Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Доплеровская микроскопия знакопеременных нестационарных потоков в живых объектах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Доплеровская микроскопия знакопеременных нестационарных потоков в живых объектах"

' МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Физический факультет

На правах рукописи УДК 577.353:575.322

ПРОСКУРИН Сергей Геннадьевич

ДОЛЛЕРОВСКАЯ МИКРОСКОПИЯ ЗНАКОПЕРЕМЕННЫХ НЕСТАЦИОНАРНЫХ ПОТОКОВ В ЖИВЫХ ОБЪЕКТАХ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1993

Работа .на кафедре общей физики, и волновых

процессов физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Официальною оппоненты

Ведущая организация

Научные руководители -кандидат физ.-мат.наук, старший

научный сотрудник А.В.Приезжев -доктор физ.-мат.наук, профессор Ю. М. Романовский -доктор физ.-мат. наук, профессор, зав. кафедрой В.А.Твердислов -доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией С.Л.Загускин Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино

Зашита состоится "18" Л 1993 г. в ^ часов в

аудитории СЯ3^ на заседании специализированного Ученого Совета №3 ОФТТ СК. 053.05.77) в МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, г.Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан Л-д^Ц 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат'физ.-мат. наук

Т.'М. Козлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Лазерная доплеровская микроскопия, как метод высоколокального изммерения динамических характеристик светорассеиваюших объектов, начала свою историю с создания первого лазерного доплеровского микроскопа СЛДЮ в 1972 году СМаеаа Т., ги^те 3.3. За двадцать лет своего развития это направление убедительно показало преимущества реализации доплеровского спектрометра на базе оптического микроскопа, особенно для биофизических исследований живых объектов малых размеров, структура которых, как праввило, пространственно неоднородна, что накладывает определенные требования на локализацию измерительного объема именно в интересующих точках. Тем не менее, до настоящего зремени ЛЛМ серийно не выпускаются, видимо в силу специфики решаемых задач.

Как правило они собраны на основе современных микроскопов, имеющих точную механику, высококачественную оптику и позволяют получать пространственное разрешение с линейным размером до 1 мкм. В них используются современные методы регистрации и обработки рассеянного излучения при помощи паралельных многоканальных спектроанализаторов и фотонных корреляторов реального зремени, автоматизированных на базе персональных компьютеров. Однако, знакочувствительного сканирующего ЛДМ. позволяющего в широких пределах измерять скорости и профили скоростей разнонаправленных нестационарных микропотокоз биологических жидкостей в живых объектах различного уровня организации, до последнего времени реализовано не было.

Необходимость реализации такого прибора продиктована важностью получения точной количественной информации о

внутренней динамике живых систем из микроскопических областей.

Приведем примеры некоторых биологических объектов жизнедеятельность которых в значительной мере определяется наличием в них знакопеременных нестационарных потоков.

Слизевой гриб РКу%агит ро1усерка1ит широко используется в качестве базового объекта для изучения ммеханизмов немшечной подвижности. К обектам, имеющим амебоидную подвижность, можно сгнести собственно зммебь:. а та:-: же лейкоциты. фибробласты. раковые клетки. Ярко выраженную аммебоидную подввижность имеет и Ркщагит ро1усерка1ит на стадии плазмодия. Так же. как у аммеб у него нет специальных органов движения, но существуют, мменяющие направление, потоки протоплазмы. Плазмодий это плоская древовидная система, представляющая собой многоядерную синиитиальную массу протоплазмы, находящуюся в постоянном возвратно-поступательном движении. Во многих лабораториях мирз проводятся теоретические и экспериментальна исследования динамики этого объекта. Однако значительный круг задач остается не решенным из-за недостатка количестввенных данных, полученных с достаточной точностью и традиционно низкого пространственного разрешения - 100 - 500 мкм.

Это в равной мере относится к результатам, полученным ранее методом лазерной доплеровской спетроскопии для решения широкого круга фундамментальных и прикладных задач задач биологии и медицины где необходимо иметь средстваи зммерения скорости потоков крови в доступных прижизненному микроскопированию областях живых обектов, например, в сосудистых бассейнах холоднокровных и теплокровных животных, в капиллярах глазного яблока, в капиллярах эмбрионов рыб и др. Потоки крови как правило нестационарны, а иногда и

знакопеременны. Некоторые сосуды с противоположными направлениями потока крови пространственно близки.

Для решения подобных задач возникла необходимость создания прибора, позволяющего соединить традиционные биологические методики, которые реализуются с помощью сбьмного микроскопа, с возможностью измерять скорости, используя спектроскопию квазиупругого рассеяния света.

Основной целью настоящей работы является исследование динамических характеристик сложных биологических коллоидов -протоплазмы и крови, имеющих различные реологические и оптические характеристики, в ммикрообластях живых обектов разного уровня организации, в том числе при температурных и химических воздействиях. Использовались методы лазерной доплеровской микроскопии и автоматизации эксперимента. Для достижения этой цели было необходимо разработать и реализовать экспериментальную установку знакочувствительного сканирующего ЛДМ. включающую систему термостабилизации объектов, систему регистрации рассеянного излучения в аналоговом режиме работы фотоприемника и з режиме счета фотонов, компьютеризированное считывание и обработку информации в реальном времени проведения эксперимента.

Основные задачи проведенных исследований заключались в следующем;

- на базе серийного микроскопа ЛШАМ-Р1 разработать и реализовать знакочувствительную систему измерения скорости;

осуществить систему сканирования столиком микроскопа, автоматизированную на базе компьютера;

- изготовить термостатированную приставку к предметному столику микроскопа для термостабилизации и температурного воздействия;

- при помощи модельных экспериментов со стеклянными капиллярами продемонстрировать возможности ЛДМ как прибора;

- получить временные зависимости скорости потока эндоплазмы в плазмодии миксомицета при различных условиях;

- измерить профиль скорости потока эндоплазмы плазмодия;

- измерить временные зависимости скоростей ■ кровотока в различных точках сосудистой системы эмбрионов рыб;

- определить температурную зависимость скорости кровотока в эмбрионе рыбы;

- измерить скорости кровотока в капиллярах брыжейки крысы.

Новизна работы.

13 В работе впервые с помощью знакочувствительного ЛДМ проведен комплекс длительных измерений скорости нестационарных потоков эндоплазмы плазмодия с пространственным разрешением, на порядок превынашим ранее достигнутое.

23 Впервые получены вертикальные профили скорости течения эндооплазмы в тяже плазмодия, подтверждены ее неньютоновские свойства.

3) Обнаружено направленное движение эндоплазмы плазмодия в направлении перпендикулярном, основному направлению потока.

43 Исследовано влияние ингибитора окислительных реакций -раствора КСЫ и салицилгидроксамовой кислоты, на движение эндоплазмы плазмодия.

53 Впервые получены временные зависимости скорости пульсирующих потоков крови в эмбрионе рыбы.

63 Впервые получена температурная зависимость максимальной и минимальной скоростей этих потоков;

73 Измерены скорости разнонаправленных потоков крови в прекапиллерных артериоллах, венулах и капиллярах брыжейки

КРЬЕЫ.

Научная и практическая ценность работы. Разработано два автоматизированных лазерных доплеровских комплекса для проведения исследований динамических характеристик биологических объектов. Первый на базе отечественного оптического люминесцентного микроскопа, с управляемым ЭВМ предметным столиком, с системой регистрации рассеянного излучения, работавшей в аналоговом режиме и в режиме счета фотонов, автоматизированный на ■ базе ЭВМ "Электроника-60" и IBM/PC-AT совместимого компьютера, С установлен в корпусе нелинейной оптики физического факультета МГУ). Второй на базе зарубежного оптического микроскопа фирмы Karl Zeiss Jena, автоматизированного на базе IBM/PC-AT с системой регистрации рассеянного излучения, работающей в режиме счета фотонов С установлен на кафедре биофизики физикоматематического факультета Университета Коменского. г. Братислава. ЧСФРЗ. Показаны широкие возможности этих приборов для изучения нестационарных динамических микроструктур in vivo и in vitro.

При помощи этих приборов, проведен комплекс биофизических исследований нестационарных потоков золеобразной эндоплазмы слизевого гриба Physarum polycephalum на стадии плазмодия. Измерены профили скорости движения эндоплазмы в плоскостях с направлением нормали вдоль основного потока и перпендикулярно ему. Подтверждены ненютоновские сзойства эндоплазмы плазмодия. Эти измерения могут непосредственно использоваться для математического моделирования подвижности протоплазмы. Разработаны методики измерения скоростей потоков в живых системах с различными размерами рассеивателей от 0.1 мкм до 8 мкм. В частности, они могут представлять интерес для ученых.

работающих в ИБФ РАН. ИБФ СО РАН. ИБХ РАН.

Установлено изменение характера подвижности эндоплазмы при воздействии ингибиторами дыхания. Гармоническое поведение временной зависимости скорости эндоплазмы наблюдается только в первые 10 - 15 минут после удаления ингибитора. Различная последовательность помещения организма в ингибитор, при одинаковых начальных и конечных условиях, приводит к различному динамическому состоянию эндоплазмы.

Временные зависимости скорости крови в эмбрионе рыбы Salmo salar демонстрируют неравномерное уменьшение скорости за ввремя цикла сердечных сокращений. Изменение температуры воды, в которую помещен эмбрион Salmo salar, приводит к постепенному росту максимальной скорости пульсирующей крови. Минимальная скорость при этом меняется мало, но существует критическая температура, после которой начинается патологический процесс частичного возвращения артериальной крови в сердце во время диастолы. который характеризуется наличием отрицательных скоростей.

Апробация работы н публикации. •

Полученные результаты опубликованны в 13 печатных работах, докладывались и обсуждались на IV советско-чехословацком семинаре "Динамика и активность биологических макромолекул: лазерный и компьютерный эксперимент" СЕрезан, 1983), II-ом Всесоюзном семинаре "Лазерная биофизика и новые применения лазеров в медшине" СТарту, 1939), Всесоюзном семинаре "Измерения в потеках. Методы, аппаратура и применения" С Москва, 1990), Всесоюзном семинаре "Лазеры в народном хозяйстве" СМосква, 1990). 3-ей Международной конференции "Laser Applications in Life Sciences" СМосква. 1990). Международной

конференции "Новое в лазерной медицине и хирургии" СПереяславль-Залесский, 19913, первой Всесоюзной конференции "Оптические методы исследования потоков" СНовосибирск, 19913. Международной школе NATO Advanced Study Institute "Structure and Dynamics of Supramolecular Aggregates and Strongly Interacting Colloids" СМаратеа. Италия, 19913, 35-ом Международном симпозуме "Optical Applied Science & Engineering, Laser Interferoraetry IV: Computer-Aided Interferometry" ССан Диего, США, 19913, Российской молодежной ассамблее "Молодежь и здоровье" С Саратов, 19923, 4-ой Международной конференции "Laser Applications in Life Sciences" СЕваскула, Финляндия. 19923, 6-й Международной конференции ECIS /European Colloid and Interface Society/ С Грац, Австрия. 19923.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы. Диссертация изложена на /2О страницах, содержит рисунков. Список литературы зключает

наименований.

Во введении дана краткая характеристика исследуемых проблем, сформулированны цели и задачи работы.

В первой главе дан обзор лазерной доплеровской микроскопии, как разновидности спектроскопии квазиупругого рассеяния в приложении к биологическим динамическим структурам микроскопических размеров. Дана сравнительная характеристика обычных доплеровских анемометров и доллеровских микроскопов.

Описан круг биофизических задач, для решения которых, необходимо использование лазерного доплеровского микроскопа СЛДМЗ с высоким пространственно-временным разрешением и

обоснована необходимость использования для их решения автоматизированного знакочувствительного сканирующего ЛДМ.

В §1.1 дана характеристика объектов исследования и методов измерения скоростей знакопеременных нестационарных потоков протоплазмы и крови. Описаны следующие объекты: слизевой гриб Physarum polycephalum на стадии плазмодия, эмбрионы рыб Danto rerio и Salmo Salar на ранних стадиях развития, брыжейка крысы.

Измерения скорости потоков протоплазмы в плазмодии миксомицета необходимо проводить как в составе целого слизевика, так и в отдельных фрагментах тяжей.

В эмбрионах рыб необходимо исследовать потоки протоплазмы на самых ранних стадиях развития, когда еще отсутствует кровеносная система, и потоки крови на более поздних стадиях формирования этой системы.

В брыжейке крысы существует множество сосудов с диаметрами от 7 до 50 мкм в которых возможно при помощи ЛДМ проводить измерения скорости кровотока.

В §1.2 на основе литературных данных сделан обзор лазерных доплеровских микроскопов. Приводятся величины, которые измеряются с их помощью. Это, как правило, коэффициенты диффузии, скорости и профили скоростей направленных потоков в стеклянных капиллярах и в биологических объектах m vivo. Приводятся количественные данные конкретных измерений. Линейньв размеры измерительного объема в различных ЛДМ лежат в пределах от 2 мкм до 100 мкм. Измеряемые скорости направленных потоков лежат в пределах от 50 мкм/с до нескольких мм/с.

В §1.3 приведено сравнение особенностей обработки доплеровского сигнала при аналоговом режиме регистрации рассеянного излучения и в режиме счета фотонов. Это' связано с

тем, что при уменьшении объема. из которого собирается рассеянное излучение, уменьшается и интенсивность попадающего на фотоприемник излучения. Регистрацию рассеянного излучения в режиме счета фотонов необходимо использовать также в тех случаях, когда рассеивающие свойства исследуеммых объектов низки или когда необходимо сильно ограничивать интенсивность зондирующих пучков.

В §1.4 приведены примеры биофизических задач, решаемых при возможности измерять скорости разнонаправленных нестационарных потоков протоплазмы и крови.

Во второй главе описан разработанный и реализованный для задач измерения скоростей знакопеременных нестационарных потоков в микроскопических областях живых объектов новый прибор автоматизированный знакочувствительный сканирующий ЛЛМ, работающий в различных режимах регистрации скорости. Его схема приведена на рис.1.

Описаны модельные эксперименты по измерению профилей скорости и концентрации потоков взвесей латекса и эритроцитов человека в плоском капилляре. Рассмотрено соответствие этих результатов теоретическим. Показаны возможности совмещения различных биологических методик воздействия на клеточную и внутриклеточную подвижность с паралельным измерением величины скорости, изменение которой рассматривали как отклик на эти воздействия.

В §2.1 на основании литературных данных обсуждаются различные знакочувствительные схемы доплеровских спектрометров. Обосновывается применение в ЛДМ двухпучковой схемы регистрации скорости, частоты каждого из пучков в которой, сдвинуты на величины порядка 50 МГц при помощи акустооптических модуляторов

CAOMD. Приводятся параметры специально изготовленного для знакочувствительного ЛДМ высокостабильного узкополосного генератора накачки АОМ-ов.

В §2.2 обсуждаются особенности спектра, полученного в дифференциальном ЛДМ с зондирующими пучками разных частот. Приводятся три экспериментально полученных спектра, соответствующие скоростям -2 мкм/с. О мкм/с и +1 мкм/с демонстрирующие достижимую при отсутствии диффузионного уширения точность определения доплеровских сдвигов при использовании знакочувствительного ЛДМ.

В §2.3 описаны проведенные модельные эксперименты по определению профиля скорости потока воды со взвешенными частицами латекса в плоском капилляре сечением 160 мкм. Получен пуазейлевский профиль скорости. Для описываемой конфигурации прибора, в которой используется 200-ти канальный спектроанализатор реального времени, максимальная измеряемая скорость равна 17 мм/с. Диапозон скоростей от 1 мкм/с до 17 мм/с позволяет исследовать динамику ппотоков в большом классе живых объектов, скорости в которых обычно не превышают нескольких мм/с.

Эксперименты с потоком эритроцитов показали. что доплеровский спектр, полученный в этом случае, отличается от спектра, полученного при рассеянии на частицах латекса. Составляющая спектра, находящаяся на разностной частоте падающих пучков, отличается в этих двух случаях. Для латекса она имеет полуширину порядка разрешения спектроанализатора и не зависит от скорости потока. Для эритроцитов эта ширина меняется от 150 до 350 Гц взависимости от величины скорости. Такое поведение спектра может быть связано с вязкоупругими свойствами

эритроцитов. В сдвиговом потоке они могут менять форму в зависимости от величины скорости и сдвиговых напряжений, а также изменять ориентацию.

В третьей главе описаны эксперименты по измерению профилей скорости в сечениях с различным направлением нормали к плоскости сечения и временных зависимостей скорости эндоплазмы плазмодия миксомицета Ркузагит ро1усерка1ит в отдельном фрагменте тяжа и в тяже, находящемся в составе целого организма.

Определены временные зависимости скорости течения эндоплазмы в отдельных фрагментах тяжа при воздействии ингибитора окислительных реакций.

Показана возможность измерения количества переносимой массы, как за один период возвратно-поступательного движения эндоплазмы,, так и за определенный отрезок времени.

В §3.1 приведены результаты измерения скорости потока эндоплазмы на оси тяжа с различным временным разрешением. В первом случае эксперимент длился 20 - 45 мин. Время между экспериментальными точками равно 5 - 7 с, время накопления каждого доплеровского спектра 0.8 - 1.6 с. На рис.2 приведена временная зависимость скорости эндоплазмы плазмодия в отдельном тяже. Во втором случае измерение скорости проводилось вблизи остановки эндоплазмы. Спектры регистрировались непрерывно в течение 25.6 с, время накопления одного спектра 0.1 с. На рис.3 приведены две временные зависимости скорости, полученные после обработки этих спектров. Кривая а соответствует временной зависимости скорости, определяемой по центру тяжести доплеровского спектра, кривая Ь - веменной зависимости скорости, определяемой по положению максимальной точки спектра.

Кривая а более плавна, кривая b более изломана и находится либо выие либо ниже кривой а. При наблюдении динамики спектра это соответствует увеличению гармоник на различных частотах.

При помощи знакочуввствительного ЛДМ получено, что на временах до 0.5 с полной остановки протоплазмы не происходит, но наблюдаются ее колебания с периодом 1 - 3 с вблизи скорости равной 0 мкм/с.

В §3.2 приводятся экспериментально полученные вертикальные профили скорости потока протоплазмы в горизонтально ориентированных тяжах при скоростях на оси потока равных 100 мкм/с, 300 мкм/с и 550 мкм/с С рис. 4Э. Измерение профилей стало возможным за счет реализованного автоматизированного сканирования предметного столика микроскопа. Ось шагового двигателя, управляемого ЭВМ, соединялась с винтом вертикальной микрометрической подачи столика. Программное обеспечение составлено таким образом, что позволяет провести сканирование и измерение скоростей потока в 2 - 10 точках за 3 - 15 с. Параболический профиль скорости получался при скорости ~ 300 мкм/с. При скоростях, больших этой получалась уплощенная парабола, что свидетельствует о неньютоновских свойствах эндоплазмы плазмодия.

Сканирование с измерением компоненты скорости в направлении перпендикулярном оси тяжа позволило обнаружить ротационное движение протопазмы. Максимальную скорость имеет эндоплазма находящаяся вблизи стенки тяжа - эктоплазмы, она равна 15-20 мкм/с.

В §3.3 описаны эксперименты, в которых, определяется влияние ингибиторов дыхания KCN и SHAM (салицилгидроксамовая кислотаЗ на поведение временных зависимостей скорости

эндоплазмы. При полной обработке фрагмента тяжа плазмодия длиной 10 мм возвратно-поступательное движение не регистрировалось с точностью до 1 мкм/с. После удаления KCN и SHAM движение востанавливается, причем в первые 15 мин существует гармоническое поведение временной зависимости, которое в других условиях существует не более 5-ти мин. При обработке половины тяжа движение сохранялось, но протоплазма в первые 10 мин уходила из области обработки (скорость имела только знак минус), после чего временная зависимость приобретала обычный вид. Через 20 мин обрабатывали вторую часть фрагмента тяжа. Таким образом тяж весь находился в растворе KCN и SHAM, как и в первом случае, но движение протоплазмы сохранялось и имело период и максимальную скорость такую же, как и до обработки. Это свидетельствует о том, что одновременное присутствие движения эндоплазмы и ингибиторов дыхания позволяет отрезку тяжа адаптироваться и открыть новый путь дахания для фосфорелирования АТФ или запустить в действие гликолиз.

В четвертой главе описана специально изготовленная для предметного столика микроскопа термостатированная приставка для проведения экспериментов с эмбрионами различных рыб. Изложены результаты измерений скоростей кровотока в эмбрионах рыб Danio rerio и Salmo salar, а также в брыжейке крысы.

Для эмбрионов определялись температурные зависимости максимальных и минимальных скоростей пульсирующих потоков крови в артерии хвостового плавника, температутная зависимость периода сокращений, а также форма периода временной зависимости скорости в артерии. Методом серво-нуля измерялось микродавление в артерии и вене хвостового плавника эмбриона.

В брыжейке крысы измерялись скорости кровотока в артериолах, венулах и капиллярах.

В §4.1 на основе литературных данных приведены особенности начальных стадий развития эмбриона костистой рыбы Salmo salar. На основе этого выделены стадии, на которых существуют потоки протоплазмы и крови. Измерение скоростей крови и определение ее изменений взависимости от различна факторов интересно с точки зрения исследования кровеносной системы и процессов обмена между кровью и тканями.

В §4.2 приведена экспериментально полученная временная зависимость скорости крови в артерии хвостового плавника Salmo salar. Каждый доплеровский спектр накапливался в течение 0.1 с, продолжительность всего эксперимента - 25.6 с. Кривые полученны по двум алгоритммам обработки доплеровских спектров. В первом случае скорость определялась по всему доплеровскому спектру Срис.5, кривая aD. во втором случае, програмными средствани, отрезалась компонента соответствующая рассеянию от неподвижных частей объекта Срис.5, кривая bD. Важно заметить, что форма временной зависимости от этого не меняется, хотя во втором случае вычисляемые значения скорости становятся больше на 5 -15 что вполне естественно.

Для определения максимальной скорости с большей точностью проводились эксперименты, в которых запись доплеровских спектров осуществлялась с периодом, несколько отличающимся от периода сердечных сокращений. Накопление одного спектра происходило втечение 0.3 с. В результате мы получали временные зависимости, по которым можно более точно определять максимальную скорость, но нельзя определить форму периода.

Максимальные значения скоростей полученные при накоплении

спектра в течение 0.1 с лежат в диапазоне 167 ± 14 мкм/с Ссг=8.7 %3, значения скоростей з той же артерии, но при накоплении спектра в течении 0.3 с Срис. 6) равны 177 ± 7 мкм/с (<?=4.2 %3. Не трудно определить, что диапазоны разбросов перекрывается.

В §4.3 приведены доплеровские спектры, полученые при рассеянии зондирующего излучения на потоках крови в артериолах. венулах и капиллярах брыжейки крысы. Измерения скоростей этих потоков проводилось в рамках комплексных исследований по определению влияния на гемодинамику малых добавок высокомолекулярного линейного полимера. Диаметры исследуемых микрососудов равнялись 7-30 мкм, измеряемые скорости лежали в пределах от 100 мкм/с до 3 мм/с.

В заключении сформулированны основные результаты работы:

13 На основе оптического микроскопа, были разработаны и реализованы автоматизированная знакочувствительная

дифференциальная лазерная доплеровская схема регистрации скорости и автоматизированная система сканирования предметного столика микроскопа, что позволило создать новый прибор: автоматизированный знакочувствительный сканирующий лазерный доплеровский микроскоп.

23 Изготовлено два действующих макета такого прибора. Первый работает в аналоговом режиме и в режиме счета фотонов. Он автоматизирован на базе ЭВМ "Электроника-60" и ЭВМ типа 1ВМ/РС-АТ. Второй работает в режиме счета фотонов и автоматизирован на базе ЭВМ типа 1ВМ/РС-АТ.

33 С помощью этих приборов впервые был проведен ряд экспериментов по измерению скоростей потоков в цилиндрическом и плоском капиллярах, в тяжах плазмодия миксомицета Ркузагит

ЗРlycephalum, в сосудах эмбрионов рыб Salmo salar, Danio rerio г брыжейки крысы. Эти эксперименты свидетельствуют, что такие приборы можно эффективно использовать для исследования знакопеременных нестационарных микропотоков in vivo и in vitro а.решения на этой основе качественно новых задач.

43 Проведены длительные измерения скоростей в центре затока в различных участках целого плазмодия миксомицета и во йэагментах тяжей плазмодия с точностью определения скорости 4 -Ю%. включая диапозон малых скоростей, что впервые позволило залучить достоверные результаты по изменению скорости вблизи эстановок протоплазмы.

5) Наблюдения за поведением доплеровского спектра вблизи ^ля скорости при разрешениии по времени 0.1 с дают основания утверждать о наличии колебаний эндоплазмы с периодом 1 - 3 с, и зб их наличии при воздействии ингибиторов дыхания, когда зозвратно-поступательное движение протоплазмы останавливалось с точностью до ±1 мкм/с.

6) Впервые был измерен вертикальный профиль скорости патока протоплазмы в тяже плазмодия. Подтверждены ее зеньютоновские свойства. Показана возможность измерения яассопереноса протоплазмы плазмодия при определении динамики зременной зависимости скорости Ссоотношение площадей под кривой z положительными и отрицательными значениями скорости} и данных а профиле при различных скоростях в центре потока.

7) Воздействие ингибиторов дыхания - KCN и галицилгидроксамозой кислоты на отрезок тяжа приводит к уходу адоплазмы из зоны обработки и увеличению периода колебаний. ЗЗнаружено. что различной последовательности обработки частей тяжа, но при одинаковых начальных и конечных условиях

воздействия ингибитора, соответствует различное конечное состояние динамического поведения эндоплазмы.

8) Для экспериментов с эмбрионами рыб разработана и реализована термостатированная приставка, управляемая источником тока от 0 до 5 А. к предметному столику микроскопа. Она позволяет регулировать температуру специально аэрированной воды в пределах от 0 до 35 °С.

93 При использовании этой приставки впервые для артерии хвостового плавника личинки Salmo salar на стадии выхода эмбриона из оболочки измерены скорость, форма периода скорости, а также получена температурная зависимость максимальной и минимальной скоростей кровотока с точностью ~ 4%.

10) В рамках комплексного исследования реологии крови з сердечно-сосудистой системе крысы проведены измерения скорости направленных потоков крови в прекапиллярных артериоллах, венулах и капиллярах Сдиаметры: 7 мкм - 50 мкм) брыжейки «рысы в диапазоне скоростей 100 мкм/с - 3 мм/с.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Глонти В.Н. . Приезжев А.В.. Проскурин С.Г., Романовский Ю.М. Лазерный доплеровский микроскоп как составная часть универсального лазерного микроскопа для исследования биологической подвижности. // В книге "Динамика и активность биологических макромолекул: лазерный и компьютерный эксперимент", тезисы доклада IV советско-чехословацкого семинара. Ереван. 1988. С. 84-85.

2. Глонти В. Н. , Приезжев А. В. , Проскурин С. Г.. Романовский Ю. М. Лазерный доплеровский микроскоп// Препринт физического ф-та МГУ

№ 32/1988. 5 с.

3. Глонти В. Н. , Приезжев А. В. . Проскурин С. Г. , Романовский Ю.М., Цветкович В. Лазерная доплеровская микроскопия биологических объектов // В кн.: Лазеры в биологии и медицине. Тарту: Изд-во Тартусского университета. 1990. С. 233-237.

4. Глонти В. Н., Приезжев А. В., Проскурин С. Г., Цветкович В. Лазерная доплеровская спектроскопия живых объектов // Тезисы доклада Всесоюзного семинара: Измерения в потоках. Методы, аппаратура и применения. Москва. 12-14 февраля 1990. С. 71.

5. Проскурин С.Г., Цветкович В. Лазерный доплеровский микроскоп для диагностики клеточной и внутриклеточной подвижности // В кн.: Лазеры в народном хозяйстве. М.: Изд-во МДНТП. 1990. С. 98-102.

6. Levenko В.A.. Priezzhev А.V. . Proskurin S.G. Monitoring of Nonstationary Flow in Fish Embryos in Mixomycete Plasmodium with the Laser Doppier Microscope // Laser Applications in Life Sciences. The 3-rd International Conference on Laser Scattering Spectroscopy and Diagnostics of Biological Objects. Moscow. Book of Abstracts. 27-31 August 1990. V.2. P. 45.

7. Приезжев А.В., Проскурин С.Г. Сканирующий знакочувствительный доплеровский микроскоп для измерения распределения скоростей нестационарных потоков протоплазмы и крови в живых микрообъектах // Тезисы международной конференции: Новое в лазерной медицине и хирургии. Переяславль-Залесский 17-19 октября 1990. 4.2. С. 283-284.

8. Priezzhev А. V. . Proskurin S.G. , Romanovsky Yu.M. , Laser Doppier Measurements of Amoeboid Cytoplasmic Streaming and Problems of Mathematical Modeling of Intracellular Hydrodynamics // USSR-CSFR Joint Seminar on Nonlinear Optics in

Control, Diagnostics, and Modeling of Biophysical Processes. S. A. Akhmanov, V.N.Zadkov Editors. Proc. SPIE 1402. 1991. P. 107-113.

9. Приезжев А. В. , Проскурин С. Г. Автоматизированный сканирующий знакочувствительньй лазерный доплеровский микроскоп: проблемы пространственно-временного разрешения // Тезисы докладов первой всесоюзной конференции: Оптические методы исследования потоков. Новосибирск 23-23 апреля 1991. С.43-44.

10. Priezzhev А. V., Proskurin S.G. Laser Doppler Velocimetry: in Vitro and in Vivo Measurements of Biological Fluid Flows in Restricted Volumes // Laser Interferometry IV: Computer-Aided Interferometry. R. J. Pryputniewicz Editor. Proc. SPIE 1553, 1992. P. 502-514.

11. Левенко Б.А., Приезжев А.В. Проскурин С.Г. Исследование скорости кровотока в сердечнососудистой системе эмбрионов рыб при помощи лазерного доплеровского микроскопа // Вестник Моск. Унив. Сер. Биология. 1992. £3. С. 23-28.

12. Lapteva N. В. , Levenko В. A., Priezzhev А. V. , Proskurin S.G. Laser Doppler Velocimetry of Blood Cells in Vitro and in Vivo // Laser Applications in Life Sciences. The 4th International Conference. Jyvaskyla (Finland). Book of Abstracts. 7-11 September 1992. P.78.

13. Firsov N. N. , Lapteva N. Б. . Levenko S. A. , Priezzhev A. V. , Proskurin S. G.. Riaboshapka 0. M. Laser Scattering Studies of Structural and Dynamic Colloidal Properties of Protoplasm and Blood in Vitro and in Vivo // VI European Colloid and Interface Society Conference. Graz (Austria). Book of Abstracts. 21-25 September 1992. P.Fl.

Общая схема знакочувствительного сканирующего лазерного

доплеровского микроскопа. 1 - предметный столик микроскопа, 2 -исследуемый объект, 3 - лазер, 4 - АОМы, 5 - генератор накачки, 6 - видеокамера, 7 - телемонитор, 8 - видеомагнитофон, 9 -фотоприемник, 10 - спектроанализатор, 11 - компьютер, 12 -графопостроитель, 13 - шаговый двигатель.

Время [с]

Гис.2.

Временная .чаписимооть скорости потока оидоплппмм па оси тяжа плазмодия. Ипморпшл праио.цопы пи гшако-чупстрителыюм ЛДМ.

Время [с]

Рис. 3.

Временные зависимости скорости движения эндоплазмы плазмодия зблизи ее остановки. Кривая а соответствует опоеделенис скорости по центру тяжести доплеровского спектра. Кривая Ь соответствует определении скорости по максимальной точке спектра.

Координата 1 [мкм]

Рис. 4.

Вертикальные профили потока эндоплазмы в" тяже плазмодия миксомицета РИузагит ро1усерка1ит при р=^личных скоростях на оси потока. Диаметр потока 120мкм.

Рис. 5

Временные зависимости скорости крови в артерии хвостового плавника эмбриона рыбы Salmo salar Две кривые соответствуют различным критериям обработки доплеровского спектра. Отчетливо видно, что форма изменения скорости при этом не меняется.

g iee,

^ в. но о

О -I00-¡с U

-зеа

V.

1С. 6

AAAW ДАМА

ь

«е. ез.

Время [с]

ее.

:намика изменения скорости на том же биологическом объекте м. пред. рис.3. Кривая а - измерения в артерии, кривая Ь - з не. Измерения производятся с некоторым фазовым сдвигом носительно периода пульсаций. ■ Максимальная и минимальная орости при этом имеют меньший разброс за счет большего эмени накопления сигнала, но длительностт и форма периода не зтветствует реальной.