Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование STREPTOMYCES LEVORIS в двухфазной системе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование STREPTOMYCES LEVORIS в двухфазной системе"

РГБ ОД

- 8 \т 1335

На правах, рукописи

ДРЕВЕЦКАЯ Виктория Леонардовна ^

Культивирование ви-ер^тусез 1еуогЬ в двухфазной системе 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на со.хкание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена на кафедре молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского Государственного технологического института (Технического Университета).

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор ГИНАК Анатолий Иосифович;

Научный консультант:

кандидат химических наук ДЫМШИЦ Валерий Аронович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор ЯКОВЛЕВА Елена Павловна

кандидат биологических наук

ВОЛЧЕК Екатерина Александровна

Ведущая организация: ГНИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург)

Защита состоится "24" МЗЯ 1995 г в ч. в ауд N 61 по адресу Санкт-Петербург, Московский пр., 26, Технологический институт

С диссертацией можно ознакомить ;я в библиотеке инсптута. Замечания и отзывы по данной работе, заверенные печатью, в одном экземпляре, просим направлять по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26

Автореферат разослан " 20' ЦРрвАЯ_1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат технических наук •* • Т.Б Лисицкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальн ость темы. Поиск» новых технолошческих путей интнсификации биосинтеза биологически активных веществ остаются актуальными, несмотря На широкое распространен??, генноинженерных методов. Основным методом, используемым сегодня в микробиологическом производстве, является глубинное культивирование, осуществляемое в квазигомогенны:; условиях. Однако, в последние годы все больший интерес вызывает гетерофазное культивирование с сознательно формируемой большой поверхностью раздела фаз (Навашин н др., 1984). Преимущество этого метода состоит в создании областей совместной сорбции субстратов, экзоферментов, клеток микроорганизмов и продуктов их синтеза, а также в приближении условий жизнедеятельности иммобилизованного организма к природным. На практике этот принцип воплощен с помощью твердофазны" носителей, таких как стекло, пластик, полиэтилен, поливинилфторид, тефлон и др. (1лпко. е.а., 1984).

Однако, при использовании твердофазных носителей возникает ряд проблем, связанных со снижением поверхности массопере;ичи субстратов I метаболита, между жидкостью и клеткой. Прежде всего это касается кислорода и углекислого газа. Возможны также тр>_»ности в отделении биомассы и пролетов биосинтеза от носителя, осложняющие как периодическую, так и непрерывную ферментацию.

В качестве альтернативы системам с твердофазными носителями нами предложено использовать эмульсию, состоящую из водной фазы (ферментационной среды) и химически инертной нерастворимой в воде органической фазы. Преимущества такой системы состоят в улучшении аэрации, в увеличении удельной поверхности раздела фаз, в легхом отделении жидкого носителя от мицелия и продуктов его жизнедеятельности.

Настоящая работа посвящена исследованию физиолого-биохимичеекчх и морфологических особенностей культуры

Streptomyces levoris, выращивав! ,й в двухфазной системе "ферментационная среда - н-алкан". Выбранная нами культура является п[ щуцентом антибиотика леворина, обладающего противогрибковой активностью. Поэтому изучение закономерностей ферментации данной культуры в условиях жидкостной гетеро-генности имеет не только научное, но и прикладное значение.

Пели , и „..задачи , исследования. Целью прдставленной работы являлось изучение влияния двухфазного культивирования на морфологические и

физиологобиохимические характеристики культуры Str. levoris. В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

- изучение воздействия различных углеводородов на культуру Str. levoris;

изучение антибиотикообразования культуры в присутствии различных углеводородов;

- изучение морфологических особенностей культуры Sir. levoris, выращенной в двухфазной системе;

- изучение интенсивности дыхания, динамики накопления биомассы и протеолитической активности культуры Str. levoris в двухфазной системе;

- изучение дисперсионных свойств двухфазной системы культивирования Str. levoris.

Научная разработан новый метод глубинного

культивирования Str. levoris - в двухфазной 'системе "водная средр - парафин". Впервые изучены морфологические свойства Str. levoris при двухфазном культивировании, что позволило обнаружить способность мицелия иммобилизоваться на каплях органи' ^ской жидке-ти. Показано влияние различных парафинов на антибиотика- и глубинное спорообразование культуры. Сравнительный анализ динамики накопления биомассы и протеолитической активности культуральной жидкости в двухфазной системе и в контрольных условиях показал, что присутствие парафина способствует удлиннению стационарной

фазы зз счет сокращения трофофазы и приводит к изменению динамики потребления субстратов среды. Показано, что при двухфазном культивировании происходит оптимизация стрз ;туры дыхания с точки зрения вторичного метаболизма. Изучены дисперсионные свойства двухфазной сна .мы культивирования. Показано, что дисперсность эмульсии воздействует на структуру дыхательной активности культуры.

Практическая значимость. Применение нового метода двухфазного культивирования для выращивания Str. levons позволило увеличить выход антибиотика леворина на 30% по сравнению с контролем. Установлено свойство двухфазного культивирования восстанавливать активность культуры, утраченную при хранении. Предложена новая установка для измерения интенсивности дыхания микроорганизмов при глубинном культивировании.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 работы.

Объем и построение работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение и выводов. Общий объем диссертации 113 страниц машинопиа. ¿го текста. Работа иллюстрирована 13 рисунками, 9 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 137 наименований.

ОСНОВНОЕ СОД ЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы состоит из 4 разделов, в которых рассмотрены особенности культивирования микроорганизмов в гетерогенных система ч, некоторые вопросы биологии актиномицетов, а гакже характеристика объекта исследований -культуры Str. levons и физико-химические . свойства антибиотика леворина.

Материалы. И .методы. Обг том исследований служила культура Str. levons - шт. 78, продуцент леворина, предоставл нный комбинатом "Биосинтез", г. Пенза.

В работе использовали стандартные лабораторные и производственные среды. Углеводороды добавляли в готовые среды в определенных отношениях к объему всей водной среды. Их вносили в стерильные среды через фильтр Зейтца с асбестовым вкладышем, или добавляли в качалочную колбу к приготовленной ферментационной среде перед стерилизацией.

Для установления факта неиспользования углеводородов в качестве субстрата применяли синтетическую среду следующего состава, г/л: крахмал 20; ' (NH^SQ*. б; MgSCty 2,5;СаСОз 3; KCl 1; КН2РО4 0,05; вода водопроводная 1л, pH 7,4 - 7,6.

Ферментацию Str. levoris проводили в стерильных условиях, на дотационной качалке, при 220 об/мин с амплитудой 7 см при температуре 27 ± 1°С в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл. В каждую колбу загружали 60 мл среды, длительность ферментации составляла 1x0-144 часа. Для засева использовали вегетативный посевной материал в количестве 10% от объема водной ферментационной среды. Выращивание вегетативного посевного материала проводили в тех же условиях/ Объем посевной среды - 100 мл. Длительность выращивания составляла 48 часов, засев проводили соскобом биомассы со скошенной агаризованиой среды.

Для изучения морфологичлскил. и кул; гуральных свойств Str. h voris, выращенного в условиях двухфазного культивирования, использовали стандартные микробиологические методы и растворы красителей (Жукова и др., 1978).

Концентрация леворина в культуральной жидкости определялась спектрофотометрически с предварительной экстракцией антибиотика буганолом (Невинский и др., 1971). Биологическую активность леворина определяли методом диффузии в агар с тест-микробом Candida utilis (Поляк и др.. 1979).

¿да ¡:mf :а.г,иост« я»шшия культур" >.,

фзрмснтпшш использовали есйствсплую •.

ИЗ **.ЧПЯ0ЧНч .i колон с двумя отводами, включенной Н \\п'> чутн никл с Аазоаиали?т ,ром и перистальтическим пафосом. Бмл нспользослп расчи интенсивности дых:. микроорганизмов по концентрациям газов в свободном пространстве кат'т.-, тмер.-е. ын с помощью выносных датчиков, включенных и замкнутый геомйт»"::^;« циркуляционный газовый нонтул.

Биомассу zr^uc.HV'' aCJbc««!;:.! истодом. Дня определения ¿> использовали метод Лоурн с предварительной

обработкой по методике Термхитаровой (Термхитарова, 1974).

Протеолчтическуго активность определяли по методу Кунитца в модификации Ласковского (Кочетов, 1981).

Для измерения межфазного натяжения на границе раздела фаз "ферментационная среда - тетрадекан" использспплн метол отрыва кольца 'метод л">-Нуи) (Абрамзои и др., 1988).

Перся определением межфазного натяжения пробы были отцептрифугиро.-ипы для разделения фаз и отделения биомассы. Б нативный раствор добавляли 2 мл азида натрия, чтобы исключить росг стрептомг ста в нати юм растворе и на грани"е раздела фаз, и затем наслаивали тетрадекан. Перед измерением межфазного нач. .кения пробы выдерживали 1 сутки при температуре 25°С.

Для определения дисперсности эмульсии тетрадекана в ферментационной среде при культивировании Str. ievoris подсчитывали капли тетрадекана различного диаметра на каждые сутки культивирования в прижизненных препаратах. Подсчет проводили по ! О полям зрения при увеличении 7x20 с помощью окулярной решетки. Контролем служило распределение капель тетрадекана в ферментационной среде через 6 часов перемешивания ча качалке без внесения посевного материала. Экспериментальные да нше обрабатывали статнстическ" Плото,; и др., 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Культивирование Str..,levons на, синтетически среде. Для установления факта неиспользования углеводородов в качестве субстрата культурой Str. levons была проведена ферментация на синтетической среде, в которой крахмал, как единственный источник углерода, был заменен на н«сь жидких парафинов нормального строения от ундекана до пентадекана. При культивировании в таких условиях рост культуры не наблюдался.

2. Антибиотикообразошие в присутствии углеводородов, Прежде всего нами исследовался процесс антибиотикообразо-вания в двухфазной системе, так как он является не только важной характеристикой физиологического состояния культуры, но и представляет значительный практический интерес.

Была проведена серия ферментаций культуры Str. levons в присутствии парафинов нормального ряда от октана CßHis до пентадекана С15Н32, концентрация которых варьировалась от 5 до 90% от объема водной фазы. Контрольным вариантом в этом эксперименте и далее служило культивирование продуцента на ферментационной среде без парафина. Контроль процесса осуществляли по выходу антибиотика - леворнна. Результаты представлены в таблице 1.

Приведенные данные позволяют сделать вывод о том, что продукция левори.а оказывается максимальной при использовании тетрадекана и пентадекана в концентрациях 25-50% об. При этом содержание леворина возрастает на треть по сравнению с контролем. В то же время в присутствии низших парафи-hol от октана до декана включительно уровень антибиотико-образования снижается по сравнению с контролем, имеет место глубинная споруляция.

Предполагая что новые условия культивирования могут изменить время ферментации, мы контролировали уровень

антибиотнкообразования каждые сутки культивирования, начиная с третьих. Было показано, что максимальная активность к^льтуральной жидкости в двухфазной системе дос. лгается на 6 сутки культивирования (144 часа), в то время как в контрольных условиях - на 5 сутки (120 часов).

Таким образом, использование тетрацекана и пентадекана при двухфазном культивировании создает благоприятные условия для процесса вторичного метаболизма.

Таблица 1

Биосинтез леворина в присутствии углеводородов ( концентрация леворина в контроле 50500 Ед/мл, соответствует 100%)*

Концентрация, % ' Октан Нонан Декан Ун-декан До-декан Три-декан Тетра-декан Пента-декан

0 100 100 100 100 100 100 100 100

5 12 20 50 65 80 100 103 100

10 11 25 50 61 85 100 107 110

15 10 26 62 82 102 115 120

20 11 21 41 65 80 105 125 123

25 9 25 49 66 81 111 130 129

30 12 23 48 61 83 110 131 133

35 10 25 46 62 89 110 133 135

40 10 28 43 62 85 105 135 130

50 8 15 42 60 81 108 130 132

60 4 5 15 43 60 100 120 130

70 0 0 0 16 42 70 100 105

80 0 0 0 0 15 25 40 50

90 0 0 0 0 5 7 10 15

В дальнейшем культивирование в двухфазной системе проводили ппи оптимальных параметрах: концентрации органической фазы 40% и времени культивирования 144 часа.

* Здесь и далее ^верительные интервалы не превышали 7% для 95%-ной доверительной вероятности.

хо

3. Морфологические_особенн оти_культуры, БшЛсуошу

выращенной.....в...,двухфазной,.¡систем?, Мы установили, что при

культивирггании в двухфазной системе происходит иммобилизация клеток микроорганизма на каплях эмульсии. В присутствии три-, тетра- и пентадекана максимум густоты ветвления мицелия и его сродство к основному красителю достигается к концу экспоненциальной фазы. При переходе в стационарную фазу базофилия цитоплазмы уменьшается, причем это происходит на сутки раньше, чем в контрольной культуре. Сеть гиф мицелия обволакивает капли алкана. К концу стационарной фазы наряду с тонкими гифами появляются толстые снльковетвящиеся гифы. Что свидетельствует о проявлении полиморфизма, свойственного актиномицетам при глубинном культивировании в поздней стационарной фазе развития.

Автолиз вегетативных гиф при культивировании в присутствии высших углеводородов начинаете, на сутки позже, чем у культуры, растущей в контрольных условиях. Споры в данной двухфазной системе, также как и в контроле, не образуются.

При культивировании на средах, содержащих октан, нонан, декан наблюдался тонкий мицелий со слабым ветвлением. В поле зрения были видны шаровилные образования, сильно преломляющие свет в прижизненных препаратах. Количество таких образований возрастало в ходе ферментации.

Засев стерильной ферментационной среды образцами культуральной жидкости после стер.шьного- отделения низших алканов приводил к нормальному развил <ю культуры стрепто-мицета. Мы предполагаем, что эти образования являются глубинными спорами. Спорообразование было наиболее интенсивным в присутствии гчтана и ослабевало при переходе к декану.

В литературе существует мнение, что синтез антибиотика и спорообразование не являются альтернативными процессами (Калакуцкий и др., 1977). Однако можно предположить, что в нашем случае это не так, поскольку при увеличении длиьы цепи парафинов уровень синтеза антибиотика и

cnopoc6po?c~"b;:t;:\;ï.î:-;> .¡ы? i-h:m j_«0 провел*»»«

;:'.льтпЕ!гропп;гпй с орд -.шшгской фачо» птсдомплишт:» сч^что ,т.:гаодородов т-тргл-.кчпг. и ...чтг-на ;• i >л н-ич <• ;v;;:^catrax.

'.УГ.ДИГЮС-У!!! фй":Н C-'Cr.W'ßU 40 7О Об CT О'щрГО 0;Неич

: ••рмеатздшшиоЛ ср»гт*т,

Oihüko, пиг'пзшшо;: ¡иы^ noerm«""—cii::e ne • ••.'гтвсрдилссь. Из тябл. ?. :'H.|fi>'i, M ГО П^КСУГСГПИЬ 2 nnrrnr-;;c:toü фа:« глииекпкп ..эмулирует процесс , ., .îôr-'.TtricoupuacûaHHH, идущий одновоемр""с i г.^""-:;;^« октаном глубинным

Таблица 2.

Зависимость антибиоппсо- к спорообразования от состава органическо" фазы

Октан % 10 30 . 50 70 90 100 0 0

Тетрэдехаи % so 70 50 50 0 1С-о »

Дг.тапносгь лгвиршш, % 131 . 1Г.0 133 117 100 10 135 100

Наличие спор ( * ; * + + - -

Итак, все вышеизложенное подтвергедает наше предположение об использовании культурой Str. levons высших углеводородов в качестве носителя.

что углеводороды способны ' растворять значительные количества кислорода. Равновесная концентрация кислорода в контакте с воздухом при нормальных условиях меняется в раду октан-ге.чсадекан от 0,0949 до 0,0506 кг/мЗ, тоща ках для воды эта пеличина составляет 0,0136 кг/гА Следовательно, диспергированные в среде алканы могут рассматриваться в качестве аналога воздуха при массопередаче кислорода.

Ингенсивш ть дыхания культ;ры Str. levons определяли при культивировании в колбах с помощью вышеупомянутой установки по разработанной нами . зтодике.

Путей предварительной калибровки системы аэрации-перемешивания "копба-пробка-встряхиватель" бьши подобраны три колбы с близкими значениями коэффициента к, характеризующего встряхиваемую систему. Калибровка осуществлялась в диапазоне концентраций кислорода от 16 до 20,8% об. Данные, полученные при определении интенсивности дыхания культуры Str. levons во время культивирования в присутствии тетргтекана-и в .сонтрольных условиях, приведены на рисунке 1.

Рис.1 Иигенсивность дыхания культуры Streptoniyces levoris '

1 • культура растущая в контрольных условиях

2 - культура растущая в двухфазной системе

В двухфазной системе максимальная интенсивность дыхания купьтуры увеличивается в 2,3 раза по сравнению с контрольными условиями. После прохождения максимума интенсивность дыхания резко снижается - в 3 раза по

сравнению с максимальным : гачением - в расчете на единицу объема водной фазы. Чтобы объяснить слабое потребление кислорода в идиофазе, необходимо рассмотреть особенности роста мицелия стрептомицета в прису-л-вии органической фазы. Как упоминалось выше, гифы культуры растут на поверхности раздела фаз, образуя сетчатое сплетение капель углеводорода.

Плотность такой сет-и на каплях тетрадекана возрастает, что создаст препятствие диффузии кислорода в капли эмульгированного парафина, при этом ухудшается массообмен, интенсивность дыхания культуры резко падает и создаются благоприятные условия для процесса вторичного метаболизма.

Развитие Str. levons в контролы. ix условиях протекает иначе. Максимум интенсчвности дыхания выражен слабо.

Обобщая сказанное, можно утверждать, что присутствие парафинов оптимизирует структуру дыхания Str. levoris с точки зрения вторичного метаболизма, так кг : увеличение интенсивности дыхания 0 трофофазе способствует накоплению биомассы и лучшей утилизац и компонентов среды, а резкое снижение интенсивности дыхания в идиофазе способе зует ю-коплению пула предшественников для биосинтеза антибиотиков.

5. Динамика накопления..,бтомясш! Намь было показано, что при ферментации Str. levoris в присутствии тетрадекана увеличивается синтез леворииа, Чтобы выясшш- связано ли это явление с увеличением общего количества биемсссы или только с ростом ее- удельной активности, мы исследовали динамику накопления биогассы в данных условиях (рн&2). .

Полученные данные показали, что общее количество биомассы в опьгге и в контроле одинаково, но в опытных условиях переход культуры в идиофазу осуществляется на сутки раньше, чем в контроле. Это обстоятельство представляется благоприятным для процессов вторичного метаболизма, так как способствует удлинению стационарной фазы. Учитывая результаты экспериментов по определению активности леворииа

можно угверх-здачь, что удельная активность культуры Str. levons в двухфазной системе выше, чем в регламентных условиях.

Время, сут

Рис.2 Накопление биомассы в процессе культивирования Strep' omyces levons

1 - культура растущая в контрольных условиях.

2 - культура растущая в двухфазной системе

Обращает, на себя ишмание ступенчатый характер зависимое i и накопления биомассы от времени в контрольных условиях, что ст.opee всего, свидетельствует о смене культурой субстрта, переходе от потребления углеводов к потреблению белков.

Отсутствие такого перегиба на опытной кривой объясняется ' Ьолее интенсивным 'дыханием в присутствии парафина. Можно предположить, что энергетические потребности ч трофофазе в двухфазной системе удовлетворяются только засчет аэробного окисления углеводов. Эту гипотезу подтверждает изучение протеолитической активности культуральной жидкости.

6. Пруколитическая, активность.Str, Jevoris, Было показано, что максимальные значения про^еазной активности в опыте и в контроле, приблизительно одинаковы (рис.3), хот ' в двух-

фазной системе максимум достигается на сутки позже, чем в контроле. Кроме того, по сравнешно с двухфазной системой, происходит гораздо более резкое снижешь уровня активности на четвертые и пятые сутки культивирования в контрольном ьарианте.

7 у

I б • 1 5 "

1 3 ••

Г"

11'

О X О

Рис.3 Зависимость протеслитической активности культуралыгой жидкости от времени культивирования

1 - культура растущая в контрольных условиях

2 - культура растущая в двухфазной системе

На основании этих результатов можно предположить, что благодаря активизации процессов дыхания в двухфазной системе энергетические потребности культуры, в этом сл;чае, в большей степени удовлетворяются за счет окисления углеводов, чем в регламентных условиях. Поэтому культура, растущая в присутствии парафина, в трофофазе не нуждается в дог элнительных субстратах. Максимальное значение протеолитической активности в контроле приходится на точку перегиба графика зависимости накопления биомассы от

Время, еут

времени, т.е. иг момент смены суб трата. Всплеск протеолити-ческой активности на третьи сутки у культуры, растущей в двухфазной системе, совпадает ^о стационарной фазой, и белки расходуются как на г дцержание, так, возможно, и в качестве источника азота для синтеза леворина.

Таким образом, культивирование в двухфазной системе приводит к изменению динамики потребления субстратов среды.

7. Дисперсионные свойства двухфазной системы. Система водная среда - тетрадекан" представляет собой эмульсию, поз.-ому особенно значимыми представляются ее поверхностные характеристики. Как компоненты среды, так и продукты жизнедеятельности стрептомицета и сам его мицелий могут рассматриваться в качестве детергентов от которых зависят параметры эмульсии.

7.1. Изменение межфазного натяжения при культивировании Str. levop's, В течение первых двух суток (рис.4) меж-., фазное натяжеш : снижалось с 22 Шм (контрольное измерение)

Рис.4 Изменение межфазного натяжения "ферментационная среда - тетрадекан" в процессе культивирования Streptomyces levons

Вероятно падение величины межфазного натяжения в ходе фазы интенсивного роста было bi : вано увеличением концентрации биомассы микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности. Это ослабление способствует стабилизации эмульсии и, следовательно, увеличению поверхности раздела фаз, что в свою очередь ведет к улучшению переноса кислорода из органической фазы в водную, т.е. к клеткам продуцента. Для подтверждения этого заключения мы исогдоваяп изменение структуры эмульсии при культивировании в двуЛфазной систем х

7.2. Определен?.........дисперсности........ ;иуш;шз

"ферментационная среда - тетралекан". Содержание мелкодисперсной фракции • fрис.5) (диаметр капел» тетрадекана 10 мкм) в течение культивирования превосходило 40% и, соответственно, было выше чем в контроле, где содержание капель диаметром 10 лкм составляло 25%.

Этот факт подтверждает вывод о влиянии Str. levons на 'уменьшение межфазного натяжения на границе раздела фаз "ферментационная среда - тетрадекан".

На крупнодиспереную фракцию (диаметр капель тетрадекана от 50 до 100 мкм) оказывало влияние только механическое перемешивание, ее содержание составляло около 1 % и не изменялось в процессе культивирования.

В течение первых трех суток культивирования содержание мелкодисперсной фракции увеличивалось с 25% до 60%. Это связано с тем, что в идиофазе идет интенсивное накопление биомассы и продуктов биосинтеза.

На четвертые сутки культивирования содержание мелкодисперсной фракции снижалось с 60% до 40%, что совпадало по времени с началом интенсивного вторичного метаболизма. Одной из причин активного снижения уровня дыханич культуры в двухфазной системе могла быть коалесценция.

Некоторое возрастание: мелкодисперсной фракции на 5-6 сутки культивирования до 55% могло быть вызвано как экскрецией вторичных метаболитов, обладающих поверхностной активностью, так и лизисом клеток, в результате которого эндогенные поверхностно-активные вещества попадали в среду.

Рис.5 Распределение капель эмульсии тетрадекана в процессе культивирования Streptomyces levons

Резюмируя, можно утверждать, что в процессе культивирования Str. levons в двухфазной системе мицелий оказывает воздействие на диспергирование • тетрадекана в ферментационной среде оптимальным для вторичного метаболизма образом.

8. Влияние ".пухфазного культивировании на уровень

¡шибиь гикообразопания_в культуре частично утратившей

активность. Известно, что хранение куль ур продуцентов на скошенной агаризованой среде сгчше тределенного срока может частично или полностью привести к утере способности продуцировать антибиотики. Для Str. levons это время составляет два месяца. Частичное восстановление уровня продукции антибиотика достигается внесением в питательную среду некоторых мембраиотропкых агентов (Дмит^лева и др., 1982). Для изучения влияния двухфазного культивирования на уровень антибиотикообразования в культуре, частично утратившей активность, в присутствии 40% тетрадекяна была проведена ферментация культуры Str, levons, которая в результате хранения в течение 6 месяцев без пересеьа утратила активность на 50%. При этом было обнаружено востановление активности культуральной жидкости до контрольного значения.

Таким образом, при культивир^чании в присутствии тетрадекана происходит регенерация культуры и восстановление антибиотической э- тивности. Использование этого явления может позволить снизить частоту селекционного тбора для поддержания активности культуры Str. levons.

ВЫВОДЫ

1.Разработан новый метод глубинного культивирования микроорганизмов - двухфазное культивирование в системе "водная среда - парафин". Метод оыл опробован на культуре Streptomyces levons - продуценте антибиотика леворина.

2.При культивировании в двухфазной системе принципиально изменяется морфология купьтуры - происходит иммобилизация мицелия на каплях носителя И появляются нок^рдиоподобные варианты.

3.Установлено, что в присутствии высших парафинов (С13Н28-С15Н32) происходит увеличение уровня антибиотико-

20 •

образования. F присутствии ни ших парафинов (CgHiß-CJ0H22) появляются глубинные споры.

4Для продуцента леворина '"'г. levons подобрана система "тетрадекан (40% об.) - ф рментационная среда", на 30% увеличивающэ" синтез леворина по сравнению с контрольными условиями.

5.C помощью оригинальной установки для изк. прения интенси!1.ости дыхания микроорганизмов в глубинных условиях показано, что в присутствии тетрадекана -нтенсивность дыхания в трофофазе увеличивается, а в вдиофазе снг кается, чтс повышает уровень антибиотикообразования.

6.Изучены дисперсионные свойства двухфазной системы. Показано, что дисперсность эмульсии воздействует на структуру дыхательной активности культуры.

7 Двухфазное культивирование восстанавливает активность, утраченную культурой Str. levcris при хранении.

По матер» лам диссертации о; бликованы следующие работы:

1 Двухфазное культивирование Streptomyces' levons. Выбор органической фазы и ее влияние на жизнедеятельность культуры / В.А. Дьшшиц, Э-Г- Гкльманов, BJI. Древецкая, И.М. Печерский //Биотехнология.- 1994,- N5.- С.20-22. .

2. Дымшиц В. А., Древецкая В Л., Иванова И. А. Двухфазное культивирование Streptomyces lévoris. Накопление биомассы и. : ротолитическая активность // Биотехнология.-1994.-N5.-С.23-24.

3. Дымшиц В.А., Гильманов В.Г., • Древецкая ВЛ. Двухфазное культивирование Streptomyces levons. Влияние парафина на массопередачу кислорода, ' дисперсионные и поверхностные характеристики среды //Биотехнология.- 1994.-N5.-C.25-27.

I4.04.C~ Зак 72-55 РТП ИК СИпТЕЗ, Московский пр., 26