Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культура нервной ткани как модель для исследования ранних стадий формирования сетевидных структур нервной системы

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Культура нервной ткани как модель для исследования ранних стадий формирования сетевидных структур нервной системы"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 576.535.5/.536:612.825

Мутана Ибрагим Хамед

Культура нервной ткани как модель для исследования ранних стадий формирования сетевидных структур нервной системы

Специальность: 03.00.11. эмбриология, гистология, цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова и в лаборатории системогенеза НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН.

Кокина Н.Н.

Научные руководители: доктор биологических наук кандидат биологических наук Зеленина И.А.

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Ярыгин В.Н.

доктор биологических наук, профессор Аджималаев Т.А.

Ведущее учреждение - научно-исследовательский институт экспериментальной медицины им. И.П.Павлова РАМН.

Защита состоится " 17 " ноября 1994г. в 1522 часов на заседании специализированного совета Д.053.05.68 при Московском государственном университете им. М.ВЛомоносова по адресу: 119899, г.Москва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета.

Автореферат разослан "_" октября 1994г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук Калистратова Е.Н.

Актуальность темы. Одной из важнейших проблем

нейроонтогенеза является процесс формирования

морфофункциональных элементов врожденных функциональных систем, который осуществляется еше в эмбриональной стадии развития (Судаков К.В., 1980).

Несмотря на существующие представления о стадиях нейроонтогенеза (Кокина H.H., 1974; Максимова Е.В., 1979, 1985; Шулейкина К.В., 1985), некоторые механизмы организации нервной ткани изучены еще недостаточно, особенно мало обобщенных фактов по ранним стадиям нейроонтогенеза.

Предметом настоящего исследования была выбрана нейроначьно-глиальная сеть, как определенная стадия формирования организации коры больших полушарий.

Эта стадия как органически, так и филогенетически предшествует образованию плотных нейрональных организаций (Коштоянц К.С., 1957). Именно на этой стадии решается вопрос избирательного расположения клеток и последующего избирательного образования межклеточных контактов.

Эта стадия нейрональной сети, как одна из ранних стадий эмбриогенеза нервной ткани хорошо выявляется в условиях тканевых культур (Крейс С., 1980). В результате сортировки клеток они объединяются не по принципу анатомической близости, а по каким-то другим, пока еше не ясным признакам избирательного сродства (Moscona A.A., 1962). Имеющиеся в литературе данные относятся к морфологогическим характеристикам нейрональных сетей и даны в основном не на культуре, а на целом мозге. К- ним относятся работы, в которых предпринимается исследование по выделению нейрональных организаций не по принципу территориальной близости, а по принципу функциональных модулей (Сентаготаи Я., Арбиб М., 1976). Таким образом, сетевидные образования в культуре коры больших полушарий новорожденных крыс были нами взяты как модель ранней стадии" модульной организации нервной системы. Подобная характеристика этой сети важна для понимания общих законов развития мозга.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение процесса формирования нейронально-глиальной сети и ее морфофизилогических свойств в культуре нервной ткани коры больших полушарий новорожденной крысы, как модели определенной стадии онтогенетического формирования функциональной системы.

В задачи исследования входило. 1. Описать процесс формирования нейронально-глиальной сети в уловиях прижизненного ее наблюдения в культуре нервной ткани.

2. Дать разностороннюю характеристику клеточным элементам, образующим нейронально-глиальную сеть, используя

электрофизиологические и морфологические методы исследоваия.

3. Определить степень зрелости нейронально-глиальной сети по вышеуказанным показателям.

4. Исследовать влияние биохимических (иммуностимулятор нейротропин) и физических (лазерное излучение) факторов на нейронально-глиальную сеть.

5. Разработать методы анализа клеточных культур, адекватные поставленным задачам.

Научная новизна работы. В работе выделен и прижизненно описан процесс формировния онтогенетической стадии созревания нервной ткани: нейронально-глиальная сеть.

Определена степень морфофункциональной зрелости по показателям биоэлектрической активности и по результататм электронно-микроскопического выявления контактов мембран.

Впервые показано синхронизирующее действие иммуностимулятора нейротропина на рост отростков в околоклеточных зонах (ОКЗ). Также впервые обнаружено влияние лазерного излучения на форму тела клеток нейронально-глиальной сети.

Научно-практическое значение работы. Полученные данные могут иметь практическое применение в научных исследованиях по нейробиологии. Результаты проведенных исследований дают возможность глубже понять механизмы межклеточных взаимодействий, предшествующих синаптогенезу и выяснить роль периодических внутриклеточных процессов при формировании межклеточных связей. Полученные данные по влиянию иммуномодулятора нейротропина на синхронизацию роста отростков клеток нейронально-глиальной сети подтверждает феноменологическое сходство нервной и иммунной систем.

Положения, выносимые на защиту.

1. Нейронально-глиальная сеть, как стадия развития нервной системы, является онтогенетически незрелым образованием.

2. Иммуностимулятор нейротропин оказывает синхронизирующее действие на динамику роста клеточных отростков в ОКЗ клеток нейронально-глиальной сети.

3. Лазерное излучение оказывает тонизирующее действие на клетки нейронально-глиальной сети и влияет на их форму.

Апробация работы. Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на секции "Нейрон in vitro" при отделении биофизики АН СССР (Пушино, 1990) на секции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" V Всесоюзной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения академика АН Армянской ССР, члена-корреспондента АН СССР Х.С.Коштоянца (Москва, 1990).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 24 рисунка. Список литературы включает 221 названий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования явилась культура клеток сенсомоторнои области коры больших полушарий новорожденных крысят линии Ч^аг (Вепринцев, 1976). Известно, что процесс становления структурной организации коры не заканчивается к моменту рождения. В условиях культивирования развитие продолжается благодаря тому, что клетки сохраняют свои морфогенетические потенции (Г.В.Коновалов и др., 1978; И.К.Сванидзе, 1984; ОагЬег, 1972). В работе использовано более 50 культур. Трипсинизированная (0,025% р-р трипсина) выращивалась на покровных стеклах, покрытых коллагеном в пеннииллиновых флаконах. Культурная среда для клеток состояла из: плацентарной сыворотки человека - 25%, среды, раствора Хенкса - 45%, среды Игла - 25%, среды 199 - 5%. Помимо указанных компонентов к 500 мл смеси добавляли: витамины В! (6% р-р; 0,05 мл), В6 (2,5% р-р; 0,05 мл), В12 (20% р-р; 0,1 мл), С (5% р-р; 0,05 мл), глюкозу (40% р-р; 7 мл), гидрокортизон (20% р-р; 0,05 мл), глютамин ( 3% р-р; 6 мл). Прижизненные наблюдения за клетками проводились в чашке Петри и в камерах Максимова. Использовался микроскоп МБИ-6, СТК-1 с фазовоконтрастным устройством. Для изучения динамики роста клеточных отростков, в течение 7 часов наблюдения проводились в камере Максимова.

Микрофотосъемка нейронально-глиатьных сетей проводилась с интервалом в 1 час. Для широкого охвата объекта микрофотосъемка велась на малом увеличении (об. 10 х ок.20). Фотоотпечатки пограничных полей зрения складывались в фотополотно, лаюшее представление о более широком клеточном поле. В результате получались фотополотна, отражающие состояние нейронатьно-глиатьных сетей через каждый час в 7 часов. Анализ этих фотополотен включал следующие процедуры:

1. Идентификация клеточного состава культуры проводилась как с помощью электронной микроскопии, так и исходя из морфологических признаков на световом уровне: структура ядра и цитоплазмы, структура и характер ветвления отростков.

2. У идентифицированных клеток подсчитывалось обшее количество отростков, находящихся в круге. проведенном из центра клетки, с радиусом равным двум клеточным диаметрам. В их число входили проксимальные участки отростков самой клетки, количество которых практически не изменялось, а также отростки других клеток, подходившие к данной клетке или проходившие около нее. Площадь внутри этого круга была принята нами за околоклеточную зону.

3. При увеличениях об.40 х ок.20 велось наблюдение за морфологическими изменениями клетки, ее органелл и контактов. Все полученные данные записывались в индивидуальный паспорт клетки.

4. Для электронной микроскопии клетки выращивались на полиэтилфталатной пленке, которая погружалась в питательный раствор вместо покровных стекол. Пленки обрабатывались по методу, предложенному В.М.Вуравлевым и др. (1973). Культуры фиксировать 30

мин. раствором глутаральдегида на фосфатном буфере, дофиксировались 1% OSO4, дегитратировались в спиртах и ацетоне и заливались в эпон-812. Применявшаяся пленка легко отслаивалась от залитой культуры. Срезы делались на ультратроме КВ. Контрастировали^ уранилацетатом и свинцом по Рейнольдсу (1963).

5. Электрофизиологические эксперименты проводились в камере из оргстекла на термостолике микроскопа МБИ-3 (Кокина, Жуковская, 1968), температура поддерживалась на уровне 35~37оС.

Мембранный потенциал отводился стеклянным пирексовым микроэлектродом, заполненным 2,5 м раствором KCL, с диаметром кончика не больше 0,5 мкм и сопротивлением 30-60 мОм. Электрод изгибался под прямым углом и подводился к эксплантату микроманипулятором MM-I. Культура просматривалась сверху при увеличении 10x10, 10x20, 10x40. Исседуемые области прижизненно фотографировались, а после опыта препарат окрашивался метиленовой синью, по Нисслю, серебрился по Вейсу в модификации Оленева (1977). Внутриклеточная регистрация велась на предусилителе с высокоомным входом типа УТП-2 и катодом осциллографа CI-19. Запись производилась на шлейфном осциллографе Н-700 или самописце Н-3020-3. Изоосматические растворы исследуемых веществ с pH 7,2-7,4 готовились непосредственно перед опытом на среде Хенкса из заранее приготовленных на бидистиллированной воде маточных растворов и вводились в камеру при помощи микроворонки. Культура находилась в висячей капле, растянутой между двумя дополнительными покровными стеклами. Смена растворов производилась путем их скапливания на дно камеры.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Процесс формирования нейронально-глиальных сетей.

В первые сутки культивирования идет процесс прикрепления микроэксплантатов диаметром от 50 мкм до 500 мкм.

На вторые сутки культивирования (30-40 час) начинается процесс миграции клеток из микроэксплантата, который может продолжаться и в последующие сутки со средней скоростью 5 мкм/час.

Миграция клеток из микроплантата происходит в различных формах:

1. Миграция отдельных клеток. Как правило, это биполяры.

2. Миграция группы клеток. Сначала на поверхности микроэксплантата формируется конусообразный выступ, из этого выступа в дальнейшем выходит цепочка биполярных клеток. Такие цепочки могут состоять из нескольких клеток (от 2 до 10).

Иногда такие выступы и цепочки клеток могут находиться в близком соседстве. Впоследствии клетки, составляющие цепочки, как правило, перегруппировываются в более компактные ансамбли.

3. Миграция в виде широкого пласта поверхности микроэксплантата. Такой пласт клеток представляет собой зону роста. В

э

зоне роста биполяров имеются и мультиполярные клетки, между которыми уже наблюдаются первичные межклеточные связи. Так что зона роста представляет собой отдельные клеточные агрегаты.

В образовавшихся в результате миграции клеточных ансамблях и агрегатах продолжается процесс формирования межклеточных связей с помошью активно растущих отростков. К 72 часам число межклеточных связей у клеток, составляющих агрегаты, достигает в среднем от 5 до 10 контактов на одну клетку.

На следующей стадии становления нейронально-глиальных сетей начинает идти процесс формирования связей между отдельными агрегатами и ансамблями, который осуществляется с помощью аксоподобных отростков на расстояния до 200 мкм.

2. Общая морфологическая характеристика нейронально-глиальных сетей.

Клеточные организации в тканевых культурах носят двойственный характер: с одной стороны - черты специфичности ткани целого организма, а с другой стороны сказывается адаптация к новым условиям изолированного существования.

В данном исследовании анализировались нервные сети, образующиеся после объединения клеток, разобщенных трипсином, а также из клеток мигрировавших после трипсинизашш микроэксплантатов. Следовательно, в этих сетях клетки объединялись "заново" и можно было изучать закономерности этого объединения.

По ряду характеристик, которые будут изложены ниже, нейронально-глиальная сеть, яатяюшаяся предметом исследования может быть отнесена к наиболее ранним сетям, образующимся в онтогенезе нервной системы (См. классификацию Милохина A.A., 1966).

Клетки, которые образуют сеть, располагаются на плоскости в виде неоднородных объединений. Они могут располагаться более плотными ансамблями, но в основном клетки таких сетей находятся друг от друга на расстоянии нескольких клеточных диаметров. Клетки распределяются на плоскости не диффузно, а группами, состоящими из варьирующегося числа единиц: 3-10 клеток. Морфологический анализ клеточного состава сетей при прижизненном наблюдении в световом микроскопе показал, что в сетях имеются клетки разного типа, нейроноподобные клетки, астроциты и олигодендрациты.

Дополнительным подтверждением нейрональной природы клеток сети olliо выявление нейронатьных элементов с помошью метода серебрения.

Поскольку при прижизненном микроскопировании на световом уровне имеются методические трудности различения нейробластов от глиобластов. мы в лпънсйшем будем пользоваться термином нейронально-глиальная сеть, не акцентируя внимания на том или другом виде клеток.

Электронно-микроскопические исследования также показали наличие в культуре как нейробластических. так и астроцитарных клеток и

различные формы контактов, предшествующие образованию типичного синапса. Контакты обнаруживаются как между отростками, так и между отростками и телами клеток.

Общее рассмотрение нейронально-глиальной сети позволяет считать, что наш обьект представляет собой избирательное объединение клеток недифференцированной нервной ткани на стадии, предшествующей типичному синаптогенезу.

3. Динамика роста клеточных отростков в околоклегочньгх зонах (ОКЗ).

В условиях прижизненного наблюдения обращают на себя внимание постоянные изменения в расположении клеточных отростков.

Картина поведения клеточных отростков показывает, что прямолинейный, независимый от субстрата рост может сменяться поисковым, адаптивным ростом. Конус роста, продвигаясь по субстрату, иногда перемешается по прямой. В других случаях конус роста перемещается по извилистой линии и отросток повторяет его путь. Предполагается, что различный рост отростков или одного и того же отростка в разные периоды времени связан с различной активностью внутриклеточных процессов. Следует учитывать, что как прямолинейный, так и извилистый рост осуществляется на. одном субстрате.

Особый интерес представляет поведение отростков, подрастающих к телу другой клетки. Наблюдаются также отростки, у которых прямолинейный рост сменяется извилистым (поисковым) при приближении к телу другой клетки. Эта извилистость роста отростка как бы отражает поисковый характер роста отростка, который как бы решает: образовывать контакт с данной клеткой или не образовывать.

Для исследования поведения клеточных отростков вблизи клеточных тел был использован метод фотополотен. Наблюдения за динамикой роста отростков с почасовой микрофотосъемкой проводились в течение 6 часов. По результатам микрофотосъемки было смонтировано 6 фотополотен. На этих фотополотнах было отобрано 30 клеток, в околоклеточных зонах которых подсчитывалась динамика изменения числа клеточных отростков по методике.

Данные подсчета приведены в таблице 1. Из таблицы видно, что в О КЗ каждой из исследованных клеток число отростков не остается постоянным, то есть наблюдается определенная динамика роста отростков, число отростков в ОКЗ в среднем на клетку равняется 17. И в дальнейшем может периодически то увеличиваться, то уменьшаться в среднем на 1-2 отростка в одной ОКЗ. На графике 1 показаны изменения числа отростков в двух конкретных ОКЗ. Из графика видно, что периодические изменения числа отростков в ОКЗ могут происходить в разных фазах. Это обстоятельство предполагает, что динамика роста отростков в ОКЗ определяется межклеточными взаимодействиями, а не влиянием среды, омывающей клетки.

Та&мш 1

ко«»*пм гтдото* ОКЗ

кдепи 1 г 3 4 5 *

1 1 7 6 м 7 5

2 20 26 19 21 и

3 22 22 22 21 29 22

4 13 20 12 23 25

5 27 23 25 20 19

К и «8 И 12 23 23

7 33 29 26 2» 26

1 24 14 21 19 28 23

9 13 15 13 10 11 и

1® и 21 22 17 и

Л 11 14 16 14 9 и

12 7 8 10 и 9 и

13 I 9 1» 11 9 11

14 7 ( * 10 13

15 13 II 10 и 17 и

и 12 и 12 14 15

17 11 и и 12 15

18 9 7 8 10 10 1

(9 27 23 13 И 13 1

20 11 13 16 18 11 11

21 13 и 17 и 10 16

22 22 12 15 17 15 28

23 18 23 21 22 17 16

24 17 17 15 19 5

25 26 23 и 17 и

26 13 12 13 10 13

27 2 19 19

28 24 26 26 14 20 22

29 18 21 13 25 24 24

30 и и 16 и 16 11

М 17 15.9 15.3 16.6 16 16.1

Почлсоыя дикаыика изменения числа отростков г ОКЗ жиронНьио-глшьиой сет*.

—I-1-1-1-1-1-

' г 1 < 5 <

!>■♦« 1- Л"««"" пншм| числа отросло« 1 окилоклетачмых аоиах жвух или К Н мМК.

По оси абсцисс - время ■ часах; по оси ординат - число отростков в околометочной зоне. На графике аилиа асимхроммостк динамики роста оттюстков.

И

п

■ а ■ ■

I

4. Электрофизиологические характеристики клеточных объединений в

культуре ткани.

Для более полной характеристики объекта были проведены измерения мембранного потенциата (МП) клеток нейронально-глиатьных сетей. Сравнительные измерения осуществлялись и в других участках культуры: конгломерат, монослой, отдельно лежащие клетки. Измерения МП проводились только на клетках, которые хорошо просматривались под микроскопом в фазовом контрасте.

Такие клетки на 3-6 день культивирования можно было наблюдать в -нейронально-глиатьных сетях, в монослое и отдельно лежащими. Клетки в конгломерате не просматриваюсь, так как в эти сроки он был многослоен.

Мембранный потенциал в эти сроки культивирования был низким по сравнению с МП зрелых дифференцированных нейронов и глиальных клеток и его величина зависела от того, в какой из выбранных нами зон располагалась клетка.

Клетки, образующие неиронально-глиальные сети, клеточная плотность которых, как правило, составляла 20-40 клеток на стандартное поле, имели мембранный потенциал в пределах 5-20 мв.

Клетки, образующие монослой, клеточная плотность которого выше, чем в сетях (80-110 клеток на стандартное поле), имели и несколько более высокий мембранный потенциал: в пределах 10-25 мв. Самые низкие величины мембранного потенциала (4-8 мв) регистрироватись у отдельно лежащих клеток.

s

5. Действие нейрогропина на динамику роста клеточных отростков в культуре нервной ткани.

В литературе неоднократно отмечалось феноменологическое сходство нервной и иммунной систем как систем обеспечивающих адекватное реагирование целостного организма на изменения окружающей внешней и внутренней среды (Абрамов В.В., 1990).

Было обнаружено, что в нервной ткани и в клеточных элементах иммунной системы присутствует ряд идентичных, в том числе специфических для них антигенных детерминант (Widermaim Ch., 1987), а также то, что иммунокомпетентные клетки обладают способностью синтезировать нейромедиаторы, гормоны, нейропептиды и другие вещества, воздействующие на нервную систему (Абрамов В.В., 1990).

В последнее время внимание ряда исследователей привлекает иммуномодулятор эндогенного происхождения небелковой природы -нейротроплн, который представляет собой коньюгированную смесь олигосахаридов, выделенных из кожи кролика при развитии гиперчувствительности замедленного типа, вызванной вирусом оспы (фирма Nippon Zoki, Japan).

Нейротропин применяется в клинике при лечении периферических нарушений вегетативной нервной системы в качестве антиаллергического средства. Обнаружено антистрессовое, анальгетическое, иммуномодулируюшее действие нейротропина,а также компенсация под его воздействием отдельных эффектов и лучевых поражений (Судаков К.В.,1991; Hata Т., 1988; Kimura Т.,1988).

Изучение механизма действия нейротропина проводилось рядом авторов в различных патологических и нормальных состояниях организма. Однако единой концепции о точке приложения нейротропина выбрано не было. Задачей данного исследования явилось изучение действия нейротропина на динамику роста клеточных отростков в условиях культивирования. На третьи сутки культивирования и контрольную и опытную культуры переносили в малую чашку Петри и наблюдали в фазовом контрасте микроскопа МБИ-6, снабженного термостатированной приставкой. Спустя 1 час в среду, омывающую опытную культуру, вводили нейротропин в концентрации 1,5x10 г/мл. Наблюдения проводились в течение 7 часов (1 час до введения и 6 часов после введения нейрогропина). С интервалом в 1 час проводилась микрофотосъемка.

В ОКЗ подсчитывалось количество находящихся там отростков. Изменение числа отростков в ОКЗ во времени могло происходить только за счет вновь подрастающих к клетке отростков, либо за счет уходящих от клетки отростков, таким образом, изменение числа отростков в ОКЗ отражает динамику роста отростков в ОКЗ.

Особенностью этой динамики является то, что периоды изменения числа отростков в соседних ОКЗ могут происходить в разных фазах. Именно поэтому средние почасовые величины числа отростков

в ОКЗ контрольной группы клеток практически не отличаются друг от друга, несмотря на изменения числа отростков в ОКЗ каждой из 30 исследованных клеток. (Таблица 1)

Полученные данные по влиянию нейротропина на динамику роста отростков в ОКЗ приведены в таблице 2. Из таблицы видно, что число отростков в ОКЗ разных клеток в начале наблюдения было различным и в дальнейшем не оставалось постоянным, а периодически изменялось во всех ОКЗ за исключением ОКЗ клеток №7 и №8, которые мы исключили из дальнейшего анализа.

Для того, чтобы проследить, как изменяется число отростков вокруг каждой из клеток в течение многих часов, по результатам полсчета были составлены графики изменения числа отростков для каждой из всех 16 клеток за время наблюдения. Попробуем сравнить графики числа отростков вокруг каждой клетки. Из таблицы видно, что каждая клетка имеет свой график колебаний числа отростков в ОКЗ. Сравнение графиков показало следующее: под воздействием нейротропина в концентрации 1,5x10-6 г/мл происходила синхронизация процесса роста отростков в ОКЗ всех клеток. Период колебаний отростков составил 2 часа.

Расчет доверительных границ средних почасовых чисел отростков в ОКЗ (График 2) показывает достоверность синхронизации процесса роста отростков в ОКЗ при введении в среду нейротропина в концентрации 1.5х10'6 г/мл. Увеличение концентрации нейротропина в два раза вызывало деградацию отростков, преимущественно глиальных клеток.

Время сутоь, щв«И|||«ц|

После «мши

14.30. 13.3С, | Ю0. } 17.30, 118130. | 19.30, | ДЫ5. 11шГ кмптм «прост«« в ОКЗ

Т~тг

! " | 1

| М 14 | 13.1 |

11 I

Иэыен«ние количества отростков в околоклсточных »из* при действии н«1|ротропика.

График 1

Синхронизации колебаний числа отростков в ОКЗ

при введении в среду нейротролинэ.

Стрелкой отмечено времн вклеии« нейротропина.

4

м

$

7

3

9

II

8

9

Ч

I

10.1

9.8

6. Действие лазерного излучения на клетки нейронально-глиальной сети.

В качестве физического фактора, воздействующего на клетки нейронально-глиальной сети, в наших исследованиях было избрано лазерное излучение.

Положительное влияние на организм излучения гелий-неоновых лазеров вызвало в последние годы их все более широкое использование в медицине при лечении многих болезней (Гамалея Н.Ф., 1972; Плетнев СЛ., 1981; Lonauer G., Krohn-Grimberghe В., 1985). Однако механизм лазерной биостимуляции во многом остается неясным (Примак A.A., 1986).

Практическая значимость лазеротерапии вызывает необходимость экспериментальных исследований с целью выяснения изменений, происходиших в тканях и клетках человека и животных под влиянием лазерного излучения. Для нашего исследования изучение действия лазерного излучения на нейронально-глиальную сеть представляло интерес еще и потому, что недавно было показано, что воздействие лазера способно резко изменять программу структурной реорганизации клеток и тканей (Непомнящих J1.M., 1987).

В настоящем исследовании использовался гелий-неоновый лазер ЛГИ-203 ( h=0,63 мкм; Р=1 мвт). Диаметр пятна расфокусировки излучения 10 мм. Рассеянное излучение позволяло подвергать облучению все клетки нейронально-глиальной сети. Облучение проводилось в непрерывном режиме в три сеанса с перерывами в 1 час. Продолжительность облучения равнялась соответственно: 15, 30 и 60 мин. Состояние клеток нейронально-глиальной сети фиксировалось микрофотосъемкой до и после облучения. Полученные фотоотпечатки позволили провести анализ на наличие изменений в состоянии клеток по следующим параметрам: форма тела клетки (величина среднего диаметра клетки), число клеточных отростков и их длина.

Проведенный анализ показал, что у клеток, подвергшихся лазерному облучению, увеличивается величина среднего диаметра клетки. Статические расчеты показали, что увеличение среднего диаметра клетки можно считать достоверным (График 3). В то же время анализ не показал изменений в количестве и длине отростков.

Нужно отметить важный эффект лазерного излучения на общее состояние культуры нервной ткани. Обычно культура нервной ткани, исследуемая в открытой чашке Петри, на следующий день практически погибает. В случае же, когда культура нервной ткани подвергалась лазерному излучению, срок ее переживания в чашке Петри увеличивался до трех суток. Этот эффект подтверждает предположения Рочкинда и Квикнайна о том, что низкоинтенсивное лазерное облучение значительно улучшает обмен в нейронах и предотвращает обширные дегеративные процессы (Rochkind S., Quaknine G.E., 1992).

Возможным механизмом эффектов действия лазерного излучения на клетки является его возбуждающее действие на ионные каналы -

колебательные контуры в (ВолобуевФ.Н., 1993).

мембранах биологических тканей

Гр**мк J. JU*T7W шпиюп) иалумям ы ипм кчякури w^wi rim.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Обсуждая полученные результаты исследований, прежде всего надо дать характеристику сети, с которой мы имели дело в данной работе. Нейронально-глиальные сети, обьект нашего ■ исследования, являются монослойными образованиями, которые возникают в результате объединения клеток коры больших полушарий, мигрировавших из микроэксплантата, а также отдельных клеток, полученных после диссоциации ткани трипсином.

По нашим морфологическим данным, сеть состоит из клеток, гетерогенно распределенных по субстрату в двумерном пространстве. Эта гетерогенность выражалась в том, что клетки располагались не диффузно, а группами по 3-10 клеток в группе. Расположение клеток в виде групп по 5-6 клеток в культуре ткани обсуждалось еще в 1976 году в работе Кокиной H.H. Кокина H.H. объясняет групповое расположение клеток в зоне роста эксплантата коры больших полушарий новорожденных крысят одновременной миграцией генетически родственных клеток. В связи с этим группы были названы "единицами миграции". Они специфичны по форме и объему для данной области мозга (Кокина H.H., 1976). Организация группы клеток препятствует свободной миграции их по субстрату. Получается, что из двух факторов противодействующих друг другу в своем атиянии на распределение культивируемой ткани по субстрату: фактора свободной миграции клеток, действующего в любых культурах (Викторов И.В., 1976), и фактора

специфической нейроиальной организации, связывающего клетки друг с другом (Кокина H.H., 1974), действие последнего оказывается прей мушествен н ым.

Представление об "единицах миграции" подтверждается фактами мозаичности нейрогенеза (Резников К.Ю., 19S4). В онтогенезе происходит дискретное продуцирование групп нейронов локальными участками герменативной зоны. Это приводит к волнообразности миграции, что в свою очередь дает возможность сделать предположение о том, что топография локальных корковых зон определяется теми пространственными параметрами, которые занимали клетки прародительницы в вентрикулярной зоне эмбрионального мозга (Rakic Р., 1982).

Подобную картину в пространственной организации коры больших полушарий у крысят в постнатальном периоде онтогенеза (1-4 сутки после рождения) отмечают Коннорс и др. (Conors B.W., et al., 1983). В этот период число клеток в таких нейронных ансамблях составляло 3-7 клеток. Причем, клетки в группе формируют между собой высокопроницаемые контакты. В исследованных нами сетях были обнаружены десмосомоподобные межклеточные контакты, которые, как известно, являются ранней стадией формирования синаптических контактов. Подобного рода несинаптические аппараты, к которым Бабминдра В.П и Братина Т.А (1986) относят дендро-дендритические, дендросоматические и другие формы специализированных и неспециализированных контактов между нейронами, могут обеспечить осуществление синхронной работы групп клеток, так . как предполагается, что в тех участках, где мембраны разделены лишь межклеточной шелью или лишь соприкасаются друг с другом, создаются условия для трансмембранного обмена ионами и метаболитами. Эти элементарные морфологические объединения, сохраняющие признаки функции, ближе всего к представлению о клеточных ансамблях в центральной нервной системе, которые описываются и морфологически, и функционально (Сентаготаи Я., Арбиб М., 1976; Shaw G.L., et al., 1982; Rakic P., 1978). Нельзя исключить, что такие клеточные объединения играют какую-то предварительную, временную роль в развитии нервной системы и, выполнив свое назначение, исчезают, заменяясь другими. Но и в этом случае, по мнению Милохина A.A. (1986), они, несомненно, служат тем фундаментом, на котором и строится в дальнейшем все здание дефинитивной нервной системы.

Гетерогенность сетей, исследованных в данной работе, заключалась не только в пространственном распределении клеток, но и в самом составе клеточных групп.

Присутствие глиальных элементов в исследованных нами сетях является существенным методическим моментом. При сравнении с распространенными в данное время исследованиями, проводимыми на

гомогенных культурах нейронов, гетерогенные культуры оказываются ближе к интактному мозгу. Рядом авторов также показано огромное значение глиальных элементов в становлении пространственной организации нервных структур.

Клеточные элементы, формировавшие исследованные нами нейронально-глиальные сети, являлись не только морфологически незрелыми, но характеризовались также низким мембранным потенциалом, отсутствием потенциала действия что, согласно критериям Шулейкиной К.В. (1979), свидетельствует о раннем этапе развития коркового нейрона.

Таким образом, исследованную нами нейронально-глиальную сеть по морфологичкеским и электрофизиологическим показателям, образующих ее клеток, а также по наличию малого количества синаптических контактов, следует считать относительно незрелой.

Это, впрочем, соответствует незрелости коры больших полушарий в целом мозге в те же сроки (3-й день после рождения). Так, массовый синаптогенез в коре больших полушарий происходит на третьей неделе после рождения (Armstrong-James М., Johson R., 1970; Cragg B.G., 1975).

Современные представления об организации функций мозга построены на основе данных об электрических и химических взаимодействиях между клетками. Представления об организации деятельности мозга продолжают усложняться, и единой картины пока нет. В связи с этим отсутствие спайковой активности на ранней стадии развития нейронально-глиальной сети не лишает данную сеть права считаться моделью клеточной организации мозга. Наша сеть является моделью системы на стадии, когда образуются электрические и модулирующие факторы, формирующие систему. Хотя в ней нет еще взрывного образования синапсов с химическим проведением, но в исследованных нами нейронально-глиальных сетях есть единичные -синапсы, есть межклеточные взаимодействия через уплотненные мембраны.

Необходимо отметить, что организация нервной системы в вше сети является в филогенетическом отношении древней формой, доминирует у таких примитивных организмов, как кишечно-полостные (Коштоянц Х.С., 1957).

В связи с вышесказанным можно заключить, что исследованные нами нейронально-глиальные сети являются моделью ранней стадии нейроонтогенеза. По данным литературы процесс нейроонтогенеза включает четыре основные стадии: 1 - деление клеток-предшественниц в герменативной зоне нервной трубки; 2 - миграция нейробластов к местам дефинитивного положения; 3 - обьединение молодых нейронов в ансамбли; 4 - консолидация нейронных объединений, включающая процессы синаптогенеза и дозревания нейронов (Кокина H.H.. 19S0; Максимова Е.В., 1985). согласно

характеристикам этих стадий, данных Кокиной Н.Н (1980), нейронально-гдиальные сети, исследованные в данной работе, следует отнести к третьей стадии нейроонтогенеза, то есть стадии образования клеточных сетей, сопровождаемой сортировкой клеток по их сродству друг к другу и степени дифференцированное™.

В соответствии с этой стадией, клетки в условиях культивирования ориентируются и направляют свои отростки так, как если бы они образовывали связи в целом организме. Такое поведение нейробластов можно объяснить как внутриклеточной детерминацией, так и межклеточными взимодействиями, что было показано в опытах на изолированных структурах и отдельных клетках в условиях диссоциированных культур (Кокина H.H., 1975).

Одной из примечательных черт данной стадии становления организации клеточных систем на уровне нейронально-глиальных сетей, которую нам удалось обнаружить в данном исследовании, является периодический характер роста клеточных отростков. Так, рост отдельных клеточных отростков может менять свой характер: прямолинейный рост отростка через 1-2 часа сменяется извилистым (поисковым), а спустя также 1-2 часа снова становится прямолинейным. На наш взгляд, это явление свидетельствует о временных изменениях чувствительности конуса роста клеточного отростка к субстрату.

Периодичность характера роста клеточных отростков согласуется с концепцией решщрокного взаимодействия внутриклеточных процессов, приводящих к разным морфологическим результатам. Периодические изменения роста отростков соответствуют сменяющим друг друга периодам внешней чувствительности клетки. Рост отростка в один период больше зависит от внутриклеточных процессов. Он сменяется периодом роста, который в большей степени контролируется средовыми влияниями (Кокина H.H., 1980).

Факторы реципрокных взаимодействий на биохимическом уровне в условиях культивирования нервной ткани были обнаружены также Громовой Е.А. и др (1985). Ими показана реципрокность во взаимоотношениях серотонинергической и норадренергической биохимических систем, с активностью которых связан синтез серотонина или норадреналина в его структурах.

Наряду с часовыми ритмами изменений роста индивидуальных отростков, особый интерес представляет обнаруженная нами суммарная динамика роста - втягивание клеточных отростков в околоклеточных зонах. Она также носит периодический характер. Установление природы этих периодических явлений требует дальнейших биохимических исследований. Нам представляется, что динамика роста отростков в околоклеточных зонах связана с околочасовыми клеточными ритмами, в частности, с околочасовыми ритмами синтеза белка. Здесь следует отметить, что в последние годы рядом исследователей особенно интенсивно начата изучаться околочасовая периодичность клеточных

процессов, такие ритмы удалось выявить in vivo и in vitro как в быстрорастущих, так и в высокоспециализированных неделяшихся клетках. Обнаружены околочасовые колебательные изменения таких цитологических параметров, как размеры клеток и ядер (Сванидзе И.К., Дидимова Е.В., 1980), ионной проводимости мембран, уровня трансмембранного потенциала (Гойда Е.А., 1987), активности различных ферментов (Нечаева Н.В. и др., 1985), концентрации глюкозы (Каминский Ю.Г., 1987), синтеза белков (Сванидзе И.К., 1985).

Все это говорит об особой роли часовых и околочасовых ритмических процесов в организации нервной деятельности, так, например, известно, что в условиях тканевых культур постоянно происходит формирование новых синапсов и их дезинтеграция, время существования короткоживуших синапсов равно 8 часам (Puro D.G.,1987).

Немаловажное значение в формировании ритмических процессов роста отростков должны играть околоклеточные процессы. Известно (Поликар А., 1976), что с наружной стороны плазменной мембраны клеток находится морфологически нечеткая зона, имеющая, однако, большое физиологическое значение: это адсорбционный слой, или окружающая непосредственно клетку микросреда. Электрические, химические и энергетические свойства микроокружения клетки находятся под влиянием самой клетки (Поликар а., 1976). Нельзя исключить, что околочасовые энергетические, биохимические, электрические клеточные ритмы опосредуют периодичность различных показателей, существующих в околоклеточной зоне. К этим показателям, в частности, к электрическому полю, могут проя&тять определенную чувствительность подрастающие конуса роста отростков других клеток (Betly D., Torocan-Raynond А., 1986). Таким образом, околочасовые клеточные ритмы через вызываемую ими периодичность процессов околоклеточной зоны, могут атиять на динамику поведения подрастающих к клетке отростков других клеток. Можно сделать, гипотетическое предположение: очень важным, если не решающим фактором образования контакта между клетками может оказаться синхронизация колебательных процессов в клетке-реципиенте и в конусе роста подрастающего отростка.

Обсуждая возможную морфогенетическую роль, выявленной нами гетерогенности клеток нейронально-глиальных сетей по характеру роста отростков в их околоклеточных зонах следует отметить, что взаимодействие клеток на основе синхронизации периодических процессов может оказаться существенным фактором при организации клеточных систем.

В работах, посвященных биоритмологии, отмечается, что взаимодействие колебательных процессов, имеющее тенденцию к синхронизации, определяет возможность пространственно-временной самоорганизации крайне разнообразных типов систем, в том числе

систем живой природы (Гудвин Б., 1966, 1979; Блехман И.И., 1971; Романовский Ю.М. и др., 1971, 1984).

Таким образом, изучаемую нами нейронально-глиальную сеть следует рассматривать, как определенную стадию формирования морфологической основы любой врожденной функциональной системы. Поскольку мы имели дело с сенсомоторной областью коры больших полушарий, наши данные следует прежде всего отнести к формированию отдельных блоков функциональных систем, связанных с процессом движения. Поскольку эмбрионогенез функции до настоящего времени изучен недостаточно, мы взяли на себя труд дать характеристику одной из общих его стадий, смоделировав ее в условиях тканевой культуры.

ВЫВОДЫ

1. Нейронально-глиальные сети в культуре коры больших полушарий новорожденной крысы представляют собой гетерогенные монослойные структуры, которые образованы как из ансамблей, так и из отдельных нервных и глиальных элементов, объединенных между собой клеточными отростками.

2. Малое количество синаптических контактов и относительная незрелость мембранного потенциала нервных и глиальных клеток сети свидетельствует о незрелости образуемой ими сети.

3. Незрелость нейронально-глиальной сети и ее монослойная структура позволяют использовать эти сети в качестве модели для морфометрических, биохимических и электрофизиологических исследований ранней стадии формирования сетевидных структур нервной системы.

4. Процесс стабилизации межклеточных связей предполагает периодический характер роста клеточных отростков в околоклеточных зонах клеток-мишеней.

5. Иммуномодулятор нейротропин оказывает синхронизирующее действие на динамику роста отростков в околоклеточных зонах клеток-мишеней в нейронально-глиальных сетях в условиях культивирования.

6. Клетки нейронально-глиальной сети, подвергнувшиеся лазерному излучению изменяют свою форму и обретают способность к более длительному переживанию в условиях культивирования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Махмутов Р.Я., Мутана Ибрагим Хамед, Патюков А.Г. Нейротропин - синхронизатор активности нейропиля. // Тез. докл. У-ой Всес. конференции, посвященной 90-летию со дня рождения чл.-корреспондента АН СССР Х.С.Коштоянца - Москва - 1990г. - стр.1892. Мутана Ибрагим Хамед, Махмутов Р.Я. Действие нейротропина на динамику роста клеточных отростков в культуре нервной ткани. // Биол. науки, 1994 - в печати.

ЭГ.с .