Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лазерная допплеровская диагностика нестационарной гемодинамики в биологических объектах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Лазерная допплеровская диагностика нестационарной гемодинамики в биологических объектах"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

РГБ ОД-

1 3 ¡VIДЙ Физический факультет

На правах рукописи УДК 577.353:567.322

САВЧЕНКО Наталья Борисовна

ЛАЗЕРНАЯ ДОПЛЕРОВСКАЯ ДИАГНОСТИКА НЕСТАЦИОНАРНОЙ ГЕМОДИНАМИКИ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Специальность: 03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1996

. Работа выполнена на кафедре общей физики и оолновых процессов • физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор Ю.М.Романовский,

Официальные оппоненты: доктор физико-математических паук,

профессор А.Н.Тихонов

доктор медицинских наук, профессор В.И.Козлов

Ведущая организации Саратовский государственный университет

нм Н.Г.Чериышевского, г.Саратов

^ I ^^

Защита состоится 14 Ь " ЬсМЭ -*< >Р 1996 года в '■-) часов в аудитории <ОФА на заседании специализированного совета № 3 ОФТТ (шифр - К.053.05.77) в МГУ им. М.В.Ломоносова.

Адрес: 119899, ГСП, г.Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета

МГУ.

Автореферат разослан 1996

года.

Ученый секретарь диссертационного совета, / ^о

кандидат фнз.-мат. наук // О.А.Коа'лышкоиа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Функционирование большинства живых объектов неразрывно связано с нестационарными процессами переноса жидкостей и,в частости, крови. Кровеносная система позвоночных выполняет разнообразные функции, непосредственно связанные с физиологическим состоянием организма. Изучение структуры и параметров кровеносных потоков in vivo, их зависимости от внешних физических факторов, является сложной задачей биофизики. Она требует разработки специальных методов, с одной стороны, дающих количественную информацию в реальном времени эксперимента, а с другой - исключающих повреждения ткани живого организма и не вносящих изменений в поток.

Наиболее приемлемыми для подобных экспериментов являются оптические и, в том числе, лазерные методы исследования, в частности, лазерная доплеропская микроскопия (ЛДМ), основанная на регистрации доплеровских сдвигов частоты лазерного излучения, рассеянного движущимися частицами (эффект Доплера). Метод ЛДМ отличает быстрота получения информации (доли секунды), высокое пространственное разрешение (до 3 мкм), возможность количественных измерений скорости в процссе относительно нормальной жизнедеятельности организма.

Со времени первых измерений скорости кровотока, выполненных в 1972 году Маедой, Фуджиме и Рипой лазерные доплеровские измерители скорости стали применяться в различных областях биологии и медицины. Тем не менее до настоящего времени корректные измерения количественных характеристик пульсирующего кровотока в отдельных микрососудах in vivo представляет собой сложную проблему. Вместе с тем существует большое число задач, в которых необходимо не только получать оценки среднего значения скорости, но и проводить мониторинг ее изменений в живом объекте в реальном времени. Это обстоятельство и мотивировало наши исследования.

Основная цель работы

Основной целью настоящей работы являлась отработка методики измерения и мониторинга методом ЛДМ параметров нестационарного кроы/гока в одиночных микрососудах биологических объектов, исследование основных тенденций их изменения вследствие действия на организмы животных (три вида костистых рыб, а также крыс) различных физических факторов, температура, свет, введение в кровеносную систему молекул полимера.

Основные задачи данной работы состояли в следующем:

1. Провести методические эксперименты по высоколокальным измерениям скоростей и профилей скоростей направленных потоков суспензии эритроцитов в гонких стеклянных капиллярах.

2. Разработать методику проведения экспериментов с биологическими объектами in vivo.

3. Получить доплеровские спектры и выполнить измерения динамики скоростей в артериолах, непулах и капиллярах брыжейки крыс.

4. Изучить гемодинамнческие последствия введения о систему кровообращения теплокровног о животного высокомолекулярного линейного полимера.

5. Провести анализ доилерокекпх Спектров от нестационарных потоков, крови в эмбрионах рыб с периодом пульсаций Порядка 1 сек. '

6. Исследовать зависимость средней скорости'кровоток»,,^ эмбрионах и личинках различных видов рыб от фазмик-развития.

7. Определить зависимости параметров кровотока от параметров светового облучения

и изменения температуры окружающей среды.

Новизна работы

• С' помощью зиакочувствитслыюго ЛД микроскопа получены профили скоростей 'течения суспензии эритроцитов в тонких капиллярах при высоколокальных

измерениях.

• Разработаны оригииальные методики доплеровских измерений скорости и мониторинга кровотока в микрососудах биологических объектов.

• Впервые ' методом ЛДМ проведены эксперименты по определению гидродинамических последствий введения высокомолекулярного линейного полимера в систему кровообращения крыс на уровне микрососудов брыжейки.

• Впервые определены динамические характеристики кровотока в процессе онтогенеза трех видов рыб.

• Впервые получены количественные данные о влиянии облучения эмбриоиов рыб светом на ностэмбриональнос состояние кровеносных потоков.

Научная и практическая ценость работы связана со следующими основными

результатами:

• Показана эффективность применения метода ЛДМ для получения количественной информации о параметрах кровотока в отдельных, микрососудах эмбриоиов рыб н брыжейки крыс и о влиянии на кровоток внешних физических факторов.

• С помощью ЛДМ с высоким пространственным и временным разрешением были зарегистрированы скорости кровотока в микрососудах теплокровного животного и впервые было установлено ее возрастание в артериолах под влиянием полиэтиленоксида, введенного в кровь.

• Была исследована динамика кровотока эмбрионов трех видов рыб методом ЛДМ. Измерены скорости кровотока в течение первых семи дней с момента начала кровообращения и до времени перехода эмбрионов на внешнее питание.

• Показано, что изменение скоростей кровеносных потоков в процессе развития эмбриона проходит несколько этапов, которые можно отделить один от другого

' по изменению скорости кровотока.

• На стадии дробления облучение разными длинами воли приводит к различным эффектам, чего не наблюдается при облучении на более поздних стадиях развития. Облучение непосредственно области сердечной мышцы личииок рыб синим светом приводит к кратковременному уменьшению частоты пульсаций, тогда как при облучении другими длинами волн такого эффекта не наблюдается.

Положения, выносимые на защиту:

• Разработанные методики проведения экспериментов позволяют с хорошей точностью регистрировать в реальном времени изменения скоростей кровеносных потоков в единичных микрососудах.

• Результаты, полученные при измерении средних .скоростей кровотока в артериолах, капиллярах и венулах брыжеек крыс хорошо согласуются с литературными данными.

• Данные, полученные при изучении влияния введения высокомолекулярного линейного полимера полиэтиленоксида в кровеносную систему, позволяют сдедагъ вывод о том, что данное вещество влияет на структуру потока и приводит о снижению резистивности артериол, тогда как сущестьенных изменений кроиотока и канлмлярах и венулах не наблюдается.

• Проведенное сравнение лад, требующихся для достижения 20% увеличения скорости кровотока в артернолах (с параллельным уменьшением среднего артериального дапления на 10%) в группах нормотензивпых и спонтанно гинертензивных крыс показало, что сравнимые с контрольными изменения параметров у последних наблюдаются нри более коротком времеш! тдокиии и, следовательно, при дозах препарата почти в два раза меньших.

• Предложенные алгоритмы экспериментов с эмбрионами и личинками костистых рыб позволяют получать воспроизводимые результаты при сравнительном изучении развития кровеносной системы и ее отклика на внешние физические воздействия.

• Различия, найденные в скоростях кровотока в процессе онтогенеза, отражают морфо-функциональные изменения в сердечно-сосудистой системе эмбрионов. В этом аспекте количественные характеристики потоков, полученные в наших экспериментах, связаны с реальными процессами, происходящими в организме. Изменения ритмической активности сердечной мышцы, имеющие одинаковые динамические характеристики у исследованных нами видов рыб, достоверны и отражают смену физиологических процессов в раннем онтогенезе.

• Данные, полученные при сравнительном изучении характера действия лазерного излучения на развитие кровеносной системы, показывают, что облучение в течение I, 2 или 3-х часов излучением He-No (>.=632.8 ни, Р=8 мВт/см2 ) и Аг (А.=514.5 им, Р=8 мВт/см2 ) лазеров приводит к увеличению средней скорости кровотока и частоты пульсаций, тогда как такое же облучение в течение более чем 3-4-х часов приводит к неоднозначной реакции (в зависимости от стадии развития, во время которой проводилось облучение, от дня развития, ви -я рыб наблюдаются реакции либо дальнейшей стимуляции, либо ингибирования данных параметров кропотока). %

Апробация работы н публикации

Материалы диссертации опубликованы в 16-ти печатных работах и докладывались и обсуждались на 12-ти конференциях и семинарах: Российская молодежная, ассамблея "Молодежь и здоровье" (Саратов, 1992), 4-ой Международной конференции "Laser Applications in Life Sciences" (Еваскула, Финляндия, 1992), 6-й Международной конференции ECIS/European Colloid and Interface Society (Грац, Австрия, 1992), конференции "Quantification and Localization Using Diffuse Photons in a Highly Scattering Medium" (Будапешт, Венгрия, 1993), конференции "Cell and Biotissuc Optics" (Саратов, 1994), 3-ей международной конференции "Optics Within Life Science" (Токио, Япония, 1994), международных конференциях: "Static and Dynamic Light Scattering in Medicine and Biology" (Лос-Анжелес, США, 1993), "Optical Diagnostics of Blood and Blood Components" (Лос-Анжелес, США, 1994), международном симпозиуме BiOS Europe'94 (Лилль, Франция, 1994), "Biological Effects of Low-Energy Laser Irradiation" (Сан-Хосе, США, 1995), международной конференции ICONO'95 (Санкт-Петербург, 1995), конференции "Optical Diagnostics of Biological Fluids" (Сан-Хосе, США, 1996), конференции "Биомеханика'96. Теоретические аспекты морфогенеза" (Москва, 1996).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Диссертация состоит m введения, 4-х глав, заключения и списка литературы. Диссертация изложена на/уЛтрапицах, содержит^ рисунков, 8 таблиц. Список литературы пключает 10^наимсиошший.

' Во введении приведены характеристики крови как оптической рассеивающей среды, проведен сравнительный анализ различных методов диагностики потоков крови в модельных капиллярах к микрососудах живых организмов, обсуждаются особенности применения метода ЛДМ для решения задач гемодинамики, дана краткая характеристика исследуемых проблем, поставлены цели работы и сформулированы задачи исследования.

Глава 1 является обзорной. В ней рассмотрены принципы и основные положения метода ЛДМ, показана эффективность его использования в медикобиологических исследованиях.

Получаемая данным, методом информация о скорости является усредненной по объему измерительной области и, следовательно, по всем частицам, находящимся в данной области. По виду спектра сигнала фотоприемника можно судить о значении средней и наиболее вероятной скорости рассеивателей, характере движения частиц, величине градиента скорости.

К преимуществам метода ЛДМ при работе с биологическими объектами можно отнести:

« бесконтактность;

• неинвазивность (при используемых плотностях мощности зондирующего излучения и типичном времени измерения не нарушаются физиологические функции отдельных органов и всего организма);

• достаточно широкий диапазон измерений скорости;

• быстроту получения результатов;

• регистрацию скорости всех, а не только крупных, видимых частиц;

• высокое пространственное и временное разрешение;

• относительная- простота и дос тупность.

Возможность регистрации потоков в живых объектах впервые была обоснована в 1972 году, когда Riva et ai. получили доплеровский сигнал от потоков крови в ретииальиых сосудах (венах н артериях Диаметром 120 мкм я более) кролика и человека. Такое пространственное разрешение было не достаточным для решения многих задач биофизики подвижности и гемодинамики. Совмещение ЛД спектрометра с достижениями современной техники микроскопии позволило сохранить все преимущества метода и применить его к изучению движения различных биологических микрообъектов (внутриклеточных органелл, микроорганизмов, потокам крови в капиллярах) и уменьшить измерительный объем -область, из которой собирается рассеянное излучение, а, следовательно, и вся информация о динамике частиц.

При разработке нашего ЛД микроскопа стремились максимально, расширить область применения прибора. Наша установка позволяет регистрировать не то." ко профили скоростей потоков биологических жидкостей, но и знак скорости, что является крайне важным для работы с реальными объектами.

Установка является универсальной. в смысле достаточно простой адаптации к изучению различных биологических объектов. В то же время сохранены все преимущес1ва ' метода ЛДМ. При решении задач данной диссретации были разработаны новые модули для проведения экспериментов с животными: термостатированная приставка к предметному столику с перестраиваимой температурой для экспериментов с эмбрионами и личинками рыб, предметный столик с подогревом для измерений скоростей кровотока в брыжейках крыс.

При создании данного ЛДМ были учтены особенности работы с реальными объектами:

• минимальны'! линейный размер измерительного объема - ~ 5 мкм;

• максимальное временное разрешение - ~ 0.03 сек;

• широкий диапазон измерений скорости - 5 мкм/сск+1 мм/сек;'

• автоматизация эксперимента, позволяющая получать результаты в реальном времени;

• возможность регистрации не только модуля скорости, ио и ее знака;

• возможность визуализации объекта, что облегчает юстировку и настройку прибора;

• возможность совмещения микроскопа с рядом различных заменяемых приставок: шаговым двигателем, видеокамерой и т.д.

Для отработки методики получения достоверной количественной информации о скоростях потоков и профилях скоростей потоков проведены модальные эксперименты in vitro, измерены профили коростсй течения суспензии человеческих эритроцитов (диаметр 7-8 мкм) в буферном растворе по тонкому плоскому стеклянному капилляру с внутренним вертикальным размером 200 мкм и горизонтальным размером 1.6 мм.

При сканировании поперечного сечения капилляра регистрировались доплеровские спектры с усреднением по 8-16 реализациям. В результате обработки получены профили скоростей движения эритроцитов в буферном растворе. С возрастанием скорости профиль несколько уплощается, что связано с проявлением непыотоповых свойств крови.

Погрешность измерения скорости в данных экспериментах составляет 5-6% от пеличины скорости, что характерно для ЛД спектрометров и соответствует стабильности молельных стационарных течений. При проведении измерений в реальных биологических объектах ошибка измерений возрастает до 10-' ">% в зависимости от оптических свойств объектов.

По данной главе сделаны следующие выводы:

• ЛДМ является весьма перспективным методом, позволяющим изучать движения в малых объемах и каналах (капилляры, клетки и т.д.) н проводить количественные воспроизводимые измерения скоростей и профилей скоростей движения рассеива. щих частиц с высокой точностью.

• ЛД микроскоп, разработанный в нашей лаборатории, позвгняет решать задачи подвижности биологических объектов и жидкостей in vivo.

Во второй главе приведены результаты исследований гемодинамических последствий введения в систему кровообращения крысы небольших количеств высокомолекулярного линейного полимера полиэтиленоксида POLYOX WSR-310 (в концентрации Ю^-Ю"5 г/мл).

Были измерены средние значения скорости кровотока, пульсирующего с частотой порядка 350 Гц, до и после введения раствора полимера в артсриолах, капиллярах и венулах брыжеек крыс.

В гидродинамике с 1948 года известен т.н. "эффект Томса", заключающийся в снижении гидродинамического сопротивления потоку жидкости, текущей по жесткой трубе в турбулентном режиме, при введении в эту систему высокомолекулярных л'гчейных полимеров.

Накопленные экспериментальные данные позволяют построить вполне обоснованную полуамиирическую теорию турбулентности разбавленных полимерных эастворов. Согласно этой теории характеристики турбулентного переноса в растворе :вязаны со способностью юлекул разворачиваться и ориентироваться в оправлениях растяжения, тем самым повышая локальную анизотропию и 1иесипацию энергии в турбулентных выбросах, снижая их иитемсишюсть и частоту.

Таким образом, о турбулентных потоках наблюдается эффект снижения . гидродинамического сопротивления полимерами (СГСП). При раздроблении полимера на мелкие сегменты эффект не возникает.

Литературные данные свидетельствуют о том, что эффект СГСП проявлется также и в потоках с числами Рейнольдса, соответствующими ламинарному течению, на при наличии нестаиионарности.

Это позволяет предположить, что "СГСП происходит благодаря изменешш структуры потока, т.к. вязко-упругие свойства крови при этом не изменяются,

Нами были проведены первые экспериментальные серии измерений скорости кровотока в. микрососудах брыжейки крысы с использованием ЛД микроскопа. С точки зрения применения ЛДМ важно, что рассеивателями являются эритроциты, имеющие размеры 6-10 мкм, т.е. порядка размеров измерительного объема микроскопа. Полученные значения скорости кровотока (от 140 до 2300 мкм/с в артериолах с просветом 16.3±0.4 мкм) согласуются с имеющимися литературными данными.

Эффект СГСП изучался на сосудах с диаметром меньшим 100 мкм (прекашллярные артериолы, капилляры и вецулы), которые вносят основной вклад в сопротивление системы кровообращения. В данных экспериментах задачей являлось измерение скорости кровотока в сосудах сопротивления в брыжейке крысы до и после введения полимера. •

Раствор нолиэтиленоксида Polyox WSR-301 в концентрации 10*5 г/мл в физиологическом растворе вводился в кровь крысы через югулярную вену в течение 1 минуты со скоростью 0.1S мл/мин с помощью автоматического шприца.

Для контроля системного эффекта СГСП в течение эксперимента параллельно регистрировалось системное артериальное давление из сонной артерии с помощью датчика мембранного типа.

Эксперименты проводились на крысах лшпш Wistar (ВК) (артериальное давление (АД) 109±2 мм рт. ст.) Первой экспериментальной группе, состоявшей из 21 животного, вводился раствор нолиэтиленоксида. Скорость кровотока измерялась в среднем в 4-х сосудах у каждого животного. Второй, контрольной группе, состоявшей из 11 крыс, вводился физиологический раствор. У этой группы скорость кровотока измерялась в среднем в 5-ти сосудах у каждой особи. Измерения скорости проводились в микрососудах, где фоновая скорость (скорость до инъекции) варьировалась в следующих диапазонах:

• в прекалиллярных артериолах от 137 мкм/с до 2283 мкм/с;

• в капиллярах от 150 мкм/с до 2380 мкм/с;

о в посткапиллярных венулах от 105 мкм/с до 285Ь мкм/с;

На ВК нами было показано, что при дозе в крови порядка Ю-6 - 10"7 г/мл полимер существенно увеличивает скорость кровотока в артериолах: - с 702±95 мкм/с до 1079±155 мкм/с. Артериальное давление при этом снижается с 10й±4 до 91±3 мм рт. ст., т.е. на 16%. Контрольные инъекции физиологического раствора существенно не изменяли значений АД (lli±3 мм рт. ст.) и скорости кровотока в артериолах (895±126 мкм/с). В капиллярах и посткапиллярных венулах реакция н? полимер неоднородна, но в среднем не отличается от контрольных данных.

Мы' исследовали влияние СГСП на скорость кровотока в норме и при гипертензии. Эксперименты проводил) ь на ВК (число животных п=11), на крысах линии Wistar-Kyoto (ВКК) (АД 136±2 мм рт. ст., п=5), и на спонтанно гипертензивных крысах с развитым заболеванием (СГК) (АД 195±4 мм рт. ст., п=6). Крысы ВК и ВКК служили контролем для спонтанно гипертензивных крыс.

Было проведено сравнение доз, требующуюся для достижения 20% увеличения скорости .кровотока в артериолах (с параллельным уменьшением АД на 10%) в

группах СГК и ВКК, являющихся иаиболсс адекватным для СГК контролем. Сравнимые с контрольными изменения регистрируемых параметров у ■ СГК наблюдали при более коротком времени инъекции полимера и, соответственно, при дозах препарата почти в два раза меньших, чем те, что требовались для достижения аналогичного эффекта у ВКК. Э1И результаты позволяют предположить, что снижение возросшего при гипсргснэии сопротивления кровотоку путем уменьшения еззмущений кровотока - перспективный путь коррекции заболевания.

В результате данных экспериментов было подтверждено, что СГС полимер РОЬУОХ 'М811-310 способен понижать гидродинамическое сопротивление в системах с фиксированными геометрическими . параметрами, влияя исключительно на микроструктуру самого потока жидкости.

В главе 3 приведены результаты измерения скоростей потеков крови в эмбрионах рыб в процессе их развития. Исследовалась динамика кровотока эмбрионов трех видов рыб методом ЛДМ. Измерены скорости кровотока в течение первых семи дней с момента начала кровообращения и до времени перехода эмбрионов на внешнее питание.

Развитие сосудистой системы личинок, рыб достаточно хорошо изучено морфологически. Однако исследования ее функционального состояния на разных стадиях не проводились, т.к. Бее известные методы измерения скоростей (микросъемка с помощью контактных объективов, компьютерная обработка изображений, ультразвуковой доплеровский метод и т.д.) либо очень трудоемки, либо не дают необходимого пространственного разрешения, либо не позволяют получать результаты непрерывно в реальном времени проведения эксперимента.

Кровоток на ранних стадиях развития эмбрионов рыб характеризуется широким диапазоном изменения скоростей - 0 + 100 мкм/сек и достаточно быстрыми пульсациями скорости с периодом и.6 + 2.0 сек у различных экземпляров.

Эмбрионы, достигшие подвижных стадий развития, перед экспериментом обрабатывали раствором анестетика МЗ-222 за одну минуту до измерений для устранения подергиваний мускулатуры. В дальнейшем после проведения эксперимента к эмбрионам возвращалась первоначальная подвижность.

Измерения проводили, начиная с момента появления движущихся эритроцитов в хвостовых сосудах - артерии и вене, внутренний диаметр которых несколько больше диаметра эритроцитов, поэтому поток крови представляет собой последовательное движение эритроцитов в небольшом количестве плазмы с квазипериодическим изменением скорости.

Параметры пульсаций скорости различаются в зависимости от расположения н диаметра сосуда, а также от стадии развития эмбриона. Разным фазам' пульсаций соответствуют различные скорости и, следовательно, разные доплеровские спектры, регистрируемые - ходе экспериментов.

Установка позволяет варьировать временное разрешение последовательно записываемых доплеровских спектров. Наши эксперименты показали, что запись спектров с временным разрешением 0.03 сек и 0.06 сек обеспечивает наилучшее разрешение пульсаций скорости при максимальном отношении сигнал/шум.-Увеличение постоянной времени усреднения приводит к потере информации о форме периода пульсаций скорости.

Для обработки зависну с-тей пульсаций скорости была написана программа На языке Турбо-Паскаль. Программа счисляет среднюю ,корость кровотока, максимальную и минимальную скорости, затем выполняет быстрое преобразование Фурье полученной пульсациоиной кривой.

Фурье-анализ временных зависимостей скорости показал, что в большинстве случаев артериальный кровоток характеризуется одной основной гармоникой, в то

.7

время как Фурье-спектр пульсаций венозного кровотока всегда содержит 5-7 значимых гармоник. Это является следствием продвижения крови по сосудам и, следовательно, возможно, следствием наложения на пульсацию сердечной мышцы иных ритмов организма. Причины появления которых требуют дальнейших ;>сследоваиий. Здесь необходимо отметить, что количество гармоник в спектрах пульсаций скорости кровотока не зависит от возраста эмбрионов и частоты пульсаций.

Мы исследовали динамику изменения скоростей кровотока в различные периоды онтогенеза. Предварительные исследования динамики скоростей на макроподах (M.opercularis) показало, что она изменяется в процессе развития регулярно у различных особей. Нами были выбраны три вида рыб (M.opercularis, M.fossilis и D.rerio) с различной морфологией кровносной системы, различными местами обитания и различной скоростью эмбрионального и онтогенетического развития.

В каждом эксперименте использовали икру от пары производителей. Для М. operculum икру брали из гнезда по 3 икринки. Для каждого эксперимента с D.rerio брали по 10 икринок, для M.fossilis использовали 40 икринок, полученных в результате искусственного оплодотворения.

Измерения скоростей кровотока у каждого из трех видов проводили регулярно в ■ одно и тоже время суток. Результаты измерения скоростей кровотока в артериальных сосудах различных видов рыб показаны на рис.1.

Средний период пульсаций при измерениях в нормальных условиях на стадии появления эритроцитарного кровообращения для M.opercularis составляет 0.46 ± 0.02 сск, anaM.fossilis - 1.00 ± 0.04 сек и для D.rerio - 0.69 ± 0.03 сек. Как можно видеть, средний период пульсаций у тсиловодиых рыб (рис.1.а,с) меньше, чем у холодноводных M.fossilis (рис.1,б).

Сравнение характера изменений скорости показывает, что у разных видов рыб на начальном периоде развития, связанном с вылунлением наблюдаются изменения скорости, одинаковые для всех особей данного вида (рис.2). Причем для тепловодных рыб M.opercularis и D.rerio обнаружено два минимума значений скорости, следующих с интервалом в двое суток. Для холодноводного вида M.fossilis наблюдается иная зависимость, для которой характерно отсутствие резкого пика скорости на аналогичной стадии развития.

Различия, найденные в скоростях кровотока в процессе онтогенеза, a priori отражают морфо-функциональные изменения . в сердечно-сосудистой системе эмбрионов. В этом аспекте количественные характеристики потоков, полученные в наших экспериментах, связаны с реальными процессами, происходящими в организме. Изменения ритмической активности сердечной мышцы, имеют но одинаковые динамические характеристики у исследованных нами видов рыб достоверны и отражают смену физиологических процессов в раннем онтогенезе.

Чепзертая глава посвящена изучению действия внешних физических факторов на эмбриональное развитие рыб. На основании литературных данных показано, что задача вдел ом неоднозначна и требует новых подходов и методов исследования.

Рыбы как объект исследования обладают целым рядом особенностей, облегчающих поставленную задачу. Некоторые наиболее важные из них - это разделение термальных и световых стимулов, сужение диапазона чувствительности "реценторных" структур, закрепленное генетическими системами организма в процессе эволюционного развития.

Мы предложили использовать метод ЛДМ для оценки кровотока в отдельных микрососудах эмбрионов, как одного из наиболее важных факторов для всех физиологических процессов в организме.

Время , с

Рис. 1. Временные зависимости скоростей кровотока в артериях а - М.орегси1апз,б - М.рскзИй, в - О. гепо

о о са-

га.

'А' 7 ' ■».........А........ А.....

Д|-1И экпперимента

-1—-К

Л

, Д и м эксперимента

Рис. 2. Зависимости средних скоростей кровотока от возраста а - М.орегси1агк,6 - М^аиИи, в - П.гегю

Скорости кровотока у D.rcrio (оптимальная температура инкубации - 26°С) измерялись при двух температурах - 26 и 30°С. Изменение температур осуществляли при помощи термостатированного столика с элементами Пельтье. Температуру контролировали с помощью термосопротивления. Изменение температуры • проводилось постепенно за 10 минут, после чего эмбрион оставляли в камере для установления температурного балланса на 20-25 минут. 'После этого проводились измерения скоростей кровотока в артерии и вене в тех же самых локусах.

Проведенный Фуръе-аналнз показал, что при оптимальной для данного вида температуре в спектре преобладает одна гармоника. мри повышении температуры на 4°С от оптимальной наблюдается изменение гармоники с наибольшей амплитудой (изменение частоты - 1,5 раза) и рост других гармоник. '

По результатам измерений можно сделать вывод, что динамика кровотока зависит от температуры окружающей среды таким образом, что при повышении температуры выше оптимальной для данного вида наблюдается изменение частоты пульсаций и их амплитуды.

Измерения в эмбрионах M.fossilis (температура инкубации - 18°С) проводились при резком понижении температуры до 8°С. Были изменены скорости кровотока в ?ртерии эмбриона вьюна при температурах 18 и 8°С. ьыло показано, что резко" изменяется средняя скорость пульсаций в данном сосуде эмбриона (при понижении температур от оптимальной наблюдается падение средней скорости с 60 мкм/сек до 10 мкм/сек).

Немногочисленные литературные данные о влиянии света на развитое яиц рыб противоречивы и дают суммарные цифры ускорения или замедления развития под действием излучения.

Мы исследовали влияние видимого света на постэмбриональное состояние .кровеносной системы двух видов рыб, не обладающих специализированной сенсорной чувствительностью на самых ранних этапах онтогенетического развития.

В качестве источников светового излучения использовали He-Ne и Аг лазеры. Проточная система обеспечивала постоянство окружающей эмбрион водной среды на необходимом для жизнеобеспечения уровне.

Использование в качестве экспериментальных объектов нескольких ендов рыб, антагонистичных по отношению их эмбрионов к одним и тем же экологическим факторам Позволило применить сравнительный биологический метод для надежного и однозначного истолкования полученных результатов.

Икру D.rerio облучали рассеяным излучением He-Ne лазера (Х=б32,8 им, Р"9мВт/см2 ) по 10 икринок на контрольную группу и каждую дозу облучения. Измерения проводились на 7 группах: котроль, 30,60,90,120,150 и 180 мин.облучения. При этом доза облучения при равномерной засветке составляла [0,20,30,40,50 и 60 J/см2 при соответствующих временах облучения). Далее икру оставляли развиваться в нормальных условиях до выхода икринок из оболочек. После установления эритроцитаршго сровообращения • проводили измерения дина», .ки скорости кровотока.

Результаты измерения частоты пульсаций и средней скорости кровотока в сосудах D.rerio в зависимости от дозы облучения показали (рис.3), что влияние облучения проявляется в общем повышении частоты пульсаций, что наиболее выражено на 2-ой день, эксперимента. Можно заметить фазы стимуляции и ингибирования. Стимуляция, пропорциональная дозе облучения, ярко выражена на 1-й и 2-й дни измерений для частоты пульса, и на второй день как для частоты пульсаций (рис.3,а) гак и для средне^ скорости кровотока (рис.3,6). Процесс ннгибироврмия наблюдается при временах облучения выше 120 мин, что видно на 3-й день.

G ' -

<

ar

ao 4-—^..........................-

О 50 100 150

ВРЕМЯ ОБЛУЧЕНИЯ, мни.

ВРЕМЯ ОБЛУЧЕНИЯ, мин. .

Рис. 3. Г5лш|с.им(Х'.Т1> частоты пульса (и) и средней скорости крооотока (б) н личинках D.rcrio от нрсмсим облучения He-Ne (X - 632.8 им) лазером. Плотность мощности Р*=8 мВт/см2 . Облучение производилось на стадии дробления.

Икру M.fossilis' облучали так же (по 10 икринок на контрольную группу и каждую дозу облучения -7 групп: котроль, 60,120,180,240 и 320 ниц.облучения). Далее первые 6 групп оставляли развиваться в нормальных условиях до.выхода икрннок из оболочек, а последнюю, 7-ую группу, оставляли развиваться в темноте при прочих равных условиях. После установления эрнтроцитарного кровообращения проводили измерения динамики скорости кровотока.

Результата измерения частоты пульсаций и средней скорости кровотока в сосудах M.fossilis в зависимости от дозы облучения показали (рис.4), что облучение приводит к общему повышению частоты пульсаций и средней скорости кровотока. Это наиболее выражено для дозы ~ 60 J/см2. Если сравнить данные, полученные для M.fossilis и .D.rerio в данных экспериментах, то можно видеть, что максимальные значения параметров кровотока у тенловодных D.rerio достигаются при меньших дозах обучения, чем у холодноводных M.fossilis. Таким образом, различные виды рыб реагируют на облучение по-разному.

Икру M.fossilis облучали на различных стадиях эмбрионального развития рассеяным излучением He-Ne (Р=8 мВт/см2 , Х=632,8 им) и Аг (Р=8 мВт/см2 , Х,=514,5 нм) лазеров. В каждой группе было по 15-20 икринок. Далее облученную икру оставляли развиваться в нормальных условиях до выхода икринок из оболочек. После чего проводили измерения динамики скорости кровотока (рис.4,5).

По результатам измерений можно сделать вывод, что облучение разными длинами волн на стадии дробления яйцеклетки поиводит к различным эффектам (при облучении He-Ne лазером наблюдался максимум при дозе облучения ~ 60 J/см2, при облучении Аг лазером такого максимума не наблюдается). На более поздних стадиях развития облучение лазерами с разными длинами волн приводит к одинаковым эффектам.

В заключении сформулированы основные результаты работы.

1. Разработаны методики выгоколокального измерения скорости пульсирующего кровотока в одиночных микрососудах различных биологических объектов.

2. Проведен анализ структуры и информативности доплеровских спектров от кровеносных потоков в сосудах личинок коститых рыб (три вида) и брыжейки крысы. Показано, что существенный вклад в форму доплеровских спектров вносят аппаратное уширение и уширсние за счет свойств объекта.

3. Методом лазерной доплеровской микроскопии были измерены средние значения скорости кровотока до и после введения раствора полимера в артериолах, капиллярах и венулах брыжейки крыс. Значения скорости кровотока до инъекции полимера в артериолах'пшертеняивных крыс были 1940±215 мкм/сек, а в сосудах нормотенпивпых крыс - 1303±2Юмкм/сек.

4. Результаты измерения скорости кройотока после введения раствора полимера показали, что в капиллярах и посткапиллярных венулах реакция на полимер неоднородна, но в среднем не. отличается от контрольных данных. В сосудах сопротивления - артериолах на фоне падения артериального давления наблюдается однородная реакция: скорость кровотока достоверно увеличивается в среднем на достаточно существенную величину - 20%.

5. ЛДМ предложена как эффективный метод, дающий количественную информацию о параметрах кровеносной системы для оценки ностэмбрионалыюго состояния рыб.

6. Проведены эксперименты с целью выяснения связи интенсивности кровотока с развитием сосудистой сети эмбрионов. Показано, что средняя скорость

кровотока изменяется со временем, причем динамика средней скороои кровотока

*

ГП'Г'ПП Г ТП -Г I 1 Т'ТП П1 ГП1П1 1ТТ ТТГТП^ II I I п

о 1 ' 2 3 4 5

ВРЕМЯ ОБЛУЧЕНИЯ часы

о 40г*.

и £

И

и о а.

а

и ¿и-

ж

к %

И

ы 10

Ои и

У

0-|тгт1 г I гп р-1тт|Т1 р |ттт-г т|т-гп ггл-т ггтттгггтг -гт-гг-ггт

Ч

Не -Ие

возив А г_

I

и

ВРЕМЯ ОНЛУЧЕНПИ чйоы

Рис. 4. .Ч<1Ш1«:нм(мТ1> частоты иульга (а) и (релиои скорости кроиотока (6) н личинках М.[оЫИх ог нремсни облучения Ш'-Ыс (А. = (Ш.Н им) и Лг1 (X = 5)4.5 им) лазерами. Плотность мощности Р=8 мВт/смг Облучение произнолилось на стадии дробления яйцеклетки.

обнаруживает различные тенденции для различных видов рыб (тепловодных н холодноводных).

7. Проведены измерения скоростей кровотока в рыбах при изменении температуры окружающей среды. Показано, что при оптимальной температуре' Фурье-спектр пульсаций скорости содержит, одну значимую гармонику, при изменечии температуры гармогичность нарушается.

8. В результате экпериментов по изучению влияния света на кровоток рыб показано, что различные виды рыб реагируют на облучение по-разному: максимальные значения частоты пульсаций и средней скорости кровотока у тепловодных достигаются при меньших дозах обучения, чем у холодноводных. На стадии дробления облучение разными длинами волн приводит к различным эффектам,-чего не наблюдается при облучении на более поздних стадиях развития.'

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

(Лаптева - девичья фамилия Савченко Н.Б.)

1. N.B.Lapteva, B.A.Levenko, A.V.Priezzhev, S.G.Proskurin: Nonstationary blood flow measurements in growing fish embryos with Laser Dopplcr microscopy. // Optical Methods of Biomedical Diagnostics and Therapy / V.V.Tuchin - cd., Proc. SPIE, v.1981, pp.108-113, 1993.

2. N.N.Firsov, N.B.Lapteva, B.A.Levenko, A.V.Priezzhev, S.G.Proskurin, and O.M.Ryaboshapka: Laser scattering studies of structural and dynamic colloidal properties of protoplasm and blood // Progr. Colloid Polym. Sci., v.93, pp. 81-84, 1993.

3. K.F.Bikkulova, N.B.Lapteva, B.A.Levenko, M.S.Polyakova, A.V.Priezzhev, S.G.Proskurin, Yu.M.Romanovsky, I.A.Sokolova: Pulsating blood flow monitoring in developing fish embryos and rat mesentery by laser Dopplcr microscopy // Static and Dynamic Light Scattering in Medicine and Biology/ RJ.Nossal, R.Pccora, A.V.Priezzhev - cds / Proc. SPIE, v.1884, pp.208-217, 1993.

4. И.А.Соколова, А.А.Шахназаров, Н.И.Тимкина, М.С.Полякова, А.В.Приезжев, С.Г.Проскурин, Н.Б.Савченко, К.Ф.Биккулова: "Уменьшение гидродинамического сопротивления в и, гериолах брыжейки крыс при инъекции полиэтнленокенда POLYOX WSR-301.// Бюлл. экспер. биол. и мед., # 11, стр.552 555, 1993.

5. Н.Ь.Лантепа, Б.А.Лсвснко, А.В.Приезжее, С.Г.Проскурин: Лазерная донлеровская микроскопия биологических объектов с различными оптическими свойствами // Изь. РАН, сер.физическая, т. 59, №6, стр.162-167, 1995.

6. B.A.Levenko, A.V.Priezzhev, S.G.Proskurin, N.B.Savchenko: Laser Dopplcr Microscopy of biological objects with different optical properties. // Cell and Biotissue Optics: Applications in Laser Diagnostics and Therapy / V.V.Tuchin -ed., Proc.SPIE, v.2100, pp. 190-194, 1994.

7. S.G.Proskurin, A.V.Priezzhev, N.B.Lapteva: Potentialities of Laser Doppler microscopy in biomedical research//Quantification and Localization Using Diffuse Photons in a Highly Scattering Medium /B.Chance, D.T.Delpy, M.Ferrary, M.J.van Gemcrt, G.J.MulIer, V.V.Tuchin - cds, Proc.SPIE, v.2082, pp.78-85, 1993.

8. M.S.Polyakova, I.A.Sokolova, A.V.Priezzhev, S.G.Proskurin, A.A.Shakhnazarov, and N.B.Savchenko: Blood-flow velocity measurements in rat mesentery arterioles in health and under hypertensive conditions//Biochemical Diagnostics .Instrumentation H.F.Bonner, G.E.Gohn, .T.M.Laue, and A.V.Priezzhev .- cds, Proc.SPIE, v., |>p.(>3-()8, 1994." " ' • V > • ,

9. A.V.Primhcv, _ N.B.Savchenko, - B.A.Levenko, ' S.G.Proskurin: Laser ' Dopplcr . microscopy of. .dynamic phenomena in fish embryoS//Optica]' Methods in

Biomedical and Environmental Scicnces /H.Ohzu, Sh.Komatsu - eds, Elsevier, pp.191-194, 1994.

10. N.B.Savchcnko, B.A.Levenko, A.V.Priezzhev: Laser Doppler microscopy of blood flows in fish embryos at different stages of ontogenesis//International Symposium on Biomedical Optics /HJ.Foth, A.Lewis, H.Podbclska'et al. - eds, Proc.SPIE, v.2329, pp.310-315, 1995.

11. И.А.Соколова, H.Б.Савченко, М.С.Полякова, А.А.Шахназаров: Влияние изменяющего структуру потока полимера на скорость кровотока норма- и гипергензивнмх крыс//Тезнсы докладов 2-й Всероссийской конференции по биомеханике памяти Н.А.Бернштейиа, т.1, стр.54-55, Нижний Новгород, 22-25 ноября, 1994.

12. N.B.Savchcnko, A.V.Priezzhev, B.A.Levenko: Biological effects of low-energy laser and nonlaser light Irradiation on fish embryos //Effects of Low-Energy Laser Irradiation /A.Katzir - ed., Ртос. SPIE, v. 2391, pp. 594-600, 1995.

13. А.В.Приезжей, Б.А.Левепко, H.Б.Савченко: Исследование динамики кровотока в эмбрногстмс M.oporcularis //Биофизика, т. 40, вып.6, стр. 1348-1353, 1995.

14. A.V.Priezzhev, O.M.Ryaboshapka, N.B.Savchcnko, N.N.Firsov, V.G.Kotinko: Assessment of whole blood structure and dynamics in vitro and in vivo//Lasers in Chemistry, Biology and Biomedicine/ V.N.Zadkov - ed, Proc. SPIE, v.2802, pp., 1996.

15. A.V.Priezzhev, O.M.Ryaboshapka, N.B.Savchcnko N.N.Firsov, V.G.Kolinko: Light scattering diagnostics of blood dynamics and structure.//Holography and Correlation Optics/ O.V.Angclsky - ed., Proc. SPIE, v.2647, pp. 521-528, 1995.

16. А.В.Приезжев, О.М.Рябошаика, Н.Б.Савченко, Н.Н.Фирсов, В.Г.Колинько: Исследование структуры и динамики цельной крови in vivo и in vitro методами светорассеяния./,/Изв.РАН, серия физическая, № 3, 1996.

Участок множительной техники

ОНЦ РАМН

Тодп. к печати 2 5\4.9 6 Заказ ßQ

Тираж 'tOO экз