Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Контроль деградации ювенильного гормона у имаго Drosophila virilis в норме и при тепловом стрессе. Генетико-биохимические аспекты

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Контроль деградации ювенильного гормона у имаго Drosophila virilis в норме и при тепловом стрессе. Генетико-биохимические аспекты"

РГ Б ОД

На правах рукописи. ^ " ; УДК 577.171.22: 595.773.4

• Л1''

Д ГРЕНБЭК ЛАРИСА ГЕОРГИЕВНА

»А

КОНТРОЛЬ ДЕГРАДАЦИИ ювенильного гормона у имаго

ояозорнпаут^ в норме и при тепловом стрессе.

ГЕЯНТЫКО-еиохимические аспекты.

Генетика 03.00.15

автореферат

диссертация на соискание ученой степени ' кандидата биологических наук

Новосибирск 199Г>

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

Научные руководители: доктор биологических наук

И.Ю. Раушенбах Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук Т.М. Хлебодароаа Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные опоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук Л.В. Высоцкая

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

доктор биологических наук H.H. Колесников Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Институт биологии развития им. Кольцова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится и_1996 г.

на_заседании диссертационного совета Д-002. 11. 01 по защите

диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте цитологии и генетики СО РАН о конференц-зале Института по адрессу: 630030, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетки СО РАН.

Автореферат разослан Ц;_1936

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор биологических наук

А. Д. Груздев.

Актуальность проблемы. Механизм реакции стресса уже не одно десятилетие привлекает внимание биологов. Резко изменяя гормональный статус и энергетический метаболизм организмов при столкновении с неблагоприятными факторами среды, стресс-реакция способствует их адаптации и тем самым за-щчщагг >/х от подобных воздействий.

ООизружгинэя Гансом Селье (1972) у млокопитакяцих, реакция стресса бы-лп от"рмтз и у насекомых (обз.; Ivarravic, 1988; Cymborovski. 1988; Rauschenbaeh, 1986).

В течение последних 15 лет интенсивно изу-млся механизм стрвсс-ое&кции, у imwwk« нассгсмчу при их развитии в неблагоприятных условиях среды. Было установлено, чю одним из центральных зсеиьсз *п«й пммим; лс-ляетсп ювенильный гормон, изменение метаболизма которого обес печивает адаптацию личинок насекомых к стрессирующим условиям (обз.: Cymborovski, 1991; Rauschenbach, 1991).

В нашей лаборатории (лаборатории генетики стресса насекомых) была создана модель, позволяющая изучать генетический контроль стресс-реакции насекомых. Модель представлена двумя линиями Drosoofrila virilis, контрастно различающимися ¡10 реакции на стрессируюшос воздействие. У личинок одной из этих линий (линии 101) з неблагоприятных условиях среды развивается стоесс-реэкцчя, позволяющая им адаптироваться к этим условиям. У личинок другой линии (147) подобный ответ отсутствует. С использованием стой модели была выявлена генная система, контролирующая деградацию ювенильного гормона у личи-_ нок и было изучено ее функционирование в нормальных условиях и при стресс (Раушенбах, 1990).

Вместе с тем, ничего не было известно о структуре и функционировании системы деградации ювенильного гормона и ее генетическом контроле в нормальных условиях и при стрессе у имаго Drosophila virilis.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование системы деградации ювенильного гормона у имаго D. virilis, выяснение механизма ее функционирования в нормальных условиях и при стрессе и изучение ее генетического контроля.

В связи с этим нами были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Охарактеризовать систему деградации ювенильного гормона у имаго D. virilis.

2. Исследовать реакцию системы деградации ювенильного гормона на кратковременный тепловой стресс у имаго линий D. virilis, контрастно различающихся по реакции личинок на стрессирующие воздействия.

3. Изучить генетический контроль активности ферментов, деградирующих юве-нильный гормон у имаго D. virilis в нормальных условиях.

4. Изучить генетический контроль ответа системы деградации ювенильного гормона имаго О. virilis на стрессирующие воздействия.

5. Определить группу сцепления гена, контролирующего ответ системы деградации ювенильного гормона имаго линий D. virilis на стрессирующие воздей-ствия.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые установлено, что система деградации ювенильного гормона у D. virilis представлена тремя ферментами - зпоксидгидралазой и двумя формами ЮГ-эстераз - ДФФ-чувствитель-ной и ДФФ-нечувствительной, и определена роль этих ферментов в регуляции титра ЮГ в онтогенезе этого вида. Впервые продемонстрировано, что активность каждой из форм ЮГ-эстеразы в нормальных условиях регулируется геном (или блоком тесно сцепленных генов), не сцепленным с хромосомой-2, в которой локализован структурный ген ДФФ-нечузствительной ЮГ-эстеразы. Исследована реакция системы деградации ЮГ на срессирующее воздействие у имаго линий D. viri lis, контрастно различающихся по реакции личинок на стрессирующее воздействие. Впервые показано, что самки линии 101 D. virilis, у личинок которой при стрессе снижается деградация ЮГ, отвечает на стрессор снижением активности обеих форм ЮГ-эстеразы. У самцов подобная реакция отсутствует. Отсутствует она и у самок мутаитной 147 линии. Впервые проведен анализ генетического контроля ответа системы деградации ЮГ имаго D. virilis на стрессирующее воздействие. Выяснено, что снижение активности ДФФ-чувствительной ЮГ-эстеразы в ответ на стрессирующее воздействие контролируется одним локусом (или блоком тесно сцепленных генов), при доминировании аллеля линии 101 по данному признаку.

Определена группа сцепления этого локуса, ею оказалась хромосома-6, в которой ранее локализован ген, контролирующий снижение в ответ на стрессор активности ДФФ-нечувствительной ЮГ-эстеразы. Полученные данные позволили

вь.скаэ.эть гипотезу о наличии единого генетического контроля для различных зве-стресс-реакции Drosoph:ia. '¡.-л»-; -.ныо ñ работ« р~г"-|ктаты вносит з^лзд я nowws'ws мсчзниэма

ггг«т-оеакции насекомых i. ¡aо.;" -л- ¡ь ">',,(■"-'"м '^.тпслор^т-.л—' занимаю 1ци.\хя г-а у позеоиоч.-'ы*.

Апробации с-богы Резу/V.f ".ы г^Х-см Пь/;:- ;1::»-д.т"звг*чны на 1-ом ' o6urcf>v.¡ г*-.:'«токов И ьвглкц!>о>'л",к;й (Сзр>-iCfe IPSn".),

на Vl-ой международной к-по г.^я-'.'.-чь-ыя г->г««с>нам (Вудс ' «им, 1С05) " на Международной конференции >•■•<,o.V':»»:•". у беспозвоночных к 'Айзенах, Германия, 1993).

Публикации. По теме диссертации опублиг.оь^:,::

Структура я объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение собственных экспериментальных данных, обсуждение результатов исследования, выводы и список цитируемой литературы, в который входит 207 наименований. Работа изложена на

' С Г „ > pa^V'-í. содср;- «т 14 рисунков и 14 таблиц.

Осноьмме рео/Лотчти пспучзмы самостой К наполнении ряда экспе-

•••чгсз сотрудницы лаКо; crpewi ча'-аге

>/, )!; Су>.»>озз, ,!.Ь. Шумная, Н К. Груч/он-л-. з.--. v, >. м-,-', грайко прибил ОоОую благо,-,срноеч. логалось бы рьтч^- •.. ».i л р',: оно.цигег^^ к 6.» 4j",eGc/t;jpoDoii 7.?И и д.б.н. Paytuch'J.íx И.¡O,

Материалы и (0.ч>..\

г.',.?<.1?риалы. ("статического анализа были использоааны линки D. w-nV/s, контрасшые по рьгкци». личинок на длишь-'нч- те.-^воо воздействие: линия 101 дикого типа, линия 147, несущая мутации tw-k Uckvtt и dvtaciicd а хро-мосочя-2 и температурочувствительную леталь в хромосоме 4, и линия 160, хромосомы которой маркированы рецессивными мутациями (вторая - broken, третья - gapped, четвертая - cardinal, пятая - peach, шестая - glossy)

Культуры выращивали на стандартной питательной среде (Rauschenbach et al., 1987) при плотности 20 личинок на 7 мл среды и температуре 25° С. Синхронизацию культур проводили по вылуплению, формированию пупариума (лаждый час

отмечали белых предкуколок) и по вылету имаго (собирали мух вы-летевших в течение 2-3 час). Особей, стрессироаанных и контрольных, замора-живали в жидком азоте и хранили при температуре - 20 0 С.

В работе использовали ингибитор общих эстераз диизопропил-фосфофлюоридат (ДФФ) и специфический ингибитор ЮГ-эстеразы октилтиотри-флюоропропанон (ОТФП), любезно предоставленные профессором Б.Д.Хэм моком (Калифорнийский университет).

Условия стрессирования. Подопытных мух подвергали кратковременному тепловому стрессу, помещая их на 4 часа в термостат с температурой 38 0 G. После стресса мух замораживали в жидком азоте и хранили при -20 0 С.

Получение антисыворотки против ЮГ-эстеразы. Полученная в результате ионнообменной хроматографии ДФФ-нечувствительная ЮГ-эстераза из 2000 24-часовых куколок D. virilis использовалась для иммунизации кролика. Было проведено два цикла иммунизации, причем второй проводили через два месяца после первого. Каждый цикл состоял из трех последовательных иммунизации с интервалом в одну неделю. Первая иммунизация проводилась с адъювантом Фрейнда. Сыворотку собирали и лиофилизировали через неделю после последней иммунизации.

Измерение гидролиза ЮГ. Для измерения гидролиза радиоактивного ювенильного гормона использовали метод, предложенный Хэммоком и Спарксом (Hammock, Sparks, 1977).

Измерение активности ЮГ-эстеразы и эпоксидгидралазы. Активность ферментов, метаболизирующих ЮГ, измеряли с использованием метода Хэм-мока и Спаркса (Hammock, Sparks, 1977), и тонкослойной хроматографии (ТСХ) по Ренуччи (Renucci, 1986).

Результаты и обсуждение.

Очистку ЮГ-эстеразы из суммарного гомогената 24-часовых куколок с помощью ионнообменной хроматографии проводили на ДЕАЕ-целлюлозе. Результаты очистки представлены на рисунке 1. Сплошной линией изображен профиль выхода белков, пунктирной - (5-нафтил-ацетат гидролизующая активность. Видно, что белки, имеющие эту активность выделяются в виде двух пиков. Было показано,

что белки из этих пиков обладают и ЮГ-гидролизующей активностью. Ингибитор-

ный анализ показал, что ЮГ-гидролизующая активность, элюирующиеся в первом пике, ингибируются ДФФ - ингибтором общих эстераз, а куколочная ЮГ-зстераза, которая элюируется во втором пике, не ингибируется ДФФ, но обе ингибируются ОТФП - селективным ингибитором эстераз ювенильного гормона насекомых.

Так как ДФФ-нечувствительная ЮГ-эстераза куколки имеет нафтилацетат-гидролизующую активность, а у имаго эта фракция не выявляется, то перед нами встал вопрос, присутствует ли эта форма фермента у имаго.

Рисунок 1. Ионообменная хроматография белхсс го-могената 24-часовых куполок О.

левая ось - оптическая плотность; правая ось - активность ЮГ-эстеразы (н моль/мин); горизонтальная

ось - номер фракции, ломаная прямая показывает градиент ЫаО (0,1, 0,2, 0,3 М),

Для решения этого вопроса, мы получили антисыворотку против ДФФ-нечувствительной ЮГ-эстеразы куколки, и используя ее, с помощью техники иммунноблота мы проанализировали гомогенаты 24-ча-ссгь'х куколок и 24-часовых мух О. \zirilis. Результаты представлены на рисунке 2. Видна сильная фракция в гомогенате куколоки, и, немного менее выраженная - в гомогенате мух, причем последняя мигрирует на ту же позицию, что и куколочная ЮГ-эстераза.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что куколочная ДФФ-

нечузствительная ЮГ-эстераза есть и у имаго О ^¡гШа и обладает той жо подвижностью, но теряет сродство к (5-нафтилацетату.

Таким образом, было установлено, что у Ь. vir¡lis ЮГ деградируется двумя формами ЮГ-эстеразы: ДФФ-нечувствительной и ДФФ-чувствительной. Есть еще

один фермент, участвующий в деградации ЮГ - эпоксидгидралаза (рис. 3 (2)), однако, ее активность в период куколочно-имагинального развития практически не меняется. По-видимому, этот фермент не играет существенной роли в онтогенетической регуляции титра ЮГ у О. уШв.

Рисунок 2. Иммуноблот (нативный электрофорез в лоли-акриламидном геле) с использованием антисыворотки против ДФФ-нечувствительной ЮГ-эстеразы. Образец 1 - 24-часовая куколка О. уМэ (линия 101); Образец 2 - 24-часовая муха О. ШИэ (линия 101);

Профиль ДФФ-чувствительной (рис.3 (1)) и ДФФ-нечувствительной (рис. 3, столбики) ЮГ-эстераз совпадает у куколок, но уровень активности ДФФ-нечувствительной формы на порядок меньше, чем ДФФ-чувствительной, а после вылета совпадение профиля исчезает. Активность Дфф-чувствительной ЮГ-эстёразы увеличивается, а ДФФ-нечувствительной падает практически до нуля.

Выяснив, что основной вклад в регуляцию титра ЮГ у имаго вносит ДФФ -чувствительная ЮГ-эстераза, мы сравнили ее активность у двух линий О. иот/й -101 и 147. На рисунке 4 представлены данные по уровню суммарной ЮГ-

Рисунок 3. ЮГ-гидролизующая активность в онтогенезе О. \ziriHs.

„ 20т

х

I 15

■з

с о £

В

г ю

г

а

5

< О

——-I (1) -

5 / 0 [ *....... . п П'п . —1-1-Ф-1--

3 с о

г с

2 ¥

е &

фп 24 48 72 96 в 24 48 72 96 120 140 Время развития (часы)

5

эстеразной активности в период куколочно-имагинального развития особей линии 47 D.vi'i:¡6 я сравнении с линией 101. Видно, что в ходе метаморфоза динамика

активности ЮГ-зстерзгы у особей линии 147 в общем совпадает с таковой у линчи 101, .г •'-.»с уровень активности ЮГ-?стерязы у мух линии 147 ниже, чем у

Рисунок 4. Суммарная ЮГ-эстервзная активность в период куколочно-имагинального развития линий 101(1) и 147(2) D. viríüs.

Вертикальная ось - активность ферментов (пмоль/ мин/особь).

Горизонтальная ось - время (час). ФП - формирование пу-ui—i—i—■—■—i—.— ■ ■—■ ■ ■.—- париума, В - вылет.

ФП 24 48 72 96 В 24 48 72 96 120 144 ^ '

линии 101. При вылете имаго активность ЮГ-эстеразы существенно ниже у мух

147 линии, а, уровень активности фермента, который у особей линии 101 наблюдается через сутки после вылета, у мух линии 147 достигается только на шестые сутки. Нужно отметить, что эти линии различаются ü по времени начала откладки и по количеству оплодотворенных яиц. Самки линии 101 начинают откладку оплодотворенных яиц на вторые сутки после вылета, а самки линии 147 только на седьмые сутки; самки линии 101 откладывают в три раза больше яиц, чем самки линии 147.

Уровень активности эпоксидгидралазы в онтогенезе линии 147 D.virilis в сравнении с линией 101 практически не различается. Исходя из этого, можно полагать, что у мух линии 147, как и у линии 101, эпоксидгидралаза не играет существенной роли в онтогенетической регуляции титра ЮГ и не может компенсировать тот низкий уровень активности ЮГ-эстераз, который наблюдается у особей линии 147 после вылета имаго.

Различия, которые мы обнаружили в активности ДФФ-чувствительной ЮГ -эстеразы между молодыми (24-часа после вылета) самками линий 101 и 147 ока-

зались значительными и это позволило провести их генетическии анализ, результаты которого представлены на рисунке 5.

20

15

147

Л

101

Н-1-H

21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47

F1 (101x147)

Рисунок 5. Генетический анализ различий в уровне ЮГ-гидроли-зующей активности ДФФ-чувстви-тельной ЮГ-эстеразы у самок линий 101 и 147 D. virilis. Вертикальная ось - частота (%), горизонтальная ось - гидролиз ЮГ(%)

На верхних гистограммах рис. 5 приведены распределения для родительских линий: слева - линия 147, справа - линия 101. На среднем рисунке представлено распределение для F1 гибридов, по которому видно, что по данному признаку доминирует аллель линии 101. Распределение на нижней гистограмме приведено для особей из потомства бэккросса F1 (101x147) х 147. Видно, что распределение распадается на два класса, что позволяет рассмотреть вопрос о справедливости гипотезы о моногенном контроле различий в уровне активности ДФФ-чувстви-тельной ЮГ-эстеразы, у линий 101 и 147. Анализ различий по % позволил сделать вывод о том, что гипотеза не отвергается.

При анализе потомства бэккросса было обнаружено, что особи, имеющие фенотип линии147, т.е. несущие

21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47

18 1С 14 12 10 Б Б 4 2

о!

F1(101x147)x147

21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47

обе хромосомы-2 от линии 147, попадали в оба класса распределения, как в класс, с уровнем активности ДФФ-нечувствительной ЮГ-эстеразы, характерным для линии 101, так и з класс с уровнем, характерным для линии 147. Из этого можно заключить, что ген {или блок тесно сцепленных генов), контролирующий (щие) активность ДФФ-нечувствительной ЮГ-эстеразы не может быть локализован g хромс-соме-2

Сходным образом был проведен генетический анализ различий в активности ДФФ-нечувствительной ЮГ-эстеразы и были г-олучзны знзлогичные результаты.

Таким образом, мы установили, что межлинейные различия .чан в активности ДФФ-момузгтзитрпьной, так и ДФФ-чувствительной ЮГ-эстеразы контролируются моногенно (или блоком тесно сцепленных геноз) и нельзя исключить вероятность того, что эти различия контролируются одним локусом, а так, как аллель особей линии 101 доминирует в обоих случаях, то речь идет, скорее всего не о структурном гене, а гене, регулирующем активность фермента.

Анализ гидролиза ЮГ у 24-часовых имаго D. virilis, подвергшихся кратковременному тепловому стрессу, демонстрирует, что самки линии 101 отвечают на стресс снижением уровня гидролиза гормона. У самск линии 147 стресс не влияет на уровень гидролиза гормона. Тепловой стресс не влияет на уровень гидролига ЮГ и у самцов D. virtiis (тсбл.1).

Анапкз продуктов гидролиза гормона показал, что наблюдаемое снижение гидролиза ЮГ у самок 10! линии з условиях стр-эсса связано с падением активности ЮГ-астерагы (уменьшается количество ЮГ-кисготы). а на эпоксцдгцд-ралаоы, причем, активность ДФФ-нечувствительной формы фермента падает почти в 2 раза.

Для оценки содержания ДФФ-нечувстгитэльной ЮГ-эстеразы был использован иммунноблот. Данные, приведенные ча рисунке 6, показывают, что содержание ДФФ-нечувствительной ЮГ-эстеразы у самок линии 101 снижается при действии теплового стресса: сыворотка против этой формы фермента выявляет уменьшение количества (26,6±3,5 условных единиц) белка у мух, подвергнутых теплоному стрессированию, по сравнению с контролем (41,3±3,5).

Ранее в лаборатории был проведен генетический анализ различий в ответе на стресс ДФФ-нечувствительной формы фермента, оставалась задача выяснить,

Таблица 1. Влияние кратковременного теплового стресса на гидролиз [3 Н] ЮГ III у имаго О. virilis.

Количество гидролизованного [J H] ЮГ III

Группа (пмоль/мин/особь)

линия 101 линия 147

Самки

Нативный гомогенат:

Контроль 14.8 + 0.5 8.2 ±0.9

Опыт 9.0 ±1.0 8.1 ±1.3

Гомогенат, инкубирован-

ный с ДФФ:

Контроль 1.28 ±0.08 0.69 ± 0.06

Опыт 0.78 ±0.10 0.60 ± 0.08

Самцы

Нативный гомогенат:

Контроль 9.1 ±1.3 -

Опыт 8.9 0.9 -

Гомогенат, инкубирован-

ный с ДФФ:

Контроль 0.84 ±0.06 0.69 ±0.14

Опыт 0.73 ±0.12 0.68 ±0.14

Примечание: (-) - измерение не проводили.

Контроль

каков ответ на стресс ДФФ-чувствительной ЮГ-эстеразы.

Как следует из рисунка 4, через 6 суток после вылета у самок линии 147 деградация ЮГ возрастает и достигает уровня линии 101. А так как у самок линии 147 при этом сохраняется свойство не реагировать на стресс снижением деградации гормона (т.е. изменением активности ДФФ-чувствительной ЮГ-эстеразы), то уровень гидролиза ЮГ при стрессе у этих двух линий различается. Это позволило провести генетический анализ межлинейных различий в от-Опыт вете системы деградации ЮГ, представленной у половозрелых самок ДФФ-чувствительной ЮГ-эстеразой, на стрессирую-щее воздействие, между самками линий 101 и 147, результаты которого приведены на рисунке 7. Рисунок 6. Денситограмма образцов иммунноблота, демонстрирующая содержание ДФФ-нечувствительной ЮГ■ эстеразы у взрослых самок линии 101 О. virilis e нормальных условиях и при тепловом стрессе.

101

147

35 , 30 ] 25 20 15

5

1

п

□

?0 ?Л ?Я 32 36 40 44 4«

П (101x147)

......... .

го 24 ге 32 зе 43 « -м

8 12 16 ?0 24 2 8 32 36 40 44 48

Рисунок 7. Гзнетический анализ различий гидролиза ЮГ между взрослыми самками линий 101 и 147 О. у/я/га при стрессе. Вертикальная ось - частота

(%), горизонтальная ось - гидрата ЮГ (%).

I

| На верхних гистогрзммп* при-| зедены распределения для роди-I тцльсчих линий. На средней - пряд-! ставлено распределение дпч И п?б-{ по которому видно, что аллель

ссосгй линии 101 доминирует по денному признаку. Распределение на нижней гистограмме приведено для особей из потомства бэккросса Я1(101х147) х 147. Видно, что это распределение распадается на два класса. что позволяет рассмотреть вопрос о справедливости гипотезы о моно-,-вкнпм контроле различий в уровне ¡идролиза ЮГ, а именно, о уровне активности ДФФ-чуествительной ЮГ-•-.стеразы, у линий 101 и 147. Анализ ! различий по х показал, что гипотеза j не отвергается и можно полагать, чго | ответ ДФФ-чусствителькой ЮГ-зстеразы на стрессирующее воздействие контролируется одним локусом или блоком тесно сцепленных генов.

Как и з предыдущих анализах, оказалось, что в потомстве бэккросса,

особи, имеющие фенотип линии 147, т.е. несущие обе хромосомы-2 от линии 147, попадали в оба класса распределения. Из этого можно заключить, что ген, кон-

15

третирующий ответ ДФФ-чувствительной ЮГ-эстеразы на стрессирующее воздействие не может быть локализован в хромосоме-2.

Для того, чтобы проанализировать остальные пары хромосом линии 147 на предмет сцепленности с ними этого гена, была использована линия 160, аутосомы которой маркированы рецессивными мутациями.

Чтобы этот анализ был возможен, половозрелые самки линии 160 должны иметь уровень гидролиза ЮГ, сходный с наблюдаемым у самок линии 101, и реагировать на стресс его снижением. Из таблицы 2 видно, что линия-анализатор реагирует на стресс как и линия 101 и аллель особей этой линии доминирует. Таблица 2. Влияние кратковременного теплового стресса на гидролиз [3Н]

ЮГ-Ш у 11-суточных самок ОговорЫ^ у1гШэ.

Группа Уровень гидролиза ЮГ (%)

101 147 160 147 х 160

контроль 36,2 ±1,7 38,7 +1,9 35,2 +1,2 38,0 ±1,8

опыт 22,4 ± 0,8 37,4 ±1,0 19,3 ±1,0 24,1 ±0,8

Для определения группы сцепления было поставлено скрещивание, схема которого показана на рисунке 8.

В потомстве Р2 были проанализированы 4 фенотипические группы. В каждой группе особи имели три пары аутосом от линии 160, т.е. были маркированы соответствующими рецессивными мутациями, и одну хромосому (в гомо- или гетерозиготном состоянии) от линии 147, т.е. не маркированную соответствующей для этой хромосомы рецессивной мутацией.

К сожалению, Х-хромосома у линии 160 не маркирована, однако, в случае, если искомый ген локализован в Х-хромосоме, то при данной схеме скрещиваний

во всех четырех тестируемых группах мы наблюдали бы расщепление по уровню

\

гидролиза 1:1.

В том случае, если искомый ген является аутосомным локусом, тогда, если он отсутствует в тестируемой хромосоме, то все особи данной группы в условиях теплового стресса будут иметь низкий уровень гидролиза ЮГ, а распределение особей по проценту гидролиза должно соответствовать таковому для линии 160. Что же касается той ситуации, когда искомый ген находится в тестируемой хромосоме, то здесь необходимо иметь в виду следующее. Поскольку хромосомы линии

?

14/ х 0*160

+ 3

+ 3 +4 +5

9р ей ре д!

о 1Л : . + Л +5 -1-6

Л?. 3.'. ±1 5®. Л.1. ЯР С.А. ±5. эр ро

я!' яр" "ГУ Тё""аГ яр" "саг "+гГ'аТ сЗ""ро"

Я? +4 ре^ д1 др Ы +5 д! ЗР са ре

"я а I

™7Г чи ^с

¡-в >-6

*гг

Р2 (хромосома 3)

35

30 -

25 [-

20

<5 г

Г | |

4. ' -и

П-

Р2 (хромосома 4)

П-1

е '2 Ш

12 и 24 30 36 V <1

Р2

Г

> I I

30 25

?0

11)

* [ 0 [

6 12 18 24 30 36 42 48

сш

и

4

6 12 1$ 24 30 Эв 42

Рисунок 8. Определение группы сцепления гена, контролирующего активность ДФФ-чувстеительной ЮГ-эстеразы при стрессе у О. мл/ю. Вертикальная ось - частота особей (%), горизонтальная - уровень гидролиза ЮГ (%).

<0

160 маркированы рецессивными мутациями, то особи, несущие одну хромосому от линии 160 и одну от линии 147, будут фенотипически неотличимы от особей, несущих обе хромосомы от линии 147. А это означает, что в такой группе только часть особей не будет реагировать на стресс снижением уровня гидролиза ЮГ, как это характерно для линии 147. Поскольку по отношению к тестируемой хромосоме и исследуемому гену данная группа особей будет потомством второго поколения обычного моногибридного скрещивания, из которого мы элиминируем одну фено-типическую группу, несущую обе тестируемые хромосомы от линии 160, то теоретически ожидаемое распределение по уровню гидролиза ЮГ в ней должно соответствовать 2:1. Причем, две части особей должны давать распределение, характерное для гибридов Р1 и одна часть - для особей линии 147.

Следует отметить, что такая постановка опыта не исключает возможности кроссинговера между генами тестируемой хромосомы линии 147 и генами соответствующей хромосомы линии 160. Поэтому можно ожидать, что исследуемые группы могут на полностью соответствовать вышеописанным из-за наличия кроссовер-ных особей. По виду распределений, представленных на рисунке 7, ясно, что ген сцеплен с хромосомой-6.

Необходимо отметить, что наличие одной мухи с высоким уровнем гидролиза ЮГ в группе, англизируемой на сцепление с хромосомой-5, является, скорее всего, как указывалось выше, результатом кроссинговера.

Итак, нами установлено, что ген, регулирующий ответ ДФФ-чувствительной ЮГ-эстеразы на стресс, локализован в хромосомэ-6, а как было показано ранее (Раушенбах, 1990), ген, регулирующий ответ ДФФ-нечувствительной ЮГ-эстеразы на стресс, локализован в той же группе сцепления.

Таким образом, у О. мпНз ведущим ферментом в системе деградации ЮГ является эстераза ювенильного гормона, которая представлена двумя формами, и ответ каждой из этих форм фермента на стресс контролируется генами, локализованными в хромосоме-6. Вполне возможно, что это один и тот же локус.

Выводы.

1. Охарактеризована система деградации ювенильного гормона у имаго О. мпНб. Она представлена тремя ферментами: эпоксидгидралазой и двумя формами

ЮГ-сстеразы: ДФФ-нечузствительной и ДФФ-чувствительной. Установлено, что активность эпоксидгилралазы не вносит существенного вклад?» в контроль титра ювелипьного ¡ормона у имаго О. viriíte. Н~"пг?чо. что у молодых самок гормон р/>д-оолизуется ДфФ-н<у ¡yací ей i ольно-", и Дс-Ф-узстрительчой !0г-эстчол7ой, у половозрелых - только псследк<_-й. OCiupyrír«*», что у самок дикого г;:ла ЮГ-гидролитическая активность выи» чем v слм:;гй.

2. Dnepuuis посэеден a»i.w.» гэн&-.",«чвссг?» контооля активности ЮГ-зстеразы у имаго О. milis в иермал^чьи Выяснено, что гстндостч ках-Л-м ^ "hjuwí """тоолируется моногенно или блоком тесно сцепяет.ых генов при доминироааним аллел" ^нни« íCi. Устс!!~^плио. ч>о ^"копирующие активность ДФФ-нечуествительной и ДФФ-чувствительной форм не оцеплены с хромосомой-2.

3. Исследована реакция системы дефадации ювенильного гормона на стрессирующее воздействие у имаго линий D. virilis, контрастно различающихся по реакции личинок на это воздействие. Установлено, что самки дикого типа (линии 101) '^вечгвг -рйспане высокой температуры существенным снижением ЮГ-гидсопи".i^fCf.CM п у счмек г«тачгччй липки (147) подобная геа-'цип

u.'Tñyc . СлМцЬ! сббЖ Г,>»! f-C'VrSVW РЧ СТО йо?дейстоие cmhatrt/.?M ГИД* уел«р гормоне Олжйчие гг,даоп''з;; ;сс^*ль»«егэ гормона у самлч * условия/ стресса c5ycmsw*<v «<t»woct4 'ДйФ-чуеотвигельной и ДФФ-

>рчувствитепьксГ» форм ЮГ-эстеразь: Г;'Н"н;ной пс.споднсо явияет:» ум«мъшзиме содержания фермата

4. Впервые проведен анализ генетического контроля ответа системы дстрд-

•cr<Bt(W¡bHoro .'ормсч,т имзге О. *t>4s нэ стгоссиоуичцее воздействие. Выяснено, что снижение акчивности ДФФ-чугпг.вительнсл !ОГ-эст«разы в отоег на стрессирующее воздействие контролируется одним локусом (или блоком теско ^иепл^п^'* генов). при доминировании аллеля линии 101 по данному признаку.

5. Определена группа сцепления для л_жуса, кон'фояируюшего у половозрелых самск О. viriüs ответ ДФФ-чувствительной ЮГ •■»стеразы на стрессирующее цоздойсгеие. Впервые показано, что данный ло«ус находится г? шестой хромосоме.

6. Высказана гипотеза о наличии единого генетического контроля для различных звеньев стресс-реакции Drosophila.

Список статей.

1. Раушенбах И.Ю., Хлебодарова Т.М., ЧенцоваН.А., Грунтенко Н.Е., Гренбэк Л.Г., Янцен Е.И., Филипенко М.Л. Генетический анализ различий в метаболизме ювенильного гормона у устойчивой и чувствительной к стрессу линий Drosophila virilis. // Генетика, 1995, Т.31, С.193-200

2. Rauschenbach I.Y., Khlebodarova Т.М., Chentsova N.A., Gruntenko N.E., Grenback L.G., Yantsen E.I., Filipenko M.L., Metabolism of the juvenile hormone in Drosophila adults under normal conditions and heat stress. // J.lnsect Physiol., 1995. V. 41. P. 179-189.

3. Хлебодарова T.M., Гренбэк Л.Г., Грунтенко Н.Е., Суханова М.Ж., Раушенбах И.Ю. Ферменты метаболизма ювенильного гормона в онтогенезе Drosophila virilis И Онтогенез. 1996. Т.27. С.31-35.

4. Rauschenbach I.Y., Gruntenko N.E., Khlebodarova Т.М., Grenback L.G., Mazurov M.M., Sukhanova M. Jh., Shumnaja L.V., Zakharov I.K., Hammock B.D.// The role of the degradation system of the juvenile hormone in the reproduction of Drosophila under stress//J.lnsect Physiol., 1996, V. 42. P. 735-742.

5. Гренбэк Л.Г., Хлебодарова Т.М., Грунтенко Н.Е., Суханова М.Ж., Шумная Л.В., Раушенбах И.Ю. Генетический контроль ответа системы метаболизма ЮГ Drosophila virilis на стрессирующие воздействия // Генетика. 1996.Т. 32.c.i€6S-16€7

6. Гренбэк Л.Г., Хлебодарова Т.М., Грунтенко Н.Е., Суханова М.Ж., Шумная Л.В., Раушенбах И.Ю. Генетический контроль ДФФ-чувствительной эстеразы ювенильного гормона у имаго Drosophila virils И Генетика. 1996. 32. С.

7. Khlebodarova Т.М., Grenback L.G., Gruntenko N.E., Sukhanova MJh., Mazurov M.M., Raushenbach I. Yu., Tomas B.A., Hammock B.D. A comparative analysis of juvenile hormone metabolyzing enzymes in two species of Drosophila during development.// J. Molec. Biochem. and Physiol. 1996. in press.