Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Культура тканей IN VITRO при межвидовой гибридизации пшеницы

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Культура тканей IN VITRO при межвидовой гибридизации пшеницы"

О -^РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ПАУК

Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юга-Востока

На правах рукописи

Столярова Светлана Викторовна УДК 633.11 "321 ":(63] .527.8:581.143.6+631.527.5)

КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ IN VITRO ПРИ МЕЖВИДОВОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ ПШЕНИЦЫ

(06.01.05 — селекция и семеноводство)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Саратов 1998

Работа выполнена в НИИСХ Юго-Востока НПО "Элита Поволжья".

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ В.А. Крупное;

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Т.И. Дьячук.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, Лауреат Государственной премии РФ Г.И. Веденеев

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Н.Х. Еналеева

Ведущее учреждение: Саратовская государственная сельскохозяйственная академия имени Н.И. Вавилова.

Защита состоится / iAJ/Q^l^ 1998 г. в {О часов на заседании Диссертационного совета К 020.29.01 Научно-исследовательского института сельского хозяйства Юго-Востока по адресу: 410020, г. Саратов, ул. Тулайкова 7, НИИСХ Юго-Востока.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан Н 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета: кандидат биологических наук Евдокимова O.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сужение генетического разнообразия затрудняет селекцию пшеницы на устойчивость к био- и абиострессам. В связи с этим расширение генофонда за счет сородичей весьма актуально. Однако успех межвидовой гибридизации сдерживается такими факторами, как нежизнеспособность зигот, гибель зародышей на ранних стадиях развития, стерильность гибридов первого поколения и т. д. Эти трудности в значительной степенп преодолевают путем использования методов культуры ткани in vilio. Метод эмбриокультуры позволяет доращивать на питательной среде абортивные зародыши.

Культивирование молодых соцветий на среде, содержащей 2,4Д, дает возможность сохранить и размножить ценный стерильный гибридный материал.

Получение гаплоидов в культуре пыльников с последующей одномоментной гомозиготизацией путем удвоения хромосом при кодхицинировании останавливает разрушение пенных комплексов генов в гибридных популяциях. Кроме того, культура пыльников сокращает срок создания линий.

Цель и задачи исследований. Целью исследования являлось: ■ изучение эффективности метода эмбриокультуры при получении межвидовых гибридов пшеницы;

» выяснение возможностей получения гаплоидов и гомозиготных линий межвидовых гибридов в культуре пыльников in vitro.

В задачи исследований входили:

1. Создать межвидовые гибриды мягкой и твердой пшеницы с T.persicum, T.aethiopicum, T.dicoccum и T.lirnopheevii.

2. Исследовать влияние генотипа и условий выращивания доноров на эффективность метода эмбриокультуры.

3. Изучить генотигшческие особенности морфогенеза межвидовых гибридов в культуре пыльников.

4. Исследовать андрогенетическую способность межвидовых гибридов, родительских форм и беккроссированных гибридов.

5. Выявить оптимальный состав питательных сред для культивирования пыльников.

6. Изучить влияние предобработки донорных растений пониженной температурой и раствором 2,4Д на частоту новообразований и на регенерацию.

7. Оценить влияние времени года и условий выращивания донорных растений на каллусообразующую и регенерационную способность гибридов.

На защиту выносятся следующие основные положения: • изучение эффективности метода эмбриокультуры при получении межвидовых гибридов;

■ »пучение особенностей каллусообразующей и регенерационной способности межвидовых гибридов в культуре пыльников;

■ результаты создания н изучении гомозиготных .niiniii межвидовых гибридов ншенппы.

НаМШЦиШШШЬ Выявлена различная реакция межвидовых гибридов пшенииы на эмбрнокультуру. Показано влияние на андрогснетнческую способность межвидовых гибридов как материнского, гак и отцовского родителя, а в беккроссных скрещиваниях — влияние реккурентного родителя. Выявлен образец T-pcrsiciim (к-13385) с повышенной способностью в культуре пыльников межвидовых гибридов к регенерации зеленых растений. Показано, что в комбинации T.aestivum/T.persiciiin андрогенетические потенции у гибридов F2 выше, чем у гибридов F3 и F4. Установлено, что в условиях Поволжья андро-гсиегические возможности о культуре пыльников в сильной мере зависят от температурного, водного и светового режимов выращивания доноров.

Практическая ценность рлбош. Выявлены оптимальные условия культи-вироваиия пыльников межвидовых гибридов пшеницы, вызывающие увеличение частоты фракций эмбриогепных пыльцевых зерен. В потомстве от скрещивания T.aeslivum/T.persicum, T.aestivum/T.aethiopicum, T.aestivum/T.ciicoccum, T.aestivurn/T.timopheevii и T.durum/T.persicum, T.durum/T.aetlHopicum получены и размножены 360 андрогенных линий, обладающих комплексом хозлй-с'гвенпо-цеиных признаков.

В релульзате селекционных испытаний выделены линии от скрещивания T.aestivum/T.persicum, обладающие высокой продуктивностью, скороспелостью и устойчивостью к мучнистой росе и пыльной головне. Выделены 2 линии T.aestiviim/T.dicoccum и 2 линии F2BC2 T.aestivum/T.tnnopheevii 2//T.aestivum, также представляющие интерес для селекции. Особая ценность линий из удвоенных гаплоидов заключается в том, что наряду с хозяйственно-ценными признаками, они обладают высокой способностью к гаплопродукции. Использование их в гибридизации дает возможность проводить стабилизацию генома в культуре пыльников.

Апробация работы. Результаты исследований Доложены на паучно-прак-тической конференции молодых ученых и специалистов {г. Саратов, 1989 г.); на первом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (г. Саратов, 1994 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и обгем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Текст изложен на 112 машинописных страница* и иллюстрирован 31 таблицей, 12 рисункам» и 15 прнложсншши'.'Список использованной литературы содержит 161 источник, в том числе 101 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ШТЕР1ЫЛ, МЕТОДЫ И УСЛ0Ш1Я ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве исходного материала использовали следующие виды пшениц: Т.аеьНтп Ь. — гексаплоилная и Тлкпит Т.реькчин \'ау., Т.ае11нор1анп ЛкиЬг., Т.сИсоссит 8с!ше1е, Т.ПторЬееУп 21шк. — зетраплоидные.

Материнскими формами служили сорта Т.агЫЬшп: Саратовская 29 (С.19), Саратовская 46 (С. 46), Альбидум 28 (А. 28), Саратовская 58 (С.58), Саратовская 60 (С.60) и Т.сЗигит: С-1898, Д-2018, Д-2034, Харьковская 46 (Х.46), Ак-тюбинская 74 (Акт.74).

Образцы тетрашюионых видов пшеницы Т. реги'шит к-13385 (Т.р); Т. ре гасит к-40576 (Т.р*Г); Т.аеШюркшт к-43757 (Т.аеИк); Т.сйсоссит к-9228 (Т.сКс.); Тлторйееун к-31684 (ТД.) служили отцовскими формами и являлись донорами хозяйственно-полезных свойств: скороспелости, повышенной кустистости, устойчивости к низким температурам, к прорастанию зерен в колосьях, низ-корослости. К полезным для селекции признакам относятся также стекловид-ность и высокое содержание белка в зерне, иммунитет к пыльной головне, мучнистой росе и бурой листовой ржавчине.

Гибридизацию пшеницы проводили путем принудительного опыления. С целью усиления у гибридов проявления признаков сортов культурной пшеницы в 31 комбинации проводили возвратные скрещивания (беккроссы), при которых гибрид повторно (однократно или двукратно) опыляли пыльной материнской формы. Для преодоления постгамной несовместимости межвидовых гибридов использовали метод эмбриокулыуры. Приготовление питательных сред, соблюдение правил асептики и посадки изолированного материала выполняли по стандартным методикам (Калинин, 1980).

Доноры для культуры пыльников выращивали в зимнее время года в боксах и грунтовой теплине, летом — и нолевых условиях. При выращивании до-норпых растений в теплице поддерживали следующий режим: температурные параметры днем 22-28°С, ночыо 16-20'С, фотопериод 16 часов, освещенность 15000 люкс. Основной отбор побегов с колосьями проводили ежедневно в утренние часы. Материалом для получения гаплоидов служили 10 родительских форм и 86 комбинаций межвидовых гибридов Р1, Р2, РЗ, Р4 и Р5.

Для точного определения стадии развития микроспор использовали методику давленных препаратов. В качестве красителя использовали ацетокармнн. Наблюдение проводили иод микроскопом ОРТОЫ-35. Помимо проведения цитологического анализа, стадию вакуплизнроианнон микроспоры определяли по следующим морфологически!) нрпжакам:

— размер и »чет пыльника (Bernard, 1980; Ouang, 1983);

— степень плотности чешуй колоса (Дьячук, 1989);

— положение колоса на растении (Суханов, Тырнов, 1981).

Пыльники культивировали на питательных средах Potato 2, N б, N б с

картофельным экстрактом (Chunng, 1987). В жидких средах для улучшения аэрации микроспор использован» фиколл и бумажные "мостики". Для регенерации растений использовали среду Б л с иди с ИУК 0,2-0,5 мг/л (Picard, Buyser, 1973. 1975). Каллусы субкультивировали на питательной срсде с 2 мг/л 2,4Д. Для получения регенератов из каллусных тканей выделяли морфогенные зоны и пересаживали их на среду, индуцирующую.развитие растений.

Полученные пробирочные растения колхицинировали с целыо удвоения хромосом у гаплоидов. Для определения плоидности у регеперантов использовали цитологические методы (Паушева, 1970).

Полученные аидроклиниые гомозиготные линии ежегодно передавали и лабораторию селекции н семеноводства яровой мягкой пшеницы, где они проходили испытания в селекционных питомниках по общепринятой схеме селекционного процесса (Ильина, 1970, 1989). Стандартами являлись районированные в Саратовской области сорта Саратовская 42 и Саратовская 46,

Экспериментальные данные обрабатывали методом дисперсионного анализа количественных признаков на ЭВМ типа "XT" IBM. Значимость результатов определяли по критерию Фишера (F) и наименьшей существенной разности (НСР) (Доспехов, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

КУЛЬТУГА ЗАРОДЫШЕЙ JN VITRO ПРИ МЕЖВИДОВОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ ПШЕНИЦЫ

Для преодоления прогамной несовместимости рыльца пшеницы обрабатывали раствором пролипа 200 мг/л, благоприятное развтгше гибридных зародышей стимулировали опрыскиванием колосьев раствором гибберелловой кислоты (75 мг/л) (Лукьяшок, 1983). У гибридов T.durum/T.pereicum к-13385 так;« обработка колосьев способствовала увеличению завязываемости пл.39% но сравнению с необработанными колосьями. У гибридов T.durum/T.petsicum к-40576 увеличение зави >ы-ваемости обработанных колосьев составило 24,5%; у T.durum/T.aetliiopicum-7,4?o, Средняя величина завязываемости гибридов T.aestivum/T.pcrsicum, T.ncstivimi/ T.aetliiopicum и T.aestivum/T.dicqccum при обработке колосьев раствором иро-лина и Г. К. составила 38,2%, что на 10,7% выще, чем без обработки.

Для преодоления посггамной несовместимости использовали метод эмбри-окультуры. В ходе эксперимента были определены рптимальные сроки введения зародышей в культуру для получения жизнеспособных проростков, равные 13-14 дням после опыления.

Эффективность метода эмбриокультуры зависела от комбинации скрещивания. Результаты эксперимента показали, что для гибридов мягкой пшеницы с голозерными пшеницами Т.регасит н Т.аеИпоркит в доращивании незрелых зародышей на искусственной питательной среде практически нет необходимости. По четырем гибридным комбинациям этих пшениц формирование растений с применением эмбриокультуры в среднем составило 98,5%, без эмбриокультуры — 91,2%. Доращивание зародышей Т.(1игит/Т.реге1сит и Т.ёигит/Т.аеЛтршит позволяло в отдельных случаях поднять количество жизнеспособных эмбрионов от 0 до 100%. Использование метода эмбриокультуры при получении гибридов Т.аехНуит/Т.сПсоссит увеличивало выход растений на 14,3%.

Репродуктивно изолированный вид Т.иторЬееуН с трудом скрещивается с мягкой и твердой пшеницей. В среднем по двум комбинациям скрещивания Т. аезиуит/Т.пторЬееУп без применения метода эмбриокультуры лишь 50% завязавшихся зерновок сформировали зеленые растения. Культивирование незрелых гибридных зародышей повышало количество жизнеспособных эмбрионов на 27,5%, однако растения оставались стерильными. Поэтому для получения фертильного потомства проводили возвратные скрещивания.

Сочетание методов эмбриокультуры, беккроссирования и культуры изолированных молодых соцветий позволило нам получить семенное потомство от 18 гибридных комбинаций Р1ВС1; Р1ВС2 и Р1ВСЗ Т.аез1тш1/Т.йторЬееУп// Т.аевйуит.

ГАПЛОИДЫ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДОВ

ГЕИОТИПИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КАЛЛУСООБРАЗОВАНИЯ И

. РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ «

В проанализированном нами наборе генотипов тетраилонды Т.йигот, Т.Лсоссит, Т.аеМнортсит и "С (йпорЬееун характеризовались низкими андроге-нетическимн потенциями по сравнению с гексаплоидной мягкой пшеницей.

Наряду с этим нами выделена тетраплоидная пшеница Т. ре гасит (к-13385), которая на протяжении 10 лет превосходила другие виды по каллусообразующей и регенерационной активности (табл. 1).

Таблица 1

Частота индукции новообразований у различных видов пшениц

Сорт, Частота ицдукии» повообразоианий, %

сортообразец

, 1988 г. 1989 г. 1990 г.

Г.им/Лкт

Саратовская 29 1,2 (6/481К 3,2 (41/1274К 0,2 (2/ту

Саратовская 46 0 (0/397) 5,5 (43/781)* 5,2 (28/542)*

Мьбндул 28 1,3 (4/313) 0,5 (3/556) 0 (0/680)

Г.фтнп

Харьковская 46 0(0/118) 1,2 (14/1202) 0,2(1/616)

С-1889 0 (0/(72) 0 (0/469) -

Т.регзкит

к-13385 7,4(13/175)* 2,7 (22/829)* 1,2 (12/963)*

к-40576 0,7 (1/135) 0,2 (2/877) 0,2 (1/617)

Т.ааЫчркчт

к-43757 0 (0/54) • 0,2 (2/977) 0 (0/755)

ТМкоссит

К-9228 0 (0/173) 0,2 (3/1500) 0 (0/1019)

РфПКГ. 8,92* 20,87* 26,19*

НСРодо 2,05 1.12 . 0,86

Примечание. в скобках представлены абсолютные значения, * — различия значимы на уровне 0,05.

Способность полученных гибридных растений к андрогенезу находилась в прямой зависимости от сортовых и видовых особенностей родительских форм. В зависимости от генотипа частота возникновения новообразований по отношению к числу культивируемых пыльников составляла 1,0-8,296, регенераитов — 0,3-6,5% и гомозиготных линий — 0,3-1,4%. Гибриды Т.ае51тдтД.регегсит по морфогснетической активности имели значимое превосходство над гибридами Т.аея(¡уит/Т.аеОйоргсит. При эТом наибольшую частоту новообразований имели те гибриды, где в качестве материнской формы использовался высокоотзывчивый сорт Саратовская 46. Следовательно гибрид наследует высокую мор-фогенетическую способность как'от отцовского, так и от материнского родителя.

В зависимости от генотипа частота формирования регенерангов, дефектных по синтезу хлорофилла колебалась от 41 до 87% и была наименьшей у гибридов Т.а^л'ипуТ.регзюит. На рис. 1 представлено суммарное соотношение зеленых, альбиносных растении и дигаплоидных линий у четырех групп гибридов.

Лшши: 1-40,6%;

2-3,8

■ 3,0%;

4- 10,7%.

Рис. 1. Схема, иллюстрирующая соотношение зеленых — ; альбинос-

ных —[ ¡растении регенерантов и гомозиготных линий — [ ] в культуре пыльников гибридов: 1 — Т. аез( 1 \и т/Т. р е ге 1 с шп; 2 — Т.ае511Уит/Т.ае11порюит; 3 — Т^игиш/Т.регБюит; 4 — Т.с1ишт/Т.ае11иор1еит.

Гибриды Т.ае511Уит/Т.регасит и Т^ишт/Т.регекит имели более низкий показатель альбинизма, чем гибриды Т.ас^ИУит/Т.аеИпаркит и Т.йигит/ Т.аеН1юр1сит. Максимальное количество гомозиготных линий было получено от гибридов Т.аезпуит/Т.ретсит.

Путь морфогенеза (эмбриоидогенез, каллусогенез) также детерминировался генотипом. Эмбриоиды формировались с частотой 83,1-96,4%, а рыхлый гаплоидный каллус составлял 3,6-16,9% от общего числа новообразований. Был выявлен эффект отцовского родителя: в гибридах Т.аезиуит/Т.аЫиоркит и Т.йигит/Т.ае^юрюит все растения были получены лишь путем прямого эмб-риоцдогенеза, каллус оказался неморфогенным. У гибридов Т.аезЦуит/Г.решсит и Т.с1игит/Т.рег5юит наряду с достаточно хорошей способностью к прямому эмбриоидогенезу (71,3-85,5%) наблюдалась высокая способность к регенерации посредством каллусогенеза.

МОРФОГЕНЕТИЧЕСКПЕ СПОСОБНОСТИ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ БЕККРОССИРОВАПНЫХ ГИБРИДОВ

Способность к ганлопродукции гибридов, полученных от возвратных скрещиваний, проявилась следующим образом. В тех случаях, когда отзывчивость на андрогенез материнского растения существенно не отличалась или была ниже отцовского, частота новообразований у гибридов, как правило, значительно превышала этот показатель у обоих родителей. В такой же последовательно« и проходила и индукция зеленых растений (рис. 2).

9 »

7 <

К . S

I «

в-

3 2 -I

S,I

2,7

0.5

2.7

0,1

2,2

—

1 2 .3 4 1 5 6 7

Генотип

Рис. 2. Частота индукции новообразований —( | и зеленых регецерантов

' — ( |в культуре пыльников при возвратном скрещивании гибридов Т.аейтяп/ Т.ретасит/УТ.аеБ^уит и Т.аезНтц/Т.аеийор^ит/УТ.аеяиуит. 1 — Р1 — А.28; 2

- Р2 - Т.р.; 3 - А.28/Т.р.; 4 - Р1ВС1 А.28/Т.р.//А.28; 5 - Р2 - Т.аеНт.; 6

- Р1 А.28/Т.аеП1.; 7 - ПВС1 А.28Д.ае«1.//А.28.

В тех случаях, кош авдрогенетическая способность к формированию новообразований у материнского растения была значительно выше, чем у отцовского, отзывчивость гибрида занимала промежуточное положение между родителями (рис. 3).

5,5

2,7

3,2

3,2

2,3 г.4

»,0

"71 0,2

I I 3 4

Рис. 3. Частота индукции новообразований —

Генотип

и зеленых регенератов

в культуре пыльников при возвратном скрещивании гибридов T.aestivuni/

T.persicum//T.aestivum 1 — PI — С,46; 2 - Р2в— Т.р.; 3 — FI С.46/Т.р.; 4 F1BÇ1 С.46/Т.р.//С.46; 5 - PI - С.29; 6 - Р2 - Т.р/; 7 - FI С.29/Т.рУ; 8

F1BC1 С.29Д.р///С.29.

В .5

Частота индукции новообразований в беккроссных поколениях приближалась к таковой у реккурентного родителя. Индукция зеленых растений не всегда совпадала с частотой новообразований, так как процессы индукции эмбриоидов и регенерации растений контролируются различными генами (Heberle — Bors, 1985). Сравнение поколений F2 и F3 ( 2,5% и 0,9%); F2BC1 и F3BC1 (1,6% и 0,4%) свидетельствовало о том, что чем выше гетерозиготность гибридов, тем большей способностью к гаплопродукции они обладают.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕДОБРАБОТОКДОНОРНЫХРАСТЕНИЙ

С цитолого-эмбриологических позиций проблема формирования гаплоидов в культуре пыльников связана с решением проблемы " переключения" развития микроспор с обычного для них гаметофитиого пути на спорофитный путь развития (Sunderland, 1977). Для повышения выхода гаплоидов при культивировании пыльников злаковых культур используют различные методы предобработки и обработки во время культивирования (Ни Нап, 1985). Юркова, Левенко (1982) к факторам, повышающим выход гаплоидных растений, относят предварительную обработку пыльников пониженными (3-5°С) и высокими (30-40'С) температурами, химическими препаратами и т.д.

В ходе эксперимента мы воздействовали пониженной положительной температурой (4°С) на колосья срезанных донорных растений. У гибрида F2 Аль-бидум 2S/T.persicum предобработка колосьев в течение 10 дней пониженной температурой снижала частоту новообразований по сравнению с контролем в 4 раза. Воздействие холодом в течение 15 дней на колосья этого гибрида вдвое снижало его регенерационную способность. При более длительном (до 25 суток) воздействии на колосья пониженной температурой, у гибридов, как правило, снижалась частота формирования структур. Но высокоотзывчивый гибрид F2 Альбидум 28/T.persicum после 22 дней предобработки сохранял высокую способность к гаплопродукции.

С целью увеличения частоты фракций эмбрйогенных пыльцевых зерен мы проводили воздействие на донорные растения раствором ауксина. Впрыскивание раствора 2,4Д в концентрации 2 мг/л в колос в момент среза и в период выхода в трубку значимо повышало частоту индукции новообразований. Обработка доноров раствором 2,4Д в концентрации 4 мг/л во всех вариантах имела отрицательный результат (табл. 2). Исследован другой способ воздействия ауксина на гибриды. Срезанные донорные растения помещали в раствор 2,4Д 2 мг/л И выдерживали в течение одной недели при температуре 4'С. Для контроля колосья в тех же условиях помешали в воду.

Таблица 2

Влияние предобработки донориых растений раствором 2,4Д на частоту индукции новообразований

Гибрид Стадия микроспор Концентрация Частота шшукиии

2,4Д (мг/л) новообразований, %

тетрада 0 0,1(1/1361)/

РЗ А.28/Т.р. 2 2,3 (4/171)*

вакуолизироваииая 0 0,1 (1/1361)

микроспора 2 2,7 (3/109)*

тетрада 0 1,7 (25/1450)

Р2 А.28/Т.р. 2 . 6, Г (4/66)*

вакуолизироваииая 0 1,7 (25/1450)

микроспора 2 0 (0/334)

Рфакг. 7,12*

НСР0,05 1,16

Примечание. * — различия значимы на уровне 0,05; /— в скобках представлены абсолютные величины.

Средняя частота новообразований четырех комбинаций, обладающих относительно высоким андрогенетическим потенциалом, Т.ае^нит/Т.рсыеит, без обработки колосьев ауксином составила 2,6%. У колосьев, выдержанных в растворе ауксина, этот показатель был вдвое выше и равнялся 5,4%. Дли пяти гибридов с низким андрогенетическим потенциалом Т.аеБиуит/Т.Фсоссит обработка колосьев раствором 2,4Д существенного влияния не оказала: 0,7% (3/401) — с ауксином и 0,8% (3/377) — без ауксина. Этими гибридами не были реализованы потенциальные возможности к ганлопродукшш.

Таким образом, в нашем эксперименте воздействие пониженной температурой на колосья межвидовых гибридов в течение 10 дней снижало частоту новообразований в 4 раза по сравнению с вариантами, в которых пыльники помещали на среду в день среза. Так как для практических целей одномомсн I но инокулировать пыльники на питательную среду невозможно, есть смысл срезанные колосья хранить в воде при температуре от + 2'С до + 4'С сроком до 15 дней. Впрыскивание раствора 2,4Д в концентрации 2 мг/л в колос значимо повышало частоту индукции новообразований.

ОПТИМИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ

Успех экспериментального получения гаплоидов в культуре пыльников злаков во многом зависит от подбора оптимальных питательных сред. Исследователями было испытано большое количество сред с различными сочетаниями аминокислот, Сахаров, фитогормонов и добавок растительных экстрактов. (Keller, 1978; Nizeki, 1968; Gyha-Mukheijeé, 1973).

В наших экспериментах наиболее удачными были среды с добавлением картофельного экстракта Potato 2 и N б. Ранее нами отмечалось преимущество среды Potato 2 по сравнению со средой N 6 для культивирования пыльников яровой мягкой пшеницы (Дьячук и др., 1986). Результаты сравнения эффективности твердых питательных сред Potato 2 и N 6 для межвидовых гибридов были следующие. Средняя частота новообразований по семи комбинациям гибридов T. nestivum/T.persicum, T.aestivum/T.dicoccum и T.durum/T.persicum, культивированных на среде N 6 составила 0,6% (13/2030). Частота новообразований тех же комбинаций на среде Potato 2 была в 10 раз выше и составила 5,9% (172/ 2908). Преимущество картофельной среды было отмечено для пыльников каждой комбинации в той или иной степени. Однако характер и степень каллусо-образования зависели от генотипа.

Немаловажную роль в культуре пыльников играет степень гетерозиготно-сти гибрида, причем последняя способствует проявлению высокой андрогене-тической способности. Так частота андрогенеза Гибридов T.aestivum/T.persicum у F2 на среде Potato 2 была выше, чем у F3 в 2,4 раза. На среде N 6 гибриды F2 имели частоту новообразований в 4 раза большую, чем гибриды F3. Причем для этих гибридов эффект гетерозиготности был выше, чем эффект среды (рис. 4). Другими авторами отмечалось, что уровень гаплопродукшш у злаков в F1 был выше, чем в F2 (Лукьяшок, Игнатова, 1983). При сравнении резльтатов культивирования пыльников гибридов F3 и F4 на питательных средах Potato 2, N 6, N 6 (+ мальтоза), N 6 (+ картофельный экстракт) было отмечено преимущество гибридов F3 на всех вариантах. У этих гибридов средняя частота формирования андрогенных структур была в 2 раза выше, чем y.F4.

В своих дальнейших исследованиях по совершенствованию состава питательных сред для межвидовых гибридов, мы предпринимали попытки добавить картофельный экстракт в другие питательные среды. Так, пыльники 21 гибридной комбинации были инокулированы на среду N 6 с добавлением картофельного экст ракта и на обычную среду N 6 (контроль). Частота образования андро-генетических структур на среде с картофельным экстрактом составила 8,5% (288/ 3385) и была в 3,3 раза выше, чем в контроле.

>s

s

§

a

s

n о

« ¡Г

г -

2,4

1,6

<. у,. 1,0

. - 0,4 pFTTj

iiil^

F2

F3

Гибрид

Рис. 4. Влияние питательных сред на частоту индукции новообразований у

— cpeaaN6,l I — среда Potato 2.

гибридов F2 и F3T.aestivum/r.peisicum:

Следует отметить, что эффект питательных сред был наиболее заметен в сочетании с другими факторами, благоприятными для'проявления анлрогене-за. Мы уже отмечали сочетание эффекта питательных сред с генотипом и гете-розиготностыо последнего. Известна зависимость морфогенетической способности растений от условий выращивания доноров (Приходько, 1989); (Heberle — Bors, 1985). В связи с этим следует сравнить данные, полученные в контрастные годы. В 1995 году, характеризующимся высокой засухой,, добавление в питательную среду картофельного экстракта увеличивало частоту авдрогенеза у гибридов Fl в 6 и 20 раз, а у гибридов F2 в 4 раза. Совершенно другая картина наблюдалась при изучении эффекта добавления картофельного экстракт а в среду для гибридов поздних поколений в относительно холодное и влажное лето 1994 гада. По всем восьми гибридным комбинациям, не зависимо от генотипа, практически не было сформировано новообразований на всех вариантах сред. Следовательно климатические условия онтогенеза донорных растений в данном случае сыграли первостепенную роль.

В нашем эксперименте замена сахарозы на мальтозу для гибридов T.aesiivum/ T.peisicum увеличивала частоту новообразований в 2,6 раза. Причем для гибридов F3 эффект от добавления мальтозы составил 6,5?о, а для гибридов П4 —

1,6%. Гибриды Р4 и Р5 Т.ае.МКит/Т.сЯсоссшп имели настолько низкую частоту андрогенеза, что сделать вывод о эффективности культуральных сред и добавок практически невозможно.

Повышению частоты андрогенеза способствовало использование для культивирования пыльников жидких сред с добавлением фиколла (табл. 3).

Таблица 3

Влияние питательных сред на частоту новообразований у межвидовых гибрнлоп

Гибрид Частота индукции новообразований, % F НСР

жидкая среда (+ фиколл) твердая среда (агар)

А.28 2,0 (1/49К 0,7 (3/475)/ 1,1 2,66

Л.28/Т.р. 10,9 (6/55)+ 5,0 (18/361) 3,1 6,72

Л.28/Т.р.//Л.28 41,7 (50/120)* 8,1 (29/358) 86,3* 7,20

A.28/T.aeth. 3,9 (3/76)* 1,1 (11/968) 4,2* 2,27

Всего 20,0 (60/300)* 2,8 (61/2142)* 176,1* 2,58

Примечание. п скобках представлены абсолютные величины; * — различия значимы На уровне 0,05; + — фиколл заменен бумажным "мостиком".

Средняя частота новообразований на жидкой среде составила 20% ( 60/300), что в 7 раз выше, чем Fia твердой среде. На жидкой питательной среде с использованием "мостика" из фильтровальной бумаги частота андрогенеза составила 10,9%, что вдвое выше, чем на агаровой среде.

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ЧАСТОТУ АНДРОГЕНЕЗА

В ходе эксперимента установлено преимущество летнего времени года для выращивания донорных растений для культуры пыльников (табл. 4).

Растения, вегетирующие в поле, формировали андрогенетические структуры в среднем с частотой 3,6%, что в 4,5 раз превышает показатели тепличного

материала.

Таблица 4

Влияние условий выращивания доноров на частоту индукции новообразований у межвидовых гибридов

Гибрид . Частота индукции новообразований при выращивании доноров F НСР

в поле в теплице

А.28/Т.р. 3,5 (75/2174)/* 0,9 (27/2999)/ 45,1* 0,76

С.29/Т.р. 2,0 (31/1570)* 0,7 (20/2791) 13,8* 0,67

С.46/Т.р. 8,2 (159/1940)* 0,9 (26/2879) 172,9* 1,10

C.29/T,aeth. 1,0 (11/1082)* 0,2 (5/2370) 10,5* 0,49

С.4б/Т.аеШ. 1,3 (17/1363)* 0,4 (12/2702) 8,3* 0,56

Примечание. /— в скобках представлены абсолютные величины; * — различия значимы на уровне 0,05.

Условия выращивания доноров оказывали влияние и на путь морфогенеза (каллусогенез, эмбриоидогенез). Суханов (1983), Ни Пап (1985) отмечали, что прямой эмбриоидогенез предпочтительнее каллусогенеза. В наших исследованиях было отмечено, что в зимнее время года спорофитное развитие микроспор в большей степени смещено в сторону образования рыхлого каллуса. Доля каллуса пяти гибридных комбинаций, вегетирующих в иоле, в среднем составляла 6,8% от общего числа новообразований. При культивировании пыльников гибридов, выращенных в теплице в зимнее время года, доля каллуса возросли в 3,8 раза н составила 25,5%.

Следовательно, выращивание доноров летом способствует увеличению доли регеиерангов, полученных путем прямого эмбриоидогенеза.

При сравнении одиннадцати экспериментальных опытов (I9S6-1996 гг.) было отмечено, что наиболее благоприятной для протекания андротенетичес-ких процессов являлась жаркая и сухая погода.

СЕЛЕКЦИОННАЯ ЦЕННОСТЬ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ МЕЖВИДОВЫХ

ГИБРИДОВ

За период с 1986 fio 1997 год в культуре пыльников на основе гаплоидов было получено ЗЫЗ гомозиготных линий в потомстве от скрещивания: T.aestivum/

Т.репнсит к-(3385, Т.ае^К'ит/Т.регеюит к-40576, Т.аеь^уит/Т.аеЛюркит, Т.яеяМЧтт^^.йгсоссит, Т.аея^уит/ТЛйпорЪееУн, Т.иитт/Т.регасит ИТ duгum/ Т,ае1|)юрк:шп. С настоящее время полученные аидрогенные линии испьпыватотся в различных звеньях селекционного процесса лаборатории селекции н семеноводства яровой мягкой пшеницы. От скрещивания мягкой пшеницы с Т.реге'юит выделены линии с сочетанием признаков; высокой продуктивности, низкорос-лости, скороспелости, устойчивости к пыльной головне и мучнистой росе. Ценный селекционный материал использовался в дальнейших скрещиваниях. Примером того может служить линия 139 р9 [Саратовская 58/Т4 (Альбцдум 28/ Т.реписшп)], полученная в лаборатории селекции и семеноводства яровой мягкой пшеницы. Данные по продуктивности этой линии за период испытания в контрольном питомнике (1995 г.) и питомнике предварительного конкурсного испытания (1996 г.) были следующие. В КП (1995 г.) линия 139 по урожаю зерна значимо превышала стандарты: Саратовскую 42 — на 2,8 ц/га и Саратовскую 58 — иа 3 ц/га. В ПКИ (1996 г.) урожай зерна линии 139 был выше Саратовской 42 на 2,6 ц/га и выше Саратовской 58 на 1 ц/га. Линия 139 проявила устойчивость к пыльной головне и частично к мучнистой росе. По содержанию клейковины она значительно превосходила все стандарты и имела высокие показатели объёма и пористости хлеба.

В настоящее время изучаются андрогенные линии, полученные от скрещивания мягкой пшеницы сТ.сНсоссшп иТ.Иторйееуц. С использованием культуры пыльников выведен и передан на Государственные испытания совместно с селекционерами новый сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64.

выводы

1. Установлена различная реакция на эмбриокультуру при получении межвидовых гибридов T.aestivum/T.persicum, T.aestivum/T.aethiopicum, T.aestivum/ T.dicoccum, T.aestivum/T.timopheevii, T.durum/T.persicum, T.durum/ T.aethiopicum.

2. В культуре пыльников межвидовых гибридов высокая морфогенетичес-кая способность наследовалась как от материнского, так и от отцовского родителя. Объединение геномов родителей с низкой нормой реакции по этому признаку давало значимый гетерозисный эффект. Частота андрогенеза в беккросс-ных скрещиваниях приближалась к таковой у реккурентного родителя.

3. В комбинации T.aestivum/T.persicum гибриды F2 .поколения показали значимо более высокие андрогенетические потенции, чем гибриды F3 и F4, независимо от состава питательных сред.

4. На межвидовых гибридах определены оптимальные сочетания условий выращивания доноров для культуры пыльников, предобработки колосьев раствором 2,4Д, комплексного состава питательных сред, способствующих повышению частоты эмбриогенных пыльцевых зерен.

5. В потомстве от скрещивания T.aestivum/T.persicum, Т. aestivum/ T.aethiopicum, T.aestivum/T.dicoccum, T.aestivum/T.timopheevii, Т.durum/ T.persicum, T.durum/T.aethiopicum получены и размножены 360 андрогенети-ческнх линий, обладающих комплексом хозяйственно-ценных признаков.

6. С использованием культуры пыльников выведен и передай на Государственные испытания совместно с селекционерами новый сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В целях повышения эффективности культуры пыльников межвидовых гибридов пшеницы предлагается использовать комплекс условий, вызывающих увеличение частоты новообразований.

2. Созданные на основе гаплоидов гомозиготные линии межвидовых гибридов пшеницы (360 шт.) рекомендуется использовать в селекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дьячук П.Л., Дьячук Т.И., Кудашкина C.B. и др. Получение гаплоидных растений мягкой яровой пшеницы Саратовских сортов в культуре пыльников.// Докл. ВАСХНИЛ. - M.:" Атропромиэдат", 1986. - № 10. - С. 3-4.

2. Дьячук П.А., Кудашкина C.B. и лр. Культура тканей и возможности её использования в селекции яровой мягкой пшеницы НИИСХ Юго-Востока.//Тез. док. 5 съезда ВОГиС. — М„ 1987. — С. 131.

3. Дьячук Т.И., Столярова C.B., Носова О.Н. Культура пыльников межвидовых гибридов пшеницы и тритикале.//Сб. науч. трудов: Биол. основы селекции. РАСХН. - Саратов, 1991. — С. 35-41.

4. Столярова C.B., Дьячук Т.И. Метод культуры пыльников в межвидовой гибридизации пшеницы.//Матер. Всес. науч. конф. по с.-х. биотехнол. Тез. докл. ~ Целиноград, 1991. — С. 54-55.

5. Столярова C.B. Закономерность наследования признака "частоты индукции новообразований" в культуре пыльников межвидовых гибридов пшеницы при беккроссах.//2 Рос. симп. "Новые методы биотехнологии растений". Тез. док.

- Пущино, 1993, 4.4. — С. 213.

6. Столярова C.B. Использование метода культуры зародышей in vitro при межвидовой гибридизации пшешщы.//Генетика. Приложение, 1994, т. 30. — С. 151.

7. Столярова C.B., ДьячукТ.И. Биотехнологические способы преодоления трудной скрещиваемости T.aestivum с T.timophéevii Zhuk.//C6. науч. трудов: Итоги и перспективы исследований в области селекции, семеноводства и ландшаф-тно-экологического земледелия. РАСХН. — Саратов, 1995. — С. 32-33.

8. Дьячук Т.И., Тучин C.B., Столярова C.B. и др. Использование методов биотехнологии в селекции пшеницы и ячменя.//Сб. науч. трудов: Селекция, семеноводство и технология воздел, полевых культур. РАСХН. — Саратов, 1996.

— С. 41-48.

9. Dyatchouk T. I., Stoljarova S.W. Response of different wheat species in anther culture.//Annual Wheat newsletter. KSU USA, 1996. - Vol. 42. — P. 175.

6A^b-

СГПТ f* 6 3.K, № Тир. уГУ