Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюция коротких ретропозонов В2-суперсемейства и использование их для определения филогенетических связей у грызунов

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Эволюция коротких ретропозонов В2-суперсемейства и использование их для определения филогенетических связей у грызунов"

р. о

1"'. и

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

На правах рукописи

УДК 575 :599.74

СЕРДОБОВА Ирина Михайловна

ЭВОЛЮЦИЯ КОРОТКИХ РЕТРОПОЗОНОВ В2-СУПЕРСЕМЕЙСТВА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИХ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ У ГРЫЗУНОВ

(Специальность 03 00 26 — молекулярная генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 199^

Работа выполнена в лаборатории Молекулярных основ развития и старения Института Биологии Гена РАН.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАН Г. П. Георгиев доктор биологических наук, профессор Д. А. Крамеров

доктор биологических наук, А. П. Рысков

кандидат биологических наук, Н. В. Любомирская

Ведущая организация — Институт Молекулярной Генетики РАН.

Защита диссертации состоится « 1994 г.

в Ю час. СЮ мин, на заседании Специализированного совета Д 200.30.01 при Институте Биологии Гена РАН, 117334 Москва, ул. Вавилова 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Биологии Гена РАН.

Автореферат разослан « о<<Ь » цСЖЛАх^СМЖ^-Н - 1994 г

Ученый секретарь .

Специализированного Совета, —1-1

кандидат фарм. наук <3 О £¿3 сУ^С^С* Л. С. Грабовская

/ ^

Актуальность проблемы. Ретропозоны - это повторявшиеся последовательности генома, амплификация которых происходит путем обратной транскрипции. Существует несколько классов этих генетических элементов. Один из таких классов составляют короткие ретропозоны: Alu-элемент (приматыI. В1-элемент (грызуны!, С-повтор (кролик), В2-элемент (мышь, крыса, хомячок), псевдогены низкомолекулярных РНК и многие другие.

Есть все основания считать, что возникнув и распространившись по геному, ретропозон продолжает сохраняться в генетическом аппарате на протяжении очень больших исторических периодов, передаваясь в эволюции от видов-предшественников к видам-потомкам. Основываясь на этом, было предположено, что выявление копия одинаковых ретропоэонов в геномной ДНК путем гибридизации может стать новым подходом для выяснения филогенетических связей. С высокой долей уверенности можно говорить о том, что виды (или группы видов), несущие в геноме ретропозон одного типа, разошлись между собой позже, нежели от них отделились виды, необлалаюиие этим ретропозоном. Филогенетические связи многих из семейств грызунов остаются неясными. Еще в прошлом веке все семейства грызунов были объединены в три подотряда (мышеподобные, белкополобные, дикобразоподобные). Однако многие Исследователи считает такое об&единение во многом искусственный. В связи со сказанным было важно и интересно более подробно исследовать наличие В2-элемента и его гомологов у различных грызунов с целью выяснения, насколько данные по распределению ретропоэона в отряде грызунов сопоставимы с общепринятыми таксономическими представлениями. Поэтому актуальными представляются исследования структуры различных родственных ретропоэонов в пределах такого обширного отряда, каким являются грызуны.

Цель и задачи исследования. У данной работы имелись две основные цели. Первая состояла в разработке и апробации метода использования коротких ретропоэонов для получения информации' о филогенезе изучаемых видов животных. Для достижения этой цели необходимо было отработать условия гибридизации и полимераэной цепной реакции, позволяющие отличать данный вид ретропозона от родственных видов. Следуюпей задачей было использование этого подхода для изучения распространенности ретропоэонов В2 и DIP среди грызунов разных семейств. Это позволило сделать ряд

заключений о филогенезе некоторых из этих семейств. Вторая цель работы состояла в выделении новых В2-подобных ретропоэонов и сопоставление их структур, что могло пролить свет на процессы возникновения, амплификации и эволюции таких генетических элементов.

Научная новизна. В работе- предложен и апробирован новыя подход к получению информации о филогенезе таксонов ранга семейств. Метод основан на изучении распределения у видов животных коротких ретропоэонов с помощьс дот-гибридизации и полииерааноя цепноя реакции. Показано филогенетическое родство таких семейств грызунов как MurIdas Iмышиные), Crecetldae (хомячки), Spal&cldae (слепыши). Подтверждено родство семейств грызунов семейств Dlpodldae (тушканчики) и Zapodldae (мыоовки). Получены аргументы в пользу более ранней дивергенции Gllrldae (сони) от общего ствола по сравнению с перечисленными выше семействами. Клонированы и изучены два новых В2-подобных рвтропозона. Один. DIP. характерен для геномов тушканчиков и мышовок, другой, MEN, выявлен пока только в геноме белки Бермоудра. Продемонстрирована необычность структуры элемента MEN: он состоит из двух мономеров, один из которых имеет родство с В2, а другой - с В1 ретропозоном. Проведено сравнение структур ретропоэонов В2, DIP, MEN и псевдогенов 4.5S1 РНК. Выявлено два консервативных района, один из которых расположен в начале каждого из элементов. Полученные результаты позволяют предположить, что все эти ретропоэоны произошли из обшей предковоя последовательности.

Научно-практическая значимость результатов. Предложенный в работе метод может быть использован для получения данных о филогенетической близости организмов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлен ы на конференции "Приоритетные направления генетики"/ Москва.1993/, на семинаре курсов ЕМВО -DNA sequencing" / Heidelberg,1993/.

Публикации. По теме работы имеются четыре публикации.

Объем работы. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение,

выводы. Работа изложена на 91 странице содержит 2 таблицы и 17 рисунков.

КАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Молекулярно-Сиологические процедуры осуществляли согласно стандартным методикам (Sambrook, 19Ô9). Для проведения дот-гибридизации на фильтр (Hytond, "Amersham"> наносили по 1 мкг. геномной ДНК животных. Гибридизацию осуществляли в растворе, содержащем 4xSSC при 65°С. Фильтр отмывали в растворе O.lxSSC/ 0,1% 5DS при 42, 32и 5ffC. Для детекции ретропозона В2 с помощью ПЦР использовали праямеры соответствующие участку с 1 по 18 нуклеотид (праямер 1 :GGGCCTCGAGAGATGGCT) и участку с 79 по 96 нуклеотид (праямер 2:CGTTGTGACCCACCATCT>. Обгем реакционной смеси был 30 мкл. Прозодился следующий цикл ПЦР: 95°С, 1 мин.; 35°С, 1 мин.; 72°С, 1 мин. После 25 циклов 10 мкл. реакционной смеси анализировали в агарозноы геле. Для детекции ретропозона DIP с помошьо ПЦР использовали праямеры, соответсвувшие началу ретропозона (праямер 1 - тот жэ, что и для В2I и участку с 109 по 126 нуклеотид (праямер 3: ACGAACTCCAGATGCATG). ПЦР осуществляли при тех же условиях, которые использовались для В2, за тем исключением, что стадия отжига праимеров проводилась при 33°С. Меченные a-tsaPl специфические зонды В2, В1 и DIP для дот- и блот-гибридиэации синтезировали с помошьо ПЦР; в качестве матрицы использовали амплифииированные тем жа методом и очищенные электрофорезом В2-последовательности генома домовой мыши и DIP-последовательности генома тушканчика Лихтенштейна, Секвенирование проводилось по методу Секгера. Сравнение последовательностей велось с использованием программ СепЪее, Mlcrogene, DNA SUN.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ЧАСТЬ ПЕРВАЯ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОРОТКИХ ДИСПЕРГИРОВАННЫХ ПОВТОРОВ (SINEe) ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ОбИНОСТИ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ВИДОВ ГРЫЗУНОВ.

1. Выявление гетерогенности распространения В2-подобных элементов у грызунов.

В первых экспериментах тестировались ДНК представителей следующих видов грызунов: Alactagulue pygmaeos (Тарбаганчик или земляной заяц), Allactodlpus bobrlnskll (Тушканчик Бобринского), Erenodlpua llchtenstelnl (Тушканчик Лихтенштейна), Dryomys nltedula (Соня лесная), Menetus terdnorel (белка Бердмоура), Cavia porcellus (Морская свинка), Mos euscuIus (домовая мышь). Apodesus peninsula (азиатская мышь), Rattus norveglcus (серая крыса), Elloblus tañere1 (Слепушонка восточная), Homo sapiens (Человек разумный).

В качестве зонда использовали вставку из мышиного клона В2мм14, меченную с помощьо ник-трансляции. ДНК предварительно не обрабатывали рестриктазами. Человеческая ДНК использовалась как отрицательный контроль, так как в геноме человека нет В2-подобных ретропозонов. Мышиная ДНК являлась положительным контролем. Результаты Саузерн-гибридиэации представлены в таблиие1.

ТАБЛИЦА 1

отмывка 42"С отмывка 92°С

Мышь домовая Азиатская мышь Крыса серая Слепушонка восточная Тушканчик Лихтенштейна Тушканчик Бобринского Тушканчик Тарбаганчик (или земляной заяц) Белка Бердмоура Соня лесная Морская свинка Человек разумник

Исходя из результатов, можно было заключить, что В2-подобные повторы присутствуй!' не у всех семейств грызунов. Повтори В2, как

♦♦♦ ++ ++♦ + *

Ч

и следовало предполагать, присутствуют у всех мышиных и хомячьих. В геномах всех ■ тестируемых представителей тушканчиков имеется повторяющаяся последовательность, умеренно гомологичная мышиным В2-элементам,и отсутствует у сонь. Повторяющаяся последовательность в геноме белки, видимо, имеет лишь очень незначительную гомологию с В2-элементом. В2-подобный элемент в геноме морской свинки отсутствует.

2. Клонирование и секвенирование повторяющегося элемента, гомологичного В2-ретровозону мыши, из генома тувканчика. Чтобы выяснить степень отличия В2-подобноя последовательности тушканчиков от собственно В2-повтора мышеподобных было произведено секвенирование генетического элемента тушканчика Бобринского (2 копии) и тушканчика Лихтенштейна И копия). После сравнения последовательностей между собой стало ясно, что они принадлежат к одному виду повторов и обладают общими чертами: протяженность приблизительно 220 нуклеотидов, два консервативных бокса промотора РНК полиыераэыШ (А и В), ТС-мотив, АТ-богатыи район. О том, что эти генетические элементы принадлежат к типу ретропозонов свидетельствуют как наличие промоторных областей и А-богатыя район на 3'конце, так и фланкирующих прямых повторов, возникновение которых, как правило, сопутствует интеграции элемента в хромосому. У всех трех секвенированных копий элемента есть сигналы полиаденилирования (ААТААА). Первые 30 пар основания, описанного элемента генома тушканчиков, обладают практически ЮОХ гомологией С В2-элементом мыши. Умеренная гомология имеется и в некоторых других участках.

Все вышеизложенные наблюдения позволили сделать заключение, что найденный элемент является новым ретропозоном В2 суперсемеясгва. Он был назван DIP. (от Dlpodldae - тушканчики). Консенсус для DIP-элемента приведен на Рис. 1. Обнаружение В2-элемента у тушканчиков и отсутствие такового у сони послужило указанием на более Слизкое филогенетическое родство семейств мышей и хомяков с тушканчиками нежели с сонями. Такое заключение основывается на предположении о том, что существовала нуклеотидная последовательность, послужившая предшественником для В2 и DIP, и возникла она уже после отделения сонь. Описанный подход к изучению филогенетических свяэзя требует более строгого доказательства некоторых Фактов и предположения. Поэтому был проведен анализ ДНК на содержание элемента В2 с помощью ПОР. Вместе с этим, был

s

CCCCTGGAGAGATCCCTTAGCGGTTAACNCACTTCCCTGTGAACCCTAAC 1

GATCCCGGTTCC—AGGCTCNATTCCCCACGACCCNCGTTAGCCAGATGC ACAAGGGGGCACATGCATCTCGAGTTCGTTTG-CAGTGGGTGGAGHCCCT

2

GGTGTGCCNАТТСТСТСТСГСТСТСТСТСТСТ------------------

----CTCAAATAAATAAANAAAA

Рис.1 Консенсус DIP элемента.

Квис«ис)гс ОКЛ ВН||Д>И ПО шр»м вопием DIP l«tMtlll№. *НН,~ символ otfain^Atm, что для вс*х трвх • лвивмпюв в «том и*с та присутствовали различии* мук лвотидм. Лрочврв в пврвом cjyitt /I/ ово»кач»«№ возможность иис»рции. Прочврв в шомц* влвивяиш /2/ соопшвтствувт вмсоко >крикб|дьмбй TC-ttoramofe области »лвмомт*.

расширен круг видов животных, тестировавшихся гибридизацией с В2. Все это позволило повысить наглядность и достоверность ряда ранее сделанных"выводов.

3. Лог-гибридизация В2-, DIP- зондов с геношшш ЛИК грызунов.

С целью выяснения того, насколько данные, получение при изучении распространенности ретропоэона в отряде грызунов, сопоставимы с общепринятыми таксономический« представлениями необходимо было расширить круг тестируемых животных. Метод Дот-гибридизации был выбран с цель» проанализировать большее количество животных из различных семейств. Наличие сильного сигнала при гибридизации говорит об имеющейся гомологии и достаточном количестве копия. Данные, полученные при проведении отмывок постепенно увеличивавшейся жесткости позволяют судить о степени гомологии элементов геномной ДНК с меченым зондом.

Результаты дот-гибридизация геномных ДНК 24 различных животных с меченными зондами, содержащими последовательности В2, DIP представлены на РИС. 2 А и 2 Б соответственно.

Фильтры последовательно подвергали отмывкам при повышающейся

температуре. Результаты гибридизации'с В2-зондом свидетельствуют о наличии В2-элемента у всех представителей сем. мышиных и хомячьих и В2-подобных элементов у тушканчиков, мышовок и белки Бермоудра. У других тестированных видов подобные последовательности в геномах не детектируются данными методами.

Полученные результаты по гибридизации фильтра с повтором тушканчиков указывают на наличие DIP-элемента не только у тушканчиков, но и у представителей семейства мышовок (Zapodldae>. Это хорошо согласуется с представлением о близости семейств тушканчиков и мышовок и - еще раз доказывает применимость предлагаемого нами метода выявления филогенетически близких групп. Применении этого метода нужно обязательно иметь в виду, что строгость доказательства будет достигнута лишь в том случае, если детектируется один вид ретропозонов ("собственно В2", "собственно DIP" и т.д. I. В этом случав должна наблюдаться высокая температурная стабильность гибридов (выше Э t С, в O.lxSSC). Применимость данного подхода не столь очевидна, если заключение о филогенетической общности групп делается на том основании, что они характеризуются сходными, но не идентичными видами ретропозонов. Например в случае сравнения В2 с DIP. Скорее всего этот подход применим и в этой случае.

61 I

ОGGO© о

О с О

Т:

" v и- м

* > .Я

09too»«

-ЯйЛ*-»-■

Рис. 2 А,Б Дот-гибридизации геномных ДНК с В2- tDIP~ зондами.

Расположение номеров животных на Дот-гибридизации.

• saiiBin 1 2 3 4 шшнааа 3 б «mawew 7 в

9 10 и 12 13 14 13 16

1? 16 19 20 21 22 23 24

1 . кмаь до мо в аа • 13. ммноях а «vcka*

2.к риса etpai 3 . МЫШЬ A )UAir>CK4

:m* *нк«й

:шанс к «я »с то«па* МАЯ

¿аск»я

4.пол«иа об «»с 9 . ПОЛ1КА ДАГ*С 6 . СAtnyaoMKА 7,ПОЛС1КА ВОДАМ

в.ПАСЧАМКА ииди

9.ШАрбАГАНчик

I О , тув! анч иш Боб рип с. * tii'о

II , myaf дичи« Лихтеишт«аи»

9 12. MUB0AK А- ЩЯКк - ВАКЬС* А А

ЫиАОАСА Л1СЛаЯ (131 »

рве С HOinptHu* . itfc ХОДА но J*ji о л ре дп о л о т-ить ,

14.соая а*с«а*

13.б*лка Б«рдмоур»

16,expos красима

17.диковраз индийский 1 в.морская скимка 19.ч*доа«к раэумкмй

20.лама

21.кабан

22. журак да

23.л«гумка трааккав

24.кролик дикий дальнейшем ис к лючаетс я и«

и л * « слабой гиб ридиэации со ас«ми зоидани, ч irvo е * ЛИК б w АО a am «с »но анач ип»льно мамам а ,

мен ¿ПК других тестируенмж аияогммх«

4. Тестирование геномных ДНК хмвотннх на содержание ретропозонов с использованием ПОР.

Результаты дот-гибридизации не исключает того, что в геноме тушканчиков имеется В2-элемент в' небольшом числе копия. Это же относится к мышовке, белке, а также ко всем тем видам, у которых дот-гибридиэациея•не удается выявить В2-подобных ретропозонов.

Для проверки этой . возможности ДНК ряда грызунов была проанализирована с помощью ГШР. Эти опыты проводились в двух вариантах. В первом варианте геномные ДНК брались в одинаково малых количествах (0,2нг). При этом ПЦР-продукт наблюдался только в случае использования ДНК представителей семейств Миг1(1ае, СгЧсе'ЬМае и гра1ас1(1&е (данные не приведены). Во втором варианте опытов все те геномные ДНК, для которых образование ПЦР-продукта не наблюдалось, добавлялись в реакционную смесь в большем количестве «200нг >- Как видно из рис.3 при такой постановки некие ПЦР-продукты образовались при использовании ДНК всех грызунов. Однако только в случае грызунов семейств МигЫае, Сг1сег1<1ае и Зра1ас1<1ае размер ПЦР-продукта соответствовал ожидаемому для В2-элемента, у других размер был заметно больше, тот результат свидетельствует о том, что у анализированных видов, не относящихся к вышеупомянутым семействам, отсутствует В2-ретропозон как таковоя, хотя, по крайней мере, у некоторых из них, вероятно, имеется родственные нуклеотидные последовательности. Чтобы подтвердить этот вывод, была проведена блот-гибридиэация ПЦР-продуктов с В2-ЗОНДОМ. Как, видно из рис.3, ПЦР-продукты синтезированные на ДНК представителей семейств Миг1йае. Cn.cetl.aae и 5ра1ас1йае гибридиаовались значительно эффективней и образовывали явно более термостабильные гибриды, чем прочие ПЦР-продукты. Таким образом, можно сделать вывод, что в геномах всех грызунов семейств Маг1йаа, Сг1сеи(1ае и Зра1ас1йае имеется большое число копий ретропозона В2, тогда как в ДНК грызунов В1ро(Шае, 2аро<Шае, С11г1й&е, Зс1иг1с1ае, Нув1г1с1бае и СаУШае этот ретропоэон не представлен даже одиночными копиями. Наблюдаемые для этой второй группы грызунов ПЦР-продукты, вероятно, амплифицируются на редких вариантах каких-то ретропозонов. Клонирование и секвенироваяие ПЦР-продукта тушканчика показало, что он синтезируется на ИР-элементе, а ПЦР-продукта белки - что он нарабатывается с матрицы ретропозона особого вида (который будет описан ниже),

dhk

0.2

200

2 <а5ш<>-и2<шм a JJuuXIa

•• V. ^

200

§ 02

200

62'

52 .

B2

DIP

РИСУНОК 3. Детекция с помощью П1!Р и последушнеч блот-гибридиэации ретропозонов В2 и DIP в геномных ДНК различных видов. В верхней части рисунка приведен результат анализа ПЦр-продуктов, разделенных электрофорезом в V/» агарозноы геле и окрашенных бромистым этидием. (Сверху указано количество геномной ДНК, внесенной в реакционную смесь). В нижней части рисунка показан результат блот-гибридиэации ПЦР4продуктов с В2- и DIP- зондами. Фильтры после гибридизации были последовательно отмыты при 4Z С и 52°С и радиоавтографированы. Часть дорожек экспонировали с ренгеновской пленкой более короткое время (время в часах указано под рисунком). Это было сделано во избежание чрезмерной засветки пленки.

Мши - мышь домовая. Аре - мышь азиатская, Pda - полевка дагестанская. Мае - лемминг лесной. Eta - слепушонка восточная, Ate - полевка водяная, Tin - песчанка индийская. Seh - малый слепишь. Abo - тушканчик Еобринского, Ару - тарбаганчик, Ell -тушканчик Лихтенштейна, Stl - мышовка тяньшанская, Sbe - мыиювка лесная iSlcista betullna), Dnl - соня лесная, МЪе - белка Бермоудра, Мса -сурок красный, Cfu - суслик желтый, Сро - морская свинка. Hie - дикообраэ индийский, Hsa - человек, Bta - бык. АЬЮ - клонированный ретропозан DIP из генома тушканчика Бобринского. 1 ООН и 123Н - маркерные ДНК, кратные соответственно 100 и 123 парам нуклеотидов. Происхождение дополнительной (нижней) полосы при ПЦР ретропоэона DIP неясно.

Ю

Работа, аналогичная той, что описана выше для ретропозона В2, была проведена и для ретропозона DIP. ГШР (рис.3> ясно показала, что DIP присутвует в геномах представителей двух семейств: Dlpodldae и Zapodldae. В геномах других тестировавшихся грызунов ретропозон DIP не выявляется даже в виде одиночных копия: наблюдаемые в случае этих грызунов ПЦР-продукты образуют с DIP-зондом лишь легкоплавкие гибриды (рис.3).

Таким образом, для обоих изученных ретропозонов IB2 и DIP) наблюдается четко обозначенный круг видов, несущих их в своих геномах. Для В2 •- это виды, относящиеся к семействам Murldae, Cricetidae и Spalacldae,. тогда как для DIP - это грызуны семейств Dlpodldae и Zapodldae. Все другие тестированные виды совершенно лишены этих ретропозонов. Мы предлагаем использовать эти ретропозоны в качестве филогенетических маркеров. Суд я по всему, возникнув в геноме некоего грызуна много миллионов дет назад, ретропозон данного типа (В2 . или DIP), видимо, быстро амплифицировался и сохранился в относительно малоизмененном виде у всех видов-потомков. На рис.4, приведен фрагмент филогенетического древа грызунов предложенного Ромером. Полученные нами данные способны надежно подтвердить некоторые черты строения этого древа. Так, например, описанный характер распределения ретропозона В2 по семействам грызунов не допускает возможности того, что какое-либо из тестированных . семейств дивергировали от ветви Murldae-Crlcetldae-Spalacldae позже, чем дивергировали друг от друга эти три семейства. Аналогичное заключение, основанное на распределении ретропозона DIP, может быть сделано в отношении ветви Dlpodldae-Zapodldae. В данном случае предложенный нами подход подтвердил разработанную на основании морфологических и палеонтологических данных филогению. Однако, возможно, для каких-то иных групп организмов использование ретропозонов в качестве филогенетических маркеров позволит сушественно исправить разработанную к настоящему моменту филогению.

На наш взгляд, предложенный подход имеет значительные перспективы, несмотря на свою ограниченность, связанную с тем, что

и

он не позволяет решать вопрос о порядке дивергенции внутри группы видов, обладающих данным ретропозоном. В отличии от морфологического подхода в данном методе к миниму сведена вероятность ошибок, связанных с конвергенцией. <Образование путем конвергенции двух одинаковых ретропозонов крайне маловероятно, поскольку согласно сложившимся представлениям, структура ретропозонов не подвержена отбору на уровне организма). Адекватность нашего метода в отличии от других молекулярных методов установления филогенетических связей не зависит от постоянства скорости молекулярной эволюции. Наконец, предлагаемый метод прост и не требует значительной работы по секвенирование. Заключая эту главу, ею раз перечислим стадии исследования необходимые для применения предлагаемого нами метода.

1. Обнаружение и клонирование ретропозона.

2. Полный или частичный сиквенс ретропозона.

3. Лот-гибридизация меченного ретропозона с геномными ДНК. животных разных видов. Гибридизация включает отмывки фильтра при разных температурах.-

4. Детекция ретропозона в геномных ДНК зивотных разных видов с помощью ПЦР. Анализ ПЦР-продуктов гибридизацией с меченным ретропозоном по Саузерну. В этом анализе также применяются отмывки фильтра при разных температурах.

5. На основе полученных данных разделение исследованных видов на имеющих и неимеюших в своем геноме данный ретропозон.

Отметим, что желательным, но не обязательным для данного подхода является клонирование и секвенирование позволяет дополнительно подтвердить отличие или идентичность ретропозонов у животных разных видов.

3. Секвенирование и анализ клонированных ПЦР- продуктов тувканчмка, суслика и белки. *

Для выяснения структуры некоторых из наблюдаемых нами ПЦР продуктов они были клонированы и секвенированы. Так была определена нуклеотидная последовательность 6 клонов ПЦР-продукта тушканчика Лихтенштейна (Ell). Нуклеотидные последовательности отличаются И* п.н. друг от друга, и все соответствовали описанному нами выше ретропозону DIP. Все 5 секвенированных клонов ПЦР-продукта суслика <Cfu> были идентичны (нет замен основания). Установление структуры Cfu-продукта было

РИСУНОК 4. Схема, иллюстрирующая соответствие между дивергенцией семейств грызунов и наличием в геномах ретропозонов В2 и DIP, Приведен фрагмент филогенетического древа грызунов по Ромеру. В правой части филогенетического древа показаны только 3 из 21 семейства, не относящиеся к Myonorpha. Знаками и "-" отмечено, соответственно, наличие к отсутствие В2 и DIP в геномах исследованных гризунов. Стрелками отмечены приблизительно моменты возникновения ретропозонов В2, DIP и 4,3S~1 РНК установленные на основании получецннх в работе данних.

интерпретировала следующим образом: амплификация при ГШР подверглась одиночная копия короткого ретропоэона. Сам ретропозон не содержит последовательности праямера 2. Но такая последовательность оказалась (в случае данной копии лежащей во фланкирующем участке вблизи конца ретропоэона) . Согласно этой интерпретации, длина этого ретропоэона около 60 п.н., и он имеет некоторую гомологию с В2-элементом мыши. Лва секвенированных клона ПЦР-продукта белки Бермоудра отличались друг отдруга 14* п.и. и. имели определенную гомологию с В2-элементом и 4,33-1 РНК на участке первых 77-50 п.н. Полученный результат указывал иа то, что мы выявили новый вид ретропоэона, принадлежащий к В2-суперсемеяству. (В диссертации приведены нуклеотидные последовательности всех клонированных ПЦР-продуктов).

ЧАСТЬ ВТОРАЯ

ПУТИ ЭВОЛЮЦИИ В2-П0Д0БНЫХ РЕТРОПОЗОНОВ У ГРЫЗУНОВ.

6. Структура В2-подобного элемента белки Бермоудра.

Для установления полной структуры предположительно существующего ретропозона белки Бермоудра, были отобраны геномные клоны, гибридиэуюшиеся с В2-зондом, и осуществлено их секвенирование. Последовательность одной из двух копий обнаруженного ретропозона представлена ниже.

1 CGGGCTGGAGATCTGGCTCAGCAGGTACAGGGCTAGCCTTGCAAGCTTGAGGC CCGGGT

60 TCAATTCCCAGCACCCACATGCATATCAATGCCTGAAAGAAAGCTCATCAACCACTAACA

120 TACATAAAAATGAGCTGGGCGTGGTGGCGCACACCCGTAATTCCAGCAGCTTGAAAGGCT

160 CAGACTCGAGGATCACGAGTTCAAAACCACCTCAGCA AAATAACCGAGGTGCTAAAGCA

239 GCTCAGAGAGACCCTGTCT

Две копии отличаются lit пар основания. Найденный элемент был обозначен, как MEN по первым трем буквам родового названия этой 0елки (Menetua>.Протяженность ретропозона' WEN около 270 пар оснований. В'конце элемента имеется олиго(А). Копии фланкированы прямыми повторами. Сравнение нуклеотидных последовательностей МЕН и В2 выявляет существенную гомологию в головной части этих элементов. Особенно высока гомология на участке с 1 по 35 и с 37 по 81 нуклеотид. Неожиданно оказалось, что MEN обладает значительной гомологией также и с В1-элементом мыши. Эта гомология локализуется в пределах второй половины ретропозона MEN и занимает большую часть элеыента В1. Гомология в В1 -элементе отсутствует (или очень снижена) лишь на одном участке длиной 36 нуклеотидов, который расположен недалеко от конца этого элемента. Интересно отметить, что именно этот участок В1~злеыента представляет собой дупликацию соседней нуклготидноя последовательности. Пока не удалось наяти гомологию и установить происхождение соответствующего района элемента MEN.

Таким образом, MEN является ликерным ретропозоном, состоящий из двух мономеров: первый мономер обладает В2-подобной, тогда как второй В1-подобной структурами. Единственным известным аналогичным примером является ретропозон из генома'лемура (Calago), состоящий из тРНК-родстенного мономера и мономера Alu-злемента. Обнаружение нами второго аналогичного примера показывает, что возникновение в эволюции такого гетеродимерного ретропозона хотя и редкое, но закономерное событие.

С помощью количественного ШР со специфическими праямерами были проведена грубая оценка числа копий элемента MEN в геноме белки Бермоудра (данные не преведены). Эта величина была оценена приблизительно 100000. Ретропозон MEN, видимо, возник сравнительно, недавно и не имеет широкого распространения среди разных видов. Это заключение было сделано на том основании, что с помощью ПЦР не удалось выявить даже небольшого числа копий этого ретропозона у белки, принадлежащей к другому роду (американская белка).

7. Выявление генов и псевдогенов 1.5S-1 РНК в геномах грызунов раэнмх видов. ! 4,53-1 РНК богато представлена в клетках мышей и крыс, но не выявляется в клетках человека. Ее функции неизвестны. В геноме крысы имеется около 10000. копий последовательностей, высокогомологичных этой низкомолекулярной РНК, большая часть которых является ее псевдогенами. Гены и псевдогены 4.3S-1 РНК обладают некоторой гомологией с В2-элементом (Krayev,1982; Reddy,l9a3). Как будет показано ниже гены 4.5S-1 РНК также имеет частичную гомологию с элементами DIP и MEN. В связи с родственностью последовательностей 4,33-1 РНК и изучаемых ретропоэонов было важно исследовать наличие в геномах разных грызунов генов и псевдогенов 4.3S-1 РНК. На рис.ЗА представлен результат дот-гибридизации 4,5S-1 РНК-зонда с геномными ДНК разных видов млекопитающих. Картина гибридизации весьма сходна с наблюдавшейся для В2-эонда. Наблюдающаяся интенсивная гибридизация свидетельствует о наличии высокоповторяюшихся последовательностей (вероятно, псевдогенов 4.5S-1 РНК) в геномах представителей семейств мышиных, хомячьих, тушканчиков и мышовок, а также белки Бермоудра. Другие тестированные виды, видимо, не содержат таких последовательностей. Для проверки этих выводов была использована

П11Р. Праямеры соответстчовали началу и концу 4.3S-1 РНК, причем праямер 1 был тем же, который использовался для ПЦР В2-элемента: Праямер 1 5* GGCTGGAGAGATGGCT 3' П1&ЙУ'Р 2 3* GGCTGGAGAGACAGCCGT 3'

Кьк видно из рис ЗБ специфический ПЦР наблюдался у всех представителей семейств мышиные и хомячьи. С помощью гибридизации с 4,33-1-зондом этот же продукт выявлялся также и в случае ДНК слепыша (Seh), но не обнаруживался при использовании геномных ДНК других грызунов. В отдельном эксперименте сравнили эффективность амплификации данного продукта в зависимости от количества геномных ДНК слепыша и крысы. В 200 раз меньшего количества ДНК крысы по сравнению со слепышом было достаточно для образования того же количества ПЦР-продукта (данные приведены в диссертации). Поскольку известно, что в геноме крысы содержится около 10000 генов и псевдогенов 4.3S-1 РНК. результаты позволяют заключить, что в геноме слепыша имеется около 30 копий таких последовательностей (Секвенирование ПЦР-продукта слепыша подтвердило его близость с последовательностью 4,33-1 РНК). Подводя итог опытов по детекции 4,3S-1 -последовательностей с помощью ПЦР можно заключить, что гены (псевдогены) этой РНК присутствуют в геномах представителей сем. мышиные, хомячьи и слепышовые (у последних в относительно небольшом числе). В геномах представителей других тестированных семейств грызунов как таковые 4,33-1-последовательности отсутствуют. Отмеченная выше эффективная гибридизация 4,33-1-зонда с геномными ДНК тушканчиков, мышовок и белки Бермоудра происходит скорей всего за счет копий DIP- и MEN-элементов -соответственно. (Нельзя, правда, исключить, что у этих животных имеются гены 4,33-1 РНК с сильно измененным 3'-концевым районом, что не позволяет им амплифицироваться при ПЦР. Однако, аргументом против этого является тот факт, что при Нозерн-гибридизации РНК печени суслика, сурка и морской свинки мы не обнаружили никаких транскриптов, способных гибрияиэоваться с 4,5S-l~30iW0u-flaHHue не приведены.)

Таким образом, гены собственно 4,33-1 РНК появились в

ii^H я

•IS

"h

'"■Vi-

д lasssss ss.

ш2< t-™ui<uMQSo Jul

■i У..У.,: .-- ,-J •••iit.-XSS^..........A^.Ai-A,

rr?

с

РИСУНОК 9A Дот-гибридизация геномных ДНК с зондом 4,53-1 РНК.(Расположение ДНК животных на фильтре соответствуют таковому на рис 2); РИСУНОК 5Б Детекция с помощью П11Р и последующей блот-гибридизации 4.5S-1 РНК с геномными ДНК следующих видов: Mmu - мышь доковая, Аре - мышь азиатская, Rno - крыса серая, Pda -полевка дагестанская. Eta - слепушонка восточная, Use - лемминг лес ноя.Ate - полевка водяная, Tin - песчанка индийская. Seh - слепышь малый, Ару - тарбаганчик, Ell - тушканчик Лихтенштейна, Stl - мышовка тяньшанская, Dnl - соня лесная, МЪе - белка Бермоудра, Cfu - суслик желтый, Мса - сурок красный, Сро - морская свинка 123N - маркерные ДНК, кратные 123 парам нуклеотидов.

В верхней части рисунка приведен результат анализа ПЦР-продуктов, разделенных электрофорезом в 4/i агароэном геле и окрашенных бромистым этидием, в нижней - результаты блот- гибридизации ПЦР-продуктов с зондом 4,53-1 РНК (с разной жесткостью отмывки:при 42°С и 52°С).

IS

эволюции приблизительно в то же время, что и В2-элемент, то есть незадолго до дивергенции сем. Spalacldae (слепыши) от общего древа, ведущего к Muridae (мышиные) и Crlcetldae (хомячки) (Р*с.4>.

ГЛАВА 0

Характеристика В2- суперсемейства ретропозонов Выявление и анализ новых В2-подобных ретропозонов из генома белки и тушканчика, описанных в этой работе, позволили говорить о наличии суперсемеяства В2-подобных элементов в геномах грызунов. В настоящее время известно около 10 ретропозонов, которые могут быть отнесены к В2-суперсемеяству: В2-элемент мыши, В2-элемент крыс, В21-элемент крыс (удлиненный вариант), повтор хомяка (значительно короче В2-элемента мыши), В2-подобныи ретропоэон слепыша (Spalax), В2РЪе-элемент крыс (был описан по одной копии), 1И-злеыент грызунов, DIP-элеиент тушканчика, WEN-элемент белки, псевдогены 4.3S-1 РНК .

В результате компьютерного анализа был определен участок повышенной гомологии для всех элементов В2-суперсемеяства - 28 нуклеотидов с 3'конца. Когда мы провели сравнение этой последовательности с банком, оказалось, что она имеет сходство исключительно с короткими повторами из генома грызунов, а также с генами низкомолекулярноя 4,53-1 РНК, спецефически присутствующей в клетках грызунов. Эти наблюдения позволили нам предположить, что все надсемеяство повторов В2 характеризуется наличием общего для различных представителей бокса, который чрезвычайно консервативен, и, возможно, несет необходимую для ретропозиции информацию. Этот бокс может являтся маркером на принадлежность повторов к Б2-суперсемейству.

ГЛАВА 9

Происхождение В2-подобных ретропозонов На Рис в представлено сравнение первых 90 нуклеотидов ретропозонов, которые не являются близкородственными: В2, В21 (длинная версия В2 из генома крысы), DTP, МЕН, 3PAL (элемент слепыша), а также 4,33-1 РНК и тРНК?иэ. Из этого сравнения видно, что гомология всех четырех ретропозонов и гена 4,33-1 РНК имеет большую протяженность,, чем их гомология с лиэиновоя тРНК (последнюю рассматривают как эволюционный предшественник В2~ элемента). Эта добавочная гомология локализуется в самом начале ретропозонов (13-И п.н.) и сразу по окончанию гомологии с тРНК

(18 п.н.). Данные наблюдения указывают следующее: ретропоэсны В2, DIP и MEN и гены 4.5S-1 РНК имеют общую предковую последовательность, и она-более протяженна, чем молекула тРНК; тРНКлиэ или ее ген скорее всего не являлись непосредственными предшественниками этих ретропозонов (хотя они ыогли быть их отдаленными предшественниками). Схематическое изображение структур ретропозонов В2, MEN, DIP, 4.SS-1 РНК псевдогенов и тРНК представлено на Рис.7.

Полученные результаты также свидетельствуют против гипотезы . о независимом образовании каждого нового вида ретропозонов- из "etrong-6top"-,HHK ретровирусов (Ohshlaa.1993). В рамках этой гипотезы было бы очень трудно обьяснить наличие одинаковой последовательности негомологичной тРНК в . начале всех трех ретропозонов и гена 4.SS-1 РНК.

43S1 1 GGGGCTGGAGAGA-TGGCTCAG-CcGTTaA-AG-gC-T-A-gGCTCac-AaCC-A-Aaaa

В2 1 GGGGCTGGAGAGA-TGGCTCAG-CGGTTaAgAGCAC-TGACTGCTC---ttCCgA-AGG-

B2L 0 -GGGCTGGAGAGA-TGGCTCAG-tGGTTaAgAGCAC-TGACTGCTC-t-ttCC-AgACGa DIP 0 -GGGCTGGAGAGA-TGGCTtAG-CGGTT-A-AGCgCtTGcCTG-T—g-AagCctaAGGa MEN I GGGGCTGGAGA-AgTGGCTCAGcCGG-T-AcAGCACtTGcCTt-T—C-AagCgtgA-G-tRNA 0 —GC—ccG-G-cTaGCTCAG-tcGgT-AgAGCA—TGA-gaCTCttaAtCtcAg-GG-

43S1 B2 B2L DIP MEN tRNA

РИСУНОК б Сравнение повторягаихса элементов Вг-суперсеиеяства (программа: DNA SUN) к тРНК. Сокращения: В2-ретропозон мыши, B2L- длинный ретропозон крысы, SPAL- ретропозон слепыш, DIP-ретропоэон тушканчика, MEN-ретропозон белки, 43S1-псевдогены малой 4,53-1 РНК, tRNA-ген тРНКлиз .

Полученные нами результаты указывают на то, что и 4.3S-1 РНК, или ее гены, не были предшественниками всех этих ретропозонов: генов "собственно" 4.5S-1 РНК нет в геномах ни у

31 Т-аТ---aa-G-aGTTCg-gTTC-CCAGCAC-CCAC—ggcTgtCtCtc-CA—

33 ТСсТ------G-aGTTCa-ATTC-CCgGCAa-CC-Catgg-TgGCtC-A-CA—

54 ТСсТ------G—GTTCa-ATTC-CCAGCAC-CCACatgg-TgGCtC-A-----

52 TCaT-ggttcGagGcTCt-ATTCtCCAGgAC-CCcCgt—TaGC---------

32 TC-T—g—cGa-GTTCt-ATTC-CCAGCAC-CCAC-a---T-GC-atAtCAat

47 TCgTgggttcGagcccCacg-T-t—gGg-CgCCA--------------:—

длин*

• H.H.

т

—t—

ioo

—н-

SCO —I

vLwm-wih-

'«ш-ш—i

Р1РЩ-Ш

ТС МОГИ»

НЕМ

fy rmiAsna е Bi

тГНК-И-0—

БОКСЫ ДА» FHK-mtt

РИСУНОК 7 Схематическое изображение некоторых ретропозонов В2-иадсемяства: В2-ретропозон мыта, DIP-повтор тушканчика, MEN-повтор белки Бермоудра, 4,531- псевдоген 4,33-1 РНК и тРНК-лизиновая тРНК. Заштрихованные прямоугольники символизирует области высокой гомологии (более 703), черные квадраты обозначают сигналы термннадми транскрипции, перечеркнутые квадраты - сигналы полиаденилирования (ААТААА); ломанная линия соответствует поли (А) последовательностям.

тушканчика и у белки Бермоудра, ни у прочих тестированных грызунов, непринадлежащих к сем. Murldae, Crecetldae и Spalacldae. Наши данные позволяют предположить, что 4,53-1-последовательность и В2-злеыенты должны были появиться приблизительно в одно и то же время (порядка 40 миллионов лет назад) у одной и той же группы грызунов. Возможно, их появление как-то взаимосвязано.

На наш взгляд, имеющиеся данные лучше всего согласуются со следующей моделью происхождения В2-подобных ретропозонов. "Strong-stop" ДНК ретровирусов, ген лизиновой тРНК или какоя-то другой (неизвестный) ген, транскрибирующийся РНК-полимеразояШ, мог приобрести, например за счет рекомбинации, особую последовательность на своем 5'конце. Образовавшийся генетический элемент, вероятно, ; обладал лишь небольшой способностью . к ретропоэици'и (амплификации). Однако в результате каких-то редких генетичес ких события этот элемент мог включить в своя состав некоторые дополнительные нуклеотидные последовательности, резко увеличившие способность элемента к амплификации. В разных ветвях филогенетического древа эти дополнительные последовательности были свои, в результате чего сейчас мы можем наблюдать такое структурное разнообразие ретропозонов В2-суперсемеиства, какое демонстрирует, описанные в работе генетические элементы.

выводи

1. С помощью гибридизации и полимеразной реакции (П11Р) исследовано наличие В2-подобных ретропозонов у грызунов различных семейств. Показано, что В2-элемент (как таковоя) имеется лишь у представителей сем.мышиные, хомячьи и слепыши. Повторяющиеся последовательности, гибридмзующиеся с В2-элементом мыши, обнаружены в геномах тушканчиков, мышовок и белки Бермоудра.

2. Проклонированы и просеквенированы три копии нового ретропозона из геномов тушканчиков, названного DIP. Структура ретропозона DIP соответствует общему плану строения ретропозонов В2-сулерсемеяства: наличие промоторных областей для РНК-полимеразыШ, А-богатыя район на 3'конце, сигналы полиаденилирования (ААТААА>, фланкирующие прямые повторы. Повтор DIP также обладает такой отличительной характерной чертой, как ТС-мотип на 3'конце.

3. Клонированы и секвенированы две копии ретропозона из генома белки Бермоудра, названного MEN. Этот ретропозон имеет своеобразную структуру. Он состоит из двух мономеров: первый может быть отнесен к элементам В2-суперсемепства, тогда как второй имеет высокую гомологию с В1 -элементом мышь

4. Проведено. сравнение элементов из В2-суперсомейства. Выделен бокс, высоко гомологичный для всех его представителей. Предложено использовать этот бокс з качестве характеристической последовательности всего В2-супврсеиеиства.

3. Показано, что гены и псевдогены 4.SS-1 РНК, нуклеотиднаи последовательность родственна ретропозонаи В2-суперсемейства, имеется в геноыах представителей сем.мышиные, хоыячьи и слепыии. Эти нуклеотидкые последовательности (как таковые!, отсутствуют в геномах прочих тестированных грызунов. Таким образом, гены 4,33-1 РНК возникли з эволюции параллельно с ретропозоном В2.

б. Предложено использовать короткие ретропоэонм л качестве филогенетических маркеров. Данные, полученные с использование» В2-элемента, наглядно демонстрируют филогенетическое родстио сем, мышиные, хомячьи и слепыши. Применение элемента DIP выявило родство сем. тушканчиков и мышовок.

Список работ, опубликованных во теме диссертации.

1. И.М.Сердобова и Д.А.Кранеров, Использование ретропозона В2 для изучения филогенетических связей у грызунов. (1083), Генетика, 12, стр. 1969-1961

2. И.М.Сердобова и Д.А.Крамеров, Возможность применения коротких повторов для эволюционных исследований, (ноябрь,1993) конференция "Приоритетные направления генетики", Москва..

3. И.М.Сердобова и Д.А.Крамеров, Использование коротких ретропозонов в качестве филогенетических маркеров. (1894), ДАН РАН, принято в печать

4. Serdobova I.M., Denchenko Т.О. and Kranerov D.A. Evolution of short Interspersed repeated sequences (SINE) of B2-superfamlly and the using of "short retroposon B2 for determination of soma phylogenetlc relationships of rodents. Abstracts for the conference; Young Scientist's View of Molecular Biotechnology, Ascom, 13-19 February (1994).