Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лазерная доплеровская диагностика нестационарной гемодинамики в биологических объектах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Лазерная доплеровская диагностика нестационарной гемодинамики в биологических объектах"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

Физический факультет

На правах рукописи УДК 577.353:567.322

ЛАЗЕРНАЯ ДОПЛЕРОПСКАЯ ДИАГНОСТИКА НЕСТАЦИОНАРНОЙ ГЕМОДИНАМИКИ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Специальность: 03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации па соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1996

. Работа выполнена па кафедре общей физики и волновых процессов • физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор 10.М.Романовский,

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор А.Н.Тихонов

доктор медицинских наук, профессор В.И.Козлов

Ведущая организации: Саратовский государственный университет

им Н.Г.Чернышевского, г.Саратов

Защита состоится 14 и " 1996 года в I часов в аудитории

на заседании специализированного совета № 3 ОФТТ (шифр - К.053.05.77) в МГУ им. М.В.Ломоносова.

Адрес: 119899, ГСП, г.Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета

МГУ.

«яг. ; |

Автореферат разослан

Ученый < екретарь диссертационного совет; канлида! фи.).-мат. наук

О.А.Ко|слышкоиа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Функционирование большинства живых объектов неразрывно связано с нестационарными процессами переноса жидкостей и,в частности, крови. Кровеносная система позвоночных выполняет разнообразные функции, непосредственно связанные с физиологическим состоянием организма. Изучение структуры и параметров кровеносных потоков in vivo, их зависимости от внешних физических факторов, является сложной задачей биофизики. Она требует разработки специальных методов, с одной стороны, дающих количественную информацию в реальном времени эксперимента, а с другой - исключающих повреждения ткани живого организма и не вносящих изменений в поток.

Наиболее приемлемыми для подобных экспериментов являются оптические и, в том числе, лазерные методы исследования, в частности, лазерная доплеровская микроскопия (ЛДМ), основанная на регистрации доплеровских сдвигов частоты лазерного излучения, рассеянного движущимися частицами (эффект Доплера). Метод ЛДМ отличает быстрота получения информации (доли секунды), высокое пространственное разрешение (до 3 мкм), возможность количественных измерений скорости в ироцссе относительно нормальной жизнедеятельности организма.

Со времени первых измерений скорости кровотока, выполненных в 1972 году Маедой, Фуджиме и Ривой лазерные доплеровскне измерители скорости стали применяться в различных областях биологии и медицины. Тем не менее до настоящего • времени корректные измерения количественных характеристик пульсирующего кровотока в отдельных мнкрососудах tn vivo представляет собой сложную проблему. Вместе с тем существует большое число задач, в которых необходимо не только получать оценки среднего значения скорости, по н проводить мониторинг се изменений в живом объекте в реальном времени. Это обстоятельство и мотивировало наши исследования.

Основная цель работы

Основной целью настоящей работы являлась отработка методики измерения и мониторинга методом ЛДМ параметров нестационарного кроъигока в одиночных микрососудах биологических объектов, исследование основных тенденций их изменения вследствие действия па организмы животных (три вида костистых рыб, а также крыс) различных физических факторов, температура, свет, введение » кровеносную систему молекул полимера.

Основные задачи данной работы состояли в следующем:

1. Провести методические эксперименты по высоколокальным измерениям скоростей и профилей скоростей направленных потоков суспензии эритроцитов в тонких стеклянных капиллярах.

2. Разработать методику проведения экспериментов с биологическими объектами in vivo.

3. Получить доплеровские спектры и выполнить измерения динамики скоростей в артериолах, венулах и капиллярах брыжейки крыс.

4. Изучить гемодинамическис последствия введения н систему кровообращения теплокровного животного высокомолекулярного линейного полимера.

5. Провести анализ доплеровских спектров от/нестационарных потоков, крови в эмбрионах рыб с периодом пульсаций порядка 1 сек.

6. Исследовать зависимость средней скорости кровотока,в Эмбрионах И личинках различных видов рыб от. фазм н.ч-развития.

7. Определить зависимости параметров кровотока от параметров светового облучения

и изменения температуры окружающей среды.

Новизна работы

• С' помощью знакочувствителыюго ЛД микроскопа получены профили скоростей 'течения суспензии эритроцитов в тонких капиллярах при высоколокальных

измерениях.

• Разработаны оригинальные методики доплеровских измерений скорости и мониторинга кровотока в микрососудах биологических объектов.

• Впервые ' методом ЛДМ проведены эксперименты по определению гидродинамических последствий введения высокомолекулярного линейного полимера в систему кровообращения крыс на уровне микрососудов брыжейки.

• Впервые определены динамические характеристики кровотока в процессе онтогенеза трех видов рыб.

• Впервые получены количественные данные о влиянии облучения эмбрионов рыб светом на постэмбриопальнос состояние кровеносных потоков.

Научная и практическая ценость работы связана со следующими основными

результатами:

• Показана эффективность применения метода ЛДМ для получения количественной информации о параметрах кровотока в отдельных микрососудах эмбрионов рыб и брыжейки крыс и о влиянии на кровоток внешних физических факторов.

• С помочью ЛДМ с высоким пространственным и временным разрешением были зарегистрированы скорости кровотока в микрососудах теплокровного животного и впервые было -установлено ее возрастание в артериолах под влиянием

, полиэтиленоксида, введенного в кровь.

• Была исследована динамика кровотока эмбрионов трех видов рыб методом ЛДМ. Измерены скорости кровотока в течение первых семи дней с момента начала кровообращения и до времени перехода эмбрионов на внешнее питание.

• Показано, что изменение скоростей кровеносных потоков в процессе развития эмбриона проходит несколько этапов, которые можно отделить один от другого

' по изменению скорости кровотока.

• На стадии дробления облучение разными длинами воли приводит к различным эффектам, чего не наблюдается при облучении на более поздних стадиях развития. Облучение непосредственно области сердечной мышцы личинок рыб синим светом приводит к кратковременному уменьшению частоты пульсаций, тогда как при облучении другими длинами волн такого эффекта не наблюдается.

Положения, выносимые на защиту:

• Разработанные методики проведения экспериментов позволяют с хорошей точностью регистрировать в реальном времени изменения скоростей кровеносных потоков в единичных микрососудах.

• Результаты, полученные при измерении средних . скоростей кровотока в артериолах, капиллярах и венулах брыжеек крыс хорошо согласуются с литературными данными.

• Данные, полученные при изучении влияния введения высокомолекулярного линейного полимера полиэтиленоксида в кровеносную систему, позволяют сделагь вывод о том, что данное вещество влияет на структуру потока и приводит о снижению рсзнстишюстн артериол, тогда как существенных изменений кровотока и канлнлярах и венулах не наблюдается.

г

• Проведенное сравнение доз, требующихся для достижения 20% увеличения скорости ' кровотока в артернолах (с параллельным уменьшением среднего артериального давления на 10%) в группах нормотензивных и спонтанно гипертензивных крыс показало, что сравнимые с контрольными изменения параметров у последних наблюдаются при более коротком времени щъекции и, следовательно, при лозах препарата почта в два раза меньших.

• Предложенные алгоритмы экспериментов с эмбрионами и личинками костистых рыб позволяют получать воспроизводимые результаты при сравнительном изучении развития кровеносной системы и се отклика на внешние физические воздействия.

• Различия, найденные в скоростях кровотока в процессе онтогенеза, отражают морфо-фуикциональные изменения в сердечно-сосудистой системе эмбрионов. В этом аспекте количественные характеристики потоков, полученные п наших экспериментах, связаны с реальными процессами, происходящими в организме. Изменения ритмической активности сердечной мышцы, имеющие одинаковые динамические характеристики у исследованных нами видов рыб, достоверны и отражают смену физиологических процессов в раннем онтогенезе.

• Данные, полученные при сравнительном изучении характера действия лазерного излучения на развитие кровеносной системы, показывают, что облучение в течение 1, 2 или 3-х часов излучением He-N'c (Х=632.8 им, Р=8 мВт/см2 ) и Аг (Х=514.5 пм, Р=8 мВт/см2 ) лазеров приводит к увеличению средней скорости кровотока и частоты пульсаций, тогда как такое же облучение в течение более чем 3-4-х часов приводит к неоднозначной реакции (в зависимости от стадии развития, во время которой проводилось облучение, от дня развития, ви-а рыб наблюдаются реакции либо дальнейшей стимуляции, либо ингибирования данных параметров кропотока).

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации опубликованы в 16-ти печатных работах и докладывались и обсуждались на 12-ти конференциях и семинарах: Российская молодежная ассамблея "Молодежь и здоровье" (Саратов, 1992), 4-oii Международной конференции "Laser Applications in Life Sciences" (Еваскула, Финляндия, 1992), 6-й Международной конференции ECIS/EÍuropean Colloid and Interface Society (Грац, Австрия, 1992), конференции "Quantification and Localization Using Diffuse Photons in a Highly Scattering Medium" (Будапешт, Венгрия, 1993), конференции "Cell and Biotissue Optics" (Саратов, 1994), 3-ей международной конференции "Optics Within Life Science" (Токио, Япония, 1994), международных конференциях: "Static and Dynamic Light Scattering in Medicine and Biology" (Лос-Анжелес, США, 1993), "Optical Diagnostics of Blood and Blood Components" (Лос-Анжелес, США, 1994), международном симпозиуме BiOS Europe'94 (Лилль, Франция, 1994), "Biological Effects of Low-Energy Laser Irradiation" (Сан-Хосе, США, 1995), международной конференции ICONO'95 (Санкт-Петербург, 1995), конференции "Optical Diagnostics of Biological Fluids" (Сан-Хосе, США, 1996), конференции "Биомеханика'96. Теоретические аспекты морфогенеза" (Москва, 1996).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения и списка литературы. Диссертация изложена на//0страпицах, содержите/рисунков, 8 таблиц. Список литературы пключает /^наименований.

■ Во введении приведены характеристики крови как оптической рассеивающей среды, проведен сравнительный анализ различных методов диагностики потоков крови в модельных капиллярах и микрососудах живых организмов, обсуждаются особенности применения метода ЛДМ для решения задач гемодинамики, дана краткая характеристика исследуемых проблем, поставлены цели работы и сформулированы задачи исследования.

Глава 1 является обзорной. В ней рассмотрены принципы и основные положения метода ЛДМ, показана эффективность его использования в медикобиологичсских исследованиях.

Получаемая данным, методом информация о скорости является усредненной по объему измерительной области и, следовательно, по всем частицам, находящимся в данной области. По виду спектра сигнала фотоприемника можно сулить о значении средней и наиболее вероятной скорости рассеивателей, характере движения частиц, величине градиента скорости.

К преимуществам метода ЛДМ при работе с биологическими объектами можно отнести:

• бесконтактность;

• неинвазивность (при используемых плотностях мощности зондирующего излучения и типичном времени измерения не нарушаются физиологические функции отдельных органов и всего организма);

• достаточно широкий диапазон измерений скорости;

• быстроту получения результатов;

• регистрацию скорости всех, а не только крупных, видимых частиц;

• высокое пространственное и временное разрешение;

• относительная- простота и доступность.

Возможность регистрации потоков в живых объектах впервые была обоснована в 1972 году, когда Riva et al. получили доплеровский сигнал от потоков крови в регинальных сосудах (венах и артериях Диаметром 120 мкм и более) кролика и человека. Такое пространственное разрешение было не достаточным для решения многих задач биофизики подвижности и гемодинамики. Совмещение ЛД спектрометра с достижениями современной техники микроскопии позволило сохранить все преимущества метода и применить его к изучению движения различных биологических микрообъектов (внутриклеточных органелл, микроорганизмов, потокам крови в капиллярах) и уменьшить измерительный объем -область, из которой собирается рассеянное излучение, а, следовательно, и вся информация о динамике частиц.

При разработке нашего ЛД микроскопа стремились максимально, расширить область применения прибора. Наша установка позволяет регистрировать не то." ко профили скоростей потоков биологических жидкостей, но.и знак скорости, что является крайне важным для работы с реальными объектами.

Установка является универсальной в смысле достаточно простой адаптации к изучению различных биологических объектов. В то же время сохранены все преимущества ' метода ЛДМ. При решении задач данной диссретации были разработаны новые модули для проведения экспериментов с животными: термостатированная приставка к предметному столику с перестраиваимой температурой для экспериментов с эмбрионами и личинками рыб, предметный столик с подогревом для измерений скоростей кровотока в брыжейках крыс.

При создании данного ЛДМ были учтены особенности работы с реальными объектами:

• минимальным линейный размер измерительного объема - - 5 мкм;

• максимальное временное разрешение - ~ 0.03 сек;

• широкий диапазон измерений скорости - 5 мкм/сек+1 мм/сек;'

• автоматизация эксперимента, позволяющая получать результаты в реальном времени;

• возможность регистрации не только модуля скорости, но и ее знака;

• возможность визуализации объекта, что облегчает юстировку и настройку прибора;

• возможность совмещения микроскопа с рядом различных заменяемых приставок: шаговым двигателем, видеокамерой и т.д.

Для отработки методики получения достоверной количественной информации о скоростях потоков и профилях скоростей потоков проведены модельные эксперименты in vitro, измерены профили коростсй течения суспензии человеческих эритроцитов (диаметр 7-8 мкм) в буферном растворе по тонкому плоскому стеклянному капилляру с внутренним вертикальным размером 200 мкм и горизонтальным размером 1.6 мм.

При сканировании поперечного сечения капилляра регистрировались доплеровские спектры с усреднением по 8-16 реализациям. В результате обработки получены профили схоростей движения эритроцитов в буферном растворе. С возрастанием скорости профиль несколько уплощается, что связано с проявлением неныотоповых свойств крови.

Погрешность измерения скорости в данных экспериментах составляет 5-6% от величины скорости, что характерно для ЛД спектрометров и соответствует стабильности модельных стационарных течений. При проведении измерений в реальных биологических объектах ошибка измерений возрастает до 10-"5% я зависимости от оптических свойств объектов.

По данной главе сделаны следующие выводы: » ЛДМ является весьма перспективным методом, позволяющим изучать движения в малых объемах и каналах (капилляры, клетки и т.д.) и проводить количественные воспроизводимые измерения скоростей и профилей скоростей движения рассеива. тих частиц с высокой точностью. > ЛД микроскоп, разработанный в нашей лаборатории, позвотясг решать задачи подвижности биологических .объектов и жидкостей in vivo.

Во второй главе приведены результаты исследований гемодинамических юследствий введения в систему кровообращения крысы небольших количеств зысокомолекулярного линейного полимера полиэтиленоксида POLYOX WSR-310 (в юнцентрании 10"®-10-5 г/мл).

Были измерены средние значения скорости кровотока, пульсирующего с |астотой порядка 350 Гц, до и после введения раствора полимера в артериолах, капиллярах и веиулах брыжеек крыс.

В гидродинамике с 1948 года известен т.н. "эффект Томса", заключающийся в шижении гидродинамического сопротивления потоку жидкости, текущей по жесткой грубс в турбулентном режиме, при введении в эту систему высокомолекулярных т!мейных полимеров.

Накопленные экспериментальные данные позволяют построить вполне >боспованную полуэмниричсскую теорию турбулентное™ разбавленных полимерных >астворов. Согласно этой теории характеристики турбулентного переноса в растворе шязаны со способностью юлскул разворачиваться и ориентироваться в управлениях растяжеиия, тем самым повышая локальную анизотропию и (иссипацию энергии в турбулентных выбросах, снижая их интенсивность и частоту.

Таким образом, в турбулентных потоках наблюдается эффект сниженш гидродинамического сопротивления полимерами (СГСП). При раздробление полимера на мелкие сегменты эффект не возникает.

Литературные данные свидетельствуют о том, что эффект СГСП п роя влете» также и в потоках с числами Рейнольдса, соответствующими ламинарному течению, но при наличии нестацирнарности.

Это позволяет предположить, что СГСП происходит благодаря изменению структуры потока, т.к. вязко-упругие свойства крови при этом не изменяются,

Нами были проведены первые экспериментальные серии измерений скорости кровотока в микрососудах брыжейкп крысы с использованием ЛД микроскопа. С точки зрения применения ЛДМ важно, что рассеивателями являются эритроциты, имеющие размеры 6-10 мкм, т.е. порядка размеров измерительного объема микроскопа. Полученные значения скорости кровотока (от 140 до 2300 мкм/с t артериолах с просветом 16.3±0.4 мкм) согласуются с имеющимися литературными данными.

Эффект СГСП изучался на сосудах с диаметром меньшим 100 мкм (прекаииллярные артсриолы, капилляры и венулы), которые вносят основной вклад в сопротивление системы кровообращения. В данных экспериментах задачей являлось измерение скорости кровотока в сосудах сопротивления в брыжейке крысы до н после введения полимера.

Раствор нолиэтиленоксида Polyox WSR-301 в концентрации 10"s г/мл i физиологическом растворе вводился в кровь крысы через югулярную вену в течение 1 минуты со скоростью 0.15 мл/мин с помощью автоматического шприца.

Для контроля системного эффекта СГСП в течение эксперимента параллельно регистрировалось системное артериальное давление из сонной артерии с помощью датчика мембранного тина.

Эксперименты проводились на крысах лшпш Wistar (ВК) (артериальное давление (АД) 10912 мм рт. ст.) Первой экспериментальной группе, состоявшей на 21 животного, вводился раствор нолиэтиленоксида. Скорость кровотока измерялась в среднем в 4-х сосудах у .каждого животного. Второй, контрольной группе, состоявшей из И крыс, вводился физиологический раствор. У этой группы скорость кровотока измерялась в среднем в 5-тн сосудах у каждой особн. Измерения скорости проводились в микрососудах, где фоновая скорости (скорость до инъекции) варьировалась в следующих диапазонах:

• в прекапиллярных артериолах от 137 мкм/с до 2283 мкм/с;

• в капиллярах от 150 мкм/с до 2380 мкм/с;

® в посткапиллярных венулах от 105 мкм/с до 2856 мкм/с; . . .

На ВК нами было показано, что при дозе в крови порядка 10"® - 10 7 г/мл полимер существенно увеличивает скорость кроротока в артериолах: - с 702±95 мкм/с до 10791155 мкм/с. Артеоиальнос давление при этом снижается с 10814 дс 9113 мм рт. ст., т.е. на 16%. Контрольные инъекции физиологического расгвора существенно не изменяли значений АД (llil3 мм рт. ст.) и скорости кровотока в артериолах (8951126 мкм/с). В капиллярах и посткапиллярных венулах реакция и? полимер неоднородна, но в среднем не отличается от контрольных данных.

Мы' исследовали влияние СГСП на скорость кровотока в норме и при гипертензии. Эксперименты проводил1 ь на ВК (число животных п=11), на крысах линии Wistar-Kyoto (ВКК) (АД 13612 мм рт. ст., п=5), и на спонтанна гинертензивных крысах с развитым заболеванием (СГК) (АД 19514 мм рт. ст., п=6). Крысы ВК и ВКК служили контролем для спонтанно гинертензивных крыс.

Было проведело сравнение доз, требующуюся для достижения 20% увеличения скорости кровотока в артериолах (с параллельным уменьшением АД на 10%) и

группах СГК и ВКК, являющихся наиболее адекватным для СГК контролем. Сравнимые с контрольными изменения регистрируемых параметров у' СГК наблюдали при более коротком времени инъекции полимера и, соответственно, при аоэах препарата почти в два раза меньших, чем те, что требовались для достижения аналогичного эффекта у ВКК. Эти результаты позволяют предположить, что снижение возросшего при гипс'^гснэии сопротивления кровотоку путем уменьшения е®змущений кровотока - перспективный путь коррекции заболевания.

В результате данных экспериментов было подтверждено, что СГС полимер РОЬУОХ \VSR-310 способен понижать гидродинамическое сопротивление в системах с фиксированными геометрическими параметрами, влияя исключительно на микроструктуру самого потока жидкости.

В главе 3 приведены результаты измерения скоростей потеков крови в эмбрионах рыб в процессе их развития. Исследовалась динамика кровотока эмбрионов трех видов рыб методом ЛДМ. Измерены скорости кровотока в течение первых семи дней с момента начала кровообращения и до времени перехода эмбрионов на внешнее питание.

Развитие сосудистой системы личинок. рыб достаточно хорошо изучено морфологически. Однако исследования ее функционального состояния на разных стадиях не проводились, т.к. все известные методы измерения скоростей (микросъемка с помощью' контактных объективов, компьютерная обработка изображений, ультразвуковой доплеровский метод и т.д.) либо очень трудоемки, либо не дают необходимого пространственного разрешения, либо не позволяют получать результаты непрерывно в реальном времени проведения эксперимента.

Кровоток на рапиих стадиях развития эмбрионов рыб характеризуется широким диапазоном изменения скоростей - О + 100 мкм/сек и достаточно быстрыми пульсациями скорости с периодом 0.6 + 2.0 сек у различных экземпляров.

Эмбрионы, достигшие подвижных стадий развития, перед экспериментом обрабатывали 1% раствором анестетика М3-222 за одну минуту до измерений для устранения подергиваний мускулатуры. В дальнейшем после проведения эксперимента к эмбрионам возвращалась первоначальная подвижность.

Измерения проводили, начиная с момента появления движущихся эритроцитов в хвостовых сосудах - артерии и вене, внутренний диаметр которых несколько больше диаметра эритроцитов, поэтому поток крови представляет собой последовательное движение эритроцитов в небольшом количестве плазмы с квазипериодическим изменением скорости.

Параметры пульсаций скорости различаются в зависимости от расположения и диаметра сосуда, а также от стадии развитая эмбриона. Разным фазам пульсаций соответствуют различные скорости и, следовательно, разные доплеровские спектры, регистрируемые * ходе экспериментов.

Установка позволяет варьировать временное разрешение последовательно записываемых доплеровских спектров. Наши эксперименты показали, что запись спектров с временным разрешением 0.03 сек и 0.06 сек обеспечивает наилучшее разрешение пульсаций скорости при максимальном отношении сигнал/шум. -Увеличение постоянной времени усреднения приводит к потере информации о форме периода пульсаций скорости.

Для обработки зависнув тей пульсаций скорости была написана программа на языке Турбо-Паскаль. Программа счисляет среднюю -корость кровотока, максимальную и минимальную скорости, затем выполняет быстрое преобразование Фурье полученной пульсациоипой кривой.

Фурье-анализ временных зависимостей скорости показал, что в большинстве случаев артериальный кровоток характеризуется одной основной 1армоникой, в то

.7

время как Фурье-спектр пульсаций венозного кровотока всегла содержит 5-7 значимых гармоник. Это является следствием продвижения крови по сосудам и, следовательно, возможно, следствием наложения на пульсацию сердечной мышцы иных ритмов оргаин.ма. Причины появления которых требуют дальнейших исследований. Здесь необходимо отмстить, что количество гармоник в спектрах пульсаций скорости кровотока не зависит от возраста эмбрионов и частоты пульсаций.

Мы исследовали динамику изменения скоростей кровотока в различные периодм онтогенеза. Предварительные исследования динамики скоростей иа макроподах СM.opercularis) показало, что она изменяется в процессе развития регулярно у различных особей. Нами были выбраны три вида рыб (М.operations, M.fossilis и D.rerio) с различной морфологией кровносной системы, различными местами обитания и различной скоростью эмбрионального и онтогенетического развития.

В каждом эксперименте использовали икру от пары производителей. Для М. opercularis икру брали из гнезда по 3 икринки. Для каждого эксперимента с D.rerio брали по 10 икринок, для M.fosstlis использовали 40 икринок, полученных в результате искусственного оплодотворения.

Измерения скоростей кровотока у каждого из трех видов проводили регулярно и одно и тоже время суток. Результаты измерения скоростей кровотока в артериальных сосудах различных видов рыб показаны на рис.1.

Средний период иульсаций при измерениях в нормальных условиях на стадии появления эритроцитарного кровообращения для M.opercularis составляет 0.46 ± 0.02 сек, wix M.fossilis - 1.00 ± 0.04 сек и для D.rerio - 0.69 1 0.03 сек. Как можно видеть, средний период пульсаций у тепловодных рыб (рис.1.а,с) меньше, чем у холодноводных M.fossilis (рис. 1,6).

Сравнение характера изменений скорости показывает, что у разных видов рыб на началыюм периоде развития, связанном с вылунлением наблюдаются изменения скорости, одинаковые для всех особей данного вила (рис.2). Причем для тепловодных рыб M,opercularis и D.rerio обнаружено два минимума значений скорости, следующих с интервалом в двое суток. Для холодноводного вида M.fossilis Наблюдается иная зависимость, для которой характерно отсутствие резкого пика скорости иа аналогичной стадии развития.

Различия, найденные в скоростях кровотока в процессе онтогенеза, a priori отражают морфо-функциональные изменения в сердечно-сосудистой системе эмбрионов. В этом аспекте количественные характеристики потоков, полученные в наших экспериментах, связаны с реальными процессами, происходящими, в организме. Изменения ритмической активности сердечной мышцы, имеющие одинаковые динамические характеристики у исследованных нами видов рыб достоверны н отражают смену физиологических процессов в раннем онтогенезе.

Четвертая глава посвящена изучению действия внешних физических факторов на эмбриональное развитие рыб. На основании литературных данный показано, что задача «делом неоднозначна и требует новых подходов и методов исследования.

Рыбы как объект исследования обладают целым рядом особенностей, облегчающих поставленную задачу. Некоторые наиболее важные из них - это разделение термальных и световых стимулов, сужение диапазона чувствительности "роценторных" структур, закрепленное генетическими системами организма в проис-ссе эволюционного развития.

Мы предложили использовать метол ЛДМ для оценки кровотока в отдельных микрососудах эмбрионов, как одного из наиболее важных факторов для всех физиологических процессов в организме.

Рнс. 1. Временные зависимости скоростей кровотока в артериях а - М.орегси1ап5,б - М.ро&Ии, в - О.гепо

" 60. Э!

К

л 40 •

е~

о о о. о

X 20-5

з .....<.........»...... ё.....

,Дми эксперимента

эг «

ж

Л

■ 3 в

,Г1, ми гжогсеримоит»

Дни эксперименте»

Рис. 2. Зависимости средних скоростей кровотока от возраста а - М.орегси1агк,6 - Л/./оз^/и, в - О.ггпо

Скорости кровотока у О.гспо (оптимальная температура инкубации - 26°С) измерялись при двух температурах - 26 и 30°С. Изменение температур осуществляли при помощи термостатированного столика с элементами Пельтье. Температуру контролировали с помощью термосопротивления. Изменение температуры ■ проводилось постепенно за 10 минут, после чего эмбрион оставляли в камере для установления температурного балланса на 20-25 минут. 'После этого проводились измерения скоростей кровотока в артерии и вене в тех же самых локусах.

Проведенный Фурье-анализ показал, что при оптимальной для данного вида температуре в спектре преобладает одна гармоника. мри повышении температуры на 4°С от онтнмальной наблюдается изменение гармоники с наибольшей амплитудой (изменение частоты - 1,5 раза) и рост других гармоник. '

По результатам измерений можно сделать вывод, что динамика кровотока зависит от температуры окружающей среды таким образом, что при повышении температуры выше оптимальной для данного вида наблюдается изменение частоты пульсаций и их амплитуды.

Измерения в эмбрионах Л/./юп/и (температура инкубации - 18°С) проводились при резком понижении температуры до 8°С. Были измочены скорости кровотока в ортерии эмбриона вьюна при температурах 18 и 8°С. Ьыло показано, что резкй изменяется средняя скорость пульсаций в данном сосуде эмбриона (при понижении температур от оп-ималыюй наблюдается падение средней скорости с 60 мкм/сек до 10 мкм/сек).

Немногочисленные литературные данные о влиянии света на развитие яиц рыб противоречивы и дают суммарные цифры ускорения или замедления развития под действием излучения.

Мы исследовали влияние видимого света на постэмбриональяое состояние . кровеносной .системы двух видов рыб, не обладающих специализированной сенсорной чувствительностью на самых ранних этапах онтогенетического развития.

В качестве источников светового излучения использовали Не-Ие и Аг лазеры. Проточная система обеспечивала постоянство окружающей эмбрион водной среды на необходимом для жизнеобеспечения уровне.

Использование в качестве экспериментальных объеюоз нескольких видов рыб, антагонистичных по отношению их эмбрионов к одним и тем же экологическим факторам Позволило применить сравнительный биологический метод для надежного и однозначного истолкования полученных результатов.

Икру О.гепо облучали рассеяным излучением Не-Ые лазера (Х=632,8 им, Р«9мВт/см2 ) по 10 икринок на контрольную группу и каждую дозу облучения. Измерения проводились на 7 группах: котроль, 30,60,90,120,150 и 180 Мин.облучсния. При этом доза облучения при равномерной засветке составляла 10,20,30,40,50 и 60 J/cм2 при соответствующих временах облучения). Далее икру оставляли развиваться в'нормальных условиях до выхода икринок из оболочек. I После установления эритроцитарного сровообращения • проводили измерения динал. .ки скорости кровотока.

Результаты измерения частоты пульсаций н средней скорости кровотока в сосудах Ь.гспо в зависимости от дозы облучения показали (рис.3), что влияние облучения проявляется в общем повышении частоты пульсаций, что наиболее выражено на 2-ой день, эксперимента. Можно заметить фазы стимуляции и ннгибирования. Стимуляция, пропорциональная дозе облучения, ярко выражена на 1-й и 2-й дни измерений для частоты пульса, и на второй день как для частоты пульсаций (рис.3,а) гак и для средней скорости кровотока (рис.3,6). Процесс ннгибироврчня наблюдается при временах облучения выше 120 мин, что видно на 3-й день.

5

I

»

< Ег

ЙО .........................

О 50 100 150

ВРЕМЯ ОБЛУЧЕНИЯ, мин.

ВРЕМЯ ОВЛУЧЕНИЯ, мни. .

Рис. 3. .Чашкимооп. часлч>11.1 мулы"! (а) и средней скорости кро1ютока (б) и личинках 1).гсги> от нрсмсии облучения Не-Ые (Л = (¡32.8 им) лазером. Плотность мощности Р=8 мВт/см2 . Облучение производилось па стадии дробления.

Икру М./омНи облучали так же (по 10 икринок на контрольную группу и каждую дозу облучения - 7 групп: котроль, 60,120,180,240 н 320 мин.облучения). Далее первые 6 групп оставляли развиваться в нормальных условиях до.выхода икринок из оболочек, а последнюю, 7-ую группу, оставляли развиваться в темноте при прочих равных условиях. После установления эрнтроцитарного кровообращения проводили измерения динамики скорости кровотока.

Результата измерения частоты пульсаций и средней скорости кровотока в сосудах Л/./ю»7м в зависимости от дозы облучения показали (рис.4), что облучение приводит к общему повышению частоты пульсаций и средней скорости кровотока. Это наиболее выражено для дозы ~ 60 ,1/см2. Если сравнить данные, полученные для М./аш/и и . О.гепо в данных экспериментах, то можно видеть, что максимальные значения параметров кровотока у тепловодных О.гепо достигаются при меньших дозах обучения, чем у холодноводных Таким образом,

различные виды рыб реагируют на облучение по-разному.

Икру М.[о$зНи облучали на различных стадиях эмбрионального развития рассеяным излучением Не-Ые (Р=*8 мВт/см2 , Х=632,8 им) и Аг (Р=8 мВт/см2 , Х."»514,5 мм) лазеров. В каждой группе было по 15-20 икринок. Далее облученную икру оставляли развиваться в нормальных условиях до выхода икринок из оболочек. После чего проводили измерения динамики скорости кровотока (рис.4,5).

По результатам измерений можно сделать вывод, что облучение разными длинами волн па стадии дробления яйцеклетки приводит к различным эффектам (при облучении Не-Ые лазером наблюдался максимум при дозе облучения ~ 60 Л/см2, ири облучении Аг лазером такого максимума не наблюдается). На более поздних стадиях развития облучение лазерами с разными длинами волн приводит к одинаковым эффектам.

В заключении сформулированы основные результаты работы.

1. Разработаны методики высоколокалыюго измерения скорости пульсирующего кровотока в одиночных микрососудах различных биологических объектов.

2. Проведен анализ структуры и информативности донлеровских спектров, от кровеносных потоков в сосудах личинок коститых рыб (три вида) и брыжейки крысы. Показано, что существенный цклад в форму донлеровских спектров вносят аппаратное уширение и уширсние за счет свойств объекта.

3. Методом лазерной доплеровскон микроскопии были измерены средние значения скорости кровотока до и после введения раствора полимера в артериолах, кг.инллярах н венулах брыжейки крыс. Значения скорости кровотока до инъекции полимера в артериолах гипертензнвных крыс были 1940±215 мкм/сек, а в сосудах нормотспливных крыс - 1303±210мкм/сек.

4. Результаты измерения скорости кровотока после введения раствора полимера показали, что в капиллярах и ноегкапнллярных венулах реакция на полимер неоднородна, но в среднем не. отличается от контрольных данных. В сосудах сопротивления - артериолах па фоне падения артериального давления наблюдается однородная реакция: скорость кровотока достоверно увеличивается в среднем на достаточно существенную величину - 20%.

5. ЛДМ предложена как эффективный метод, дающий количественную информацию о параметрах кровеносной системы для оцсики постэмбрноиалыюго состояния рыб.

6. Проведены эксперименты с целью выяснения связи интенсивности кровотока с развитием сосудистой сети эмбрионов. Показано, что средняя скорость кроногока изменяется со временем, причем динамика средней скорости кровотока

СРЕДНЯЯ СКОРОСТЬ, мк^с

о = = е-' £>= I

п их-; 1

0 ЬЛ ? 2 «I ^ С

1 1

г ^ * _

=5 ь С ^

« С I =

С* гз 3 X

Б I 1 1

0 = 2 с-

1 ^ "

I

5 &-3

- .г —

= 5:

ь р ; ;

2 2 - £

а о ¡г е

» = я ^

аа — -V х |8

я з с -

| Т > =

3 юд: г ас й 3

. 5 * ~

2 ^ —

С

О

-V

/

СРЕДНЯЯ СКОРОСТЬ, икн/с

— — N

СП О ст. с

У

О = = «

Оч -> Ь

£ 5

5 1

| 1

а X X

01 г

•г

з

Т.

'•Л -

|

1 и

X .<«■4

г 2

г -

с & Л

ь

§ с с

с г ^

Г £

£ «Г *х

с:

-о »

о •та *—. 52

л м

£

в> п

л 1Г

5*3

2 л

>Г « I

ОС ~ X

>15

£ ч/ V

--и I Л М 111, } 2 Н 11,1.1. 1 ■ ■ « ■ ■ ■ ^ \' 1 • 1 |

J ^ н / 1 / / ■ / 1

Г / 1/ /

^ / // //

3

обнаруживает различные тенденции для различных видов рыб (тепловодных и холодиоводных).

7. Проведены измерения скоростей кровотока в рыбах при изменении температуры окружающей среды. Показано, что при оптимальной температуре' Фурье-спектр пульсаций скорости содержит, одну значимую гармонику, при изменении температуры гармогичность нарушается.

8. В результате экпериментов по изучению влияния света на кровоток рыб показано, что различные виды рыб реагируют на облучение по-разному: максимальные значения частоты пульсаций и средней скорости кровотока у тепловодных достигаются при меньших дозах обучения, чем у холодиоводных. На стадии дробления облучение разными длинами волн приводит к различным эффектам,-чего не наблюдается при облучении на более поздних стадиях развития.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

(Лаптева - девичья фамилия Савченко Н.Б.)

1. N.B.Laptcva, B.A.Lcvcnko, A V.Prie7.zhcv, S.G.Proskurin: Nonstationary blood flow measurements In growing fish embryos with Laser Doppler microscopy. // Optica! Methods of Biomedical Diagnostics and Therapy / V.V.Tuchin - cd., Proc. SP1E, v.1981, pp.108-113, 1993.

2. N.N.Firsov, N.B.Laptcva, B.A.Lcvcnko, A.V.Priezzhev, S.G.Proskurin, and O.M.Ryaboshupka: Laser scattering studies of structural-and dynamic colloidal properties of protoplasm and blood // Progr. Colloid Polym. Sci., v.93, pp. 81-84, 1993.

3. K.F.Bikkulova, N.B.Lapteva, B.A.Lcvcnko, M.S.Polyakova, A.V.Priezzhev, S.G.Proskurin, Yu.M.Romanovsky, I.A.Sokolova: Pulsating blootf flow monitoring in developing fish embryos and rat mesentery by laser Doppler microscopy // Static and Dynamic Light Scattering in Medicine and Biology/ R.J.Nossal, R.Pccora, A.V.Priezzhev - eds / Proc. SP1E, v.1884, pp.208-217, 1993.

4. И.А.Соколова, А.А.Шахназаров, Н.И.Тимкина, М.С.Полякова, А.В.Присзжсв, С.Г.Проскурин, Н.Б.Савченко, К.Ф.Биккулова: "Уменьшение гидродинамического сопротивления в и, гериолах брыжейки крыс при инъекции нолиэтпленокенда POLYOX WSR-301.// Бюлл. экспер. биол. и мед., # 11, стр..'>52555, 1993.

5. II. (¡.Лаптева, Б.А.Лсвснко, А.В.Присзжсв, С. Г. Проскурин: Лазерная доплсровская микроскопия биологических объектов с различными оптическими свойствами // Иль. РАН, сер.физическая, т. 59, №6, стр.162-167, 1995.

6. B.A.Lcvcnko, A.V.Priezzhev, S.G.Proskurin, N.B.Savchcnko: Laser Doppler Microscopy of biological objects with different optical properties. // Cell and Biotissue Optics: Applications in Laser Diagnostics and Therapy / V.V.Tuchin -ed., Proc.SPIE, v.2100, pp.190-194, 1994.

7. S.G.Proskurin, A.V.Priezzhev, N.B.Laptcva: Potentialities of Laser Doppler microscopy in biomedical research//Quantification and Localization Using Diffuse Photons in a Highly Scattering Medium /B.Chanco, D.T.Delpy, M.Ferrary, M.J.van Gcmert, G.J.Mullcr, V.V.Tuchin - eds, Proc.SPIE, v.2082, pp.78-85, 1993.

8. M.S.Polyakova, I.A.Sokolova, A.V.Priezzhev, S.G.Proskurin, A.A.Shakhnazarov, and N.B.Savchcnko: Blood-flow velocity measurements in rat mesentery arterioles in health and under hypertensive conditions/'/Biochcmical Diagnostics Instrumentation U.F.Uonner, G.lv.Gohn, T.M.Lauc, and A.V.Priezzhev .- eds, Proc.SPli-:, v., pp.63-68, 199.}.* ; : - • ' '.■ >

9. A.V Priezzhev, N.H.Savchcnko, -B.A.Lcvcnko, S.G.Proskurin: Laser \Doppler microscopy of. »dynamic phenomena in fish emhryoi//Optical Methods in

Biomedical and Environmental Sciences /H.Ohzu, Sh.Komatsu - eds, Elsevier, pp.191-194, 1994.

10. N.B.Savchenko, B.A.Lcvenko, A.V.Priczzhev: Laser Doppler microscopy of blood flows in fish embryos at different stages of ontogenesis//International Symposium on Biomedical Optics /H.J.Foth, A.Lewis, H.Podbelska'et al. - eds, Proc.SPIE, v.2329, pp.310-315, 1995.

11. И.А.Соколова, H.Б.Савченко, М.С.Полякова, A.A.Шахназаров: Влияние изменяющего структуру потока полимера на скорость кровотока нирмо- и гипертензивных крыс//Тезисы локлалов 2-й Всероссийской конференции по биомеханике памяти Н.А.Бернштсйна, т.1, стр.54-55, Нижний Новгород, 22-25 ноября, 1994.

12. N.B.Savchenko, A.V.Priezzhev, B.A.Lcvenko: Biological effects of low-energy laser and nonlaser light irradiation on fish embryos //Effects of Low-Energy Laser Irradiation /.A.Katzir - ed., Proc. SPIE, v. 2391, pp. 594-600, 1995.

13. A.B.Приезжем, Б.А.Лсвенко, H.Б.Савченко: Исследование динамики кровотока в эмбриогенезе M.opercuiaris //Биофизика, т. 40, вып.6, стр.1348-1353, 1995.

14. A.V.Priczzhev, O.M.Ryaboshapka, N.B.Savchenko, N.N.Firsov, V.G.Kolinko: Assessment of whole blood structure and dynamics in vitro and in vivo//Lasers in Chemistry, Biology and Biomedicine/ V.N.Zadkov - cd, Proc. SPIE, v.2802, pp., 1996.

15. A.V.Priezzhev, O.M.Ryaboshapka, N.B.Savchenko N.N.Firsov, V.G.Kolinko: Light scattering diagnostics of blood dynamics and structure.//Holography and Correlation Optics/ O.V.Angelsky - ed., Proc. SPIE, v.2647, pp. 521-528, 1995.

16. А.В.Приезжев, О.М.Рябошапка, Н.Б.Савченко, Н.Н.Фирсов, В.Г.Колинько: Исследование структуры и динамики цельной крови in vivo и in vitro методами светорассеяния.//Изв.РАН, серия физическая, № 3, 1996.

Участок множнтелыюй техники ОНЦ РАМН

[одп. к печати 2 5.4.9 6 Заказ 90

Тираж 'fOO экз