Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Консервативные нуклеотидные последовательности ретропозонов Alu семейства: происхождение и роль в регуляции генной экспрессии

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Консервативные нуклеотидные последовательности ретропозонов Alu семейства: происхождение и роль в регуляции генной экспрессии"

На правах рукописи УДК 577.23+575.113

/

Казаков Василий Иванович

Консервативные нуклеотидные последовательности ретропозонов Alu семейства: происхождение и роль в регуляции генной экспрессии

03.00.25. - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Н. В. Томил и н Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. И. Воробьев Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор М. И. Мосевицкий Сан кт-Петербургс ки й институт ядерной физики РАН

Ведущее учреждение Научно-исследовательский

институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Защита состоится "/6"с(.<т года в / 3 часов

на заседании Диссертационного совета Д. 002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект дом 4.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан "¿£" <»_е <^.7 Хс Ь£,1998 года

Ученый секретарь Диссертационного совета1 доктор биологических наук Л. Н. Писарева

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Геном эукариот отличается от генома прокариот в первую очередь большими размерами и сложностью организации. Суммарное количество ДНК гаплоидного набора может быть измерено в пикограммах. Так в каждой диплоидной клетке человека содержится около 6 пикограммов ДНК, а общая длина гаплоидного набора оценивается в 3,5хЮчпар нуклеотидов (Као F.-Т., 1985). Размер генов прокариот составляет в среднем 3 - 4кб., следовательно, количества ДНК, содержащегося в гаплоидном наборе человека, вполне достаточно для кодирования по крайней мере миллиона генов. Однако, по многим независимым оценкам истинное число структурных генов человека лежит в пределах 50000 -100000, и, вероятнее всего, составляет около 80 000. Если сопоставить это значение со средними размерами гена и соотношением между размерами интронных и экзонных областей, получается, что кодирующие последовательности занимают не более 10 % всего генома (McKusick V. A., Ruddle F. H., 1977; Singer, 1982). Таким образом, основная часть молекулы ДНК человека, как и других эукариот, не несет информации об аминокислотной последовательности белков, не кодирует структуру различных типов РНК, а представляет собой некую "избыточную" ДНК, функции которой в значительной степени до сих пор не изучены, хотя ее структура выяснена достаточно подробно. В составе этой "избыточной" ДНК выделяют три фракции - высокоповторяющихся, умеренно повторяющихся, и уникальных последовательностей. Высокоповторяюшиеся последовательности многократно представлены в геноме (до 106 копий), в их состав входят 4 основные типа сателлитной ДНК, альфоидные повторы, мини- и микросателлнтные последовательности, инвертированные повторы. Группа умеренно повторяющихся последовательностей генома человека составляет около 20 % и представлена множеством классов гетерогенных по длине и числу копий (от 10 до 105) последовательностей. Подлине повторяющихся элементов последовательности этой группы принято делить на короткие (Sines), повторенные в геноме 105 раз и имеющие длину до 500 н.п. п более длинные (Line), повторенные в геноме не более чем 10 000 раз. Половина - (10% генома) всех умеренно повторяющихся последовательностей входит в состав двух основных семейств умеренных повторов - Alu и Kpn I. Уникальные не кодирующие последова-

тельности представлены псевдогенами, нитронами и регуля горными элементами генома. Относительно функции "избыточной" ДНК имеется ряд предположении. Она может участвовать в регуляции экспрессии генов и процессннге РНК, выполнять структурные функции, повышать точность рекомбинации, способствовать успешной репликации, накапливать в себе неизбежно возникающие в процессе фпло- и онтогенеза мутации, не имеющие фенотипическо-го проявления, иметь эволюционную значимость и так далее. Но все же, получается, что человек практически мало что знает о функциональной роли (или отсутствии таковой) 90 % , то есть, основной части собственного генома. Изучение этой части генома представляет большой теоретический и практический интерес, так как позволит понять механизмы эволюции и функционирования генома и может дать возможность влиять на работу генов, выявлять предрасположенность к различным наследственным патологиям, идентифицировать личность на генетическом уровне, устанавливать отцовство и тому подобное.

Данная работа посвящена изучению распределения, происхождения и роли в регуляции генной экспрессии самого многочисленного по числу копий семейства умеренно повторяющихся последовательностей генома человека - Alu-повторов.

Цели и задачи исследования. Цель работы заключалась в выяснении распределения Alu - повторов и их ориентации в индивидуальных хромосомах человека, получении экспериментального подтверждения гипотезы автора о происхождении Alu-повторов и выяснении возможной роли Alu-повторов в регуляции экспрессии белок кодирующих генов. Исходя из этого были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Выяснить распределение инвертированных Alu-повторов в индивидуальных хромосомах человека.

2 Показать наличие в геномах некоторых рыбообразных, рыб и беспозвоночных нуклеотидных последовательностей, гомологичных различным областям Alu-повторов человека.

3 Показать наличие в Alu-повторах различных регуляториых элементов, модулирующих экспрессию белок кодирующих генов.

4 Изучить инсерционно - делеционнын полиморфизм Alu-повтора в 16 интроне гена ангиотензин-1-конвертирующего фермента человека у жителей С.-Петербурга и Ленинградской области.

Научная новизна. Впервые показано распределение инвертированных Alu-повторов в 1, 3 и 13 хромосомах человека. На основе длины участков ДНК, фланкированных Alu-повторамн, получены фин-герпринты указанных хромосом и предложен метод идентификации человеческого материала в гибридных клетках. Показана возможность использования для физического картирования генома человека фланкированных Alu-повторами последовательностей, выделенных из пулов и индивидуальных клонов хромосомспецифическнх клонотек, созданных на основе фага к и космид, а также из изолированных хромосом. В составе внеклеточной ДНК крови женщин во время первого триместра беременности показано наличие фрагментов, фланкированных Alu-повторами, исчезающих во втором триместре. Обсуждена возможная роль описанных структур в онтогенезе. Впервые показано, что в геномах некоторых рыбообразных, рыб, моллюсков н иглокожих имеются структуры, подобные отдельным областям Alu-повторов человека. Выдвинута гипотеза происхождения Alu-повторов приматов путем "самосборки" из блоков, уже имеющихся в геномах более примитивных животных, то есть происхождения независимым путем от других гомологичных повторяющихся элементов генома приматов. Проведен сравнительный анализ частоты встречаемости сайтов связывания транскрипционных факторов (ССТФ) в человеческих промоторах, м-РНК и ре-тропозонах Alu семейства. Показано, что плотность этих сайтов значительно выше в промоторах и Alu-повторах, чем в м-РНК, и что Alu-повторы потенциально способны регулировать экспрессию белок кодирующих генов посредством модуляции транскрипции, осуществляемой при помощи РНК полимеразы И. Выяснено, что встречаемость Alu - повтора в 16 интроие гена анпютензнн-1-конвертирующего фермента у жителей С.-Петербурга и Ленинградской области соответствует таковой в европейских популяциях. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в работе результаты важны для понимания структуры, функционирования и эволюции повторяющихся элементов генома человека -Alu-повторов. В практическом отношении полученные результаты представляют интерес при проведении медико-генетического консультирования и преподавании этой дисциплины в медицинских институтах.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на первой (Переславль-Залесскин 1990), второй (Переславль-

Залесский 1991) всесоюзных и третьей (Черноголовка 1993) всероссийской конференциях по программе "Геном человека", первой европейской конференции "Организация генома человека" (Гейдельберг 1990), восьмой конференции Международного Общества Дифференцировки (ISD) (Хиросима 1994), пятом Всероссийском совещании по систематике, биологии и биотехнике разведения лососевых рыб (С.-Петербург 1994), четвертом европейском конгрессе по биологии клетки (Прага 1994), всероссийской конференции "Актуальные вопросы неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики" (Уфа 1998) и на совместном семинаре лаб. стабильности хромосом и клеточной инженерии, лаб. радиационной цитологии и лаб. биохимических основ репродукции клеток Института цитологии РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертация изложена на Л~Р страницах машинописного текста, иллюстративный материал содержит 15 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает/;^? наименований, из них MB на иностранном языке.

Материалы и методы исследований

В настоящей работе исследовалась тотальная ДНК, выделенная из различных тканей и органов многих организмов. В таблице 1 приведен список этих организмов и источник ДНК. ДНК, выделенная из перечисленных в таблице организмов, использовалась в качестве матрицы при проведении полнмеразной цепной реакции (ПЦР) и для проведения дот - гибридизации. Кроме того, в качестве матрицы при проведении ПЦР выступали: индивидуальные хромосомы человека, плазмида Pal I с клонированным в ней Alu-повтором MF семейства, препараты ДНК, выделенные из гетеро-миеломной клеточной линии "мышь - человек" (линия ГИГ), клеток HeLa, клонов дрожжей двух YAC - клонотек (ДКГЛ; Гришин и др., 1991) и ICRF (Anand et. al., 1990), внеклеточная ДНК беременных женщин. В качестве отрицательного контроля использовалась ДНК, выделенная из кишечной палочки (Escherichia coli). Для вспомога-

тельных пелен - плазмида pBR322, бактериофаги к, М13тр18 и <рХ 174.

Таблица 1

Русское название Латинское название Источник ДНК

Тип Моллюски (Mollusca)

тихоокеанская каллиста Callista brevisiphonata печень

глицемерис Glvcymens essoensis печень

мидия съедобная Mitilus ediilis печень

Тип Иглокожие (ЕсМпоскгпЫа)

дальневосточный тре- Stichopus japonicus половая железа

панг

морская звезда Asterias amurensis печеночный вырост

морской еж StronRylocentrotus intermedins семенники

Тип Хордовые (ОюпЫа), Подтип Позвоночные (УеНеЬга(а),

Класс Круглоротые (Cycf os tomata).

минога Lampetra fluviatilus печень

Класс Костные рыбы (СЫекЫЬуез)

атлантический лосось Salmo salar печень

кумжа Salmo trutta печень

радужная форель Salmo Rairdneri печень

гибрид лосося и форели S-salar x S.Rairdneri печень

гибрид лосося и кумжи Scalar x S.trutta печень

европейский хариус Thymallus thymallus печень

плотва Rutilus rutilus печень

язь Leuciscus idus печень

Класс Млекопитающие (Mammalia)

Человек разумный Homo sapiens кровь

Выделение ДНК. Несмотря на различные источники ДНК, метод ее выделения во всех случаях был одинаковый, а именно, фенольно-хлороформный с последующим осаждением 96% этиловым спиртом и троекратной промывкой 70% этиловым спиртом. После осаждения ДНК растворяется в трис-ЭДТА (ТЕ) буфере рН 7,4, содержащем 10 мМ трис-НС1 и I мМ ЭДТА. При необходимости препараты ДНК обрабатывались РНКазой для удаления РНК. Однако, РНК не мешает протеканию ПЦР, и, в большинстве случаев, обработка проб РНКазой не требуется. Этот метод выделения ДНК является общепринятым, широко используется многими исследователями и подробно изложен в известных руководствах, например, в книге Т. Маниатиса с соавторами. Собственно обработка материала фенолом, хлороформом и осаждение ДНК спиртом являются финальными стадиями ее выделения. Начальные же стадии ( гомогенизация

тканей и лизис клеток) значительно варьируют в зависимости от источника ДНК и особенностей строения надмембранного комплекса клеток представителей различных царств.

Синтез олигонуклеотидов. Все синтезы проводились твердофазным фосфиттриэфирным методом в р-цианоэтнльной модификации с использованием автоматического синтезатора "Gene assembler" фирмы Pharmacia. Основные стадии синтеза и предложенные нами его модификации описаны в разделе 3.2. диссертации. После завершения синтеза олигонуклеотид и низкомолекулярные продукты синтеза снимали с твердофазного носителя путем аммонолиза в течение 20 часов при температуре 50 °С в водяной бане, одновременно освобождаясь от блокирующих бензоильных и изобутирильных групп. По завершении аммонолиза производили гель фильтрацию на колонке NAP 25 (носитель сефадекс G25) фирмы Pharmacia против 0,5 мМ триэтиламмонийацетатного буфера рН 7,0. Выход и чистоту продукта оценивали по характеристике спектра поглощения ультрафиолетового света при рН 7,0 на двулучевом спектрофотометре фирмы Hitachi. От низкомолекулярных продуктов синтеза олиго-нуклеотиды очищали двухкратной анионообменной хроматографией на колонке MohoQ (фирма Pharmacia) на хроматографе высокого давления FPLC той же фирмы. Степень очистки определяли по данным электрофореза в 20 % ПААГ в денатурирующих условиях. Последовательности праймеров, использовавшихся в экспериментах, приведены в тексте диссертации.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР проводили на автоматических термоциклерах различных конструкций (фирмы Techne, ТТО "Ирлен" Гатчина, АОЗТ "БИС" Новосибирск). Все они имели водяное охлаждение. В зависимости от эксперимента варьировал объем реакционной смеси, количество матрицы, концентрация праймеров и MgC^. В процессе работы использовались различные препараты термофильной ДНК-полимеразы, выделенные из штаммов Thermus thermophilus, Thermus aquaticus, или Thermus sp. (как отечественного, так и импортного производства). В зависимости от имеющегося на момент проведения эксперимента в нашем распоряжении препарата фермента, подбирался тот или иной буфер для проведения реакции и, соответственно, варьировала температура элонгации (от 72 до 74 °С). В начале ПЦР реакционную смесь денатурировали при 93 °С в течении 3-5 минут и после этого про-

водили 30 - 35 циклов амплификации. Температура отжига прайме-ров подбиралась экспериментально для каждой пары праймеров или для одного праймера таким образом, чтобы при высоком выходе специфического продукта отсутствовали неспецифические фрагменты ДНК (или их выход был бы сведен к минимуму). При использовании в ПЦГ праймеров с "чужеродной" им матрицей (ираймеры гомологичны различным областям Alu-повтора человека, а в качестве матрицы выступает ДНК, выделенная из печени пли гонад других животных) температуру отжига оставляли как при использовании в качестве матрицы тотальной человеческой ДНК. Подробно условия ПЦР для каждого эксперимента обсуждаются в соответствующих разделах главы "Результаты и обсуждение". Продукты реакции анализировали в агарозном или полиакриламидном гелях.

Гибридизация ДНК с олигоиуклеотидиыми зоилами. Олигонукле-отидные зонды метили у32 Р АТФ при помощи Т4 полинуклеотид-киназы. От не включившихся трифосфатов освобождались, проводя гель фильтрацию на колонке NAP 25 фирмы Pharmacia. Тотальную ДНК иммобилизовывали на нейлоновой мембране Hybond-N фирмы Amersham. Гибридизацию проводили в течение 12 часов при 42 °С в растворе Денхардта. После окончания гибридизации иитроцеллго-лозную мембрану высушивали и экспонировали в кассете с рентгеновской пленкой.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Alu-повторы относятся к группе умеренно повторяющихся последовательностей генома человека и высших приматов и представлены в их геномах в количестве около 105 копий. Alu-повторы названы так потому, что несмотря на имеющиеся различия в нук-леотидной последовательности между членами семейства, все они имеют сайт рестрикции для рестриктазы Alu I. Длина Alu-повторов 300 п.п., хотя отдельные представители семейства Moiyr иметь и иную длину за счет вариабельных областей и вариаций длины входящих в состав повтора полиадешщовых участков. Собственно, Alu-повтор представляет из себя димер, состоящий из двух прямых повторов длиной 130 н.п., разделенных богатой аденином вставкой из 31 нуклеотида. Богатая аденином последовательность имеется и на 3' конце второго мономера. Оба мономера Alu-повтора гомологичны друг другу на 80 % . При этом в составе всего повтора мож-

no выделить 3 консервативные и 2 вариабельные области. Каждый Alu-повтор фланкирован прямыми повторами длиной от 7 до 20 н.п., различными для различных членов семейства и имеющими большую степень гомологии с аналогичными повторами транспозо-нов про- и эукариот.

Распределение Alu - повторов в хромосомах человека. Повторы Alu-семейства распределены по геному человека более или менее равномерно. Значительная часть их соседствует с уникальными кодирующими генами. Alu-повторы часто фланкируют их или присутствуют в интронах, однако встречаются и довольно протяженные Alu кластеры. Причем входящие в них Alu-повторы могут находится как и в одинаковой ориентации, так и быть инвертированными по отношению друг к другу. Так значительные по протяженности кластеры показаны в бандах 1р32-р35, Iq21-q25, 2q21-q24, 6р21, 6ql4-ql5, 10р13-р14, 10q21-q22 и llql4, Alu-повторы могут концентрироваться и в области центромеры. Интроны некоторых генов (например, гена протромбина) главным образом состоят из Alu-повторов с минимальной долей уникальной ДНК между ними, однако в геноме человека имеются и длинные области, (до нескольких мегабаз), вообще не содержащие Alu-повторов (Sainz et. al., 1992). Распределение Alu - повторов в индивидуальных хромосомах можно выяснить при помощи гибридизации in situ, а в диапазоне сотен кб. методом флюоресцентного мечения Alu - праймера и инициации им полимеразной реакции на тотальной ДНК человека в присутствии меченого биотином dUTP (Tomilin et. al., 1993). Однако, эти методы не дают информации о взаимной ориентации Alu-повторов, поэтому в нашей работе был применен метод ПЦР. В Alu-повторах имеются достаточно консервативные участки, на которые могут быть синтезированы олигонуклеотидные праймеры для ПЦР (см. рис.1). В случае использования для ПЦР лишь одного концевого праймера (3' или 5') амплифицируются уникальные фрагменты, расположенные между инвертированными копиями Alu-повторов (интер-А1и-фрагменты). 3' Alu-праймеры амплифицируют участки генома, фланкированные расходящимися Alu-повторами, 5' Alu праймеры, - сходящимися инвертированными Alu, а использование и З'-прямых и 5'-обратных праймеров в одной ПЦР позволяет амплифицировать последовательности, расположенные между и прямыми, и инвертированными Alu-повторами. В качестве матрицы

при проведении ПЦР использовались препараты индивидуальных хромосом человека, любезно предоставленные нам В.В.Зениным. При использовании одновременно двух праймеров Тс65 и В2 на электрофореграмме не наблюдалось дискретных полос, что говорит о значительном количестве Alu-повторов, присутствующих в индивидуальной хромосоме. При использовании одного праймера Тс65 или В2 после ПЦР получается около 20 мажорных уникальных фрагментов, расположенных между Alu-повторами, на одну среднюю хромосому человека (100 мб.). Обращает на себя внимание наличие идентичных по длине коротких фрагментов в продуктах ПЦР при использовании в качестве матрицы различных хромосом. Самый короткий из этих фрагментов (длиной около 100 п.н.) представляет собой, по-видимому, инвертированные расходящиеся Alu без уникального спенсера между ними, происхождение же других подобных фрагментов из разных хромосом неясно. Не исключено, что какие-то инвертированные Alu-повторы встроены в консервативный, присутствующий во многих хромосомах тандемный повтор, например в сателлитную ДНК. Таким образом нами получены Alu-фингерпринты различных хромосом человека (1, 3 и 13). Подобные Alu-фингрепринты могут быть применены для идентификации ДНК человека, например, в гибридных клеточных линиях с остаточными хромосомами человека. Так, нами была проанализирована одна гибридная линия человек-мышь (линия ГИГ)- По данным цитогене-тического анализа предполагалось, что клетки этой линии содержат фрагмент хромосомы 3 человека 3p21-ter. При проведении ПЦР с одним праймером С1 происходила амплификация дискретных ин-тер-А1и-фрагаентов, что подтверждает наличие в клетках ГИГ хромосомного материала человека. Амплификация ДНК клеток ГИГ происходила и при использовании менее "консервативного" праймера ТС65, гибридизующегося с более редкими Alu-повторами, отстоящими друг от друга в хромосоме человека в среднем на 500 кб. Мы сопоставили Alu-фингерпрннт очищенной хромосомы 3 с AIu-фингерпринтом указанного выше гибрида, а также других хромосом человека (13 и 1). Оказалось, что гибрид содержит фрагменты обоих плеч хромосомы 3 и, возможно других хромосом человека. Полученные результаты согласуются с цитогенетическнми данными о присутствии в клетках линии ГИГ короткого фрагмента р плеча 3-й хромосомы человека. Становится ясно, что предложенный метод ПЦР-анализа гибридных клеточных линий с использованием Alu-

праймеров вполне применим для идентификации человеческих хромосом или их фрагментов, входящих в состав гибридных клеток, и удачно дополняет данные цитогенетического анализа. Рисунок 1 Взаимное расположение А1и-праймеров и теоретически ожидаемые длины (в н.п.) продуктов ПЦР при использовании различных пар праймеров.

ПЦР-праймеры и зонды для повторов ДНК А1и-семейства

Физическое картирование хромосом человека с помощью Alu-

ПЦР. Необходимым этапом программ по полному секвенированию генома человека и идентификации основных генов является детальное картирование хромосом человека (с разрешением около 100 кб.) Один из подходов к составлению физической карты генома человека, предложенный Ольсоном и др. (Olson et al., 1989), предполагает составление такой карты на основе взаиморасположения так называемых sequence tagged sites (STS). Эти участки с известной последовательностью ДНК и хромосомной локализацией, равномерно покрывающие геном с интервалом 100 кб., позволят объединить уже имеющиеся разрозненные генетические и физические карты. Для этих целей существенным является требование уникальности STS, способ же их получения может быть любым. В частности, в качестве STS могут выступать уникальные фрагменты ДНК, локализованные между Alu-повторами. Как уже отмечалось, Alu-

повторы распределены по всему геному человека. Это дает возможность получения уникальных фрагментов ДНК, локализованных между Л1и-повторами после проведения ПЦР, при этом в качестве матрицы может выступать ДНК, выделенная из различных источников (из пулов и индивидуальных клонов хромосомспецифических клонотек, созданных на основе фага X и космидах, и из изолированных хромосом человека). Если учесть при этом, что концентрация Alu в некоторых районах генома человека может быть значительно (в 10 раз) больше средней (Filatov et al., 1987; Korenberg, Rykowsky, 1988), то становится ясным, что Alu-ПЦР может быть использована для получения STS даже из индивидуальных клонов геномных клонотек в фаге X, имеющих вставки 10-15 кб. В наших исследованиях продемонстрирована реальность такого подхода.

В нашем распоряжении была геномная клонотека, полученная Е.Р.Забаровским в векторе серии SK на основе ДНК гибридных клеток мышей, содержащих остаточную хромосому 3 человека, а также 50 индивидуальных клонов, содержащих вставки ДНК человека (отобранных по гибридизации с тотальной ДНК человека) из Notl-связуюшей клонотеки тех же гибридных клеток. Все это было любезно предоставлено нам Л.Л.Киселевым и Е.Р.Забаровским в рамках программы "Геном человека" для получения и анализа уникальных фрагментов хромосомы 3. В этих опытах использовался праймер ТС65, хорошо зарекомендовавший себя при работе с ДНК гибридных клеток и амплифицирующий участки между расходящимися Alu -повторами. Ясно, что на индивидуальных клонах со вставками порядка 10 кб. частота инициации синтеза ДНК с одиночным праймером может быть недостаточной, и поэтому в опытах с индивидуальными клонами Notl-связующей клонотеки мы использовали как одиночные праймеры, так и пары праймеров, комплементарные различным цепям Alu, т.е. инициирующие синтез в различных направлениях от Alu и способные амплифицировать фрагменты и между прямыми Alu-повторами, например, праймеры CI и В2 (см. рис.1). Почти все исследованные Notl-связуюшие клоны дают дискретные наборы фрагментов после ПЦР с указанными праймерами. Для подтверждения уникальности этих фрагментов мы использовали блот-гибридизацию по Саузерну с меченой Р32 Alu-пробой. Оказалось, что во многих клонах образующиеся ПЦР-фраг-менты гибридизуются с Alu, то есть не являются уникальными, хотя

среди них были и уникальные фрагменты, не гибридизующиеся с Alu. Эти результаты указывают, что при использовании Alu-ПЦР для получения STS фрагменты необходимо проверять на уникальность, даже если ПЦР делается с двумя различными праймерами. Мы также получили дискретные фрагменты после ПЦР с праимерами С1 и В2 при использовании в качестве матрицы космидных клонов 3 хромосомы, любезно предоставленные нам г-ном Yamakawa, и некоторые из них были идентифицированы как уникальные. Очевидно, что картина уникальных фрагментов из клонов, содержащих длинные вставки с Alu повторами (например, космидных или YAC-клонов), получаемая с помощью Alu-ПЦР, может быть способом идентификации этих клонов и установления их перекрывания.

При помощи праймера ТС65 нами обнаружены участки, фланкированные инвертированными Alu-повторами, и в составе внеклеточной ДНК плазмы крови беременных женщин, что само по себе не представляет особого интереса. Интересно, что такие, несомненно уникальные, структуры, обнаружены только в крови женщин I триместра беременности и исчезают во II триместре. В начале беременности наблюдается децидуализация эндометрия и рост плодного пузыря, т.е. процесс дифференцировки клеток слизистой матки и клеток трофобласта, и, вероятно, экскреция ими интер-А1и-фрагментов. С учетом роли Alu-повторов в регуляции генной экспрессии и рекомбинации можно предположить, что обнаруженные нами в крови беременных женщин интер-Alu-фрагменты могут выполнять какую-то регуляторную функцию на ранних сроках беременности.

Происхождение Alu-повторов. Большое значение имеет вопрос о происхождении и дальнейшей эволюции Alu-повторов, приведшей к накоплению огромного количества их копий у высших приматов. Уллу с соавторами (Ullu et. al. 1982) обнаружили выраженную гомологию между геном 7SL РНК человека и каждым из мономеров Alu-повтора. На основании этого они предположили, что ген 7SL РНК возник из Alu-повтора. Однако дальнейшее изучение генов 7SL РНК выявило их высокую консервативность у различных таксонов, поэтому тот же Уллу выдвинул новое предположение, что гены 7SL РНК являются эволюционными предшественниками Alu-повторов приматов. А с учетом выраженной гомологии генов 7SL

РНК, Alu-повторов приматов и BI повторов грызунов можно сделать еще ряд предположении. Например, предковои формой мог быть повтор BI, из которого в результате инсерции участка длиной 150 Ii.п. возникли гены 7SL РНК, а в результате дупликации Alu-повторы (Ullu et. al. 1982). lime через два года Уллу предполагает, что в качестве предковой формы мог выступать некий эволюционный предшественник генов 7SL РНК, который, с одной стороны, дал современные формы генов 7SL РНК архебактерий, беспозвоночных, амфибий и млекопитающих, а с другой, за счет делеции центральной части гена, повторы В1 а вследствие их последующей дупликации появились Alu-повторы (Ullu et. al. 1984). Очевидно, что можно предположить и другие возможные варианты эволюционных взаимоотношений для этой группы последовательностей ДНК. Alu-повторы на 60% гомологичны метиониновой т-РНК (Daniels and Deiniger 1985). Естественно можно предположить, что Alu-повторы произошли от гена метиониновой т-РНК, (Rogers 1985). Таким образом, все гипотезы о происхождении Alu-повторов основаны на том, что те или иные структуры геномов различных организмов имеют более или менее высокую гомологию с Alu-повторами. Автором выдвинута альтернативная гипотеза о независимом от других гомологичных структур происхождении Alu-повторов приматов в результате длительной эволюции Alu-подобных элементов более примитивных животных.

Все данные о присутствии в геномах различных эукариотиче-ских организмов повторяющихся последовательностей получены в результате изучения скорости ренатурации их ДНК или рестриктно-го анализа. Геномы позвоночных животных изучены значительно лучше, чем геномы остальных эукариот. Наряду с данными о кинетике ренатурации ДНК в базах данных нуклеотидных последовательностей имеется значительное количество сиквенсов различных компонентов генома. Однако сказанное относится скорее к амниотам, чем к анамниям. Поэтому, для проверки нашей гипотезы мы проанализировали геномы некоторых рыбообразных, рыб, моллюсков и иглокожих при помощи ПЦР и гибридизации с праймерами, гомологичными различным участкам Alu-повторов человека.

Alu-подобные элементы в геномах рыбообразных и рыб. Особи атлантического лосося Salmo salar, радужной форели Salmo gairdneri, гибридов S.salar х S.gairdneri и S.salar х S.trutta были лю-

безно предоставлены нам Лужскнм рыбоводным заводом. Остальные рыбообразные и рыбы (см. таблицу 1) были пойманы в 1995 году в бассейне р.Луга (Ленинградская обл.). В качестве гибриднза-ционных зондов и ПЦР-праймеров использовали олигонуклеотнды, гомологичные трем наиболее консервативным участкам Alu-повто-ра человека: А, В и С (см. рис.1). Представленные в таблице 2 результаты гибрцдизационных опытов показывают, что в ДНК исследованных лососевых, хариуса и миноги имеются участки, гомологичные всем трем консервативным районам Alu-повторов человека. В ДНК плотвы обнаружены участки, гомологичные А и С районам Alu-повторов человека, и не обнаружены участки, гомологичные В району. В ДНК язя, как и в отрицательном контроле (Escherihia coli, фаг Я ), не выявлено гомологии с Alu-повторами ДНК человека. Кроме того, поиск, произведенный нами в базах данных GenBank и EMBL, показал наличие в геномах многих семейств рыб последовательностей ДНК, гомологичных различным областям Alu-повторов человека. Это позволило предположить, что в геномах рыбообразных и рыб имеются структуры, подобные Alu-повторам приматов (но не сами полноразмерные Alu-повторы). Для проверки этого предположения проведена Г1ЦР с различными парами прай-меров - В1-С2; В1-А2 и А1-С2.

Таблица 2

Объект исследований Гибридизуемость ДНК с зоилами, гичиыми различным областям Alu ров человека гомоло-- повто-

А В С

Речная минога + + +

Атлантический лосось + + +

Кумжа + + +

Речная форель + + +

Гибрид S. salar х S. giardneri + + +

Гибрид S. salar х S. trutta +■ + +

Европейский хариус + +

Плотва + - +

Язь - - -

В случае использования пар праймеров В1-С2 и В|-Аг дискретные фрагменты ДНК при электрофоретическом разделении

продуктов ПЦР в ПААГ не обнаружены, при использовании пары праймеров А1-С2 длины фрагментов, были следующими: речная минога - менее 72 и 87 н.п.; атлантический лосось, кумжа, гибриды S.salar х S.gairdneri и S.salar х S.trutta - 87, 100 и 215 н.п.; радужная форель - 87 и 215 н.п.; европейский хариус и плотва - 87 н.п. Эти результаты позволяют говорить о том, что у изученных рыбообразных и рыб последовательности, гомологичные областям А и С Alu-повторов человека, сближены друг с другом, что характерно для структуры этих повторов. Последовательность же, гомологичная В области Alu-повторов человека, хотя и присутствует в геномах изученных рыбообразных и рыб, удалена от последовательностей, гомологичных областям А и С на значительное расстояние - более 2 кб., тогда как в Alu-повторах человека расстояние между В и С участками составляет около 300 п.н. Об удаленности В-подобной области свидетельствует тот факт, что при проведении ПЦР с парами праимеров В1-С2 и В1-А2 не были обнаружены дискретные фрагменты ДНК. Расстояния между А и С участками Alu-подобных элементов у разных видов рыб оказались различными. Интересно, что у радужной форели отсутствует фрагмент длиной 100 н.п., а у гибрида S.salar х S.gairdneri такой фрагмент имеется. Очевидно, эта особенность генома унаследована гибридом от лосося. Результаты компьютерного анализа, а также наши экспериментальные данные позволяют предположить, что в геномах рыбообразных и рыб уже сформировались Alu-подобные структуры сходные с 3' областью Alu-повторов приматов, где находятся сближенные А и С участки.

Alu-подобные элементы в геномах некоторых представителей беспозвоночных. Нами были исследованы геномы представителей двух высших типов беспозвоночных: Моллюсков и Иглокожих (см. таблицу 1). Указанные виды были собраны на литорали залива Петра Великого Японского моря. В качестве ПЦР-праймеров использовали те же пары олигонуклеотидов, что и при анализе геномов рыбообразных и рыб. Результаты ПЦР свидетельствуют, что в геномах всех изученных моллюсков имеются структуры, гомологичные всем трем консервативным областям Alu-повторов человека, однако эти области, очевидно, не входят в состав какого-нибудь одного повтора и, вероятнее всего, удалены друг от друга на значительное расстояние. Не исключено, что указанные структуры входят в состав различных повторяющихся элементов генома. Интересно, что в от-

личии от экспериментов с ДНК рыбообразных и рыб, дискретные фрагменты ДНК были получены при использовании всех трех пар праймеров. Размеры этих фрагментов приведены в таблице 3.

таблица 3

Источник Пара праймеров

ДНК а,-с2 в1-а1 в|-с2

тихоокеанская отсутствуют 120, 160 ii.ii. 46, 100, 140 ii.ii.

каллиста

глииемерис 84, 140 п.н. 120, 160 п.и. 46, 140 п.н.

мидия съедоб- 84 ii.ii. 120, 160 п.и. 46, 72, 100,.140, 280

ная п.н.

При использовании в качестве матрицы тотальной ДНК различных иглокожих после проведения ПЦР дискретные фрагменты наблюдались при использовании пар праймеров А1-С2 и В1-С2, но не пары праймеров В1-А2. Размеры фрагментов ДНК представлены в таблице 4.

таблица 4

Источник ДНК Пара праймеров

А,-С! В,-С2

трепанг 84 п.н., 140 п.н., 264 п.н. 140 п.н., 264 п.н.

морской еж 84 п.н., 140 п.н., 264 п.н. 140 п.н., 264 п.н.

морская звезда отсутствуют меньше 72 п.н.

ДНК моллюсков была получена от представителей одного класса - пластинчатожаберных или двустворчатых моллюсков (ЬатеШЬгапсЫа, или В1УаМа), а каждый представитель типа Иглокожих относится к разному классу. Этим, отчасти, можно объяснить существенные различия в строении геномов иглокожих. Очевидно, что в пределах таких крупных таксонов как класс могут наблюдаться значительные различия в строении и распределении повторяющихся элементов генома. При проведении ПЦР с парой праймеров В1-С2 среди синтезировавшихся фрагментов был и фрагмент длиной 264 н.п., что соответствует длине полноразмерного А1и-повтора, но утверждать на основании одного этого факта, что у иглокожих уже присутствуют А1и-повторы вряд ли возможно. Обращает на себя внимание факт отсутствия на электрофореграмме дискретных фрагментов после проведения ПЦР с парой праймеров В1-Л2. Если у иглокожих имеются Л1и-повторы, аналогичные таковым приматов, и работают пары праймеров В1-С2 и А1-С2, то работать должна и пара В|-Аг, что не соответствует экспериментальным

данным. Это можно объяснить тем, что блоки В-С и В-А локализованы в разных участках генома и эти участки еще не собраны в полноразмерный Alu-повтор или у иглокожих уже имеются структуры, аналогичные Alu-повтору, но нуклеотидная последовательность А области значительно отличается от таковой у приматов.

Alu-подобные элементы моллюсков более всего отличаются от Alu-повторов приматов. Это согласуется с филогенетическими данными. Моллюски являются нервичноротыми животными, которые дивергировали от вторичноротых еще на уровне первичных це-ломатических животных. Иглокожие дивергировали уже от общего древа вторичноротых и их Alu-подобные элементы более похожи на Alu-повторы приматов. Наибольшее сходство с Alu-повторами приматов описанные структуры имеют у миноговых и лососевых. Эти таксоны лежат на "магистральном" пути эволюции, приведшем к возникновению Tetrapoda. Ряд структурных особенностей их Alu-подобных элементов мог "сохраниться" в Alu-повторах человека. Таким образом, вполне вероятно, что Alu-повторы человека и других приматов сформировались в результате длительной эволюции Alu-подобных элементов. В то же время сами Alu-подобные элементы могут обладать транспозонной и рекомбиногенной природой и, на определенном этапе своего формирования, могли оказать влияние на темп и направление филогенетически значимых перестроек генома.

Роль Alu - повторов в регуляции генной экспрессии. Экспрессия эукариотических генов контролируется, главным образом, специфическими ДНК связывающимися белками (транскрипционными факторами) которые связываются с относительно короткими значащими последовательностями, локализованными как до, так и после последовательностей, кодирующих белки, а также внутри нитронов. Все эти регуляторные последовательности представляют собой сайты связывания транскрипционного фактора (ССТФ). Положение этого сайта внутри гена значительно влияет на эффективность транскрипции, однако многие сайты, находящиеся в противоположной ориентации, изменяют этот эффект. Для регуляции генной экспрессии очень важно присутствие этих сайтов и количество их копий внутри гена. Эти короткие последовательности встречаются и в транспозонах, способных к горизонтальному и вертикальному перемещению, и следовательно, наряду с мутагенезом велика их роль

в эволюции. Кроме того инсерцнонная инактивация гена трапспо-зонами - пример модуляции генной экспрессии. Так инсерция de novo члена молодого Alu (Sb2 подсемейство) во 2 экзон гена холи-нэстеразы была найдена у пациента с ахолинэстераземней (Mukatani et. al., 1991). Инактивация геиа Alu-повтором PV подсемейства показана в гене FIX (IX фактор свертывания крови). Инсерция произошла в 5 экзоне этого гена, что привело к наследованию гемофилии В в одной семье (Vidaud et. al., 1993). Инсерция Alu-повтора PV/HS-1 подсемейства в 7 экзон гена кальций зависимого рецептора (CaR) идентифицирована (Janicic et. al., 1995) в одной шотландской семье с семейной формой гипсркапьцемии и серьезным шперпаратиреозом новорожденных. У больных из этой семьи, из-за ассоциированного с Alu-инсерцией стоп кодона, С -терминальная часть белка оказалась делетнрованной. Одной из мутаций, произошедших в клетках зародышевого пути, в семействе, склонном к раку молочной железы, была мутация в гене BRCA2, обусловленная инсерцией Alu элемента в 22 экзон, что привело к возникновению альтернативного сплайсинга, в результате чего 22 экзон отсутствовал в зрелой м-РНК (Miki et. al., 1996). Ретропозо-ном Alu-семейства был обусловлен и один случаи нейрофибромато-за типа I. Инсерция повтора PV/HS-1 подсемейства в интрон гена NF-1 привела к изменению интрон-экзонной границы, и, как следствие, удалению при сплайсинге следующего за ним экзона. (Wallace et. al., 1991). Имеется и ряд других примеров. Ретропозоны Alu-семейства исключительны в этом плане так как, некоторые из них и в настоящий момент сохраняют ретропозонный потенциал. Даже не транслируемые Alu-повторы, в силу вышеизложенных фактов, активно влияют на экспрессию генов. Хорошо известны в плане модуляции генной экспрессии и Alu-повторы, транскрибируемые РНК-полимеразой III. Это эволюционно молодое семейство Alu-повторов фиксировалось в геноме человека в течении последних 10 ООО лет и отсутствует у высших приматов. Alu-повторы мо-iyr содержать м важные элементы промотора (главным образом .V-рсиюн) генов транскрибируемых РНК-полимеразой II .

Кроме иисерционной инактивации генов Alu-повторами существуют примеры модуляции генной экспрессии, демонстрирующие, что, по меньшей мере, некоторые из этих элементов содержат сигналы модуляции транскрипции до реинсерщш или приобретают их после таковой. Ретропозоны Alu-семейства исключительно силь-

но амплнфицировались в геноме приматов всего за 60 млн. лет, что в эволюционном плане является очень коротким сроком. Возникает вопрос почему распространение Alu-повторов в геномах приматов было столь успешно по сравнению с другими семействами мобильных диспергированных повторов, количество копий которых в геномах приматов не столь велико. Это различие трудно объяснить, принимая во внимание целиком нейтральные механизмы фиксации новых Alu-инсерцнй в популяции. Наличие же функций, связанных с нуклеотидной последовательностью Alu-повторов приводит к их селективной значимости.

Мы сравнили концентрации ССТФ для 10 известных факторов транскрипции в Alu-повторах, м-РНК, и промоторах (в основном генов второго класса). Последовательности Alu-повторов, использованные для анализа, были взяты наугад из различных регионов генома при анализе баз данных GenBank и ENTREZ при помощи программы DNASIS версии 6.0. Alu-повторы внутри длинных геномных последовательностей находили по их гомологии с кон-сенсуальной Alu-последовательностью. Большинство выделенных таким образом Alu-повторов относилось к главному Alu-подсе-мейству, фиксировавшемуся в геномах приматов более чем 20 миллионов лет назад (Batzer and Deininger, 1991). Последовательности 99 человеческих м-РНК были также наугад отобраны из базы данных GenBank, а последовательности 92 промоторов найдены в базе данных ENTREZ при ее сканировании с использованием кодового слова "человеческий промотор". Поиск ССТФ в отобранных нами последовательностях проводили, используя, возможности программы DNASIS находить любые сайты рестрикции.

В предварительных исследованиях мы проанализировали большое количество (около 100) различных известных консенсу-альных последовательностей ССТФ и обнаружили, что только некоторые из них содержатся в нашем наборе Alu-повторов. Некоторые ССТФ представлены в Alu-повторах, но в виде довольно коротких фрагментов консенсуальной последовательности (5 или менее н.п.). Такие ССТФ были исключены из дальнейшего анализа, так как создавали значительные помехи при интерпретации данных. В конечном итоге нами были выделены 10 ССТФ, представленных в Alu-повторах. Эти ССТФ и были использованы для компьютерно-

го анализа. Их консенсуальныс последовательности представлены в

таблице 5. Таблица 5.

Трапскршшион ный фактор Коисенсуальный сайт свазывания Транскрипцио нный фактор Консенсуальный сайт связывания

АР-2 СССМ^в ьш,и САССТС

сссстм АР-1 ТСАвТМА

5Р-1 сссвсс \IER-1 тссксмс

ЬуГ-1 УУТСССАСИ РРАИ АССТСА

САТА-З \VGATAR иигг ТСАвСТСА

Обозначен»! иуклеотидов в таблице 5. А - адении, Т - тамин, С - гуанин, С • цитозин, 8 - шггознн или гуанин, М - адеиии или иитозин, \У - аденин пли тамин, У - тамин или цитозин, И - аденин или гуанин, N - любой нуклсотил.

Концентрация ССТФ во всех последовательностях была выражена как число сайтов на килобазу. В сравнительном плане была рассчитана плотность для случайной последовательности нуклеотидов. На рисунке 2 показана гистограмма, отражающая распределение ССТФ в А1и-повторах (верхняя часть гистограммы) и в м-РНК (нижняя часть ) гистограммы. Видно, что гистограмма довольно симметрична и большинство м-РНК имеют низкую плотность ССТФ/кб. Значительным является и различие в средней плотности ССТФ. Она выше в А1и-повторах, чем в м-РНК.

Если проанализировать не все, а только самые распространенные транскрипционные факторы, то полученный результат будет таким же, как и при использовании полного набора факторов, представленного в таблице 5, а именно: концентрация ССТФ статистически достоверно выше в А1и-повторах, чем в м-РНК. Далее было проведено сравнение концентрации ССТФ в А1и-повторах и в промоторах. Результаты представлены а рисунке 3 в виде гистограммы. Средняя плотность ССТФ/кб. значимо не отличается в А1и-повторах и промоторах, но распределение ССТФ в промоторах очень асимметрично и является мультимодальным с усредненными значениями модальных классов, равными приблизительно 10, 20, 27 и 35 ССТФ/кб. Медиана первой моды приближается к средней величине ССТФ/кб. для м-РНК, но статистическое сравнение полного мультимодального распределения ССТФ в промоторах и м-РНК показало увеличение концентрации ССТФ в промоторах как по сравнению с м-РНК, так и по сравнению с консенсуальной последовательностью А1и-повторов. Однако, человеческие промоторы очень

Рисунок 2 Рисунок

Кошчссто ССТФ на кн тоачу Ко.иркчпно ССТФ |ы ыио(>а)у

летерогенны и по содержанию ССТФ их можно разделить на несколько классов. Как известно, промоторы позвоночных гетероген-ны и по содержанию СрО островков. Промоторы одного класса генов тканеспецифических белков относительно богаты СрО островками, в то время как другой класс имеет плотность Срв островков, соответствующую таковой для случайной ДНК с 50 % содержанием вС-пар (60 Срв/кб.). Плотность СрО островков может коррелировать или не коррелировать с содержанием ОС-пар. Поэтому была исследована плотность Срв островков и содержание ОС-пар в отобранных нами последовательностях А1и-повторов и промоторов. Как и предполагалось, многие промоторы имеют высокую корреляцию между плотностью Срв островков и содержанием ОС-пар, хотя выделяется группа промоторов, плотность Срв островков в которой всегда низка, независимо от содержания ОС-пар. Большинство А1и-повторов содержат более 54 % СС-пар и являются довольно гомогенными по содержанию Срв островков (средняя плотность меньше 30 СрО/кб.), которая никак не коррелирует с содержанием в них ССТФ. Промоторы являются очень вариабельными по содержанию Срв островков, но их плотность хорошо коррелирует с содержанием ССТФ. Подгруппа СрС-бедных промоторов, характеризующаяся также низкой плотностью ССТФ, представлена промоторами генов, кодирующих тканеспецифические белки и независимых от факторов транскрипции, использованных в настоящей работе.

Подгруппа CpG-богатых промоторов, представленная промоторами генов "домашнего хозяйства" (housekeeping), и некоторыми промоторами генов, кодирующих тканеспецифнческие белки, имела высокую плотность ССТФ. Это говорит о том, что использованные нам» последовательности ССТФ являются информативными для довольно большой группы промоторов. Третья подгруппа промоторов характеризуется умеренным содержанием CpG островков и ССТФ. Промоторы этой группы по содержанию указанных элементов похожи на Alu-повторы и могут быть выделены в подгруппу Alu -подобных промоторов, и эта подгруппа так же хорошо, как и собственно Alu-повторы, отличается от выбранного пула м-РНК по плотности ССТФ, если учесть, что концентрация 15-25 ССТФ/кб. является еще информативной для последовательностей промоторов. В результате проведенного анализа установлено, что Alu-повторы основного (мажорного) класса по содержанию CpG островков и ССТФ сходны с одной из подгрупп человеческих промоторов.

Плотность ССТФ в консенсуалыюй последовательности Alu-повторов (20 ССТФ/кб.) выше, чем в фиксированных геномных Alu-повторах (16 ССТФ/кб.). Это говорит о том, что у Alu-повто-ров, дивергировавших от консенсуалыюй последовательности, потенциал модуляции транскрипции после инсерции и фиксации в геноме в основном снижается. Однако многие Alu-повторы имеют плотность ССТФ больше, чем 20/кб., следовательно, дивергенция Alu может сопровождаться увеличением плотности ССТФ, и, как следствие, увеличением потенциала модуляции транскрипции. Тот факт, что большинство Alu-повторов в соматических клетках метилированы и связываются с белками, чувствительными к CpG-ост-ровкам (Tomilin et. al., 1992) не обязательно вредит их возможным энхансерным функциям, так же как наличие сильного энхансера транскрипции элиминирует ингибирование CpG-бедных промоторов вследствие их метилирования. С другой стороны, инсерция энхан-серного элемента Alu-повтора в промотор, имеющий низкую плотность ССТФ, может повлиять на тканеспецнфичность экспрессии гена. В этой связи открывается интригующая возможность идентифицировать модуляцию генной экспрессии у людей, вызванную интродукцией Alu-повторов PV-подсемейства - одного из подсемейств Alu-повторов, специфических для человека и распространившихся в человеческих популяциях уже после дивергенции архантропов и

человекообразных обезьян. Не исключено, что именно модуляция экспрессии генов, специфических для периной ткани, Alu-повторами этою подсемейства, могла быть одной из причин возникновения разумности у архаптропов.

Не менее интересны и Alu-повторы, вызывающие, в силу своей способности модулировать экспрессию генов, фенотипические изменения, связанные с различными патологиями, так как изучение их ннсерционно-делеционного полиморфизма может привести к ранней диагностике различных заболеваний пли выявлению предрасположенности к ним у различных групп населения. Наличие ннсерционно-делеционного полиморфизма Alu-повторов можно выявить с помощью ПЦР. Если Alu-повтор локализован в интроне, то в качестве праймеров используются олигануклеотиды, гомологичные фланкирующим ннтрон последовательностям экзонов. В результате электрофоретического разделения продуктов ПЦР в ПААГ должны наблюдаться фрагменты ДНК ожидаемой длины. В случае наличия Alu-повтора в интроне фрагмент ДНК будет длиннее теоретически рассчитанного приблизительно на 300 пар нуклеотидов (длина Alu-повтора). Таким образом на электрофореграмме возможны три варианта: а) один фрагмент расчетной длины - делеци-онная гомозигота (DD) Ь) один фрагмент длиннее расчетного на 300 пар нуклеотидов - инсерционная гомозигота (II) и два фрашен-та - гетерозигота (ID). Так наличие Alu-повтора длиной 287 н.п. в 16 ингроне обоих аллелей гена анпютензин-1-конвертируюшего фермента (АСЕ) в некоторых европейских и японских популяциях приводит к уменьшенному риску инфаркта миокарда. АСЕ преобразует в значительной степени бездействующий декапептид ангио-тензин I в активный октапеитид ангнотензин II - ключевой компонент ренин-ангиотензииовой системы. Ген АСЕ имеет длину 21 кб. и состоит из 26 экзонов. Уровень АСЕ в крови уменьшен у I I и повышен у DD. DD генотип коррелирует с повышенной тяжестью течения болезни у пациентов с IgA нефропатией (Harden et. al., 1995), развитием ишемнческой болезни сердца и инфаркта миокарда (Margaglione et. al., 1996), а у мальчиков школьного возраста с левосторонней вентрикулярной гипертрофией (Е.И.Шварц и др., 1997). Подобные работы в настоящее время ведутся и в нашей лаборатории. Паши данные свидетельствуют о том, что частоты I и D аллелей в нашей популяции соответствуют таковым в европейских

популяциях, что весьма важно, так как при меднко-генетическом консультировании врачи генетики могут пользоваться литературным данными для европейских популяций.

Изучение ретроиозонов имеет как теоретическое (строение генома, вопросы эволюции), так п практическое (некоторые наследственные заболевания и предрасположенность к ним) значение. Хочется верить, что настоящая работа вносит крохотный вклад в исследование ретропозонов Alu семейства человека.

Выводы

1. В ретропозонах Alu семейства выявлены консервативные участки для синтеза праймеров, с помощью которых можно ампли-фицировать любые уникальные фрагменты ДНК человека, фланкированных Alu-повторами (интер-А1и-ПЦР).

2. Показано, что указанный метод амплификации применим для идентификации хромосомного материала человека в гибридных клетках, фингерпрннтирования индивидуальных хромосом и YAC клонов человека и для получения STS клонов.

3. С помощью интер-А1и-ПЦР в плазме крови женщин I триместра беременности обнаружены специфические фрагменты ДНК, исчезающие во II триместре.

4. В геномах некоторых рыбообразных, рыб, моллюсков и иглокожих имеются структуры, подобные отдельным областям А1и-иовторов человека.

5. С помощью компьютерного анализа показано, что встречаемость консенсуальных сайтов для некоторых транскрипционных факторов в ретропозонах Alu семейства выше чем в зрелой м-РНК.

6. Выяснено, что встречаемость Alu-повтора в 16 интроне гена ангиотензин-1-конвертирующего фермента у жителей С.-Петербурга и Ленинградской области соответствует таковой в европейских популяциях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Катакоп В.И., Константинов В.В., Божков В.М. Синто олитнуклсо гидов с исшшьчоваиисм отечественных растворителей // Бюллетень ВНИИРГЖ Ленинград 1988. №102. С. 12-17.

2. Томшнш Н.В., Божков В.М., Светлова М.П., Катков В.И., Филатов Л.В., Ермилов А.Н. Иснолыопанмс метода нолимерашой псиной реакции для фичн-ческош картирования гепома человека. //То.докл. и сообш. 1 Bcceoionioii конференции "Геном человека". Переелавль-Залееский. 8-12 октября 1990.

С.32.

3. Tomilin N V., Bozhkov V.M., Svctlova M.P.. Ka/akov V.I.. FilaU>v I..V.. Distribution of the Alu family DNA repeals in human genome and ¡solatium of chromosome specific probes using Alii-Alu PCR // Genome analysis from sequence to human DNA Heidelberg. 10-12 December I WO. P.28.

4. "Гомилии H.B., Божкон В.M., Светлова M.П., Кашкон В.И., Кругшшми Р.И. Получение ¡ондов к уникальным последовательностям ДНК хромосомы III человека с помощью ПЦР с Alu праймерами // Тсч. докл. к сообт. 2 Всесоюзной конференции "Геном человека". Псреслаиль-Залесский, 8-12 октября 1991. С.58-59.

5. Кашкон В.И., Бойко В.П., Горашш К.В., Зспии В.В., Аксенов Н.Д., Шатрова А.Н., Божков В.М., Томилии Н.В. Амплификация с помощью Alu-ПЦР последовательностей ДНК, экспресснруемых н клетках человека // Тет .докл. и сообт. 3 Всероссийской конференции "Геном человека". Черноголовка, 10-12 марта 1993. С.24.

6. Кашков В.И., Бойко В.П., Горашш К.В., Зсшш В.В., Аксенов Н.Д., Божков

B.М., Томилии Н.В. Получение хромосомстлшфичсских 1Штер-А1и-фригментов ДНК человека // То.докл. и сообш. 3 Всероссийской конференции "Геном человека". Черноголовка, 10-12 марта 1993. С.42.

7. Светлова МП., Тимченко Д.И., Кашков В.И., Божком В.М., Томилии Н.В. Набор олигонуклеотидных ПЦР-ираймеров на уникальные последовательное! и хромосомы III человека и ею характеристика // Тсч. докл. и сообш. 3 Всероссийской конференции "Геном человека". Черноголовка, 10-12 марта 1993.

C. 165.

8. Аиацкий С.Ю., Казаков В.И., Божков В.М. Структура повторяющихся последовательностей ДНК у лососевых рыб // Материалы 5 Всероссийской) совещания "Систематика, биология и биотехника разведения лососевых рыб". Санкт-Петер-бург, 1994. С. 5-8.

9. V.Kazakov, V.Bozkov, V.Lindc and V.Mikhailov. Extracellular DNA in sera pregnant women. //Cell Biology Intrenational 1994 Vol.18 №.5 P.527.

10. Mikhailov V., Stein G., Kazakov V. and Bozkov V. Programmed Death of Decidual Cells. Cytochemical Events of Formation of Apoptosis.// The Eighth International Conference of the International Society of Differentiation Hiroshima, 22-26 October 1994. P.240.

11. Кашков В.И., Божков В.M., Линде В.А.. Ренина М.А., Михайлов В.М. Висклеючиая ДНК в крови беременных женщин. // Цитология 1995 Т. 37 №3 С.232-236.

12. Светлова М.П., Кашков В.И., Тимченко Д.И., Коршунова Ю.О., Божков

B.М., Томилии Н.В. // Физическое картирование хромосом человека. Использование полимеразнои цепной реакции па уникальных последовательностях ДНК с ишеечной локализацией в хромосоме 3. // Цигология 1995 Т. 37 N"8

C.813-Х19.

13. V.Kazakov and N.Tomilin. Increased concentrations of some transcription factor binding sites in human réimposons of the Alu family. // Genetiea 1996 №97 P. 15-22.

14. Каюков В.И.. Светлова М.П.. Бойко В.П.. Крушлнпа Р.И., Зснин В.В.. Аксенов И.Д.. Шатрова Л.И., Божков В.М.. Томилин II.В. // Фишчсскос кар-тиропапис хромосом человека. Получение уникальных хромосомснсцифичс-еких фрагментон ДИК с помощью нолимерашой псиной реакции с олшонук-лсошдпыми праймерами па конссрват ивные участки Л1и-повторов. // Цитология 1996 Т.38 № 4/5 С. 510-516.

15. Анацкии С.Ю.. Катаков В.И., Божкон В.М. Структура А1и-нодобных пук-леотидных последовательностей ДНК у рыбообразных и рыб. // Цитологии 1996 Т.38 №12 С. 1255-1260.

16. Аксенов Н.Л., Кашков В.И. Исследование молнморфитми А1и-новтора в 1спе X сцсплепной умственной отсталости (FMR1) человека в нормальной популяции жителей Санкт-Петербурга // Тсчисы всероссийской конференции "Актуальные вопросы неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики". Уфа. 30 июня - 3 июля 1998. С. 11-12.