеточного рН, которые отчетливо выявляются методами микрофлуориметрии и кюветной флуориметрии. Установлено, что переход мужского гаметофита в состояние физиологического покоя сопряжен с резким снижением внутриклеточного рН, а выход из этого состояния при инициации прорастания - с возрастанием рН. Таким образом, выявленные изменения рН в онтогенезе мужского гаметофита подчиняются тем же закономерностям, что и у животных объектов, в онтогенезе которых имеется фаза физиологического покоя (Альберте и др., 1994; Roos, Boron, 1981) и, следовательно, как и у этих объектов, рН выполняет функции регуляции внутриклеточных обменных процессов.

Участие внутриклеточного рН в регуляции процессов прорастания пыльцевого зерна непосредственно подтверждено экспериментами in vitro с искусственным закислением или защелачиванием цитозоля. Снижение величины рН, обусловленное поступлением в клетки пропионовой кислоты, подавляет активацию дыхания и приводит к ингибированию процессов прорастания. Противоположный эффект - более быстрая активация дыхания и ускорение прорастания - достигается при увеличении

внутриклеточного рН посредством воздействия на пыльцевые зерна конканавалином А.

В связи с полученными данными, свидетельствующими о существенной роли внутриклеточного рН в регуляции развития и прорастания мужского гаметофита, представлялось целесообразным рассмотреть механизмы, контролирующие концентрацию протонов внутри гаметофита. С этой целью было изучено влияние внеклеточных ионов калия и хлорида на величину внутриклеточного рН в пыльцевых зернах, развивающихся in vitro. Было установлено, что концентрация этих ионов оказывает существенное влияние на величину внутриклеточного рН. При этом высокие концентрации внеклеточных ионов калия и хлора приводили к снижению внутриклеточного рН до значений, характерных для состояния физиологического покоя.

Наряду с регуляцией внутриклеточного рН, осуществляемой с участием внеклеточных неорганических ионов, были выявлены следующие механизмы контроля рН в пыльцевом зерне: АТФазы р-типа, хлоридные каналы и альтернативная оксидаза. Было установлено, что относительный вклад каждого из этих механизмов варьирует и зависит от стадии онтогенеза мужского гаметофита.

Таким образом, в ходе проведения работы впервые получены количественные оценки внутриклеточных концентраций неорганических ионов и величины рН на критических стадиях онтогенеза мужского гаметофита и установлена взаимосвязь изменений ионного состава внутри- и внеклеточной сред с инициацией реорганизации метаболизма пыльцевого зерна, обусловленной его переходом в состояние физиологического покоя или выходом из этого состояния. На примере величины внутриклеточного рН показано, что ионный состав внутриклеточной среды, в свою очередь, контролируется взаимосвязанными биохимическими и биофизическими механизмами. В целом, представленные данные приводят к заключению о важной роли изменения концентраций неорганических ионов и величины внутриклеточного рН как в спорофитной регуляции развития мужского гаметофита, так и в инициации его прорастания на рыльце.

Выводы

1. Процесс роста и дифференциации мужского гаметофита сопровождается возрастанием концентрации ионов калия и хлорида в локулярной жидкости развивающегося пыльника. Это возрастание является необходимым условием снижения величины внутриклеточного рН до уровня, соответствующего состоянию физиологического покоя, что свидетельствует об участии внеклеточных неорганических ионов в регуляции развития мужского гаметофита.

2. Выявлена существенная роль внутриклеточных неорганических ионов в регуляции развития мужского гаметофита: концентрация этих ионов во внутриклеточной среде изменяется по мере развития мужского гаметофита, эти изменения коррелируют с интенсивностью ростовых процессов и процессов энергетического метаболизма; минимум интенсивности как тех, так и других процессов совпадает во времени с достижением минимальных концентрации калия и максимальной концентрации хлорида.

3. В процессе развития и прорастания мужского гаметофита имеет место существенное изменение величины внутриклеточного рН. Установлена взаимосвязь этой величины с интенсивностью энергетического метаболизма: при увеличении рН возрастает скорость поглощения кислорода и содержание АТФ в пыльцевом зерне.

4. Существенная роль величины внутриклеточного рН в регуляции процесса прорастания мужского гаметофита получила непосредственное подтверждение в экспериментах in vitro:

1) понижение величины внутриклеточного рН, обусловленное поступлением в клетки пропионовой кислоты, блокировало активацию потребления кислорода пыльцевыми зернами и их прорастание;

2) повышение величины внутриклеточного рН конканавалином А активировало потребление кислорода и ускоряло прорастание пыльцевых зерен.

5. Показано, что величина внутриклеточного рН в пыльцевом зерне в период его дифференциации и прорастания находится под контролем, по меньшей мере, трех механизмов: АТФаз р-типа, хлоридных каналов и альтернативной оксидазы. Относительный вклад каждого из этих механизмов варьировал, в зависимости от стадии онтогенеза мужского гаметофита.

6. Выявленная в работе взаимосвязь изменений ионного состава вне-и внутриклеточной сред мужского гаметофита с определенными этапами его развития и прорастания свидетельствуют о важной роли межклеточных ионных потоков в спорофитной регуляции развития мужского гаметофита и инициации его прорастания на рыльце.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант N99-04-49096)

Публикации.

1. Андреюк Д.С., Богданов А.Г., Матвеева Н.П., Тукеева М.И., Ермаков И.П. Изменения элементного состава микроспоры, пыльцевого зерна и содержимого локулы в процессе развития пыльника табака. Тр. Междунар. конф. по анатомии и морфологии растений, С.-Петербург, 1997. С.341.

2. Андреюк Д.С., Богданов А.Г., Матвеева Н.П., Тукеева М.И., Ермаков И.П. Изменения элементного состава микроспоры табака в связи с подготовкой к делению. Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология. 3-й ежегодн. симп. ОФР РАН Москва, 27-28 июня, 1997. Тез. докл. С. 109.

3. Андреюк Д.С., Богданов А.Г., Матвеева Н.П., Тукеева М.И., Ермаков И.П. Динамика элементного состава локулы пыльника в процессе гаметофитогенеза у табака. Онтогенез. 1998. Т.29, № 5, С.335-341.

4. Андреюк Д.С., Матвеева Н.П., Тукеева М.И., Ермаков И.П. Изменения паттерна распределения подвижных ионов в локуле пыльника табака в процессе дифференциации мужского гаметофита. Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков. П(Х) съезд Русского ботанического общества, С.-Петербург, 26-29 мая, 1998. Тез. докл. Т.1. С.97-98.

5. Андреюк Д.С., Матвеева Н.П., Тукеева М.И., Ермаков И.П. Участие ионов калия и нитрата в дифференциации пыльцевого зерна. Междунар. конф.: Рецепция и внутриклеточная сигнализация, Пущино, 21-25 сентября, 1998. Тез. докл. С.204-206.

6. Андреюк Д.С. Определение рН в клетках мужского гаметофита табака с использованием флуоресцентного зонда. Междунар. конф. студентов и аспирантов "Ломоносов-99", Москва, 7-10 апреля, 1999. Изд-во МГУ, 2000. Тез. докл. Вып. 5. С.10-11.

7. Андреюк Д.С., Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Изменение величины рН и концентрации калия в пыльцевом зерне табака в процессе его дифференциации. 4 Съезд общества физиологов растений России. Москва, 4-9 октября 1999. Тез. докл. Т.2. С. 519.

8. Андреюк Д.С., Матвеева Н.П., Тукеева М.И., Ермаков И.П. Динамика неорганических ионов в микроспоре и пыльцевом зерне табака в процессе развития мужского гаметофита. Онтогенез. 2000. т. 31. № 2. С. 114-119.

9. Войцех О.О., Андреюк Д.С. Механизмы регуляции внутриклеточного рН на поздних этапах развития мужского гаметофита. Междунар. конф. студентов и аспирантов "Ломоносов-2000", Москва, 12-15 апреля, 2000. Тез. докл. Вып. 4. С.19.

10. Андреюк Д.С., Войцех О.О. Изменения рН в процессе дифференциации мужского гаметофита Nicotiana tabacum L. VII Молодежная конф. ботаников. С.Петербург, 15-19 мая, 2000. Тез. докл. С.95.

11. Войцех О.О., Андреюк Д.С. Роль цитозольного рН в регуляции прорастания мужского гаметофита. там же, С. 104.

12. Андреюк Д.С., Войцех О.О. Взаимосвязь изменений рН и энергетического обмена в процессе развития и прорастания мужского гаметофита. Горизонты физико-химической биологии. Пущино, 28 мая - 2 июня, 2000. Тез. докл. С.307.

13.Andreyuk D.S., Voyscekh О.О., Matveyeva N.P., Yermakov I.P. Changes in intracellular pH during tobacco pollen development and germination. Plant Physiology and Biochemistry. 2000. V.38 (supplement) P S03-T1.

14. Андреюк Д.С., Матвеева Н.П., Тукеева М.И., Ермаков И.П. Внутриклеточные концентрации калия, хлорида и протонов в процессах дифференциации мужского гаметофита табака. Физиология растений (в печати). /'i\i\

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андреюк, Денис Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Субклеточный уровень регуляции.

2. Клеточный уровень регуляции.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Внутриклеточный рН и интенсивность энергетического метаболизма.

2. Неорганические ионы локулярной жидкости.

3. Неорганические ионы внутриклеточной среды микроспоры и пыльцевого зерна.

4. Роль внутриклеточного рН в регуляции функциональной активности мужского гаметофйта.

5. Факторы определяющие величину внутриклеточного рН пыльцевого зерна.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ионные механизмы регуляции развития и прорастания мужского гаметофита табака Nicotiana tabacum L."

Свободные неорганические ионы участвуют в реализации многих жизненно важных процессов: контролируют активность ферментов, играют центральную роль в генерации и трансдукции сигналов, осморегуляции и регуляции транспорта веществ через клеточные мембраны. К числу наиболее "универсальных" в этом отношении ионов, действующих в любых клетках, следует отнести ионы калия, хлорид, а также протоны (Marshner, 1995). В жизни растительной клетки протоны играют особую роль, поскольку они служат для энергизации плазматических мембран (Sze et al., 1999). Наряду с перечисленными ионами регуляторные функции в клетках растений выполняет нитрат (Scheible et al., 1997а).

Вопросы, связанные с изучением роли указанных ионов в регуляции роста и метаболизма у растений, изучены достаточно полно на вегетативных тканях и органах (Marshner, 1995). У покрытосеменных растений, с этой точки зрения, наиболее исследован корень (Walker et al., 1998). Такой важный для решения фундаментальных проблем физиологии растений объект, каким является мужской гаметофит, оставался вне поля зрения исследователей, хотя и было известно, что его онтогенез у покрытосеменных сопровождается резкими изменениями интенсивности биосинтетических и ростовых процессов (Резникова, 1984). Это следует объяснять отсутствием до последнего времени адекватных методических подходов к изучению механизмов ионной регуляции на столь специфичном объекте.

Основываясь на данных исследования процессов вегетативного роста, допустимо предположить, что ионные механизмы играют важную роль в регуляции метаболизма и роста мужского гаметофита. Для проверки этого предположения представлялось необходимым с использованием комплекса современных методов установить, в какой мере и каким конкретно образом неорганические ионы участвуют в регуляции критических этапов онтогенеза мужского гаметофита. Это, во-первых, совокупность процессов, предшествующих и подготавливающих формирование мужского гаметофита (рост, вакуолизация и поляризация микроспоры); во-вторых, дифференциация пыльцевого зерна и его взаимодействие с тканями пыльника; и, наконец, его активация на начальном этапе прорастания.

Целью настоящей работы являлось установление роли ионов калия, хлорида, нитрата и величины внутриклеточного рН в регуляции онтогенеза мужского гаметофита покрытосеменных растений на примере ШсоНапа tabacum Ь.

Для достижения этой цели были исследованы стадии развития и прорастания мужского гаметофита, резко различающиеся между собой направленностью доминирующих физиологических функций. При этом решались следующие конкретные задачи:

• изучить динамику внутриклеточных концентраций ионов калия, хлорида и нитрата, а также величины внутриклеточного рН с целью выявления взаимосвязи этих показателей с функциональной активностью мужского гаметофита;

• провести анализ элементного состава локулярной жидкости пыльника и установить роль внеклеточных ионов в контроле развития мужского гаметофита;

• выявить на клеточном уровне основные физиологические механизмы, определяющие величину внутриклеточного рН в процессе развития и прорастания мужского гаметофита.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Андреюк, Денис Сергеевич

выводы

1. Процесс роста и дифференциации мужского гаметофита сопровождается возрастанием концентрации ионов калия и хлорида в локулярной жидкости развивающегося пыльника. Это возрастание является необходимым условием снижения величины внутриклеточного рН до уровня, соответствующего состоянию физиологического покоя, что свидетельствует об участии внеклеточных неорганических ионов в регуляции развития мужского гаметофита.

2. Выявлена существенная роль внутриклеточных неорганических ионов в регуляции развития мужского гаметофита: концентрация этих ионов во внутриклеточной среде изменяется по мере развития мужского гаметофита, эти изменения коррелируют с интенсивностью ростовых процессов и процессов энергетического метаболизма; минимум интенсивности как тех, так и других процессов совпадает во времени с достижением минимальных концентрации калия и максимальной концентрации хлорида.

3. В процессе развития и прорастания мужского гаметофита имеет место существенное изменение величины внутриклеточного рН. Установлена взаимосвязь этой величины с интенсивностью энергетического метаболизма: при увеличении рН возрастает скорость поглощения кислорода и содержание АТФ в пыльцевом зерне.

4. Существенная роль величины внутриклеточного рН в регуляции процесса прорастания мужского гаметофита получила непосредственное подтверждение в экспериментах in vitro:

1) понижение величины внутриклеточного рН, обусловленное поступлением в клетки пропионовой кислоты, блокировало активацию потребления кислорода пыльцевыми зернами и их прорастание;

2) повышение величины внутриклеточного рН конканавалином А активировало потребление кислорода и ускоряло прорастание пыльцевых зерен.

5. Показано, что величина внутриклеточного рН в пыльцевом зерне в период его дифференциации и прорастания находится под контролем, по меньшей мере, трех механизмов: АТФаз р-типа, хлоридных каналов и альтернативной оксидазы. Относительный вклад каждого из этих механизмов варьировал, в зависимости от стадии онтогенеза мужского гаметофита.

6. Выявленная в работе взаимосвязь изменений ионного состава вне- и внутриклеточной сред мужского гаметофита с определенными этапами его развития и прорастания свидетельствуют о важной роли межклеточных ионных потоков в спорофитной регуляции развития мужского гаметофита и инициации его прорастания на рыльце.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант N99-04-49096)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе исследовали участие неорганических ионов и величины внутриклеточного рН в регуляции критических стадий онтогенеза мужского гаметофита табака, начиная от стадии ранней микроспоры и заканчивая стадией инициации прорастания зрелого пыльцевого зерна.

Установлено, что развитие мужского гаметофита сопровождается существенными изменениями интенсивности ростовых процессов (оцениваемых по изменению биомассы и объема гаметофита), а также интенсивности энергетического метаболизма (скорости поглощения кислорода, содержанию в клетках АТФ). Наиболее значимые изменения соответствуют, во-первых, переходу мужского гаметофита из состояния активного метаболизма в состояние физиологического покоя в конце фазы дифференциации пыльцевого зерна и, во-вторых, выходу из этого состояния на начальном этапе прорастания зрелого пыльцевого зерна. Таким образом, стало очевидно, что именно эти периоды - переход в состояние покоя и выход из него - представляют наибольший интерес для выявления участия ионных механизмов в регуляции онтогенеза мужского гаметофита. Поэтому на них и было сосредоточено наше внимание.

Изучение методом РМА динамики элементного состава локулярной жидкости, в окружении которой развивается мужской гаметофит, выявило накопление в ней ионов калия и хлорида к концу фазы дифференциации пыльцевого зерна, что можно связать с подготовкой перехода гаметофита в состояние покоя. В этот же период, как показало исследование, проведенное с использованием ионселективных электродов, ионный состав внутриклеточной среды гаметофита также существенно изменяется: концентрация калия снижается, а хлорида - возрастает, т.е. в цитозоле создаются ионные условия, способствующие, как известно, ингибированию синтеза белка (Wyn Jones, Pollard, 1983).

Вопрос о возможной роли нитрата в регуляции развития мужского гаметофита нуждается в дальнейшем изучении. Его концентрация поддерживается на постоянном уровне, исключая период роста и вакуолизации микроспоры, подготавливающий и детерминирующий формирование мужского гаметофита. На протяжении этого периода внутриклеточная концентрация нитрата постепенно снижается. Косвенным свидетельством участия этого иона в регуляции биохимических процессов может служить тот факт, что на всех изученных стадиях концентрация нитрата в гаметофите была выше, чем в целом пыльнике.

Таким образом, в результате проведенного исследования не только впервые выявлена динамика содержания неорганических ионов во внутриклеточной и внеклеточной средах в процессе развития микроспоры и пыльцевого зерна, но и установлена взаимосвязь изменений ионного состава этих сред с инициацией реорганизации метаболизма пыльцевого зерна, обусловленной его переходом в состояние физиологического покоя.

Наряду с изменениями ионного состава, развитие и прорастание мужского гаметофита сопровождается изменением величины внутриклеточного pH, которые отчетливо выявляются методами микрофлуориметрии и юоветной флуориметрии. Установлено, что переход мужского гаметофита в состояние физиологического покоя сопряжен с резким снижением внутриклеточного pH, а выход из этого состояния при инициации прорастания - с возрастанием pH. Таким образом, выявленные изменения pH в онтогенезе мужского гаметофита подчиняются тем же закономерностям, что и у животных объектов, в онтогенезе которых имеется фаза физиологического покоя (Альберте и др., 1994; Roos, Boron, 1981) и, следовательно, как и у этих объектов, рН выполняет функции регуляции внутриклеточных обменных процессов.

Участие внутриклеточного рН в регуляции процессов прорастания пыльцевого зерна непосредственно подтверждено экспериментами in vitro с искусственным закислением или защелачиванием цитозоля. Снижение величины рН, обусловленное поступлением в клетки пропионовой кислоты, подавляет активацию дыхания и приводит к ингибированию процессов прорастания. Противоположный эффект - более быстрая активация дыхания и ускорение прорастания - достигается при увеличении внутриклеточного рН посредством воздействия на пыльцевые зерна конканавалином А.

В связи с полученными данными, свидетельствующими о существенной роли внутриклеточного рН в регуляции развития и прорастания мужского гаметофита, представлялось целесообразным рассмотреть механизмы, контролирующие концентрацию водородных ионов внутри гаметофита. С этой целью было изучено влияние внеклеточных ионов калия и хлорида на величину внутриклеточного рН в пыльцевых зернах, развивающихся in vitro. Было установлено, что концентрация этих ионов оказывает существенное влияние на величину внутриклеточного рН. При этом высокие концентрации внеклеточных ионов калия и хлора приводили к снижению внутриклеточного рН до значений, характерных для состояния физиологического покоя.

Наряду с регуляцией внутриклеточного рН, осуществляемой с участием внеклеточных неорганических ионов, были выявлены следующие механизмы контроля рН в пыльцевом зерне: АТФазы р-типа, хлоридные каналы и альтернативная оксидаза. Было установлено, что относительный вклад каждого из этих механизмов варьирует и зависит от стадии онтогенеза мужского гаметофита.

Таким образом, в ходе проведения работы впервые получены количественные оценки внутриклеточных концентраций неорганических ионов и величины рН на критических стадиях онтогенеза мужского гаметофита и установлена взаимосвязь изменений ионного состава внутри- и внеклеточной сред с инициацией реорганизации метаболизма пыльцевого зерна, обусловленной его переходом в состояние физиологического покоя или выходом из этого состояния. На примере величины внутриклеточного рН показано, что ионный состав внутриклеточной среды, в свою очередь, контролируется взаимосвязанными биохимическими и биофизическими механизмами. В целом, представленные данные приводят к заключению о важной роли изменения концентраций неорганических ионов и величины внутриклеточного рН как в спорофитной регуляции развития мужского гаметофита так и в инициации его прорастания на рыльце.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андреюк, Денис Сергеевич, Москва

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К, Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. Т.1. М.:Мир, 1994. 515с.

2. Бхандари Н.Н. Микроспорангий//Эмбриология растений т. 1. М.: Агропромиздат, 1990. 509с. С. 66-146.3. ван Вент Дж. Л., Виллемсе М.Т.М. Оплодотворение// Эмбриология растений т. 1. М.: Агропромиздат, 1990. 509с. С.317-367.

3. Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П. И др. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ: в 2-х книгах. Книга 2. М.: Мир, 1984. 348с.

4. Джапаридзе Л.И. Практикум по микроскопической химии растений. М.: Советская наука, 1953. 152с.

5. Данвелл Дж. М. Культуры гаплоидных клеток// Биотехнология растений: культура клеток. М. Агропромиздат. 1989. 280с. С.45-47.

6. Калинина А.Ю. Изучение роли ауксина и ионов кальция в регуляции полярного роста и морфогенеза растений// Автореферат диссертации кандидата биологических наук. С.-Петербург. 2000. 17с.

7. Карпова Л.В. Физиологические особенности мужского гаметофита покрытосеменных растений на ранних этапах прорастания// Диссертация кандидата биологических наук. Москва. 1985. 152с.

8. Кине М., Сакс Р., Бернъе Ж. Физиология цветения. Том 3: Развитие цветков. М. .'Агропромиздат, 1991. 445с.

9. Ковалёва Л. В., Комарова Э. Н. Лектины проводниковой ткани столбика петунии и межклеточные взаимодействия в системе пыльца пестик// Доклады Академии Наук. 1994. Т.339. №2. С.279-280.

10. Ковалёва Л. В., Комарова Э. К, Выскребенцева Э.И. Спорофитно-гаметофитные взаимодействия в системе пыльца-пестик. 1. Лектины клеточных стенок// Физиология Растений. 1999. Т.46. №1. С.98-101.

11. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки. М.:Мир, 1976. 957с.

12. Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Физиология развития мужского гаметофита покрытосеменных растений (современные направления исследований)// Журнал общей биологии. 1999. Т.60. N.3. С.277-293.

13. Матвеева Н.П., Старостенко Н.В., Тукеева М.И., Андреюк Д.С., Блинцов А.Н., Ермаков И.П. Изменение пути развития микроспор табака под влиянием внеклеточных факторов, выделяемых in vitro// Физиология растений. 1998. Т.45. № 5. С.730-734.

14. Медведев С.С., Батов А.Ю., Мошков A.B., Маркова И.В. Роль ионных каналов в трансдукции ауксинового сигнала// Физиология растений, 1999. т.46. №5. С.711-717.

15. Нокс Р.Б. Пыльцевое зерно// Эмбриология растений т. 1. М.: Агропромиздат, 1990. 509с. С.224-317.

16. Резникова С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника// М.: Наука, 1984. 267с.

17. Трофимова М.С. Н+-АТФаза плазмалеммы как компонент рН-стата цитозоля изолированных протопластов// Физиология растений, 1993, Т.39. №1. С.5-15.

18. Трофимова М.С., Молотковский Ю.Г. Роль НС037 С1~ обмена в регулировании pH цитозоля// Физиология растений, 1993, Т.40. С.93-99.

19. Тукеева М.И., Матвеева Н.П., Дегасюк А.Н., Ермаков И.П. Изменение путей дыхания в процессе формирования пыльцевого зерна табака// Физиология растений. 1998. Т. 45, № 1. С. 43-47.

20. Тукеева М.И., Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Дыхание микроспор при индукции пыльцевого эмбриогенеза у табака// Физиология растений. 1994. Т. 41, № 6 С. 821-825.

21. Шишова М.Ф., Инге-Вечтомова Н.И., Выхвалов К.А., Рудашевская E.JI., Полевой В.В. Ауксинзависимый транспорт К+ и Са+ через мембрану везикул плазмалеммы клеток колеоптилей// Физиология Растений, 1998. Т.45. №1. С.79-85.

22. Шишова М.Ф. Мембранный механизм действия ауксина на растительные клетки// Автореферат диссертации доктора биологических наук. С.-Петербург. 1999. 49с.

23. Abeysekera R.M., Robarda A.W. Freeze-fracture artifacts: how to recognize and avoid them// Rapid freezing, freeze fracture and deep etching. Eds. N.J. Severs and D.M. Shotton. New York etc: Willey-Liss, 1995. P. 69-89.

24. Baldi B.G., Franceschi V.R., Loewus F.A. Localization of phosphorus and cation reserves in Lilium longiflorum pollen// Plant Physiol. 1987. V.83. P.1018-1021.

25. Bashe D., Mascarenhas J.P. Changes in Potassium Ion Concentration during Pollen Dehydration and Germination in Relation to Protein Synthesis// Plant Science Let. 1984. V.35. P.55-60.

26. Beffagna N., Romani G., Meraviglia G., Pallini S. Effects of abscisic acid and cytoplasmic pH on potassium and chloride efflux in Arabidopsis thaliana seedlings// Plant Cell Physiol. 1997. V.38. N.5. P.503-510.

27. Bednarska E. The effect of exogenous Ca ions on pollen grain germination and pollen tube growth// Sex. Plant Reprod. 1989. V.2. P.53-58.

28. Beeley J.G. Glycoprotein and proteoglycan techniques // Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. V. 16/ Amsterdam at el.:Elsevier. 1985. 462p.

29. Benito Moreno R.M., Macke F., Alwen A., Heberle-Bors E. In-situ seed production after pollination with in-vitro-matured, isolated pollen// Planta. 1988. V.176. P.145-148.

30. Bibikova T.N., Jacob T., Dahse I., Gilroy S. Localized changes in apoplastic and cytoplasmic pH are associates with root hair development in Arabidopsis thalianall Development. 1998. V.125. P.2925-2934.

31. Buttgereit F., Brand M.D., Muller M. ConA induced changes in energy metabolism of rat thymocytes// Bioscience Reports. 1992. V.12. N.2. P.109-114.

32. Capkova V., Hrabetova E., Tupy J. Protein changes in tobacco pollen culture; a newly synthesized protein related to pollen tube growth// J. Plant Physiol. 1987. V.130.N.4-5. P.307-314.

33. Capkova-Balatkova V., Hrabetova E., Tupy J. Effect of cycloheximide on pollen of Nicotiana tabacum in culture// Biochem. Physiol. Pflanzen. 1980. V.175. P.412-420.

34. Carratu G., Giannattasio M. Lectin activity in pollen from plants representative of thirty orders of spermatophyta// Sex. Plant Reprod. 1990. V.3. P.35-40.

35. Chrispeels M.J., Crawford N.M., Schroeder J.I. Proteins for transport of water and mineral nutrients across the membranes of plant cells// Plant Cell. 1999. V.ll. P.661-675.

36. Clement C., Burrus M., Audran M. Floral organ growth and carbohydrate content during pollen development in Lilium//Am. Journ. Bot. 1996. V.83. № 4. P.459-469.

37. Clement C., Laport P., Audran J.C. The loculus content and tapetum during pollen development in Liliumll Sexual Plant Reproduction. 1998. V.11.N.2. P.94-106.

38. Crawford N.M. Nitrate: nutrient and signal for plant growth// Plant Cell. 1995. V.7. P.859-868.

39. Crawford N.M., Glass A.M.D. Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants// Trends in Plant Sci. 1998. Y.3. N.10. P.385-395.

40. Dumas C., Knox R.B., Gaude T. Pollen-pistil recognition: new concepts from electron microscopy and cytochemistry// Intern. Rev. Cytol. V. 90. Orlando etc.: Acad. Press, 1984. P.239-272.

41. Eady C., Lindsey K., Twell D. The significance of microspore division and division symmetry for vegetative cell-specific transcription and generative cell differentiation// Plant Cell. 1995. V.7. N.l. P. 65-74.

42. Faure J.F., Aldon D., Rougier M., Dumas C. Emerging data on pollen tube growth and fertilization in flowering plants// Protoplasma. 1996. V. 193. № 1-4. P.132-143.

43. Feijo J.A., Malho R., Obermeyer G. Ion dynamics and its possible role during in vitro pollen germination and tube growth// Protoplasma. 1995. V.187. P.155-167.

44. Flowers T.J., Lauchli A. Sodium versus potassium: substitution and compartmentation// Encycl. of Plant Physiology. Inorganic Plant Nutrition. New ser. V.15B/ Eds Zauchli A., Bielski R.L. Berlin etc.: Springer-Verlag, 1983. 870p. P.651-681.

45. Fowler J.E., Quatrano R.S., Plant cell morphogenesis plasma membrane interactions with the cytosceleton and cell wall// Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1997. V.13. P.697-743.

46. Franklin-Tong V.E. Signaling and the modulation of pollen tube growth// Plant Cell. 1999. V.ll. N.4. P.727-738.

47. French J., Stelzer R., Steudle E. NaCl uptake in roots of Zea mays seedlings: comparison of root pressure probe and EDX data// Annual Botany. 1992. V.70. P.543-550.

48. Fricke W., Flowers T.J. Control of leaf elongation in barley. Generation rates of osmotic pressure and turgor, and growth-associated water potential gradients// Planta. 1998. V.206. P.53-65.

49. Fricker M.D., White N.S., Obermeyer G. pH gradients are not associated with tip growth in pollen tubes of Lilium longiflorum!f J. Cell Sci. 1997. Y.l 10 Part. 15. P. 1729-1740.

50. Geitmann A., Cresti M. Ca channels control the rapid expansions in pulsative growth of Petunia hibrida pollen tubes// Plant Physiol. 1998. V.152. N.4-5. P.439-447.

51. Gilroy S. Fluorescence microscopy of living cells// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V.48. P.165-190.

52. Goodner B., Quatrano R.S. Fucus embryogenesis: a model to study the establishment of polarity// Plant Cell. 1993. V.5. P.1471-1481.

53. Guern J., Mathieu Y., Pean M., Pasquier C., Beloeil L.-C., Lallemand J.~ Y. Cytoplasmic pH regulation in Acer pseudoplatanus cells. 1. A 31P NMR description of acid-load effects// Plant Physiol. 1986. V.82. N.3. P.840-845.

54. Harling H., Czaja I., Schell J., Walden R. A plant cation-chloride co-transporter promoting auxin-independent tobacco protoplast division// EMBO J. 1997. V.16. N.19. P.5855-5866.

55. Haugland P. Handbook of fluorescent probes and research chemicals. Leiden: Molecular Probes Inc, 1996. 670 p., P.553

56. Heberle-Bors E. Isolated pollen culture in tobacco: plant reproductive development in a nutshell// Sex Plant Reprod. 1989. V.2. P. 1-10.

57. Heberle-Bors E., Stoger E., Touraev A., Zarsky V., Vicente O. In vitro cultures: progress and perspectives// Pollen biothechnology. London: Chapman & Hall, 1996. P. 85-109.

58. Herpen M.M.A., van, Groot P.F.M., de, Schrauwen J.A.M., Heuvel K.J.P.T., van den, Weterings K.A.P., Wullems G.J. In vitro culture of tobacco pollen: gene expression and protein synthesis// Sex. Plant Reprod. 1992. V. 5. № 4. P. 304-309.

59. Hesketh T., Moore J., Morris J.D., Taylor M. V., Rogers J., Smith G.A., Metcalfe J.C. A common sequence of calcium and pH signals in the mitogenic stimulation of eucaryotic cells// Nature, 1985. V.313, P.481-484.

60. Heslop-Harrison J. Pollen germination and pollen tube growth// Int. Rev.Cytol. 1987. V.107. P.l-78.

61. Heslop-Harrison J., Heslop-Harrison Y, Reger B.J., Anther filament extension in Lilium: potassium ion movement and some anatomical features//Annals of Botany, 1987, V.69, N.5, P.505-515.

62. Heslop-Harrison J., Heslop-Harrison Y., Shivanna K.R. The evaluation of pollen quality, and further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure//Theor. Appl. Gen. 1984. V.67. P.367-375.

63. Heslop-Harrison J., Reger B.J. Chloride and Potassium Ions and Turgidity in the Grass Stigma// J. Plant Physiol. 1986. V.124. P.55-60.

64. Hesse M. Cytology and morphogenesis of pollen and spores// Progress in Botany. 1995. V.56. P.33-55.

65. Hodson M.J. Ion localization and x-ray microanalysis// Methods in plant cell biology, Part A. Eds. D.W. Galbraith, H.J Bohnert, D.P. Bourque. San-Diego etc: Academic Press, 1995. P.21-32.

66. Hoestra F.A. Mitochondrial development and activity of binucleate and trinucleate pollen during germination in vitro// Planta. 1979. V.145. P.25-36.

67. Hoestra F.A., Bruinsma J. Control of respiration of binucleate and trinucleate pollen under humid conditions// Physiologia Plantarum 1980. V. 48. P.71-77.

68. Hoffmann B., Plaenker R., Mengel K. Measurements of pH in the apoplast of sunflower leaves by means of fluorescence// Physiologia Plantarum. 1992. V.84. N.l. P.146-153.

69. Johannes E., Crofts A., Sanders D. Control of CP efflux in Char a corallina by cytosolic pH, free Ca++, and phosphorylation indicates a role of plasma membrane anion channels in cytosolic pH regulation//Plant Phisiol. 1998. V.118. P.173-181.

70. Kapur A., Malik C.P., Dhawan A.K. Nitrate assimilation in Crotalaria juncea (Linn.) pollen suspension culture// Plant & Cell Physiology, 1978, v.19, N4, p. 685-689.

71. Koike S., Hayashi T., Yamaguchi T., Suzuki K. Chilling injury during microsporogenesis in lily//Plant Physiol. 1997. V.114. N.3. P.242.

72. Koltunow A.M., Truettner J., Cox K. H., Wallroth M., Goldberg R.B. Different Temporal and Spatial Gene Expression Patterns Occur during Anther Development. //Plant Cell. 1990. V.2. P. 1201 1224.

73. Kropf D., Bisgrove S.R., Habl W.E. Establishing a growth axis in fucoid algae// Trends in Plant Sci. 1999. V.4. N.12. P.490-494.

74. Kurkdjian A., Guern J. Intracellular pH: measurement and importance in cell activity// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1989. V.40. P.271-303.

75. Kyo M., Harada H. Control of the developmental pathway of tobacco pollen in vitro//Planta. 1986. V.168. P.427-432.

76. Lanzagorta J.M., de la Torre C., Aller P. The effect of butirate on cell cycle progression in Allium cepa root meristem// Physiologia Plantarum, 1988. V.72.N.4. P.775-781.

77. Lapous D., Mathieu Y., Guern J., Lauriere C. Increase of defense gene transcripts by cytoplasmic acidification in tobacco cell suspensions// Planta. 1998. V.205. P.452-458.

78. Leigh R.A., Wyn Jones R.G. A hypothesis relating critical potassium concentrations for growth to the distribution and function of this ion in the plant cell// New Phytol. 1984. V.97. №1. P. 1-13.

79. Leigh R.A., Storey R. Intercellular compartmentation of ions in barley leaves in relation to potassium nutrition and salinity// J. Exp. Bot. 1993. V.44. P.755-762.

80. Lechene C. Electron probe microanalysis of picoliter liquid samples// In: Microprobe analysis as applied to cells and tissues/ Eds. T. Hall, P. Echlin, R. Kaufmann. London et al.: Academic Press. 1974. 43 5p.

81. Lechene C., Warner R.R. Electron probe analysis of liquid droplets// In: Microbeam Analysis in Biology/ Eds. Lechene C.P., Warner R.R. NY et al.:Acad. Press. 1979. 672p.

82. Lhuissier F., Verdus M.C., Labulle B., Lefebvre F., Bocquel C., Ripoll C. SIMS investigation of the distribution of K+, Na+, Mg2+, and Ca2+ cations in birch pollen// Botanica Acta. 1997. V.l 10. N.5. P.378-387.

83. Li Q., Fritz E., Tianqing L., Huetermann A. X-Ray microanalysis of ion contents in roots of Populus maximowiczii grown under potassium and posphorus deficiency// J. Plant Physiol. 1991. V. 138. N.2. P.180-185.

84. Maathuis F.J.M., Ichida A.M., Sanders D., Schroeder J.I. Roles of higher plant K+ channels// Plant Physiology, 1997. V.l 14. P. 1141-1149.

85. Malone M, Leigh R.A., Tomos A.D. Concentrations of vacuolar inorganic ions in individual cells of intact wheat leaf epidermis// J. Exp. Bot. 1991. V.42. P.305-309.

86. Marshner H. General introduction to the mineral nutrion of plants// Encycl. of Plant Physiology. Inorganic Plant Nutrition. Newser. V.l 5 A/ Eds Pierson A., Zimmermann M.H. Berlin etc.: Springer-Verlag, 1983. 870p. P.5-61.

87. Marshner H. Mineral nutrition of higher plants. London etc.: Academic Press, 1995. 889 p.

88. Mathieu Y., Guern J., Pean M., Pasquier C., Beloeil J.C., Lallemand J.Y. Cytoplasmic pH regulation in Acerpseudoplataneus cells// Plant Physiol. 1986. V.82. P.846-852.

89. Mathieu Y., Lapous D., Thomine S., Lauriere C., Guern J. Cytoplasmic acidification as an early phosporilation dependent response of tobacco cells to elicitors//Planta. 1996. V.199. P.416-424.

90. McCormick S. Male gametophyte development//Plant Cell. 1993. V.5. N.10. P.1265-1275.

91. Mcintyre J.I. The role of nitrate in the osmotic and nutritional control of plant development// Austr. J. Plant Physiol. 1997. V.24. N.2. P.103-118.

92. Messerli M., Robinson K.R. Tip localized Ca pulses are coincident with peak pulsatile growth rates in pollen tubes of Lilium longiflorum// J.Cell Sci. 1997. V.110. P.1269-1278

93. Messerli M., Robinson K.R. Cytoplasmic acidification and current influx follow growth pulses of Lilium longiflorum pollen tubes// Plant J. 1998. V.16. N.l. P.87-91.

94. Moorby J., Besford R.T. Mineral nutrition and growth// Encycl. of Plant Physiology. Inorganic Plant Nutrition. New ser. V.15B/ Eds Zauchli A., Bielski R.L. Berlin etc.: Springer-Verlag, 1983. 870p. P.481-527.

95. Murashige T., Skoog E. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures// Physiol. Plant. 1962. V.15. P.473-497.

96. Murphy R., Smith J.A.C. Determination of cell water-relation parameters using the pressure probe: extended theory and practice of the pressure-clamp technique// Plant Cell and Environment. 1998. V.27. N.7. P.637-657.

97. Nakanishi T.M., Matsumoto S. Element distribution of Na, Mg, P, CI, K, Ca and Mn in barley leaves//Radioisotopes. 1991. V.40. P. 107-111.

98. Nakashima H., Majewska-Sawka A., Shimamoto Y. Application of X-ray microanalysis to plant tissues examination. 1. Sugar beet anther and pollen// Proc. Japan. Soc. Sugar Beet Technol. 1990. V.32. P. 125-128.

99. Nitsch J.P. Deux especes photoperiodiques de jours courts: Plumbago indica L. et P. zeylanica L.//Bull. Soc. Bot. Fr. 1965. V.l 12. N.9. P. 517522.

100. Obermeyer G., Klaushofer H., Nagl M., Hoeftberger M., Bentrup F.W. In-vitro germination and growth of lily pollen tubes is affected by protein phosphotase inhibitors// Planta. 1998. V.207. P.303-312.

101. Obermeyer G, Kriechbaumer P, Stras s er D, Maschessnig A, Bentrup FW. Boric acid stimulates the plasma membrane H^-ATPase of ungerminated lily pollen grains// Physiol Plant. 1996. V.98. N.2. P.281-290.

102. Obermeyer G., Luetzelschwab M., Heumann H.G., Weisenseel M.H. Immunolocalization of H^-ATPases in the plasma membrane of pollen grains and pollen tubes of Lilium longiflorum// Protoplasma. 1992. V.171 P.55-63.

103. Oldenhof M.T., Groot P.F.M., de, Visser J.H., Schrauwen J.A.M., Wullems G.J. Isolation and characterization of a microspore-specific gene from tobacco// Plant Mol. Biol. 1996. V.31. N.2. P.213-225.

104. Pruitt R.E. Complex sexual signals for the male gametophyte// Curr.Opin.Plant Biol. 1999. V.2. N.5. P.419-422.

105. Raghavan V. Manipulation of pollen grains for gametophytyc and sporophytic types of growth// Methods in plant cell biology, Part A. Eds. D.W. Galbraith, H.J Bohnert, D.P. Bourque. San-Diego etc: Academic Press, 1995. P.367-375.

106. Rihova L., Capkova V., Tupy J. Changes in Glycoprotein Patterns Associated with Male Gametophyte Development and with Induction of

107. Pollen Embryogenesis in Nicotiana tabacum L.// J. Plant Physiol. 1996. V.147. P.573-581.

108. Roos A., Boron W.F. Intracellular pH// Physiol. Rev. 1981. V.61. N.2 P.296-434.

109. Sakano K. Revision of biochemical pH-stat: involvement of alternative pathway metabolisms/ZPlant Cell Physiol. 1998. V.39. N.5. P.467-473.

110. Sanders D., Brownlee C., Harper J.F. Communicating with calcium// Plant Cell. 1999. V.l 1. N.4. P.691-706.

111. Scheible W.-R, Gonzalez-Fontes A., Lauerer M. et al. Nitrate acts as a signal to induce organic acid metabolism and repress starch metabolism in tobacco//Plant cell. 1997a. V.9. N.5. P.783-798.

112. Schrauwen J.A.M., Groot P.F.M., de, Herpen M.M.A., van et al. Stage-related expression of mRNAs during pollen development in lily and tobacco//Planta. 1990. V.l82. N.2. P.298-304.

113. Scott R, Hodge R., Paul W., Draper J. The molecular biology of anther differentiation//Plant Science. 1991. V.80. N.l, 2. P. 167-191.

114. Serrano R. Structure and function of plasma membrane ATPase// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1989. V.40. P.61-94.

115. Severs N.J., Newman T.M., Shotton D.M. A practical introduction to rapid freezing techniques// Rapid freezing, freeze fracture and deep etching. Eds. N.J. Severs and D.M. Shotton. New York etc: Willey-Liss, 1995. P.31-51.

116. Soutkworih D. Lectins stimulate pollen germination// Nature. 1975. V.258. P.600-601.

117. Southworth D. pH changes during pollen germination in Lilium longifloruml7 Pollen: Biology and Implication for Plant Breeding./ Eds. D.L. Mulcahy, E. Ottaviano. 1983. P.61-65.

118. Stanley R. G. Pollen chemistry and tube growth// Pollen: development and physiology./ Ed. J. Heslop-Harrison. London: Butterworths, 1971. P. 131156.

119. Stanley R.G., Linskens H.F. Pollen: biology, biochemistry, management. Berlin etc: Springer-Verlag, 1974. 307p.

120. Storchova H., Capkova V., Tupy J. A Nicotiana tabacum mRNA encoding a 69-kDa glycoprotein occurring abundantly in pollen tubes is transcribed but not translated during pollen development in the anthers// Planta. 1994. V. 192. № 3. P. 441-445.

121. Sunderland N., Huang B., Hills G.J. Disposition of pollen in situ and its relevance to anther/pollen culture// Journal of Experimental Botany. 1984. V. 35. N.153. P.521-530.

122. Sze H, Li X., Palmgren M.G. Energization of plant cell membranes by if -pumping ATPases: regulation and biosynthesis//The Plant Cell. 1999. V.ll. P.677-689.

123. Taylor A., Brownlee C. Calcium and potassium currents in the Fucus egg//Planta. 1993. V.189. P. 109-119.

124. Taylor L., Hepler P. Pollen germination and tube growth//Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V.48. P.461-491.

125. Tomos A.D., Leigh R.A., Shaw C.A., et al. A comparison of methods for measuring turgor pressures and osmotic pressures of cells of red beet storage tissue//J. Exp. Bot. 1984. V.35. N.160. P.1675-1683.

126. Tramontano W.A., DeLillo A.R., Yung S.Y., Natarajan C., Kearns C.M. Short-chain fatty-acid-induced effects on the cell cycle in root meristem of Pisum sativum!! Physiologia Plantarum, 1991. V.82. P.79-84.

127. Trewavas A. Le calcium, C'est la vie: calcium makes waves// Plant Physiol. 1999. V.120. N.l. P.l-6.

128. Tupy J., RihovaL., Capkova V.,Zarsky V. Differentiation and Maturation of Tobacco Pollen in situ and in Suspension Culture// Angiosperm Pollen and Ovules/ Eds Ottaviano E. et al. N.Y.: Springer-Verlag, 1992. P.309-314.

129. Tupy J., Rihova L., Zarsky V. Production of fertile tobacco pollen from microspores in suspension culture and its storage for in situ polination// Sex Plant Reprod. 1991. V.4. P.284-287.

130. Tupy J., Suss J., Hrabetova E., Rihova L. Developmental changes in gene expression during pollen differentiation and maturation in Nicotiana tabacum LJ/ Biol. Plant. 1983. V. 25. N.3. P.231-237.

131. Twell D. Molecular and cellular aspects of plant reproduction//Society for Experimental Botany Seminar Series 55/ Eds. Scott R.J., Stead A.D. Cambridge University Press, 1994, P.83-135.

132. Tyerman S.D. Anion channels in plants// Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1992. V.43. P.351-373.

133. Vanlerberghe G.C., Mcintosh L. Alternative oxidase: from gene to function// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V.48. P.703-734.

134. Vanlerberghe G.C., Mcintosh L., Yip J.Y.H. Molecular localization of redox modulated process regulating plant mitochondrial electron transport//Plant Cell. 1998. V.10. N.9. P. 1551-1560.

135. Van Steveninck R.F.M., van Steveninck M.E. Ion localization// Electron microscopy and cytochemistry of plant cells. Ed. J.L. Hall. Elsevier: North-Holland Biomedical Press, 1978. P.188-229.

136. Vasil IK. Physiology and culture of pollen// Int. Rev. Cytol. V. 107. Orlando etc.: Acad. Press, 1987. P. 127-174.

137. Vergne P., Delvallee I., Dumas C. Rapid assessment of microspore and pollen development stage in wheat and maize using DAPI and membrane permeabilization//Stain Technol. 1987. V.62. P.299-304.

138. Vicente O., Benito Moreno R.M., Heberle-Bors E. Pollen cultures as a tool to study plant development// Cell Biol. Rev. 1991. V.25. P.295-305.

139. Walker D.J., Smith S.J., Miller A.J. Simultaneous measurement of intracellular pH and K+ or NO3" in barley root cells using triple-barreled, ion-selective microelectrodes//Plant Physiol. 1995. V.108. N.2. P.743-751.

140. Walker D.J., Leigh R., Miller A.J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V.93. P. 10510-10514.

141. Walker D.J., Black C.R., Miller A.J. The role of cytosolic potassium and pH in the growth of barley roots// Plant Physiol. 1998. V. 118. P.957-964.

142. Ward J.M., Pei Z.M., Schroeder J.I. Roles of ion channels in initiation of signal transduction in higher plants// Plant Cell. 1995. V.7. N.7. P.833-844.

143. Weber L.A., Hickey E.D., Maroney P. A., Baglioni C. Inhibition of protein synthesis by C17/ J. Biol. Chem. 1977. V.252. P.4007-4010.

144. Webster C., Kim C.Y., Roberts J.K.M. Elongation and termination reactions of protein synthesis on maize root tip polyribosomes studied in a homologous cell-free system//Plant Physiology. 1991. V.96. P.418-425.

145. Wilson C., Voronin V., Touraev A., Vicente O., Heberle-Bors E. A developmentally regulated MAP kinase activated by hydration in tobacco pollen// Plant Cell. 1997. V.9. N. 11. P.2093-2100.

146. Wyn Jones R.G., Pollard A. Proteins, Enzymes and Inorganic Ions// Encycl. of Plant Physiology. Inorganic Plant Nutrition. New ser. V.15B/ Eds Zauchli A., Bielski R.L. Berlin etc.: Springer-Verlag, 1983. P.528-562.

147. Zimmermann S., Sentenac H. Plant ion channels: from molecular structures to physiological functions// Curr. Opin. Plant Biol. 1999. V.2. P.477-482.