Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль системы деградации ювенильного гормона в стресс-реакции имаго и адаптации популяций Drosophhila к неблагоприятным условиям среды

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль системы деградации ювенильного гормона в стресс-реакции имаго и адаптации популяций Drosophhila к неблагоприятным условиям среды"

На правах рукописи УДК 577.171.22:591.25:595.77

ГРУНТЕНКО НАТАЛИЯ ЕВГЕНЬЕВНА

РОЛЬ СИСТЕМЫ ДЕГРАДАЦИИ ЮВЕНИЛЫЮГО ГОРМОНА В СТРЕСС-РЕАКЦИИ ИМАГО И АДАПТАЦИИ ПОПУЛЯЦИЙ ОгоаорЖа К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ СРЕДЫ

Генетика - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1996"

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Т.М. Хлебодарова Институт Цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный консультант:

доктор биологических наук, И.Ю. Раушенбах

Институт Цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л.Н. Иванова Институт Цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Л.З. Кайданов Санкт-Петербургский государственный университет, г. Санкт-Петербург

Ведущее учереждение: Институт биологии развития

им. Н.К. Кольцова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится 1996 г.

на ¿/ТТ^^Р /У/г-^заседании диссертационного совета по задате диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-00Е.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференцзале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан

а&уг&г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Механизм реакции стресса уже не одно десятилетие является объектом пристального внимания физиологов. Показано, что эта реакция является эволюционно консервативной и характерной как для млекопитающих, так и для насекомых. Также делаются попытки изучения генетического контроля стресс-реакции. Но механизм стресс-реакции млекопитающих настолько сложен, что изучение- его генетического контроля связано с большими трудностями. Поэтому особый интерес представляет изучение генетического контроля стресс-реакции насекомых, как в плане понимания эволюционных аспектов становления этой реакции, так и с той точки зрения, что насекомые могут служить моделью для установления некоторых закономерностей. генетического контроля стресс-реакции млекопитающих. Представляется также интересным выяснить, какую роль играет стресс-реакция в адаптации популяций животных к неблагоприятным условиям.

Известно, что у личинок насекомых в неблагоприятных условиях среды возникает неспецифическая гормональная реакция, вызывающая либо состояние диапаузы, либо задержку метаморфоза у недиапаузирующих видов. Показано, что одним из центральных звеньев стресс-реакции является ювенильный гормон (ЮГ), и что именно повышение содержания ЮГ при стрессирухэдих воздействиях обеспечивает адаптацию личинок насекомых к неблагоприятным условиям (обз.: СутЬогоугек!, 1991; ИаизсЬепЬасЬ, 1991).

Однако о механизме стресс-реакции у имаго насекомых известно крайне мало, а о той роли, которую играет эта реакция в адаптации популяций к неблагоприятным условиям, не известно практически ничего. Но так как у личинок насекомых одним из центральных звеньев стресс-реакции является система деградации ЮГ, можно предположить, что и у имаго насекомых ЮГ играет важную роль в этой реакции.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью данной работы является выяснение роли системы деградации ЮГ в стресс-реакции имаго 0гозорКг1а ше1 аподавЬег и роли стресс-реакции в адаптации популяций БгозорШа к неблагоприятным условиям среды.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить систему деградации ЮГ у 0. mela.noga.ster.

2. Исследовать реакцию системы деградации ЮГ у имаго 0. melanogaster на стрессирующее воздействие.

3. Провести анализ генетического контроля активности ЮГ-эстеразы у Б. теХапоёазЬег.

4. Осуществить анализ природных популяций Б. теХапоёаяЬег по системе деградации ЮГ.

5. Исследовать роль системы деградации ЮГ в размножении БгоБОрНИа в условиях стресса и в адаптации популяций ОговорН-Ца к этим условиям.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Детально охарактеризована система деградации ЮГ у имаго Б. те1апо£азЬег. Впервые установлено, что ЮГ-гидролитическая активность существенно выше у самок, чем у самцов этого вида. Впервые продемонстрировано, что у молодых самок Б. теЫподазЬег деградация гормона осуществляется двумя ферментами, ЮГ-эстеразой (ЮГЭ) и ЮГ-эпоксидгидра-зой (ВГЭГ), а у интенсивно размножающихся самок - только ЮГЭГ. Изучена тканевая экспрессия гена ЮГЭ у Б. теЫподазЬег. Впервые показано, что ген экспрессируется в яичниках. Впервые изучена реакция системы деградации ЮГ В. теЬаповазЬег на стрессирующее воздействие. Установлено, что самки отвечают на действие высокой температуры снижением ЮГ-гидролитической активности (у молодых самок снижается активность ЮГЭ и ЮГЭГ, у интенсивно размножающихся - только ЮГЭГ). У самцов подобная реакция отсутствует. Впервые проведен анализ генетического контроля активности ЮГЭ у Б. те1апойаз1ег. Обнаружено, что активность фермента в норме и при стрессе контролируется разными генетическими элементами. Ген(ы) контролирующий(ие) активность ЮГЭ в нормальных условиях локализован(ы) во второй группе сцепления. Впервые продемонстрирован полиморфизм природных популяций Б. те1апо#о^ег по системе деградации ЮГ. Впервые установлено, что самки БгогорМЛа (Б. у!гг!гз и Б. ше1 аподазЬег) отвечают на стрессирующее воздействие задержкой в откладке яиц, и что контролируется это явление системой деградации ЮГ. Предложена гипотеза о роли системы деградации ЮГ в адаптации популяций к неблагоприятным условиям среды.

Результаты данной работы вносят вклад в понимание механизма реакции стресса насекомых и той роли, которую стресс-реакция играет в адаптации популяций животных к неблагоприятным условиям Среды, и могут быть использованы исследователями, занимающимися проблемой стресса.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы были представлены на 1-ой съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов. 1994г.), на VI-ой международной конференции по ювенильным гормонам (Вудс Холл, США, 1995) и на Международной конференции "Механизмы адаптации у беспозвоночных к изменениям окружающей среды" (Айзенах, Германия, 1993).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 6 статей.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение собственных экспериментальных данных, обсуждение результатов исследования, выводы и список литературы (212 ссылок). Работа изложена на 143 страницах, содержит 21 рисунок и 10 таблиц.

Основные результаты получены автором самостоятельно. В выполнении ряда экспериментов принимали участие сотрудницы лаборатории генетики стресса насекомых Л. Г. Гренбэк, М.Ж. Суханова. Л. В. Шумная и сотрудник лаборатории генетических основ онтогенеза М.Л.. Мазуров, за что автор им крайне признательна. Особую благодарность хотелось бы выразить моим руководителям к.б.н. Т.М. Хлебодаровой и д.б.н. И.Ю. Раушенбах, а также д.б.н. И. К. Захарову за консультаций по проблемам популяционной генетики.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы: В работе использованы линии D. virilis, контрастные по реакции на длительное тепловое воздействие: линия 101 дикого типа и линия 147, несущая мутации brick, broken и detached в хромосоме 2 и температурочувствительную леталь в хромосоме 6, и линии D. melanogaster: In(2LR)Cy/L; In(3LR)D/Sb. Canton-S, а также сток "Алтай" и ряд изосамочьих линий, выделенных из популяций мух Алтайского края и любезно предоставленных И. К. Захаровым, и линия 921283. созданная нами на основе одной из изо-самочьих линий путем пяти поколений инбредных скрещиваний. 1.734 т.п.н. фрагмент кДНК гена ЮГЭ Heliothis virescens (Lepidoptera), был выделен, охарактеризован и любезно предоставлен нам профессором Б. Д. Хэммоком (Калифорнийский университет, США). Препарат очищенной ЮГЗ H.virescens и специфический ингибитор ЮГЭ, октилтиотрифлюоропропанон (ОТФП), также любезно предоставлен профессором Хэммоком.

Условия стрессиравания. Мух .стрессировали, помещая их в термостат с температурой 38°С; на 4 часа D. virilis и 3 часа

D. metanogaster. Стрессировали только самок, т.к. самцы становятся стерильными после стресса такой продолжительности.

Измерение гидролиза ЮГ. Для измерения гидролиза радиоактивного ЮГ использовали метод,. предложенный Б.Д. Хэммоком и Т. С. Спарксом (Hammock, Sparks. 1977).

Измерение активности ЮГЗ и ЮГЭГ. Активность ферментов, гид-ролизующих ЮГ. измеряли с использованием метода Хэммока и Спаркса (Hammock, Sparks, 1977) и тонкослойной хроматографии (ТСХ) по Ренуччи (Renucci, 1986).

Иолекуяярно-генетческие методы. Приготовление компетентных клеток, выделение и рестрикционный анализ плазмидной. ДНК. электрофорез в полиакриламидном и агарозном гелях и элюцию фрагментов ДНК из гелей проводили стандартными методами (Маниатис, 1984). Введение 32Р-нуклеотидов во фрагмент ДНК осуществляли с помощью статистической затравки и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Суммарную РНК из тканей дрозофилы для дот-гибридизации выделяли по методу Хомчински и. Сасхи (Chomczynskl. Sacchi, 1987). РНК-дот-гибридизацию проводили по методу Томаса (Thomas. 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Результаты исследования системы деградации ЮГ в онтогенезе линии дикого типа D. metanogaster (рис.1) свидетельствуют, что

Рис.1. Активность ЮГЗ и ЮГЭГ в онтогенезе самок линии Сагиоп-Б Б. те1апо£аБ1ег. ФП - формирование пупариума, В - вылет имаго.

у блуждающих личинок гидролиз ЮГ осуществляется ЮГЭГ, в период метаморфоза, в основном, посредством ЮГЭ, у молодых мух в равной мере ЮГЭ и ЮГЭГ, а у половозрелых самок Б. melanogaster он обеспечивается ЮГЗГ. У самцов Б. mela.noga.ster ЮГ-гидролитическая активность оказалась существенно более низкой, чем у самок. Это совпадает с данными получеными в нашей лаборатории раннее, свидетельствующими, что у 0. virilis самцы также характеризуются более низким уровнем гидролиза ЮГ, чем самки.

Экспрессия гена ЮГЭ в различных тканях личинки и имаго 0.те1апо§аз1ег была изучена посредством РНК-дот-анализа с использованием фрагмента кДНК гена ЮГЭ Н. уггезсегше в качестве зонда (рис.2). В анализе использовались образцы суммарной РНК

ч ------

1 2 3 4 5 6 7

Рис.2. РНК-дот гибридизация с меченым фрагментом кДНК гена ЮГЭ Н. VIтеБсепэе. 1 - суммарная РНК из нервных ганглиев, 2 -

из слюнных желез, 3 - из жировых тел личинок 0. те1апо^Ьет; 4 - суммарная РНК дрожжей; 5 - суммарная РНК из яичников, 6 -из голов, 7 - из тел имаго Б. ше1аподаз1ег. (по 20 мкг). В качестве контроля использовали суммарную РНК дрожжей (10 мкг). Видно, что гибридизация наблюдается с образцами из жировых тел личинок (3) и из яичников имаго (5) дрозофилы; с образцами РНК из других тканей гибридизации не наблюдается. Присутствие ЮГЭ в жировом теле личинок Б. уггШБ было показано в нашей лаборатории ранее (РаизсйепЬасЬ е1 а1., 1980). Обнаруженная же нами экспрессия гена ЮГЭ в яичниках имаго позволяет предположить, что поддержание баланса в уровне ЮГ, необходимого для регуляции роста, созревания и откладки яиц у Drosoph.Ua, может осуществляться посредством интенсивного синтеза гормона и быстрой его деградации в тех отделах яичника, в которых яйца находятся на стадии завершения созревания.

Исследовав влияние стрессирующего воздействия на ЮГ-гидро-лизующую активность у самок дикого типа Б. те!апо^с^ег, мы об-

Dxoaophi la удлгл ?if

1 сутки после вылета

зо-, ИГЭ

(Ь

20

10 -

Р

пгэг

S суток посла вылета югэ

пгэг

#3

№

101

147 101 147 1«1

147

101 147

DrosophdJL* тоХлхюдлаЬлт

1 сутки после вылета

4 суток после вылета

20

ПГЭ

КГЭГ

ЮГЭ

КГЭГ *

* *

m

Cant 1283 Cant 1283 Cut 1283 Cant 1283

Рис.3. Влияние теплового стресса на активность ЮГЭ и ЮГЭГ у . самок линий 101 и 147 D. virilis и линий Canton-S и 921283 D. nelanogaster. Штриховкой обозначены данные по активности фермента после стресса. Звездочками показана достоверность различий (три звездочки - Р>0.99, две - Р>0.95). наружили ее существенное снижение (рис.3). Причем это снижение происходит у молодых самок D. metanogaster за счет ЮГЭ и ЮГЭГ, а.у четырехсуточных - только за счет ЮГЭГ. Мы также исследовали влияние теплового стресса на гидролиз ЮГ и у мух дикого типа D. virilis. (рис. 3) и обнаружили, что снижение гидролиза ЮГ в стрессирующих условиях происходит только за счет ЮГЭ и у молодых, и у зрелых самок. Таким образом мы показали, что у

половозрелых самок Б.тектовс^ег основным ферментом деградации ЮГ, ответственным за снижение гидролиза гормона при стрессе, является ЮГЭГ, тогда как у й. угг-Шг эту роль играет ЮГЗ.

Проанализировав активность ЮГ-гидролизующих ферментов у линии 921283 Б. melanogasteг (рис.3), мы выяснили, что она является мутантной и характеризуется низким уровнем гидролиза ЮГ в нормальных условиях, причем этот уровень не меняется при стрессе, в отличие от линии дикого типа. Существование подобных различий обнаружено и для двух линий (101 и 147) д. угг-Шя, контрастных по реакции на стресс.

Линию 921283 использовали для анализа генетического контроля активности ЮГЭ у 0. теХапое^ег. Необходимо подчеркнуть, что мы проводили генетический анализ на молодых самках Б. теЫпойазЬег. у которых деградация ЮГ осуществляется как ЮГЭ, так и ЮГЗГ, однако условия измерения гидролиза гормона были таковы, что мы регистрировали только различия в активности ЮГЭ, активность же ЮГЭГ оставалась неизменной. Так что проводя локализацию гена, контролирующего различия в уровне гидролиза ЮГ у 0. те1аподаБ1ег в нормальных условиях, мы локализовали ген, контролирующий активность ЮГЭ.

На верхней гистограмме рис.4 представлены распределения самок линий 921283 и Су/Ь; О/БЪ по уровню гидролиза ЮГ (т.е. активности ЮГЭ) в нормальных условиях. Для линии Су/Ы О/БЬ в норме характерен высокий уровень гидролиза ЮГ, который снижается при кратковременном тепловом стрессе. Для линии 921283 характерен низкий уровень гидролиза ЮГ, как в нормальных условиях, так и при стрессе. В нормальных условиях трансгрессия невелика и различия между линиями достоверны (Р>0,95).

Тип наследования уровня гидролиза ЮГ (активности ЮГЗ) и характера реакции на стресс определялся в скрещивании самок +1/+1; +2/+2; +3/+3 (линия 921283) с самцами Су/1; Б/БЬ. "На средней гистограмме рис.4 представлено распределение гибридов , демонстрирующее промежуточный характер наследования изучаемого признака. Объемы выборок 921283, Су/Ь; О/БЪ и Р} равны, соответственно, 20, 28 и 22. Различия между группами 921283 и и между Су/1; Б/БЪ и ?! достоверны (Р>0,95), что позволяет говорить о кодоминатном наследовании признака.

На нижней гистограмме рис.4 представлено распределение гиб-

ш h О h

u

(О X

во

70 60 50 -j 40 30 20 10 О

I ' I ' I I Г"У !■!■■■ Г*

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

80 -I

7060 -50 40 30 20 -10 -

й

I I I I I I 1 I MlTTI'l l n rri'l I'l l

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

уровень гидролиза ЮГ (%)

РИДОВ ?! по уровню гидролиза ЮГ после теплового стресса. Видно, что хотя гибриды характеризуются уровнем гидролиза ЮГ, промежуточным между родительскими линиями, они реагируют на стресс его снижением. как и линия Су/1; Б/БЬ, что свидетельствует о доминировании способности реагировать на стрессирующее воздействие снижением гидролиза ЮГ, т. е. активности ЮГЭ. Эти результаты позволяют

заключить, что - у Б. теЫпоёавЬег активность ЮГЭ в нормальных условиях и при стрессе контролируется, по видимому, различными генетическими элементами. Рис.4. Гибридологический анализ различий в гидролизе ЮГ у самок 0. meíanogaster линий Су/Ц й/БЬ и 921283. Верхняя гистограмма, вертикальная штриховка -линия 921283, горизонтальная штриховка - линия Су/1: й/БЬ. Средняя гистограмма - гибриды ?! в нормальных условиях, нижняя гистограмма гибриды ?! после стресса.

Вторым этапом генетического анализа было определение группы сцепления, к которой относится ген (или группа генов), контролирующий уровень гидролиза ЮГ (активность ЮГЭ) у В. те1аги^аз1ег в нормальных условиях. Схема скрещивания приведена на рис.5.

+1 +2 +з + Су 0

+ 1+2+3 у ь 5Ь

И!.- С?

+ ' Су О У +2 +3

Рис. 5. Схема скрещивания для определе-+ 1 +2 +3 ния группы

9 = = = сцепления ге-

' + +>-.+* +о ш (группы

генов), конт-+ 1 Су в .+1 +2 О +1 Су +з ролирующе-

Рт- $ — — —; ^ _. ^ „ го(их) актив-

+ 1+2+3 +1+2+3 +1 +2- +3 ность югэ_

Уровень гидролиза ЮГ анализировали у самок Рг трех классов. Так как гибриды ?! имеют промежуточное значение исследуемого признака, низкий уровень гидролиза ЮГ будет наблюдаться только у особей, несущих соответствующий генетический детерминант в

гомозиготном состоянии. Таким образом, если изучаемый признак связан с Х-хромосомой, то все три исследуемые группы Г2 будут характеризоваться низким уровнем гидролиза ЮГ. Если признак связан с хромосомой 2, то им будут обладать только самки с генотипом +1/+1; +г/+г; 0/+3 (фенотип "Б"); а если с хромосомой 3, - с генотипом +1/+1; Су/+2; +3/+3 (фенотип "Су"). В проведенном нами анализе низким уровнем гидролиза ЮГ характеризовалась группа с фенотипом "Б", что позволило нам заключить, что ген (или группа генов), контролирующий активность ЮГЗ, оцениваемую по уровню гидролиза ЮГ в нормальных условиях, находится у В. те1.апо£а51ег в хромосоме 2.

Проведенный нами популяционный анализ деградации ЮГ и реакции на тепловой стресс показал, что природные популяции 0. те1апоёав1ег полиморфны по интенсивности гидролиза ЮГ в норме и по реакции системы деградации ЮГ на стрессирующее воздействие, и что в них с неожиданно высокой частотой (55.8% в популяции Поспелиха и 64.0Ж - в популяции Горно-Алтайск) встре-

х

чаются особи с низким уровнем гидролиза гормона, не меняющимся в стрессирующих условиях (рис.6). Но ранее в нашей лаборатории

dP

т

i* о к

и «

V

2 8 12 16 20 24 28 32 36 40

40

30 20 10

Т—I—I—I—I—I—г

2 8

12 16 20 24 28 32 36 40 уровень гидролиза ЮГ (%)

Рис.6. Уровень гидролиза ЮГ у самок D. metanogaster из популяции Горно-Алтайск в нормальных условиях (верхняя гистограмма) и после теплового стресса (нижняя гистограмма), было показано, что для мух линии 147 D. virilis, также не реагирующих на стрессирующее воздействие, характерны пониженные жизнеспособность и плодовитость (Раушенбах, 1990). Чем же обусловлена такая высокая частота особей, неспособных к стрессорной реакции и, предположительно, отличающихся пониженной плодовитостью, в природных популяциях Drosophita? Видимо, они имеют какое-то преимущество в оставлении потомства в существующих природных условиях, которое и делает их конкурентоспособными.

Попытаемся рассмотреть, в чем может заключаться это преимущество. Так как известно, что ЮГ играет важную роль в размножении насекомых, контролируя рост превителлогениновых фолликулов и поглощение вителлогенинов ооцитами (Bownes, 1992), но в то же время показано, что у некоторых Díptera для завершения созрева-

0

ния яиц необходимо резкое снижение титра ЮГ (Shapiro et al.. 1996) и в яичниках Drosophila экспрессируется ген ЮГЭ (см. рис.2), мы предположили, что обнаруженное нами снижение ЮГ-гид-ролиэующей активности при стрессе у Drosophila должно сказываться на процессе откладки яиц - вызывать ее задержку.

Изучив влияние стресса на размножение самок линии дикого типа D. viriUs, мы обнаружили, что у молодых самок (рис. 7А)

дни после начала откладки яиц

Рис.7. Влияние стресса на плодовитость самок линии 101 Б. угггИг. А - стресс на первые сутки после начала откладки

яиц. Б - стресс через шесть суток после начала откладки яиц. Сплошная линия - контроль, штриховая - опыт, стрессирующее воздействие вызывает задержку начала откладки яиц на сутки с последующим снижением плодовитости в течение 7 дней.

У активно размножающихся самок (рис.7Б) стресс вызывает прекращение откладки яиц на двое суток и дальнейшее понижение плодо-. витости в течение нескольких дней.

Как показали измерения ЮГ-гидролизующей активности у активно размножающихся самок О.уггШв дикого типа (табл.1), продемонстрированное прекращение откладки яиц на двое суток совпадает со снижением активности ЮГЭ, что согласуется с нашим предположением относительно роли ЮГ в реакции системы размножения 0гоэорНг1а на стрессирующее воздействие.

Таблица 1. Активность ЮГЭГ и ЮГЭ у самок линии 101 В.уггШз через различные промежутки времени после стресса (стресс через 6 суток после начала откладки яиц).

Группа Активность (пмоль/мин/муху)

ЮГЭГ ЮГЭ

Контроль 7,7±0,2 25.7±0,6

Опыт (часы после стресса):

4 7,8±0,4 18,1±0.4

24 6.8*0,3 19.2*1.3

48 7,2±0,4 20,9±1,6

Аналогичные результаты мы получили и для самок линии дикого типа 0.теЬапоёазЬег: у молодых самок стресс вызывал суточную задержку начала откладки яиц, а у зрелых - прекращение откладки на два дня. В обоих случаях также наблдалось снижение плодовитости в течение нескольких дней после стресса.

Таким образом полученные данные подтвердили наше предположение о том. что снижение уровня гидролиза ЮГ при стрессе приводит к прекращению откладки яиц у ОговорМХа и последующему снижению плодовитости.

Но поскольку нам известно, что самки линии 147 й.НгШв не реагируют на стресс изменением уровня гидролиза ЮГ. то. в соответствии с нашей гипотезой, они не должны и реагировать на стресс прекращением откладки яиц. И. как видно на рис.8, стрес-сируюцее воздействие, действительно, не вызывает у особей этой линии никаких изменений в процессе размножения.

Ц 25

2

«3

t 15

25

о

5 1

ё 0.5

§

со

ст 0

1

дни после начала откладки яиц

Рис.8. Влияние стресса на плодовитость ' самок линии 147 Б. уггИхэ. Стресс через шесть суток после начала откладки яиц. Сплошная линия - контроль, штриховая - опыт.

Необходимо, тем не менее, заметить, что стрессирующие воздействия вызывают существенные изменения в гормональном балансе и общем метаболизме насекомых (обз.: СЪегпуБЬ, 1991; 1уапоу1с, 1991). В связи с этим нельзя было исключить, что обнаруженная нами задержка в откладке яиц у Drosoph.Ha может быть и не связана с системой метаболизма ЮГ. Для того, чтобы это выяснить наверняка, мы использовали специфический ингибитор ЮГЭ у ОговорЬИа. ОТФП. Изучив влияние аппликации ОТФП на характер размножения особей линии дикого типа Б. virilis мы обнаружили, что одноразовая аппликация ОТФП Б. уйчИз, как и тепловой стресс, вызывает задержку в откладке яиц (рис.9), что подтверждает наше представление о том, что именно система деградации ЮГ контролирует задержку откладки яиц при стрессе у этого вида. Двухразовая аппликация ОТФП увеличивает срок задержки в откладке яиц. Эта дозовая зависимость связана с увеличением времени инактивации ЮГЭ • при повторной аппликации. Мы также показали, что ОТФП не вызывает снижения плодовитости у О.те1апода$1ег, у которых основным ЮГ-гидролизующим ферментом является ЮГЭГ, которую ОТФП не ингибирует. Следовательно, действие ОТФП на плодовитость Б. угггНз специфично.

Еще одним подтверждением того, что именно уровень ЮГ-гидро-

ё

часы после начала откладки яиц

Рис.9. Влияние ОТФП на плодовитость самок линии 101 И. НгШв. Аппликация на первые сутки после начала откладки яиц. Сплошная линия - интактный контроль, штриховая - контроль (аппликация этанола), точечная - одноразовая аппликация ОТФП. штрихпунктирная - двухразовая аппликация ОТФП. лизующей активности ответственен за откладку яиц у дгозоркИа, является эксперимент с инъекцией ЮГЭ Н.уггезсепсе самкам линии 147 (рис.10). В норме особи этой линии начинают отк-

ладывать яйца на несколько суток позже, чем мухи дикого типа, поскольку активность ЮГЭ у них позже достигает уровня, необходимого для начала откладки яиц. Инъекция экзогенной ЮГЭ вызывает у них начало откладки яиц на три дня раньше, чем в контроле.

Таким образом мы установили, что неблагоприятные условия вызывают у имаго дрозофилы снижение активности ферментов деградации ЮГ у самок и, по-видимому, возрастание уровня ЮГ, И именно эта гормональная реакция на стрессирующее воздействие у имаго приводит к задержке откладки яиц, что способствует адаптации. позволяя популяции "переждать" неблагоприятные условия.

Но мы показали, что в природных популяциях 0.те1аги^с154ег с высокой частотой встречаются особи, неспособные реагировать на стрессирующие воздействия подобной гормональной реакцией (см. рис.6). Так как изученные популяции В. melanogaster происходят из промышленно развитых районов с высокой степенью антропогенного влияния, мы считаем, что повышенная частота мутантных осо-

дни после инъекции

Рис.10. Влияние инъекции ЮГЭ Н. мгеясепсе на плодовитость самок линии 147 й. уХгШв. бей является отражением существования популяции в условиях частых стрессирующих воздействий невысокой интенсивности. Именно в таких условиях особи, способные к стрессорной реакции, реагируют на стрессирующие условия задержкой в откладке яиц и таким образом "пережидают" неблагоприятный период, особи же, неспособные к этой реакции, продолжают размножаться с обычным для них невысоким уровнем плодовитости, приобретая, таким образом, преимущество в оставлении потомства, что и приводит, по всей видимости, к возрастанию частоты подобных особей в популяции.

ВЫВОДЫ.

1. Изучена система деградации ювенильногр гормона у ОгозорИтЛа теХапоёазЬег. Продемонстрировано, что в период куколочно-имагинапьного развития имеется два периода высокой ЮГ-гидролитической активности, обеспечивающихся разными ферментами: ЮГ-эстеразой в период метаморфоза, ЮГ-эстеразой и ЮГ-эпоксидгидразой у молодых самок и только ЮГ-эпоксидгидраэой у половозрелых самок. Показано, что у самок ЮГ-гидролитическая активность выше, чем у самцов.

2. Исследована реакция системы деградации ювенильного гормона на стрессирующее воздействие у имаго 0. теХаподазЬег.

Впервые установлено, что самки отвечают существенным снижением ЮГ-гидролитической активности на действие высокой температуры, тогда как у самцов подобная реакция отсутствует. Причем у молодых самок снижение гидролиза' гормона осуществляется за счет снижения активности как ЮГ-эпоксидгидразы. так и ЮГ-эстеразы, а у половозрелых самок - за счет снижения активности только ЮГ-эпоксидгидразы.

3. Впервые . проведен анализ генетического контроля активности ЮГ-эстеразы у D. melanogaster. Выяснено, что активность фермента в нормальных условиях и при стрессе контролируется различными генетическими элементами. Продемонстрировано, что ген (или группа генов), контролирующий(ие) активность ЮГ-эстеразы у D. metanogaster в нормальных условиях, относится ко второй группе сцепления.

4. Впервые показано, что природные популяции D.melanogaster полиморфны по уровню деградации ювенильного гормона в норме и по реакции системы деградации ювенильного гормона на стрессирующее воздействие.

5. Изучено влияние теплового . стресса на размножение Drosophila. Впервые установлено, что стрессирующее воздействие вызывает у молодых самок D. viritis и D. metanogaster суточную задержку начала откладки яиц, а у интенсивно размножающихся -прекращение откладки яиц на двое ■ суток, с последующим понижением плодовитости в течение нескольких дней.

6. Исследована роль системы деградации ювенильного гормона в размножении Drosophila в условиях стресса. Впервые показано, что именно изменения в уровне активности ферментов деградации ювенильного гормона вызывают задержку откладки яиц при стрессе у Drosophila.

7. Предложена гипотеза о роли системы деградации ювенильного гормона Drosophila в адаптации популяций к неблагоприятным условиям среды.

СПИСОК СТАТЕЙ.

1. Раушенбах И.Ю., Хлебодарова Т.М., Ченцова H.A.. Грунтенко Н. Е., Гренбек Л. Г.. Янцен Е.И., Филипенко М.Л. Генетический анализ различий в метаболизме ювенильного гормона у устойчивой и чувствительной к стрессу линий Drosophila virilis. // Генетика, 1995, 31. 193-200

2. Rauachenbach I. Y., Khlebodarova T.M., Cftentsova N.A.. Gruntenko N.E., Grenback L.G.. Yantsen E. I.. FillpenkoM.L., Metabolism of the juvenile hormone in Drosophila adults under normal conditions and heat stress. // J. Insect Physiol., 1995, 41, 179-189. -

3. Грунтенко H. E., Хлебодарова Т. M.. Гренбэк Л. Г., Захаров И.К., Раушенбах И.Ю. Полиморфизм природных популяций Drosophila melanogaster по уровню метаболизма ювенильного гормона и реакции.на тепловой стресс. // Генетика, 1995, 31, 201- 204.

4. Хлебодарова Т. М., Гренбэк Л. Г., Грунтенко Н, Б., Суханова М.Ж., Раушенбах И.Ю. Ферменты метаболизма ювенильного гормона в онтогенезе Drosophila virilis // Онтогенез.- 1996, 27, 126-130.

5. Грунтенко Н.Е.. Хлебодарова Т.М., Гренбэк Л.Г., Суханова М.1., Захаров И.К., Раушенбах И. Ю. Генетический контроль метаболизма ювенильного гормона у Drosophila melanogaster // Генетика. 1996, 32. 228-232.

6. Грунтенко Н.Е., Хлебодарова Т. М.. Мазуров М. М.. Гренбэк Л.Г.. Суханова М.Я., Шумная Л.В., Захаров И. К., Хэммок Б. Д., Раушенбах И.Ю. Роль метаболизма ювенильного гормона в адаптации популяций Drosophila к стрессирующим условиям среды // Генетика. 1996, 32, I l$i-{i3g_ . ... .

Подписано к пёчати 23.05.1996 г.

Формат бумаги 60x90 1/16. Печ. л. Уч.-изд. л.

Тираж 110 экз. Заказ 47

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН

630090, Новосибирск," проспект-академика Ы. А. Лаврентьева, 10.